一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测he4的方法
一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测he4的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法。
【背景技术】
[0002]目前市场上对HE4蛋白的免疫学检测方法主要包括酶联免疫分析法、电化学发光法和化学发光酶免疫测定法等。酶联免疫分析法可用于定量检测，但操作步骤繁琐，受人为因素影响大，在灵敏度、特异性和应用范围上差别很大；电化学发光法定量检测的准确度较高，水平具有定量和稳定的优点，但是不适合于现代自动免疫仪器，需要专门的配套仪器使用，投资成本较高、因此难以推广应用；化学发光酶免疫测定法灵敏度和准确性要普遍高于酶联免疫法，同时对检测仪器设备的要求又远低于电化学发光法，所以一直受到广泛关注，但由于该类化学发光物质需要相应酶类进行催化发光，导致背景高灵敏度略低，此外酶催化的化学发光达到平台期需要一定时间，限制了检测效率。
[0003]化学发光免疫分析技术，是一项集中了多种免疫标记检测技术优点的免疫学检测技术，于1977年由Halmann等在经典放射性免疫分析技术的基础上创立而来。该检测技术包括两个主要系统，其中在继承了抗原抗体高特异性免疫反应系统的基础上，结合了化学发光系统，以化学发光物质作为标记物直接标记抗体或抗原，或是以能催化化学发光物质的酶作为标记物，在免疫反应后，化学发光物质在相应的氧化剂或催化酶存在的环境下，形成不稳定的中间体激发态，在回到基态时迅速释放可被化学发光仪检测到的光子信号，实现对待测抗原抗体复合物的准确定性或定量测定。其中以化学发光物质吖啶酯直接作为标记物，具有比酶催化化学发光更高的信号值和检测灵敏度。
[0004]传统的化学发光免疫分析大多以微孔板作为固相载体连接抗原或抗体，吖啶酯快速集中的发光特性使免疫分析过程更易实现自动化，便对固相载体有进一步要求。磁性微粒作为更加高效的抗原、抗体免疫反应固相载体，是一种在外磁场存在的条件下具有响应性的磁性金属或金属氧化物，大多以氧化铁为核心，经过分子修饰可以在其表面固定大量生物分子。此外磁性微粒的超顺磁性使其在外加磁场存在的情况下能够迅速聚集，而去掉外磁场后又能够重新悬浮分散于溶液中，极大缩短免疫检测操作过程中的清洗时间。
[0005]胶体金是一种具有一定大小，由静电作用形成的稳定胶体状态的金颗粒，很早就被用于生物分子的标记和检测。
[0006]结合磁性纳米粒子的超顺磁性和胶体金表面生物分子可修饰性的双重特质，发明人所在研宄组研制了 Fe3O4Au磁性复合微粒，即金磁微粒，并将其实现了商业化。金磁微粒是一种新型磁性无机物复合微粒，这种材料兼有磁性粒子在外磁场中的可分离性以及磁颗粒表面修饰后对生物分子的快速固定化等特点，在生物与医学领域具有重要的应用前景。
[0007]基于磁性微粒的化学发光免疫分析法是将磁分离技术、免疫分析技术及化学发光检测技术三者有效结合在一起的新型的分析检测技术，因而具有化学发光的高灵敏度、免疫分析的强特异性、磁分离系统的快速分离的特点，此外，还具有检测时间短、线性范围宽、以及易实现自动化等优点，因此，近年来被广泛应用于临床诊断、生物医学、食品安全及毒品检测等众多方面。
[0008]对于特定的检测对象，基于磁性微粒(包括金磁微粒)的(吖啶酯化学发光)免疫分析法的建立需要进行大量的实验和分析研宄才有可能取得有意义的成果。这主要是因为不同检测对象的分子结构、分子量、生物活性以及稳定的保存环境等都不相同。建立该方法的难点和复杂之处在于，不同检测对象对检测方法、免疫反应条件、甚至检测体系中的各个成分配比、发光液成分等都有着不同的要求，通过大量实验确定最优的结果才能达到最佳检测范围和灵敏度；在磁性分离过程中不同磁场强度或磁分离时间都直接影响分离效果；此外在抗体标记过程中，不同抗体甚至不同抗体用量，都直接影响标记体系结果的好坏(主要体现在标记效率)，标记反应条件、纯化收集的条件、保存条件等都需要反复设计实验来确定。
【发明内容】
[0009]本发明提供了一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法，以解决上述【背景技术】检测HE4存在的局限性、特异性、灵敏性、危险性等问题。
[0010]为实现上述发明目的，本发明给出以下解决方案:
[0011]基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法，包括以下步骤:
[0012]⑴包被
[0013]以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将HE4包被抗体偶联在金磁微粒的表面；具体过程如下:
[0014](1.1)预处理:取金磁微粒，用平衡缓冲液清洗平衡I?3遍；
[0015](1.2)偶联:将HE4包被抗体与偶联缓冲液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在25-40°C，150?250rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；
[0016](1.3)清洗:用清洗缓冲液清洗3-5次，磁性分离，弃上清；
[0017](2)封闭
[0018]在步骤⑴的产物中加入封闭液，置于摇床中，在25_40°C条件下，以150?250rpm的转速反应I?2小时，封闭金磁微粒表面未与HE4包被抗体结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用；
[0019](3)抗体的标记
[0020](3.1)预处理:用洗脱缓冲液对脱盐柱进行平衡；
[0021 ] (3.2)抗体标记:取吖啶酯溶液和HE4标记抗体溶液，在标记缓冲液环境中进行标记反应，最后加入赖氨酸盐溶液再次进行反应；
[0022](3.3)纯化收集:将步骤(3.2)反应得到的抗体溶液上样脱盐柱，用洗脱缓冲液进行洗脱收集，通过收集物的发光值和抗体浓度筛选抗体纯化产物，即标记有吖啶酯的HE4抗体；
[0023](4)与待测物结合
[0024]将待检样品和能与HE4抗原发生特异性结合的标记有吖啶酯的HE4抗体，加入经过步骤(2)封闭后的结合有HE4包被抗体的金磁微粒中进行反应，待测样品中所含的HE4抗原被金磁微粒上的HE4包被抗体捕获，同时与吖啶醋标记HE4抗体结合，形成“双抗体夹心复合物”;
[0025](5)清洗
[0026]用清洗缓冲液清洗双抗体夹心复合物，磁性分离，弃上清；
[0027](6)化学发光检测
[0028]向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后立即测定待测各孔的发光强度；发光强度与待测样本的浓度成正比关系O
[0029]本发明还确立了以下优化环节和参数:
[0030]步骤(1.1)平衡缓冲液的较佳选择为以下缓冲液中的任一种:
[0031]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0032]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液、
[0033]步骤(1.2)偶联缓冲液选自以下缓冲液中的任一种:
[0034]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0035]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0036]步骤(1.3)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.05-0.2% (体积分数，下同)吐温的该种缓冲液:
[0037]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0038]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0039]步骤(2)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.05-0.2%吐温的该种缓冲液:
[0040]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0041]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0042]步骤(2)所述封闭液为牛血清白蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶或动物血清之中的任一种或其中2-3种的混合物，该封闭液的质量体积浓度(g/mL)为1-5% ;所述动物血清为胎牛血清或马血清，封闭剂配置缓冲溶液为偶联缓冲液；
[0043]所述封闭剂配置缓冲液选自以下缓冲液中的任一种:
[0044]ρΗ5.0?8.0， 浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0045]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0046]步骤⑵中采用的保存缓冲液选自以下缓冲液中的任一种:
[0047]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0048]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0049]步骤(3)中采用的洗脱缓冲液选自以下缓冲液含0.10-0.15M NaCl:
[0050]ρΗ5.0?7.0，浓度为0.05Μ?0.15Μ的磷酸盐(PBS)缓冲液；
[0051]步骤(3.2)中采用的标记缓冲液选自以下缓冲液含0.10-0.15Μ NaCl:
[0052]ρΗ7.0?10.0，浓度为0.05Μ?0.15Μ的磷酸盐(PBS)缓冲液；
[0053]步骤(5)所述清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或者还含0.05-0.2%吐温的该种缓冲液:
[0054]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0055]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液。
[0056]所述步骤(1.3)中采用含0.05%吐温的清洗缓冲液则效果最佳。
[0057]所述步骤⑵中采用含0.1%吐温的清洗缓冲液则效果最佳。
[0058]所述步骤(4)中采用含0.05%吐温的清洗缓冲液则效果最佳。
[0059]步骤(I)中采用的ΗΕ4单克隆抗体为Meridian、Hytest、或Abcam公司产品。
[0060]步骤(3.2)中，吖啶酯溶液浓度为0.05-lmM，HE4标记抗体的投入量为50-500 μ g。反应的条件具体为:取吖啶酯溶液和HE4标记抗体溶液，用标记缓冲液混合，置于摇床中，在20-25°C条件下，以150?250rpm的转速反应10?30分钟；加入赖氨酸盐溶液，再次置于摇床中，在20-25°C条件下，以150?250rpm的转速反应20?50分钟；采用的标记抗体是吖啶酯或吖啶磺酰胺类化学发光物质标记的鼠单克隆HE4抗体。
[0061]步骤(4)反应的条件为:将待检样品和吖啶酯标记的HE4抗体加入金磁微粒中，置于摇床，在25-40°C条件下，以150?250rpm的转速反应30?90分钟。
[0062]上述标记用吖啶酯类化学发光物质是4-(2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐、B丫啶酯-NSP-DMAE-NHS，或采用吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS。
[0063]步骤￠)中采用的化学发光底物是含有双氧水和氢氧化钠的溶液，或者在所述含有双氧水和氢氧化钠的溶液中还含有曲拉通-100和硝酸。具体操作过程中采用的化学发光底物可以分为使用前独立存在的发光激发液A和发光激发液B，其中发光激发液A中含有0.1% (体积分数)双氧水、0.05-0.5M硝酸，发光激发液B中含有0.25M氢氧化钠、
0.5% -5% (体积分数)的曲拉通-100。
[0064]本发明具有以下优点:
[0065]本发明以金磁微粒为载体，结合化学发光免疫检测系统，建立了基于金磁微粒的化学发光免疫学检测HE4的方法。使用的抗体为单克隆抗体，与抗原之间反应特异性好，有效避免交叉反应，且由于金磁微粒对蛋白质等大分子物质具有的高吸附能力，加之抗体、抗原免疫反应的高特异性，同时还兼具吖啶酯化学发光法的高灵敏度和标记物稳定、无污染的特点。在制备过程中不同步骤使用适当的缓冲溶液和PH值，使得抗体与固相载体之间有效结合，并有效进行位点封闭，避免的了非特异性反应的产生。
[0066]该方法检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好、无放射性污染，操作安全，方法简便快速。尤其在检测灵敏度、特异性、准确度及精密度方面均比酶参与的免疫检测有显著提高。
【附图说明】
[0067]图1是本发明吖啶醋标记抗体的原理示意图；
[0068]图2是实施例一中本发明抗体标记洗脱组分的吖啶酯发光值和抗体浓度检测结果;
[0069]图3是实施例一中本发明定量检测HE4的标准曲线。
【具体实施方式】
[0070]以下实施例对本发明的方案以具体实验操作的形式示例，其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限；本领域技术人员应当能够基于本发明的原理在合理的范围内确定实验条件和设定参数，仍可实现本发明的发明目的。
[0071]实施例一:一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法
[0072](I)包被
[0073](1.1)预处理:取 10mg/ml 的金磁微粒 100 μ 1，用 ρΗ7.4,0.02Μ Tris-HCl 平衡缓冲液200 μ I清洗2次，平衡磁粒的pH。
[0074](1.2)偶联:将 50 μ g 的 HE4 包被抗体溶解于 200 μ I ρΗ7.4，0.02Μ Tris-HCl 偶联缓冲液中，混匀后加入预处理过的金磁微粒中，于37°C，180rpm，摇床中反应30min。反应完毕后取出，磁性分离，弃上清。
[0075](1.3)清洗:加入300 μ I ρΗ7.4，含0.05%吐温-20的0.0lM PBS清洗缓冲液，磁性分离，弃上清，清洗3次。
[0076](2)封闭:向上述反应后的金磁微粒中加入Iml含5%脱脂奶粉和2%胎牛血清的pH7.4,0.0lM PBS缓冲液中，于37°C，180rpm，摇床中反应2h，磁性分离，弃上清。用ImlpH7.4，含0.1 %吐温-20的0.0lM PBS缓冲液清洗3次，磁粒悬于Iml pH7.4的含I %牛血清白蛋白的0.0lM PBS的保存缓冲液中，4°C备用。
[0077](3)抗体的标记:
[0078](3.1)预处理:将G-25葡聚糖凝胶脱盐柱用25mL洗脱缓冲液进行平衡。
[0079](3.2) 口丫啶酯的标记:取250 μ g的HE4抗体，加入0.5mM的吖啶醋(4- (2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐)溶液50μ1，加入pH8.0的含0.15ΜNaCL的0.1M PBS标记缓冲液使总反应体积为1000 μ 1，避光于25°C，180rpm，摇床中反应20min。反应完毕后取出，加入10%的赖氨酸盐溶液100 μ 1，继续避光于25°C，180rpm，摇床中反应30min。
[0080](3.3)过柱纯化:将上述反应物上样在已经平衡好的G-25脱盐柱中，用pH 6.3的含0.15M NaCL的0.1M PBS洗脱缓冲液进行洗脱并收集，洗脱速度为120drops/min，用
1.5mL试管收集洗脱液，每管收集500 μ I共收集24管，并对收集管内洗脱组分的发光值和抗体浓度进行测定，结果如图2所示，收集第4、5、6管混合作为标记有吖啶酯的ΗΕ4抗体，加入I %牛血清白蛋白和50%甘油于-20°C保存备用。
[0081](4)与待测物结合:取出包被有HE4抗体的金磁微粒，于室温下平衡15min，取出发光检测试管，依次加入上述金磁微粒30 μ 1、待测样本(0ng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、
1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml)各 100 μ 1、50 倍稀释的标记有吖啶酯的HE4抗体100 μ 1，置摇床中37°C，180rpm，反应40min，形成双抗体夹心复合物。
[0082](5)清洗:取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用pH7.4含0.05%吐温-20的
0.0lM PBS清洗缓冲液清洗3次，磁性分离，弃上清。
[0083](6)化学发光检测:向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物的金磁微粒，加入0.1M HNO3,0.1 % H2O2发光激发液A 100 μ 1，立即放入化学发光免疫检测仪内，调整仪器自动加入0.25Μ NaOH, 2% Triton-100发光激发液BlOO μ 1，检测累计时间15s，检测各孔的发光强度(RLU)，其发光强度与待测样本浓度关系如图3所示，在0.3ng/ml?25ng/ml的范围内线性较好，最低检出限可达0.069ng/mlo
[0084]结论:在抗体的吖啶 酯标记中，被吖啶酯标记上的HE4抗体约占总投入的抗体的69.77%，并且标记效率高达1.92，即每分子抗体上平均标记有1.92个吖啶酯分子；
[0085]该基于金磁微粒的化学发光检测HE4方法的浓度-发光值标准曲线显示，在
0.05ng/ml?25ng/ml的范围内具有良好线性，且通过计算后最低检测限可达0.069ng/ml。
[0086]实施例二:一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法
[0087](I)包被
[0088](1.1)预处理:取10mg/ml的金磁微粒100 μ 1，用ρΗ7.4的0.0lM磷酸盐(PBS)平衡缓冲液200 μ I清洗2次，平衡磁粒的pH。
[0089](1.2)偶联:将50 μ g的HE4包被抗体溶解于200 μ I ρΗ7.4的0.0lM磷酸盐(PBS)偶联缓冲液中，混匀后加入预处理过的金磁微粒中，于37°C，180rpm，摇床中反应30min。反应完毕后取出，磁性分离，弃上清。
[0090](1.3)清洗:加入300 μ I ρΗ7.4，含0.05%吐温-20的0.0lM PBS清洗缓冲液，磁性分离，弃上清，清洗3次。
[0091](2)封闭:向上述反应后的金磁微粒中加入Iml含5%脱脂奶粉和2%牛血清白蛋白的pH7.4，0.01M PBS缓冲液中，于37°C，180rpm，摇床中反应2h，磁性分离，弃上清。用Iml ρΗ7.4，含0.1 %吐温-20的0.0lM PBS缓冲液清洗3次，磁粒悬于Iml ρΗ7.4的含I %牛血清白蛋白的0.0lM PBS的保存缓冲液中，4°C备用。
[0092](3)抗体的标记:
[0093](3.1)预处理:将G-25葡聚糖凝胶脱盐柱用25mL洗脱缓冲液进行平衡。
[0094](3.2) 口丫啶酯的标记:取500 μ g的HE4抗体，加入0.1mM的吖啶醋(4- (2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐)溶液50μ1，加入pH8.0的含0.15ΜNaCL的0.1M PBS标记缓冲液使总反应体积为1000 μ 1，避光于25°C，180rpm，摇床中反应30min。反应完毕后取出，加入10%的赖氨酸盐溶液100 μ 1，继续避光于25°C，180rpm，摇床中反应40min。
[0095](3.3)过柱纯化:将上述反应物上样在已经平衡好的G-25脱盐柱中，用pH6.3的含0.15M NaCL的0.1M PBS洗脱缓冲液进行洗脱并收集，洗脱速度为120drops/min，用
1.5mL试管收集洗脱液，每管收集500 μ I共收集24管，并对收集管内洗脱组分的发光值和抗体浓度进行测定，收集第4、5、6管混合作为标记有吖啶酯的ΗΕ4抗体，加入1%牛血清白蛋白和50%甘油于-20°C保存备用。
[0096](4)与待测物结合:取出包被有HE4抗体的金磁微粒，于室温下平衡15min，取出发光检测试管，依次加入上述金磁微粒30 μ 1、待测样本(0ng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、
1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml)各 100 μ 1、50 倍稀释的标记有吖啶酯的HE4抗体100 μ 1，置摇床中37°C，180rpm，反应50min，形成双抗体夹心复合物。
[0097](5)清洗:取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用pH7.4含0.05%吐温-20的0.0lM PBS清洗缓冲液清洗3次，磁性分离，弃上清。
[0098](6)化学发光检测:向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物的金磁微粒，加入0.3M HNO3,0.1 % H2O2发光激发液A 100 μ 1，立即放入化学发光免疫检测仪内，调整仪器自动加入0.25Μ NaOH，0.5% Triton-100发光激发液B ΙΟΟμΙ，检测累计时间15s，检测各孔的发光强度(RLU)，其发光强度与待测样本浓度关系在一定范围成正比，其中在0.3ng/ml?25ng/ml的范围内线性较好，最低检出限可达0.086ng/ml。
[0099]结论:在抗体的吖啶酯标记中，被吖啶酯标记上的HE4抗体约占总投入的抗体的63.51%，并且标记效率高达1.83，即每分子抗体上平均标记有1.83个吖啶酯分子；
[0100]该基于金磁微粒的化学发光检测HE4方法的浓度-发光值标准曲线显示，在
0.05ng/ml?25ng/ml的范围内具有良好线性，且通过计算后最低检测限可达0.086ng/ml。
[0101]实施例三:一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法
[0102](I)包被
[0103](1.1)预处理-M 10mg/ml 的金磁微粒 100 μ 1，用 pH8.0,0.1M Tris-HCl 平衡缓冲液200 μ I清洗2次，平衡磁粒的pH。
[0104](1.2)偶联:将 50 μ g 的 HE4 包被抗体溶解于 200 μ I ρΗ8.0,0.1M Tris-HCl 偶联缓冲液中，混匀后加入预处理过的金磁微粒中，于37°C，180rpm，摇床中反应30min。反应完毕后取出，磁性分离，弃上清。
[0105](1.3)清洗:加入 300 μ I ρΗ7.4，含 0.05%吐温-20 的 0.1M Tris-HCl 清洗缓冲液，磁性分离，弃上清，清洗3次。
[0106](2)封闭:向上述反应后的金磁微粒中加入Iml含5%脱脂奶粉和2%胎牛血清的pH8.0,0.1M Tris-HCl缓冲液中，于37°C，180rpm，摇床中反应2h，磁性分离，弃上清。用ImlpH7.4，含0.1 %吐温-20的0.0lM PBS缓冲液清洗3次，磁粒悬于Iml pH7.4的含I %牛血清白蛋白的0.0lM PBS的保存缓冲液中，4°C备用。
[0107](3)抗体的标记:
[0108](3.1)预处理:将G-25葡聚糖凝胶脱盐柱用25mL洗脱缓冲液进行平衡。
[0109](3.2)吖啶酯的标记:取250 μ g的HE4抗体，加入0.5mM的吖啶酯(吖啶酯-NSP-DMAE-NHS)溶液50 μ 1，加入ρΗ9.0的含0.10Μ NaCL的0.15Μ PBS标记缓冲液使总反应体积为1000 μ 1，避光于25°C，180rpm，摇床中反应20min。反应完毕后取出，加入10%的赖氨酸盐溶液100 μ 1，继续避光于25°C，180rpm，摇床中反应30min。
[0110](3.3)过柱纯化:将上述反应物上样在已经平衡好的G-25脱盐柱中，用pH5.8的含0.10M NaCL的0.15M PBS洗脱缓冲液进行洗脱并收集，洗脱速度为120drops/min，用
1.5mL试管收集洗脱液，每管收集500 μ I共收集24管，并对收集管内洗脱组分的发光值和抗体浓度进行测定，收集第4、5、6管混合作为标记有吖啶酯的ΗΕ4抗体，加入1%牛血清白蛋白和50%甘油于-20°C保存备用。
[0111](4)与待测物结合:取出包被有HE4抗体的金磁微粒，于室温下平衡15min，取出发光检测试管，依次加入上述金磁微粒30 μ 1、待测样本(0ng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、
1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml)各 100 μ 1、50 倍稀释的标记有吖啶酯的HE4抗体100 μ 1，置摇床中37°C，180rpm，反应40min，形成双抗体夹心复合物。
[0112](5)清洗:取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用pH8.0含0.05%吐温-20的0.1M Tris-HCl清洗缓冲液清洗3次，磁性分离，弃上清。
[0113](6)化学发光检测:向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物的金磁微粒，加入0.1M HNO3,0.1 % H2O2发光激发液A 100 μ 1，立即放入化学发光免疫检测仪内，调整仪器自动加入0.25Μ NaOH, 2% Triton-100发光激发液BlOO μ I，检测累计时间15s，检测各孔的发光强度(RLU)，其发光强度与待测样本浓度关系在一定范围内成正比，在0.3ng/ml?25ng/ml的范围内线性较好，最低检出限可达0.12ng/ml。
[0114]结论:在抗体的吖啶酯标记中，被吖啶酯标记上的HE4抗体约占总投入的抗体的72.53%，并且标记 效率高达1.73，即每分子抗体上平均标记有1.73个吖啶酯分子；
[0115]该基于金磁微粒的化学发光检测HE4方法的浓度-发光值标准曲线显示，在0.05ng/ml?25ng/ml的范围内具有良好线性，且通过计算后最低检测限可达0.12ng/ml。
【主权项】
1.一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，包括以下步骤: (1)包被 以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将HE4包被抗体偶联在金磁微粒的表面；具体过程如下: (1.D预处理:取金磁微粒，用平衡缓冲液清洗平衡I?3遍； (1.2)偶联:将HE4包被抗体与偶联缓冲液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在25-40°C，150?250rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清； (1.3)清洗:用清洗缓冲液清洗3-5次，磁性分离，弃上清； (2)封闭 在步骤(I)的产物中加入封闭液，置于摇床中，在25-40°C条件下，以150?250rpm的转速反应I?2小时，封闭金磁微粒表面未与HE4包被抗体结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用； (3)抗体的标记 (3.1)预处理:用洗脱缓冲液对脱盐柱进行平衡； (3.2)抗体标记:取吖啶酯溶液和HE4标记抗体溶液，在标记缓冲液环境中进行标记反应，最后加入赖氨酸盐溶液再次进行反应； (3.3)纯化收集:将步骤(3.2)反应得到的抗体溶液上样脱盐柱，用洗脱缓冲液进行洗脱收集，通过收集物的发光值和抗体浓度筛选抗体纯化产物，即标记有吖啶酯的HE4抗体； (4)与待测物结合 将待检样品和能与HE4抗原发生特异性结合的标记有吖啶醋的HE4抗体，加入经过步骤(2)封闭后的结合有HE4包被抗体的金磁微粒中进行反应，待测样品中所含的HE4抗原被金磁微粒上的HE4包被抗体捕获，同时与吖啶醋标记HE4抗体结合，形成“双抗体夹心复合物”； (5)清洗 用清洗缓冲液清洗双抗体夹心复合物，磁性分离，弃上清； (6)化学发光检测 向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后立即测定待测各孔的发光强度；发光强度与待测样本的浓度成正比关系。2.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 步骤(1.D平衡缓冲液选自以下缓冲液中的任一种: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 ΡΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液、 步骤(1.2)偶联缓冲液选自以下缓冲液中的任一种: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 ΡΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；步骤(1.3)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.05-0.2%吐温的该种缓冲液: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 ΡΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；步骤(2)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.05-0.2%吐温的该种缓冲液: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 ΡΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；步骤(2)所述封闭液为牛血清白蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶或动物血清之中的任一种或其中2-3种的混合物，该封闭液的质量体积浓度(g/mL)为1-5% ;所述动物血清为胎牛血清或马血清，封闭剂配置缓冲溶液为偶联缓冲液； 所述封闭剂配置缓冲液选自以下缓冲液中的任一种: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 ΡΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液； 步骤⑵中采用的保存缓冲液选自以下缓冲液中的任一种: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 ΡΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；步骤(3)中采用的洗脱缓冲液为:ρΗ5.0?7.0，浓度为0.05Μ?0.15Μ的磷酸盐(PBS)缓冲液，其中还含有0.10-0.15Μ NaCl ； 步骤(3.2)中采用的标记缓冲液为:ρΗ7.0?10.0，浓度为0.05Μ?0.15Μ的磷酸盐(PBS)缓冲液，其中还含有0.10-0.15Μ NaCl ； 步骤(5)所述清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或者还含0.05-0.2%吐温的该种缓冲液: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 pH 7.0?9.0，浓度为0.005M?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液。3.根据权利要求2所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 所述步骤(1.3)中的清洗缓冲液是含0.05%吐温的该种缓冲液； 所述步骤(2)中的清洗缓冲液是含0.1 %吐温的该种缓冲液； 所述步骤(5)中的清洗缓冲液是含0.05%吐温的该种缓冲液。4.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 步骤(I)中采用的HE4单克隆抗体为Meridian、Hytest、或Abcam公司产品。5.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 步骤(3.2)中，卩丫啶酯溶液浓度为0.05-lmM，HE4标记抗体的投入量为50-500 μ g。6.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 步骤(3.2)反应的条件为:取吖啶酯溶液和HE4标记抗体溶液，用标记缓冲液混合，置于摇床中，在20-25°C条件下，以150?250rpm的转速反应10?30分钟；加入赖氨酸盐溶液，再次置于摇床中，在20-25°C条件下，以150?250rpm的转速反应20?50分钟；HE4抗体标记采用的标记物是吖啶酯类化学发光物质或吖啶磺酰胺类化学发光物质； 步骤(4)反应的条件为:将待检样品和吖啶酯标记的HE4抗体加入金磁微粒中，置于摇床，在25-40°C条件下，以150?250rpm的转速反应30?90分钟。7.根据权利要求6所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 所述吖啶酯类化学发光物质为4-(2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐、B丫啶酯-NSP-DMAE-NHS，所述吖啶磺酰胺类化学发光物质为吖啶磺酰胺NSP-SA-NHSo8.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 步骤￠)中采用的化学发光底物是含有双氧水和氢氧化钠的溶液，或者在所述含有双氧水和氢氧化钠的溶液中还含有曲拉通-100和硝酸。9.根据权利要求8所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 步骤(6)中采用的化学发光底物包括使用前独立存在的发光激发液A和发光激发液B，其中发光激发液A中含有0.1 %双氧水、0.05-0.5M硝酸，发光激发液B中含有0.25M氢氧化钠、0.5% -5%的曲拉通-100。
【专利摘要】本发明提供了一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法，主要包括以下步骤：(1)以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将HE4包被抗体偶联在金磁微粒的表面；(2)用封闭液封闭金磁微粒表面未与HE4包被抗体结合的空白位点；(3)用吖啶酯(AE)对HE4标记抗体进行标记；(4)将待检样品和能与HE4抗原发生特异性结合吖啶酯标记的HE4抗体加入封闭后的包被有HE4抗体的金磁微粒中进行反应，形成双抗体夹心复合物；(5)清洗；(6)化学发光检测。本发明检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好、无放射性污染、操作安全、方法简便快速。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/68, G01N21/76, G01N33/543
【公开号】CN104897901
【申请号】CN201510240537
【发明人】马乐, 郭博阳, 崔亚丽
【申请人】西安金磁纳米生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法。
【背景技术】
[0002]目前市场上对HE4蛋白的免疫学检测方法主要包括酶联免疫分析法、电化学发光法和化学发光酶免疫测定法等。酶联免疫分析法可用于定量检测，但操作步骤繁琐，受人为因素影响大，在灵敏度、特异性和应用范围上差别很大；电化学发光法定量检测的准确度较高，水平具有定量和稳定的优点，但是不适合于现代自动免疫仪器，需要专门的配套仪器使用，投资成本较高、因此难以推广应用；化学发光酶免疫测定法灵敏度和准确性要普遍高于酶联免疫法，同时对检测仪器设备的要求又远低于电化学发光法，所以一直受到广泛关注，但由于该类化学发光物质需要相应酶类进行催化发光，导致背景高灵敏度略低，此外酶催化的化学发光达到平台期需要一定时间，限制了检测效率。
[0003]化学发光免疫分析技术，是一项集中了多种免疫标记检测技术优点的免疫学检测技术，于1977年由Halmann等在经典放射性免疫分析技术的基础上创立而来。该检测技术包括两个主要系统，其中在继承了抗原抗体高特异性免疫反应系统的基础上，结合了化学发光系统，以化学发光物质作为标记物直接标记抗体或抗原，或是以能催化化学发光物质的酶作为标记物，在免疫反应后，化学发光物质在相应的氧化剂或催化酶存在的环境下，形成不稳定的中间体激发态，在回到基态时迅速释放可被化学发光仪检测到的光子信号，实现对待测抗原抗体复合物的准确定性或定量测定。其中以化学发光物质吖啶酯直接作为标记物，具有比酶催化化学发光更高的信号值和检测灵敏度。
[0004]传统的化学发光免疫分析大多以微孔板作为固相载体连接抗原或抗体，吖啶酯快速集中的发光特性使免疫分析过程更易实现自动化，便对固相载体有进一步要求。磁性微粒作为更加高效的抗原、抗体免疫反应固相载体，是一种在外磁场存在的条件下具有响应性的磁性金属或金属氧化物，大多以氧化铁为核心，经过分子修饰可以在其表面固定大量生物分子。此外磁性微粒的超顺磁性使其在外加磁场存在的情况下能够迅速聚集，而去掉外磁场后又能够重新悬浮分散于溶液中，极大缩短免疫检测操作过程中的清洗时间。
[0005]胶体金是一种具有一定大小，由静电作用形成的稳定胶体状态的金颗粒，很早就被用于生物分子的标记和检测。
[0006]结合磁性纳米粒子的超顺磁性和胶体金表面生物分子可修饰性的双重特质，发明人所在研宄组研制了 Fe3O4Au磁性复合微粒，即金磁微粒，并将其实现了商业化。金磁微粒是一种新型磁性无机物复合微粒，这种材料兼有磁性粒子在外磁场中的可分离性以及磁颗粒表面修饰后对生物分子的快速固定化等特点，在生物与医学领域具有重要的应用前景。
[0007]基于磁性微粒的化学发光免疫分析法是将磁分离技术、免疫分析技术及化学发光检测技术三者有效结合在一起的新型的分析检测技术，因而具有化学发光的高灵敏度、免疫分析的强特异性、磁分离系统的快速分离的特点，此外，还具有检测时间短、线性范围宽、以及易实现自动化等优点，因此，近年来被广泛应用于临床诊断、生物医学、食品安全及毒品检测等众多方面。
[0008]对于特定的检测对象，基于磁性微粒(包括金磁微粒)的(吖啶酯化学发光)免疫分析法的建立需要进行大量的实验和分析研宄才有可能取得有意义的成果。这主要是因为不同检测对象的分子结构、分子量、生物活性以及稳定的保存环境等都不相同。建立该方法的难点和复杂之处在于，不同检测对象对检测方法、免疫反应条件、甚至检测体系中的各个成分配比、发光液成分等都有着不同的要求，通过大量实验确定最优的结果才能达到最佳检测范围和灵敏度；在磁性分离过程中不同磁场强度或磁分离时间都直接影响分离效果；此外在抗体标记过程中，不同抗体甚至不同抗体用量，都直接影响标记体系结果的好坏(主要体现在标记效率)，标记反应条件、纯化收集的条件、保存条件等都需要反复设计实验来确定。
【发明内容】
[0009]本发明提供了一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法，以解决上述【背景技术】检测HE4存在的局限性、特异性、灵敏性、危险性等问题。
[0010]为实现上述发明目的，本发明给出以下解决方案:
[0011]基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法，包括以下步骤:
[0012]⑴包被
[0013]以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将HE4包被抗体偶联在金磁微粒的表面；具体过程如下:
[0014](1.1)预处理:取金磁微粒，用平衡缓冲液清洗平衡I?3遍；
[0015](1.2)偶联:将HE4包被抗体与偶联缓冲液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在25-40°C，150?250rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；
[0016](1.3)清洗:用清洗缓冲液清洗3-5次，磁性分离，弃上清；
[0017](2)封闭
[0018]在步骤⑴的产物中加入封闭液，置于摇床中，在25_40°C条件下，以150?250rpm的转速反应I?2小时，封闭金磁微粒表面未与HE4包被抗体结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用；
[0019](3)抗体的标记
[0020](3.1)预处理:用洗脱缓冲液对脱盐柱进行平衡；
[0021 ] (3.2)抗体标记:取吖啶酯溶液和HE4标记抗体溶液，在标记缓冲液环境中进行标记反应，最后加入赖氨酸盐溶液再次进行反应；
[0022](3.3)纯化收集:将步骤(3.2)反应得到的抗体溶液上样脱盐柱，用洗脱缓冲液进行洗脱收集，通过收集物的发光值和抗体浓度筛选抗体纯化产物，即标记有吖啶酯的HE4抗体；
[0023](4)与待测物结合
[0024]将待检样品和能与HE4抗原发生特异性结合的标记有吖啶酯的HE4抗体，加入经过步骤(2)封闭后的结合有HE4包被抗体的金磁微粒中进行反应，待测样品中所含的HE4抗原被金磁微粒上的HE4包被抗体捕获，同时与吖啶醋标记HE4抗体结合，形成“双抗体夹心复合物”;
[0025](5)清洗
[0026]用清洗缓冲液清洗双抗体夹心复合物，磁性分离，弃上清；
[0027](6)化学发光检测
[0028]向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后立即测定待测各孔的发光强度；发光强度与待测样本的浓度成正比关系O
[0029]本发明还确立了以下优化环节和参数:
[0030]步骤(1.1)平衡缓冲液的较佳选择为以下缓冲液中的任一种:
[0031]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0032]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液、
[0033]步骤(1.2)偶联缓冲液选自以下缓冲液中的任一种:
[0034]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0035]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0036]步骤(1.3)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.05-0.2% (体积分数，下同)吐温的该种缓冲液:
[0037]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0038]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0039]步骤(2)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.05-0.2%吐温的该种缓冲液:
[0040]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0041]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0042]步骤(2)所述封闭液为牛血清白蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶或动物血清之中的任一种或其中2-3种的混合物，该封闭液的质量体积浓度(g/mL)为1-5% ;所述动物血清为胎牛血清或马血清，封闭剂配置缓冲溶液为偶联缓冲液；
[0043]所述封闭剂配置缓冲液选自以下缓冲液中的任一种:
[0044]ρΗ5.0?8.0， 浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0045]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0046]步骤⑵中采用的保存缓冲液选自以下缓冲液中的任一种:
[0047]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0048]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0049]步骤(3)中采用的洗脱缓冲液选自以下缓冲液含0.10-0.15M NaCl:
[0050]ρΗ5.0?7.0，浓度为0.05Μ?0.15Μ的磷酸盐(PBS)缓冲液；
[0051]步骤(3.2)中采用的标记缓冲液选自以下缓冲液含0.10-0.15Μ NaCl:
[0052]ρΗ7.0?10.0，浓度为0.05Μ?0.15Μ的磷酸盐(PBS)缓冲液；
[0053]步骤(5)所述清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或者还含0.05-0.2%吐温的该种缓冲液:
[0054]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0055]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液。
[0056]所述步骤(1.3)中采用含0.05%吐温的清洗缓冲液则效果最佳。
[0057]所述步骤⑵中采用含0.1%吐温的清洗缓冲液则效果最佳。
[0058]所述步骤(4)中采用含0.05%吐温的清洗缓冲液则效果最佳。
[0059]步骤(I)中采用的ΗΕ4单克隆抗体为Meridian、Hytest、或Abcam公司产品。
[0060]步骤(3.2)中，吖啶酯溶液浓度为0.05-lmM，HE4标记抗体的投入量为50-500 μ g。反应的条件具体为:取吖啶酯溶液和HE4标记抗体溶液，用标记缓冲液混合，置于摇床中，在20-25°C条件下，以150?250rpm的转速反应10?30分钟；加入赖氨酸盐溶液，再次置于摇床中，在20-25°C条件下，以150?250rpm的转速反应20?50分钟；采用的标记抗体是吖啶酯或吖啶磺酰胺类化学发光物质标记的鼠单克隆HE4抗体。
[0061]步骤(4)反应的条件为:将待检样品和吖啶酯标记的HE4抗体加入金磁微粒中，置于摇床，在25-40°C条件下，以150?250rpm的转速反应30?90分钟。
[0062]上述标记用吖啶酯类化学发光物质是4-(2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐、B丫啶酯-NSP-DMAE-NHS，或采用吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS。
[0063]步骤￠)中采用的化学发光底物是含有双氧水和氢氧化钠的溶液，或者在所述含有双氧水和氢氧化钠的溶液中还含有曲拉通-100和硝酸。具体操作过程中采用的化学发光底物可以分为使用前独立存在的发光激发液A和发光激发液B，其中发光激发液A中含有0.1% (体积分数)双氧水、0.05-0.5M硝酸，发光激发液B中含有0.25M氢氧化钠、
0.5% -5% (体积分数)的曲拉通-100。
[0064]本发明具有以下优点:
[0065]本发明以金磁微粒为载体，结合化学发光免疫检测系统，建立了基于金磁微粒的化学发光免疫学检测HE4的方法。使用的抗体为单克隆抗体，与抗原之间反应特异性好，有效避免交叉反应，且由于金磁微粒对蛋白质等大分子物质具有的高吸附能力，加之抗体、抗原免疫反应的高特异性，同时还兼具吖啶酯化学发光法的高灵敏度和标记物稳定、无污染的特点。在制备过程中不同步骤使用适当的缓冲溶液和PH值，使得抗体与固相载体之间有效结合，并有效进行位点封闭，避免的了非特异性反应的产生。
[0066]该方法检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好、无放射性污染，操作安全，方法简便快速。尤其在检测灵敏度、特异性、准确度及精密度方面均比酶参与的免疫检测有显著提高。
【附图说明】
[0067]图1是本发明吖啶醋标记抗体的原理示意图；
[0068]图2是实施例一中本发明抗体标记洗脱组分的吖啶酯发光值和抗体浓度检测结果;
[0069]图3是实施例一中本发明定量检测HE4的标准曲线。
【具体实施方式】
[0070]以下实施例对本发明的方案以具体实验操作的形式示例，其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限；本领域技术人员应当能够基于本发明的原理在合理的范围内确定实验条件和设定参数，仍可实现本发明的发明目的。
[0071]实施例一:一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法
[0072](I)包被
[0073](1.1)预处理:取 10mg/ml 的金磁微粒 100 μ 1，用 ρΗ7.4,0.02Μ Tris-HCl 平衡缓冲液200 μ I清洗2次，平衡磁粒的pH。
[0074](1.2)偶联:将 50 μ g 的 HE4 包被抗体溶解于 200 μ I ρΗ7.4，0.02Μ Tris-HCl 偶联缓冲液中，混匀后加入预处理过的金磁微粒中，于37°C，180rpm，摇床中反应30min。反应完毕后取出，磁性分离，弃上清。
[0075](1.3)清洗:加入300 μ I ρΗ7.4，含0.05%吐温-20的0.0lM PBS清洗缓冲液，磁性分离，弃上清，清洗3次。
[0076](2)封闭:向上述反应后的金磁微粒中加入Iml含5%脱脂奶粉和2%胎牛血清的pH7.4,0.0lM PBS缓冲液中，于37°C，180rpm，摇床中反应2h，磁性分离，弃上清。用ImlpH7.4，含0.1 %吐温-20的0.0lM PBS缓冲液清洗3次，磁粒悬于Iml pH7.4的含I %牛血清白蛋白的0.0lM PBS的保存缓冲液中，4°C备用。
[0077](3)抗体的标记:
[0078](3.1)预处理:将G-25葡聚糖凝胶脱盐柱用25mL洗脱缓冲液进行平衡。
[0079](3.2) 口丫啶酯的标记:取250 μ g的HE4抗体，加入0.5mM的吖啶醋(4- (2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐)溶液50μ1，加入pH8.0的含0.15ΜNaCL的0.1M PBS标记缓冲液使总反应体积为1000 μ 1，避光于25°C，180rpm，摇床中反应20min。反应完毕后取出，加入10%的赖氨酸盐溶液100 μ 1，继续避光于25°C，180rpm，摇床中反应30min。
[0080](3.3)过柱纯化:将上述反应物上样在已经平衡好的G-25脱盐柱中，用pH 6.3的含0.15M NaCL的0.1M PBS洗脱缓冲液进行洗脱并收集，洗脱速度为120drops/min，用
1.5mL试管收集洗脱液，每管收集500 μ I共收集24管，并对收集管内洗脱组分的发光值和抗体浓度进行测定，结果如图2所示，收集第4、5、6管混合作为标记有吖啶酯的ΗΕ4抗体，加入I %牛血清白蛋白和50%甘油于-20°C保存备用。
[0081](4)与待测物结合:取出包被有HE4抗体的金磁微粒，于室温下平衡15min，取出发光检测试管，依次加入上述金磁微粒30 μ 1、待测样本(0ng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、
1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml)各 100 μ 1、50 倍稀释的标记有吖啶酯的HE4抗体100 μ 1，置摇床中37°C，180rpm，反应40min，形成双抗体夹心复合物。
[0082](5)清洗:取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用pH7.4含0.05%吐温-20的
0.0lM PBS清洗缓冲液清洗3次，磁性分离，弃上清。
[0083](6)化学发光检测:向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物的金磁微粒，加入0.1M HNO3,0.1 % H2O2发光激发液A 100 μ 1，立即放入化学发光免疫检测仪内，调整仪器自动加入0.25Μ NaOH, 2% Triton-100发光激发液BlOO μ 1，检测累计时间15s，检测各孔的发光强度(RLU)，其发光强度与待测样本浓度关系如图3所示，在0.3ng/ml?25ng/ml的范围内线性较好，最低检出限可达0.069ng/mlo
[0084]结论:在抗体的吖啶 酯标记中，被吖啶酯标记上的HE4抗体约占总投入的抗体的69.77%，并且标记效率高达1.92，即每分子抗体上平均标记有1.92个吖啶酯分子；
[0085]该基于金磁微粒的化学发光检测HE4方法的浓度-发光值标准曲线显示，在
0.05ng/ml?25ng/ml的范围内具有良好线性，且通过计算后最低检测限可达0.069ng/ml。
[0086]实施例二:一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法
[0087](I)包被
[0088](1.1)预处理:取10mg/ml的金磁微粒100 μ 1，用ρΗ7.4的0.0lM磷酸盐(PBS)平衡缓冲液200 μ I清洗2次，平衡磁粒的pH。
[0089](1.2)偶联:将50 μ g的HE4包被抗体溶解于200 μ I ρΗ7.4的0.0lM磷酸盐(PBS)偶联缓冲液中，混匀后加入预处理过的金磁微粒中，于37°C，180rpm，摇床中反应30min。反应完毕后取出，磁性分离，弃上清。
[0090](1.3)清洗:加入300 μ I ρΗ7.4，含0.05%吐温-20的0.0lM PBS清洗缓冲液，磁性分离，弃上清，清洗3次。
[0091](2)封闭:向上述反应后的金磁微粒中加入Iml含5%脱脂奶粉和2%牛血清白蛋白的pH7.4，0.01M PBS缓冲液中，于37°C，180rpm，摇床中反应2h，磁性分离，弃上清。用Iml ρΗ7.4，含0.1 %吐温-20的0.0lM PBS缓冲液清洗3次，磁粒悬于Iml ρΗ7.4的含I %牛血清白蛋白的0.0lM PBS的保存缓冲液中，4°C备用。
[0092](3)抗体的标记:
[0093](3.1)预处理:将G-25葡聚糖凝胶脱盐柱用25mL洗脱缓冲液进行平衡。
[0094](3.2) 口丫啶酯的标记:取500 μ g的HE4抗体，加入0.1mM的吖啶醋(4- (2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐)溶液50μ1，加入pH8.0的含0.15ΜNaCL的0.1M PBS标记缓冲液使总反应体积为1000 μ 1，避光于25°C，180rpm，摇床中反应30min。反应完毕后取出，加入10%的赖氨酸盐溶液100 μ 1，继续避光于25°C，180rpm，摇床中反应40min。
[0095](3.3)过柱纯化:将上述反应物上样在已经平衡好的G-25脱盐柱中，用pH6.3的含0.15M NaCL的0.1M PBS洗脱缓冲液进行洗脱并收集，洗脱速度为120drops/min，用
1.5mL试管收集洗脱液，每管收集500 μ I共收集24管，并对收集管内洗脱组分的发光值和抗体浓度进行测定，收集第4、5、6管混合作为标记有吖啶酯的ΗΕ4抗体，加入1%牛血清白蛋白和50%甘油于-20°C保存备用。
[0096](4)与待测物结合:取出包被有HE4抗体的金磁微粒，于室温下平衡15min，取出发光检测试管，依次加入上述金磁微粒30 μ 1、待测样本(0ng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、
1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml)各 100 μ 1、50 倍稀释的标记有吖啶酯的HE4抗体100 μ 1，置摇床中37°C，180rpm，反应50min，形成双抗体夹心复合物。
[0097](5)清洗:取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用pH7.4含0.05%吐温-20的0.0lM PBS清洗缓冲液清洗3次，磁性分离，弃上清。
[0098](6)化学发光检测:向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物的金磁微粒，加入0.3M HNO3,0.1 % H2O2发光激发液A 100 μ 1，立即放入化学发光免疫检测仪内，调整仪器自动加入0.25Μ NaOH，0.5% Triton-100发光激发液B ΙΟΟμΙ，检测累计时间15s，检测各孔的发光强度(RLU)，其发光强度与待测样本浓度关系在一定范围成正比，其中在0.3ng/ml?25ng/ml的范围内线性较好，最低检出限可达0.086ng/ml。
[0099]结论:在抗体的吖啶酯标记中，被吖啶酯标记上的HE4抗体约占总投入的抗体的63.51%，并且标记效率高达1.83，即每分子抗体上平均标记有1.83个吖啶酯分子；
[0100]该基于金磁微粒的化学发光检测HE4方法的浓度-发光值标准曲线显示，在
0.05ng/ml?25ng/ml的范围内具有良好线性，且通过计算后最低检测限可达0.086ng/ml。
[0101]实施例三:一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法
[0102](I)包被
[0103](1.1)预处理-M 10mg/ml 的金磁微粒 100 μ 1，用 pH8.0,0.1M Tris-HCl 平衡缓冲液200 μ I清洗2次，平衡磁粒的pH。
[0104](1.2)偶联:将 50 μ g 的 HE4 包被抗体溶解于 200 μ I ρΗ8.0,0.1M Tris-HCl 偶联缓冲液中，混匀后加入预处理过的金磁微粒中，于37°C，180rpm，摇床中反应30min。反应完毕后取出，磁性分离，弃上清。
[0105](1.3)清洗:加入 300 μ I ρΗ7.4，含 0.05%吐温-20 的 0.1M Tris-HCl 清洗缓冲液，磁性分离，弃上清，清洗3次。
[0106](2)封闭:向上述反应后的金磁微粒中加入Iml含5%脱脂奶粉和2%胎牛血清的pH8.0,0.1M Tris-HCl缓冲液中，于37°C，180rpm，摇床中反应2h，磁性分离，弃上清。用ImlpH7.4，含0.1 %吐温-20的0.0lM PBS缓冲液清洗3次，磁粒悬于Iml pH7.4的含I %牛血清白蛋白的0.0lM PBS的保存缓冲液中，4°C备用。
[0107](3)抗体的标记:
[0108](3.1)预处理:将G-25葡聚糖凝胶脱盐柱用25mL洗脱缓冲液进行平衡。
[0109](3.2)吖啶酯的标记:取250 μ g的HE4抗体，加入0.5mM的吖啶酯(吖啶酯-NSP-DMAE-NHS)溶液50 μ 1，加入ρΗ9.0的含0.10Μ NaCL的0.15Μ PBS标记缓冲液使总反应体积为1000 μ 1，避光于25°C，180rpm，摇床中反应20min。反应完毕后取出，加入10%的赖氨酸盐溶液100 μ 1，继续避光于25°C，180rpm，摇床中反应30min。
[0110](3.3)过柱纯化:将上述反应物上样在已经平衡好的G-25脱盐柱中，用pH5.8的含0.10M NaCL的0.15M PBS洗脱缓冲液进行洗脱并收集，洗脱速度为120drops/min，用
1.5mL试管收集洗脱液，每管收集500 μ I共收集24管，并对收集管内洗脱组分的发光值和抗体浓度进行测定，收集第4、5、6管混合作为标记有吖啶酯的ΗΕ4抗体，加入1%牛血清白蛋白和50%甘油于-20°C保存备用。
[0111](4)与待测物结合:取出包被有HE4抗体的金磁微粒，于室温下平衡15min，取出发光检测试管，依次加入上述金磁微粒30 μ 1、待测样本(0ng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、
1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml)各 100 μ 1、50 倍稀释的标记有吖啶酯的HE4抗体100 μ 1，置摇床中37°C，180rpm，反应40min，形成双抗体夹心复合物。
[0112](5)清洗:取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用pH8.0含0.05%吐温-20的0.1M Tris-HCl清洗缓冲液清洗3次，磁性分离，弃上清。
[0113](6)化学发光检测:向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物的金磁微粒，加入0.1M HNO3,0.1 % H2O2发光激发液A 100 μ 1，立即放入化学发光免疫检测仪内，调整仪器自动加入0.25Μ NaOH, 2% Triton-100发光激发液BlOO μ I，检测累计时间15s，检测各孔的发光强度(RLU)，其发光强度与待测样本浓度关系在一定范围内成正比，在0.3ng/ml?25ng/ml的范围内线性较好，最低检出限可达0.12ng/ml。
[0114]结论:在抗体的吖啶酯标记中，被吖啶酯标记上的HE4抗体约占总投入的抗体的72.53%，并且标记 效率高达1.73，即每分子抗体上平均标记有1.73个吖啶酯分子；
[0115]该基于金磁微粒的化学发光检测HE4方法的浓度-发光值标准曲线显示，在0.05ng/ml?25ng/ml的范围内具有良好线性，且通过计算后最低检测限可达0.12ng/ml。
【主权项】
1.一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，包括以下步骤: (1)包被 以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将HE4包被抗体偶联在金磁微粒的表面；具体过程如下: (1.D预处理:取金磁微粒，用平衡缓冲液清洗平衡I?3遍； (1.2)偶联:将HE4包被抗体与偶联缓冲液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在25-40°C，150?250rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清； (1.3)清洗:用清洗缓冲液清洗3-5次，磁性分离，弃上清； (2)封闭 在步骤(I)的产物中加入封闭液，置于摇床中，在25-40°C条件下，以150?250rpm的转速反应I?2小时，封闭金磁微粒表面未与HE4包被抗体结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用； (3)抗体的标记 (3.1)预处理:用洗脱缓冲液对脱盐柱进行平衡； (3.2)抗体标记:取吖啶酯溶液和HE4标记抗体溶液，在标记缓冲液环境中进行标记反应，最后加入赖氨酸盐溶液再次进行反应； (3.3)纯化收集:将步骤(3.2)反应得到的抗体溶液上样脱盐柱，用洗脱缓冲液进行洗脱收集，通过收集物的发光值和抗体浓度筛选抗体纯化产物，即标记有吖啶酯的HE4抗体； (4)与待测物结合 将待检样品和能与HE4抗原发生特异性结合的标记有吖啶醋的HE4抗体，加入经过步骤(2)封闭后的结合有HE4包被抗体的金磁微粒中进行反应，待测样品中所含的HE4抗原被金磁微粒上的HE4包被抗体捕获，同时与吖啶醋标记HE4抗体结合，形成“双抗体夹心复合物”； (5)清洗 用清洗缓冲液清洗双抗体夹心复合物，磁性分离，弃上清； (6)化学发光检测 向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后立即测定待测各孔的发光强度；发光强度与待测样本的浓度成正比关系。2.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 步骤(1.D平衡缓冲液选自以下缓冲液中的任一种: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 ΡΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液、 步骤(1.2)偶联缓冲液选自以下缓冲液中的任一种: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 ΡΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；步骤(1.3)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.05-0.2%吐温的该种缓冲液: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 ΡΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；步骤(2)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.05-0.2%吐温的该种缓冲液: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 ΡΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；步骤(2)所述封闭液为牛血清白蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶或动物血清之中的任一种或其中2-3种的混合物，该封闭液的质量体积浓度(g/mL)为1-5% ;所述动物血清为胎牛血清或马血清，封闭剂配置缓冲溶液为偶联缓冲液； 所述封闭剂配置缓冲液选自以下缓冲液中的任一种: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 ΡΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液； 步骤⑵中采用的保存缓冲液选自以下缓冲液中的任一种: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 ΡΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；步骤(3)中采用的洗脱缓冲液为:ρΗ5.0?7.0，浓度为0.05Μ?0.15Μ的磷酸盐(PBS)缓冲液，其中还含有0.10-0.15Μ NaCl ； 步骤(3.2)中采用的标记缓冲液为:ρΗ7.0?10.0，浓度为0.05Μ?0.15Μ的磷酸盐(PBS)缓冲液，其中还含有0.10-0.15Μ NaCl ； 步骤(5)所述清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或者还含0.05-0.2%吐温的该种缓冲液: ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、 pH 7.0?9.0，浓度为0.005M?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液。3.根据权利要求2所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 所述步骤(1.3)中的清洗缓冲液是含0.05%吐温的该种缓冲液； 所述步骤(2)中的清洗缓冲液是含0.1 %吐温的该种缓冲液； 所述步骤(5)中的清洗缓冲液是含0.05%吐温的该种缓冲液。4.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 步骤(I)中采用的HE4单克隆抗体为Meridian、Hytest、或Abcam公司产品。5.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 步骤(3.2)中，卩丫啶酯溶液浓度为0.05-lmM，HE4标记抗体的投入量为50-500 μ g。6.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 步骤(3.2)反应的条件为:取吖啶酯溶液和HE4标记抗体溶液，用标记缓冲液混合，置于摇床中，在20-25°C条件下，以150?250rpm的转速反应10?30分钟；加入赖氨酸盐溶液，再次置于摇床中，在20-25°C条件下，以150?250rpm的转速反应20?50分钟；HE4抗体标记采用的标记物是吖啶酯类化学发光物质或吖啶磺酰胺类化学发光物质； 步骤(4)反应的条件为:将待检样品和吖啶酯标记的HE4抗体加入金磁微粒中，置于摇床，在25-40°C条件下，以150?250rpm的转速反应30?90分钟。7.根据权利要求6所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 所述吖啶酯类化学发光物质为4-(2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐、B丫啶酯-NSP-DMAE-NHS，所述吖啶磺酰胺类化学发光物质为吖啶磺酰胺NSP-SA-NHSo8.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 步骤￠)中采用的化学发光底物是含有双氧水和氢氧化钠的溶液，或者在所述含有双氧水和氢氧化钠的溶液中还含有曲拉通-100和硝酸。9.根据权利要求8所述的基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，其特征在于: 步骤(6)中采用的化学发光底物包括使用前独立存在的发光激发液A和发光激发液B，其中发光激发液A中含有0.1 %双氧水、0.05-0.5M硝酸，发光激发液B中含有0.25M氢氧化钠、0.5% -5%的曲拉通-100。
【专利摘要】本发明提供了一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法，主要包括以下步骤：(1)以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将HE4包被抗体偶联在金磁微粒的表面；(2)用封闭液封闭金磁微粒表面未与HE4包被抗体结合的空白位点；(3)用吖啶酯(AE)对HE4标记抗体进行标记；(4)将待检样品和能与HE4抗原发生特异性结合吖啶酯标记的HE4抗体加入封闭后的包被有HE4抗体的金磁微粒中进行反应，形成双抗体夹心复合物；(5)清洗；(6)化学发光检测。本发明检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好、无放射性污染、操作安全、方法简便快速。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/68, G01N21/76, G01N33/543
【公开号】CN104897901
【申请号】CN201510240537
【发明人】马乐, 郭博阳, 崔亚丽
【申请人】西安金磁纳米生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
最新回复(0)