一种羧基微球标记蛋白的方法
一种羧基微球标记蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫诊断试剂盒制备技术领域，具体地，涉及一种新的、成本低、操作 简便的羧基微球标记蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 纳米微球被广泛地应用于体外诊断试剂中，极大地提高了试剂的灵敏度，可以检 测到样本含量极微的物质。纳米微球在诊断试剂中作为载体，大小均一，微球表面包被抗 体、抗原等蛋白分子，蛋白分子吸附到纳米微球上，方法有两种：物理吸附和化学偶联。物理 吸附是比较传统有效的方法，但是其也有对体系变化敏感，稳定性差的缺点；化学偶联可以 避免这些缺陷。化学偶联狭义上是指利用市售的活性交联剂，把蛋白和纳米微球通过化学 反应连接在一起，一旦连接成功，纳米微球会非常稳定。
[0003] 用于化学偶联的纳米微球表面会被修饰一些化学基团，譬如羧基、氨基、羟基等， 其中羧基微球应用比较广泛。把羧基活化，进一步与抗体等蛋白分子交联，目前普遍的方法 有两种：一步法，是指在合适条件下，把交联剂碳二亚胺（EDC)、羧基微球和蛋白分子三种 成分混合在一起，反应1个小时以上，再终止反应，离心或者切向流过滤等方法把羧基微球 分离出来；两步法，引入了另外一种试剂，即N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)或Sulfo-NHS，具体 操作为先在羧基微球中同时加入EDC和NHS或Sulfo-NHS，室温活化5~20min，再通过离 心或切向流过滤等方法去掉多余的EDC和NHS或Sulfo-NHS，然后用pH7~9的缓冲液重 悬，加入抗体室温反应3h以上，再通过离心或切向流过滤等方法把偶联了蛋白分子的羧基 微球分离出来，用合适的缓冲液重悬储存。
[0004] 一步法的优点是操作简单，利用EDC作为交联剂，虽然比较简便，但是这种方法不 可控，最终产物除了目的产物外，可能还会有大量的多个抗体自连产物，这样不仅浪费抗 体，还大大降低了反应率。二步法是利用EDC和NHS或Sulfo-NHS作为交联剂，因为反应是 分步进行，第一步活化羧基，洗涤微球后再加入抗体，所以反应的方向是一定的，具有可控 性，活化后洗涤微球最常用有两种方法，一是离心，这种方法不仅费时费力，而且高速离心 过程中微球的距离越来越近，表面电荷相互作用，可能会导致微球的自连沉淀，严重影响偶 联的效率；二是切向流过滤，这种方法不会导致胶乳沉淀，但是其耗时较长，影响第二步反 应的效率；如果是磁性羧基微球，则比较方便，可以使用磁性分离系统洗涤微球。两种化学 偶联的方法的共同缺点是对反应条件的要求比较苛刻，比如一步法必须在偏酸性环境下反 应，两步法的第一步必须在偏酸性环境下，第二步最好在偏碱性环境下。因此本领域迫切需 要一种偶联反应可控、有效，操作简便的羧基微球偶联蛋白的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种操作简便、成本低、用时少、偶联效率高的羧基微球标 记蛋白的方法。
[0006] 本发明提供的一种羧基微球标记蛋白的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)将羧基微球溶于活化液中，所述活化液为10~50mM MES，pH 5. 0~7. 0 ;
[0008] (2)按照EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比0? 8~2:1，向步骤（1)的体系中 加入EDC ;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌；
[0009] (3)立即调节步骤⑵体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白， 搅拌；
[0010] (4)使微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为10~50mM Tris，0. 1 ~1% BSA，0. 1% NaN3, pH 7. 0 ~8. 0〇
[0011] 本发明所述的羧基微球为羧基胶乳微球或羧基磁性微球。
[0012] 本发明方法步骤（1)中，羧基微球溶于活化液的终浓度为0. 5%~1%，所述％为 质量百分比。
[0013] 本发明方法步骤（2)搅拌时间为10~20min。搅拌方法可以为磁珠搅拌，也可以 为玻棒搅拌。
[0014] 优选地，本发明方法步骤（2)中，EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比为1:1， EDC :NHS 或 Sulfo-NHS 的摩尔比为 1:1。
[0015] 本发明方法步骤（3)加入待标记蛋白后使其终浓度为0. 1~lmg/mL。
[0016] 本发明所述的胶乳微球，直径大小为50~200nm，表面羧基含量为0. 1~ 0. 3mmol/g，大小均一。
[0017] 本发明所述的待标记蛋白可以为抗原、抗体、亲和素等其他应用于生物技术领域 的诊断、检测用蛋白。待标记蛋白的初始浓度5~1 Omg/mL。
[0018] 本发明方法步骤（3)搅拌时间为2~4h。
[0019] 本发明方法步骤（4)用储存液重悬胶乳颗粒使其终浓度为0. 5%~1%，所述％为 质量百分比。
[0020] 步骤（4)中的分离方法可采用离心或者切向流过滤方法是胶乳颗粒与未连接的 抗原、抗体或其他待标记的蛋白分离。
[0021] 本发明提供了上述方法在制备适用于免疫比浊法的抗原或抗体检测试剂盒中的 应用。
[0022] 本发明还提供了一种以羧基胶乳微球为载体的检测试剂盒，含有R1试剂和R2试 剂，
[0023] 其中R1试剂为：在10~50mM Tris，pH值为7~9的缓冲液中加入终浓度为2. 5% 的NaCl、0. 5%的Tween-20,搅拌均匀即得；
[0024]R2试剂通过以下方法制备得到：
[0025] (1)将羧基胶乳微球溶于活化液中，所述活化液为10~50mM MES，pH 5. 0~7. 0;
[0026] (2)按照EDC与羧基胶乳微球表面羧基含量的摩尔比0.8~2:1，向步骤⑴的体 系中加入EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌；
[0027] (3)立即调节步骤⑵体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白， 搅拌；
[0028] (4)使微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为10mM Tris， 0. 1% BSA,0. 1% NaN3, pH 7. 5〇
[0029] 进一步地，R2试剂制备方法的步骤（2)中，EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比 为 1:1，EDC :NHS 或 Sulfo-NHS 的摩尔比为 1:1。
[0030] 进一步地，R2试剂制备方法的步骤（3)中，立即调节步骤（2)体系的pH值为9. 5。
[0031] R2试剂制备方法的步骤（4)中，用储存液重悬胶乳微球使其终浓度为0. 05 %~ 〇. 1%，所述％为质量百分比。
[0032] 本发明还提供一种以羧基磁性微球为载体的检测试剂盒，含有磁微粒分离试剂， 所述磁微粒分离试剂是通过以下方法制备得到的：
[0033] (1)将羧基磁性微球溶于活化液中，所述活化液为10~50mM MES，pH 5. 0~7. 0;
[0034] (2)按照EDC与羧基磁性微球表面羧基含量的摩尔比0? 8~2:1，向步骤（1)的体 系中加入EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌；
[0035] (3)立即调节步骤⑵体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白， 搅拌；
[0036] (4)使羧基磁性微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为10mM Tris,0. 1% BSA,0. 1% NaN3, pH 7. 5〇
[0037] 优选地，步骤（2)EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比为1:1，EDC:NHS或 Sulfo-NHS的摩尔比为1:1。
[0038] 步骤（4)中，用储存液重悬胶乳微球使其终浓度为0. 05%~0. 1%，所述％为质量 百分比。
[0039] 在本发明的一个实施例中，偶联的待标记蛋白为链霉亲和素。将偶联了链霉亲和 素的羧基磁性微球用10mM Tris，0. 1 % BSA，0. 1 % NaN3, pH 7. 50的溶液稀释到0. 01 %。
[0040] 本发明的羧基微球标记蛋白的方法具有以下优点及有益效果：
[0041] (1)操作简便，实现羧基微球与待标记蛋白的高效偶联。
[0042] (2)通过加入合适比例的交联剂，使微球表面的羧基数量和活化的羧基数量处于 最佳比例，有利于蛋白标记和应用于胶乳免疫比浊试剂盒中。
[0043] (3)通过调节pH值使得反应体系快速从利于活化的条件转为利于蛋白标记的状 态，且针对传统的两步法进行了改进，对于羧基胶乳微球，传统的两步法通过离心等方法洗 涤微球后再加待标记蛋白进行反应，而本发明方法在加入待标记蛋白前，省去了离心或切 向流过滤的步骤，避免了胶乳颗粒沉淀和活化的中间产物水解；对于羧基磁性微球，传统的 两步法通过磁性分离系统洗涤微球后再加待标记蛋白进行反应，而本发明省去了洗涤这一 个步骤，节约了时间，在活化中间产物半衰期之内尽快进行下一步反应。
[0044] (4)与现有技术的微球标记方法相比，经过本发明方法能够有效降低试剂的用量， 节省了成本。
【附图说明】
[0045] 图1为根据BSA蛋白标准作的标准曲线。
[0046]图2为采用本发明实施例2制得的试剂盒对6种不同浓度标准品检测结果作的标 准曲线图。
[0047] 图3为采用本发明实施例4制得的试剂盒检测结果的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0048] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0049] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段； 实施例中所用的试剂为市售商品。本发明实施例所述的活化液为10~50mM MES，pH5. 0~ 7. 0 ;所述储存液为 10mM Tris，0. 1% BSA，0. 1% NaN3, pH 7. 5。
[0050] 实施例1羧基胶乳微球标记胱抑素C抗体
[0051] 胱抑素C抗体为东方酵母公司产品，多抗，浓度为15mg/mL。该抗体仅与人胱抑素 C反应，与其他抗原无交叉免疫反应，基本满足本试验所需。胶乳微球为JSR公司产品，粒 径为61nm，羧基含量为0. 190mmol/g，浓度为5. 2%，溶液为0. 09%叠氮化钠的纯化水。EDC 和NHS为Pierce公司产品。
[0052] 胶乳微球用10mM MES，pH 6. 00的活化液配制成0. 5%的溶液，搅拌均匀，根据胶 乳颗粒表面的羧基含量，按照摩尔比EDC:NHS: -C00H = 1:1:1的比例，计算所需EDC和NHS 的量，称取后直接加入到胶乳微球溶液中，边加边搅拌，室温搅拌反应15min。立即用NaOH 调节胶乳颗粒溶液pH值为9. 80,随即加入用活化液稀释了浓度为5mg/mL的胱抑素C抗 体，使抗体终浓度为〇. 5mg/mL，边加边搅拌，室温搅拌反应3h。反应完成后，离心清洗胶乳 颗粒，最后使连接有胱抑素C抗体的胶乳微球保存在10mM Tris，0. 1% BSA，0. 1% NaN3, pH 7. 50的溶液中，微球浓度为0. 5%，可以长期保存。
[0053] 可以通过测定离心后上清中的胱抑素C抗体剩余量来测定抗体的偶联 效率。离心 后上清用透析袋透析24小时，透析液为0. 1M PBS缓冲液，期间换4次透析液，透析完成后， 4 °C保存备用。
[0054] 称取5mg BSA，溶于5mL的0? 1M PBS溶液中，浓度为lmg/mL。根据表1制备BSA 梯度标准溶液。
[0055] 表1 BSA浓度梯度标准溶液的制备
[0057]在紫外可见分光光度计波长280nm处测定BSA浓度梯度标准溶液的0D值，根据 0D280nm-BSA标准溶液的终浓度作标准曲线，见图1。同时测定透析后上清液的0D280nm值， 计算上清液的蛋白浓度。上清液的测定结果为：〇D280nm = 0. 064,计算得到的蛋白浓度为： (0.064+0. 002)/0? 55 = 0? 12mg/mL，即偶联效率为：（0.5-0. 12)/0? 5*% = 76%。
[0058]实施例2胱抑素C的测定试剂盒的制备与应用
[0059] (1)制备R2试剂。
[0060] 把连接好胱抑素C抗体的胶乳颗粒（即实施例1制得的羧基微球标记胱抑素C抗 体）用 10mM Tris，0. 1% BSA，0. 1% NaN3, pH7. 50 的溶液稀释到 0? 05%，制成 R2 试剂。
[0061] (2)制备R1试剂。
[0062] 在10mM Tris，pH值为8. 5的缓冲液中加入终浓度为2. 5%的NaCl、0. 5%的 Tween-20，搅拌均匀，即为试剂R1。
[0063] (3)标准品的制备
[0064] 将胱抑素C纯品溶解在10mM Tris，0. 1 % BSA，0. 1 % NaN3, pH 7. 50的溶液中，制 成梯度浓度约为〇、〇. 5、l、2、4、8mg/L的标准品。
[0065] 试剂Rl、R2和标准品构成胱抑素C的测定试剂盒。
[0066] (4)胱抑素C的测定试剂盒检测的线性试验
[0067] 仪器：岛津紫外分光光度计；检测波长：570nm，比色杯光径：1cm。
[0068] 检测方法：取3 y L的标准品，分别加入到160 y L R1试剂，混匀室温放置5min，然 后再加入40 y L R2试剂，读取30~50秒和4~5分钟的0D570,绘制标准曲线，检测数据 见表1，标准曲线见图1。表1中的样品ID指标准品的6个点。
[0069] 从表2可以看出来，当胱抑素C浓度约为lmg/mL时，0D570的变化率为0. 0142,在 0. 1~0. 5范围之内，符合要求。
[0070] 从图2可以看出来，标准曲线的R2= 0. 994,也是符合要求的。
[0071] 表2胱抑素C梯度浓度在0~5min的变化率
[0073]实施例3羧基磁性微球偶联链霉亲和素
[0074] 磁性微球是merck公司产品，粒径0? 5~2 ym，羧基含量为78 ymol/g，浓度为 10 %，溶液为0. 09 %叠氮化钠的纯化水；链霉亲和素是Thermo公司产品，为冻干粉；EDC和 NHS为Pierce公司产品。
[0075] 磁性微球用20mMMES，pH5. 80的活化液配制成1 %的溶液，搅拌均匀，根据磁性 微球表面的羧基含量，按照摩尔比EDC:NHS:-C00H= 1:1:1的比例，计算所需EDC和NHS的 量，称取后直接加入到磁性微球溶液中，边加边搅拌，室温搅拌反应15min。立即用NaOH调 节磁性微球溶液pH值为8. 5,随即加入事先用纯化水溶解的链霉亲和素，使链霉亲和素终 浓度为〇. 5mg/mL，边加边搅拌，室温搅拌反应3h。反应完成后，利用磁性分离系统清洗磁 性微球，最后使连接有链霉亲和素的磁性微球保存在10mM Tris，0. 1%BSA，0.1%NaN3, pH 7. 50的溶液中，微球浓度为1%，可以长期保存。
[0076]参照实施例1的方法处理分离磁性微球后的上清液后，用于测定未连接上的蛋白 含量，标准蛋白曲线可以利用图1。上清液的测定结果为：〇D280nm = 0. 042,计算得到的蛋 白浓度为：（〇? 042+0. 002)/0? 55 = 0? 08mg/mL，即偶联效率为：（0? 5-0. 08)/0? 5*% = 84% [0077]实施例4游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒的制备与应用 [0078] (1)制备磁微粒分离试剂。
[0079] 把连接好链霉亲和素的磁性微球（即实施例3制得的羧基磁性微球标记链霉亲和 素）用10mM Tris，0. 1% BSA，0. 1% NaN3, pH7. 50的溶液稀释到0. 01%，制成磁分离试剂。
[0080] (2)制备抗体试剂。
[0081] 将生物素标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗体用0. 1M Tris，0. 5% BSA，0. 1% Tween-20,0. 1%NaN3,pH 8. 0 缓冲液稀释成终浓度为 25ng/mL。
[0082] (3)酶标试剂的制备
[0083] 将碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸用0. 1M Tris，0. 5% BSA，0. 1% Tween-20,0. 1% NaN3, pH 8. 0缓冲液稀释成终浓度为12ng/mL。
[0084] (4)标准品的制备
[0085] 称量抗原lmg溶于1mlDMS0中，搅拌混勾，即lmg/ml，此为一级母液，吸取一级母 液5 yL溶于5mlDMS0中，搅拌混匀，此即为抗原母液。在10mL的10mMTris，0.1%BSA， 0? 1%NaN3,pH 7. 50 的溶液中，分别加入 0? 000、0? 006、0. 013、0. 026、0. 052、0. 086mL 抗原 母液，搅拌均匀，制成系列浓度为〇、l. 5、3、6、12、20pg/mL的标准品。
[0086] 磁分离试剂、抗体试剂、酶标试剂和标准品构成游离三碘甲状腺原氨酸定量检测 试剂盒。
[0087] (5)游离三碘甲状腺原氨酸定量检测试剂盒的线性试验
[0088] 仪器：倍爱康半自动免疫发光分析仪；底物是深圳美凯特公司产品。检测方法： 所有试剂，缓冲液平衡到室温。准备好磁板架，试管。往所有试管中加入30 yL游离三碘 甲状腺原氨酸标准品或待测血清，50 y L抗体试剂，混合均匀后盖上薄膜，37°C恒温箱孵育 15min。往所有试管中加入50 y L酶标试剂，30 y L磁性分离试剂，混合均匀后盖上薄膜， 37°C恒温箱孵育15min。取出试管架，装上磁板，沉淀lmin，弃去试管中液体，在滤纸上排干 残余水分。加入300 y L洗液，充分振荡20s，沉淀lmin，弃去试管中液体，在滤纸上排干残 余水分。再重复洗涤2次。洗完后每管加入底物200 yL。在化学发光分析仪上检测每个试 管的RLU值。标准曲线见图3,可见0~20.0 pg/mL测量范围内，相关系数r = 0. 9978,完 全满足要求。
[0089] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种羧基微球标记蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将羧基微球悬于活化液中，所述活化液为10~50mMMES，pH5.O~7.O; (2) 按照EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比0.8~2:1，向步骤⑴的体系中加入 EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌； (3) 立即调节步骤（2)体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白，搅拌； (4) 使微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为IOmMTris，0. 1% BSA,0.I%NaN3,pH7. 5〇2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，羧基微球溶于活化液的终浓 度为0.5%~1%，所述％为质量百分比。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)搅拌时间为10~20min。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)加入待标记蛋白后使其终浓度为 0? 1 ~lmg/mL〇5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)搅拌时间为2~4h。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4)用储存液重悬胶乳颗粒使其终浓 度为0.5%~1%，所述％为质量百分比。7. 权利要求1~6任一所述的方法在制备适用于免疫比浊法或化学发光法的抗原或抗 体检测试剂盒中的应用。8. -种以羧基胶乳微球为载体的检测试剂盒，其特征在于，含有Rl试剂和R2试剂， 其中Rl试剂为：在IOmMTris，pH值为7~9的缓冲液中加入终浓度为2. 5%的NaCl、 0? 5%的Tween-20,搅拌均匀即得； R2试剂通过以下方法制备得到： (1) 将羧基胶乳微球悬于活化液中，所述活化液为10~50mMMES，pH5. 0~7. 0 ; (2) 按照EDC与羧基胶乳微球表面羧基含量的摩尔比0.8~2:1，向步骤（1)的体系中 加入EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌； (3) 立即调节步骤（2)体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白，搅拌； (4) 使微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为IOmMTris，0. 1% BSA,0.I%NaN3,pH7. 5〇9. 如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，R2试剂制备方法的步骤（2)中，EDC与羧 基微球表面羧基含量的摩尔比为I:I，EDS:NHS或Sulfo-NHS的摩尔比为1:1。10. -种以羧基磁性微球为载体的检测试剂盒，其特征在于，含有磁微粒分离试剂，所 述磁微粒分离试剂是通过以下方法制备得到的： (1) 将羧基磁性微球溶于活化液中，所述活化液为10~50mMMES，pH5. 0~7. 0 ; (2) 按照EDC与羧基磁性微球表面羧基含量的摩尔比0.8~2:1，向步骤（1)的体系中 加入EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌； (3) 立即调节步骤（2)体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白，搅拌； (4) 使羧基磁性微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为IOmMTris， 0. 1%BSA,0.I%NaN3,pH7. 5〇
【专利摘要】本发明提供了一种羧基微球标记蛋白的方法，属于免疫诊断试剂盒制备领域。本发明通过在羧基微球标记蛋白的体系中，根据微球表面羧基含量，设定交联剂EDC：-COOH的摩尔比为0.8～2：1，并使EDC：NHS或Sulfo-NHS的摩尔比为1～3：1，使微球表面的羧基数量和活化的羧基数量处于最佳的比例，同时调节pH值使反应体系快速从利于活化的条件转为利于抗体连接的状态，并省去离心或切向流过滤的步骤，最终实现简化标记步骤，节省成本，达到羧基微球高效标记蛋白的目的。本发明方法可应用于以胶乳微球或磁性微球为载体的检测试剂盒的制备中，具有较好的市场应用前景和经济价值。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN104897904
【申请号】CN201510289769
【发明人】黎霞, 赵文姬, 张志栋
【申请人】中生北控生物科技股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫诊断试剂盒制备技术领域，具体地，涉及一种新的、成本低、操作 简便的羧基微球标记蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 纳米微球被广泛地应用于体外诊断试剂中，极大地提高了试剂的灵敏度，可以检 测到样本含量极微的物质。纳米微球在诊断试剂中作为载体，大小均一，微球表面包被抗 体、抗原等蛋白分子，蛋白分子吸附到纳米微球上，方法有两种：物理吸附和化学偶联。物理 吸附是比较传统有效的方法，但是其也有对体系变化敏感，稳定性差的缺点；化学偶联可以 避免这些缺陷。化学偶联狭义上是指利用市售的活性交联剂，把蛋白和纳米微球通过化学 反应连接在一起，一旦连接成功，纳米微球会非常稳定。
[0003] 用于化学偶联的纳米微球表面会被修饰一些化学基团，譬如羧基、氨基、羟基等， 其中羧基微球应用比较广泛。把羧基活化，进一步与抗体等蛋白分子交联，目前普遍的方法 有两种：一步法，是指在合适条件下，把交联剂碳二亚胺（EDC)、羧基微球和蛋白分子三种 成分混合在一起，反应1个小时以上，再终止反应，离心或者切向流过滤等方法把羧基微球 分离出来；两步法，引入了另外一种试剂，即N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)或Sulfo-NHS，具体 操作为先在羧基微球中同时加入EDC和NHS或Sulfo-NHS，室温活化5~20min，再通过离 心或切向流过滤等方法去掉多余的EDC和NHS或Sulfo-NHS，然后用pH7~9的缓冲液重 悬，加入抗体室温反应3h以上，再通过离心或切向流过滤等方法把偶联了蛋白分子的羧基 微球分离出来，用合适的缓冲液重悬储存。
[0004] 一步法的优点是操作简单，利用EDC作为交联剂，虽然比较简便，但是这种方法不 可控，最终产物除了目的产物外，可能还会有大量的多个抗体自连产物，这样不仅浪费抗 体，还大大降低了反应率。二步法是利用EDC和NHS或Sulfo-NHS作为交联剂，因为反应是 分步进行，第一步活化羧基，洗涤微球后再加入抗体，所以反应的方向是一定的，具有可控 性，活化后洗涤微球最常用有两种方法，一是离心，这种方法不仅费时费力，而且高速离心 过程中微球的距离越来越近，表面电荷相互作用，可能会导致微球的自连沉淀，严重影响偶 联的效率；二是切向流过滤，这种方法不会导致胶乳沉淀，但是其耗时较长，影响第二步反 应的效率；如果是磁性羧基微球，则比较方便，可以使用磁性分离系统洗涤微球。两种化学 偶联的方法的共同缺点是对反应条件的要求比较苛刻，比如一步法必须在偏酸性环境下反 应，两步法的第一步必须在偏酸性环境下，第二步最好在偏碱性环境下。因此本领域迫切需 要一种偶联反应可控、有效，操作简便的羧基微球偶联蛋白的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种操作简便、成本低、用时少、偶联效率高的羧基微球标 记蛋白的方法。
[0006] 本发明提供的一种羧基微球标记蛋白的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)将羧基微球溶于活化液中，所述活化液为10~50mM MES，pH 5. 0~7. 0 ;
[0008] (2)按照EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比0? 8~2:1，向步骤（1)的体系中 加入EDC ;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌；
[0009] (3)立即调节步骤⑵体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白， 搅拌；
[0010] (4)使微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为10~50mM Tris，0. 1 ~1% BSA，0. 1% NaN3, pH 7. 0 ~8. 0〇
[0011] 本发明所述的羧基微球为羧基胶乳微球或羧基磁性微球。
[0012] 本发明方法步骤（1)中，羧基微球溶于活化液的终浓度为0. 5%~1%，所述％为 质量百分比。
[0013] 本发明方法步骤（2)搅拌时间为10~20min。搅拌方法可以为磁珠搅拌，也可以 为玻棒搅拌。
[0014] 优选地，本发明方法步骤（2)中，EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比为1:1， EDC :NHS 或 Sulfo-NHS 的摩尔比为 1:1。
[0015] 本发明方法步骤（3)加入待标记蛋白后使其终浓度为0. 1~lmg/mL。
[0016] 本发明所述的胶乳微球，直径大小为50~200nm，表面羧基含量为0. 1~ 0. 3mmol/g，大小均一。
[0017] 本发明所述的待标记蛋白可以为抗原、抗体、亲和素等其他应用于生物技术领域 的诊断、检测用蛋白。待标记蛋白的初始浓度5~1 Omg/mL。
[0018] 本发明方法步骤（3)搅拌时间为2~4h。
[0019] 本发明方法步骤（4)用储存液重悬胶乳颗粒使其终浓度为0. 5%~1%，所述％为 质量百分比。
[0020] 步骤（4)中的分离方法可采用离心或者切向流过滤方法是胶乳颗粒与未连接的 抗原、抗体或其他待标记的蛋白分离。
[0021] 本发明提供了上述方法在制备适用于免疫比浊法的抗原或抗体检测试剂盒中的 应用。
[0022] 本发明还提供了一种以羧基胶乳微球为载体的检测试剂盒，含有R1试剂和R2试 剂，
[0023] 其中R1试剂为：在10~50mM Tris，pH值为7~9的缓冲液中加入终浓度为2. 5% 的NaCl、0. 5%的Tween-20,搅拌均匀即得；
[0024]R2试剂通过以下方法制备得到：
[0025] (1)将羧基胶乳微球溶于活化液中，所述活化液为10~50mM MES，pH 5. 0~7. 0;
[0026] (2)按照EDC与羧基胶乳微球表面羧基含量的摩尔比0.8~2:1，向步骤⑴的体 系中加入EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌；
[0027] (3)立即调节步骤⑵体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白， 搅拌；
[0028] (4)使微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为10mM Tris， 0. 1% BSA,0. 1% NaN3, pH 7. 5〇
[0029] 进一步地，R2试剂制备方法的步骤（2)中，EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比 为 1:1，EDC :NHS 或 Sulfo-NHS 的摩尔比为 1:1。
[0030] 进一步地，R2试剂制备方法的步骤（3)中，立即调节步骤（2)体系的pH值为9. 5。
[0031] R2试剂制备方法的步骤（4)中，用储存液重悬胶乳微球使其终浓度为0. 05 %~ 〇. 1%，所述％为质量百分比。
[0032] 本发明还提供一种以羧基磁性微球为载体的检测试剂盒，含有磁微粒分离试剂， 所述磁微粒分离试剂是通过以下方法制备得到的：
[0033] (1)将羧基磁性微球溶于活化液中，所述活化液为10~50mM MES，pH 5. 0~7. 0;
[0034] (2)按照EDC与羧基磁性微球表面羧基含量的摩尔比0? 8~2:1，向步骤（1)的体 系中加入EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌；
[0035] (3)立即调节步骤⑵体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白， 搅拌；
[0036] (4)使羧基磁性微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为10mM Tris,0. 1% BSA,0. 1% NaN3, pH 7. 5〇
[0037] 优选地，步骤（2)EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比为1:1，EDC:NHS或 Sulfo-NHS的摩尔比为1:1。
[0038] 步骤（4)中，用储存液重悬胶乳微球使其终浓度为0. 05%~0. 1%，所述％为质量 百分比。
[0039] 在本发明的一个实施例中，偶联的待标记蛋白为链霉亲和素。将偶联了链霉亲和 素的羧基磁性微球用10mM Tris，0. 1 % BSA，0. 1 % NaN3, pH 7. 50的溶液稀释到0. 01 %。
[0040] 本发明的羧基微球标记蛋白的方法具有以下优点及有益效果：
[0041] (1)操作简便，实现羧基微球与待标记蛋白的高效偶联。
[0042] (2)通过加入合适比例的交联剂，使微球表面的羧基数量和活化的羧基数量处于 最佳比例，有利于蛋白标记和应用于胶乳免疫比浊试剂盒中。
[0043] (3)通过调节pH值使得反应体系快速从利于活化的条件转为利于蛋白标记的状 态，且针对传统的两步法进行了改进，对于羧基胶乳微球，传统的两步法通过离心等方法洗 涤微球后再加待标记蛋白进行反应，而本发明方法在加入待标记蛋白前，省去了离心或切 向流过滤的步骤，避免了胶乳颗粒沉淀和活化的中间产物水解；对于羧基磁性微球，传统的 两步法通过磁性分离系统洗涤微球后再加待标记蛋白进行反应，而本发明省去了洗涤这一 个步骤，节约了时间，在活化中间产物半衰期之内尽快进行下一步反应。
[0044] (4)与现有技术的微球标记方法相比，经过本发明方法能够有效降低试剂的用量， 节省了成本。
【附图说明】
[0045] 图1为根据BSA蛋白标准作的标准曲线。
[0046]图2为采用本发明实施例2制得的试剂盒对6种不同浓度标准品检测结果作的标 准曲线图。
[0047] 图3为采用本发明实施例4制得的试剂盒检测结果的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0048] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0049] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段； 实施例中所用的试剂为市售商品。本发明实施例所述的活化液为10~50mM MES，pH5. 0~ 7. 0 ;所述储存液为 10mM Tris，0. 1% BSA，0. 1% NaN3, pH 7. 5。
[0050] 实施例1羧基胶乳微球标记胱抑素C抗体
[0051] 胱抑素C抗体为东方酵母公司产品，多抗，浓度为15mg/mL。该抗体仅与人胱抑素 C反应，与其他抗原无交叉免疫反应，基本满足本试验所需。胶乳微球为JSR公司产品，粒 径为61nm，羧基含量为0. 190mmol/g，浓度为5. 2%，溶液为0. 09%叠氮化钠的纯化水。EDC 和NHS为Pierce公司产品。
[0052] 胶乳微球用10mM MES，pH 6. 00的活化液配制成0. 5%的溶液，搅拌均匀，根据胶 乳颗粒表面的羧基含量，按照摩尔比EDC:NHS: -C00H = 1:1:1的比例，计算所需EDC和NHS 的量，称取后直接加入到胶乳微球溶液中，边加边搅拌，室温搅拌反应15min。立即用NaOH 调节胶乳颗粒溶液pH值为9. 80,随即加入用活化液稀释了浓度为5mg/mL的胱抑素C抗 体，使抗体终浓度为〇. 5mg/mL，边加边搅拌，室温搅拌反应3h。反应完成后，离心清洗胶乳 颗粒，最后使连接有胱抑素C抗体的胶乳微球保存在10mM Tris，0. 1% BSA，0. 1% NaN3, pH 7. 50的溶液中，微球浓度为0. 5%，可以长期保存。
[0053] 可以通过测定离心后上清中的胱抑素C抗体剩余量来测定抗体的偶联 效率。离心 后上清用透析袋透析24小时，透析液为0. 1M PBS缓冲液，期间换4次透析液，透析完成后， 4 °C保存备用。
[0054] 称取5mg BSA，溶于5mL的0? 1M PBS溶液中，浓度为lmg/mL。根据表1制备BSA 梯度标准溶液。
[0055] 表1 BSA浓度梯度标准溶液的制备
[0057]在紫外可见分光光度计波长280nm处测定BSA浓度梯度标准溶液的0D值，根据 0D280nm-BSA标准溶液的终浓度作标准曲线，见图1。同时测定透析后上清液的0D280nm值， 计算上清液的蛋白浓度。上清液的测定结果为：〇D280nm = 0. 064,计算得到的蛋白浓度为： (0.064+0. 002)/0? 55 = 0? 12mg/mL，即偶联效率为：（0.5-0. 12)/0? 5*% = 76%。
[0058]实施例2胱抑素C的测定试剂盒的制备与应用
[0059] (1)制备R2试剂。
[0060] 把连接好胱抑素C抗体的胶乳颗粒（即实施例1制得的羧基微球标记胱抑素C抗 体）用 10mM Tris，0. 1% BSA，0. 1% NaN3, pH7. 50 的溶液稀释到 0? 05%，制成 R2 试剂。
[0061] (2)制备R1试剂。
[0062] 在10mM Tris，pH值为8. 5的缓冲液中加入终浓度为2. 5%的NaCl、0. 5%的 Tween-20，搅拌均匀，即为试剂R1。
[0063] (3)标准品的制备
[0064] 将胱抑素C纯品溶解在10mM Tris，0. 1 % BSA，0. 1 % NaN3, pH 7. 50的溶液中，制 成梯度浓度约为〇、〇. 5、l、2、4、8mg/L的标准品。
[0065] 试剂Rl、R2和标准品构成胱抑素C的测定试剂盒。
[0066] (4)胱抑素C的测定试剂盒检测的线性试验
[0067] 仪器：岛津紫外分光光度计；检测波长：570nm，比色杯光径：1cm。
[0068] 检测方法：取3 y L的标准品，分别加入到160 y L R1试剂，混匀室温放置5min，然 后再加入40 y L R2试剂，读取30~50秒和4~5分钟的0D570,绘制标准曲线，检测数据 见表1，标准曲线见图1。表1中的样品ID指标准品的6个点。
[0069] 从表2可以看出来，当胱抑素C浓度约为lmg/mL时，0D570的变化率为0. 0142,在 0. 1~0. 5范围之内，符合要求。
[0070] 从图2可以看出来，标准曲线的R2= 0. 994,也是符合要求的。
[0071] 表2胱抑素C梯度浓度在0~5min的变化率
[0073]实施例3羧基磁性微球偶联链霉亲和素
[0074] 磁性微球是merck公司产品，粒径0? 5~2 ym，羧基含量为78 ymol/g，浓度为 10 %，溶液为0. 09 %叠氮化钠的纯化水；链霉亲和素是Thermo公司产品，为冻干粉；EDC和 NHS为Pierce公司产品。
[0075] 磁性微球用20mMMES，pH5. 80的活化液配制成1 %的溶液，搅拌均匀，根据磁性 微球表面的羧基含量，按照摩尔比EDC:NHS:-C00H= 1:1:1的比例，计算所需EDC和NHS的 量，称取后直接加入到磁性微球溶液中，边加边搅拌，室温搅拌反应15min。立即用NaOH调 节磁性微球溶液pH值为8. 5,随即加入事先用纯化水溶解的链霉亲和素，使链霉亲和素终 浓度为〇. 5mg/mL，边加边搅拌，室温搅拌反应3h。反应完成后，利用磁性分离系统清洗磁 性微球，最后使连接有链霉亲和素的磁性微球保存在10mM Tris，0. 1%BSA，0.1%NaN3, pH 7. 50的溶液中，微球浓度为1%，可以长期保存。
[0076]参照实施例1的方法处理分离磁性微球后的上清液后，用于测定未连接上的蛋白 含量，标准蛋白曲线可以利用图1。上清液的测定结果为：〇D280nm = 0. 042,计算得到的蛋 白浓度为：（〇? 042+0. 002)/0? 55 = 0? 08mg/mL，即偶联效率为：（0? 5-0. 08)/0? 5*% = 84% [0077]实施例4游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒的制备与应用 [0078] (1)制备磁微粒分离试剂。
[0079] 把连接好链霉亲和素的磁性微球（即实施例3制得的羧基磁性微球标记链霉亲和 素）用10mM Tris，0. 1% BSA，0. 1% NaN3, pH7. 50的溶液稀释到0. 01%，制成磁分离试剂。
[0080] (2)制备抗体试剂。
[0081] 将生物素标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗体用0. 1M Tris，0. 5% BSA，0. 1% Tween-20,0. 1%NaN3,pH 8. 0 缓冲液稀释成终浓度为 25ng/mL。
[0082] (3)酶标试剂的制备
[0083] 将碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸用0. 1M Tris，0. 5% BSA，0. 1% Tween-20,0. 1% NaN3, pH 8. 0缓冲液稀释成终浓度为12ng/mL。
[0084] (4)标准品的制备
[0085] 称量抗原lmg溶于1mlDMS0中，搅拌混勾，即lmg/ml，此为一级母液，吸取一级母 液5 yL溶于5mlDMS0中，搅拌混匀，此即为抗原母液。在10mL的10mMTris，0.1%BSA， 0? 1%NaN3,pH 7. 50 的溶液中，分别加入 0? 000、0? 006、0. 013、0. 026、0. 052、0. 086mL 抗原 母液，搅拌均匀，制成系列浓度为〇、l. 5、3、6、12、20pg/mL的标准品。
[0086] 磁分离试剂、抗体试剂、酶标试剂和标准品构成游离三碘甲状腺原氨酸定量检测 试剂盒。
[0087] (5)游离三碘甲状腺原氨酸定量检测试剂盒的线性试验
[0088] 仪器：倍爱康半自动免疫发光分析仪；底物是深圳美凯特公司产品。检测方法： 所有试剂，缓冲液平衡到室温。准备好磁板架，试管。往所有试管中加入30 yL游离三碘 甲状腺原氨酸标准品或待测血清，50 y L抗体试剂，混合均匀后盖上薄膜，37°C恒温箱孵育 15min。往所有试管中加入50 y L酶标试剂，30 y L磁性分离试剂，混合均匀后盖上薄膜， 37°C恒温箱孵育15min。取出试管架，装上磁板，沉淀lmin，弃去试管中液体，在滤纸上排干 残余水分。加入300 y L洗液，充分振荡20s，沉淀lmin，弃去试管中液体，在滤纸上排干残 余水分。再重复洗涤2次。洗完后每管加入底物200 yL。在化学发光分析仪上检测每个试 管的RLU值。标准曲线见图3,可见0~20.0 pg/mL测量范围内，相关系数r = 0. 9978,完 全满足要求。
[0089] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种羧基微球标记蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将羧基微球悬于活化液中，所述活化液为10~50mMMES，pH5.O~7.O; (2) 按照EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比0.8~2:1，向步骤⑴的体系中加入 EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌； (3) 立即调节步骤（2)体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白，搅拌； (4) 使微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为IOmMTris，0. 1% BSA,0.I%NaN3,pH7. 5〇2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，羧基微球溶于活化液的终浓 度为0.5%~1%，所述％为质量百分比。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)搅拌时间为10~20min。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)加入待标记蛋白后使其终浓度为 0? 1 ~lmg/mL〇5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)搅拌时间为2~4h。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4)用储存液重悬胶乳颗粒使其终浓 度为0.5%~1%，所述％为质量百分比。7. 权利要求1~6任一所述的方法在制备适用于免疫比浊法或化学发光法的抗原或抗 体检测试剂盒中的应用。8. -种以羧基胶乳微球为载体的检测试剂盒，其特征在于，含有Rl试剂和R2试剂， 其中Rl试剂为：在IOmMTris，pH值为7~9的缓冲液中加入终浓度为2. 5%的NaCl、 0? 5%的Tween-20,搅拌均匀即得； R2试剂通过以下方法制备得到： (1) 将羧基胶乳微球悬于活化液中，所述活化液为10~50mMMES，pH5. 0~7. 0 ; (2) 按照EDC与羧基胶乳微球表面羧基含量的摩尔比0.8~2:1，向步骤（1)的体系中 加入EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌； (3) 立即调节步骤（2)体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白，搅拌； (4) 使微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为IOmMTris，0. 1% BSA,0.I%NaN3,pH7. 5〇9. 如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，R2试剂制备方法的步骤（2)中，EDC与羧 基微球表面羧基含量的摩尔比为I:I，EDS:NHS或Sulfo-NHS的摩尔比为1:1。10. -种以羧基磁性微球为载体的检测试剂盒，其特征在于，含有磁微粒分离试剂，所 述磁微粒分离试剂是通过以下方法制备得到的： (1) 将羧基磁性微球溶于活化液中，所述活化液为10~50mMMES，pH5. 0~7. 0 ; (2) 按照EDC与羧基磁性微球表面羧基含量的摩尔比0.8~2:1，向步骤（1)的体系中 加入EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌； (3) 立即调节步骤（2)体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白，搅拌； (4) 使羧基磁性微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为IOmMTris， 0. 1%BSA,0.I%NaN3,pH7. 5〇
【专利摘要】本发明提供了一种羧基微球标记蛋白的方法，属于免疫诊断试剂盒制备领域。本发明通过在羧基微球标记蛋白的体系中，根据微球表面羧基含量，设定交联剂EDC：-COOH的摩尔比为0.8～2：1，并使EDC：NHS或Sulfo-NHS的摩尔比为1～3：1，使微球表面的羧基数量和活化的羧基数量处于最佳的比例，同时调节pH值使反应体系快速从利于活化的条件转为利于抗体连接的状态，并省去离心或切向流过滤的步骤，最终实现简化标记步骤，节省成本，达到羧基微球高效标记蛋白的目的。本发明方法可应用于以胶乳微球或磁性微球为载体的检测试剂盒的制备中，具有较好的市场应用前景和经济价值。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN104897904
【申请号】CN201510289769
【发明人】黎霞, 赵文姬, 张志栋
【申请人】中生北控生物科技股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
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