检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测的技术领域，尤其涉及一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试 纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 盐酸克伦特罗属e-肾上腺激素类药物，这种物质在动物生长同时提高饲养效 率，抑制脂肪形成，促进脂类物质分解，增加组织蛋白质。但值得关注的是，食用含一定量 0 _肾上腺激素的动物组织或食品会对人体健康造成威胁。在美国和澳大利亚允许使用一 定量的莱克多巴胺用于猪和牛的饲养，中国和大多数欧洲国家禁止将0 _肾上腺激素类的 药物添加于动物饲料中。
[0003] 考虑到0 _肾上腺激素的非法使用情况及其残留对人体健康的危害性，目前急需 一种灵敏高的方法来检测肾上腺激素。现已有关于检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和 其他肾上腺激素的检测方法，报道多是定性法和定量法。定量方法中有液相色谱法、气 相色谱法、液质联用等，这些方法均需要较繁琐的样品前处理步骤及配合有专业技能的人 员进行操作；免疫分析方法多进行定性判断，这类检测方法快速且准确。
[0004] 此外，e -肾上腺激素的产量不断增加，这类药物会进入到减肥产品及运动员的饮 食中，因此需要高效快速的检测手段实现该类药物残留的监控。检测方法应当具备耗时少、 成本低，可满足检测大量样品，利于简单分析定性。已经发展利用起来的免疫检测方法包括 ELISA、免疫层析法和免疫S印aration-ELISA，这些方法可同时检测0 -肾上腺激素中的几 种。近年来，将免疫层析技术用于盐酸克伦特罗的检测已成热门，低成本投入使许多生物公 司纷纷开始进行胶体金免疫层析试纸条的研制。
[0005] 在现有技术中，目前市售的盐酸克伦特罗胶体金试纸条种类繁多，国内各类生物 公司研制出的试纸条检测范围在3~5ppb，检测多以猪尿液为主，对控制含有CLB猪肉流 入市场较为有效。但检测工作仍以抽检方式进行，不能确保所有流入市场的动物生鲜肉品 及其相关产品都是安全可靠的，对于动物活体组织为对象的盐酸克伦特罗胶体金试纸条尚 未有开发，这主要是基于对于此类样本的处理，目前还没有一个完善科学的处理方法。
[0006] 有鉴于此，本发明人研宄和设计了一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条 及其制备方法，本案由此产生。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种特异性强、操作简便，检测快速、准确并适合现场使用 的专门用于检测动物物体组织的检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条及其制备方法， 以符合实际的检测需求，依据本试纸条可以确保流入市场的动物生鲜肉品及其相关产品的 安全可靠性。
[0008] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：
[0009] 一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素 包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水 垫依次搭接在所述PVC底板上，所述结合垫包被设有盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金标 记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有盐酸克伦特罗抗 原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
[0010] 一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0011] 步骤一、胶体金的制备：取1个2501^烧杯，加入10011^0.01%氯金酸溶液，于恒 温磁力搅拌器上使用温度档400°C对其进行加热，转速为300r/min，加热至沸腾状态后，沸 腾时的实际温度为l〇〇°C，向烧杯中快速加入1. 8mL 1 %柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变 为红色后再加热lOmin，直至溶液透亮，冷却至室温，4°C密封保存，即制得胶体金；
[0012] 步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7. 4的所述胶体金lmL于2. OmL离 心管中，向离心管中加入4. 5 y g/ml的盐酸克伦特罗单克隆抗体，用涡旋仪涡旋lOmin后静 置15min ;向离心管中加入60 y L 1% BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，4°C封闭，静置lOmin， 制得金标抗体，即盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金标记物；
[0013] 同时，将制得的金标抗体溶液于4°C 2500r/min，离心10min，去除下层沉淀，将上 清液转到另一离心管中，于4°C 11000r/min，离心30min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释 溶液稀释至原体积的1/20,于4°C保存备用；
[0014] 步骤三、试纸条的组装：（1)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC 底板上，吸水垫压住NC膜上方l-2mm ; (2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上 切割成4_宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4_宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗 体溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成lcm长的小块并贴于PVC 底板上，金标垫压住NC膜下方l-2mm，同时用样品垫压住金标垫下方l-2mm，根据试纸条长 度修剪样品垫；（5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被盐酸克伦特罗抗原和羊抗鼠 IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速 度40mm/s，单位喷量：检测线为0. 8 yL/cm，质控线为1. 0 yL/cm，使得盐酸克伦特罗抗原包 被浓度为〇. 2mg/mL ;羊抗鼠IgG包被浓度为1. 0mg/mL。
[0015] 作为实施例的优选方式，在所述步骤三（3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前 处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4_宽的长条，用含有5%的蔗 糖、5% BSA和终体积浓度为0. 1 %的pH为7. 4的0. 01m〇l/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后 将溶液沥干，在37°C条件下烘干12h备用。
[0016] 作为实施例的优选方式，还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验 所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3 次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡lmin后进行硅化处理；将经 过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中 37 °C进行干燥处理，备用。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有下列优点：
[0018] 1、本发明的检测盐酸克伦特罗的胶体金免疫层析试纸条，具有特异性强，灵敏度 高，检测时间短等优点，可以广泛应用于动物的活体组织检测。
[0019] 2、本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，可现场操作，检测成本低。
[0020] 3、本发明的检测试纸条操作简便，不需要专业人员操作。
[0021] 4、本发明对样品垫与金标垫进行了前处理，使得样品垫与金标垫具有优异的吸水 能力及释放能力，进而大大提尚了检测能力。
[0022] 5、本发明对试验所用容器都进行清洗，最终增强了金标抗体的稳定性。
[0023] 6、本发明可以同时检测液体样品和组织样品，无需分开检测，而传统的试纸条对 于这两种样品是分开检测的。
[0024] 7、本发明的胶体金标记抗体时最佳蛋白标记量的确定采用了氯化钠破坏法与性 能实验相结合的方法，在提高检测的灵敏度的同时，节省了抗体使用量。
[0025] 说明书附图
[0026] 图1为本发明胶体金免疫层析试纸条的结构示意图；
[0027] 图2为本发明实施例4试纸条灵敏度测试结果图；
[0028] 图3为本发明实施例4试纸条稳定性测试保存温度选择；
[0029] 图4为本发明实施例4试纸条稳定性测试室温保存10天、30天、60天、90天试纸 条性能对比；
[0030] 图5为本发明实施例5样品测试的猪肉组织粗提取方法选择检测结果，其中，从左 至右依次为粗提取方法一、方法二、方法三、方法四经加标后的检测结果；
[0031] 图6为本发明实施例5样品测 试的样品提取缓冲液选择检测结果图；其中，从左至 右依次是0. 〇lmol/L的盐酸、氢氧化钠、乙酸铵、PBS ;
[0032] 图7为本发明实施例5样品测试的试纸条在猪肉组织中的检测结果；其中，从左至 右标品添加量为 50ng/g、40ng/g、30ng/g、25ng/g、20ng/g、18ng/g、15ng/g、0ng/g ;
[0033] 图8为本发明实施例5样品测试的前处理优化方案一检测结果部分展示；其中，从 左至右样品依次为每克猪肉（加标品〇ng、15ng)、每克牛肉干（加标品0ng、15ng、20ng)、每 克猪肉松（加标品〇ng、15ng)、每克动物肝脏（加标品0ng、15ng、20ng);
[0034] 图9为本发明实施例5样品测试的前处理优化方案二检测结果部分展示；其中，从 左至右样品依次为每克猪肉（加标品〇ng、15ng)、每克牛肉干（加标品0ng、15ng、20ng)、每 克猪肉松（加标品〇ng、15ng)、每克动物肝脏（加标品0ng、15ng);
[0035] 图10为本发明实施例5样品测试的正己烷对动物性加工食品提取液的处理效果； 其中，左侧为牛肉干提取液，右侧为猪肉松提取液。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1
[0037] 如图1所示，本发明揭示了一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条，包括 样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素包被膜3、吸水垫4及PVC底板5,所述样品垫1、所述结合垫 2、所述硝酸纤维素包被膜3及所述吸水垫4依次搭接在所述PVC底板5上：所述结合垫2 包被设有盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜3上设有检测 线31和质控线32,所述检测线31包被有盐酸克伦特罗抗原，所述质控线32包被有羊抗鼠 IgG〇
[0038] 实施例2
[0039] 一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0040]步骤一、胶体金的制备：取1个250mL烧杯，加入100mL 0. 01 %氯金酸溶液，于恒 温磁力搅拌器上使用温度档400°C对其进行加热，转速为300r/min，加热至沸腾状态后，沸 腾时的实际温度为l〇〇°C，向烧杯中快速加入1. 8mL 1 %柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变 为红色后再加热lOmin，直至溶液透亮，冷却至室温，4°C密封保存，即制得胶体金；
[0041] 步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7. 4的所述胶体金lmL于2. OmL离 心管中，向离心管中加入4. 5 y g/ml的盐酸克伦特罗单克隆抗体，用涡旋仪涡旋lOmin后静 置15min ;向离心管中加入60 y L 1% BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，4°C封闭，静置lOmin， 制得金标抗体，即盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金标记物；
[0042] 同时，将制得的金标抗体溶液于4°C 2500r/min，离心10min，去除下层沉淀，将上 清液转到另一离心管中，于4°C 11000r/min，离心30min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释 溶液稀释至原体积的1/20,于4°C保存备用；
[0043] 步骤三、试纸条的组装：（1)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC 底板上，吸水垫压住NC膜上方l-2mm ; (2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上 切割成4_宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4_宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗 体溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成lcm长的小块并贴于PVC 底板上，金标垫压住NC膜下方l-2mm，同时用样品垫压住金标垫下方l-2mm，根据试纸条长 度修剪样品垫；（5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被盐酸克伦特罗抗原和羊抗鼠 IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速 度40mm/s，单位喷量：检测线为0. 8 yL/cm，质控线为1. 0 yL/cm，使得盐酸克伦特罗抗原包 被浓度为〇. 2mg/mL ;羊抗鼠IgG包被浓度为1. 0mg/mL。
[0044] 作为实施例的优选方式，在所述步骤三（3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前 处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4_宽的长条，用含有5%的蔗 糖、5% BSA和终体积浓度为0. 1 %的pH为7. 4的0. 01m〇l/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后 将溶液沥干，在37°C条件下烘干12h备用。
[0045] 作为实施例的优选方式，还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验 所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3 次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡lmin后进行硅化处理；将经 过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中 37 °C进行干燥处理，备用。
[0046] 实施例3胶体金标记抗体时最佳蛋白标记量的确定
[0047] 氯化钠破坏法：取1. 5mL洁净的PC管，用lmL胶体金溶液标记抗体，如表1，用 0. 2mol/L K2C03的添加量调节pH，分别加入抗体量1、2、3、4、5 y g，中档转速充分涡旋1~ 2min，4°C静置30min，再加入100 y L 10% NaCl混匀3min，4°C反应30min，观察溶液的变色 情况。依据Mey氏稳定化实验，不发生变色的离心管中所加入的抗体量增加20%即为最小 标记抗体量。抗体标记量不宜过高，一方面造成成本的增加，另一方面游离的抗体会影响试 纸条灵敏度。该实验结果作为抗体标记量参考值，具体标记量可在此范围附近作调整，根据 试纸条检测效果选择最佳抗体标记量。
[0048] 表1最低标记蛋白量的确定
[0049]
[0050] 性能实验：取3个离心管，編号为1~3号，各加lmL胶体金溶液，调节溶液至最佳 PH，根据氯化钠破坏法的实验结果，实验中对1~3号管分别标记0 y g、3. 5 y g、4. 0 y g的 抗体蛋白，加入l〇〇yL 10% BSA封闭保护金标液，金标液经纯化、稀释，親合到金标垫上， 与NC膜组装成试纸条，分别测试100 y g/L的阳性标准品和阴性PBS溶液，对比抗体加入量 的不同对试纸条显色的影响，准确判断最佳标记量。
[0051] 探索胶体金标记抗体蛋白的最佳标记量，各离心管中的溶液发生反应后颜色发生 了变化，其中，1、2、3号管抗体蛋白的加入量不能够稳定胶体金体系，加入氯化钠后，产生的 盐离子效应，破坏了胶体金的平衡，使溶液出现了由红色变蓝色或紫色的不同程度的聚沉 现象，4号管溶液有轻微变色，说明加入氯化钠后对溶液的影响较小，5号管加入的抗体量 可以稳定胶体金体系，所以加入氯化钠后对溶液没有影响，考虑到胶体金标记抗体后加入 的稳定剂BSA对体系的保护作用，本探索实验初步选择4号、5号管两组为合适的抗体加入 量，即最低抗体标记量为4. 5 y g/mL或5. 0 y g/mL。
[0052] 为更准确的确定最佳抗体标记量，结合氯化钠实验法的选择结果，选择抗体标记 量为4. 5 y g/ml、5. 0 y g/ml、5. 5 y g/ml进行了性能实验，分别对三种标记量的试纸条进 行同浓度的阴性样本和阳性样本测试，三组试纸条的检测结果无差异，说明抗体标记量为 4. 5 y g/ml时稳定剂BSA保护了反应体系，不影响试纸条性能，因此为节省抗体使用量和提 高检测的灵敏度，本实验选择胶体金标记抗体蛋白时，最佳抗体标记量为4. 5 y g/ml。
[0053] 实施例4试纸条的性能评价
[0054] 4. 1试纸条的灵敏度
[0055] 盐酸克伦特罗标品可溶于水，先将粉末状标品配制成浓度为10 y g/mL储备液，再 用 0? 01mol/L pH7. 4PBS 稀释为所需的浓度梯度：3ng/mL、5ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、15ng/ mL、20ng/mL，以PBS缓冲液作为阴性 对照。上样时，阴性样本及各浓度标品取100 y L，滴 于样品垫，观察各组显线情况。当试纸条质控线（C线）处有红色条带形成，说明试纸条正 常有效的，否则该试纸条作废；当试纸条产生两条清晰红色条带，即质控线（C线）、检测线 (T线）均发生免疫反应，两线显色程度一致，此时说明阴性样本正常；当滴加不同浓度标品 时，检测线（T线）显色程度随着CLB浓度的增加而降低，将恰好消除T线时的标品浓度定 为试纸条的灵敏度。
[0056] 将梯度稀释的盐酸克伦特罗标液等体积上样于制备好的试纸条，当检测线（T线） 恰好消线时，作为试纸条灵敏度值。如图2所示，由左至右标品浓度依次为0ng/mL、20ng/ mL、10ng/mL、8ng/mL、5ng/mL、3ng/mL，在8ng/mL时，试纸条检测线（T线）恰好消线，当浓度 继续减小时结果为假阴性，因此本实验制备的试纸条灵敏度在8ng/mL。
[0057] 4. 2交叉反应率
[0058] 选择与CLB性质相似的0 -受体激动剂，常用的有莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他 林和马布特罗，用0.0 lmol/L PB缓冲液稀释上述高浓度标品，分别配制成浓度为5ng/mL、 25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL待测液，此外再将这五类标品配制成两种混合溶液， 每种各组分比例相同，即每毫升各含5ng (混合0 -受体激动剂25ng/mL)、15ng (混合0 -受 体激动剂75ng/mL)。取100 y L作为待检液，观察试纸条检测线（T线）显色情况。
[0059] 如表2所示，除了盐酸克伦特罗标品在25~100ng/ml范围内检测为阳性外，其他 各单类标准物质均无阳性反应；混合标准物质中，混标1检测为阴性，混标2检测为阳性； 综上说明，试纸条特异性好，与其他0 _受体激动剂无交叉反应，即使混合上样，只要盐酸 克伦特罗含量高于检测线便可被检测。
[0060] 表2试纸条交叉反应测试
[0062] 注：" + "表示检测结果为阳性，"一"表示检测结果为阴性，"/"表示未实验
[0063] 4. 3试纸条的稳定性
[0064] 试纸条研发应处于恒定的温湿度环境，保证每次制备出的试纸条性能稳定。将试 纸条分别密封存放在4°C、室温16~18°C及37°C，存放30天后取出分别进行阴性、阳性试 验，观察存放温度对试纸条性能的影响。
[0065] 对同批次制备出的试纸条分别在室温干燥的铝箔袋中存放10天、30天、60天和90 天；对不同批次制备的试纸条比较存放30天后试纸条性能变化。分别上样后观察阴性组和 阳性组的显线情况。
[0066] 如图3所示，同批次制备的试纸条在4°C、室温、37°C保存30天后，每个温度下分别 用阴性样本和8ng/mL盐酸克伦特罗标品上样，每组3个平行。明显看出，37°C下保存后试 纸条阴性样本检测线（T线）显色程度下降，金标抗体与包被抗原免疫反应减弱，影响检测 结果判断。4°C与室温保存的试纸条性能相对稳定，故试纸条保存时可放于4°C或室温。
[0067] 如图4反映在室温下随着保存时间的延长试纸条性能变化，均以阴性样本和阳性 标液作参照，在10~60天内试纸条性能稳定，各组显色程度无差异，结果正确，灵敏度好； 当保存90天后，试纸条稳定性受到影响，阴性样本检测线（T线）明显颜色变淡，可能包被 抗原活性降低，单抗更多的与羊抗鼠发生反应。综上，在室温下试纸条可以稳定保存60天。
[0068] 不同批次间试纸条质量对比见表3所示，五个批次下，室温保存30天后，分别抽取 30个试纸条进行实验，阴性、阳性对照各15个，其中仅有个别试纸条性能不稳定，试纸条质 量合格率在97%，说明试纸条制备工艺较为合理，不同批次间差异性小，可用于实际样品检 测。
[0069] 表3不同批次间试纸条稳定性测试
[0071] 实施例5样品测试
[0072] 盐酸克伦特罗试纸条目前在猪尿检测中应用广泛，直接接取个体猪的尿液，适量 上样即可，对控制含有CLB猪肉流入市场较为有效。但检测工作仍以抽检方式进行，不能确 保所有流入市场的动物生鲜肉品及其相关产品都是安全可靠的，因此选择合理的样品处理 方式，使试纸条得以充分发挥作用。
[0073] 5. 1生鲜猪肉组织中盐酸克伦特罗粗提方法
[0074] 盐酸克伦特罗易溶于水，新鲜的动物组织有弹性，含水分较高，组织液中可残留盐 酸克伦特罗，为了较快的获得检测液，设计粗提取方法如下：
[0075] 方法一：均质组织样品，称取2g样品于10mL离心管中，80~100 °C水浴加热 lOmin，20°C、8000r/min离心5min，取组织渗出液待检。
[0076] 方法二：均质组织样品，称取2g样品于10mL离心管中，加入提取液lmL，高速涡旋 混勾lmin，20°C、8000r/min，离心5min，取上层液待检。
[0077] 方法三：均质组织样品，称取2g样品于10mL离心管中，加入提取液lmL，高速涡旋 混勾lmin，在80~100°C水浴加热5~lOmin，8000r/min，离心5min，取上清液待检。
[0078] 方法四：均质组织样品，称取2g样品于10mL离心管中，加入提取液500uL，高速涡 旋混勾lmin，在80~100°C水浴加热5~lOmin，8000r/min，离心3min，取上清液于一支新 离心管中，再向样品组织中加入500 yL提取液，高速祸旋2min，10000r/min，离心3min，合 并两次上清液待检。
[0079] 上述方法中的生鲜猪肉组织，经检测不含盐酸克伦特罗成分，因此可作为本实验 阴性样品。
[0080] 粗提方法中所使用的每克样品中均加入盐酸克伦特罗标准品25ng，方法中提取液 采用超纯水，提取液不足lmL的用水补足。
[0081] 5. 2样品提取缓冲液优化
[0082] 采用方法三，样品中不添加标品物质，提取液选择0? Olmol/L盐酸、0? Olmol/L Na0H、0. 01m〇l/L乙酸铵、0? 01m〇l/L pH7. 4PBS，根据试纸条检测情况确定合理的提取液。
[0083] 5. 3试纸条在猪肉组织检测中的应用
[0084] 根据5. 1和5. 2确定的样品粗提取方法，在每克猪肉样品中加入标准品50ng、 40ng、30ng、25ng、20ng、18ng、15ng、0ng，取上层提取液定容至lmL，混勾后分别取100 y L上 样，观察试纸条对猪肉组织中CLB检测情况。
[0085] 5. 4样品前处理方法优化
[0086] 样品粗提法仅适用于生鲜组织，对一些加工食品（如猪肉松、牛肉干）及肝脏组织 则需要更充分的处理，提取环节进一步优化，方法如下：
[0087] 优化方案一：称取均质组织样品2g，加入lmL 10% K2C03，再加入5mL乙酸乙酯，高 速匀浆5分钟；20°C、8000r/min，离心5分钟；移取上层萃取液于另一支试管中，再向残渣 中加入10mL乙酸乙醋，涡旋2分钟，相同条件离心后，合并两次萃取液；65°C氮气吹干，加入 lmL提取液复溶CLB，必要时用正己烷纯化，吸取水相100 y L试纸条检测。
[0088] 优化方案二：称取2g均质样品与5mL 0. 2mol/L HC1-4% NaCl混合，振荡3~5 分钟，使溶液与样品充分接触；20°C、8000r/min，离心5分钟；转移上清液到另一个离心管 中，加入lmL lmol/L NaOH祸旋30s，称取4~5g NaCl加入上清液中，祸旋振荡lmin，保证 溶液为过饱和状态，加入10mL乙酸乙酯，振荡混匀，静置5分钟，20°C、8000r/min，离心5分 钟，吸取上层有机相于另一支离心管中，65°C氮气吹干，加入lmL提取液，，必要时用正己烷 纯化，吸取水相100 U L试纸条检测。
[0089] 在每克待测样品中分别加入标准品Ong、15ng、20ng、25ng，样品种类包括 生鲜猪 肉、动物肝脏、猪肉松、牛肉干，参照国标方法[4° ]检测均为阴性，样品实验前均粉碎匀浆。
[0090] 5. 5结果分析与讨论
[0091] 5. 5. 1猪肉组织粗提法选择
[0092] 如图5显示，依据方法二的提取方式处理样品后，试纸条结果显色为阴性，其他三 组检测结果为阳性。方法二与其他组的差别是没有经过加热，直接用提取液上样，而提取液 中含有可溶性血红蛋白，在层析时对抗原抗体的免疫反应产生干扰，影响试纸条灵敏度。因 此提取液在上样前必须除去可溶性蛋白及杂质。方法四在方法三的基础上增加了一次提取 过程，但检测结果无差异性，因此根据实际样品状态和性质选择方法一或方法三即可。
[0093] 5. 5. 2样品提取缓冲液选择
[0094] 根据盐酸克伦特罗在不同pH条件下均具有水溶性，分别选择酸性、中性、碱性 溶液提取，如图6中，试纸条检测结果如下：从左至右，提取液依次为0. 01mol/L盐酸、 0. 01mol/LNa0H、0. 01mol/L乙酸钠、0. 01mol/L pH7. 4PBS。左侧两个试纸条完全没有条带产 生，试纸条检测无效；右侧两个试纸条结果显色准确，均为阴性，因此用乙酸铵和PBS缓冲 液作为提取液效果均良好，本实验选择PBS作为提取液。
[0095] 可以看出，试纸条检测时对上样液的pH环境有要求。虽然盐酸克伦特罗在酸性与 碱性均可溶，但导致试纸条无效，提取液扩散时金标抗体失活，同时影响了试纸条上羊抗鼠 与包被抗原活性，造成免疫反应无法发生。中性偏弱碱性较为适合，不会破坏金标抗体，免 疫反应环境温和，保证试纸条检测性能。
[0096] 5. 5. 3试纸条在猪肉组织中的检测应用
[0097] 为了检测粗提取方法效果，进行5. 3的实验，观察试纸条在实际样品中的检测情 况，如图7所示。当样品中标准品添加量为18ng/g时，试纸条恰好消线，进一步说明粗提取 方法三在对猪肉组织检测时具有借鉴意义，可筛查CLB残留较高的样品。
[0098] 5. 5. 4样品前处理方法优化
[0099] 根据粗提取方法提供的经验，设计了优化方案一和优化方案二，以生鲜猪肉、动物 肝脏、猪肉松和牛肉干为检测对象，通过加标的方式，比较两种样品前处理方法，检测结果 如图8、图9所示。
[0100] 用优化方案一的处理方法对加标品后的样品处理，猪肉和猪肉松在加标15ng时 便可被检出，而牛肉干和动物肝脏在加标20ng时使检测线（T线）消线，所有样品空白对照 组检测正常；用优化方案二处理加标样品，猪肉、猪肉松和动物肝脏在加入15ng时均可被 检出，而牛肉干仍然在加标20ng时才被检出。两种方法对比，优化方案二对处理动物肝脏 较为有效。
[0101] 两种样品前处理方案均具有一定的实用性，方案一的特点是耗时短，处理快，无蛋 白影响；方案二利用酸性高盐溶液使蛋白变性沉淀，释放被蛋白结合的盐酸克伦特罗，过饱 和盐溶液使得其更易被乙酸乙酯萃取，提取更充分，尤其是对动物肝脏样品处理时效果显 著。
[0102] 动物性加工食品中有添加油脂和调味料，使得最终的提取液不够澄清，影响上样， 此时加入lmL正己烷可萃取这些物质，检测时取下层清液即可，处理效果见图10。
[0103] 本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应 认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素 包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水 垫依次搭接在所述PVC底板上，其特征在于：所述结合垫包被设有盐酸克伦特罗单克隆抗 体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有盐 酸克伦特罗抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。2. -种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下 步骤： 步骤一、胶体金的制备：取1个250mL烧杯，加入IOOmL0.Ol%氯金酸溶液，于恒温磁 力搅拌器上使用温度档400°C对其进行加热，转速为300r/min，加热至沸腾状态后，沸腾时 的实际温度为l〇〇°C，向烧杯中快速加入I. 8mL1%柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为红 色后再加热lOmin，直至溶液透亮，冷却至室温，4°C密封保存，即制得胶体金； 步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7. 4的所述胶体金ImL于2.OmL离心管 中，向离心管中加入4.5yg/ml的盐酸克伦特罗单克隆抗体，用涡旋仪涡旋IOmin后静置 15min;向离心管中加入60yL1%BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，4°C封闭，静置lOmin，制 得金标抗体，即盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金标记物； 同时，将制得的金标抗体溶液于4°C2500r/min，离心lOmin，去除下层沉淀，将上清液 转到另一离心管中，于4°C11000r/min，离心30min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液 稀释至原体积的1/20,于4°C保存备用； 步骤三、试纸条的组装：（1)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底 板上，吸水垫压住NC膜上方l-2mm; (2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切 割成4mm宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体 溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成Icm长的小块并贴于PVC底 板上，金标垫压住NC膜下方l-2mm，同时用样品垫压住金标垫下方l-2mm，根据试纸条长度 修剪样品垫；(5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被盐酸克伦特罗抗原和羊抗鼠 IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速 度40mm/s，单位喷量：检测线为0. 8yL/cm，质控线为I.OyL/cm，使得盐酸克伦特罗抗原包 被浓度为〇. 2mg/mL;羊抗鼠IgG包被浓度为I.Omg/mL。3. 如权利要求2所述的一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其 特征在于：在所述步骤三（3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫 与金标结合垫用切条机分别切成4_宽的长条，用含有5%的蔗糖、5%BSA和终体积浓度 为0. 1 %的pH为7. 4的0.Olmol/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37°C条件 下烘干12h备用。4. 如权利要求2所述的一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其 特征在于：还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验所用容器在重铬酸钾洗 液中浸泡24h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器 于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡Imin后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放 置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37°C进行干燥处理，备 用。
【专利摘要】本发明公开了一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上，所述结合垫包被设有盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有盐酸克伦特罗抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG；本发明同时公开了上述胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括胶体金的制备、金标抗体的制备及纯化及试纸条的组装步骤。本发明的胶体金免疫层析试纸条具有特异性强、灵敏度高、操作简便，检测快速、准确并适合现场使用的特点。
【IPC分类】G01N33/558, G01N33/74, G01N33/531
【公开号】CN104897908
【申请号】CN201510258151
【发明人】周常义, 苏文金, 苏国成, 李健, 马静
【申请人】集美大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月20日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测的技术领域，尤其涉及一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试 纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 盐酸克伦特罗属e-肾上腺激素类药物，这种物质在动物生长同时提高饲养效 率，抑制脂肪形成，促进脂类物质分解，增加组织蛋白质。但值得关注的是，食用含一定量 0 _肾上腺激素的动物组织或食品会对人体健康造成威胁。在美国和澳大利亚允许使用一 定量的莱克多巴胺用于猪和牛的饲养，中国和大多数欧洲国家禁止将0 _肾上腺激素类的 药物添加于动物饲料中。
[0003] 考虑到0 _肾上腺激素的非法使用情况及其残留对人体健康的危害性，目前急需 一种灵敏高的方法来检测肾上腺激素。现已有关于检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和 其他肾上腺激素的检测方法，报道多是定性法和定量法。定量方法中有液相色谱法、气 相色谱法、液质联用等，这些方法均需要较繁琐的样品前处理步骤及配合有专业技能的人 员进行操作；免疫分析方法多进行定性判断，这类检测方法快速且准确。
[0004] 此外，e -肾上腺激素的产量不断增加，这类药物会进入到减肥产品及运动员的饮 食中，因此需要高效快速的检测手段实现该类药物残留的监控。检测方法应当具备耗时少、 成本低，可满足检测大量样品，利于简单分析定性。已经发展利用起来的免疫检测方法包括 ELISA、免疫层析法和免疫S印aration-ELISA，这些方法可同时检测0 -肾上腺激素中的几 种。近年来，将免疫层析技术用于盐酸克伦特罗的检测已成热门，低成本投入使许多生物公 司纷纷开始进行胶体金免疫层析试纸条的研制。
[0005] 在现有技术中，目前市售的盐酸克伦特罗胶体金试纸条种类繁多，国内各类生物 公司研制出的试纸条检测范围在3~5ppb，检测多以猪尿液为主，对控制含有CLB猪肉流 入市场较为有效。但检测工作仍以抽检方式进行，不能确保所有流入市场的动物生鲜肉品 及其相关产品都是安全可靠的，对于动物活体组织为对象的盐酸克伦特罗胶体金试纸条尚 未有开发，这主要是基于对于此类样本的处理，目前还没有一个完善科学的处理方法。
[0006] 有鉴于此，本发明人研宄和设计了一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条 及其制备方法，本案由此产生。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种特异性强、操作简便，检测快速、准确并适合现场使用 的专门用于检测动物物体组织的检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条及其制备方法， 以符合实际的检测需求，依据本试纸条可以确保流入市场的动物生鲜肉品及其相关产品的 安全可靠性。
[0008] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：
[0009] 一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素 包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水 垫依次搭接在所述PVC底板上，所述结合垫包被设有盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金标 记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有盐酸克伦特罗抗 原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
[0010] 一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0011] 步骤一、胶体金的制备：取1个2501^烧杯，加入10011^0.01%氯金酸溶液，于恒 温磁力搅拌器上使用温度档400°C对其进行加热，转速为300r/min，加热至沸腾状态后，沸 腾时的实际温度为l〇〇°C，向烧杯中快速加入1. 8mL 1 %柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变 为红色后再加热lOmin，直至溶液透亮，冷却至室温，4°C密封保存，即制得胶体金；
[0012] 步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7. 4的所述胶体金lmL于2. OmL离 心管中，向离心管中加入4. 5 y g/ml的盐酸克伦特罗单克隆抗体，用涡旋仪涡旋lOmin后静 置15min ;向离心管中加入60 y L 1% BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，4°C封闭，静置lOmin， 制得金标抗体，即盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金标记物；
[0013] 同时，将制得的金标抗体溶液于4°C 2500r/min，离心10min，去除下层沉淀，将上 清液转到另一离心管中，于4°C 11000r/min，离心30min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释 溶液稀释至原体积的1/20,于4°C保存备用；
[0014] 步骤三、试纸条的组装：（1)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC 底板上，吸水垫压住NC膜上方l-2mm ; (2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上 切割成4_宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4_宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗 体溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成lcm长的小块并贴于PVC 底板上，金标垫压住NC膜下方l-2mm，同时用样品垫压住金标垫下方l-2mm，根据试纸条长 度修剪样品垫；（5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被盐酸克伦特罗抗原和羊抗鼠 IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速 度40mm/s，单位喷量：检测线为0. 8 yL/cm，质控线为1. 0 yL/cm，使得盐酸克伦特罗抗原包 被浓度为〇. 2mg/mL ;羊抗鼠IgG包被浓度为1. 0mg/mL。
[0015] 作为实施例的优选方式，在所述步骤三（3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前 处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4_宽的长条，用含有5%的蔗 糖、5% BSA和终体积浓度为0. 1 %的pH为7. 4的0. 01m〇l/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后 将溶液沥干，在37°C条件下烘干12h备用。
[0016] 作为实施例的优选方式，还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验 所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3 次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡lmin后进行硅化处理；将经 过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中 37 °C进行干燥处理，备用。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有下列优点：
[0018] 1、本发明的检测盐酸克伦特罗的胶体金免疫层析试纸条，具有特异性强，灵敏度 高，检测时间短等优点，可以广泛应用于动物的活体组织检测。
[0019] 2、本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，可现场操作，检测成本低。
[0020] 3、本发明的检测试纸条操作简便，不需要专业人员操作。
[0021] 4、本发明对样品垫与金标垫进行了前处理，使得样品垫与金标垫具有优异的吸水 能力及释放能力，进而大大提尚了检测能力。
[0022] 5、本发明对试验所用容器都进行清洗，最终增强了金标抗体的稳定性。
[0023] 6、本发明可以同时检测液体样品和组织样品，无需分开检测，而传统的试纸条对 于这两种样品是分开检测的。
[0024] 7、本发明的胶体金标记抗体时最佳蛋白标记量的确定采用了氯化钠破坏法与性 能实验相结合的方法，在提高检测的灵敏度的同时，节省了抗体使用量。
[0025] 说明书附图
[0026] 图1为本发明胶体金免疫层析试纸条的结构示意图；
[0027] 图2为本发明实施例4试纸条灵敏度测试结果图；
[0028] 图3为本发明实施例4试纸条稳定性测试保存温度选择；
[0029] 图4为本发明实施例4试纸条稳定性测试室温保存10天、30天、60天、90天试纸 条性能对比；
[0030] 图5为本发明实施例5样品测试的猪肉组织粗提取方法选择检测结果，其中，从左 至右依次为粗提取方法一、方法二、方法三、方法四经加标后的检测结果；
[0031] 图6为本发明实施例5样品测 试的样品提取缓冲液选择检测结果图；其中，从左至 右依次是0. 〇lmol/L的盐酸、氢氧化钠、乙酸铵、PBS ;
[0032] 图7为本发明实施例5样品测试的试纸条在猪肉组织中的检测结果；其中，从左至 右标品添加量为 50ng/g、40ng/g、30ng/g、25ng/g、20ng/g、18ng/g、15ng/g、0ng/g ;
[0033] 图8为本发明实施例5样品测试的前处理优化方案一检测结果部分展示；其中，从 左至右样品依次为每克猪肉（加标品〇ng、15ng)、每克牛肉干（加标品0ng、15ng、20ng)、每 克猪肉松（加标品〇ng、15ng)、每克动物肝脏（加标品0ng、15ng、20ng);
[0034] 图9为本发明实施例5样品测试的前处理优化方案二检测结果部分展示；其中，从 左至右样品依次为每克猪肉（加标品〇ng、15ng)、每克牛肉干（加标品0ng、15ng、20ng)、每 克猪肉松（加标品〇ng、15ng)、每克动物肝脏（加标品0ng、15ng);
[0035] 图10为本发明实施例5样品测试的正己烷对动物性加工食品提取液的处理效果； 其中，左侧为牛肉干提取液，右侧为猪肉松提取液。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1
[0037] 如图1所示，本发明揭示了一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条，包括 样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素包被膜3、吸水垫4及PVC底板5,所述样品垫1、所述结合垫 2、所述硝酸纤维素包被膜3及所述吸水垫4依次搭接在所述PVC底板5上：所述结合垫2 包被设有盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜3上设有检测 线31和质控线32,所述检测线31包被有盐酸克伦特罗抗原，所述质控线32包被有羊抗鼠 IgG〇
[0038] 实施例2
[0039] 一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0040]步骤一、胶体金的制备：取1个250mL烧杯，加入100mL 0. 01 %氯金酸溶液，于恒 温磁力搅拌器上使用温度档400°C对其进行加热，转速为300r/min，加热至沸腾状态后，沸 腾时的实际温度为l〇〇°C，向烧杯中快速加入1. 8mL 1 %柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变 为红色后再加热lOmin，直至溶液透亮，冷却至室温，4°C密封保存，即制得胶体金；
[0041] 步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7. 4的所述胶体金lmL于2. OmL离 心管中，向离心管中加入4. 5 y g/ml的盐酸克伦特罗单克隆抗体，用涡旋仪涡旋lOmin后静 置15min ;向离心管中加入60 y L 1% BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，4°C封闭，静置lOmin， 制得金标抗体，即盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金标记物；
[0042] 同时，将制得的金标抗体溶液于4°C 2500r/min，离心10min，去除下层沉淀，将上 清液转到另一离心管中，于4°C 11000r/min，离心30min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释 溶液稀释至原体积的1/20,于4°C保存备用；
[0043] 步骤三、试纸条的组装：（1)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC 底板上，吸水垫压住NC膜上方l-2mm ; (2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上 切割成4_宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4_宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗 体溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成lcm长的小块并贴于PVC 底板上，金标垫压住NC膜下方l-2mm，同时用样品垫压住金标垫下方l-2mm，根据试纸条长 度修剪样品垫；（5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被盐酸克伦特罗抗原和羊抗鼠 IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速 度40mm/s，单位喷量：检测线为0. 8 yL/cm，质控线为1. 0 yL/cm，使得盐酸克伦特罗抗原包 被浓度为〇. 2mg/mL ;羊抗鼠IgG包被浓度为1. 0mg/mL。
[0044] 作为实施例的优选方式，在所述步骤三（3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前 处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4_宽的长条，用含有5%的蔗 糖、5% BSA和终体积浓度为0. 1 %的pH为7. 4的0. 01m〇l/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后 将溶液沥干，在37°C条件下烘干12h备用。
[0045] 作为实施例的优选方式，还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验 所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3 次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡lmin后进行硅化处理；将经 过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中 37 °C进行干燥处理，备用。
[0046] 实施例3胶体金标记抗体时最佳蛋白标记量的确定
[0047] 氯化钠破坏法：取1. 5mL洁净的PC管，用lmL胶体金溶液标记抗体，如表1，用 0. 2mol/L K2C03的添加量调节pH，分别加入抗体量1、2、3、4、5 y g，中档转速充分涡旋1~ 2min，4°C静置30min，再加入100 y L 10% NaCl混匀3min，4°C反应30min，观察溶液的变色 情况。依据Mey氏稳定化实验，不发生变色的离心管中所加入的抗体量增加20%即为最小 标记抗体量。抗体标记量不宜过高，一方面造成成本的增加，另一方面游离的抗体会影响试 纸条灵敏度。该实验结果作为抗体标记量参考值，具体标记量可在此范围附近作调整，根据 试纸条检测效果选择最佳抗体标记量。
[0048] 表1最低标记蛋白量的确定
[0049]
[0050] 性能实验：取3个离心管，編号为1~3号，各加lmL胶体金溶液，调节溶液至最佳 PH，根据氯化钠破坏法的实验结果，实验中对1~3号管分别标记0 y g、3. 5 y g、4. 0 y g的 抗体蛋白，加入l〇〇yL 10% BSA封闭保护金标液，金标液经纯化、稀释，親合到金标垫上， 与NC膜组装成试纸条，分别测试100 y g/L的阳性标准品和阴性PBS溶液，对比抗体加入量 的不同对试纸条显色的影响，准确判断最佳标记量。
[0051] 探索胶体金标记抗体蛋白的最佳标记量，各离心管中的溶液发生反应后颜色发生 了变化，其中，1、2、3号管抗体蛋白的加入量不能够稳定胶体金体系，加入氯化钠后，产生的 盐离子效应，破坏了胶体金的平衡，使溶液出现了由红色变蓝色或紫色的不同程度的聚沉 现象，4号管溶液有轻微变色，说明加入氯化钠后对溶液的影响较小，5号管加入的抗体量 可以稳定胶体金体系，所以加入氯化钠后对溶液没有影响，考虑到胶体金标记抗体后加入 的稳定剂BSA对体系的保护作用，本探索实验初步选择4号、5号管两组为合适的抗体加入 量，即最低抗体标记量为4. 5 y g/mL或5. 0 y g/mL。
[0052] 为更准确的确定最佳抗体标记量，结合氯化钠实验法的选择结果，选择抗体标记 量为4. 5 y g/ml、5. 0 y g/ml、5. 5 y g/ml进行了性能实验，分别对三种标记量的试纸条进 行同浓度的阴性样本和阳性样本测试，三组试纸条的检测结果无差异，说明抗体标记量为 4. 5 y g/ml时稳定剂BSA保护了反应体系，不影响试纸条性能，因此为节省抗体使用量和提 高检测的灵敏度，本实验选择胶体金标记抗体蛋白时，最佳抗体标记量为4. 5 y g/ml。
[0053] 实施例4试纸条的性能评价
[0054] 4. 1试纸条的灵敏度
[0055] 盐酸克伦特罗标品可溶于水，先将粉末状标品配制成浓度为10 y g/mL储备液，再 用 0? 01mol/L pH7. 4PBS 稀释为所需的浓度梯度：3ng/mL、5ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、15ng/ mL、20ng/mL，以PBS缓冲液作为阴性 对照。上样时，阴性样本及各浓度标品取100 y L，滴 于样品垫，观察各组显线情况。当试纸条质控线（C线）处有红色条带形成，说明试纸条正 常有效的，否则该试纸条作废；当试纸条产生两条清晰红色条带，即质控线（C线）、检测线 (T线）均发生免疫反应，两线显色程度一致，此时说明阴性样本正常；当滴加不同浓度标品 时，检测线（T线）显色程度随着CLB浓度的增加而降低，将恰好消除T线时的标品浓度定 为试纸条的灵敏度。
[0056] 将梯度稀释的盐酸克伦特罗标液等体积上样于制备好的试纸条，当检测线（T线） 恰好消线时，作为试纸条灵敏度值。如图2所示，由左至右标品浓度依次为0ng/mL、20ng/ mL、10ng/mL、8ng/mL、5ng/mL、3ng/mL，在8ng/mL时，试纸条检测线（T线）恰好消线，当浓度 继续减小时结果为假阴性，因此本实验制备的试纸条灵敏度在8ng/mL。
[0057] 4. 2交叉反应率
[0058] 选择与CLB性质相似的0 -受体激动剂，常用的有莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他 林和马布特罗，用0.0 lmol/L PB缓冲液稀释上述高浓度标品，分别配制成浓度为5ng/mL、 25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL待测液，此外再将这五类标品配制成两种混合溶液， 每种各组分比例相同，即每毫升各含5ng (混合0 -受体激动剂25ng/mL)、15ng (混合0 -受 体激动剂75ng/mL)。取100 y L作为待检液，观察试纸条检测线（T线）显色情况。
[0059] 如表2所示，除了盐酸克伦特罗标品在25~100ng/ml范围内检测为阳性外，其他 各单类标准物质均无阳性反应；混合标准物质中，混标1检测为阴性，混标2检测为阳性； 综上说明，试纸条特异性好，与其他0 _受体激动剂无交叉反应，即使混合上样，只要盐酸 克伦特罗含量高于检测线便可被检测。
[0060] 表2试纸条交叉反应测试
[0062] 注：" + "表示检测结果为阳性，"一"表示检测结果为阴性，"/"表示未实验
[0063] 4. 3试纸条的稳定性
[0064] 试纸条研发应处于恒定的温湿度环境，保证每次制备出的试纸条性能稳定。将试 纸条分别密封存放在4°C、室温16~18°C及37°C，存放30天后取出分别进行阴性、阳性试 验，观察存放温度对试纸条性能的影响。
[0065] 对同批次制备出的试纸条分别在室温干燥的铝箔袋中存放10天、30天、60天和90 天；对不同批次制备的试纸条比较存放30天后试纸条性能变化。分别上样后观察阴性组和 阳性组的显线情况。
[0066] 如图3所示，同批次制备的试纸条在4°C、室温、37°C保存30天后，每个温度下分别 用阴性样本和8ng/mL盐酸克伦特罗标品上样，每组3个平行。明显看出，37°C下保存后试 纸条阴性样本检测线（T线）显色程度下降，金标抗体与包被抗原免疫反应减弱，影响检测 结果判断。4°C与室温保存的试纸条性能相对稳定，故试纸条保存时可放于4°C或室温。
[0067] 如图4反映在室温下随着保存时间的延长试纸条性能变化，均以阴性样本和阳性 标液作参照，在10~60天内试纸条性能稳定，各组显色程度无差异，结果正确，灵敏度好； 当保存90天后，试纸条稳定性受到影响，阴性样本检测线（T线）明显颜色变淡，可能包被 抗原活性降低，单抗更多的与羊抗鼠发生反应。综上，在室温下试纸条可以稳定保存60天。
[0068] 不同批次间试纸条质量对比见表3所示，五个批次下，室温保存30天后，分别抽取 30个试纸条进行实验，阴性、阳性对照各15个，其中仅有个别试纸条性能不稳定，试纸条质 量合格率在97%，说明试纸条制备工艺较为合理，不同批次间差异性小，可用于实际样品检 测。
[0069] 表3不同批次间试纸条稳定性测试
[0071] 实施例5样品测试
[0072] 盐酸克伦特罗试纸条目前在猪尿检测中应用广泛，直接接取个体猪的尿液，适量 上样即可，对控制含有CLB猪肉流入市场较为有效。但检测工作仍以抽检方式进行，不能确 保所有流入市场的动物生鲜肉品及其相关产品都是安全可靠的，因此选择合理的样品处理 方式，使试纸条得以充分发挥作用。
[0073] 5. 1生鲜猪肉组织中盐酸克伦特罗粗提方法
[0074] 盐酸克伦特罗易溶于水，新鲜的动物组织有弹性，含水分较高，组织液中可残留盐 酸克伦特罗，为了较快的获得检测液，设计粗提取方法如下：
[0075] 方法一：均质组织样品，称取2g样品于10mL离心管中，80~100 °C水浴加热 lOmin，20°C、8000r/min离心5min，取组织渗出液待检。
[0076] 方法二：均质组织样品，称取2g样品于10mL离心管中，加入提取液lmL，高速涡旋 混勾lmin，20°C、8000r/min，离心5min，取上层液待检。
[0077] 方法三：均质组织样品，称取2g样品于10mL离心管中，加入提取液lmL，高速涡旋 混勾lmin，在80~100°C水浴加热5~lOmin，8000r/min，离心5min，取上清液待检。
[0078] 方法四：均质组织样品，称取2g样品于10mL离心管中，加入提取液500uL，高速涡 旋混勾lmin，在80~100°C水浴加热5~lOmin，8000r/min，离心3min，取上清液于一支新 离心管中，再向样品组织中加入500 yL提取液，高速祸旋2min，10000r/min，离心3min，合 并两次上清液待检。
[0079] 上述方法中的生鲜猪肉组织，经检测不含盐酸克伦特罗成分，因此可作为本实验 阴性样品。
[0080] 粗提方法中所使用的每克样品中均加入盐酸克伦特罗标准品25ng，方法中提取液 采用超纯水，提取液不足lmL的用水补足。
[0081] 5. 2样品提取缓冲液优化
[0082] 采用方法三，样品中不添加标品物质，提取液选择0? Olmol/L盐酸、0? Olmol/L Na0H、0. 01m〇l/L乙酸铵、0? 01m〇l/L pH7. 4PBS，根据试纸条检测情况确定合理的提取液。
[0083] 5. 3试纸条在猪肉组织检测中的应用
[0084] 根据5. 1和5. 2确定的样品粗提取方法，在每克猪肉样品中加入标准品50ng、 40ng、30ng、25ng、20ng、18ng、15ng、0ng，取上层提取液定容至lmL，混勾后分别取100 y L上 样，观察试纸条对猪肉组织中CLB检测情况。
[0085] 5. 4样品前处理方法优化
[0086] 样品粗提法仅适用于生鲜组织，对一些加工食品（如猪肉松、牛肉干）及肝脏组织 则需要更充分的处理，提取环节进一步优化，方法如下：
[0087] 优化方案一：称取均质组织样品2g，加入lmL 10% K2C03，再加入5mL乙酸乙酯，高 速匀浆5分钟；20°C、8000r/min，离心5分钟；移取上层萃取液于另一支试管中，再向残渣 中加入10mL乙酸乙醋，涡旋2分钟，相同条件离心后，合并两次萃取液；65°C氮气吹干，加入 lmL提取液复溶CLB，必要时用正己烷纯化，吸取水相100 y L试纸条检测。
[0088] 优化方案二：称取2g均质样品与5mL 0. 2mol/L HC1-4% NaCl混合，振荡3~5 分钟，使溶液与样品充分接触；20°C、8000r/min，离心5分钟；转移上清液到另一个离心管 中，加入lmL lmol/L NaOH祸旋30s，称取4~5g NaCl加入上清液中，祸旋振荡lmin，保证 溶液为过饱和状态，加入10mL乙酸乙酯，振荡混匀，静置5分钟，20°C、8000r/min，离心5分 钟，吸取上层有机相于另一支离心管中，65°C氮气吹干，加入lmL提取液，，必要时用正己烷 纯化，吸取水相100 U L试纸条检测。
[0089] 在每克待测样品中分别加入标准品Ong、15ng、20ng、25ng，样品种类包括 生鲜猪 肉、动物肝脏、猪肉松、牛肉干，参照国标方法[4° ]检测均为阴性，样品实验前均粉碎匀浆。
[0090] 5. 5结果分析与讨论
[0091] 5. 5. 1猪肉组织粗提法选择
[0092] 如图5显示，依据方法二的提取方式处理样品后，试纸条结果显色为阴性，其他三 组检测结果为阳性。方法二与其他组的差别是没有经过加热，直接用提取液上样，而提取液 中含有可溶性血红蛋白，在层析时对抗原抗体的免疫反应产生干扰，影响试纸条灵敏度。因 此提取液在上样前必须除去可溶性蛋白及杂质。方法四在方法三的基础上增加了一次提取 过程，但检测结果无差异性，因此根据实际样品状态和性质选择方法一或方法三即可。
[0093] 5. 5. 2样品提取缓冲液选择
[0094] 根据盐酸克伦特罗在不同pH条件下均具有水溶性，分别选择酸性、中性、碱性 溶液提取，如图6中，试纸条检测结果如下：从左至右，提取液依次为0. 01mol/L盐酸、 0. 01mol/LNa0H、0. 01mol/L乙酸钠、0. 01mol/L pH7. 4PBS。左侧两个试纸条完全没有条带产 生，试纸条检测无效；右侧两个试纸条结果显色准确，均为阴性，因此用乙酸铵和PBS缓冲 液作为提取液效果均良好，本实验选择PBS作为提取液。
[0095] 可以看出，试纸条检测时对上样液的pH环境有要求。虽然盐酸克伦特罗在酸性与 碱性均可溶，但导致试纸条无效，提取液扩散时金标抗体失活，同时影响了试纸条上羊抗鼠 与包被抗原活性，造成免疫反应无法发生。中性偏弱碱性较为适合，不会破坏金标抗体，免 疫反应环境温和，保证试纸条检测性能。
[0096] 5. 5. 3试纸条在猪肉组织中的检测应用
[0097] 为了检测粗提取方法效果，进行5. 3的实验，观察试纸条在实际样品中的检测情 况，如图7所示。当样品中标准品添加量为18ng/g时，试纸条恰好消线，进一步说明粗提取 方法三在对猪肉组织检测时具有借鉴意义，可筛查CLB残留较高的样品。
[0098] 5. 5. 4样品前处理方法优化
[0099] 根据粗提取方法提供的经验，设计了优化方案一和优化方案二，以生鲜猪肉、动物 肝脏、猪肉松和牛肉干为检测对象，通过加标的方式，比较两种样品前处理方法，检测结果 如图8、图9所示。
[0100] 用优化方案一的处理方法对加标品后的样品处理，猪肉和猪肉松在加标15ng时 便可被检出，而牛肉干和动物肝脏在加标20ng时使检测线（T线）消线，所有样品空白对照 组检测正常；用优化方案二处理加标样品，猪肉、猪肉松和动物肝脏在加入15ng时均可被 检出，而牛肉干仍然在加标20ng时才被检出。两种方法对比，优化方案二对处理动物肝脏 较为有效。
[0101] 两种样品前处理方案均具有一定的实用性，方案一的特点是耗时短，处理快，无蛋 白影响；方案二利用酸性高盐溶液使蛋白变性沉淀，释放被蛋白结合的盐酸克伦特罗，过饱 和盐溶液使得其更易被乙酸乙酯萃取，提取更充分，尤其是对动物肝脏样品处理时效果显 著。
[0102] 动物性加工食品中有添加油脂和调味料，使得最终的提取液不够澄清，影响上样， 此时加入lmL正己烷可萃取这些物质，检测时取下层清液即可，处理效果见图10。
[0103] 本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应 认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素 包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水 垫依次搭接在所述PVC底板上，其特征在于：所述结合垫包被设有盐酸克伦特罗单克隆抗 体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有盐 酸克伦特罗抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。2. -种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下 步骤： 步骤一、胶体金的制备：取1个250mL烧杯，加入IOOmL0.Ol%氯金酸溶液，于恒温磁 力搅拌器上使用温度档400°C对其进行加热，转速为300r/min，加热至沸腾状态后，沸腾时 的实际温度为l〇〇°C，向烧杯中快速加入I. 8mL1%柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为红 色后再加热lOmin，直至溶液透亮，冷却至室温，4°C密封保存，即制得胶体金； 步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7. 4的所述胶体金ImL于2.OmL离心管 中，向离心管中加入4.5yg/ml的盐酸克伦特罗单克隆抗体，用涡旋仪涡旋IOmin后静置 15min;向离心管中加入60yL1%BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，4°C封闭，静置lOmin，制 得金标抗体，即盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金标记物； 同时，将制得的金标抗体溶液于4°C2500r/min，离心lOmin，去除下层沉淀，将上清液 转到另一离心管中，于4°C11000r/min，离心30min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液 稀释至原体积的1/20,于4°C保存备用； 步骤三、试纸条的组装：（1)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底 板上，吸水垫压住NC膜上方l-2mm; (2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切 割成4mm宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体 溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成Icm长的小块并贴于PVC底 板上，金标垫压住NC膜下方l-2mm，同时用样品垫压住金标垫下方l-2mm，根据试纸条长度 修剪样品垫；(5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被盐酸克伦特罗抗原和羊抗鼠 IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速 度40mm/s，单位喷量：检测线为0. 8yL/cm，质控线为I.OyL/cm，使得盐酸克伦特罗抗原包 被浓度为〇. 2mg/mL;羊抗鼠IgG包被浓度为I.Omg/mL。3. 如权利要求2所述的一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其 特征在于：在所述步骤三（3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫 与金标结合垫用切条机分别切成4_宽的长条，用含有5%的蔗糖、5%BSA和终体积浓度 为0. 1 %的pH为7. 4的0.Olmol/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37°C条件 下烘干12h备用。4. 如权利要求2所述的一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其 特征在于：还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验所用容器在重铬酸钾洗 液中浸泡24h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器 于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡Imin后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放 置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37°C进行干燥处理，备 用。
【专利摘要】本发明公开了一种检测盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上，所述结合垫包被设有盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有盐酸克伦特罗抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG；本发明同时公开了上述胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括胶体金的制备、金标抗体的制备及纯化及试纸条的组装步骤。本发明的胶体金免疫层析试纸条具有特异性强、灵敏度高、操作简便，检测快速、准确并适合现场使用的特点。
【IPC分类】G01N33/558, G01N33/74, G01N33/531
【公开号】CN104897908
【申请号】CN201510258151
【发明人】周常义, 苏文金, 苏国成, 李健, 马静
【申请人】集美大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月20日
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