一种促黄体生成素(lh)化学发光免疫分析法定量检测试剂盒的制作方法
一种促黄体生成素(lh)化学发光免疫分析法定量检测试剂盒的制作方法
【技术领域】：
[0001]本发明涉及促黄体生成素（LH)化学发光免疫分析法定量测定试剂盒，属于化学 发光免疫分析法检测领域。
【背景技术】：
[0002] 促黄体生成素（Luteinizing Hormone，LH)是人体中重要的内分泌激素。内分泌 功能障碍，可导致人体多种疾病的发生，因此准确检测体内激素水平对诊断内分泌疾病有 着重要的意义。
[0003] 促黄体生成素（LH)与促卵泡刺激素（FSH) -样同属促性腺激素家族，二者协同调 节和刺激性腺（卵巢和睾丸）的发育和功能。与FSH、TSH(促甲状腺激素）和hCG(人绒 毛膜促性腺激素）一样，LH也是糖蛋白，由两种亚单位（a和0)组成，含121个氨基酸和 3条糖链，分子量29. 5kD。在有卵泡刺激素存在下，与其协同作用，刺激卵巢激素分泌，使卵 泡成熟与排卵，使破裂卵泡形成黄体并分泌雌激素和孕激素。刺激睾丸间质细胞发育并促 进其分泌睾酮。故又称间质细胞促进素。促黄体生成素的分泌受下丘脑促黄体生成素释放 激素的调节，是由脑垂体千叶分泌的促性腺素的一种，作用于卵巢的黄体或黄体细胞，促进 孕激素的分泌。
[0004]对于女性，该激素在下丘脑-垂体-卵巢调节环路中发挥作用，控制月经周期。LH 和FSH从垂体的促性腺细胞中阵发性的释放，经血流到达卵巢，在卵巢中LH和FSH -起刺 激卵泡的成长和成熟，进而刺激雌激素和雄激素的生物合成。LH水平在月经周期的中期呈 现最高峰，诱导排卵和形成黄体，其主要分泌物是雄激素。在睾丸的Leyding细胞内，LH刺 激睾酮的产生。LH检测对查明下丘脑-垂体-卵巢系统的功能失常有作用。LH和FSH联 合检测还可以用于查明染色体异常的先天性的疾病、多囊性卵巢（PC0)、闭经的病因、绝经 综合征和疑有间质细胞发育不全。
[0005] 目前血清LH检测主要有酶免疫法（ELISA)、免疫放射法（IRMA)、时间分辨荧光免 疫测定（TRFIA)。由于受示踪剂性状的限制，ELISA的灵敏度不高，检测范围有限；IRMA试 剂盒受同位素半衰期的影响，有效期短，此外还有一定的放射性污染；当进行超微量分析的 时候，TRFIA受激发光的杂散光的影响很严重。
[0006]化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA)，是将具有高灵敏 度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、 酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时 间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。主要具有灵敏度高、试剂价 格低廉、试剂稳定且有效期（6-18个月）、方法稳定快速、检测范围宽、安全无毒无污染、操 作简单自动化程度高等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。
【发明内容】
：
[0007] 本发明的目的是提供一种用于LH化学发光免疫分析法定量检测的试剂盒，主要 解决现有LH检测领域存在的灵敏度低、稳定性差、操作繁琐、污染环境、试剂不稳定且价格 昂贵等问题。
[0008] 本发明的技术方案：本发明描述的促黄体生成素（LH)化学发光免疫分析法定量 检测试剂盒包括微孔板、校准品、标记物、发光底物A、发光底物B、浓缩洗涤液。本试剂盒采 用夹心法测定血清中LH水平，以抗LH抗体作为包被抗体，加入LH校准品或待测血清后，再 加入另一株抗LH抗体标记物进行反应，充分洗涤后加入发光底物测定其发光强度（RLU)， 根据标准曲线即可算出样品中LH的含量，样品的RLU值随LH浓度的增加而上升。
[0009] 本发明的基本操作如下：
[0010] 1. LH抗体包被微孔板的制备
[0011] ①包被缓冲液的制备
[0012] 柠檬酸三钠 7.0~7.4g
[0013]柠檬酸 4.2~4.6g
[0014] 纯化水加至 1000ml
[0015] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0016] ②包被工作液的制备
[0017] 取促黄体生成素（LH)，按1 y g/ml的浓度加入①中制备的包被缓冲液中，搅拌混 匀，2~8°C密封保存备用。
[0018] ③封闭液的制备
[0020] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0021] ④LH抗体包被微孔板的制备过程；
[0022] a)按所需的数量准备发光微孔板；
[0023] b)使用包被机进行包被，每孔加入100~120 y 1的包被工作液，震荡混勾，移入冰 箱（2~8°C )静置16-20小时；
[0024] c)取出步骤b)静置后的微孔板，使用包板机每孔分别加入封闭液300~350 y 1， 37 °C，放置1小时；
[0025] d)甩掉孔内的封闭液，然后在吸水纸上拍干。将拍干的微孔板放入干燥间干燥 6-8小时。
[0026] e)从干燥间中取出，立即进行封袋，2~8°C保存备用。
[0027] 2.酶标记物的制备
[0028]①酶稀释液的配制
[0029]
[0030] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0031] ②PB缓冲液的配制
[0032] 磷酸二氢钠 0? 9~1. lg
[0033] 磷酸氢二钠 5. 0~5. 3g
[0034] 纯化水加至 1000ml
[0035] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0036] ③酶标记物的制备
[0037] a)按辣根过氧化物酶：LH = 1 : 1的比例混合，加入1. 5当量碳二亚胺，混匀后 室温反应1-3小时；
[0038] b)转入透析袋中透析，用步骤②配制的PB缓冲液透析过夜；
[0039] c)转入玻璃瓶，加入质量分数1 %小牛血清白蛋白及质量分数1 %丙三醇，2~8°C 保存；
[0040] d)将标记物按稀释度1 : 20000稀释，2~8°C密封保存备用；
[0041] 3?浓缩洗涤液的配制
[0043] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0044] 4.化学发光底物的制备
[0045] ①化学发光底物液A的配制
[0047] 将上述试剂称量好放入黑色洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封避光保存备用。
[0048] ②化学发光底物液B的配制
[0049]
[0050] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0051] 5促黄体生成素（LH)定量检测试剂盒的使用
[0052] ①取出实验中所需的LH抗体包被微孔板、LH标准原料、HRP标记的LH抗体及待测 样品，待温度与室温（25°C )平衡15分钟以后使用；
[0053] ②每孔先加入25ul的校准品或待测样本，再加入150ul的标记物，用微量震荡器 充分振荡混匀，37°C温育30-45分钟。用稀释后的洗涤液洗板5次，最后在干净的吸水纸上 扣干；
[0054] ③每孔加100UL发光底物混合液；
[0055] ④步骤③中发光底物混合液是在洁净容器中预先将发光底物A鲁米诺和发光底 物B双氧水以1 : 1的比例混合均匀，现配现用。
[0056] ⑤用微量震荡器充分振荡混合均匀，在化学发光免疫分析仪上依序测量各孔的发 光强度（RLU)，测量时间1秒/孔，必须于加化学发光底物液后的第1-3分钟内测量。
[0057] ⑥待测样品的浓度计算按下列方法进行：用化学发光免疫分析仪中的数据处理程 序（拟合类型：线性拟合，坐标选择 ：l〇g(X)-log(Y)，实验方法：夹心法。进行直线拟合时， 校准品和样品发光信号应扣除〇点校准品发光信号）直接给出校准曲线及样品的浓度值。
[0058]⑦步骤⑥中数据处理程序特征是拟合类型：线性拟合，坐标选择：l〇g(X)-l〇g(Y)， 实验方法：夹心法。进行直线拟合时，校准品和样品发光信号应扣除〇点校准品发光信号。
【具体实施方式】：
[0059] 实施例1
[0060] (1)LH抗体包被微孔板的配制
[0061] ①包被缓冲液的配制
[0062] 柠檬酸三钠 7. 0g
[0063] 柠檬酸 4. 2g
[0064] 纯化水加至 1000ml
[0065] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0066] ②包被工作液的制备
[0067] 取促黄体生成素（LH)，按1 y g/ml的浓度加入步骤①中制备的包被缓冲液中，搅 拌混匀，2~8°C密封保存备用。
[0068]③封闭液的制备
[0069]
[0070] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C保存备 用。
[0071] ④LH抗体包被微孔板的制备过程
[0072] a)准备96孔发光微孔板；
[0073] b)使用包被机进行包被，每孔加入100 y L的包被工作液，震荡混匀，移入冰箱 (2~8°C )静置16小时；
[0074] c)取出步骤b)静置后的微孔板，使用包板机每孔分别加入封闭液300 yL，37°C， 放置1小时；
[0075] d)甩掉孔内的封闭液，然后在吸水纸上拍干。将拍干的微孔板放入干燥间干燥6 小时。
[0076] e)从干燥间中取出，立即进行封袋，2~8°C密封保存备用。
[0077] (2)酶标记物的制备
[0078] ①酶稀释液的配制
[0080] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0081] ②PB缓冲液的配制
[0082] 磷酸二氢钠 0? 9g
[0083] 磷酸氢二钠 5. 0g
[0084] 纯化水加至 1000ml
[0085] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0086] ③酶标记物的制备
[0087] a)按辣根过氧化物酶：LH = 1 : 1的比例混合，加入1. 5当量碳二亚胺，混匀后 室温反应1小时；
[0088] b)转入透析袋中透析，用步骤②配制的PB缓冲液透析过夜；
[0089] c)转入玻璃瓶，加入质量分数1 %小牛血清白蛋白及质量分数1 %丙三醇，2~8°C 密封保存；
[0090] d)将标记物按稀释度1 : 20000稀释，2~8°C密封保存；
[0091] e)将检测合格的酶标记物工作液分装，2~8°C密封保存备用。
[0092] (3)浓缩洗涤液的配制
[0094] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，分装2~8°C密封保存备用。
[0095] (4)化学发光底物的制备
[0096] ①化学发光底物液A的配制
[0098] 将上述试剂称量好放入黑色洁净容器中，溶解混匀，分装，2~8°C密封避光保存 备用。
[0099] ②化学发光底物液B的配制
[0101] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，分装，2~8°C密封保存备用。
[0102] (5)定量检测试剂盒检测结果
[0103] 采用检测合格的LH试剂盒检测如下项目，用化学发光免疫分析仪（北京华科泰化 学发光免疫分析仪）测定，成品检测结果如表2 :
[0104] 表2-1布板分布情况
[0106] 表2-2光子数检测
[0108]
[0109] 表2-3浓度检测结果
[0111] 本试剂盒的最低检测限：< 1. OmIU/mL
[0112] 本试剂盒的精密度的批间差为CV < 15%，重复性CV < 10%。
[0113] 本试剂盒的准确性：用国家标准品作为样本进行检测，其测量结果的相对偏差应 在±10%范围内。
[0114] 线性范围控制在2-200mIU/mL范围内，用Log-Log模型拟合，剂量-反应曲线相关 系数的绝对值（|r|)应不低于0.9900。
[0115] 本发明促黄体生成素（LH)定量检测试剂盒20个样品检测结果（表3)与罗氏公 司促黄体生成素（LH)检测试剂盒20个样品检测结果（表4)对比，促黄体生成素含量无明 显差异。
[0116] 表3本发明20个样品检测结果
[0118] 表4罗氏公司20个样品检测结果
[0120] 实施例2
[0121] (1) LH抗体包被微孔板的配制
[0122] ①包被缓冲液的配制
[0123] 柠檬酸三钠 7. 4g
[0124]柠檬酸 4.6g
[0125] 纯化水加至 1000ml
[0126] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0127] ②包被工作液的制备
[0128]取促黄体生成素（LH)，按1 y g/ml的浓度加入步骤①中制备的包被缓冲液中，搅 拌混匀，2~8°C密封保存备用。
[0129] ③封闭液的制备
[0131] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0132] ④LH抗体包被微孔板的制备过程
[0133] a)准备96孔发光微孔板；
[0134] b)使用包被机进行包被，每孔加入120 yL的包被工作液，震荡混匀，移入冰箱 (2~8°C )静置20小时；
[0135] c)取出步骤b)静置后的微孔板，使用包板机每孔分别加入封闭液350 yL，37°C， 放置1小时；
[0136] d)甩掉孔内的封闭液，然后在吸水纸上拍干。将拍干的微孔板放入干燥间干燥8 小时。
[0137] e)从干燥间中取出，立即进行封袋，2~8°C密封保存备用。
[0138] (2)酶标记物的制备
[0139] ①酶稀释液的配制
[0140]
[0141] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0142] ②PB缓冲液的配制
[0143] 磷酸二氢钠 1. lg
[0144] 磷酸氢二钠 5. 3g
[0145] 纯化水加至 1000ml
[0146] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0147] ③酶标记物的制备
[0148] a)按辣根过氧化物酶：LH = 1 : 1的比例混合，加入1. 5当量碳二亚胺，混匀后 室温反应3小时；
[0149] b)转入透析袋中透析，用步骤②配制的PB缓冲液透析过夜；
[0150] c)转入玻璃瓶，加入质量分数1 %小牛血清白蛋白及质量分数1 %丙三醇，2~8 °C 密封保存；
[0151] d)将标记物按稀释度1 : 20000稀释，2~8°C密封保存；
[0152] e)将检测合格的酶标记物工作液分装，2~8°C密封保存备用。
[0153] (3)浓缩洗涤液的配制
[0155] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，分装2~8°C密封保存备用。
[0156] (4)化学发光底物的制备
[0157] ①化学发光底物液A的配制
[0159] 将上述试剂称量好放入黑色洁净容器中，溶解混匀，分装，2~8°C密封避光保存 备用。
[0160] ②化学发光底物液B的配制
[0161]
[0162] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，分装，2~8°C密封保存备用。
[0163] 本发明促黄体生成素（LH)定量检测试剂盒20个样品检测结果与罗氏公司促黄体 生成素（LH)检测试剂盒20个样品检测结果对比，促黄体生成素含量无明显差异。
【主权项】
1. 一种促黄体生成素（LH)化学发光免疫分析法定量检测试剂盒，其特征是包含微孔 板、校准品、标记物、发光底物A、发光底物B、浓缩洗涤液。2. 根据权利要求1所述微孔板，其特征在于制备过程中所使用的包被工作液是浓度为 Iyg/ml促黄体生成素（LH)。3. 根据权利要求1所述标记物，其特征在于标记物制备过程中辣根过氧化物酶：LH的 比例是I:1。4. 根据权利要求1所述标记物，其特征在于标记物的稀释度为1 : 20000。5. 根据权利要求1中所述的化学发光底物液A，其特征在于由12.Ig三羟甲基氨基甲 烷，I.Og小牛血清白蛋白，0. 50g鲁米诺，0. 003g增强剂，加纯化水至1000 ml配制而成。6. 根据权利要求5中所述的化学发光底物液A，其特征在于增强剂为四苯硼钠。7. 根据权利要求1中所述的化学发光底物液B，其特征在于由0. 73g柠檬酸三钠， 0. 44g梓檬酸，3. 3ml30%双氧水，加纯化水至1000 ml配制而成。8. 根据权利要求1中所述的浓缩洗涤液，其特征在于稀释度1 : 30。
【专利摘要】本发明公开了一种促黄体生成素(LH)化学发光免疫分析法定量测定试剂盒，本试剂盒采用夹心法测定血清中LH水平，以抗LH抗体作为包被抗体，加入LH校准品或待测血清后，再加入另一株抗LH抗体标记物进行反应，充分洗涤后加入发光底物测定其发光强度(RLU)，根据标准曲线即可算出样品中LH的含量，样品的RLU值随LH浓度的增加而上升。本发明操作简单，测试时间短，可提高临床检验的效率。
【IPC分类】G01N33/535, G01N33/531, G01N33/76, G01N21/76
【公开号】CN104897909
【申请号】CN201510227902
【发明人】王贤俊, 江新涛, 郭二豪, 郑蓓蕾
【申请人】王贤俊
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月2日
【技术领域】：
[0001]本发明涉及促黄体生成素（LH)化学发光免疫分析法定量测定试剂盒，属于化学 发光免疫分析法检测领域。
【背景技术】：
[0002] 促黄体生成素（Luteinizing Hormone，LH)是人体中重要的内分泌激素。内分泌 功能障碍，可导致人体多种疾病的发生，因此准确检测体内激素水平对诊断内分泌疾病有 着重要的意义。
[0003] 促黄体生成素（LH)与促卵泡刺激素（FSH) -样同属促性腺激素家族，二者协同调 节和刺激性腺（卵巢和睾丸）的发育和功能。与FSH、TSH(促甲状腺激素）和hCG(人绒 毛膜促性腺激素）一样，LH也是糖蛋白，由两种亚单位（a和0)组成，含121个氨基酸和 3条糖链，分子量29. 5kD。在有卵泡刺激素存在下，与其协同作用，刺激卵巢激素分泌，使卵 泡成熟与排卵，使破裂卵泡形成黄体并分泌雌激素和孕激素。刺激睾丸间质细胞发育并促 进其分泌睾酮。故又称间质细胞促进素。促黄体生成素的分泌受下丘脑促黄体生成素释放 激素的调节，是由脑垂体千叶分泌的促性腺素的一种，作用于卵巢的黄体或黄体细胞，促进 孕激素的分泌。
[0004]对于女性，该激素在下丘脑-垂体-卵巢调节环路中发挥作用，控制月经周期。LH 和FSH从垂体的促性腺细胞中阵发性的释放，经血流到达卵巢，在卵巢中LH和FSH -起刺 激卵泡的成长和成熟，进而刺激雌激素和雄激素的生物合成。LH水平在月经周期的中期呈 现最高峰，诱导排卵和形成黄体，其主要分泌物是雄激素。在睾丸的Leyding细胞内，LH刺 激睾酮的产生。LH检测对查明下丘脑-垂体-卵巢系统的功能失常有作用。LH和FSH联 合检测还可以用于查明染色体异常的先天性的疾病、多囊性卵巢（PC0)、闭经的病因、绝经 综合征和疑有间质细胞发育不全。
[0005] 目前血清LH检测主要有酶免疫法（ELISA)、免疫放射法（IRMA)、时间分辨荧光免 疫测定（TRFIA)。由于受示踪剂性状的限制，ELISA的灵敏度不高，检测范围有限；IRMA试 剂盒受同位素半衰期的影响，有效期短，此外还有一定的放射性污染；当进行超微量分析的 时候，TRFIA受激发光的杂散光的影响很严重。
[0006]化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA)，是将具有高灵敏 度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、 酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时 间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。主要具有灵敏度高、试剂价 格低廉、试剂稳定且有效期（6-18个月）、方法稳定快速、检测范围宽、安全无毒无污染、操 作简单自动化程度高等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。
【发明内容】
：
[0007] 本发明的目的是提供一种用于LH化学发光免疫分析法定量检测的试剂盒，主要 解决现有LH检测领域存在的灵敏度低、稳定性差、操作繁琐、污染环境、试剂不稳定且价格 昂贵等问题。
[0008] 本发明的技术方案：本发明描述的促黄体生成素（LH)化学发光免疫分析法定量 检测试剂盒包括微孔板、校准品、标记物、发光底物A、发光底物B、浓缩洗涤液。本试剂盒采 用夹心法测定血清中LH水平，以抗LH抗体作为包被抗体，加入LH校准品或待测血清后，再 加入另一株抗LH抗体标记物进行反应，充分洗涤后加入发光底物测定其发光强度（RLU)， 根据标准曲线即可算出样品中LH的含量，样品的RLU值随LH浓度的增加而上升。
[0009] 本发明的基本操作如下：
[0010] 1. LH抗体包被微孔板的制备
[0011] ①包被缓冲液的制备
[0012] 柠檬酸三钠 7.0~7.4g
[0013]柠檬酸 4.2~4.6g
[0014] 纯化水加至 1000ml
[0015] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0016] ②包被工作液的制备
[0017] 取促黄体生成素（LH)，按1 y g/ml的浓度加入①中制备的包被缓冲液中，搅拌混 匀，2~8°C密封保存备用。
[0018] ③封闭液的制备
[0020] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0021] ④LH抗体包被微孔板的制备过程；
[0022] a)按所需的数量准备发光微孔板；
[0023] b)使用包被机进行包被，每孔加入100~120 y 1的包被工作液，震荡混勾，移入冰 箱（2~8°C )静置16-20小时；
[0024] c)取出步骤b)静置后的微孔板，使用包板机每孔分别加入封闭液300~350 y 1， 37 °C，放置1小时；
[0025] d)甩掉孔内的封闭液，然后在吸水纸上拍干。将拍干的微孔板放入干燥间干燥 6-8小时。
[0026] e)从干燥间中取出，立即进行封袋，2~8°C保存备用。
[0027] 2.酶标记物的制备
[0028]①酶稀释液的配制
[0029]
[0030] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0031] ②PB缓冲液的配制
[0032] 磷酸二氢钠 0? 9~1. lg
[0033] 磷酸氢二钠 5. 0~5. 3g
[0034] 纯化水加至 1000ml
[0035] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0036] ③酶标记物的制备
[0037] a)按辣根过氧化物酶：LH = 1 : 1的比例混合，加入1. 5当量碳二亚胺，混匀后 室温反应1-3小时；
[0038] b)转入透析袋中透析，用步骤②配制的PB缓冲液透析过夜；
[0039] c)转入玻璃瓶，加入质量分数1 %小牛血清白蛋白及质量分数1 %丙三醇，2~8°C 保存；
[0040] d)将标记物按稀释度1 : 20000稀释，2~8°C密封保存备用；
[0041] 3?浓缩洗涤液的配制
[0043] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0044] 4.化学发光底物的制备
[0045] ①化学发光底物液A的配制
[0047] 将上述试剂称量好放入黑色洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封避光保存备用。
[0048] ②化学发光底物液B的配制
[0049]
[0050] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0051] 5促黄体生成素（LH)定量检测试剂盒的使用
[0052] ①取出实验中所需的LH抗体包被微孔板、LH标准原料、HRP标记的LH抗体及待测 样品，待温度与室温（25°C )平衡15分钟以后使用；
[0053] ②每孔先加入25ul的校准品或待测样本，再加入150ul的标记物，用微量震荡器 充分振荡混匀，37°C温育30-45分钟。用稀释后的洗涤液洗板5次，最后在干净的吸水纸上 扣干；
[0054] ③每孔加100UL发光底物混合液；
[0055] ④步骤③中发光底物混合液是在洁净容器中预先将发光底物A鲁米诺和发光底 物B双氧水以1 : 1的比例混合均匀，现配现用。
[0056] ⑤用微量震荡器充分振荡混合均匀，在化学发光免疫分析仪上依序测量各孔的发 光强度（RLU)，测量时间1秒/孔，必须于加化学发光底物液后的第1-3分钟内测量。
[0057] ⑥待测样品的浓度计算按下列方法进行：用化学发光免疫分析仪中的数据处理程 序（拟合类型：线性拟合，坐标选择 ：l〇g(X)-log(Y)，实验方法：夹心法。进行直线拟合时， 校准品和样品发光信号应扣除〇点校准品发光信号）直接给出校准曲线及样品的浓度值。
[0058]⑦步骤⑥中数据处理程序特征是拟合类型：线性拟合，坐标选择：l〇g(X)-l〇g(Y)， 实验方法：夹心法。进行直线拟合时，校准品和样品发光信号应扣除〇点校准品发光信号。
【具体实施方式】：
[0059] 实施例1
[0060] (1)LH抗体包被微孔板的配制
[0061] ①包被缓冲液的配制
[0062] 柠檬酸三钠 7. 0g
[0063] 柠檬酸 4. 2g
[0064] 纯化水加至 1000ml
[0065] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0066] ②包被工作液的制备
[0067] 取促黄体生成素（LH)，按1 y g/ml的浓度加入步骤①中制备的包被缓冲液中，搅 拌混匀，2~8°C密封保存备用。
[0068]③封闭液的制备
[0069]
[0070] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C保存备 用。
[0071] ④LH抗体包被微孔板的制备过程
[0072] a)准备96孔发光微孔板；
[0073] b)使用包被机进行包被，每孔加入100 y L的包被工作液，震荡混匀，移入冰箱 (2~8°C )静置16小时；
[0074] c)取出步骤b)静置后的微孔板，使用包板机每孔分别加入封闭液300 yL，37°C， 放置1小时；
[0075] d)甩掉孔内的封闭液，然后在吸水纸上拍干。将拍干的微孔板放入干燥间干燥6 小时。
[0076] e)从干燥间中取出，立即进行封袋，2~8°C密封保存备用。
[0077] (2)酶标记物的制备
[0078] ①酶稀释液的配制
[0080] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0081] ②PB缓冲液的配制
[0082] 磷酸二氢钠 0? 9g
[0083] 磷酸氢二钠 5. 0g
[0084] 纯化水加至 1000ml
[0085] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0086] ③酶标记物的制备
[0087] a)按辣根过氧化物酶：LH = 1 : 1的比例混合，加入1. 5当量碳二亚胺，混匀后 室温反应1小时；
[0088] b)转入透析袋中透析，用步骤②配制的PB缓冲液透析过夜；
[0089] c)转入玻璃瓶，加入质量分数1 %小牛血清白蛋白及质量分数1 %丙三醇，2~8°C 密封保存；
[0090] d)将标记物按稀释度1 : 20000稀释，2~8°C密封保存；
[0091] e)将检测合格的酶标记物工作液分装，2~8°C密封保存备用。
[0092] (3)浓缩洗涤液的配制
[0094] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，分装2~8°C密封保存备用。
[0095] (4)化学发光底物的制备
[0096] ①化学发光底物液A的配制
[0098] 将上述试剂称量好放入黑色洁净容器中，溶解混匀，分装，2~8°C密封避光保存 备用。
[0099] ②化学发光底物液B的配制
[0101] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，分装，2~8°C密封保存备用。
[0102] (5)定量检测试剂盒检测结果
[0103] 采用检测合格的LH试剂盒检测如下项目，用化学发光免疫分析仪（北京华科泰化 学发光免疫分析仪）测定，成品检测结果如表2 :
[0104] 表2-1布板分布情况
[0106] 表2-2光子数检测
[0108]
[0109] 表2-3浓度检测结果
[0111] 本试剂盒的最低检测限：< 1. OmIU/mL
[0112] 本试剂盒的精密度的批间差为CV < 15%，重复性CV < 10%。
[0113] 本试剂盒的准确性：用国家标准品作为样本进行检测，其测量结果的相对偏差应 在±10%范围内。
[0114] 线性范围控制在2-200mIU/mL范围内，用Log-Log模型拟合，剂量-反应曲线相关 系数的绝对值（|r|)应不低于0.9900。
[0115] 本发明促黄体生成素（LH)定量检测试剂盒20个样品检测结果（表3)与罗氏公 司促黄体生成素（LH)检测试剂盒20个样品检测结果（表4)对比，促黄体生成素含量无明 显差异。
[0116] 表3本发明20个样品检测结果
[0118] 表4罗氏公司20个样品检测结果
[0120] 实施例2
[0121] (1) LH抗体包被微孔板的配制
[0122] ①包被缓冲液的配制
[0123] 柠檬酸三钠 7. 4g
[0124]柠檬酸 4.6g
[0125] 纯化水加至 1000ml
[0126] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0127] ②包被工作液的制备
[0128]取促黄体生成素（LH)，按1 y g/ml的浓度加入步骤①中制备的包被缓冲液中，搅 拌混匀，2~8°C密封保存备用。
[0129] ③封闭液的制备
[0131] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0132] ④LH抗体包被微孔板的制备过程
[0133] a)准备96孔发光微孔板；
[0134] b)使用包被机进行包被，每孔加入120 yL的包被工作液，震荡混匀，移入冰箱 (2~8°C )静置20小时；
[0135] c)取出步骤b)静置后的微孔板，使用包板机每孔分别加入封闭液350 yL，37°C， 放置1小时；
[0136] d)甩掉孔内的封闭液，然后在吸水纸上拍干。将拍干的微孔板放入干燥间干燥8 小时。
[0137] e)从干燥间中取出，立即进行封袋，2~8°C密封保存备用。
[0138] (2)酶标记物的制备
[0139] ①酶稀释液的配制
[0140]
[0141] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0142] ②PB缓冲液的配制
[0143] 磷酸二氢钠 1. lg
[0144] 磷酸氢二钠 5. 3g
[0145] 纯化水加至 1000ml
[0146] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，2~8°C密封保存备用。
[0147] ③酶标记物的制备
[0148] a)按辣根过氧化物酶：LH = 1 : 1的比例混合，加入1. 5当量碳二亚胺，混匀后 室温反应3小时；
[0149] b)转入透析袋中透析，用步骤②配制的PB缓冲液透析过夜；
[0150] c)转入玻璃瓶，加入质量分数1 %小牛血清白蛋白及质量分数1 %丙三醇，2~8 °C 密封保存；
[0151] d)将标记物按稀释度1 : 20000稀释，2~8°C密封保存；
[0152] e)将检测合格的酶标记物工作液分装，2~8°C密封保存备用。
[0153] (3)浓缩洗涤液的配制
[0155] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，分装2~8°C密封保存备用。
[0156] (4)化学发光底物的制备
[0157] ①化学发光底物液A的配制
[0159] 将上述试剂称量好放入黑色洁净容器中，溶解混匀，分装，2~8°C密封避光保存 备用。
[0160] ②化学发光底物液B的配制
[0161]
[0162] 将上述试剂称量好放入洁净容器中，溶解混匀，分装，2~8°C密封保存备用。
[0163] 本发明促黄体生成素（LH)定量检测试剂盒20个样品检测结果与罗氏公司促黄体 生成素（LH)检测试剂盒20个样品检测结果对比，促黄体生成素含量无明显差异。
【主权项】
1. 一种促黄体生成素（LH)化学发光免疫分析法定量检测试剂盒，其特征是包含微孔 板、校准品、标记物、发光底物A、发光底物B、浓缩洗涤液。2. 根据权利要求1所述微孔板，其特征在于制备过程中所使用的包被工作液是浓度为 Iyg/ml促黄体生成素（LH)。3. 根据权利要求1所述标记物，其特征在于标记物制备过程中辣根过氧化物酶：LH的 比例是I:1。4. 根据权利要求1所述标记物，其特征在于标记物的稀释度为1 : 20000。5. 根据权利要求1中所述的化学发光底物液A，其特征在于由12.Ig三羟甲基氨基甲 烷，I.Og小牛血清白蛋白，0. 50g鲁米诺，0. 003g增强剂，加纯化水至1000 ml配制而成。6. 根据权利要求5中所述的化学发光底物液A，其特征在于增强剂为四苯硼钠。7. 根据权利要求1中所述的化学发光底物液B，其特征在于由0. 73g柠檬酸三钠， 0. 44g梓檬酸，3. 3ml30%双氧水，加纯化水至1000 ml配制而成。8. 根据权利要求1中所述的浓缩洗涤液，其特征在于稀释度1 : 30。
【专利摘要】本发明公开了一种促黄体生成素(LH)化学发光免疫分析法定量测定试剂盒，本试剂盒采用夹心法测定血清中LH水平，以抗LH抗体作为包被抗体，加入LH校准品或待测血清后，再加入另一株抗LH抗体标记物进行反应，充分洗涤后加入发光底物测定其发光强度(RLU)，根据标准曲线即可算出样品中LH的含量，样品的RLU值随LH浓度的增加而上升。本发明操作简单，测试时间短，可提高临床检验的效率。
【IPC分类】G01N33/535, G01N33/531, G01N33/76, G01N21/76
【公开号】CN104897909
【申请号】CN201510227902
【发明人】王贤俊, 江新涛, 郭二豪, 郑蓓蕾
【申请人】王贤俊
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月2日
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