测定血管性血友病因子活性的方法及检测试剂盒的制作方法
测定血管性血友病因子活性的方法及检测试剂盒的制作方法
【专利说明】
[0001] 本发明是申请日2008年7月3日、发明名称为"在不存在瑞斯托霉素的情 况下测定血管性血友病因子活性的方法和测定ADAMTS-13蛋白酶的方法"、申请号为 200880023579. 6的申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明属于凝血诊断技术领域，涉及一种在样本中测定血管性血友病因子（VWF) 活性的体外方法。所述方法包括对GPIba蛋白功能获得性变异体的使用，这样就可不使用 瑞斯托霉素、美洲矛头腹毒蛋白或与瑞斯托霉素或美洲矛头腹毒蛋白等效的其他物质。本 发明还涉及一种测定血管性血友病因子（VWF)裂解ADAMTS-13蛋白酶活性的方法。
【背景技术】
[0003] 血管性血友病因子（VWF)是血浆中的一种大分子多聚体糖蛋白，在初期止血过 程中具有重要作用。另外，VWF具有胶原蛋白结合位点和用于定位于血小板表面的糖蛋白 Ib(GPIb)的结合位点。GPIb是一种整合膜蛋白，会与另一种整合膜蛋白（糖蛋白IX(GPIX)) 在血小板膜中形成糖蛋白Ib-IX受体复合物。GPIb是双链分子，由一条表观分子质量约为 145kDa的重链（同义词：heavy chain、a链或GPIb a )和一条表观分子质量约为22kDa 的轻链（同义词：light chain、|3链或GPIb|3 )构成，这两条链通过二硫键彼此相连 [Lopez, J. A?等人（1987)Cloning of the a chain of human platelet glycoprotein Ib:A transmembrane protein with homology to leucine-rich a 2-glycoprotein. Proc.Natl. Acad. Sci USA 84:5615-5619]。
[0004] 血管受伤时，VWF结合到暴露的胶原蛋白表面。由于与胶原蛋白结合以及受到增 大的剪力（作用在与胶原蛋白结合的VWF上）的影响，VWF发生变化或被激活，从而可以结 合到血小板膜的GPIb-IX受体复合物中的GPIb重链（GPIba)的氨基末端。经激活的VWF 通过这种方式俘获从旁边经过的血小板，使得受伤处形成由VWF、胶原蛋白和血小板构成的 第一团聚体。随后血小板被激活，从而开始血浆凝血过程，该过程在经过复数次放大级联反 应和血小板进一步聚集后最终促成伤口的愈合。
[0005] VWF在质或量上的异常是血管性血友病（同义词：von Willebrand Disease，VWD) 的起因，这种病是最常见的遗传出血性疾病之一。就血管性血友病的诊断而言目前存在不 同的筛查方法，例如测定出血时间（BT)、测定VWF抗原浓度（VWF:Ag)的定量法（例如ELISA 方法）和测定VWF活性的方法（例如瑞斯托霉素诱导血小板凝集（VWF:RCo))。
[0006] 瑞斯托霉素诱导固定血小板聚集的方法（又称"瑞斯托霉素辅因子检测"）还能 识别VWF蛋白用测定VWF抗原浓度的定量法所识别不到的功能性缺陷。因此，为能对血管 性血友病做出完全诊断，有必要实施用于测定瑞斯托霉素辅因子活性的瑞斯托霉素辅因子 检测。实施瑞斯托霉素辅因子检测时通常是将患者的血浆样本与固定的血小板混合和与瑞 斯托霉素混合。在斯托霉素的诱导下，样本所含的VWF结合到所添加的血小板的GPIb受体 上，从而实现血小板的聚集。这一聚集反应的反应程度与患者样本所含的被激活的VWF的 量有关。例如，这种聚集反应可通过测量传播增长进行光学检测，从而实现VWF:RCo活性的 量化。
[0007] 与VWF抗原检测相比，瑞斯托霉素辅因子检测的优点在于可对VWF进行活性测定， 从而实现对VWF功能性紊乱的识别，以及对血管性血友病的不同子类进行分类，这些子类 中仅部分子类也是随VWF抗原浓度的降低而出现。一般情况下，对这些子类进行分类时须 形成VWF瑞斯托霉素辅因子活性（VWF:RCo)与VWF抗原浓度（VWF:Ag)的比率（Ratio)。对 于血管性血友病的子类2A、2B和2M而言，VWF:RCo/VWF:Ag之比通常小于1。通常建议将 〇. 7的比率作为极限值。
[0008] 传统的瑞斯托霉素辅因子检测的不足之处在于实施过程很难自动化，因为在测量 过程中需要不断地充分搅拌检测标本（Testansatz)中的血小板。此外，这种检测的精确度 相对较低，对相关标准所规定的处于〇%至20%范围内的低VWF活性的测定无法充分发挥 作用。
[0009] 近来有人研发出了基于GPIba的VWF-ELISA检测，这种检测所使用的重组GPIba 片段（1-289 或 1-290)包含氨基末端 VWF 结合区[W001/02853A2 或 Vanhoorelbeke, K.等 人(2002)A reliable von ffillebrand factor:Ristocetin cofactor enzyme-linked immunosorbent assay to differentiate between type land type 2von ffillebrand disease. Semin Thromb Hemost. 28 (2):161-165 以及 Federici, A. B?等人（2004)A sensitive ristocetin co-factor activity assay with recombinant glycoprotein lb a for the diagnosis of patients with low von ffillebrand factor levels. Heamatologica 89(1):77_85]。这些检测方法借助特异性抗体将重组GPIba片段结合在 酶标板上。添加患者样本和瑞斯托霉素，使得患者样本中的VWF可以结合到重组GPIba片 段上。最后借助抗VWF抗体对结合的VWF进行定量检测。结果表明，这种VWF-ELISA检测 十分接近于基于血小板的传统VWF瑞斯托霉素辅因子活性检测，甚至比之更敏感、更精确。
[0010] Hui等人（摘要，ISTH 2007)所描述的基于GPIb a的VWF-ELISA检测使用在位 置233和位置239上具有突变体的重组GPIba片段（1-483)。这些突变体是所谓的功能 获得性突变体，它们在瑞斯托霉素浓度较低的情况下与野生型GPIba蛋白（W0 93/16712) 相比对VWF的亲和性更高，可以更强烈地与VWF相互作用。上述突变体是众所周知的 GPIba链突变变异体。Miller等人（US 5, 317, 097)描述的是GPIba链的位置233上 的甘氨酸残基被缬氨酸残基（G233V)取代的方法。这种变异是血小板型血管性血友病 (PT-VWD)的起因，PT-VWD是一种常染色体显性遗传出血性疾病。Russell和Roth描述的 是GPIba链的位置239上的甲硫氨酸残基被缬氨酸残基（M239V)取代的方法[Russell，S. D. &Roth, G. J. (1993)Pseudo-von ffillebrand Disease:A mutation in the platelet glycoprotein lb a gene associated with a hyperactive surface receptor.Blood 81 (7), 1787-1791]。这种变异也会引发PT-VWD。
[0011] 上述基于GPIba的VWF-ELISA检测以及瑞斯托霉素辅因子检测的缺点在于，它们 建立在使用瑞斯托霉素或其他可以促使VWF结合到GPIb a链上的外源非生理性调节因子 的基础上。瑞斯托霉素是一种来自于诺卡氏菌属的抗生糖肽，美洲矛头腹毒蛋白（同义词： 副凝集素（co-agglutinin))是一种来自于矛头腹属的蛇毒，它们通常用于体外诱导VWF结 合到血小板或结合到分离GPIba蛋白或其片段上。使用瑞斯托霉素的缺点是，它不仅会结 合到VWF上，还会结合到许多其他类型的蛋白上，例如纤维蛋白原或抗GPIba抗体（在特 定的实验中观察到的）。因此，在VWF检测方法中使用瑞斯托霉素存在发生非特异性结合反 应或沉淀反应的风险，这些反应会使检测结果失真。
【发明内容】
[0012] 因此，本发明的目的是提供一种在不存在瑞斯托霉素的情况下测定VWF活性的方 法。
[0013] 基于人类GPIba受体氨基酸序列，通过位置233和位置239上具有两处点突变的 GPIba链的功能获得性变异体来实现本发明的目的。在本发明范围内，GPIba链的功能获 得性变异体指的是一种在瑞斯托霉素浓度较低的情况下与野生型GPIb a蛋白相比对VWF 的亲和性明显更高、可以更强烈地与VWF相互作用的突变变异体。
[0014] 本发明的标的是一种在样本中测定血管性血友病因子（VWF)活性的方法，其中， 将所述样本和分离GPIb a蛋白混合成一检测标本，该检测标本中不添加瑞斯托霉素和美 洲矛头腹毒蛋白。所用的GPIb a蛋白包括一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与人类GPIb a 蛋白的野生型序列相比至少包含氨基酸残基1-268,且分别在位置233和239上具有一种取 代基Xaa(SEQID NO:l)。GPIba链位置233上的甘氨酸残基取代基Xaa和位置239上的甲 硫氨酸残基取代基Xaa优选由一种缬氨酸残基（G233V或M239V)或一种丝氨酸残基（G233S 或M239S)构成。这两个位置上的不同取代基Xaa可以为任意一种组合。在对本发明进行 说明时，提及GPIb a蛋白时均可理解是指这样一种突变变异体。
[0015] 此外，优选不在所述检测标本中添加"瑞斯托霉素或美洲矛头腹毒蛋白的等效物 质"。在本发明范围内，"瑞斯托霉素或美洲矛头腹毒蛋白的等效物质"是指可以体外诱导分 离VWF结合到野生型GPIb a链或其片段上的外源（即非生理性）物质。
[0016] 本发明的一个优点在于，通过使用GPIba的功能获得性变异体，就无需通过（例 如）流体流动、搅拌或振动来对检测标本施加抗剪应力。
[0017] 就VWF活性测定方法而言，"样本"指的是有可能含有待检测物质（即VWF)的材 料。例如，"样本"这一概念包括特别是人和动物的生物液体（如血液、血浆或血清）以及 用于血管性血友病患者替代疗法的工业产品（如Haemate?P)，如VWF定标剂、VWF质控 血浆（VWF-Kontrolle)或高浓度VWF浓缩物。必要时须对样本进行预处理，以便可以检测 到被分析物或将干扰性的样本成分移除。这种样本预处理可以包括分离和/或溶解细胞或 对样本的离心分离。"样本"这一概念还包括包含上述样本材料中的一种样本材料的反应混 合物，该样本材料中被加入用作基质的分离VWF，以便测定VWF改性因子的活性，在培养VWF 基质后需要借助VWF改性因子在这类反应混合物中测定残留VWF活性。例如，由血浆样本 和分离大分子VWF构成的用于测定该血浆样本中的VWF裂解ADAMTS-13蛋白酶的混合物就 是这样一种反应混合物。血浆样本中的ADAMTS-13蛋白酶裂解所添加的VWF基质，从而降 低该样本的VWF活性。
[0018] 本发明的方法所用的GPIb a链可以是用重组法或合成法制成的GPIb a蛋白。已 知的原核或真核表达系统适合用来制造重组GPIba蛋白，例如在细菌（如大肠杆菌）中表 达，在酵母（如酿酒酵母、甲醇酵母）中表达，在植物、动物或人类细胞培养中表达。已知的 体外蛋白合成技术适合用来制造合成GPIb a蛋白，例如固相合成（例如Merrifield合成 法）。本发明的方法所用的GPIba蛋白优选是一种用重组法在人类细胞培养物（优选人胚 肾细胞（HEK细胞）培养物）中制成的GPIb a蛋白。
[0019] 本发明的方法所用的GPIba蛋白可在N端上与同源的人类GPIba信号序列 MPLLLLLLLLPSPLHP(SEQ ID NO:2,亦称"氨基酸残基16至1"）融合。作为替代方案，所用 的GPIb a蛋白可在N端上与异源信号序列融合，即与一种通常不存在于人类GPIb a多肽 中、但在所选表达系统中会对重组表达的GPIb a蛋白的表达和/或分泌产生有利影响的多 肽融合。例如，MPLQLLLLLILLGPGNSLQLWDTWADEAEKALGPLLARDRR(SEQ ID NO:3)就是一种适 用的异源信号序列。
[0020] 此外，本发明的方法所用的GPIb a蛋白还可在C端上与一个以上亲和标签融合， 这些亲和标签可使如重组表达蛋白结合到亲和载体上，从而使如重组表达GPIb a蛋白得 到纯化，或者还使重组GPIb a蛋白与一种固相结合。优选长度仅有12个氨基酸的小亲和 标签为。特别优选的亲和标签是选自组氨酸标签、Flag标签、精氨酸标签、c-Myc标签和 Strep标签群组的亲和标签。以较高亲和性结合到亲和标签上的适当亲和载体例如是特异 性抗体、固定化阳离子（例如对组氨酸标签具有亲和性的Ni 2+)或其他类型的结合对象（例 如对Strep标签具有亲和性的链霉亲和素）。
[0021] 根据本发明的方法的一种实施方式，所述GPIb a蛋白与一种固相相关。"相关"这 一概念含义广泛，例如包括共价结合和非共价结合、直接结合和间接结合、表面吸附和凹穴 夹杂出；[118(31111188；[116；[116/61'1：16；1!\11^)。共价结合是分离6?]^(3蛋白借助化学键结合到 固相上。非共价结合的一个例子就是表面吸附。除了直接结合到固相上之外，分离GPIb a 蛋白也可通过与其他特异性结合对象的特异性相互作用来间接地结合到固相上，例如通过 与抗体的特异性相互作用，优选是与抗GPIba抗体（只要分离GPIba蛋白具有亲和标签） 或与抗亲和标签抗体的特异性相互作用。
[0022] 在本发明范围内，"固相"这一概念包括一种由非水溶性多孔和/或无孔材料构成 的物体，它可以极其不同的形式存在，例如容器、细管、微量滴定板（例如酶标板）、球体、微 粒、细棒、条带、滤纸或层析纸等。一般情况下，该固相的表面亲水或可以获得亲水性。所述 固相可由各种材料构成，例如无机和/或有机材料、合成材料、天然材料和/或经改性的天 然材料。固相材料例如聚合物（例如纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酰 胺、交联右旋糖酐分子、琼脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸醋或尼龙）、乳胶、 陶瓷、玻璃、金属（特别是贵金属，如金和银）、磁体、上述材料的混合物或组合物。
[0023] 所述固相可具有一种由一个以上分层构成的覆盖层，所述分层由（例如）蛋白、碳 水化合物、亲脂性物质、生物聚合物、有机聚合物或其混合物构成，用以抑制或避免样本成 分与该固相之间的非特异性结合，或者改善在粒子固相的悬浮稳定性、贮存稳定性、成形稳 定性或者抗紫外线、抗微生物或抗其他具有破坏作用的用剂的特性。
[0024] 本发明的VWF活性测定方法的一种优选实施方式包括对粒子相关的GPIb a蛋 白（优选一种乳胶粒子相关的GPIb a蛋白）的使用，以及借助粒子固相的GPIb a介导凝 集对VWF活性的测定。优选使用通过抗体与粒子固相发生关联的GPIb a蛋白。此处可用 抗 GPIb a 抗体，特别是单克隆抗体 VM16d[Mazurov，A.V?等人（1991)Characterization of an antiglycoprotein lb monoclonals antibody that specifically inhibits platelet-thrombin interaction. Thromb Res. 62 (6)，673-684 ;购买途径：荷兰于登的 三比欧有限责任公司（Sanbio B.V.)，产品号MON 1146]和SZ-2[Ruan，C?等人（1987)A murine antiglycoprotein lb complex monoclonal antibody, SZ 2,inhibits platelet aggregation induced by both ristocetin and collagen. Blood 69 (2), 570-577 ;购买 途径：美国富勒顿的贝克曼库尔特有限公司（Beckman Coulter Inc.)，产品号頂0409]。 如果所用的GPIb a蛋白在C端上与一个以上Flag标签融合，贝也可使用抗Flag抗体 [参见US 5, 011，912 ;购买途径：德国施泰因海姆的西格玛奥德里奇化学有限责任公司 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH)]。定量测定与样本中所存在的VWF的量或活性之间存在关 联的凝集反应时，可对粒子聚集体上的光散射加以利用，例如通过测量散射光强度（散射 比浊法）或测量介质的浊度（测浊法）。
[0025] 优选在存在洗涤剂的情况下通过粒子固相的GPIb a介导凝集来测定VWF活性，所 述洗绦剂优选选自吐温-20 ( Tween? 20)、Thesit (哲斯特）、曲拉通（Triton)洗绦剂（例 如Triton X-100?或Triton X-405? )和十二烷基硫酸钠（SDS)群组。本发明发现，洗 涤剂的存在会对依赖于VWF的粒子固相（特别是乳胶粒子）的凝集速率产生影响：
[0026] 在不同的VWF浓度和逐步升高的Tween? 20浓度下测定该凝集速率（参见图4， 测定方法如实例5)。从图中可以清楚看到，当Tween? 20浓度相对较低（0. 02-0. lg/L) 时，反应强化作用特别明显，随着Tweeiv? 20浓度的升高，这种强化作用逐渐变小，并达到 一个稳定的强化水平。例如，当VWF浓度为149. 6%、Tween? 20浓度约为lg/L时，达到稳 定的强化水平，强化度为不存在Tween? 20时的初始值的85%。如果将Tween? 20用作 洗涤剂，就会存在两种可能性。其一，可以在浓度较低（0.02-0. lg/L)时调节Tween? 20， 以便对特定VWF浓度进行最高达20 %的特强强化。这样就会在Tween? 20浓度为0. 05g/ L(在检测标本中）、VWF浓度为30. 4%时获得216%的凝集速率强化度。由于低VWF浓度 特别难以测定，因而此时进行反应强化就特别有帮助。其二，如果在洗涤剂的饱和区内针对 所有的相关VWF浓度进行操作，则测量系统通常会更加稳定。例如自lg/L的Tween? 20 浓度起，情况即如此。这种方案更适用于VWF浓度范围较宽的筛查检测。如果需要在测定 VWF浓度时将凝集反应强化超过20 %，则0. 6-20. 0g/L (优选lg/L)的Tween? 20浓度是 有利的。
[0027] 其他洗绦剂，如Thesit (同义词：Polydocanol，瑞士罗特里斯特的善瑞尔和施兰 普费尔有限责任公司Schiirer & Sch丨iipfer Ltd.)、Trit〇n洗绦剂（例如Triton X-100? 或Triton X-405?)和十二烷基硫酸钠（SDS)，显示出稳定的与浓度有关的凝集反应强 化作用（参见图5,测定方法如实例5 :45 y L样本，但该样本中包含Thesit而非Tween? 20) 〇
[0028] 测定一血浆样本的VWF活性时，通常用缓冲液或乏VWF血浆对所述样本进行预稀 释。在需要制作定标曲线的情况下，要对正常血浆（例如标准人类血浆）进行同样的处理。 本发明发现，在用乏VWF血浆稀释的过程中以及在常规的洗涤剂浓度（在检测标本中为lg/ L)下，GPIb a乳胶粒子的凝集没有达到预想的强化结果，但是通过足够多的洗涤剂可以抑 制这种强化作用。如果如图6所示在一含有45 y L样本的检测标本中用乏VWF血浆或缓冲 液稀释该样本（在此情况下为标准人类血浆），则在存在乏VWF血浆的情况下，特定的VWF 浓度下该样本中就会出现较高的凝集速率。而如果在检测系统中不使用洗涤剂，并用乏VWF 血浆稀释标准人类血浆样本，所产生的凝集速率就会低于用缓冲液稀释时的凝集速率。但 如果添加足够多的洗涤剂（例如多3g/L Thesit)，用缓冲液稀释和用乏血浆稀释的凝集速 率就会相似。借此可确保在缓冲液中对血浆样本的进行稀释是恰当的。无论是对正常血浆 (用作定标剂）的稀释还是对患者样本的可能的稀释，均可通过简单的缓冲液来实现，而不 是借助于乏VWF血浆，这对检测是特别有利的。缓冲液价格不贵，由更好的贮存稳定性保 证，许多自动检测机仅用一种缓冲液来实施多种检测。此外，乏VWF血浆并非任何一个实验 室都有供应。测量VWF浓缩物时需要进行大量的稀释操作，其中，能用缓冲液真正有效地达 成稀释目的也是十分有利的。
[0029] 另一优选方案是在存在聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、优选在该聚乙烯吡咯烷酮在检测 标本中的浓度为〇. 1 %至1. 〇%的情况下和/或在存在右旋糖酐T500、优选在该右旋糖酐在 检测标本中的浓度为〇. 1%至3%的情况下和/或在存在藻酸盐500-600cP、优选在该藻酸 盐500-600〇?在检测标本中的浓度为0.01%至0.2%的情况下通过粒子固相的6?此(1介 导凝集来测定VWF活性。
[0030] 本发明的测定VWF活性方法的另一优选实施例涉及的是一种具有竞争力 的检测方案。这种方法包括对粒子相关抗GPIba抗体（优选VM16d)和反应标本 (Reaktionsansatz)中的粒子相关VWF的使用以及GPIba蛋白的添加。在存在GPIba蛋 白，不存在瑞斯托霉素、美洲矛头腹毒蛋白或等效物质的情况下，粒子发生凝集。添加含有 VWF的样本，可以抑制这种凝集反应。凝集反应受到抑制的程度与存在于样本中的VWF的量 或活性存在关联。
[0031] 本发明的VWF活性测定方法的另一优选实施方式包括对与非粒子固相相关的 GPIba蛋白（优选与微量滴定板表面相关的GPIba蛋白）的使用以及通过测定已结合到 该GPIba蛋白上的VWF量对VWF活性的测定。优选使用通过抗体与非粒子固相发生关联的 GPIba蛋白。此处可用抗GPIba抗体，特别是单克隆抗体VM16d(参见上文）和MB45[参 见Modderman，P. W?等人（1992) Glycoproteins V and Ib-IX form a noncovalent complex in the platelet membrane. J. Biol. Chem. 267(1) ,364-369 及其中所引用的参考文献 26; 购买途径：荷兰阿姆斯特丹的三奎恩（Sanquin) :PeliCluster CD42b，产品号M9142]。如 果所用的GPIba蛋白在C端上与一个以上Flag标签融合，则也可使用抗Flag抗体（参见 上文）。测定已结合到GPIba蛋白上的VWF量时，可使用直接或间接与一信号形成系统的 成分相关的抗VWF抗体，从而实现GPIba结合VWF量的量化。由于只有"活性"（功能完好 的）VWF会结合到GPIb a受体上，因此根据这一原理测定的VWF抗原浓度与VWF活性之间 存在关联。
[0032] 本发明还涉及一种应用于本发明的方法的检测试剂盒，其中，所述检测试剂盒包 括至少一种试剂，所述试剂含有GPIba蛋白，所述GPIba蛋白包括一种氨基酸序列，所 述氨基酸序列与人类GPIba蛋白的野生型序列（SEQ ID N0:1)相比至少包含氨基酸残基 1-268,且分别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa，所述GPIb a蛋白与一种 粒子固相相关。该检测试剂盒优选包括一种含有乳胶粒子相关GPIba蛋白的试剂。所述 GPIba蛋白优选通过抗体与所述粒子固相发生关联。该试剂可以液态或冻干形式加以提 供。如果该试剂以冻干粉剂形式存在，则所述检测试剂盒还可包含使该冻干粉剂悬浮所需 的溶剂，例如蒸馏水或适当的缓冲液。
[0033] 本发明此外还涉及一种应用于本发明的方法的检测试剂盒，其中，所述检测试剂 盒包括一种非粒子固相，优选一种微量滴定板，所述非粒子固相与包括一种氨基酸序列的 GPIba蛋白相关，所述氨基酸序列与人类GPIba蛋白的野生型序列（SEQ ID NO:l)相比 至少包含氨基酸残基1-268,且分别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa。所述 GPIba蛋白优选通过抗体与所述非粒子固相相关。所述检测试剂盒还可包括一种试剂，该 试剂含有一种抗VWF抗体，优选一种直接或间接与一种信号形成系统的成分相关的抗VWF 抗体。所述含有抗VWF抗体的试剂可以液态或冻干形式加以提供。如果该试剂以冻干粉剂 形式存在，则所述检测试剂盒还可包含使该冻干粉剂悬浮所需的溶剂，例如蒸馏水或一种 适当的缓冲液。
[0034] 本发明还涉及一种分离GPIba蛋白在体外测定血管性血友病因子（VWF)活性方 法中的应用，所述分离GPIba蛋白包括一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与人类GP Iba蛋 白的野生型序列（SEQ ID NO: 1)相比至少包含氨基酸残基1-268,且分别在位置233和239 上具有一种氨基酸取代基Xaa，其中，所述VWF活性测定方法不使用瑞斯托霉素和美洲矛头 腹毒蛋白。
[0035] 优选使用位置233和/或位置239上的氨基酸取代基Xaa由一种结|氨酸残基或一 种丝氨酸残基构成的分离GPIba蛋白。这两个位置上的不同取代基Xaa可以为任意一种 组合。
[0036] 本发明此外还涉及一种获得分离GPIba蛋白的方法，所述分离GPIba蛋白包括 一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与人类GPIba蛋白的野生型序列（SEQ ID N0:1)相比至 少包含氨基酸残基1-268,且分别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa，其特征 在于，在原核细胞或真核细胞的培养物中重组表达所述GPIba蛋白，通过使用亲和载体以 亲和层析的方式从细胞溶解产物或细胞培养上清液中分离出所述GPIb a蛋白。
[0037] 优选用于获得位置233和/或位置239上的氨基酸取代基Xaa由缬氨酸残基或丝 氨酸残基构成的分离GPIb a蛋白的方法。这两个位置上的不同取代基Xaa可以为任意一 种组合。
[0038] 本发明的另一标的是一种测定血管性血友病因子（VWF)裂解ADAMTS-13蛋白酶活 性的方法。
[0039] ADAMTS-13(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs)是一种溶蛋白性裂解血管性血友病因子（VWF)、从而减小血管性血友病因子（VWF) 活性的金属蛋白酶。ADAMTS-13酶活性的先天性或获得性缺乏是各种疾病的起因，例如血栓 性血小板减少性紫癜（TTP)，一种危及生命的血栓栓塞性微循环疾病。在TTP患者的血浆中 发现的异常巨大的VWF多聚体被视为引起大量聚集VWF和血小板的血栓形成的原因所在。 因此，在患者样本中测定ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解蛋白酶活性具有诊断学意义。
[0040] 在测定VWF裂解ADAMTS-13蛋白酶活性或诊断ADAMTS-13缺乏症方面，现有技术 中存在多种不同的方法：
[0041] Furlan等人（1996)描述的方法是以经纯化的人类VWF为基质来培养含有 ADAMTS-13蛋白酶的样本，随后通过借助于SDS琼脂糖凝胶电泳的VWF多聚体分析或通过借 助于聚丙烯酰胺凝胶电泳的VWF片段分析，随后再通过免疫印迹来检测ADAMTS-13蛋白酶 的蛋白水解活性[Furlan，M.，Robles, R?及 Iimm丨e,B. (1996)Partial purification and characterization of a protease from human plasma cleaving von ffillebrand factor to fragments produced by in vivo proteolysis. Blood 87,10:4223-4234]。这类借助 凝胶电泳而实现的多聚体分析工作量极大，耗时颇多，因而不适用于临床实验室。
[0042] 其他的功能检测方法测定ADAMTS-13蛋白酶的蛋白水解活性的方式是以VWF为 基质来培养含有ADAMTS-13蛋白酶的样本，随后再测定VWF基质的活性损失。样本中所含 ADAMTS-13蛋白酶越多，被裂解的VWF基质就越多，之后可在反应混合物中检测到的VWF活 性就越少。这类功能检测方法的优点在于，通过将VWF用作基质以及通过测量大分子多聚 体的功能丧失，可以体外模拟ADAMTS-13蛋白酶在活体内的相关功能。
[0043] W0 2004/005451A2所揭示的方法是以经纯化的人类VWF为基质来培养含有 ADAMTS-13蛋白酶的样本，随后借助瑞斯托霉素辅因子检测通过测定残留在反应混合物中 的VWF活性来检测ADAMTS-13蛋白酶的蛋白水解活性。替代方案是通过胶原结合检测来测 定残留在反应混合物中的VWF活性（参见W0 00/50904)。其缺点是反应混合物的培养时间 极长，部分须连夜进行，以便使VWF被充分地蛋白水解。Kostousov, V.，Fehr, J.，Bombeli, T. (2006)Novel, semi-automated, 6〇-min-assay to determine von ffillebrand factor cleaving activity of ADAMTS-13. Thrombosis Res. 118:723-731 则描述了一种经改进的 方法，可以将培养时间缩减至60分钟。
[0044] US 2007/0065895 A1和US 2005/0186646 A1所揭示的方法是以具有特异性 ADAMTS-13蛋白酶裂解位点的肽或VWF肽（片段）为基质来培养含有ADAMTS-13蛋白酶的 样本，随后再借助SDS-PAGE通过对所生成的肽片段进行分析以及视情况通过免疫印迹来 检测ADAMTS-13蛋白酶的蛋白水解活性。
[0045] 已知检测系统的缺点在于不是技术上太复杂（例如借助SDS-PAGE分析蛋白水解 所生成的基质片段），就是没有对天然VWF基质加以利用，因而可能无法识别到ADAMTS-13 蛋白酶某些功能缺陷。
[0046] 因此，本发明的目的是提供一种测定血管性血友病因子（VWF)裂解ADAMTS-13蛋 白酶活性的方法，这种方法可以尽可能多地检测到ADAMTS-13蛋白酶功能障碍，还可以在 传统的临床分析仪上以节省时间的方式自动进行。
[0047] 达成这个目的的解决方案是将一种可能含有ADAMTS-13蛋白酶的样本和用作基 质的分离VWF混合成一种反应标本，其中，所述VWF基质由大分子多聚体VWF构成，所述大 分子多聚体VWF包含有具有至少一处氨基酸序列变异（多态或突变）的VWF单体，所述氨 基酸序列变异使得所述VWF基质与大分子多聚体、由野生型VWF单体构成的VWF的VWF基 质相比，可以加速ADAMTS-13的分解作用。
[0048] 先在活体内将人类VWF单体合成2813个氨基酸长度的前体蛋白。通过细胞内处理 产生大小可超过20000kDa的VWF多聚体。这些多聚体由通过二硫键彼此相连大小为275kDa 长度为2050个氨基酸的呈线性分布的VWF单体构成。该VWF以大小自500kDa(二聚体） 至15000kDa不等的多聚体的球状形式在血浆中循环。
[0049] 在本发明范围内，"大分子多聚体VWF基质"指的是一种由10个以上二聚化VWF 分子构成、大小超过5000kDa的VWF蛋白，这可以通过本领域技术人员熟悉的凝胶电泳加以 确定。此外，大分子多聚体VWF还包含有具有至少一处氨基酸序列变异（多态或突变）的 VWF单体，所述氨基酸序列变异使得所述VWF基质与大分子多聚体、由野生型VWF单体构成 的VWF的VWF基质相比，可以加速ADAMTS-13的分解作用。
[0050] VWF蛋白的氨基酸序列变异可以提高VWF对ADAMTS-13蛋白酶溶蛋白性裂解 的灵敏度，这一点属于现有技术[参见 Hassenpflug, W. A.，Budde, U.，Obser, T.，Angerh aus, D. , Drewke, E. , Schneppenheim, S. ,Schneppenheim, R. (2006)Impact of mutations in the von ffillebrand factor A2domain onADAMTS13-dependent proteolysis. Blood 107: 2339-2345 或 Rayes, J.，Hommais, A.，Legendre, P.，Tout, H.，Veyradier, A.，Obert, B. ,Ribba, A. S. , Girma, J. P. (2006)Effect of von ffillebrand disease type 2B and type 2Mmutations on the susceptibility of von ffillebrand factor to ADAMTS-13. J Thromb Haemost. 5:321-328]。特别适用于本发明的VWF基质应该由大分子多聚体VWF构 成，所述大分子多聚体VWF包含有VWF单体，所述VWF单体具有至少一处来自下列群组的氨 基酸序列变异：
[0051] P1648S、E1638K、G1505R、S1506L、M1528V、R1569del、R1597W、V1607D、G1609R、 G1629E、G1631D、R1597Q、V1499E 和 Y1584C。
[0052] 氨基酸位置的说明与VWF前体蛋白2813个氨基酸长度的氨基酸序列有关（参见 NCBI Accession No.AAB59458, Version AA59458.1，G1:340356)。"del"这个缩写表示的 是相关氣基酸残基的缺失。有关血管性血友病因子的突变和多态命名，另见Goodeve, A. C. , Eikenboom, J. C. J. , Ginsburg, D. , Hilbert, L. , Mazurier, C. , Peake, I. R. , Sadler, J. E?和Rodeghiero, F. (2001)A Standard nomenclature for von ffillebrand factor gene mutations and polymorphisms. Thromb Haemost. 85:929-931〇
[0053] 其他天然存在的或人工制成的VWF氨基酸序列变异同样适用于本发明，只要它们 能使得所生成的VWF基质与大分子多聚体、由野生型VWF单体构成的VWF的VWF基质相比， 可以加速ADAMTS-13的分解作用，也就是说，所生成的VWF基质对ADAMTS-13蛋白水解具有 更高的灵敏度。"对ADAMTS-13蛋白水解具有更高的灵敏度"表示的是，大分子多聚体VWF 基质在体外被ADAMTS-13蛋白水解的速度超过纯野生型的大分子多聚体VWF基质，亦即，在 相同的培养条件下VWF基质的断裂程度更大，这可以通过本领域技术人员熟悉的凝胶电泳 加以确证。
[0054] 本发明所使用的分离大分子多聚体VWF基质可从适当VWF氨基酸序列变异的杂合 或纯合载体的捐献者血楽?（Spenderplasmen)中获得，或者可以借助本领域技术人员熟悉 的方法加以重组表达。用重组法制成的VWF基质的优点在于，它没有任何在移入检测标本 的过程中会导致检测结果失真的ADAMTS-13污染，且其完全多聚化，不像从血浆中分离出 来的VWF那样被蛋白水解。
[0055] 根据本发明用于测定血管性血友病因子（VWF)裂解ADAMTS-13蛋白酶活性的方法 的一种优选实施方式，通过将所述样本附加地与肝磷脂和/或分离天然GPIb a蛋白和/或 重组野生型GPIb a蛋白以及瑞斯托霉素或美洲矛头腹毒蛋白混合，还可进一步加速VWF基 质的分解。为此，也可将所述样本与包括一种氨基酸序列的重组或合成GPIb a蛋白混合， 所述氨基酸序列与人类GPIb a蛋白的野生型序列（SEQ ID NO: 1)相比至少包含氨基酸残 基1-268,且分别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa。所用GPIb a蛋白的位 置233和/或位置239上的氨基酸取代基Xaa优选由一种缬氨酸残基或一种丝氨酸残基构 成。用VWF基质培养样本后残留在反应标本中的VWF活性可用不同的方式加以测定，例如 通过测量瑞斯托霉素辅因子活性（VWF:RCo)或其他的已知方法。一种优选实施方式用以测 定反应标本中的残留VWF活性的方法是将该反应标本或它的等分试样与包括一种氨基酸 序列的分离GPIb a蛋白混合，不添加瑞斯托霉素和美洲矛头腹毒蛋白，其中，所述氨基酸 序列与人类GPIba蛋白的野生型序列（SEQ ID N0:1)相比至少包含氨基酸残基1-268,且 分别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa (优选Xaa =缬氨酸残基或丝氨酸残 基）。特别优选的方案是上述GPIb a蛋白与一种粒子固相相关，该粒子固相根据残留VWF 活性发生凝集。借助该凝集反应可测定反应标本中的残留VWF活性，根据残留VWF活性又 可得知所述样本所含的AD AMTS-13活性。
[0056] 本发明在样本中测定血管性血友病因子（VWF)裂解ADAMTS-13蛋白酶活性的方法 的优点主要在于可以免去对VWF基质的尿素处理，使用尿素会带来这样的风险：如果预处 理时没有严格遵守培养时间，就会测到过低的VWF活性。在现有技术的各种各样方法中， 必须通过用尿素或具有相似变性作用的物质对VWF基质进行预处理来使VWF完全能够被 ADAMTS-13 蛋白酶分解（参见 TO 2004/005451A2)。
[0057] 由于任何一份需要在其中对ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解活性加以测定的人类血 浆样本中均含有样本固有VWF，因而在对原有检测标本进行测量的同时并行测量一份第二 检测标本是有利的；测量时，用本发明的方法对同一样本的第二等分试样进行分析，但并不 对与VWF基质混合的样本进行与原有检测标本一样长时间的培养，而是在样本和VWF基质 混合后立即在第二检测标本中测定VWF活性。在此情况下，第二检测标本中的VWF活性（无 培养步骤）与原有检测标本中的VWF活性（经用于实现VWF蛋白水解的培养步骤）之差就 是在原有检测标本中被ADAMTS-13分解的VWF活性。
【附图说明】
[0058] 图1 :上图为基于GPIb-(aal-285，G233V/M239V)的ELISA中依赖于瑞斯托霉素 浓度（mg/mL)的VWF结合；下图为基于野生型GPIb的ELISA中依赖于瑞斯托霉素浓度 (mg/mL)的VWF结合。本发明测定VWF所应用的GPIba-( aal-285，G233V/M239V)检测系 统或野生型GPIb a-ELISA检测系统的结构如实例4所述。将VWF/Faktor VIII浓缩物 Haemate?的四份不同稀释物用作样本。在不存在瑞斯托霉素（0mg/mL)的情况下，使用突 变GPIb a -(aal-285, G233V/M239V)时，VWF会发生依赖于浓度的强烈结合（上图）。在添 加瑞斯托霉素的情况下，这种结合可小幅上升，其原因可能在于非特异性结合，这种结合即 使不存在GPIb a也会发生。而野生型GPIb a只需添加1.2mg/mL瑞斯托霉素就会发生程 度相当的VWF结合。使用野生型GPIb a时，如果不添加瑞斯托霉素，就不会出现任何结合 现象（下图）。
[0059] 图2 :借助GPIb a乳胶粒子凝集检测在不使用瑞斯托霉素的情况下用于在人类柠 檬酸盐血浆样本中测定VWF活性（10% -200% VWF活性）的定标曲线（参见实例5)。图示 为依赖于VWF活性的粒子凝集反应速度。
[0060] 图3 :借助GPIb a乳胶粒子凝集检测在不使用瑞斯托霉素的情况下用于在人类柠 檬酸盐血浆样本中测定低VWF活性（彡3% VWF活性）的定标曲线（参见实例5,45 y L的 样本）。图示为依赖于VWF活性的粒子凝集反应速度。
[0061] 图4 :在样本不含瑞斯托霉素以及在检测标本中存在不同Tween?20浓度的情 况下以不同VWF浓度（14. 9%至149. 6% )进行的GPIb a乳胶粒子凝集检测（参见实例5， Tween?20浓度变化，15 y L样本）。
[0062] 图5 :在样本不含瑞斯托霉素以及在检测标本中存在不同Thesit浓度的情况下以 不同VWF浓度（8%至40% )进行的GPIb a乳胶粒子凝集检测（参见实例5,用Thesit代 替 Tweerr? 20,45 y L 样本）。
[0063] 图6 :在样本不含瑞斯托霉素以及在检测标本中存在不同Thesit浓度的情况下以 不同VWF浓度（样本已预先用乏VWF血浆或缓冲液加以稀释）进行的GPIb a乳胶粒子凝 集检测（参见实例5,用Thesit代替Tween? 20,45 y L样本）。
【具体实施方式】
[0064] 下面借助实例对本发明的各个方面进行说明，但本发明并不限于这些实例。
[0065] 实例
[0066] 实例1:克隆6?让〇-(6233￥/]\1239￥)-(3\?13§)-(6\出8)组成物
[0067] 对表达载体pIRES neo2(BD生物科学公司（BD Biosciences),科隆泰克产品 (Clontech)，货号：6938-1)进行改性，使其在EcoRI限制性酶切位点和Notl限制性酶切位 点之间包含一种3XFlag标签和一种6XHis标签。在标签序列的上游（5'）插入一个为信 号肽（SEQ ID NO: 2)和人类GPIb a受体（SEQ ID NO: 1)的氨基酸1-285编码片段，这个片 段在为氨基酸位置233和239编码的位点上分别包含有一个为缬氨酸编码的密码子。
[0068] 实例2:在冊1(细胞中表达重组6?让(1-(6233￥/]\123叭)-(3\卩138)-(6\出8)融 合蛋白
[0069] 用实例1中所描述的组成物转化HEK 293细胞（人胚肾细胞；ATCC编号： CRL-1573;海德堡的细胞线服务公司（Cell Lines Service CLS))。
[0070] 在下列物质中培养这些细胞：
[0071] DMEM(货号：31966-021，Invitrogen)
[0072] 经热灭活处理的 +10 % FBS Origin EU (货号：10270-106, Invitrogen)或 10 % FBS Origin USA(货号：A15-003,批号：A01123-678，PAA)
[0073] +1 % Antibiotic-Antimycotic-Solution (100x)(货号：PI 1-002, PAA)
[0074] +0? 1 % Gentamycin-Solution 50mg/ml (货号 Pll-005, PAA)
[0075] +500μg/ml Geneticin(G418)-Solution 50mg/ml active Geneticin(货号： 10131-027, Invitrogen)
[0076] 用于表达（生成）：
[0077] OPTIPRO-SFM(货号：12309-019, Invitrogen)
[0078] +0? 5% Antibiotic-Antimycotic-Solution (100x)(货号：PI 1-002, PAA)
[0079] +0? 05% Gentamycin-Solution 50mg/ml (货号：P11_005, PAA)
[0080] +2% Glutamax 1 (100X)(货号：3505〇-〇38, Invitrogen)
[0081] 以及无 Geneticin
[0082] 过程如下：
[0083] 1)在含血清的介质中，在T175中进行细胞的融解（lKryo具有5_10xl0e6细胞） 和培养96h
[0084] 2)碎裂成 4x T175,培养 72-96h
[0085] 3)碎裂成 25x T175,培养 72-96h
[0086] 4)将一个T175碎裂，并继续培养以作储备。将剩余的24x T175碎裂成3x CellStack Corning(每 CellStack 10 层，总共 6360cm2)，培养 72h
[0087] 5)移除介质，清洗有DMEM但没有FBS l_2x的单层，添加不含血清的 0PTIPR0-SFM(每 CellStack 1. 8 升），培养 96h
[0088] 6)收获介质。用离心法滤除上清液，回收分离出的细胞抽提物，将其回加到具有新 鲜 0PTIPR0-SFM 的 CellStack 中，培养 96h
[0089] 7)如 6)
[0090]8)最终收获介质，结束培养。
[0091] 实例 3 :亲和层析分离重组 GPIba-(G233V/M239V)-(3XFlag)-(6XHis)融合蛋 白
[0092] 通过离心分离法（35min, lOOOOrpm, Beckman J2-21,德国 Beckman Coulter GmbH)从存留的细胞或细胞片段中分离出按实例2获得的、包含GPIba-(G233V/ M239V)-(3XFlag)-(6XHis)的介质。使用分离限值为10kDa的超滤盒 (Ultrafiltrationskassette)(PES 10,德国的施莱彻和舒尔公司（Schleicher&Schilll)) 通过切向流超滤将由此获得的不含细胞的上清液浓缩至初始体积的1/10。
[0093] 用Ni2+琼脂糖凝胶（His Pr印FF16/10,瑞典的通用电气医疗集团（GE Healthcare))按制造商的说明通过亲和层析法进行纯化。通过在浓缩上清液中添加 500mMol NaCl、20mMol似2册04和5mM咪唑，并通过添加5M HC1将pH值调整至pH 7. 4,以 实现6?让〇-(6233￥/]?239￥)-(3\?13§)-(6\出8)的结合。通过用成分为 5001111〇1恥(：1、 20mMol Na2HP〇dP5mM咪唑的缓冲液（pH 7.4)来冲洗导柱来洗去未结合的成分。用成分为 20mMol Na2HP04、500mMol NaCl, 500mMol 咪唑的缓冲液（pH 7. 4)对结合的 GPIb a -(G233V/ M239V)-(3XFlag)-(6XHis)进行洗脱处理。用超滤膜分离限值为10kDa的超滤搅拌室 (UltrafiltrationsrUhrzelle) (OMEGA 10K,美国的颇尔生命科学（Pall Life Sciences)) 将由此获得的洗脱液浓缩至初始体积的1/10。用层析柱Superdex 200prep grade 35/600 (瑞典GE Healthcare)按制造商指示通过凝胶过滤法对污染物进行进一步的纯化 和分离。用成分为 〇.〇48mol/L Na2HP04、0.02mol/L KH2P04、0.145mol/L NaCl、0.015mol/ LNaN^缓冲液（pH 7. 2)以5. Oml/min的流率进行层析处理。施加样本后，GPIb a -(G233V/ M239V)-(3XFlag)-(6XHis)以一根据约300ml的洗脱体积的峰值从所用的层析柱中洗 脱。
[0094] 实例4 :本发明在不使用瑞斯托霉素的抗FLAG/GPIb a -ELISA中测定VWF活性的 方法
[0095] 使用已涂有抗Flag标签抗体（美国圣路易斯西格玛（Sigma)，ANTI-FLAG HS，M2coated 96-well Plates (clear),产品号P 2983)的酶标板。在该酶标本的每个 凹穴内均加入100 u L的磷酸缓冲液，该磷酸缓冲液含有浓度为2. 4 y g/mL的重组野生型 GPIba-(3XFlag)_(6XHis)融合蛋白（细胞沉积后培养基的1:10稀释上清液）或分离 重组 GPIba-(aal-285，G233V/M239V)-(3XFlag)-(6XHis)融合蛋白（参见实例 3)，在 夜间于2-8°C下进行培养。用磷酸缓冲液（+0.01% Tween? )进行过四重清洗后，添加 50 y L经磷酸缓冲液+0. 1 %牛血清白蛋白稀释的Hiimate? (德国马尔堡的杰特贝林公 司（ZLB Behring))稀释物和50 yL经磷酸缓冲液+0.1 %牛血清白蛋白稀释的瑞斯托霉 素稀释物。随后在室温下培养1小时。用上述方法进行过四重清洗后，添加100 UL的辣 根过氧化物酶相关抗 VWF 抗体（Rabbit Anti-Human VWF/HRP，DAKO, Ref. P0226)，在室温 下培养1小时后按上述方式进行清洗。随后添加100 U L用作基质的四甲基联苯胺溶液 (TMB Substrat,德国马尔堡的答德贝林马尔博格股份有限公司（Dade Behring Marburg GmbH)，Ref. 450684)，在室温下培养4分钟。通过添加100 y L的0. 5N硫酸来终止反应。随 后用分光光度计在405nm下测量消退度。
[0096] 在不存在瑞斯托霉素的情况下，使用根据实例1-3制得的突变GPIb a时，VWF会 发生与浓度有关的强烈结合。在添加瑞斯托霉素的情况下，这种结合小 幅上升，其原因可 能在于非特异性结合，这种结合即使不存在GPIb a也会发生。而野生型GPIb a只需添加 1. 2mg/mL瑞斯托霉素就会发生程度相当的VWF结合。使用野生型GPIb a时，如果不添加瑞 斯托霉素，就不会出现任何结合现象（图1)。
[0097] 实例5 :本发明在不使用瑞斯托霉素的GPIb a乳胶粒子凝集检测中测定VWF活性 的方法
[0098] 准备三种试剂：
[0099] 试剂 1 :
[0100] 将单克隆抗6?让(1抗体疆16(1(荷兰于登5&111^〇8.￥.，产品号腸附146)结合到 乳胶粒子的表面，使粒子再悬浮在一用于长期贮存的缓冲液中（〇.6g/L TRIS，1.1%亮氨 酸，12.5%蔗糖，0.05%批4,6.2511^/1庆大霉素和0.62511^/1两性霉素4118.25，乳胶浓度 0.22% )〇
[0101] 试剂 2:
[0102] 乏VWF血浆
[0103] 试剂 3:
[0104] 将下列成分混合，产生总体积为30mL的试剂3 :
[0105] 2. 5mL聚乙烯吡咯烷酮（PVP)(德国的福卢卡公司（Fluka))在磷酸缓冲液（pH 7. 1)中的7. 5%溶液，
[0106] 12. 9mL(0. 625mg/mL)在Tris缓冲液（pH 7. 1)中的异嗜性抗体阻断剂1 (斯堪 提波迪实验室股份有限公司（Scantibodies Laboratory Inc),美国三提（Santee)，CA 92071，），
[0107] Tween?20 (美国密苏里州圣路易斯的西格玛（Sigma))在磷酸缓冲液（pH 7. 2) 中浓度为21g/L的3. 4mL溶液，
[0108] 重组6?让〇-(6233￥/]?239￥)-(31?138)-(61把8)(参见实例3)在磷酸缓冲液&11 7. 1)中浓度为5. 59mg/mL的0? 086mL溶液，以及
[0109] 11. 2mL 磷酸缓冲液（pH 7. 1)。
[0110] 在自动凝血分析仪BCS? (贝林凝集系统（Behring Coagulation System),德 国马尔堡Dade Behring Marburg GmbH)上进行检测。将15 yL的人类梓檬酸盐血衆样本、 30 y L试剂2和70 y L试剂3混合在一起。通过添加混合40 y L试剂1来开始反应过程。 在575nm下持续对反应混合物的消退度进行测量。乳胶粒子的凝集速度与样本中的VWF活 性有关。
[0111] 为了计算VWF活性，利用标准人类血衆（德国马尔堡Dade Behring Marburg GmbH)来制作定标曲线。将标称瑞斯托霉素辅因子值用作该BCS?系统的VWF标定值。通 过在减少试剂2用量的同时提高标准人类血浆的体积，产生最高达200%的VWF活性。通过 用试剂2稀释该标准人类血浆，产生较低的VWF活性。图2显示的是一种典型的定标曲线。 借助于测定的反应速度可以在该定标曲线上读取某一样本的VWF活性。
[0112] 在一用于在样本中测量特低VWF活性的检测标本中使用45 yL样本，而非15 yL 或30 y L样本（参见上文）。进行定标时，用试剂2稀释标准人类血浆，从而产生最低达3% 的低VWF活性（参见图3)。这个检测标本使得对极低VWF活性的精确测定成为可能，这一 点在形成VWF活性/抗原比率以便对血管性血友病的不同子类进行分类时特别重要。通过 将标本中的PVP浓度提高到0. 35%以及将样本体积增大到60 y L，可以进一步强化与VWF 有关的凝集反应，还可以进行1 % VWF分化和0% VWF分化。借此可以极为可靠地将第3类 血管性血友病（0% VWF)与极度缺乏的其他类型（例如1-5% )区别开来。
[0113] 实例6 :本发明以经尿素预处理的大分子多聚体VWF(P1648S)为VWF基质测定 ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解活性的方法
[0114] 1.反应缓冲液：lmmol/L Pefabloc SC(德国曼海姆的罗氏诊断股份有限公司 (Roche Diagnostics GmbH)),12. 5mmol/L BaCl2,5mmol/L TRIS,pH 8.0 ；
[0115] 2.准备基质缓冲液，在室温下精确培养5分钟：8. 3U/mL (830% )用重组法制成的 大分子多聚体 VWF-P1648S，4. 6mol/L 尿素，4. 6mmol/LTRIS，pH 8. 0 ;
[0116] 3.在15 y L人类血浆样本中掺入300 y L反应缓冲液，再与150 y L基质缓冲液混 合；
[0117] 4.在37°C下将检测标本培养4至8小时；
[0118] 5.以如实例5所述的方式，在将该反应混合物用作样本的情况下测量VWF活性。
[0119] 实例7 :本发明以经尿素预处理的重组大分子多聚体VWF(P1648S)为VWF基质测 定ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解活性的方法
[0120] 1?将6 y L人类血浆样本（用反应缓冲液1:6稀释）与20 y L反应缓冲液混合；
[0121] 2.在37°C下将该混合物培养5分钟以激活ADAMTS-13蛋白酶；
[0122] 3?添加12yL基质缓冲液（5U/mL(500% )重组大分子多聚体VWF-P1648S，5mol/ L 尿素，5mmol/L Tris-HCl，pH 8.0);
[0123] 4.在37°C下将检测标本培养20分钟；
[0124] 5.以如实例5所述的方式，在将该反应混合物用作样本的情况下测量VWF活性。
[0125] 实例8 :本发明以大分子多聚体VWF(P1648S)为VWF基质测定ADAMTS-13蛋白酶 的VWF裂解活性的方法和借助/不借助ADAMTS-13分解来求差的方法
[0126]检测 1：
[0127] L 将 10 y L 人类血浆样本 20 y L ADAMTS-13 激活缓冲液（18. 75mmol/L BaCl2，pH 8. 0, 5mmol/L Tris-HCl, 1. 5mmol/L Pefabloc SC(德国曼海姆Roche Diagnostics GmbH)) 混合；
[0128] 2.在37°C下将该混合物培养5分钟；
[0129] 3?添加 20 y L 在 5mmol/L Tris-HCl 中的浓度为 1. 25U/mL(125% )的重组 VWF 基 质（P1648S)，pH 8. 0 ;
[0130] 4.在37°C下将检测标本培养20分钟；
[0131] 5.以如实例5所述的方式，在将该反应混合物用作样本的情况下测量VWF活性。
[0132]检测 2：
[0133] 以如检测1所述的方式对同一个人类血浆样本的另外10 UL进行处理，但此处不 实施在37°C下培养20分钟的培养步骤（参见第4步），而是在添加VWF基质（P1648S)后， 立即以如实例5所述的方式在将该反应混合物用作样本的情况下测量VWF活性。检测1和 检测2的VWF活性差就是被分解的VWF活性，也就是ADAMTS-13活性。借助定标曲线据此 测定血浆样本中的ADAMTS-13活性。
【主权项】
1. 一种在样本中测定血管性血友病因子（VWF)活性的方法，其中，将所述样本和分离 GPIba蛋白混合成一种检测标本，所述方法包括： a) 使用包括一种氨基酸序列的分离GPIba蛋白，所述氨基酸序列与人类GPIba蛋白 的野生型序列（SEQIDNO: 1)相比至少包含氨基酸残基1-268,且分别在位置233和239上 具有一种氨基酸取代基Xaa，以及 b) 在所述检测标本中不添加瑞斯托霉素和美洲矛头腹毒蛋白，以及 c) 其中所用GPIba蛋白与一种粒子固相相关。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，在所述检测标本中不添加瑞斯托霉素或美洲矛 头腹毒蛋白的等效物质。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所用GPIba蛋白的位置233和/或位置 239上的氨基酸取代基Xaa由一种缬氨酸残基或一种丝氨酸残基构成。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所用GPIba蛋白是用重组法或合成法制备 的。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所用GPIba蛋白在N端上与同源的人类 GPIba信号序列（SEQIDNO:2)或一种异源信号序列融合。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所用GPIba蛋白在C端上与一个以上亲和 标签融合。7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所用GPIba蛋白在C端上与一个以上选自群组 的亲和标签融合，该群组由组氨酸标签、Flag标签、精氨酸标签、c-Myc标签和Strep标签组 成。8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所用GPIba蛋白通过一种抗体与所述粒子固相 相关。9. 根据权利要求8所述的方法，其中，所用GPIba蛋白通过一种抗GPIba抗体与所述 粒子固相相关。10. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述GPIba蛋白通过一种抗亲和标签抗体与所 述粒子固相相关。11. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述粒子固相由一种乳胶构成。12. 根据权利要求1所述的方法，其中，通过所述粒子固相的GPIba介导凝集测定所述 VWF活性。13. 根据权利要求12所述的方法，其中，所用GPIba蛋白通过选自VM16d和SZ2群组 的单克隆抗GPIba抗体与所述粒子固相相关。14. 根据权利要求12所述的方法，其中，所用GPIba蛋白在C端上与一个以上Flag标 签融合，且通过抗Flag抗体与所述粒子固相相关。15. 根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中，所述检测标本包含一洗涤剂。16. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述洗涤剂为一选自吐温-20、哲斯特、曲拉通 洗涤剂和十二烷基硫酸钠（SDS)群组的洗涤剂。17. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述检测标本包含浓度从0. 02g/L至20g/L的 吐温-20。18. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述样本为一种源自人类或动物的生物液 体。19. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述样本为一种包括一种生物液体反应混 合物，所述生物液体中添加有用作基质的分离VWF。20. -种用于实施根据权利要求1所述的方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括一 种试剂，所述试剂含有GPIba蛋白，所述GPIba蛋白包括一种氨基酸序列，所述氨基酸序 列与人类GPIba蛋白的野生型序列（SEQIDNO:l)相比至少包含氨基酸残基1-268,且分 别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa，所述GPIba蛋白与一种粒子固相相关。
【专利摘要】本发明涉及测定血管性血友病因子活性的方法及检测试剂盒。本发明涉及一种在样本中测定血管性血友病因子(VWF)活性的方法，其中，将样本和分离GPIbα蛋白混合成一种检测标本，该方法包括：a)使用包括一种氨基酸序列的分离GPIbα蛋白，氨基酸序列与人类GPIbα蛋白的野生型序列(SEQ ID NO:1)相比至少包含氨基酸残基1-268，且分别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa，以及b)在检测标本中不添加瑞斯托霉素和美洲矛头腹毒蛋白，c)其中所用GPIbα蛋白与一种粒子固相相关。本发明还涉及用于该方法的检测试剂盒。
【IPC分类】G01N33/86
【公开号】CN104897910
【申请号】CN201510146007
【发明人】哈拉尔德·阿尔特豪斯, 托比亚斯·奥布斯尔, 于尔根·帕茨克, 赖因哈德·施内彭海姆
【申请人】西门子医学诊断产品有限责任公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2008年7月3日
【公告号】CA2692576A1, CN101755211A, CN103076459A, CN103076459B, DE102007031708A1, EP2167978A2, EP2167978B1, EP2388596A1, EP2388596B1, US8932820, US20100136589, US20130078652, WO2009007051A2, WO2009007051A3
【专利说明】
[0001] 本发明是申请日2008年7月3日、发明名称为"在不存在瑞斯托霉素的情 况下测定血管性血友病因子活性的方法和测定ADAMTS-13蛋白酶的方法"、申请号为 200880023579. 6的申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明属于凝血诊断技术领域，涉及一种在样本中测定血管性血友病因子（VWF) 活性的体外方法。所述方法包括对GPIba蛋白功能获得性变异体的使用，这样就可不使用 瑞斯托霉素、美洲矛头腹毒蛋白或与瑞斯托霉素或美洲矛头腹毒蛋白等效的其他物质。本 发明还涉及一种测定血管性血友病因子（VWF)裂解ADAMTS-13蛋白酶活性的方法。
【背景技术】
[0003] 血管性血友病因子（VWF)是血浆中的一种大分子多聚体糖蛋白，在初期止血过 程中具有重要作用。另外，VWF具有胶原蛋白结合位点和用于定位于血小板表面的糖蛋白 Ib(GPIb)的结合位点。GPIb是一种整合膜蛋白，会与另一种整合膜蛋白（糖蛋白IX(GPIX)) 在血小板膜中形成糖蛋白Ib-IX受体复合物。GPIb是双链分子，由一条表观分子质量约为 145kDa的重链（同义词：heavy chain、a链或GPIb a )和一条表观分子质量约为22kDa 的轻链（同义词：light chain、|3链或GPIb|3 )构成，这两条链通过二硫键彼此相连 [Lopez, J. A?等人（1987)Cloning of the a chain of human platelet glycoprotein Ib:A transmembrane protein with homology to leucine-rich a 2-glycoprotein. Proc.Natl. Acad. Sci USA 84:5615-5619]。
[0004] 血管受伤时，VWF结合到暴露的胶原蛋白表面。由于与胶原蛋白结合以及受到增 大的剪力（作用在与胶原蛋白结合的VWF上）的影响，VWF发生变化或被激活，从而可以结 合到血小板膜的GPIb-IX受体复合物中的GPIb重链（GPIba)的氨基末端。经激活的VWF 通过这种方式俘获从旁边经过的血小板，使得受伤处形成由VWF、胶原蛋白和血小板构成的 第一团聚体。随后血小板被激活，从而开始血浆凝血过程，该过程在经过复数次放大级联反 应和血小板进一步聚集后最终促成伤口的愈合。
[0005] VWF在质或量上的异常是血管性血友病（同义词：von Willebrand Disease，VWD) 的起因，这种病是最常见的遗传出血性疾病之一。就血管性血友病的诊断而言目前存在不 同的筛查方法，例如测定出血时间（BT)、测定VWF抗原浓度（VWF:Ag)的定量法（例如ELISA 方法）和测定VWF活性的方法（例如瑞斯托霉素诱导血小板凝集（VWF:RCo))。
[0006] 瑞斯托霉素诱导固定血小板聚集的方法（又称"瑞斯托霉素辅因子检测"）还能 识别VWF蛋白用测定VWF抗原浓度的定量法所识别不到的功能性缺陷。因此，为能对血管 性血友病做出完全诊断，有必要实施用于测定瑞斯托霉素辅因子活性的瑞斯托霉素辅因子 检测。实施瑞斯托霉素辅因子检测时通常是将患者的血浆样本与固定的血小板混合和与瑞 斯托霉素混合。在斯托霉素的诱导下，样本所含的VWF结合到所添加的血小板的GPIb受体 上，从而实现血小板的聚集。这一聚集反应的反应程度与患者样本所含的被激活的VWF的 量有关。例如，这种聚集反应可通过测量传播增长进行光学检测，从而实现VWF:RCo活性的 量化。
[0007] 与VWF抗原检测相比，瑞斯托霉素辅因子检测的优点在于可对VWF进行活性测定， 从而实现对VWF功能性紊乱的识别，以及对血管性血友病的不同子类进行分类，这些子类 中仅部分子类也是随VWF抗原浓度的降低而出现。一般情况下，对这些子类进行分类时须 形成VWF瑞斯托霉素辅因子活性（VWF:RCo)与VWF抗原浓度（VWF:Ag)的比率（Ratio)。对 于血管性血友病的子类2A、2B和2M而言，VWF:RCo/VWF:Ag之比通常小于1。通常建议将 〇. 7的比率作为极限值。
[0008] 传统的瑞斯托霉素辅因子检测的不足之处在于实施过程很难自动化，因为在测量 过程中需要不断地充分搅拌检测标本（Testansatz)中的血小板。此外，这种检测的精确度 相对较低，对相关标准所规定的处于〇%至20%范围内的低VWF活性的测定无法充分发挥 作用。
[0009] 近来有人研发出了基于GPIba的VWF-ELISA检测，这种检测所使用的重组GPIba 片段（1-289 或 1-290)包含氨基末端 VWF 结合区[W001/02853A2 或 Vanhoorelbeke, K.等 人(2002)A reliable von ffillebrand factor:Ristocetin cofactor enzyme-linked immunosorbent assay to differentiate between type land type 2von ffillebrand disease. Semin Thromb Hemost. 28 (2):161-165 以及 Federici, A. B?等人（2004)A sensitive ristocetin co-factor activity assay with recombinant glycoprotein lb a for the diagnosis of patients with low von ffillebrand factor levels. Heamatologica 89(1):77_85]。这些检测方法借助特异性抗体将重组GPIba片段结合在 酶标板上。添加患者样本和瑞斯托霉素，使得患者样本中的VWF可以结合到重组GPIba片 段上。最后借助抗VWF抗体对结合的VWF进行定量检测。结果表明，这种VWF-ELISA检测 十分接近于基于血小板的传统VWF瑞斯托霉素辅因子活性检测，甚至比之更敏感、更精确。
[0010] Hui等人（摘要，ISTH 2007)所描述的基于GPIb a的VWF-ELISA检测使用在位 置233和位置239上具有突变体的重组GPIba片段（1-483)。这些突变体是所谓的功能 获得性突变体，它们在瑞斯托霉素浓度较低的情况下与野生型GPIba蛋白（W0 93/16712) 相比对VWF的亲和性更高，可以更强烈地与VWF相互作用。上述突变体是众所周知的 GPIba链突变变异体。Miller等人（US 5, 317, 097)描述的是GPIba链的位置233上 的甘氨酸残基被缬氨酸残基（G233V)取代的方法。这种变异是血小板型血管性血友病 (PT-VWD)的起因，PT-VWD是一种常染色体显性遗传出血性疾病。Russell和Roth描述的 是GPIba链的位置239上的甲硫氨酸残基被缬氨酸残基（M239V)取代的方法[Russell，S. D. &Roth, G. J. (1993)Pseudo-von ffillebrand Disease:A mutation in the platelet glycoprotein lb a gene associated with a hyperactive surface receptor.Blood 81 (7), 1787-1791]。这种变异也会引发PT-VWD。
[0011] 上述基于GPIba的VWF-ELISA检测以及瑞斯托霉素辅因子检测的缺点在于，它们 建立在使用瑞斯托霉素或其他可以促使VWF结合到GPIb a链上的外源非生理性调节因子 的基础上。瑞斯托霉素是一种来自于诺卡氏菌属的抗生糖肽，美洲矛头腹毒蛋白（同义词： 副凝集素（co-agglutinin))是一种来自于矛头腹属的蛇毒，它们通常用于体外诱导VWF结 合到血小板或结合到分离GPIba蛋白或其片段上。使用瑞斯托霉素的缺点是，它不仅会结 合到VWF上，还会结合到许多其他类型的蛋白上，例如纤维蛋白原或抗GPIba抗体（在特 定的实验中观察到的）。因此，在VWF检测方法中使用瑞斯托霉素存在发生非特异性结合反 应或沉淀反应的风险，这些反应会使检测结果失真。
【发明内容】
[0012] 因此，本发明的目的是提供一种在不存在瑞斯托霉素的情况下测定VWF活性的方 法。
[0013] 基于人类GPIba受体氨基酸序列，通过位置233和位置239上具有两处点突变的 GPIba链的功能获得性变异体来实现本发明的目的。在本发明范围内，GPIba链的功能获 得性变异体指的是一种在瑞斯托霉素浓度较低的情况下与野生型GPIb a蛋白相比对VWF 的亲和性明显更高、可以更强烈地与VWF相互作用的突变变异体。
[0014] 本发明的标的是一种在样本中测定血管性血友病因子（VWF)活性的方法，其中， 将所述样本和分离GPIb a蛋白混合成一检测标本，该检测标本中不添加瑞斯托霉素和美 洲矛头腹毒蛋白。所用的GPIb a蛋白包括一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与人类GPIb a 蛋白的野生型序列相比至少包含氨基酸残基1-268,且分别在位置233和239上具有一种取 代基Xaa(SEQID NO:l)。GPIba链位置233上的甘氨酸残基取代基Xaa和位置239上的甲 硫氨酸残基取代基Xaa优选由一种缬氨酸残基（G233V或M239V)或一种丝氨酸残基（G233S 或M239S)构成。这两个位置上的不同取代基Xaa可以为任意一种组合。在对本发明进行 说明时，提及GPIb a蛋白时均可理解是指这样一种突变变异体。
[0015] 此外，优选不在所述检测标本中添加"瑞斯托霉素或美洲矛头腹毒蛋白的等效物 质"。在本发明范围内，"瑞斯托霉素或美洲矛头腹毒蛋白的等效物质"是指可以体外诱导分 离VWF结合到野生型GPIb a链或其片段上的外源（即非生理性）物质。
[0016] 本发明的一个优点在于，通过使用GPIba的功能获得性变异体，就无需通过（例 如）流体流动、搅拌或振动来对检测标本施加抗剪应力。
[0017] 就VWF活性测定方法而言，"样本"指的是有可能含有待检测物质（即VWF)的材 料。例如，"样本"这一概念包括特别是人和动物的生物液体（如血液、血浆或血清）以及 用于血管性血友病患者替代疗法的工业产品（如Haemate?P)，如VWF定标剂、VWF质控 血浆（VWF-Kontrolle)或高浓度VWF浓缩物。必要时须对样本进行预处理，以便可以检测 到被分析物或将干扰性的样本成分移除。这种样本预处理可以包括分离和/或溶解细胞或 对样本的离心分离。"样本"这一概念还包括包含上述样本材料中的一种样本材料的反应混 合物，该样本材料中被加入用作基质的分离VWF，以便测定VWF改性因子的活性，在培养VWF 基质后需要借助VWF改性因子在这类反应混合物中测定残留VWF活性。例如，由血浆样本 和分离大分子VWF构成的用于测定该血浆样本中的VWF裂解ADAMTS-13蛋白酶的混合物就 是这样一种反应混合物。血浆样本中的ADAMTS-13蛋白酶裂解所添加的VWF基质，从而降 低该样本的VWF活性。
[0018] 本发明的方法所用的GPIb a链可以是用重组法或合成法制成的GPIb a蛋白。已 知的原核或真核表达系统适合用来制造重组GPIba蛋白，例如在细菌（如大肠杆菌）中表 达，在酵母（如酿酒酵母、甲醇酵母）中表达，在植物、动物或人类细胞培养中表达。已知的 体外蛋白合成技术适合用来制造合成GPIb a蛋白，例如固相合成（例如Merrifield合成 法）。本发明的方法所用的GPIba蛋白优选是一种用重组法在人类细胞培养物（优选人胚 肾细胞（HEK细胞）培养物）中制成的GPIb a蛋白。
[0019] 本发明的方法所用的GPIba蛋白可在N端上与同源的人类GPIba信号序列 MPLLLLLLLLPSPLHP(SEQ ID NO:2,亦称"氨基酸残基16至1"）融合。作为替代方案，所用 的GPIb a蛋白可在N端上与异源信号序列融合，即与一种通常不存在于人类GPIb a多肽 中、但在所选表达系统中会对重组表达的GPIb a蛋白的表达和/或分泌产生有利影响的多 肽融合。例如，MPLQLLLLLILLGPGNSLQLWDTWADEAEKALGPLLARDRR(SEQ ID NO:3)就是一种适 用的异源信号序列。
[0020] 此外，本发明的方法所用的GPIb a蛋白还可在C端上与一个以上亲和标签融合， 这些亲和标签可使如重组表达蛋白结合到亲和载体上，从而使如重组表达GPIb a蛋白得 到纯化，或者还使重组GPIb a蛋白与一种固相结合。优选长度仅有12个氨基酸的小亲和 标签为。特别优选的亲和标签是选自组氨酸标签、Flag标签、精氨酸标签、c-Myc标签和 Strep标签群组的亲和标签。以较高亲和性结合到亲和标签上的适当亲和载体例如是特异 性抗体、固定化阳离子（例如对组氨酸标签具有亲和性的Ni 2+)或其他类型的结合对象（例 如对Strep标签具有亲和性的链霉亲和素）。
[0021] 根据本发明的方法的一种实施方式，所述GPIb a蛋白与一种固相相关。"相关"这 一概念含义广泛，例如包括共价结合和非共价结合、直接结合和间接结合、表面吸附和凹穴 夹杂出；[118(31111188；[116；[116/61'1：16；1!\11^)。共价结合是分离6?]^(3蛋白借助化学键结合到 固相上。非共价结合的一个例子就是表面吸附。除了直接结合到固相上之外，分离GPIb a 蛋白也可通过与其他特异性结合对象的特异性相互作用来间接地结合到固相上，例如通过 与抗体的特异性相互作用，优选是与抗GPIba抗体（只要分离GPIba蛋白具有亲和标签） 或与抗亲和标签抗体的特异性相互作用。
[0022] 在本发明范围内，"固相"这一概念包括一种由非水溶性多孔和/或无孔材料构成 的物体，它可以极其不同的形式存在，例如容器、细管、微量滴定板（例如酶标板）、球体、微 粒、细棒、条带、滤纸或层析纸等。一般情况下，该固相的表面亲水或可以获得亲水性。所述 固相可由各种材料构成，例如无机和/或有机材料、合成材料、天然材料和/或经改性的天 然材料。固相材料例如聚合物（例如纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酰 胺、交联右旋糖酐分子、琼脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸醋或尼龙）、乳胶、 陶瓷、玻璃、金属（特别是贵金属，如金和银）、磁体、上述材料的混合物或组合物。
[0023] 所述固相可具有一种由一个以上分层构成的覆盖层，所述分层由（例如）蛋白、碳 水化合物、亲脂性物质、生物聚合物、有机聚合物或其混合物构成，用以抑制或避免样本成 分与该固相之间的非特异性结合，或者改善在粒子固相的悬浮稳定性、贮存稳定性、成形稳 定性或者抗紫外线、抗微生物或抗其他具有破坏作用的用剂的特性。
[0024] 本发明的VWF活性测定方法的一种优选实施方式包括对粒子相关的GPIb a蛋 白（优选一种乳胶粒子相关的GPIb a蛋白）的使用，以及借助粒子固相的GPIb a介导凝 集对VWF活性的测定。优选使用通过抗体与粒子固相发生关联的GPIb a蛋白。此处可用 抗 GPIb a 抗体，特别是单克隆抗体 VM16d[Mazurov，A.V?等人（1991)Characterization of an antiglycoprotein lb monoclonals antibody that specifically inhibits platelet-thrombin interaction. Thromb Res. 62 (6)，673-684 ;购买途径：荷兰于登的 三比欧有限责任公司（Sanbio B.V.)，产品号MON 1146]和SZ-2[Ruan，C?等人（1987)A murine antiglycoprotein lb complex monoclonal antibody, SZ 2,inhibits platelet aggregation induced by both ristocetin and collagen. Blood 69 (2), 570-577 ;购买 途径：美国富勒顿的贝克曼库尔特有限公司（Beckman Coulter Inc.)，产品号頂0409]。 如果所用的GPIb a蛋白在C端上与一个以上Flag标签融合，贝也可使用抗Flag抗体 [参见US 5, 011，912 ;购买途径：德国施泰因海姆的西格玛奥德里奇化学有限责任公司 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH)]。定量测定与样本中所存在的VWF的量或活性之间存在关 联的凝集反应时，可对粒子聚集体上的光散射加以利用，例如通过测量散射光强度（散射 比浊法）或测量介质的浊度（测浊法）。
[0025] 优选在存在洗涤剂的情况下通过粒子固相的GPIb a介导凝集来测定VWF活性，所 述洗绦剂优选选自吐温-20 ( Tween? 20)、Thesit (哲斯特）、曲拉通（Triton)洗绦剂（例 如Triton X-100?或Triton X-405? )和十二烷基硫酸钠（SDS)群组。本发明发现，洗 涤剂的存在会对依赖于VWF的粒子固相（特别是乳胶粒子）的凝集速率产生影响：
[0026] 在不同的VWF浓度和逐步升高的Tween? 20浓度下测定该凝集速率（参见图4， 测定方法如实例5)。从图中可以清楚看到，当Tween? 20浓度相对较低（0. 02-0. lg/L) 时，反应强化作用特别明显，随着Tweeiv? 20浓度的升高，这种强化作用逐渐变小，并达到 一个稳定的强化水平。例如，当VWF浓度为149. 6%、Tween? 20浓度约为lg/L时，达到稳 定的强化水平，强化度为不存在Tween? 20时的初始值的85%。如果将Tween? 20用作 洗涤剂，就会存在两种可能性。其一，可以在浓度较低（0.02-0. lg/L)时调节Tween? 20， 以便对特定VWF浓度进行最高达20 %的特强强化。这样就会在Tween? 20浓度为0. 05g/ L(在检测标本中）、VWF浓度为30. 4%时获得216%的凝集速率强化度。由于低VWF浓度 特别难以测定，因而此时进行反应强化就特别有帮助。其二，如果在洗涤剂的饱和区内针对 所有的相关VWF浓度进行操作，则测量系统通常会更加稳定。例如自lg/L的Tween? 20 浓度起，情况即如此。这种方案更适用于VWF浓度范围较宽的筛查检测。如果需要在测定 VWF浓度时将凝集反应强化超过20 %，则0. 6-20. 0g/L (优选lg/L)的Tween? 20浓度是 有利的。
[0027] 其他洗绦剂，如Thesit (同义词：Polydocanol，瑞士罗特里斯特的善瑞尔和施兰 普费尔有限责任公司Schiirer & Sch丨iipfer Ltd.)、Trit〇n洗绦剂（例如Triton X-100? 或Triton X-405?)和十二烷基硫酸钠（SDS)，显示出稳定的与浓度有关的凝集反应强 化作用（参见图5,测定方法如实例5 :45 y L样本，但该样本中包含Thesit而非Tween? 20) 〇
[0028] 测定一血浆样本的VWF活性时，通常用缓冲液或乏VWF血浆对所述样本进行预稀 释。在需要制作定标曲线的情况下，要对正常血浆（例如标准人类血浆）进行同样的处理。 本发明发现，在用乏VWF血浆稀释的过程中以及在常规的洗涤剂浓度（在检测标本中为lg/ L)下，GPIb a乳胶粒子的凝集没有达到预想的强化结果，但是通过足够多的洗涤剂可以抑 制这种强化作用。如果如图6所示在一含有45 y L样本的检测标本中用乏VWF血浆或缓冲 液稀释该样本（在此情况下为标准人类血浆），则在存在乏VWF血浆的情况下，特定的VWF 浓度下该样本中就会出现较高的凝集速率。而如果在检测系统中不使用洗涤剂，并用乏VWF 血浆稀释标准人类血浆样本，所产生的凝集速率就会低于用缓冲液稀释时的凝集速率。但 如果添加足够多的洗涤剂（例如多3g/L Thesit)，用缓冲液稀释和用乏血浆稀释的凝集速 率就会相似。借此可确保在缓冲液中对血浆样本的进行稀释是恰当的。无论是对正常血浆 (用作定标剂）的稀释还是对患者样本的可能的稀释，均可通过简单的缓冲液来实现，而不 是借助于乏VWF血浆，这对检测是特别有利的。缓冲液价格不贵，由更好的贮存稳定性保 证，许多自动检测机仅用一种缓冲液来实施多种检测。此外，乏VWF血浆并非任何一个实验 室都有供应。测量VWF浓缩物时需要进行大量的稀释操作，其中，能用缓冲液真正有效地达 成稀释目的也是十分有利的。
[0029] 另一优选方案是在存在聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、优选在该聚乙烯吡咯烷酮在检测 标本中的浓度为〇. 1 %至1. 〇%的情况下和/或在存在右旋糖酐T500、优选在该右旋糖酐在 检测标本中的浓度为〇. 1%至3%的情况下和/或在存在藻酸盐500-600cP、优选在该藻酸 盐500-600〇?在检测标本中的浓度为0.01%至0.2%的情况下通过粒子固相的6?此(1介 导凝集来测定VWF活性。
[0030] 本发明的测定VWF活性方法的另一优选实施例涉及的是一种具有竞争力 的检测方案。这种方法包括对粒子相关抗GPIba抗体（优选VM16d)和反应标本 (Reaktionsansatz)中的粒子相关VWF的使用以及GPIba蛋白的添加。在存在GPIba蛋 白，不存在瑞斯托霉素、美洲矛头腹毒蛋白或等效物质的情况下，粒子发生凝集。添加含有 VWF的样本，可以抑制这种凝集反应。凝集反应受到抑制的程度与存在于样本中的VWF的量 或活性存在关联。
[0031] 本发明的VWF活性测定方法的另一优选实施方式包括对与非粒子固相相关的 GPIba蛋白（优选与微量滴定板表面相关的GPIba蛋白）的使用以及通过测定已结合到 该GPIba蛋白上的VWF量对VWF活性的测定。优选使用通过抗体与非粒子固相发生关联的 GPIba蛋白。此处可用抗GPIba抗体，特别是单克隆抗体VM16d(参见上文）和MB45[参 见Modderman，P. W?等人（1992) Glycoproteins V and Ib-IX form a noncovalent complex in the platelet membrane. J. Biol. Chem. 267(1) ,364-369 及其中所引用的参考文献 26; 购买途径：荷兰阿姆斯特丹的三奎恩（Sanquin) :PeliCluster CD42b，产品号M9142]。如 果所用的GPIba蛋白在C端上与一个以上Flag标签融合，则也可使用抗Flag抗体（参见 上文）。测定已结合到GPIba蛋白上的VWF量时，可使用直接或间接与一信号形成系统的 成分相关的抗VWF抗体，从而实现GPIba结合VWF量的量化。由于只有"活性"（功能完好 的）VWF会结合到GPIb a受体上，因此根据这一原理测定的VWF抗原浓度与VWF活性之间 存在关联。
[0032] 本发明还涉及一种应用于本发明的方法的检测试剂盒，其中，所述检测试剂盒包 括至少一种试剂，所述试剂含有GPIba蛋白，所述GPIba蛋白包括一种氨基酸序列，所 述氨基酸序列与人类GPIba蛋白的野生型序列（SEQ ID N0:1)相比至少包含氨基酸残基 1-268,且分别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa，所述GPIb a蛋白与一种 粒子固相相关。该检测试剂盒优选包括一种含有乳胶粒子相关GPIba蛋白的试剂。所述 GPIba蛋白优选通过抗体与所述粒子固相发生关联。该试剂可以液态或冻干形式加以提 供。如果该试剂以冻干粉剂形式存在，则所述检测试剂盒还可包含使该冻干粉剂悬浮所需 的溶剂，例如蒸馏水或适当的缓冲液。
[0033] 本发明此外还涉及一种应用于本发明的方法的检测试剂盒，其中，所述检测试剂 盒包括一种非粒子固相，优选一种微量滴定板，所述非粒子固相与包括一种氨基酸序列的 GPIba蛋白相关，所述氨基酸序列与人类GPIba蛋白的野生型序列（SEQ ID NO:l)相比 至少包含氨基酸残基1-268,且分别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa。所述 GPIba蛋白优选通过抗体与所述非粒子固相相关。所述检测试剂盒还可包括一种试剂，该 试剂含有一种抗VWF抗体，优选一种直接或间接与一种信号形成系统的成分相关的抗VWF 抗体。所述含有抗VWF抗体的试剂可以液态或冻干形式加以提供。如果该试剂以冻干粉剂 形式存在，则所述检测试剂盒还可包含使该冻干粉剂悬浮所需的溶剂，例如蒸馏水或一种 适当的缓冲液。
[0034] 本发明还涉及一种分离GPIba蛋白在体外测定血管性血友病因子（VWF)活性方 法中的应用，所述分离GPIba蛋白包括一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与人类GP Iba蛋 白的野生型序列（SEQ ID NO: 1)相比至少包含氨基酸残基1-268,且分别在位置233和239 上具有一种氨基酸取代基Xaa，其中，所述VWF活性测定方法不使用瑞斯托霉素和美洲矛头 腹毒蛋白。
[0035] 优选使用位置233和/或位置239上的氨基酸取代基Xaa由一种结|氨酸残基或一 种丝氨酸残基构成的分离GPIba蛋白。这两个位置上的不同取代基Xaa可以为任意一种 组合。
[0036] 本发明此外还涉及一种获得分离GPIba蛋白的方法，所述分离GPIba蛋白包括 一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与人类GPIba蛋白的野生型序列（SEQ ID N0:1)相比至 少包含氨基酸残基1-268,且分别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa，其特征 在于，在原核细胞或真核细胞的培养物中重组表达所述GPIba蛋白，通过使用亲和载体以 亲和层析的方式从细胞溶解产物或细胞培养上清液中分离出所述GPIb a蛋白。
[0037] 优选用于获得位置233和/或位置239上的氨基酸取代基Xaa由缬氨酸残基或丝 氨酸残基构成的分离GPIb a蛋白的方法。这两个位置上的不同取代基Xaa可以为任意一 种组合。
[0038] 本发明的另一标的是一种测定血管性血友病因子（VWF)裂解ADAMTS-13蛋白酶活 性的方法。
[0039] ADAMTS-13(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs)是一种溶蛋白性裂解血管性血友病因子（VWF)、从而减小血管性血友病因子（VWF) 活性的金属蛋白酶。ADAMTS-13酶活性的先天性或获得性缺乏是各种疾病的起因，例如血栓 性血小板减少性紫癜（TTP)，一种危及生命的血栓栓塞性微循环疾病。在TTP患者的血浆中 发现的异常巨大的VWF多聚体被视为引起大量聚集VWF和血小板的血栓形成的原因所在。 因此，在患者样本中测定ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解蛋白酶活性具有诊断学意义。
[0040] 在测定VWF裂解ADAMTS-13蛋白酶活性或诊断ADAMTS-13缺乏症方面，现有技术 中存在多种不同的方法：
[0041] Furlan等人（1996)描述的方法是以经纯化的人类VWF为基质来培养含有 ADAMTS-13蛋白酶的样本，随后通过借助于SDS琼脂糖凝胶电泳的VWF多聚体分析或通过借 助于聚丙烯酰胺凝胶电泳的VWF片段分析，随后再通过免疫印迹来检测ADAMTS-13蛋白酶 的蛋白水解活性[Furlan，M.，Robles, R?及 Iimm丨e,B. (1996)Partial purification and characterization of a protease from human plasma cleaving von ffillebrand factor to fragments produced by in vivo proteolysis. Blood 87,10:4223-4234]。这类借助 凝胶电泳而实现的多聚体分析工作量极大，耗时颇多，因而不适用于临床实验室。
[0042] 其他的功能检测方法测定ADAMTS-13蛋白酶的蛋白水解活性的方式是以VWF为 基质来培养含有ADAMTS-13蛋白酶的样本，随后再测定VWF基质的活性损失。样本中所含 ADAMTS-13蛋白酶越多，被裂解的VWF基质就越多，之后可在反应混合物中检测到的VWF活 性就越少。这类功能检测方法的优点在于，通过将VWF用作基质以及通过测量大分子多聚 体的功能丧失，可以体外模拟ADAMTS-13蛋白酶在活体内的相关功能。
[0043] W0 2004/005451A2所揭示的方法是以经纯化的人类VWF为基质来培养含有 ADAMTS-13蛋白酶的样本，随后借助瑞斯托霉素辅因子检测通过测定残留在反应混合物中 的VWF活性来检测ADAMTS-13蛋白酶的蛋白水解活性。替代方案是通过胶原结合检测来测 定残留在反应混合物中的VWF活性（参见W0 00/50904)。其缺点是反应混合物的培养时间 极长，部分须连夜进行，以便使VWF被充分地蛋白水解。Kostousov, V.，Fehr, J.，Bombeli, T. (2006)Novel, semi-automated, 6〇-min-assay to determine von ffillebrand factor cleaving activity of ADAMTS-13. Thrombosis Res. 118:723-731 则描述了一种经改进的 方法，可以将培养时间缩减至60分钟。
[0044] US 2007/0065895 A1和US 2005/0186646 A1所揭示的方法是以具有特异性 ADAMTS-13蛋白酶裂解位点的肽或VWF肽（片段）为基质来培养含有ADAMTS-13蛋白酶的 样本，随后再借助SDS-PAGE通过对所生成的肽片段进行分析以及视情况通过免疫印迹来 检测ADAMTS-13蛋白酶的蛋白水解活性。
[0045] 已知检测系统的缺点在于不是技术上太复杂（例如借助SDS-PAGE分析蛋白水解 所生成的基质片段），就是没有对天然VWF基质加以利用，因而可能无法识别到ADAMTS-13 蛋白酶某些功能缺陷。
[0046] 因此，本发明的目的是提供一种测定血管性血友病因子（VWF)裂解ADAMTS-13蛋 白酶活性的方法，这种方法可以尽可能多地检测到ADAMTS-13蛋白酶功能障碍，还可以在 传统的临床分析仪上以节省时间的方式自动进行。
[0047] 达成这个目的的解决方案是将一种可能含有ADAMTS-13蛋白酶的样本和用作基 质的分离VWF混合成一种反应标本，其中，所述VWF基质由大分子多聚体VWF构成，所述大 分子多聚体VWF包含有具有至少一处氨基酸序列变异（多态或突变）的VWF单体，所述氨 基酸序列变异使得所述VWF基质与大分子多聚体、由野生型VWF单体构成的VWF的VWF基 质相比，可以加速ADAMTS-13的分解作用。
[0048] 先在活体内将人类VWF单体合成2813个氨基酸长度的前体蛋白。通过细胞内处理 产生大小可超过20000kDa的VWF多聚体。这些多聚体由通过二硫键彼此相连大小为275kDa 长度为2050个氨基酸的呈线性分布的VWF单体构成。该VWF以大小自500kDa(二聚体） 至15000kDa不等的多聚体的球状形式在血浆中循环。
[0049] 在本发明范围内，"大分子多聚体VWF基质"指的是一种由10个以上二聚化VWF 分子构成、大小超过5000kDa的VWF蛋白，这可以通过本领域技术人员熟悉的凝胶电泳加以 确定。此外，大分子多聚体VWF还包含有具有至少一处氨基酸序列变异（多态或突变）的 VWF单体，所述氨基酸序列变异使得所述VWF基质与大分子多聚体、由野生型VWF单体构成 的VWF的VWF基质相比，可以加速ADAMTS-13的分解作用。
[0050] VWF蛋白的氨基酸序列变异可以提高VWF对ADAMTS-13蛋白酶溶蛋白性裂解 的灵敏度，这一点属于现有技术[参见 Hassenpflug, W. A.，Budde, U.，Obser, T.，Angerh aus, D. , Drewke, E. , Schneppenheim, S. ,Schneppenheim, R. (2006)Impact of mutations in the von ffillebrand factor A2domain onADAMTS13-dependent proteolysis. Blood 107: 2339-2345 或 Rayes, J.，Hommais, A.，Legendre, P.，Tout, H.，Veyradier, A.，Obert, B. ,Ribba, A. S. , Girma, J. P. (2006)Effect of von ffillebrand disease type 2B and type 2Mmutations on the susceptibility of von ffillebrand factor to ADAMTS-13. J Thromb Haemost. 5:321-328]。特别适用于本发明的VWF基质应该由大分子多聚体VWF构 成，所述大分子多聚体VWF包含有VWF单体，所述VWF单体具有至少一处来自下列群组的氨 基酸序列变异：
[0051] P1648S、E1638K、G1505R、S1506L、M1528V、R1569del、R1597W、V1607D、G1609R、 G1629E、G1631D、R1597Q、V1499E 和 Y1584C。
[0052] 氨基酸位置的说明与VWF前体蛋白2813个氨基酸长度的氨基酸序列有关（参见 NCBI Accession No.AAB59458, Version AA59458.1，G1:340356)。"del"这个缩写表示的 是相关氣基酸残基的缺失。有关血管性血友病因子的突变和多态命名，另见Goodeve, A. C. , Eikenboom, J. C. J. , Ginsburg, D. , Hilbert, L. , Mazurier, C. , Peake, I. R. , Sadler, J. E?和Rodeghiero, F. (2001)A Standard nomenclature for von ffillebrand factor gene mutations and polymorphisms. Thromb Haemost. 85:929-931〇
[0053] 其他天然存在的或人工制成的VWF氨基酸序列变异同样适用于本发明，只要它们 能使得所生成的VWF基质与大分子多聚体、由野生型VWF单体构成的VWF的VWF基质相比， 可以加速ADAMTS-13的分解作用，也就是说，所生成的VWF基质对ADAMTS-13蛋白水解具有 更高的灵敏度。"对ADAMTS-13蛋白水解具有更高的灵敏度"表示的是，大分子多聚体VWF 基质在体外被ADAMTS-13蛋白水解的速度超过纯野生型的大分子多聚体VWF基质，亦即，在 相同的培养条件下VWF基质的断裂程度更大，这可以通过本领域技术人员熟悉的凝胶电泳 加以确证。
[0054] 本发明所使用的分离大分子多聚体VWF基质可从适当VWF氨基酸序列变异的杂合 或纯合载体的捐献者血楽?（Spenderplasmen)中获得，或者可以借助本领域技术人员熟悉 的方法加以重组表达。用重组法制成的VWF基质的优点在于，它没有任何在移入检测标本 的过程中会导致检测结果失真的ADAMTS-13污染，且其完全多聚化，不像从血浆中分离出 来的VWF那样被蛋白水解。
[0055] 根据本发明用于测定血管性血友病因子（VWF)裂解ADAMTS-13蛋白酶活性的方法 的一种优选实施方式，通过将所述样本附加地与肝磷脂和/或分离天然GPIb a蛋白和/或 重组野生型GPIb a蛋白以及瑞斯托霉素或美洲矛头腹毒蛋白混合，还可进一步加速VWF基 质的分解。为此，也可将所述样本与包括一种氨基酸序列的重组或合成GPIb a蛋白混合， 所述氨基酸序列与人类GPIb a蛋白的野生型序列（SEQ ID NO: 1)相比至少包含氨基酸残 基1-268,且分别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa。所用GPIb a蛋白的位 置233和/或位置239上的氨基酸取代基Xaa优选由一种缬氨酸残基或一种丝氨酸残基构 成。用VWF基质培养样本后残留在反应标本中的VWF活性可用不同的方式加以测定，例如 通过测量瑞斯托霉素辅因子活性（VWF:RCo)或其他的已知方法。一种优选实施方式用以测 定反应标本中的残留VWF活性的方法是将该反应标本或它的等分试样与包括一种氨基酸 序列的分离GPIb a蛋白混合，不添加瑞斯托霉素和美洲矛头腹毒蛋白，其中，所述氨基酸 序列与人类GPIba蛋白的野生型序列（SEQ ID N0:1)相比至少包含氨基酸残基1-268,且 分别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa (优选Xaa =缬氨酸残基或丝氨酸残 基）。特别优选的方案是上述GPIb a蛋白与一种粒子固相相关，该粒子固相根据残留VWF 活性发生凝集。借助该凝集反应可测定反应标本中的残留VWF活性，根据残留VWF活性又 可得知所述样本所含的AD AMTS-13活性。
[0056] 本发明在样本中测定血管性血友病因子（VWF)裂解ADAMTS-13蛋白酶活性的方法 的优点主要在于可以免去对VWF基质的尿素处理，使用尿素会带来这样的风险：如果预处 理时没有严格遵守培养时间，就会测到过低的VWF活性。在现有技术的各种各样方法中， 必须通过用尿素或具有相似变性作用的物质对VWF基质进行预处理来使VWF完全能够被 ADAMTS-13 蛋白酶分解（参见 TO 2004/005451A2)。
[0057] 由于任何一份需要在其中对ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解活性加以测定的人类血 浆样本中均含有样本固有VWF，因而在对原有检测标本进行测量的同时并行测量一份第二 检测标本是有利的；测量时，用本发明的方法对同一样本的第二等分试样进行分析，但并不 对与VWF基质混合的样本进行与原有检测标本一样长时间的培养，而是在样本和VWF基质 混合后立即在第二检测标本中测定VWF活性。在此情况下，第二检测标本中的VWF活性（无 培养步骤）与原有检测标本中的VWF活性（经用于实现VWF蛋白水解的培养步骤）之差就 是在原有检测标本中被ADAMTS-13分解的VWF活性。
【附图说明】
[0058] 图1 :上图为基于GPIb-(aal-285，G233V/M239V)的ELISA中依赖于瑞斯托霉素 浓度（mg/mL)的VWF结合；下图为基于野生型GPIb的ELISA中依赖于瑞斯托霉素浓度 (mg/mL)的VWF结合。本发明测定VWF所应用的GPIba-( aal-285，G233V/M239V)检测系 统或野生型GPIb a-ELISA检测系统的结构如实例4所述。将VWF/Faktor VIII浓缩物 Haemate?的四份不同稀释物用作样本。在不存在瑞斯托霉素（0mg/mL)的情况下，使用突 变GPIb a -(aal-285, G233V/M239V)时，VWF会发生依赖于浓度的强烈结合（上图）。在添 加瑞斯托霉素的情况下，这种结合可小幅上升，其原因可能在于非特异性结合，这种结合即 使不存在GPIb a也会发生。而野生型GPIb a只需添加1.2mg/mL瑞斯托霉素就会发生程 度相当的VWF结合。使用野生型GPIb a时，如果不添加瑞斯托霉素，就不会出现任何结合 现象（下图）。
[0059] 图2 :借助GPIb a乳胶粒子凝集检测在不使用瑞斯托霉素的情况下用于在人类柠 檬酸盐血浆样本中测定VWF活性（10% -200% VWF活性）的定标曲线（参见实例5)。图示 为依赖于VWF活性的粒子凝集反应速度。
[0060] 图3 :借助GPIb a乳胶粒子凝集检测在不使用瑞斯托霉素的情况下用于在人类柠 檬酸盐血浆样本中测定低VWF活性（彡3% VWF活性）的定标曲线（参见实例5,45 y L的 样本）。图示为依赖于VWF活性的粒子凝集反应速度。
[0061] 图4 :在样本不含瑞斯托霉素以及在检测标本中存在不同Tween?20浓度的情 况下以不同VWF浓度（14. 9%至149. 6% )进行的GPIb a乳胶粒子凝集检测（参见实例5， Tween?20浓度变化，15 y L样本）。
[0062] 图5 :在样本不含瑞斯托霉素以及在检测标本中存在不同Thesit浓度的情况下以 不同VWF浓度（8%至40% )进行的GPIb a乳胶粒子凝集检测（参见实例5,用Thesit代 替 Tweerr? 20,45 y L 样本）。
[0063] 图6 :在样本不含瑞斯托霉素以及在检测标本中存在不同Thesit浓度的情况下以 不同VWF浓度（样本已预先用乏VWF血浆或缓冲液加以稀释）进行的GPIb a乳胶粒子凝 集检测（参见实例5,用Thesit代替Tween? 20,45 y L样本）。
【具体实施方式】
[0064] 下面借助实例对本发明的各个方面进行说明，但本发明并不限于这些实例。
[0065] 实例
[0066] 实例1:克隆6?让〇-(6233￥/]\1239￥)-(3\?13§)-(6\出8)组成物
[0067] 对表达载体pIRES neo2(BD生物科学公司（BD Biosciences),科隆泰克产品 (Clontech)，货号：6938-1)进行改性，使其在EcoRI限制性酶切位点和Notl限制性酶切位 点之间包含一种3XFlag标签和一种6XHis标签。在标签序列的上游（5'）插入一个为信 号肽（SEQ ID NO: 2)和人类GPIb a受体（SEQ ID NO: 1)的氨基酸1-285编码片段，这个片 段在为氨基酸位置233和239编码的位点上分别包含有一个为缬氨酸编码的密码子。
[0068] 实例2:在冊1(细胞中表达重组6?让(1-(6233￥/]\123叭)-(3\卩138)-(6\出8)融 合蛋白
[0069] 用实例1中所描述的组成物转化HEK 293细胞（人胚肾细胞；ATCC编号： CRL-1573;海德堡的细胞线服务公司（Cell Lines Service CLS))。
[0070] 在下列物质中培养这些细胞：
[0071] DMEM(货号：31966-021，Invitrogen)
[0072] 经热灭活处理的 +10 % FBS Origin EU (货号：10270-106, Invitrogen)或 10 % FBS Origin USA(货号：A15-003,批号：A01123-678，PAA)
[0073] +1 % Antibiotic-Antimycotic-Solution (100x)(货号：PI 1-002, PAA)
[0074] +0? 1 % Gentamycin-Solution 50mg/ml (货号 Pll-005, PAA)
[0075] +500μg/ml Geneticin(G418)-Solution 50mg/ml active Geneticin(货号： 10131-027, Invitrogen)
[0076] 用于表达（生成）：
[0077] OPTIPRO-SFM(货号：12309-019, Invitrogen)
[0078] +0? 5% Antibiotic-Antimycotic-Solution (100x)(货号：PI 1-002, PAA)
[0079] +0? 05% Gentamycin-Solution 50mg/ml (货号：P11_005, PAA)
[0080] +2% Glutamax 1 (100X)(货号：3505〇-〇38, Invitrogen)
[0081] 以及无 Geneticin
[0082] 过程如下：
[0083] 1)在含血清的介质中，在T175中进行细胞的融解（lKryo具有5_10xl0e6细胞） 和培养96h
[0084] 2)碎裂成 4x T175,培养 72-96h
[0085] 3)碎裂成 25x T175,培养 72-96h
[0086] 4)将一个T175碎裂，并继续培养以作储备。将剩余的24x T175碎裂成3x CellStack Corning(每 CellStack 10 层，总共 6360cm2)，培养 72h
[0087] 5)移除介质，清洗有DMEM但没有FBS l_2x的单层，添加不含血清的 0PTIPR0-SFM(每 CellStack 1. 8 升），培养 96h
[0088] 6)收获介质。用离心法滤除上清液，回收分离出的细胞抽提物，将其回加到具有新 鲜 0PTIPR0-SFM 的 CellStack 中，培养 96h
[0089] 7)如 6)
[0090]8)最终收获介质，结束培养。
[0091] 实例 3 :亲和层析分离重组 GPIba-(G233V/M239V)-(3XFlag)-(6XHis)融合蛋 白
[0092] 通过离心分离法（35min, lOOOOrpm, Beckman J2-21,德国 Beckman Coulter GmbH)从存留的细胞或细胞片段中分离出按实例2获得的、包含GPIba-(G233V/ M239V)-(3XFlag)-(6XHis)的介质。使用分离限值为10kDa的超滤盒 (Ultrafiltrationskassette)(PES 10,德国的施莱彻和舒尔公司（Schleicher&Schilll)) 通过切向流超滤将由此获得的不含细胞的上清液浓缩至初始体积的1/10。
[0093] 用Ni2+琼脂糖凝胶（His Pr印FF16/10,瑞典的通用电气医疗集团（GE Healthcare))按制造商的说明通过亲和层析法进行纯化。通过在浓缩上清液中添加 500mMol NaCl、20mMol似2册04和5mM咪唑，并通过添加5M HC1将pH值调整至pH 7. 4,以 实现6?让〇-(6233￥/]?239￥)-(3\?13§)-(6\出8)的结合。通过用成分为 5001111〇1恥(：1、 20mMol Na2HP〇dP5mM咪唑的缓冲液（pH 7.4)来冲洗导柱来洗去未结合的成分。用成分为 20mMol Na2HP04、500mMol NaCl, 500mMol 咪唑的缓冲液（pH 7. 4)对结合的 GPIb a -(G233V/ M239V)-(3XFlag)-(6XHis)进行洗脱处理。用超滤膜分离限值为10kDa的超滤搅拌室 (UltrafiltrationsrUhrzelle) (OMEGA 10K,美国的颇尔生命科学（Pall Life Sciences)) 将由此获得的洗脱液浓缩至初始体积的1/10。用层析柱Superdex 200prep grade 35/600 (瑞典GE Healthcare)按制造商指示通过凝胶过滤法对污染物进行进一步的纯化 和分离。用成分为 〇.〇48mol/L Na2HP04、0.02mol/L KH2P04、0.145mol/L NaCl、0.015mol/ LNaN^缓冲液（pH 7. 2)以5. Oml/min的流率进行层析处理。施加样本后，GPIb a -(G233V/ M239V)-(3XFlag)-(6XHis)以一根据约300ml的洗脱体积的峰值从所用的层析柱中洗 脱。
[0094] 实例4 :本发明在不使用瑞斯托霉素的抗FLAG/GPIb a -ELISA中测定VWF活性的 方法
[0095] 使用已涂有抗Flag标签抗体（美国圣路易斯西格玛（Sigma)，ANTI-FLAG HS，M2coated 96-well Plates (clear),产品号P 2983)的酶标板。在该酶标本的每个 凹穴内均加入100 u L的磷酸缓冲液，该磷酸缓冲液含有浓度为2. 4 y g/mL的重组野生型 GPIba-(3XFlag)_(6XHis)融合蛋白（细胞沉积后培养基的1:10稀释上清液）或分离 重组 GPIba-(aal-285，G233V/M239V)-(3XFlag)-(6XHis)融合蛋白（参见实例 3)，在 夜间于2-8°C下进行培养。用磷酸缓冲液（+0.01% Tween? )进行过四重清洗后，添加 50 y L经磷酸缓冲液+0. 1 %牛血清白蛋白稀释的Hiimate? (德国马尔堡的杰特贝林公 司（ZLB Behring))稀释物和50 yL经磷酸缓冲液+0.1 %牛血清白蛋白稀释的瑞斯托霉 素稀释物。随后在室温下培养1小时。用上述方法进行过四重清洗后，添加100 UL的辣 根过氧化物酶相关抗 VWF 抗体（Rabbit Anti-Human VWF/HRP，DAKO, Ref. P0226)，在室温 下培养1小时后按上述方式进行清洗。随后添加100 U L用作基质的四甲基联苯胺溶液 (TMB Substrat,德国马尔堡的答德贝林马尔博格股份有限公司（Dade Behring Marburg GmbH)，Ref. 450684)，在室温下培养4分钟。通过添加100 y L的0. 5N硫酸来终止反应。随 后用分光光度计在405nm下测量消退度。
[0096] 在不存在瑞斯托霉素的情况下，使用根据实例1-3制得的突变GPIb a时，VWF会 发生与浓度有关的强烈结合。在添加瑞斯托霉素的情况下，这种结合小 幅上升，其原因可 能在于非特异性结合，这种结合即使不存在GPIb a也会发生。而野生型GPIb a只需添加 1. 2mg/mL瑞斯托霉素就会发生程度相当的VWF结合。使用野生型GPIb a时，如果不添加瑞 斯托霉素，就不会出现任何结合现象（图1)。
[0097] 实例5 :本发明在不使用瑞斯托霉素的GPIb a乳胶粒子凝集检测中测定VWF活性 的方法
[0098] 准备三种试剂：
[0099] 试剂 1 :
[0100] 将单克隆抗6?让(1抗体疆16(1(荷兰于登5&111^〇8.￥.，产品号腸附146)结合到 乳胶粒子的表面，使粒子再悬浮在一用于长期贮存的缓冲液中（〇.6g/L TRIS，1.1%亮氨 酸，12.5%蔗糖，0.05%批4,6.2511^/1庆大霉素和0.62511^/1两性霉素4118.25，乳胶浓度 0.22% )〇
[0101] 试剂 2:
[0102] 乏VWF血浆
[0103] 试剂 3:
[0104] 将下列成分混合，产生总体积为30mL的试剂3 :
[0105] 2. 5mL聚乙烯吡咯烷酮（PVP)(德国的福卢卡公司（Fluka))在磷酸缓冲液（pH 7. 1)中的7. 5%溶液，
[0106] 12. 9mL(0. 625mg/mL)在Tris缓冲液（pH 7. 1)中的异嗜性抗体阻断剂1 (斯堪 提波迪实验室股份有限公司（Scantibodies Laboratory Inc),美国三提（Santee)，CA 92071，），
[0107] Tween?20 (美国密苏里州圣路易斯的西格玛（Sigma))在磷酸缓冲液（pH 7. 2) 中浓度为21g/L的3. 4mL溶液，
[0108] 重组6?让〇-(6233￥/]?239￥)-(31?138)-(61把8)(参见实例3)在磷酸缓冲液&11 7. 1)中浓度为5. 59mg/mL的0? 086mL溶液，以及
[0109] 11. 2mL 磷酸缓冲液（pH 7. 1)。
[0110] 在自动凝血分析仪BCS? (贝林凝集系统（Behring Coagulation System),德 国马尔堡Dade Behring Marburg GmbH)上进行检测。将15 yL的人类梓檬酸盐血衆样本、 30 y L试剂2和70 y L试剂3混合在一起。通过添加混合40 y L试剂1来开始反应过程。 在575nm下持续对反应混合物的消退度进行测量。乳胶粒子的凝集速度与样本中的VWF活 性有关。
[0111] 为了计算VWF活性，利用标准人类血衆（德国马尔堡Dade Behring Marburg GmbH)来制作定标曲线。将标称瑞斯托霉素辅因子值用作该BCS?系统的VWF标定值。通 过在减少试剂2用量的同时提高标准人类血浆的体积，产生最高达200%的VWF活性。通过 用试剂2稀释该标准人类血浆，产生较低的VWF活性。图2显示的是一种典型的定标曲线。 借助于测定的反应速度可以在该定标曲线上读取某一样本的VWF活性。
[0112] 在一用于在样本中测量特低VWF活性的检测标本中使用45 yL样本，而非15 yL 或30 y L样本（参见上文）。进行定标时，用试剂2稀释标准人类血浆，从而产生最低达3% 的低VWF活性（参见图3)。这个检测标本使得对极低VWF活性的精确测定成为可能，这一 点在形成VWF活性/抗原比率以便对血管性血友病的不同子类进行分类时特别重要。通过 将标本中的PVP浓度提高到0. 35%以及将样本体积增大到60 y L，可以进一步强化与VWF 有关的凝集反应，还可以进行1 % VWF分化和0% VWF分化。借此可以极为可靠地将第3类 血管性血友病（0% VWF)与极度缺乏的其他类型（例如1-5% )区别开来。
[0113] 实例6 :本发明以经尿素预处理的大分子多聚体VWF(P1648S)为VWF基质测定 ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解活性的方法
[0114] 1.反应缓冲液：lmmol/L Pefabloc SC(德国曼海姆的罗氏诊断股份有限公司 (Roche Diagnostics GmbH)),12. 5mmol/L BaCl2,5mmol/L TRIS,pH 8.0 ；
[0115] 2.准备基质缓冲液，在室温下精确培养5分钟：8. 3U/mL (830% )用重组法制成的 大分子多聚体 VWF-P1648S，4. 6mol/L 尿素，4. 6mmol/LTRIS，pH 8. 0 ;
[0116] 3.在15 y L人类血浆样本中掺入300 y L反应缓冲液，再与150 y L基质缓冲液混 合；
[0117] 4.在37°C下将检测标本培养4至8小时；
[0118] 5.以如实例5所述的方式，在将该反应混合物用作样本的情况下测量VWF活性。
[0119] 实例7 :本发明以经尿素预处理的重组大分子多聚体VWF(P1648S)为VWF基质测 定ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解活性的方法
[0120] 1?将6 y L人类血浆样本（用反应缓冲液1:6稀释）与20 y L反应缓冲液混合；
[0121] 2.在37°C下将该混合物培养5分钟以激活ADAMTS-13蛋白酶；
[0122] 3?添加12yL基质缓冲液（5U/mL(500% )重组大分子多聚体VWF-P1648S，5mol/ L 尿素，5mmol/L Tris-HCl，pH 8.0);
[0123] 4.在37°C下将检测标本培养20分钟；
[0124] 5.以如实例5所述的方式，在将该反应混合物用作样本的情况下测量VWF活性。
[0125] 实例8 :本发明以大分子多聚体VWF(P1648S)为VWF基质测定ADAMTS-13蛋白酶 的VWF裂解活性的方法和借助/不借助ADAMTS-13分解来求差的方法
[0126]检测 1：
[0127] L 将 10 y L 人类血浆样本 20 y L ADAMTS-13 激活缓冲液（18. 75mmol/L BaCl2，pH 8. 0, 5mmol/L Tris-HCl, 1. 5mmol/L Pefabloc SC(德国曼海姆Roche Diagnostics GmbH)) 混合；
[0128] 2.在37°C下将该混合物培养5分钟；
[0129] 3?添加 20 y L 在 5mmol/L Tris-HCl 中的浓度为 1. 25U/mL(125% )的重组 VWF 基 质（P1648S)，pH 8. 0 ;
[0130] 4.在37°C下将检测标本培养20分钟；
[0131] 5.以如实例5所述的方式，在将该反应混合物用作样本的情况下测量VWF活性。
[0132]检测 2：
[0133] 以如检测1所述的方式对同一个人类血浆样本的另外10 UL进行处理，但此处不 实施在37°C下培养20分钟的培养步骤（参见第4步），而是在添加VWF基质（P1648S)后， 立即以如实例5所述的方式在将该反应混合物用作样本的情况下测量VWF活性。检测1和 检测2的VWF活性差就是被分解的VWF活性，也就是ADAMTS-13活性。借助定标曲线据此 测定血浆样本中的ADAMTS-13活性。
【主权项】
1. 一种在样本中测定血管性血友病因子（VWF)活性的方法，其中，将所述样本和分离 GPIba蛋白混合成一种检测标本，所述方法包括： a) 使用包括一种氨基酸序列的分离GPIba蛋白，所述氨基酸序列与人类GPIba蛋白 的野生型序列（SEQIDNO: 1)相比至少包含氨基酸残基1-268,且分别在位置233和239上 具有一种氨基酸取代基Xaa，以及 b) 在所述检测标本中不添加瑞斯托霉素和美洲矛头腹毒蛋白，以及 c) 其中所用GPIba蛋白与一种粒子固相相关。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，在所述检测标本中不添加瑞斯托霉素或美洲矛 头腹毒蛋白的等效物质。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所用GPIba蛋白的位置233和/或位置 239上的氨基酸取代基Xaa由一种缬氨酸残基或一种丝氨酸残基构成。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所用GPIba蛋白是用重组法或合成法制备 的。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所用GPIba蛋白在N端上与同源的人类 GPIba信号序列（SEQIDNO:2)或一种异源信号序列融合。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所用GPIba蛋白在C端上与一个以上亲和 标签融合。7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所用GPIba蛋白在C端上与一个以上选自群组 的亲和标签融合，该群组由组氨酸标签、Flag标签、精氨酸标签、c-Myc标签和Strep标签组 成。8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所用GPIba蛋白通过一种抗体与所述粒子固相 相关。9. 根据权利要求8所述的方法，其中，所用GPIba蛋白通过一种抗GPIba抗体与所述 粒子固相相关。10. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述GPIba蛋白通过一种抗亲和标签抗体与所 述粒子固相相关。11. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述粒子固相由一种乳胶构成。12. 根据权利要求1所述的方法，其中，通过所述粒子固相的GPIba介导凝集测定所述 VWF活性。13. 根据权利要求12所述的方法，其中，所用GPIba蛋白通过选自VM16d和SZ2群组 的单克隆抗GPIba抗体与所述粒子固相相关。14. 根据权利要求12所述的方法，其中，所用GPIba蛋白在C端上与一个以上Flag标 签融合，且通过抗Flag抗体与所述粒子固相相关。15. 根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中，所述检测标本包含一洗涤剂。16. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述洗涤剂为一选自吐温-20、哲斯特、曲拉通 洗涤剂和十二烷基硫酸钠（SDS)群组的洗涤剂。17. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述检测标本包含浓度从0. 02g/L至20g/L的 吐温-20。18. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述样本为一种源自人类或动物的生物液 体。19. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述样本为一种包括一种生物液体反应混 合物，所述生物液体中添加有用作基质的分离VWF。20. -种用于实施根据权利要求1所述的方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括一 种试剂，所述试剂含有GPIba蛋白，所述GPIba蛋白包括一种氨基酸序列，所述氨基酸序 列与人类GPIba蛋白的野生型序列（SEQIDNO:l)相比至少包含氨基酸残基1-268,且分 别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa，所述GPIba蛋白与一种粒子固相相关。
【专利摘要】本发明涉及测定血管性血友病因子活性的方法及检测试剂盒。本发明涉及一种在样本中测定血管性血友病因子(VWF)活性的方法，其中，将样本和分离GPIbα蛋白混合成一种检测标本，该方法包括：a)使用包括一种氨基酸序列的分离GPIbα蛋白，氨基酸序列与人类GPIbα蛋白的野生型序列(SEQ ID NO:1)相比至少包含氨基酸残基1-268，且分别在位置233和239上具有一种氨基酸取代基Xaa，以及b)在检测标本中不添加瑞斯托霉素和美洲矛头腹毒蛋白，c)其中所用GPIbα蛋白与一种粒子固相相关。本发明还涉及用于该方法的检测试剂盒。
【IPC分类】G01N33/86
【公开号】CN104897910
【申请号】CN201510146007
【发明人】哈拉尔德·阿尔特豪斯, 托比亚斯·奥布斯尔, 于尔根·帕茨克, 赖因哈德·施内彭海姆
【申请人】西门子医学诊断产品有限责任公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2008年7月3日
【公告号】CA2692576A1, CN101755211A, CN103076459A, CN103076459B, DE102007031708A1, EP2167978A2, EP2167978B1, EP2388596A1, EP2388596B1, US8932820, US20100136589, US20130078652, WO2009007051A2, WO2009007051A3
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