Cry1Ea在组合中用于管理抗性秋粘虫昆虫的用图
Cry1Ea在组合中用于管理抗性秋粘虫昆虫的用图
【专利说明】CryIEa在组合中用于管理抗性秋粘虫昆虫的用途
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求获得于2012年10月5日提交的美国临时专利申请61/710, 154的利 益。本文通过提述并入其全部公开内容。
[0003] 发明背景
[0004] 人类为粮食和能源用途而种植谷物。人类还种植其它作物，包括大豆和棉花。昆 虫摄食并毁坏植物，从而破坏人类的这些努力。人们每年花费数十亿美元用于控制昆虫害 虫，并额外承受由昆虫造成的数十亿美元的损失。合成有机化学杀虫剂已经成为用于控制 昆虫害虫的首要工具，但是在某些领域，生物杀虫剂，例如从苏云金芽孢杆菌（Bt)获得的 杀虫蛋白，发挥着重要的作用。通过用Bt杀虫蛋白进行转化以产生抗虫植物的能力已经引 发了现代农业革命，并凸显了杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。
[0005] 迄今为止，有多种Bt蛋白被用于创建抗虫转基因植物，并且被成功地注册并商业 化。这些包括玉米中的CrylAb,CrylAc,CryIF和Cry3Bb，棉花中的CrylAc和Cry2Ab，和马 铃薯中的Cry3A。
[0006] 表达这些蛋白的商业产品一般表达单一的蛋白质，除了下面的情况：期望2种 蛋白的组合杀虫谱（例如在玉米中组合使用CrylAb和Cry3Bb以提供分别对鳞翅目害 虫和根虫（rootworm)的抗性），或者蛋白质的独立作用使它们可以用作延迟在易感昆虫 群体中发生抗性的有用工具（例如在棉花中组合使用CrylAc和Cry2Ab以提供对烟草 夜蛾（tobaccobudworm)的抗性管理）。另见美国专利申请公开No. 2009/0313717,其 涉及Cry2蛋白加Vip3Aa,CrylF,或CrylA，用于控制谷食夜蛾（Helicoverpazea)或棉 铃虫（armigerain)。W02009/132850 涉及CrylF或CrylA和Vip3Aa，用于控制秋粘虫 (Spodopterafrugiperda)。美国专利申请公开No. 2008/0311096部分涉及CrylAb，用于控 制CrylF抗性ECB。
[0007] 也就是说，抗虫转基因植物的一些品质不但导致这一技术快速而广泛地应用，也 造成了问题，即害虫群体会对这些植物所产生的杀虫蛋白产生抗性。已经建议了多种策 略用于保护基于Bt的昆虫抗性特性的功效，包括采用高剂量的蛋白与避难所植物组合 使用，或者可选择地与不同的毒素组合使用或共同使用（McGaugheyetal. (1998)，"B. t.ResistanceManagement,"NatureBiotechnol. 16:144-146) 〇
[0008] 选择用于昆虫抗性管理（IRM)堆叠（stack)的蛋白毒素需要独立地发挥它们的杀 虫效果，从而使对一种蛋白产生的抗性不会导致对第二种蛋白的抗性（即，蛋白没有交叉 抗性）。例如，如果对"蛋白A"耐受的害虫群体对"蛋白B"敏感，则可以得出结论，即蛋白 A和蛋白B没有交叉抗性，并且两者的组合可有效延迟对单独蛋白A的抗性。
[0009] 当不存在抗性昆虫群体时，可以根据其它假定的与作用机制和交叉抗性潜力相关 的特征进行评估。已经有人提议受体介导的结合在鉴定可能不会显示交叉抗性的杀虫蛋白 方面的用处（vanMellaertetal. 1999)。这种方法中蕴含的对缺少交叉抗性的关键预测 因素是杀虫蛋白在敏感昆虫物种中不会竞争受体。
[0010] 在两种Bt毒素竞争同一受体的情形，如果昆虫中的受体突变导致一种毒素不再 结合该受体从而对该昆虫不再具有杀虫作用，则该昆虫可能也会对第二种毒素（其竞争性 结合同一受体）具有抗性。也就是说，昆虫被称作对两种Bt毒素具有交叉抗性。然而，如 果两种毒素结合两个不同的受体，则可以指示，昆虫不会对这两种毒素同时产生抗性。
[0011] 在官方Bt命名委员会的网址上列出了代表性的Cry毒素（Crickmoreetal.;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前，〃Cry〃蛋白有将近 60 个主要 的族（Cryl-Cry59)，还有其他的Cyt蛋白和VIP蛋白等等。每个数字族中有多个大写字母 亚族，大写字母亚族有小写字母子亚族（例如，Cryl有A-L，而CrylA有a-i)。 发明概要
[0012] 本发明部分涉及令人惊讶的发现，即杀虫蛋白CrylEa不会和 CrylAb,CrylBe,CrylCa,CrylDa,或VIP3Ab竞争结合秋粘虫（FAW;Spodoptera frugiperda)肠细胞膜受体制备物。正如本领域的技术人员借助于本公开会认识到的，产生 彼此不会竞争结合的任何主题蛋白对（包括全长蛋白的杀虫部分）的植物可以延迟或防止 对这些杀虫蛋白中的单独一种产生抗性。
[0013] 因此，本发明部分涉及使用CrylEa蛋白与CrylAb,CrylBe,CrylCa,CrylDa,和/ 或VIP3Ab蛋白的组合。产生CrylEa与至少一种本文所述的其它蛋白质的组合的植物（和 种植有这类植物的田地）包含在本发明的范围之内。
[0014] 本发明还部分地涉及三种（或更多种）毒素的三重堆叠或"金字塔（pyramids) "， 该堆叠中的至少一种蛋白是CrylEa。在一些优选的金字塔实施方案中，选定毒素的组合提 供针对FAW的非交叉抗性作用。一些优选的"三作用位点"金字塔组合包括：主题基础蛋白 对（CrylEa加CrylAb、CrylCa、CrylDa、Vip3Ab或CrylBe)之一，和另一种革巴向FAW的Bt蛋 白。根据本发明，这些特殊的三重堆叠可以有利地并且令人惊讶地提供针对FAW的三个作 用位点。这能够有助于减少或消除对避难田地的需要。
[0015] 附图简述
[0016] 图1显示了125ICrylEa(0.5nM)在来自FAW的BBMV中的百分比特异性结合与由 无标记的同源CrylEa和异源CrylAb所致的竞争的关系。
[0017] 图2显示了125ICrylAb与来自FAW幼虫的BBMV的结合，以及随后被递增浓度的 无标记CrylAb的置换。
[0018] 图3显示了125ICrylEa在来自FAW的BBMV中的百分比特异性结合与由无标记的 同源CrylEa和异源CrylCa所致的竞争的关系。
[0019] 图4显示了结合测定的结果，其中125ICrylEa与FAW幼虫的BBMV结合，随后添加 CrylEa,CrylBe,CrylDa,和VIP3Abl配体。
[0020] 序列简述
[0021] SEQIDNO: 1显示了 1148个氨基酸的CrylEa蛋白（具有CrylAb原毒素节段）的 氨基酸序列。
[0022] SEQIDNO:2显示了全长（1155个氨基酸）CryIAb蛋白的氨基酸序列。
[0023] SEQIDNO: 3显示了1186个氨基酸的CrylBe蛋白（具有CrylAb原毒素节段）的 氨基酸序列。
[0024]SEQIDN0:4显示了1164个氨基酸的CrylCa蛋白（具有CrylAb原毒素节段）的 氨基酸序列。
[0025] SEQIDNO: 5显示了1139个氨基酸的CrylDa蛋白（具有CrylAb原毒素节段）的 氨基酸序列。
[0026] SEQIDNO:6显示了全长Vip3Ab蛋白的氨基酸序列。
[0027] SEQIDN0:7显示了蛋白酶加工的CrylEa蛋白的氨基酸序列。
[0028] SEQIDN0:8显示了蛋白酶加工的CrylAb蛋白的氨基酸序列。
[0029] SEQIDN0:9显示了蛋白酶加工的CrylBe蛋白的氨基酸序列。
[0030] SEQIDNO: 10显示了蛋白酶加工的CrylCa蛋白的氨基酸序列。
[0031] SEQIDNO: 11显示了蛋白酶加工的CrylDa蛋白的氨基酸序列。
[0032] 发明详细说明书
[0033] 本发明部分涉及令人惊讶的发现，即CrylEa具有独特且独立的作用模式，且不与 CrylAb、CrylBe、CrylCa、CrylDa或VIP3Abl竞争秋粘虫（FAW;Spodopterafrugiperda) 的肠道中的结合位点。因此，CrylEa蛋白可以与CrylAb、CrylBe、CrylCa、CrylDa和/或 VIP3Abl蛋白在转基因玉米（和其它植物；例如棉花）中组合使用，以延迟或防止FAW对这 些蛋白个别产生抗性。本主题蛋白与本文公开的其它Cry或VIP蛋白一起使用，能够有效 保护植物（例如玉米植物和/或大豆植物）免于被Cry抗性秋粘虫破坏。也就是说，使用 本发明可以保护玉米和其它经济学上重要的植物物种免于遭受可能对单一Cry或VIP蛋白 产生了抗性的秋粘虫群体所造成的破坏和产量损失。
[0034] 因此，本发明教导了一种昆虫抗性管理（IRM)堆叠，其包括CrylEa和CrylAb、 CrylBe、CrylCa、CrylDa和/或VIP3Abl，用于防止或减轻FAW对这些蛋白中的某一种单独 使用时产生的抗性。
[0035] 本发明包括用于控制FAW的组合物，其中该组合物包括CryIEa杀虫蛋白和 〇7认13、(：巧186、(：巧10&、(：巧10 &和/或￥1?34131杀虫蛋白。主题组合物包括植物和植物细 胞。
[0036] 本发明进一步包括被转化而产生CrylEa杀虫蛋白与CrylAb、CrylBe、CrylCa、 CrylDa或VIP3Abl杀虫蛋白的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。主题多核苷酸优 选地处于遗传构建体中，在非苏云金芽孢杆菌的启动子的控制之下。术语"分离的"和"异 源的"意味着多核苷酸或DNA分子处于不同于其天然环境的状态一涉及人的操作。主题多 核苷酸可包括用于提高在植物中表达的密码子使用。
[0037] 此外，本发明包括控制FAW的方法，其中该方法包括使所述FAW或所述FAW的环境 与有效量的组合物接触，该组合物含有本发明的包含CrylEa核心毒素的蛋白对。
[0038] 本发明的一个实施方案包括含有编码本发明的CrylEa杀虫蛋白对的植物可表达 基因的植物（可以包括玉米、大豆和棉花），和此类植物的种子。
[0039] 本发明进一步的实施方案包括这样的植物，其中编码本发明CrylEa杀虫蛋白对 的植物可表达基因已被基因渗入到该植物中，和此类植物的种子。
[0040] 如实施例中所述，使用放射性标记的CrylEa蛋白和/或放射性标记的CrylAb 蛋白的竞争性受体结合研宄显示，CrylAb，CrylBe，CrylCa，CrylDa，和VIP3Abl蛋白不与 CrylEa竞争结合CrylEa所结合的FAW中肠刷状缘膜囊泡（midgutbrushbordermembrane vesicle)。这些结果还表明，CrylEa与这些其它蛋白质的组合能够作为一种有效的手段 来减轻FAW群体对这些蛋白产生抗性。因此，部分地根据本文所述的数据，认为CrylEa与CrylAb,CrylCa,CrylBe,CrylDa,和/或VIP3Abl蛋白的共产生（堆叠）能够用于产生高剂 量的IRM堆叠，用于控制/抑制/杀死FAW。
[0041] 其它的蛋白质可以添加到主题对中。例如，本发明还部分涉及三种（或更多种） 毒素的三重堆叠或"金字塔"，其中一个主题对是基础对。在一些优选的金字塔实施方案中， 选定的毒素对FAW具有三种不同的作用模式。一些优选的"三作用模式"金字塔组合包括 主题基础蛋白对加上第三种用于靶向FAW的蛋白。"不同作用位点"的含义是，任一种给定 蛋白均不会与其它产生交叉抗性。根据本主题发明，这些特定的三重堆叠可有利地并且令 人惊讶地提供针对FAW的三种作用位点。这能够帮助减少或消除对避难田地的需要。
[0042] 因此，一个部署选项是将主题蛋白对与第三种毒素/基因组合使用，并使用这种 三重堆叠减轻FAW对这些毒素的任一种产生抗性。因此，本发明还部分涉及三种（或更多 种）毒素的三重堆叠或"金字塔"。在一些优选的金字塔实施方案中，选定的毒素具有针对 FAW的三种不同作用位点。
[0043] 在本发明的各种部署选项中，包括在FAW会产生抗性群体的作物种植区域内使用 主题蛋白中的两种、三种或更多种蛋白。
[0044] 产生任一种主题蛋白组合的植物（和种植有这类植物的田地）包含在本发明的范 围内。也可以添加额外的毒素/基因，但是上面讨论的特殊堆叠可有利地并且令人惊讶地 提供针对FAW的多个作用位点。这可有助于减少或消除对避难田地的需要。因此，超过10 英亩的如此种植的田地包含在本发明的范围内。
[0045]GENBANK也可以用于获得本文公开或提到的任何基因和蛋白的序列。相关序列也 可以在专利中获得。代表性的Cry毒素在官方Bt命名委员会的网 站上列出（Crickmoreet al. ;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/) 〇 目前〃Cry〃蛋白有大约 70 个主 要的族，还有其他的VIP蛋白等等。
[0046] 本文所述蛋白的组合可用于控制鳞翅目害虫。成年鳞翅目昆虫，例如蝴蝶和飞蛾， 主要食用花蜜并且是授粉的重要实施者。几乎所有的鳞翅目幼虫，即毛虫，均以植物为食， 许多是严重的害虫。毛虫在植物叶片上面或内部或者在根或茎上取食，剥夺植物营养并经 常破坏植物的物理支撑结构。此外，毛虫以水果、纤维和储存的粮食和面粉为食，导致这些 产品无法出售，或严重削弱其价值。如本文所使用的，"鳞翅目害虫"是指害虫的各个生命阶 段，包括幼虫阶段。
[0047] 本发明的一些嵌合蛋白包含完整Bt蛋白毒素的完整N端核心毒素区，并且，在核 心毒素部分末端之后的某个位置，这些蛋白具有向异源原毒素序列的过渡。Bt蛋白毒素的 N-末端杀虫活性毒素部分被称作"核心"毒素。位于核心毒素C端一侧的部分被称作"原 毒素"节段或部分。核心毒素节段向异源原毒素节段的过渡可发生于核心毒素/原毒素接 点附近，或者，天然原毒素的一部分可以被保留，而向异源原毒素部分的过渡发生在下游。
[0048] 作为一个实例，本发明的一种嵌合蛋白是CrylEa的完整核心毒素部分（大约是前 600个氨基酸）和/或异源原毒素（直到C端为止的其余氨基酸）。在一个优选实施方案 中，嵌合蛋白的包含原毒素的部分源自CrylAb毒素。除了Vip3Ab之外，所有根据本发明使 用的蛋白质均具有相似的全长和核心毒素大小和结构。
[0049] 本领域的技术人员将意识到，Bt蛋白毒素，即使在一个特定的类别如CrylEa内， 长度也有一定程度的变化，并且从核心毒素到原毒素的精确过渡位置也会改变。典型地，例 如，CrylEa蛋白的长度是大约1150至大约1200个氨基酸。核心毒素部分向原毒素部分的 过渡通常发生在毒素全长的大约50%至大约60%。本发明的嵌合蛋白将包括该N末端核心 毒素区域的全部范围。因此，所述嵌合蛋白将包括CRYlBt毒素蛋白全长的至少大约50%。 这通常会是至少大约590个氨基酸。关于原毒素部分，CrylAb原毒素部分的全部范围从核 心毒素部分的末端延伸到该分子的C末端。
[0050]基因和毒素根据本发明使用的基因和毒素不仅包括所公开的全长序列，还包括 这些序列的片段、变体、突变体和融合蛋白的保留了本文中具体举例的核心毒素的特征性 杀虫活性的片段。如本文所使用的，术语基因的"变体"或"变异"是指编码相同毒素或编 码具有杀虫活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文所使用的，术语"等同毒素"是指具有与 要求保护的毒素相同或基本相同的对目标害虫的生物活性的毒素。
[0051]如本文所使用的，边界（boundaries)代表大约 95 % (CrylEa)，78 % (CrylE)， 和 45 % (Cryl)序列同一性，见"RevisionoftheNomenclaturefortheBacillus thuringiensisPesticidalCrystalProteins, "N.Crickmore,D.R.Zeigler,J. Feitelson,E.Schnepf,J.VanRie,D.Lereclus,J.Baum,和D.H.Dean.Microbiologyand MolecularBiologyReviews(1998)Vol62:807-813。这些截止点也可以仅适用于核心毒 素。
[0052] 本发明的技术人员会意识到，编码活性毒素的基因可以通过若干手段鉴定和获 得。本文所列举的具体基因或基因部分可以从保藏在培养物保藏机构的分离物中获得。这 些基因，或这些基因的部分或变体，也可以通过合成手段构建，例如使用基因合成仪。基因 的变异可以使用标准的点突变制造技术容易地构建。另外，这些基因的片段可以使用市售 的核酸外切酶或核酸内切酶根据标准程序加以制备。例如，可以使用酶（如Bal31)或定点 诱变，系统性地从这些基因的末端切下核苷酸。编码活性片段的基因也可以使用多种限制 性内切酶获得。可以用蛋白酶来直接获得这些蛋白毒素的活性片段。
[0053] 保留示例毒素的杀虫活性的片段和等同物在本发明的范围内。此外，由于遗传密 码子的冗余性，有许多不同的DNA序列能够编码本文公开的氨基酸序列。创建这些编码相 同或基本上相同毒素的替代DNA序列完全在本领域的技术人员的能力范围之内。这些变体 DNA序列在本发明的范围内。如本文所使用的，"基本上相同的"序列是指具有不会显著影 响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。基因的编码保留杀虫活性的蛋白质的 片段也包含在本定义内。
[0054] 另一种用于鉴定编码可根据本发明使用的毒素的基因或基因部分的方法是通过 使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列可以通过合适的标记物 被检测，或者可以根据国际专利No.W093/16094所述制成具有固有荧光。如本领域众所周 知的，如果探针分子和核酸样品通过在两个分子之间形成强键而杂交，则可以合理推定探 针和样品具有相当的同源性。优选地，杂交在严格条件下通过本领域众所周知的技术实 施，这样的技术在例如Keller,G.H.，M.M.Manak(1987)DNAProbes,StocktonPress,New York，N.Y.，169-170页中有描述。盐浓度与温度的组合的一些实例如下（以严格度增大排 序）：室温，2XSSPE或SSC;42°CIXSSPE或SSC;42°C0.1XSSPE或SSC;65°C0.1XSSPE 或SSC。探针的检测提供了一种按照已知的方式确定杂交是否发生的手段。这种探针分析 提供了一种快速的鉴定本发明的毒素编码基因的方法。用作根据本发明的探针的核苷酸片 段可以使用DNA合成仪和标准程序加以合成。这些核苷酸序列还可以用作PCR引物，用于 扩增本发明的基因。
[0055]变体毒素本发明的某些毒素在本文中已经有具体举例。因为这些毒素仅仅是本 发明毒素的举例，因此容易想到的是，本发明包括具有与例示的毒素相同或相似的杀虫活 性的变体或等同毒素（和编码等同毒素的核苷酸序列）。等同毒素会与例示毒素具有氨基 酸同源性。这种氨基酸同源性通常大于75%，优选地大于90%，最优选地大于95%。氨基 酸同源性在毒素中负责生物活性、或参与决定最终负责生物活性的三维构象的关键区域内 是最高的。关于这一点，如果某些氨基酸取代位于对于活性而言非关键的区域内，或者是不 会影响分子三维构象的保守氨基酸取代，则这些取代是可以接受的，并且预期会发生。例 如，氨基酸可以归于如下的类型：非极性、不带电荷的极性、碱性和酸性。保守取代，即一个 类型的氨基酸被相同类型的另一种氨基酸代替，通常在本发明的范围内，只要该取代没有 实质性改变化合物的生物活性。下面列出了属于每个类型的氨基酸的实例。
[0056]
[0057] 在一些情况下，也可以进行非保守的取代。关键因素是这些取代必须不会显著降 低毒素的生物活性。
[0058]重组宿主编码本发明毒素的基因能够被引入到多种多样的不同微生物或植物宿 主中。毒素基因的表达直接或间接地导致杀虫剂在细胞内产生并保持。可利用接合转移或 重组转移来创建表达本发明两种毒素的Bt株。也可以用这些毒素基因中的一种或两种转 化其它宿主生物体，然后用来实现协同效果。使用合适的微生物宿主，例如假单胞菌，可以 将微生物施加到害虫的地域，在那里它们将繁殖并被摄食。结果是害虫得到控制。或者，可 以在能够延长毒素活性或稳定化细胞的条件下处理携带毒素基因的微生物。然后可以将经 过处理的细胞，其保留毒素活性，施加到目标害虫的环境中。
[0059] 当Bt毒素基因通过合适的载体引入到微生物宿主中，并且将所述宿主以存活状 态施加到环境时，使用某些特定的宿主微生物是关键的。选择已知占据一种或多种感兴趣 玉米的"植物圈"（叶面，叶围，根际和/或根面）的微生物宿主。选择这些微生物是为了能 够成功地在特定环境（作物和其它昆虫栖息地）中与野生型微生物竞争，为表达多肽杀虫 剂的基因的稳定保持和表达提供条件，并且理想地，为更好地保护杀虫剂免于环境降解和 失活提供条件。
[0060] 已知有大量微生物栖息在许多种重要农作物的叶面（植物叶的表面）和/或根 际（植物根系周围的土壤）。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物， 如细菌，例如假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、 根瘤菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属（Methylophilius)、土壤杆菌属（Agrobactenum)、 醋酸杆菌属（Acetobacter)、乳杆菌属（Lactobacillus)、节杆菌属（Arthrobacter)、 固氮菌属（Azotobacter)、明串球菌属（Leuconostoc)和产喊菌属（Alcaligenes);真 菌，特别是酵母，例如酵母属（Saccharomyces)、隐球菌属（Cryptococcus)、克鲁维酵 母属（Kluyveromyces)、掷抱酵母属（Sporobolomyces)、红酵母属（Rhodotorula)和 短梗霉属（Aureobasidium)。特别感兴趣的是如下的植物圈细菌物种，如丁香假单胞 菌（PseudomonasSyringae)、突光假单胞菌（PseudomonasFluorescens)、粘质沙雷 氏菌（SerratiaMarcescens)、木醋酸杆菌（AcetobacterXylinum)、根癌土壤杆菌 (AgrobacteriumTumefaciens)、浑球红假单胞菌（RhodopseudomonasSpheroides)、野 油菜黄单胞菌（XanthomonasCampestris)、苜蓿根瘤菌（RhizobiumMelioti)、真养产 喊菌（AlcaligenesEntrophus)和维涅兰德固氮菌（AzotobacterVinlandii);和植物 圈酵母物种，如深红酵母（Rhodotorularubra)、粘红酵母（R.glutinis)、海洋红酵母 (R.marina)、澄红酵母（R.aurantiaca)、浅白隐球菌（Cryptococcusalbidus)、流散隐球 菌（C.diffIuens)、罗伦特隐球菌（C.Iaurentii)、罗斯酵母（Saccharomycesrosei)、有 抱酵母（S.pretoriensis)、酿酒酵母（S.cerevisiae)、玫瑰掷抱酵母（Sporobolomyces roseus)、香味掷抱酵母（S.odorus)、维罗纳克鲁维酵母（Kluyveromycesveronae)和 出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans)。特别感兴趣的是产色的微生物（pigmented microorganisms)〇
[0061] 有多种多样的方法可用于将编码毒素的Bt基因在允许所述基因稳定保持和表达 的条件下引入到微生物宿主中。这些方法是本领域技术人员众所周知的，并且例如在美国 专利No. 5, 135, 867中描述，其通过提述并入本文。
[0062]细朐处理可以对表达Bt毒素的苏云金芽孢杆菌或重组细胞进行处理以延长毒 素活性和稳定化细胞。所形成的杀虫微囊将Bt毒素包含于已被稳定化的细胞结构内，当微 囊被施于目标害虫的环境时，该细胞结构会保护该毒素。合适的宿主细胞可以包括原核生 物或真核生物，通常限于那些不会产生对高等生物如哺乳动物有毒的物质的细胞。然而，当 毒性物质不稳定或者施加水平足够低以至可以避免对哺乳动物宿主的任何可能的毒性时， 也可以使用会产生对高等生物有毒的物质的生物。作为宿主，特别感兴趣的是原核生物和 低等真核生物，如真菌。
[0063] 在处理时，细胞通常是完整的并且基本上处于可增殖的形式，而不是处于孢子形 式，尽管在一些情况下可以采用孢子。
[0064] 微生物细胞（例如含有Bt毒素基因的微生物）的处理可以通过化学或物理手段 进行，或者通过化学和/或物理手段的组合进行，只要该技术不会有害地影响毒素的性质 并且不会减小细胞保护毒素的能力即可。化学试剂的实例是卤化剂，特别是原子序号17-80 的卤素。更特别地，碘可以在温和的条件下使用足够长的时间以获得期望的结果。其它合 适的技术包括醛如戍二醛处理；抗感染剂处理，如氯化苯甲径按（Zephiranchloride)和氯 化十六烧吡啶（CetylpyridiniumChloride);醇如异丙醇和乙醇处理；多种组织固定剂处 理，如鲁哥氏碘液（Lugoliodine)、布安氏固定剂（Bouin'sfixative)、多种酸和海利氏 固定剂（Helly'sfixative)(参见Humason，GretchenL. ,AnimalTissueTechniques,ff. H.FreemanandCompany, 1967);或保留和延长在将细胞施加于宿主环境时细胞内产生的 毒素的活性的物理（加热）和化学剂的组合。物理手段的实例为短波辐射，如Y-辐射和 X-辐射、冷冻、UV照射、冷冻干燥等。用于处理微生物细胞的方法在美国专利No. 4, 695, 455 和4, 695, 462中公开，其通过提述并入本文。
[0065] 细胞一般具有增强的结构稳定性，可提高对环境条件的抗性。当杀虫剂处于原型 (Proform)时，选定的细胞处理方法应当不抑制目标害虫病原体将杀虫剂从原型加工为成 熟形式。例如，甲醛会交联蛋白质并可抑制多肽杀虫剂原型的加工。处理的方法应当能够 保留毒素的至少相当部分的生物可用性或生物活性。
[0066] 出于生产目的，在选择宿主细胞时特别感兴趣的特征包括将Bt基因引入宿主 的便利性，表达系统的可用性，表达效率，杀虫剂在宿主体内的稳定性，和辅助遗传能力 的存在。用作杀虫剂微囊的感兴趣特征包括对杀虫剂的保护性品质，如厚细胞壁、染色 (pigmentation)、和细胞内包装或形成包涵体；在含水环境中的存活；缺乏哺乳动物毒性； 吸引害虫摄食；容易杀死和固定而不会伤害毒素；等等。其它的考虑包括配制和操作的便 宜性、经济性、储存稳定性等。
[0067]细胞牛长含有Bt杀虫基因的细胞宿主可以在任何常规的营养培养基中生长，其 中DNA构建体提供选择优势，从而提供选择性培养基，使得基本上全部或者全部的细胞保 留Bt基因。然后可以根据常规方法收获这些细胞。或者，细胞可以在收获之前处理。
[0068] 产生本发明毒素的Bt细胞可以用标准技术培养基和发酵技术培养。发酵循环一 旦完成，可以收获细菌，首先通过本领域众所周知的手段将Bt孢子和结晶与发酵液分离。 回收的Bt孢子和结晶可以通过添加表面活性剂、分散剂、惰性载体和其它有利于操作和施 用于特定目标害虫的组分而配制成可湿性粉剂、浓缩液、颗粒或其它配制物。这些配制物和 施用步骤是本领域众所周知的。
[0069]配制物含有引诱剂和Bt分离株的孢子、结晶和毒素的配制的诱饵颗粒，或者含 有可以从本文公开的Bt分离株中获得的基因的重组微生物，可施于土壤。配制的产品也 可以作为种子包衣（seedcoating)、或根处理、或在作物周期（CropCycle)的晚期作为 全植物处理来施用。通过与多种惰性材料如无机矿物质（层状硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷 酸盐等）或植物材料（粉化玉米穗轴、稻壳、核桃壳等）混合，Bt细胞的植物和土壤处理 可以作为可湿性粉剂、颗粒或喷洒物（dust)使用。配制物可以包括展布剂-粘着剂佐剂 (Spreader-StickerAdjuvant)、稳定剂、其它杀虫添加剂或表面活性剂。液体配制物可为 基于水的或非水的，并作为泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化的浓缩物等利用。成分可以包括流变 剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。
[0070] 如本领域的技术人员会意识到的，取决于特定制剂的性质，特别是它是浓缩物或 是直接使用的，杀虫剂浓度可以变化很大。杀虫剂以按重量计至少1%存在，并可为按重量 计100%。干的配制物中具有按重量计约1-95%的杀虫剂，而液体配制物一般为在液相中 按重量计约1-60%的固体。配制物一般具有大约IO2-大约IO4个细胞/mg。这些配制物以 每公顷大约50mg(液体或干的）至Ikg或者更多施用。
[0071] 配制物可通过喷雾、扬尘、撒布（sprinkling)等向鳞翅类害虫的环境（例如叶子 或土壤）中施加。
[0072] 棺物转化用于表达本发明杀虫蛋白的某些优选重组宿主是植物。更高度优选的 宿主是通常用于生产食物、饲料、燃料和油的作物。更高度优选的宿主作物植物是玉米、大 豆、棉花和芥花。玉米是高度优选的实施方案。编码如本文公开的Bt毒素蛋白的基因可以 用多种本领域众所周知的技术插入植物细胞。例如，有多种含有在大肠杆菌中的复制系统 和允许选择转化细胞的标记的克隆载体可用于将外源基因插入高等植物。所述载体包括例 如PBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，具有编码Bt毒素蛋白序列的DNA片 段可在合适的限制位点插入所述载体。所得的质粒可用于转化入大肠杆菌（E.coli)。大肠 杆菌细胞在合适的营养培养基中培养，然后收获和裂解。回收质粒。作为分析方法，通常进 行序列分析、限制性分析、电泳和其它生物化学-分子生物学方法。在每个操作后，可以将 所用的DNA序列切割并连接到下一个DNA序列。每个质粒序列可以克隆于同一或其他的质 粒中。取决于将期望基因插入植物的方法，其它的DNA序列可能是必需的。如果例如使用 Ti或Ri质粒转化植物细胞，那么必须连接至少Ti或Ri质粒T-DNA的右边界，但常常是左 右两个边界，作为待插入基因的侧翼区。T-DNA用于转化植物细胞的应用已经被广泛研宄， 并充分描述于EP120 516,Lee和Gelvin(2008),Hoekema(1985),Fraley等（1986)，和An 等（1985)中，并且在本领域中已经得到确立。
[0073] 所插入的DNA-旦被整合于植物基因组中，就会相对稳定。转化载体通常含有可 选择标志物，其赋予转化的植物细胞对杀生物剂或抗生素（如双丙氨磷、卡那霉素、G418、 博来霉素或潮霉素等）的抗性。因此，个别使用的标志物应当允许选择转化的细胞，而不选 择不含插入DNA的细胞。
[0074] 有许多技术可用于将DNA插入植物宿主细胞。这些技术包括使用根癌土壤杆菌或 发根土壤杆菌（AgrobacteriumRhizogenes)作为转化载体的T-DNA转化、融合、注射、生物 射弹（Biolistics)(微粒子轰击）或电穿孔以及其它包括纳米微粒转化和细胞渗透肽介导 的转化的方法。见例如WO2008/148223,W02009/046384,W02011/046786,W02011/126644， W02012/006439,和W02012/006443。如果使用土壤杆菌转化，则待插入的DNA必须克隆到 特殊的质粒中，即克隆到中间载体或者克隆到二元载体中。中间载体可以借助与T-DNA中 的序列同源的序列通过同源重组整合到Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包括T-DNA转移 必需的vir区。中间载体在土壤杆菌中不能复制自身。中间载体可以通过辅助质粒转移到 根癌土壤杆菌中（接合）。双元载体能够在大肠杆菌和土壤杆菌中自我复制。它们包括选 择标志物基因和被T-DNA左右边界区框定的接头或多接头。可以将它们直接转化进入土壤 杆菌（Holsters等，1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌包括携带vir区的质粒。该vir区是 将T-DNA转移入植物细胞所必需的。可以含有额外的T-DNA。使用如此转化的细菌转化植 物细胞。可以有利地让根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌与植物外植体一起培养，以便将DNA 转入植物细胞。然后可以在含有用于筛选的杀生物剂或抗生素的合适培养基中，从感染的 植物材料（例如叶的碎片、茎杆的区段、根，还有原生质体或悬浮培养的细胞）再生整个植 物。然后可以测试如此获得的植物是否存在插入的DNA。在注射和电穿孔的情形，对质粒没 有特殊的要求。可以使用普通的质粒，例如PUC衍生物。
[0075] 被转化的细胞可以以通常的方式培育并分化成完整的能育植物。它们能够形成生 殖细胞并将转化的性状传递到后代植物。可以以正常的方式培育这些植物，并与具有相同 的转化的遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得的杂合个体具有相应的表型特征。本 发明的植物细胞还可以是非全能的/不能再生出完整植物。这些细胞可以包括例如叶细 胞。然而，本发明还包括来自本发明种子的细胞，其能够再生出完整植物。
[0076] 在本发明的一个优选实施方案中，用其中密码子用法已针对植物优化过的基因来 转化植物。参见，例如美国专利No. 5380831，其通过提述并入本文。虽然本文例示了一些截 短的毒素，但是在Bt领域中众所周知的是，130kDa型（全长）毒素具有作为核心毒素的N 端半部和作为原毒素"尾"的C端半部。因此，适当的"尾"可与本发明的截短/核心毒素一 起使用。参见，例如美国专利No. 6, 218, 188和美国专利No. 6, 673, 990。此外，用于生成在 植物中使用的合成Bt基因的方法是本领域已知的（Stewart和Burgin, 2007)。优选的转化 植物的一个非限制性实例是能育的玉米植物，其包含编码CrylEa蛋白的植物可表达基因， 还包含编码CrylAb、CrylBe、CrylCa、CrylDa或VIP3Ab蛋白的第二植物可表达基因。
[0077] 将CrylEa对性状转移（或渐渗）到近交（inbred)种系中可以通过轮回选择育 种，例如通过回交实现。在这种情况下，期望的轮回亲本首先与携带赋予CrylEa对性状 的合适基因的近交供体（非轮回亲本）杂交。然后将该杂交的后代与轮回亲本回交，其后 选择所得后代的从非轮回亲本转移来的期望性状。在与轮回亲本回交3个，优选4个，更 优选5个或更多个世代并对期望性状进行选择后，后代就控制被转移性状的座位（Loci) 而言是杂合的，但在大多数或者基本上全部的其它基因处则与轮回亲本相似（参见，例如 Poehlman&Sleper(1995)BreedingFieldCrops,第4版，172-175 ;Fehr(1987)Principles OfCultivarDevelopment,第I卷：TheoryAndTechnique, 360-376)〇
[0078]昆虫抗件管理（IRM)策略例如Roush等概述了（Outline)双毒素策略，也称作 "金字塔"或"堆叠"，用于管理杀虫转基因作物。（TheRoyalSociety.Phil.Trans.R.Soc. Lond.B. (1998)353, 1777-1786)〇
[0079] 美国环境保护局在其网站上公开了为产生对目标害虫有活性的单一Bt蛋白的转 基因作物提供非转基因（即非Bt)避难所（选出的非-Bt作物/玉米）的如下要求（印a. gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)〇
[0080] "针对抗玉米螟Bt(CrylAb和CrylF)玉米产品的具体结构化要求如下：
[0081] 结构化避难所：在玉米种植带中，20%非鳞翅类Bt玉米避难所；
[0082] 在棉花种植带中，50 %非鳞翅类Bt避难所。
[0083]地块（[Blocks)
[0084] 内部（即在Bt田地内）
[0085] 外部（即距Bt田地1/2英里（如果可能的话，1/4英里）内的不同田地，
[0086] 使随机配合最大化）
[0087] 田地内的条垄
[0088] 条垄必须至少4行宽（优选6行），以降低幼虫运动效应。"
[0089] 此外，美国玉米种植者协会在其网站上（ncga.com/insect-resistance-mana gement-fact-sheet-bt-corn)也提供了相似的关于避难所要求的指导。例如：
[0090] "玉米螟IRM的要求：
[0091]-你的至少20%的玉米田亩数种植避难所杂种
[0092]-在产棉区，避难所必须为50%
[0093]-必须种植在距避难所杂种1/2英里内
[0094]-避难所可以在Bt田内成条垄状种植；避难所条垄必须至少4行宽
[0095] -只有对于目标昆虫达到了经济阈值时才可以用常规的杀虫剂处理避难所
[0096]-基于Bt的可喷洒杀虫剂不能用在避难所玉米上
[0097]-在每一块有Bt玉米的农场上必须种植适当的避难所"
[0098] 类似的结构化避难所指导可用于本发明的FAW保护的Bt作物。
[0099] 如Roush等所述（例如在1780和1784页右栏），堆叠或金字塔两种不同蛋白质， 其每一种可有效对抗目标害虫并且具有很小的或者没有交叉抗性，可允许使用更小的避难 所。Roush建议，对于成功的堆叠，小于10%的避难所规模即可提供与单一（非金字塔）性 状大约50%的避难所相当的抗性管理。对于目前可得的金字塔Bt玉米产品，美国环境保护 局要求种植的非Bt玉米结构化避难所（一般5% )显著少于单一性状产品（一般20% )。
[0100] 提供避难所的IRM作用的手段有许多，包括田地内的多种几何种植模式（如上所 述）和袋内（In-Bag)种子混合物，如Roush等（前文）和美国专利No. 6, 551，962中进一 步讨论的。
[0101] 上述的百分比，或相似的避难所比例，可用于主题的双重或三重堆叠或金字塔。对 于具有针对单一目标害虫的三个作用位点的三重堆叠，目标是零避难所（或者例如小于 5%避难所）。对于产业上的田亩数，例如超过10英亩而言尤为如此。
[0102] 通过提述并入本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物的全部 内容，以它们与本说明书的明确教导无矛盾为限。
[0103] 除非具体指出或提示，否则术语"一"、"一个"和"该"表示本文所用的"至少一个"。
[0104] 下面的实施 例说明了用于实践本发明的操作过程。这些实施例不应当认为是限制 性的。除非另外指出，否则所有百分比是依照重量，并且所有溶剂混合比是依照体积。所有 温度为摄氏度。 实施例
[0105] 实施例I-mIfe：记CrylEa和CrylAb蛋白
[0106]Cry毒素的碘化用胰蛋白酶切割全长CrylEa和CrylAb蛋白（SEQIDNO: 1和2) 产生激活的杀虫性形式（用SEQIDNO: 7和8表示）。纯化的截短Cry毒素用Iodo-Bead或 Iodo-gen(Pierce)碘化。简而言之，将两个Iodo-Bead用500y1磷酸盐缓冲盐水PBS(20mM 磷酸钠，0.15MNaCl，pH7. 5)清洗2次，并置于铅屏后的1.5ml离心管中。向其中添加 100yIPBS。在层流罩（hood)中，使用适当的放射性操作技术，向含有Iodo-Bead的PBS溶 液中添加〇.5mCiNa125I(17. 4Ci/mg，Lot0114,Amersham)。使组分在室温下反应5分钟，然 后向溶液中添加2-25yg高纯的截短Cry蛋白，并使之再反应3-5分钟。通过从Iodo-Bead 除去溶液而终止反应，并将其施加到0. 5ml用PBS平衡的脱盐Zeba旋转柱（InVitrogen) 中。洗涤Iodo-Bead两次，每次用IOylPBS并将清洗液施加到脱盐柱中。通过在1,000X g将脱盐柱离心2min使放射性溶液洗脱通过脱盐柱。
[0107] 碘化Cry蛋白的放射性纯度通过SDS-PAGE、磷屏成像（phosphorimaging)和y 计数加以确定。简而言之，通过SDS-PAGE分离2yl放射性蛋白。分离后，用BioRad凝胶 干燥设备按照制造商的使用说明干燥凝胶。通过将干燥的凝胶包裹在Mylar底片（12ym 厚）中，并在MolecularDynamics存储磷光屏（storagephosphorscreen) (35cmX43cm) 下曝光I小时进行成像。平板用MolecularDynamicsStorm820磷屏成像仪显色，用 ImageQuant?软件进行图像分析。使用剃须刀片从凝胶上切下放射性条带和条带上下紧邻 的区域，并在Y计数器中计数。仅在Cry蛋白条带和这些条带的下方区域内检测到了放射 活性。在条带上方没有检测到放射性，表明所有放射性污染物均由小于截短的Cry蛋白的 蛋白组分组成。这些组分最有可能代表了降解产物。
[0108] 实施例2-BBMV制各方案
[0109] 可溶性BBMV的制备和分级末龄秋粘虫幼虫禁食过夜后，在晨间于冰上冷却15分 钟后解剖。从体腔移除中肠组织，留下附着在外皮上的后肠（hindgut)。将中肠置于9X体 积的冰冷匀浆缓冲液中（300mM甘露糖醇，5mMEGTA，17mMTris碱，pH7. 5)，匀浆缓冲液 补充有按照供应商推荐稀释的蛋白酶抑制剂鸡尾酒YSigmaP-2714)。将组织用玻璃组织 勾楽器勾楽_ 15个冲程（stroke)。通过Wolfersberger(1993)的1\%012沉淀法制备BBMV。 简而言之，将溶于300mM甘露醇中的24mM1%(：12溶液与中肠匀浆物等体积混合，搅拌5分 钟，并在冰上放置15分钟。将溶液以2500Xg在4°C离心15分钟。保留上清液，并将沉淀 悬浮在原始体积的〇. 5X稀释的匀浆缓冲液中，并再次离心。将两个上清液合并，在4°C下 27, 000Xg离心30分钟，以形成BBMV级分。将沉淀悬浮到IOml匀浆缓冲液中，补充蛋白酶 抑制物，并在4°C再次以27,OOOxg离心30分钟，以清洗BBMV。将所得沉淀悬浮在BBMV保 存缓冲液中（IOmMffiPES，130mMKC1，10%甘油，pH7. 4)，浓度为大约3mg/ml蛋白。蛋白 浓度用Bradford法（1976)确定，以牛血清白蛋白（BSA)作为标准。在冷冻样品之前，使用 Sigma测定系统按照制造商的使用说明进行碱性磷酸酶测定。BBMV级分中该标志物酶的比 活性通常比中肠匀浆级分中的比活性增加7倍。将BBMV等分成250y1的样品，在液氮中 快速冷冻，并储存在-80 °C。
[0110] 实施例3-测量1Crv蛋白与BBMV蛋白结合的方法
[0111] 125ICry蛋白与BBMV的结合为了确定在结合测定中使用的BBMV蛋白的最佳量， 生成了饱和曲线。125I放射性标记的Cry蛋白（0. 5nM)与不同量的BBMV蛋白在28°C温育1 小时，BBMV蛋白量的范围是在结合缓冲液（8mMNaHPO4, 2mMKH2PO4, 150mMNaCl, 0. 1%牛血 清白蛋白，pH7. 4)中0-500yg/ml。总体积是0. 5ml。通过从I. 5ml离心管中一式三份取 样150y1反应混合物到500y1离心管中，并在室温下将样品14,OOOxg离心6分钟，将结 合的125ICry蛋白与未结合者分离。轻柔除去上清液，沉淀用冰冷的结合缓冲液轻柔冲洗 3次。将含有沉淀的离心管的底部切下，并置于13X75-mm玻璃培养管中。将各样品在Y 计数器中分别计数5分钟。将样品中含有的计数减去背景计数（没有任何蛋白的计数），并 对BBMV蛋白浓度作图。待使用的最佳蛋白量被确定为0.15mg/mlBBMV蛋白。 1 鸡尾酒组分的终浓度(以IiM计)是AEBSF(500)，EDTA(250mM)，抑氨肽酶B(Bestatin) (32),E-64 (0.35), 亮肽酶素(Leupeptin) (0.25)，和抑肽酶(Aprotinin) (0.075).
[0112] 为了确定结合动力学，生成了饱和曲线。简而言之，将BBMV(150yg/ml)与递增浓 度（范围是0.Ol-IOnM)的125ICry毒素在28°C温育1小时。通过如上所述地从每个浓度 一式三份取样150yl，对样品进行离心并计数，确定总结合。用相同的方式确定非特异性 结合，只是向反应混合物中添加1，OOOnM同源的胰蛋白酶处理过的非放射性Cry毒素（以 SEQIDN0:7-ll和未经胰蛋白酶处理的SEQIDN0:6为代表）以饱和所有的非特异性受体 结合位点。特异性结合作为总结和非特异性结合之间的差值计算。
[0113] 同源和异源竞争结合测定使用150μg/mlBBMV蛋白和0.5nM125I放射性标记的 Cry蛋白来进行。添加到反应混合物中的竞争性非放射性标记的Cry毒素的浓度范围是 0. 045-1，OOOnM，并且与放射性配体同时添加，以确保真实的结合竞争。温育在28°C进行1 小时，如上文所述地测量与其受体毒素结合的125ICry蛋白的量，并减去非特异性结合。在 不存在任何竞争配体的条件下确定100%总结合。将结果在半对数图上以百分比总特异性 结合与所添加的竞争性配体的浓度的关系作图。
[0114] 实施例4-结果总结
[0115] 图1显示：125I CrylEa (0. 5nM)在来自FAW的BBMV中的百分比特异性结合与由无 标记的同源CrylEa(鲁）和异源CrylAb所致的竞争（)的关系。CrylEa所致的同源竞 争的置换曲线产生这样的曲线，其显示当非标记的CrylEa为大约InM时，50%的放射性配 体发生置换。在测试的任何浓度下（最高达l，〇〇〇nM，或者在测定所用125I CrylEa浓度的 2000倍），CrylAb均不置换125I CrylEa的特异性结合。
[0116] 图2显示了125I CrylAb与来自FAW幼虫的BBMV的结合，以及随后被递增浓度的无 标记CrylAb的替换。在大约0. 3NM的浓度，未标记的CrylAb置换了50%的放射性CrylAb 的结合。I CrylAb与FAW BBMV的结合没有被CrylEa置换。因此，这两种Cry毒素结合于 FAW昆虫肠道中的不同位点。
[0117] 图3显示了125I CrylEa在来自FAW的BBMV中的百分比特异性结合与由无标记的 同源CrylEa(鲁）和异源CrylCa所致的竞争（▲)的关系。CrylEa所致的同源竞争的置换 曲线产生这样的曲线，其显示在大约InM的非标记CrylEa的存在下，放射性配体发生50% 置换。CrylCa不能置换125I CrylEa的结合。
[0118] 图4显示了结合测试的结果，其中令125ICrylEa与来自FAW幼虫的BBMV结合，随 后添加CrylEa、CrylBe、CrylDa和VIP3Abl配体。CrylBe、CrylDa和VIP3Abl不能置换125I CrylEa的结合，但是CrylDa在1，OOOnM的浓度下，或者在测定所用125ICrylEa浓度的2000 倍的浓度下，导致大约40%的置换。
[0119] 参考文献列表
[0120] Bernardi, R. , Tedeschi, G. , Ronchi, S. , and Palmieri, S. (1996). Isolation and some molecular properties of a trypsin-like enzyme from larvae of European corn borer Ostrinia nubilalis Hnbner(Lepidoptera:pyralidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology 26, 883-889.
[0121] Christeller, J. T. , Laing W.A.,Marwick N. P. , and Burgess E. P. J. (1992). Midgut protease activities in 12phytophagous lepidopteran larvae:Dietary and protease inhibitor interactions. Insect Biochem. Molec. Biol. 22, 735-746.
[0122] Gatehouse, L. N. , Shannon, A. L. , Burgess, E. P. , and Christeller, J. T. (1997). Characterization of major midgut proteinase cDNAs from Helicoverpa armigera larvae and changes in gene expression in response to four proteinase inhibitors in the diet. Insect Biochem Mol Biol 27, 929-944.
[0123] Gomez, I. , Arenas, I. , Benitez, I. , Miranda-Riosj J. , Becerril, B. , Grande, R. ,Almagro, J. C. , Bravo, A. , and SoberonjM. (2006). Specific epitopes of domains II and III of Bacillus thuringiensis CrylAb toxin involved in the sequential interaction with cadherin and aminopeptidase-N receptors in Manduca sexta. J Biol. Chem. 281，34032-34039.
[0124] Gomez，I.，Dean，D. H.，Bravo, A.，and Soberon，M. (2003)?Molecular basis for Bacillus thuringiensis CrylAb toxin specificity:two structural determinants in the Manduca sexta Bt-Rlreceptor interact with loops alpha_8and 2in domain II of CylAb toxin. Biochemistry 42, 10482-10489.
[0125] Gomez, I. , Pardo-Lopezj L. , Munoz-Garayj C. , Fernandez, L. E. , Perez, C. , Sanche z, J. , Soberon, M. , and Bravo, A.(2007). Role of receptor interaction in the mode of action of insecticidal Cry and Cyt toxins produced by Bacillus thuringiensis. Peptides28, 169-173.
[0126] Pigott, C. R. and EllarjD. J. (2007). Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal t oxin activity. Microbiol Mol Biol. Rev. 71, 255-281.
[0127] Rausell, C. , Garcia-Roblesj I. , Sanchez, J. , Munoz-Garayj C. , Martinez-Ramir ez, A. C. , Real, M. D. , and BravojA. (2004). Role of toxin activation on binding and pore formation activity of the Bacillus thuringiensis Cry3 toxins in membranes of Leptinotarsa decemlineata(Say). Biochim. Biophys Acta 1660,99-105.
[0128] Roush RT. Two-toxin strategies for management of insecticidal transgenic crops:can pyramiding succeed where pesticide mixtures have not ? Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.1998 Oct 29 ；353 (1376):1777 - 1786.
[0129] Van，R. J.，Jansens，S.，Hofte，H.，Degheele，D.，and Van，M. H. (1990a). Receptors on the brush border membrane of the insect midgut as determinants of the specificity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins.Appl Environ Microbiol 56, 1378-1385.
[0130] Heckel, D. G. , Gahan, L. J. , Baxter, S. W. , Zhao, J. Z. , Shelton, A. M. , Gould, F. , and Tabashnik, B. E. (2007). The diversity of Bt resistance genes in species of Lepidoptera. J Invertebr Pathol 95, 192-197.
[0131] Luo, K. , Banks, D. , and Adang, M. J. (1999). Toxicity, binding, and permeability analyses of four bacillus thuringiensis cry I delta-endotoxins using brush border membrane vesicles of spodoptera exigua and spodoptera frugiperda. Appl. Environ. Microbiol. 65, 457-464.
[0132] Palmer，M.，Buchkremer，M，Valeva，A，and Bhakdi, S. Cysteine-specific radioiodination of proteins with fluorescein maleimide.Analytical Biochemistry253, 175-179. 1997.
[0133] Ref Type: Journal (Full)
[0134] Sambrook, J. and RusselljD. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory).
[0135] Schlenz, M. L. , Babcock, J. M. , and Storer, N. P. Response of CrylF-resistant and Susceptible European Corn Borer and Fall Armyworm Colonies to Cry1A.105 and Cryl2Ab2. DAI 0830, 2008. Indianapolis,Dow AgroSciences. Derbi Report.
[0136] Sheets, J. J. and Storer, N. P. Analysis of CrylAc Binding to Proteins in Brush Border Membrane Vesicles of Corn Earworm Larvae (Heleothis zea). Interactions with CrylF Proteins and Its Implication for Resistance in the Field. DAI-0417, 1-26. 2001. Indianapolis, Dow AgroSciences.
[0137] Tabashnik，B. E.，Liu，Y. B.，Finson，N.，Masson，L.，and Heckel，D. G. (1997) ? One gene in diamondback moth confers resistance to four Bacillus thuringiensis toxins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 1640-1644.
[0138] Tabashnik, B. E. , Malvar, T. , Liu, Y. B. , Finson, N. , Borthakur, D. , Shin, B. S. , Park, S. H. , Masson, L. , de Maagd, R. A. , and BoschjD. (1996). Cross-resistance of the diamondback moth indicates altered interactions with domain II of Bacillus thuringiensis toxins.Appl. Environ. Microbiol. 62, 2839-2844.
[0139] Tabashnik，B. E.，Roush，R. T.，Earle，E. D.，and Shelton，A. M. (2000) ? Resistance to Bt toxins.Science 287,42.
[0140] Wolfersberger, M. G. (1993). Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the gypsy moth(Lymantria dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol 24, 139-147.
[0141] Xu, X. , Yu, L. , and Wuj Y. (2005). Disruption of a cadherin gene associated with resistance to CrylAc {delta}-endotoxin of Bacillus thuringiensis in Helicoverpa armigera. Appl Environ Microbiol 71，948-954.
【主权项】
1. 一种转基因植物，其包含编码CrylEa杀虫蛋白的多核苷酸，和编码第二杀虫蛋白的 第二多核苷酸，所述第二杀虫蛋白选自下组：CryIAb,CrylBe,CrylCa,CrylDa,和Vip3Ab。2. 权利要求1的转基因植物，所述植物进一步包含编码第三杀虫蛋白的DNA。3. 根据权利要求1的植物的种子，其中所述种子包含所述异源多核苷酸。4. 根据权利要求3的植物的种子，其中所述种子包含所述异源多核苷酸。5. 植物田地，包含非Bt避难所植物和多个根据权利要求1的植物，其中所述避难所植 物占所述田地中全部作物植物的少于40%。6. 权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于 30%〇7. 权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于 20%〇8. 权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于 10%〇9. 权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于10. 权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物形成地块或条垄。11. 一种组合物，包括来自非Bt避难所植物的避难所种子和多个权利要求3的种子，其 中所述避难所种子占该组合物中全部种子的少于40%。12. 权利要求11的组合物，其中所述避难所种子占该组合物中全部种子的少于30%。13. 权利要求11的组合物，其中所述避难所种子占该组合物中全部种子的少于20%。14. 权利要求11的组合物，其中所述避难所种子占该组合物中全部种子的少于10%。15. 权利要求11的组合物，其中所述避难所种子占该组合物中全部种子的少于5%。16. -种管理昆虫对Cry蛋白产生抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要 求5的植物田地。17. 权利要求5-10中任一项的田地，其中所述植物占地超过10英亩。18. 权利要求1的植物，其中所述植物选自下组：玉米、大豆、棉花、芥花和向日葵。19. 权利要求1的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含所述编码所述CrylEa杀虫 蛋白的多核苷酸，其中所述CrylEa杀虫蛋白与SEQIDNO:7至少95%相同。20. 权利要求1的植物，其中所述CrylEa杀虫蛋白包含SEQIDNO: 7。21. -种产生权利要求19的植物细胞的多核苷酸的方法，所述方法包括在多个所述细 胞内复制所述多核苷酸。22. -种控制秋粘虫昆虫的方法，所述方法包括向所述昆虫提供供经口摄取的CrylEa 杀虫蛋白和第二杀虫蛋白，所述第二杀虫蛋白选自下组：CryIAb,CrylBe,CrylCa,CrylDa, 和Vip3Ab。23. 权利要求1的植物的植物细胞，其中所述第二核苷酸编码CrylAb杀虫蛋白，并且其 中所述CryIAb杀虫蛋白与SEQIDNO:8至少95%相同。24. 权利要求1的植物，其中所述CrylAb杀虫蛋白包含SEQIDN0:8。25. 权利要求1的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含所述编码CrylBe杀虫蛋白 的所述分离多核苷酸，其中所述CrylBe杀虫蛋白与SEQIDN0:9至少95%相同。26. 权利要求1的植物，其中所述CrylBe杀虫蛋白包含SEQIDN0:9。27. 权利要求1的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含编码所述CrylCa杀虫蛋白 的所述多核苷酸，其中所述CrylCa杀虫蛋白与SEQIDNO: 10至少95%相同。28. 权利要求1的植物，其中所述CrylCa杀虫蛋白包含SEQIDNO: 10。29. 权利要求1的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含编码所述CrylDa杀虫蛋白 的所述多核苷酸，其中所述CrylDa杀虫蛋白与SEQIDNO: 11至少95%相同。30. 权利要求1的植物，其中所述CrylDa杀虫蛋白包含SEQIDNO: 11。31. 权利要求1的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含编码所述Vip3Ab杀虫蛋白 的所述多核苷酸，其中所述Vip3Ab杀虫蛋白与SEQIDN0:6至少95%相同。32. 权利要求1的植物，其中所述Vip3Ab杀虫蛋白包含SEQIDN0:6。33. 权利要求22的方法，所述方法包括向所述昆虫提供第三杀虫蛋白。34. 权利要求1的植物的植物细胞。35. 权利要求2的植物的植物细胞。36. 权利要求18的植物的植物细胞。
【专利摘要】本发明包括用于控制秋粘虫(fall army worm)鳞翅目昆虫的方法和植物，所述植物含有Cry1Ea杀虫蛋白和选自下组的第二杀虫蛋白：Cry1Ab,Cry1Be,Cry1Ca,Cry1Da,和Vip3Ab，以延迟或防止昆虫产生抗性。
【IPC分类】A01P7/00, A01H1/00, A01H5/00
【公开号】CN104902744
【申请号】CN201380063218
【发明人】J·J·希茨, K·E·纳瓦, S·伯顿, E·A·考德威尔
【申请人】美国陶氏益农公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月4日
【公告号】CA2886787A1, EP2903413A1, US20140109263, WO2014055881A1
【专利说明】CryIEa在组合中用于管理抗性秋粘虫昆虫的用途
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求获得于2012年10月5日提交的美国临时专利申请61/710, 154的利 益。本文通过提述并入其全部公开内容。
[0003] 发明背景
[0004] 人类为粮食和能源用途而种植谷物。人类还种植其它作物，包括大豆和棉花。昆 虫摄食并毁坏植物，从而破坏人类的这些努力。人们每年花费数十亿美元用于控制昆虫害 虫，并额外承受由昆虫造成的数十亿美元的损失。合成有机化学杀虫剂已经成为用于控制 昆虫害虫的首要工具，但是在某些领域，生物杀虫剂，例如从苏云金芽孢杆菌（Bt)获得的 杀虫蛋白，发挥着重要的作用。通过用Bt杀虫蛋白进行转化以产生抗虫植物的能力已经引 发了现代农业革命，并凸显了杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。
[0005] 迄今为止，有多种Bt蛋白被用于创建抗虫转基因植物，并且被成功地注册并商业 化。这些包括玉米中的CrylAb,CrylAc,CryIF和Cry3Bb，棉花中的CrylAc和Cry2Ab，和马 铃薯中的Cry3A。
[0006] 表达这些蛋白的商业产品一般表达单一的蛋白质，除了下面的情况：期望2种 蛋白的组合杀虫谱（例如在玉米中组合使用CrylAb和Cry3Bb以提供分别对鳞翅目害 虫和根虫（rootworm)的抗性），或者蛋白质的独立作用使它们可以用作延迟在易感昆虫 群体中发生抗性的有用工具（例如在棉花中组合使用CrylAc和Cry2Ab以提供对烟草 夜蛾（tobaccobudworm)的抗性管理）。另见美国专利申请公开No. 2009/0313717,其 涉及Cry2蛋白加Vip3Aa,CrylF,或CrylA，用于控制谷食夜蛾（Helicoverpazea)或棉 铃虫（armigerain)。W02009/132850 涉及CrylF或CrylA和Vip3Aa，用于控制秋粘虫 (Spodopterafrugiperda)。美国专利申请公开No. 2008/0311096部分涉及CrylAb，用于控 制CrylF抗性ECB。
[0007] 也就是说，抗虫转基因植物的一些品质不但导致这一技术快速而广泛地应用，也 造成了问题，即害虫群体会对这些植物所产生的杀虫蛋白产生抗性。已经建议了多种策 略用于保护基于Bt的昆虫抗性特性的功效，包括采用高剂量的蛋白与避难所植物组合 使用，或者可选择地与不同的毒素组合使用或共同使用（McGaugheyetal. (1998)，"B. t.ResistanceManagement,"NatureBiotechnol. 16:144-146) 〇
[0008] 选择用于昆虫抗性管理（IRM)堆叠（stack)的蛋白毒素需要独立地发挥它们的杀 虫效果，从而使对一种蛋白产生的抗性不会导致对第二种蛋白的抗性（即，蛋白没有交叉 抗性）。例如，如果对"蛋白A"耐受的害虫群体对"蛋白B"敏感，则可以得出结论，即蛋白 A和蛋白B没有交叉抗性，并且两者的组合可有效延迟对单独蛋白A的抗性。
[0009] 当不存在抗性昆虫群体时，可以根据其它假定的与作用机制和交叉抗性潜力相关 的特征进行评估。已经有人提议受体介导的结合在鉴定可能不会显示交叉抗性的杀虫蛋白 方面的用处（vanMellaertetal. 1999)。这种方法中蕴含的对缺少交叉抗性的关键预测 因素是杀虫蛋白在敏感昆虫物种中不会竞争受体。
[0010] 在两种Bt毒素竞争同一受体的情形，如果昆虫中的受体突变导致一种毒素不再 结合该受体从而对该昆虫不再具有杀虫作用，则该昆虫可能也会对第二种毒素（其竞争性 结合同一受体）具有抗性。也就是说，昆虫被称作对两种Bt毒素具有交叉抗性。然而，如 果两种毒素结合两个不同的受体，则可以指示，昆虫不会对这两种毒素同时产生抗性。
[0011] 在官方Bt命名委员会的网址上列出了代表性的Cry毒素（Crickmoreetal.;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前，〃Cry〃蛋白有将近 60 个主要 的族（Cryl-Cry59)，还有其他的Cyt蛋白和VIP蛋白等等。每个数字族中有多个大写字母 亚族，大写字母亚族有小写字母子亚族（例如，Cryl有A-L，而CrylA有a-i)。 发明概要
[0012] 本发明部分涉及令人惊讶的发现，即杀虫蛋白CrylEa不会和 CrylAb,CrylBe,CrylCa,CrylDa,或VIP3Ab竞争结合秋粘虫（FAW;Spodoptera frugiperda)肠细胞膜受体制备物。正如本领域的技术人员借助于本公开会认识到的，产生 彼此不会竞争结合的任何主题蛋白对（包括全长蛋白的杀虫部分）的植物可以延迟或防止 对这些杀虫蛋白中的单独一种产生抗性。
[0013] 因此，本发明部分涉及使用CrylEa蛋白与CrylAb,CrylBe,CrylCa,CrylDa,和/ 或VIP3Ab蛋白的组合。产生CrylEa与至少一种本文所述的其它蛋白质的组合的植物（和 种植有这类植物的田地）包含在本发明的范围之内。
[0014] 本发明还部分地涉及三种（或更多种）毒素的三重堆叠或"金字塔（pyramids) "， 该堆叠中的至少一种蛋白是CrylEa。在一些优选的金字塔实施方案中，选定毒素的组合提 供针对FAW的非交叉抗性作用。一些优选的"三作用位点"金字塔组合包括：主题基础蛋白 对（CrylEa加CrylAb、CrylCa、CrylDa、Vip3Ab或CrylBe)之一，和另一种革巴向FAW的Bt蛋 白。根据本发明，这些特殊的三重堆叠可以有利地并且令人惊讶地提供针对FAW的三个作 用位点。这能够有助于减少或消除对避难田地的需要。
[0015] 附图简述
[0016] 图1显示了125ICrylEa(0.5nM)在来自FAW的BBMV中的百分比特异性结合与由 无标记的同源CrylEa和异源CrylAb所致的竞争的关系。
[0017] 图2显示了125ICrylAb与来自FAW幼虫的BBMV的结合，以及随后被递增浓度的 无标记CrylAb的置换。
[0018] 图3显示了125ICrylEa在来自FAW的BBMV中的百分比特异性结合与由无标记的 同源CrylEa和异源CrylCa所致的竞争的关系。
[0019] 图4显示了结合测定的结果，其中125ICrylEa与FAW幼虫的BBMV结合，随后添加 CrylEa,CrylBe,CrylDa,和VIP3Abl配体。
[0020] 序列简述
[0021] SEQIDNO: 1显示了 1148个氨基酸的CrylEa蛋白（具有CrylAb原毒素节段）的 氨基酸序列。
[0022] SEQIDNO:2显示了全长（1155个氨基酸）CryIAb蛋白的氨基酸序列。
[0023] SEQIDNO: 3显示了1186个氨基酸的CrylBe蛋白（具有CrylAb原毒素节段）的 氨基酸序列。
[0024]SEQIDN0:4显示了1164个氨基酸的CrylCa蛋白（具有CrylAb原毒素节段）的 氨基酸序列。
[0025] SEQIDNO: 5显示了1139个氨基酸的CrylDa蛋白（具有CrylAb原毒素节段）的 氨基酸序列。
[0026] SEQIDNO:6显示了全长Vip3Ab蛋白的氨基酸序列。
[0027] SEQIDN0:7显示了蛋白酶加工的CrylEa蛋白的氨基酸序列。
[0028] SEQIDN0:8显示了蛋白酶加工的CrylAb蛋白的氨基酸序列。
[0029] SEQIDN0:9显示了蛋白酶加工的CrylBe蛋白的氨基酸序列。
[0030] SEQIDNO: 10显示了蛋白酶加工的CrylCa蛋白的氨基酸序列。
[0031] SEQIDNO: 11显示了蛋白酶加工的CrylDa蛋白的氨基酸序列。
[0032] 发明详细说明书
[0033] 本发明部分涉及令人惊讶的发现，即CrylEa具有独特且独立的作用模式，且不与 CrylAb、CrylBe、CrylCa、CrylDa或VIP3Abl竞争秋粘虫（FAW;Spodopterafrugiperda) 的肠道中的结合位点。因此，CrylEa蛋白可以与CrylAb、CrylBe、CrylCa、CrylDa和/或 VIP3Abl蛋白在转基因玉米（和其它植物；例如棉花）中组合使用，以延迟或防止FAW对这 些蛋白个别产生抗性。本主题蛋白与本文公开的其它Cry或VIP蛋白一起使用，能够有效 保护植物（例如玉米植物和/或大豆植物）免于被Cry抗性秋粘虫破坏。也就是说，使用 本发明可以保护玉米和其它经济学上重要的植物物种免于遭受可能对单一Cry或VIP蛋白 产生了抗性的秋粘虫群体所造成的破坏和产量损失。
[0034] 因此，本发明教导了一种昆虫抗性管理（IRM)堆叠，其包括CrylEa和CrylAb、 CrylBe、CrylCa、CrylDa和/或VIP3Abl，用于防止或减轻FAW对这些蛋白中的某一种单独 使用时产生的抗性。
[0035] 本发明包括用于控制FAW的组合物，其中该组合物包括CryIEa杀虫蛋白和 〇7认13、(：巧186、(：巧10&、(：巧10 &和/或￥1?34131杀虫蛋白。主题组合物包括植物和植物细 胞。
[0036] 本发明进一步包括被转化而产生CrylEa杀虫蛋白与CrylAb、CrylBe、CrylCa、 CrylDa或VIP3Abl杀虫蛋白的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。主题多核苷酸优 选地处于遗传构建体中，在非苏云金芽孢杆菌的启动子的控制之下。术语"分离的"和"异 源的"意味着多核苷酸或DNA分子处于不同于其天然环境的状态一涉及人的操作。主题多 核苷酸可包括用于提高在植物中表达的密码子使用。
[0037] 此外，本发明包括控制FAW的方法，其中该方法包括使所述FAW或所述FAW的环境 与有效量的组合物接触，该组合物含有本发明的包含CrylEa核心毒素的蛋白对。
[0038] 本发明的一个实施方案包括含有编码本发明的CrylEa杀虫蛋白对的植物可表达 基因的植物（可以包括玉米、大豆和棉花），和此类植物的种子。
[0039] 本发明进一步的实施方案包括这样的植物，其中编码本发明CrylEa杀虫蛋白对 的植物可表达基因已被基因渗入到该植物中，和此类植物的种子。
[0040] 如实施例中所述，使用放射性标记的CrylEa蛋白和/或放射性标记的CrylAb 蛋白的竞争性受体结合研宄显示，CrylAb，CrylBe，CrylCa，CrylDa，和VIP3Abl蛋白不与 CrylEa竞争结合CrylEa所结合的FAW中肠刷状缘膜囊泡（midgutbrushbordermembrane vesicle)。这些结果还表明，CrylEa与这些其它蛋白质的组合能够作为一种有效的手段 来减轻FAW群体对这些蛋白产生抗性。因此，部分地根据本文所述的数据，认为CrylEa与CrylAb,CrylCa,CrylBe,CrylDa,和/或VIP3Abl蛋白的共产生（堆叠）能够用于产生高剂 量的IRM堆叠，用于控制/抑制/杀死FAW。
[0041] 其它的蛋白质可以添加到主题对中。例如，本发明还部分涉及三种（或更多种） 毒素的三重堆叠或"金字塔"，其中一个主题对是基础对。在一些优选的金字塔实施方案中， 选定的毒素对FAW具有三种不同的作用模式。一些优选的"三作用模式"金字塔组合包括 主题基础蛋白对加上第三种用于靶向FAW的蛋白。"不同作用位点"的含义是，任一种给定 蛋白均不会与其它产生交叉抗性。根据本主题发明，这些特定的三重堆叠可有利地并且令 人惊讶地提供针对FAW的三种作用位点。这能够帮助减少或消除对避难田地的需要。
[0042] 因此，一个部署选项是将主题蛋白对与第三种毒素/基因组合使用，并使用这种 三重堆叠减轻FAW对这些毒素的任一种产生抗性。因此，本发明还部分涉及三种（或更多 种）毒素的三重堆叠或"金字塔"。在一些优选的金字塔实施方案中，选定的毒素具有针对 FAW的三种不同作用位点。
[0043] 在本发明的各种部署选项中，包括在FAW会产生抗性群体的作物种植区域内使用 主题蛋白中的两种、三种或更多种蛋白。
[0044] 产生任一种主题蛋白组合的植物（和种植有这类植物的田地）包含在本发明的范 围内。也可以添加额外的毒素/基因，但是上面讨论的特殊堆叠可有利地并且令人惊讶地 提供针对FAW的多个作用位点。这可有助于减少或消除对避难田地的需要。因此，超过10 英亩的如此种植的田地包含在本发明的范围内。
[0045]GENBANK也可以用于获得本文公开或提到的任何基因和蛋白的序列。相关序列也 可以在专利中获得。代表性的Cry毒素在官方Bt命名委员会的网 站上列出（Crickmoreet al. ;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/) 〇 目前〃Cry〃蛋白有大约 70 个主 要的族，还有其他的VIP蛋白等等。
[0046] 本文所述蛋白的组合可用于控制鳞翅目害虫。成年鳞翅目昆虫，例如蝴蝶和飞蛾， 主要食用花蜜并且是授粉的重要实施者。几乎所有的鳞翅目幼虫，即毛虫，均以植物为食， 许多是严重的害虫。毛虫在植物叶片上面或内部或者在根或茎上取食，剥夺植物营养并经 常破坏植物的物理支撑结构。此外，毛虫以水果、纤维和储存的粮食和面粉为食，导致这些 产品无法出售，或严重削弱其价值。如本文所使用的，"鳞翅目害虫"是指害虫的各个生命阶 段，包括幼虫阶段。
[0047] 本发明的一些嵌合蛋白包含完整Bt蛋白毒素的完整N端核心毒素区，并且，在核 心毒素部分末端之后的某个位置，这些蛋白具有向异源原毒素序列的过渡。Bt蛋白毒素的 N-末端杀虫活性毒素部分被称作"核心"毒素。位于核心毒素C端一侧的部分被称作"原 毒素"节段或部分。核心毒素节段向异源原毒素节段的过渡可发生于核心毒素/原毒素接 点附近，或者，天然原毒素的一部分可以被保留，而向异源原毒素部分的过渡发生在下游。
[0048] 作为一个实例，本发明的一种嵌合蛋白是CrylEa的完整核心毒素部分（大约是前 600个氨基酸）和/或异源原毒素（直到C端为止的其余氨基酸）。在一个优选实施方案 中，嵌合蛋白的包含原毒素的部分源自CrylAb毒素。除了Vip3Ab之外，所有根据本发明使 用的蛋白质均具有相似的全长和核心毒素大小和结构。
[0049] 本领域的技术人员将意识到，Bt蛋白毒素，即使在一个特定的类别如CrylEa内， 长度也有一定程度的变化，并且从核心毒素到原毒素的精确过渡位置也会改变。典型地，例 如，CrylEa蛋白的长度是大约1150至大约1200个氨基酸。核心毒素部分向原毒素部分的 过渡通常发生在毒素全长的大约50%至大约60%。本发明的嵌合蛋白将包括该N末端核心 毒素区域的全部范围。因此，所述嵌合蛋白将包括CRYlBt毒素蛋白全长的至少大约50%。 这通常会是至少大约590个氨基酸。关于原毒素部分，CrylAb原毒素部分的全部范围从核 心毒素部分的末端延伸到该分子的C末端。
[0050]基因和毒素根据本发明使用的基因和毒素不仅包括所公开的全长序列，还包括 这些序列的片段、变体、突变体和融合蛋白的保留了本文中具体举例的核心毒素的特征性 杀虫活性的片段。如本文所使用的，术语基因的"变体"或"变异"是指编码相同毒素或编 码具有杀虫活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文所使用的，术语"等同毒素"是指具有与 要求保护的毒素相同或基本相同的对目标害虫的生物活性的毒素。
[0051]如本文所使用的，边界（boundaries)代表大约 95 % (CrylEa)，78 % (CrylE)， 和 45 % (Cryl)序列同一性，见"RevisionoftheNomenclaturefortheBacillus thuringiensisPesticidalCrystalProteins, "N.Crickmore,D.R.Zeigler,J. Feitelson,E.Schnepf,J.VanRie,D.Lereclus,J.Baum,和D.H.Dean.Microbiologyand MolecularBiologyReviews(1998)Vol62:807-813。这些截止点也可以仅适用于核心毒 素。
[0052] 本发明的技术人员会意识到，编码活性毒素的基因可以通过若干手段鉴定和获 得。本文所列举的具体基因或基因部分可以从保藏在培养物保藏机构的分离物中获得。这 些基因，或这些基因的部分或变体，也可以通过合成手段构建，例如使用基因合成仪。基因 的变异可以使用标准的点突变制造技术容易地构建。另外，这些基因的片段可以使用市售 的核酸外切酶或核酸内切酶根据标准程序加以制备。例如，可以使用酶（如Bal31)或定点 诱变，系统性地从这些基因的末端切下核苷酸。编码活性片段的基因也可以使用多种限制 性内切酶获得。可以用蛋白酶来直接获得这些蛋白毒素的活性片段。
[0053] 保留示例毒素的杀虫活性的片段和等同物在本发明的范围内。此外，由于遗传密 码子的冗余性，有许多不同的DNA序列能够编码本文公开的氨基酸序列。创建这些编码相 同或基本上相同毒素的替代DNA序列完全在本领域的技术人员的能力范围之内。这些变体 DNA序列在本发明的范围内。如本文所使用的，"基本上相同的"序列是指具有不会显著影 响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。基因的编码保留杀虫活性的蛋白质的 片段也包含在本定义内。
[0054] 另一种用于鉴定编码可根据本发明使用的毒素的基因或基因部分的方法是通过 使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列可以通过合适的标记物 被检测，或者可以根据国际专利No.W093/16094所述制成具有固有荧光。如本领域众所周 知的，如果探针分子和核酸样品通过在两个分子之间形成强键而杂交，则可以合理推定探 针和样品具有相当的同源性。优选地，杂交在严格条件下通过本领域众所周知的技术实 施，这样的技术在例如Keller,G.H.，M.M.Manak(1987)DNAProbes,StocktonPress,New York，N.Y.，169-170页中有描述。盐浓度与温度的组合的一些实例如下（以严格度增大排 序）：室温，2XSSPE或SSC;42°CIXSSPE或SSC;42°C0.1XSSPE或SSC;65°C0.1XSSPE 或SSC。探针的检测提供了一种按照已知的方式确定杂交是否发生的手段。这种探针分析 提供了一种快速的鉴定本发明的毒素编码基因的方法。用作根据本发明的探针的核苷酸片 段可以使用DNA合成仪和标准程序加以合成。这些核苷酸序列还可以用作PCR引物，用于 扩增本发明的基因。
[0055]变体毒素本发明的某些毒素在本文中已经有具体举例。因为这些毒素仅仅是本 发明毒素的举例，因此容易想到的是，本发明包括具有与例示的毒素相同或相似的杀虫活 性的变体或等同毒素（和编码等同毒素的核苷酸序列）。等同毒素会与例示毒素具有氨基 酸同源性。这种氨基酸同源性通常大于75%，优选地大于90%，最优选地大于95%。氨基 酸同源性在毒素中负责生物活性、或参与决定最终负责生物活性的三维构象的关键区域内 是最高的。关于这一点，如果某些氨基酸取代位于对于活性而言非关键的区域内，或者是不 会影响分子三维构象的保守氨基酸取代，则这些取代是可以接受的，并且预期会发生。例 如，氨基酸可以归于如下的类型：非极性、不带电荷的极性、碱性和酸性。保守取代，即一个 类型的氨基酸被相同类型的另一种氨基酸代替，通常在本发明的范围内，只要该取代没有 实质性改变化合物的生物活性。下面列出了属于每个类型的氨基酸的实例。
[0056]
[0057] 在一些情况下，也可以进行非保守的取代。关键因素是这些取代必须不会显著降 低毒素的生物活性。
[0058]重组宿主编码本发明毒素的基因能够被引入到多种多样的不同微生物或植物宿 主中。毒素基因的表达直接或间接地导致杀虫剂在细胞内产生并保持。可利用接合转移或 重组转移来创建表达本发明两种毒素的Bt株。也可以用这些毒素基因中的一种或两种转 化其它宿主生物体，然后用来实现协同效果。使用合适的微生物宿主，例如假单胞菌，可以 将微生物施加到害虫的地域，在那里它们将繁殖并被摄食。结果是害虫得到控制。或者，可 以在能够延长毒素活性或稳定化细胞的条件下处理携带毒素基因的微生物。然后可以将经 过处理的细胞，其保留毒素活性，施加到目标害虫的环境中。
[0059] 当Bt毒素基因通过合适的载体引入到微生物宿主中，并且将所述宿主以存活状 态施加到环境时，使用某些特定的宿主微生物是关键的。选择已知占据一种或多种感兴趣 玉米的"植物圈"（叶面，叶围，根际和/或根面）的微生物宿主。选择这些微生物是为了能 够成功地在特定环境（作物和其它昆虫栖息地）中与野生型微生物竞争，为表达多肽杀虫 剂的基因的稳定保持和表达提供条件，并且理想地，为更好地保护杀虫剂免于环境降解和 失活提供条件。
[0060] 已知有大量微生物栖息在许多种重要农作物的叶面（植物叶的表面）和/或根 际（植物根系周围的土壤）。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物， 如细菌，例如假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、 根瘤菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属（Methylophilius)、土壤杆菌属（Agrobactenum)、 醋酸杆菌属（Acetobacter)、乳杆菌属（Lactobacillus)、节杆菌属（Arthrobacter)、 固氮菌属（Azotobacter)、明串球菌属（Leuconostoc)和产喊菌属（Alcaligenes);真 菌，特别是酵母，例如酵母属（Saccharomyces)、隐球菌属（Cryptococcus)、克鲁维酵 母属（Kluyveromyces)、掷抱酵母属（Sporobolomyces)、红酵母属（Rhodotorula)和 短梗霉属（Aureobasidium)。特别感兴趣的是如下的植物圈细菌物种，如丁香假单胞 菌（PseudomonasSyringae)、突光假单胞菌（PseudomonasFluorescens)、粘质沙雷 氏菌（SerratiaMarcescens)、木醋酸杆菌（AcetobacterXylinum)、根癌土壤杆菌 (AgrobacteriumTumefaciens)、浑球红假单胞菌（RhodopseudomonasSpheroides)、野 油菜黄单胞菌（XanthomonasCampestris)、苜蓿根瘤菌（RhizobiumMelioti)、真养产 喊菌（AlcaligenesEntrophus)和维涅兰德固氮菌（AzotobacterVinlandii);和植物 圈酵母物种，如深红酵母（Rhodotorularubra)、粘红酵母（R.glutinis)、海洋红酵母 (R.marina)、澄红酵母（R.aurantiaca)、浅白隐球菌（Cryptococcusalbidus)、流散隐球 菌（C.diffIuens)、罗伦特隐球菌（C.Iaurentii)、罗斯酵母（Saccharomycesrosei)、有 抱酵母（S.pretoriensis)、酿酒酵母（S.cerevisiae)、玫瑰掷抱酵母（Sporobolomyces roseus)、香味掷抱酵母（S.odorus)、维罗纳克鲁维酵母（Kluyveromycesveronae)和 出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans)。特别感兴趣的是产色的微生物（pigmented microorganisms)〇
[0061] 有多种多样的方法可用于将编码毒素的Bt基因在允许所述基因稳定保持和表达 的条件下引入到微生物宿主中。这些方法是本领域技术人员众所周知的，并且例如在美国 专利No. 5, 135, 867中描述，其通过提述并入本文。
[0062]细朐处理可以对表达Bt毒素的苏云金芽孢杆菌或重组细胞进行处理以延长毒 素活性和稳定化细胞。所形成的杀虫微囊将Bt毒素包含于已被稳定化的细胞结构内，当微 囊被施于目标害虫的环境时，该细胞结构会保护该毒素。合适的宿主细胞可以包括原核生 物或真核生物，通常限于那些不会产生对高等生物如哺乳动物有毒的物质的细胞。然而，当 毒性物质不稳定或者施加水平足够低以至可以避免对哺乳动物宿主的任何可能的毒性时， 也可以使用会产生对高等生物有毒的物质的生物。作为宿主，特别感兴趣的是原核生物和 低等真核生物，如真菌。
[0063] 在处理时，细胞通常是完整的并且基本上处于可增殖的形式，而不是处于孢子形 式，尽管在一些情况下可以采用孢子。
[0064] 微生物细胞（例如含有Bt毒素基因的微生物）的处理可以通过化学或物理手段 进行，或者通过化学和/或物理手段的组合进行，只要该技术不会有害地影响毒素的性质 并且不会减小细胞保护毒素的能力即可。化学试剂的实例是卤化剂，特别是原子序号17-80 的卤素。更特别地，碘可以在温和的条件下使用足够长的时间以获得期望的结果。其它合 适的技术包括醛如戍二醛处理；抗感染剂处理，如氯化苯甲径按（Zephiranchloride)和氯 化十六烧吡啶（CetylpyridiniumChloride);醇如异丙醇和乙醇处理；多种组织固定剂处 理，如鲁哥氏碘液（Lugoliodine)、布安氏固定剂（Bouin'sfixative)、多种酸和海利氏 固定剂（Helly'sfixative)(参见Humason，GretchenL. ,AnimalTissueTechniques,ff. H.FreemanandCompany, 1967);或保留和延长在将细胞施加于宿主环境时细胞内产生的 毒素的活性的物理（加热）和化学剂的组合。物理手段的实例为短波辐射，如Y-辐射和 X-辐射、冷冻、UV照射、冷冻干燥等。用于处理微生物细胞的方法在美国专利No. 4, 695, 455 和4, 695, 462中公开，其通过提述并入本文。
[0065] 细胞一般具有增强的结构稳定性，可提高对环境条件的抗性。当杀虫剂处于原型 (Proform)时，选定的细胞处理方法应当不抑制目标害虫病原体将杀虫剂从原型加工为成 熟形式。例如，甲醛会交联蛋白质并可抑制多肽杀虫剂原型的加工。处理的方法应当能够 保留毒素的至少相当部分的生物可用性或生物活性。
[0066] 出于生产目的，在选择宿主细胞时特别感兴趣的特征包括将Bt基因引入宿主 的便利性，表达系统的可用性，表达效率，杀虫剂在宿主体内的稳定性，和辅助遗传能力 的存在。用作杀虫剂微囊的感兴趣特征包括对杀虫剂的保护性品质，如厚细胞壁、染色 (pigmentation)、和细胞内包装或形成包涵体；在含水环境中的存活；缺乏哺乳动物毒性； 吸引害虫摄食；容易杀死和固定而不会伤害毒素；等等。其它的考虑包括配制和操作的便 宜性、经济性、储存稳定性等。
[0067]细胞牛长含有Bt杀虫基因的细胞宿主可以在任何常规的营养培养基中生长，其 中DNA构建体提供选择优势，从而提供选择性培养基，使得基本上全部或者全部的细胞保 留Bt基因。然后可以根据常规方法收获这些细胞。或者，细胞可以在收获之前处理。
[0068] 产生本发明毒素的Bt细胞可以用标准技术培养基和发酵技术培养。发酵循环一 旦完成，可以收获细菌，首先通过本领域众所周知的手段将Bt孢子和结晶与发酵液分离。 回收的Bt孢子和结晶可以通过添加表面活性剂、分散剂、惰性载体和其它有利于操作和施 用于特定目标害虫的组分而配制成可湿性粉剂、浓缩液、颗粒或其它配制物。这些配制物和 施用步骤是本领域众所周知的。
[0069]配制物含有引诱剂和Bt分离株的孢子、结晶和毒素的配制的诱饵颗粒，或者含 有可以从本文公开的Bt分离株中获得的基因的重组微生物，可施于土壤。配制的产品也 可以作为种子包衣（seedcoating)、或根处理、或在作物周期（CropCycle)的晚期作为 全植物处理来施用。通过与多种惰性材料如无机矿物质（层状硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷 酸盐等）或植物材料（粉化玉米穗轴、稻壳、核桃壳等）混合，Bt细胞的植物和土壤处理 可以作为可湿性粉剂、颗粒或喷洒物（dust)使用。配制物可以包括展布剂-粘着剂佐剂 (Spreader-StickerAdjuvant)、稳定剂、其它杀虫添加剂或表面活性剂。液体配制物可为 基于水的或非水的，并作为泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化的浓缩物等利用。成分可以包括流变 剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。
[0070] 如本领域的技术人员会意识到的，取决于特定制剂的性质，特别是它是浓缩物或 是直接使用的，杀虫剂浓度可以变化很大。杀虫剂以按重量计至少1%存在，并可为按重量 计100%。干的配制物中具有按重量计约1-95%的杀虫剂，而液体配制物一般为在液相中 按重量计约1-60%的固体。配制物一般具有大约IO2-大约IO4个细胞/mg。这些配制物以 每公顷大约50mg(液体或干的）至Ikg或者更多施用。
[0071] 配制物可通过喷雾、扬尘、撒布（sprinkling)等向鳞翅类害虫的环境（例如叶子 或土壤）中施加。
[0072] 棺物转化用于表达本发明杀虫蛋白的某些优选重组宿主是植物。更高度优选的 宿主是通常用于生产食物、饲料、燃料和油的作物。更高度优选的宿主作物植物是玉米、大 豆、棉花和芥花。玉米是高度优选的实施方案。编码如本文公开的Bt毒素蛋白的基因可以 用多种本领域众所周知的技术插入植物细胞。例如，有多种含有在大肠杆菌中的复制系统 和允许选择转化细胞的标记的克隆载体可用于将外源基因插入高等植物。所述载体包括例 如PBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，具有编码Bt毒素蛋白序列的DNA片 段可在合适的限制位点插入所述载体。所得的质粒可用于转化入大肠杆菌（E.coli)。大肠 杆菌细胞在合适的营养培养基中培养，然后收获和裂解。回收质粒。作为分析方法，通常进 行序列分析、限制性分析、电泳和其它生物化学-分子生物学方法。在每个操作后，可以将 所用的DNA序列切割并连接到下一个DNA序列。每个质粒序列可以克隆于同一或其他的质 粒中。取决于将期望基因插入植物的方法，其它的DNA序列可能是必需的。如果例如使用 Ti或Ri质粒转化植物细胞，那么必须连接至少Ti或Ri质粒T-DNA的右边界，但常常是左 右两个边界，作为待插入基因的侧翼区。T-DNA用于转化植物细胞的应用已经被广泛研宄， 并充分描述于EP120 516,Lee和Gelvin(2008),Hoekema(1985),Fraley等（1986)，和An 等（1985)中，并且在本领域中已经得到确立。
[0073] 所插入的DNA-旦被整合于植物基因组中，就会相对稳定。转化载体通常含有可 选择标志物，其赋予转化的植物细胞对杀生物剂或抗生素（如双丙氨磷、卡那霉素、G418、 博来霉素或潮霉素等）的抗性。因此，个别使用的标志物应当允许选择转化的细胞，而不选 择不含插入DNA的细胞。
[0074] 有许多技术可用于将DNA插入植物宿主细胞。这些技术包括使用根癌土壤杆菌或 发根土壤杆菌（AgrobacteriumRhizogenes)作为转化载体的T-DNA转化、融合、注射、生物 射弹（Biolistics)(微粒子轰击）或电穿孔以及其它包括纳米微粒转化和细胞渗透肽介导 的转化的方法。见例如WO2008/148223,W02009/046384,W02011/046786,W02011/126644， W02012/006439,和W02012/006443。如果使用土壤杆菌转化，则待插入的DNA必须克隆到 特殊的质粒中，即克隆到中间载体或者克隆到二元载体中。中间载体可以借助与T-DNA中 的序列同源的序列通过同源重组整合到Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包括T-DNA转移 必需的vir区。中间载体在土壤杆菌中不能复制自身。中间载体可以通过辅助质粒转移到 根癌土壤杆菌中（接合）。双元载体能够在大肠杆菌和土壤杆菌中自我复制。它们包括选 择标志物基因和被T-DNA左右边界区框定的接头或多接头。可以将它们直接转化进入土壤 杆菌（Holsters等，1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌包括携带vir区的质粒。该vir区是 将T-DNA转移入植物细胞所必需的。可以含有额外的T-DNA。使用如此转化的细菌转化植 物细胞。可以有利地让根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌与植物外植体一起培养，以便将DNA 转入植物细胞。然后可以在含有用于筛选的杀生物剂或抗生素的合适培养基中，从感染的 植物材料（例如叶的碎片、茎杆的区段、根，还有原生质体或悬浮培养的细胞）再生整个植 物。然后可以测试如此获得的植物是否存在插入的DNA。在注射和电穿孔的情形，对质粒没 有特殊的要求。可以使用普通的质粒，例如PUC衍生物。
[0075] 被转化的细胞可以以通常的方式培育并分化成完整的能育植物。它们能够形成生 殖细胞并将转化的性状传递到后代植物。可以以正常的方式培育这些植物，并与具有相同 的转化的遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得的杂合个体具有相应的表型特征。本 发明的植物细胞还可以是非全能的/不能再生出完整植物。这些细胞可以包括例如叶细 胞。然而，本发明还包括来自本发明种子的细胞，其能够再生出完整植物。
[0076] 在本发明的一个优选实施方案中，用其中密码子用法已针对植物优化过的基因来 转化植物。参见，例如美国专利No. 5380831，其通过提述并入本文。虽然本文例示了一些截 短的毒素，但是在Bt领域中众所周知的是，130kDa型（全长）毒素具有作为核心毒素的N 端半部和作为原毒素"尾"的C端半部。因此，适当的"尾"可与本发明的截短/核心毒素一 起使用。参见，例如美国专利No. 6, 218, 188和美国专利No. 6, 673, 990。此外，用于生成在 植物中使用的合成Bt基因的方法是本领域已知的（Stewart和Burgin, 2007)。优选的转化 植物的一个非限制性实例是能育的玉米植物，其包含编码CrylEa蛋白的植物可表达基因， 还包含编码CrylAb、CrylBe、CrylCa、CrylDa或VIP3Ab蛋白的第二植物可表达基因。
[0077] 将CrylEa对性状转移（或渐渗）到近交（inbred)种系中可以通过轮回选择育 种，例如通过回交实现。在这种情况下，期望的轮回亲本首先与携带赋予CrylEa对性状 的合适基因的近交供体（非轮回亲本）杂交。然后将该杂交的后代与轮回亲本回交，其后 选择所得后代的从非轮回亲本转移来的期望性状。在与轮回亲本回交3个，优选4个，更 优选5个或更多个世代并对期望性状进行选择后，后代就控制被转移性状的座位（Loci) 而言是杂合的，但在大多数或者基本上全部的其它基因处则与轮回亲本相似（参见，例如 Poehlman&Sleper(1995)BreedingFieldCrops,第4版，172-175 ;Fehr(1987)Principles OfCultivarDevelopment,第I卷：TheoryAndTechnique, 360-376)〇
[0078]昆虫抗件管理（IRM)策略例如Roush等概述了（Outline)双毒素策略，也称作 "金字塔"或"堆叠"，用于管理杀虫转基因作物。（TheRoyalSociety.Phil.Trans.R.Soc. Lond.B. (1998)353, 1777-1786)〇
[0079] 美国环境保护局在其网站上公开了为产生对目标害虫有活性的单一Bt蛋白的转 基因作物提供非转基因（即非Bt)避难所（选出的非-Bt作物/玉米）的如下要求（印a. gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)〇
[0080] "针对抗玉米螟Bt(CrylAb和CrylF)玉米产品的具体结构化要求如下：
[0081] 结构化避难所：在玉米种植带中，20%非鳞翅类Bt玉米避难所；
[0082] 在棉花种植带中，50 %非鳞翅类Bt避难所。
[0083]地块（[Blocks)
[0084] 内部（即在Bt田地内）
[0085] 外部（即距Bt田地1/2英里（如果可能的话，1/4英里）内的不同田地，
[0086] 使随机配合最大化）
[0087] 田地内的条垄
[0088] 条垄必须至少4行宽（优选6行），以降低幼虫运动效应。"
[0089] 此外，美国玉米种植者协会在其网站上（ncga.com/insect-resistance-mana gement-fact-sheet-bt-corn)也提供了相似的关于避难所要求的指导。例如：
[0090] "玉米螟IRM的要求：
[0091]-你的至少20%的玉米田亩数种植避难所杂种
[0092]-在产棉区，避难所必须为50%
[0093]-必须种植在距避难所杂种1/2英里内
[0094]-避难所可以在Bt田内成条垄状种植；避难所条垄必须至少4行宽
[0095] -只有对于目标昆虫达到了经济阈值时才可以用常规的杀虫剂处理避难所
[0096]-基于Bt的可喷洒杀虫剂不能用在避难所玉米上
[0097]-在每一块有Bt玉米的农场上必须种植适当的避难所"
[0098] 类似的结构化避难所指导可用于本发明的FAW保护的Bt作物。
[0099] 如Roush等所述（例如在1780和1784页右栏），堆叠或金字塔两种不同蛋白质， 其每一种可有效对抗目标害虫并且具有很小的或者没有交叉抗性，可允许使用更小的避难 所。Roush建议，对于成功的堆叠，小于10%的避难所规模即可提供与单一（非金字塔）性 状大约50%的避难所相当的抗性管理。对于目前可得的金字塔Bt玉米产品，美国环境保护 局要求种植的非Bt玉米结构化避难所（一般5% )显著少于单一性状产品（一般20% )。
[0100] 提供避难所的IRM作用的手段有许多，包括田地内的多种几何种植模式（如上所 述）和袋内（In-Bag)种子混合物，如Roush等（前文）和美国专利No. 6, 551，962中进一 步讨论的。
[0101] 上述的百分比，或相似的避难所比例，可用于主题的双重或三重堆叠或金字塔。对 于具有针对单一目标害虫的三个作用位点的三重堆叠，目标是零避难所（或者例如小于 5%避难所）。对于产业上的田亩数，例如超过10英亩而言尤为如此。
[0102] 通过提述并入本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物的全部 内容，以它们与本说明书的明确教导无矛盾为限。
[0103] 除非具体指出或提示，否则术语"一"、"一个"和"该"表示本文所用的"至少一个"。
[0104] 下面的实施 例说明了用于实践本发明的操作过程。这些实施例不应当认为是限制 性的。除非另外指出，否则所有百分比是依照重量，并且所有溶剂混合比是依照体积。所有 温度为摄氏度。 实施例
[0105] 实施例I-mIfe：记CrylEa和CrylAb蛋白
[0106]Cry毒素的碘化用胰蛋白酶切割全长CrylEa和CrylAb蛋白（SEQIDNO: 1和2) 产生激活的杀虫性形式（用SEQIDNO: 7和8表示）。纯化的截短Cry毒素用Iodo-Bead或 Iodo-gen(Pierce)碘化。简而言之，将两个Iodo-Bead用500y1磷酸盐缓冲盐水PBS(20mM 磷酸钠，0.15MNaCl，pH7. 5)清洗2次，并置于铅屏后的1.5ml离心管中。向其中添加 100yIPBS。在层流罩（hood)中，使用适当的放射性操作技术，向含有Iodo-Bead的PBS溶 液中添加〇.5mCiNa125I(17. 4Ci/mg，Lot0114,Amersham)。使组分在室温下反应5分钟，然 后向溶液中添加2-25yg高纯的截短Cry蛋白，并使之再反应3-5分钟。通过从Iodo-Bead 除去溶液而终止反应，并将其施加到0. 5ml用PBS平衡的脱盐Zeba旋转柱（InVitrogen) 中。洗涤Iodo-Bead两次，每次用IOylPBS并将清洗液施加到脱盐柱中。通过在1,000X g将脱盐柱离心2min使放射性溶液洗脱通过脱盐柱。
[0107] 碘化Cry蛋白的放射性纯度通过SDS-PAGE、磷屏成像（phosphorimaging)和y 计数加以确定。简而言之，通过SDS-PAGE分离2yl放射性蛋白。分离后，用BioRad凝胶 干燥设备按照制造商的使用说明干燥凝胶。通过将干燥的凝胶包裹在Mylar底片（12ym 厚）中，并在MolecularDynamics存储磷光屏（storagephosphorscreen) (35cmX43cm) 下曝光I小时进行成像。平板用MolecularDynamicsStorm820磷屏成像仪显色，用 ImageQuant?软件进行图像分析。使用剃须刀片从凝胶上切下放射性条带和条带上下紧邻 的区域，并在Y计数器中计数。仅在Cry蛋白条带和这些条带的下方区域内检测到了放射 活性。在条带上方没有检测到放射性，表明所有放射性污染物均由小于截短的Cry蛋白的 蛋白组分组成。这些组分最有可能代表了降解产物。
[0108] 实施例2-BBMV制各方案
[0109] 可溶性BBMV的制备和分级末龄秋粘虫幼虫禁食过夜后，在晨间于冰上冷却15分 钟后解剖。从体腔移除中肠组织，留下附着在外皮上的后肠（hindgut)。将中肠置于9X体 积的冰冷匀浆缓冲液中（300mM甘露糖醇，5mMEGTA，17mMTris碱，pH7. 5)，匀浆缓冲液 补充有按照供应商推荐稀释的蛋白酶抑制剂鸡尾酒YSigmaP-2714)。将组织用玻璃组织 勾楽器勾楽_ 15个冲程（stroke)。通过Wolfersberger(1993)的1\%012沉淀法制备BBMV。 简而言之，将溶于300mM甘露醇中的24mM1%(：12溶液与中肠匀浆物等体积混合，搅拌5分 钟，并在冰上放置15分钟。将溶液以2500Xg在4°C离心15分钟。保留上清液，并将沉淀 悬浮在原始体积的〇. 5X稀释的匀浆缓冲液中，并再次离心。将两个上清液合并，在4°C下 27, 000Xg离心30分钟，以形成BBMV级分。将沉淀悬浮到IOml匀浆缓冲液中，补充蛋白酶 抑制物，并在4°C再次以27,OOOxg离心30分钟，以清洗BBMV。将所得沉淀悬浮在BBMV保 存缓冲液中（IOmMffiPES，130mMKC1，10%甘油，pH7. 4)，浓度为大约3mg/ml蛋白。蛋白 浓度用Bradford法（1976)确定，以牛血清白蛋白（BSA)作为标准。在冷冻样品之前，使用 Sigma测定系统按照制造商的使用说明进行碱性磷酸酶测定。BBMV级分中该标志物酶的比 活性通常比中肠匀浆级分中的比活性增加7倍。将BBMV等分成250y1的样品，在液氮中 快速冷冻，并储存在-80 °C。
[0110] 实施例3-测量1Crv蛋白与BBMV蛋白结合的方法
[0111] 125ICry蛋白与BBMV的结合为了确定在结合测定中使用的BBMV蛋白的最佳量， 生成了饱和曲线。125I放射性标记的Cry蛋白（0. 5nM)与不同量的BBMV蛋白在28°C温育1 小时，BBMV蛋白量的范围是在结合缓冲液（8mMNaHPO4, 2mMKH2PO4, 150mMNaCl, 0. 1%牛血 清白蛋白，pH7. 4)中0-500yg/ml。总体积是0. 5ml。通过从I. 5ml离心管中一式三份取 样150y1反应混合物到500y1离心管中，并在室温下将样品14,OOOxg离心6分钟，将结 合的125ICry蛋白与未结合者分离。轻柔除去上清液，沉淀用冰冷的结合缓冲液轻柔冲洗 3次。将含有沉淀的离心管的底部切下，并置于13X75-mm玻璃培养管中。将各样品在Y 计数器中分别计数5分钟。将样品中含有的计数减去背景计数（没有任何蛋白的计数），并 对BBMV蛋白浓度作图。待使用的最佳蛋白量被确定为0.15mg/mlBBMV蛋白。 1 鸡尾酒组分的终浓度(以IiM计)是AEBSF(500)，EDTA(250mM)，抑氨肽酶B(Bestatin) (32),E-64 (0.35), 亮肽酶素(Leupeptin) (0.25)，和抑肽酶(Aprotinin) (0.075).
[0112] 为了确定结合动力学，生成了饱和曲线。简而言之，将BBMV(150yg/ml)与递增浓 度（范围是0.Ol-IOnM)的125ICry毒素在28°C温育1小时。通过如上所述地从每个浓度 一式三份取样150yl，对样品进行离心并计数，确定总结合。用相同的方式确定非特异性 结合，只是向反应混合物中添加1，OOOnM同源的胰蛋白酶处理过的非放射性Cry毒素（以 SEQIDN0:7-ll和未经胰蛋白酶处理的SEQIDN0:6为代表）以饱和所有的非特异性受体 结合位点。特异性结合作为总结和非特异性结合之间的差值计算。
[0113] 同源和异源竞争结合测定使用150μg/mlBBMV蛋白和0.5nM125I放射性标记的 Cry蛋白来进行。添加到反应混合物中的竞争性非放射性标记的Cry毒素的浓度范围是 0. 045-1，OOOnM，并且与放射性配体同时添加，以确保真实的结合竞争。温育在28°C进行1 小时，如上文所述地测量与其受体毒素结合的125ICry蛋白的量，并减去非特异性结合。在 不存在任何竞争配体的条件下确定100%总结合。将结果在半对数图上以百分比总特异性 结合与所添加的竞争性配体的浓度的关系作图。
[0114] 实施例4-结果总结
[0115] 图1显示：125I CrylEa (0. 5nM)在来自FAW的BBMV中的百分比特异性结合与由无 标记的同源CrylEa(鲁）和异源CrylAb所致的竞争（)的关系。CrylEa所致的同源竞 争的置换曲线产生这样的曲线，其显示当非标记的CrylEa为大约InM时，50%的放射性配 体发生置换。在测试的任何浓度下（最高达l，〇〇〇nM，或者在测定所用125I CrylEa浓度的 2000倍），CrylAb均不置换125I CrylEa的特异性结合。
[0116] 图2显示了125I CrylAb与来自FAW幼虫的BBMV的结合，以及随后被递增浓度的无 标记CrylAb的替换。在大约0. 3NM的浓度，未标记的CrylAb置换了50%的放射性CrylAb 的结合。I CrylAb与FAW BBMV的结合没有被CrylEa置换。因此，这两种Cry毒素结合于 FAW昆虫肠道中的不同位点。
[0117] 图3显示了125I CrylEa在来自FAW的BBMV中的百分比特异性结合与由无标记的 同源CrylEa(鲁）和异源CrylCa所致的竞争（▲)的关系。CrylEa所致的同源竞争的置换 曲线产生这样的曲线，其显示在大约InM的非标记CrylEa的存在下，放射性配体发生50% 置换。CrylCa不能置换125I CrylEa的结合。
[0118] 图4显示了结合测试的结果，其中令125ICrylEa与来自FAW幼虫的BBMV结合，随 后添加CrylEa、CrylBe、CrylDa和VIP3Abl配体。CrylBe、CrylDa和VIP3Abl不能置换125I CrylEa的结合，但是CrylDa在1，OOOnM的浓度下，或者在测定所用125ICrylEa浓度的2000 倍的浓度下，导致大约40%的置换。
[0119] 参考文献列表
[0120] Bernardi, R. , Tedeschi, G. , Ronchi, S. , and Palmieri, S. (1996). Isolation and some molecular properties of a trypsin-like enzyme from larvae of European corn borer Ostrinia nubilalis Hnbner(Lepidoptera:pyralidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology 26, 883-889.
[0121] Christeller, J. T. , Laing W.A.,Marwick N. P. , and Burgess E. P. J. (1992). Midgut protease activities in 12phytophagous lepidopteran larvae:Dietary and protease inhibitor interactions. Insect Biochem. Molec. Biol. 22, 735-746.
[0122] Gatehouse, L. N. , Shannon, A. L. , Burgess, E. P. , and Christeller, J. T. (1997). Characterization of major midgut proteinase cDNAs from Helicoverpa armigera larvae and changes in gene expression in response to four proteinase inhibitors in the diet. Insect Biochem Mol Biol 27, 929-944.
[0123] Gomez, I. , Arenas, I. , Benitez, I. , Miranda-Riosj J. , Becerril, B. , Grande, R. ,Almagro, J. C. , Bravo, A. , and SoberonjM. (2006). Specific epitopes of domains II and III of Bacillus thuringiensis CrylAb toxin involved in the sequential interaction with cadherin and aminopeptidase-N receptors in Manduca sexta. J Biol. Chem. 281，34032-34039.
[0124] Gomez，I.，Dean，D. H.，Bravo, A.，and Soberon，M. (2003)?Molecular basis for Bacillus thuringiensis CrylAb toxin specificity:two structural determinants in the Manduca sexta Bt-Rlreceptor interact with loops alpha_8and 2in domain II of CylAb toxin. Biochemistry 42, 10482-10489.
[0125] Gomez, I. , Pardo-Lopezj L. , Munoz-Garayj C. , Fernandez, L. E. , Perez, C. , Sanche z, J. , Soberon, M. , and Bravo, A.(2007). Role of receptor interaction in the mode of action of insecticidal Cry and Cyt toxins produced by Bacillus thuringiensis. Peptides28, 169-173.
[0126] Pigott, C. R. and EllarjD. J. (2007). Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal t oxin activity. Microbiol Mol Biol. Rev. 71, 255-281.
[0127] Rausell, C. , Garcia-Roblesj I. , Sanchez, J. , Munoz-Garayj C. , Martinez-Ramir ez, A. C. , Real, M. D. , and BravojA. (2004). Role of toxin activation on binding and pore formation activity of the Bacillus thuringiensis Cry3 toxins in membranes of Leptinotarsa decemlineata(Say). Biochim. Biophys Acta 1660,99-105.
[0128] Roush RT. Two-toxin strategies for management of insecticidal transgenic crops:can pyramiding succeed where pesticide mixtures have not ? Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.1998 Oct 29 ；353 (1376):1777 - 1786.
[0129] Van，R. J.，Jansens，S.，Hofte，H.，Degheele，D.，and Van，M. H. (1990a). Receptors on the brush border membrane of the insect midgut as determinants of the specificity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins.Appl Environ Microbiol 56, 1378-1385.
[0130] Heckel, D. G. , Gahan, L. J. , Baxter, S. W. , Zhao, J. Z. , Shelton, A. M. , Gould, F. , and Tabashnik, B. E. (2007). The diversity of Bt resistance genes in species of Lepidoptera. J Invertebr Pathol 95, 192-197.
[0131] Luo, K. , Banks, D. , and Adang, M. J. (1999). Toxicity, binding, and permeability analyses of four bacillus thuringiensis cry I delta-endotoxins using brush border membrane vesicles of spodoptera exigua and spodoptera frugiperda. Appl. Environ. Microbiol. 65, 457-464.
[0132] Palmer，M.，Buchkremer，M，Valeva，A，and Bhakdi, S. Cysteine-specific radioiodination of proteins with fluorescein maleimide.Analytical Biochemistry253, 175-179. 1997.
[0133] Ref Type: Journal (Full)
[0134] Sambrook, J. and RusselljD. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory).
[0135] Schlenz, M. L. , Babcock, J. M. , and Storer, N. P. Response of CrylF-resistant and Susceptible European Corn Borer and Fall Armyworm Colonies to Cry1A.105 and Cryl2Ab2. DAI 0830, 2008. Indianapolis,Dow AgroSciences. Derbi Report.
[0136] Sheets, J. J. and Storer, N. P. Analysis of CrylAc Binding to Proteins in Brush Border Membrane Vesicles of Corn Earworm Larvae (Heleothis zea). Interactions with CrylF Proteins and Its Implication for Resistance in the Field. DAI-0417, 1-26. 2001. Indianapolis, Dow AgroSciences.
[0137] Tabashnik，B. E.，Liu，Y. B.，Finson，N.，Masson，L.，and Heckel，D. G. (1997) ? One gene in diamondback moth confers resistance to four Bacillus thuringiensis toxins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 1640-1644.
[0138] Tabashnik, B. E. , Malvar, T. , Liu, Y. B. , Finson, N. , Borthakur, D. , Shin, B. S. , Park, S. H. , Masson, L. , de Maagd, R. A. , and BoschjD. (1996). Cross-resistance of the diamondback moth indicates altered interactions with domain II of Bacillus thuringiensis toxins.Appl. Environ. Microbiol. 62, 2839-2844.
[0139] Tabashnik，B. E.，Roush，R. T.，Earle，E. D.，and Shelton，A. M. (2000) ? Resistance to Bt toxins.Science 287,42.
[0140] Wolfersberger, M. G. (1993). Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the gypsy moth(Lymantria dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol 24, 139-147.
[0141] Xu, X. , Yu, L. , and Wuj Y. (2005). Disruption of a cadherin gene associated with resistance to CrylAc {delta}-endotoxin of Bacillus thuringiensis in Helicoverpa armigera. Appl Environ Microbiol 71，948-954.
【主权项】
1. 一种转基因植物，其包含编码CrylEa杀虫蛋白的多核苷酸，和编码第二杀虫蛋白的 第二多核苷酸，所述第二杀虫蛋白选自下组：CryIAb,CrylBe,CrylCa,CrylDa,和Vip3Ab。2. 权利要求1的转基因植物，所述植物进一步包含编码第三杀虫蛋白的DNA。3. 根据权利要求1的植物的种子，其中所述种子包含所述异源多核苷酸。4. 根据权利要求3的植物的种子，其中所述种子包含所述异源多核苷酸。5. 植物田地，包含非Bt避难所植物和多个根据权利要求1的植物，其中所述避难所植 物占所述田地中全部作物植物的少于40%。6. 权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于 30%〇7. 权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于 20%〇8. 权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于 10%〇9. 权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于10. 权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物形成地块或条垄。11. 一种组合物，包括来自非Bt避难所植物的避难所种子和多个权利要求3的种子，其 中所述避难所种子占该组合物中全部种子的少于40%。12. 权利要求11的组合物，其中所述避难所种子占该组合物中全部种子的少于30%。13. 权利要求11的组合物，其中所述避难所种子占该组合物中全部种子的少于20%。14. 权利要求11的组合物，其中所述避难所种子占该组合物中全部种子的少于10%。15. 权利要求11的组合物，其中所述避难所种子占该组合物中全部种子的少于5%。16. -种管理昆虫对Cry蛋白产生抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要 求5的植物田地。17. 权利要求5-10中任一项的田地，其中所述植物占地超过10英亩。18. 权利要求1的植物，其中所述植物选自下组：玉米、大豆、棉花、芥花和向日葵。19. 权利要求1的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含所述编码所述CrylEa杀虫 蛋白的多核苷酸，其中所述CrylEa杀虫蛋白与SEQIDNO:7至少95%相同。20. 权利要求1的植物，其中所述CrylEa杀虫蛋白包含SEQIDNO: 7。21. -种产生权利要求19的植物细胞的多核苷酸的方法，所述方法包括在多个所述细 胞内复制所述多核苷酸。22. -种控制秋粘虫昆虫的方法，所述方法包括向所述昆虫提供供经口摄取的CrylEa 杀虫蛋白和第二杀虫蛋白，所述第二杀虫蛋白选自下组：CryIAb,CrylBe,CrylCa,CrylDa, 和Vip3Ab。23. 权利要求1的植物的植物细胞，其中所述第二核苷酸编码CrylAb杀虫蛋白，并且其 中所述CryIAb杀虫蛋白与SEQIDNO:8至少95%相同。24. 权利要求1的植物，其中所述CrylAb杀虫蛋白包含SEQIDN0:8。25. 权利要求1的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含所述编码CrylBe杀虫蛋白 的所述分离多核苷酸，其中所述CrylBe杀虫蛋白与SEQIDN0:9至少95%相同。26. 权利要求1的植物，其中所述CrylBe杀虫蛋白包含SEQIDN0:9。27. 权利要求1的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含编码所述CrylCa杀虫蛋白 的所述多核苷酸，其中所述CrylCa杀虫蛋白与SEQIDNO: 10至少95%相同。28. 权利要求1的植物，其中所述CrylCa杀虫蛋白包含SEQIDNO: 10。29. 权利要求1的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含编码所述CrylDa杀虫蛋白 的所述多核苷酸，其中所述CrylDa杀虫蛋白与SEQIDNO: 11至少95%相同。30. 权利要求1的植物，其中所述CrylDa杀虫蛋白包含SEQIDNO: 11。31. 权利要求1的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含编码所述Vip3Ab杀虫蛋白 的所述多核苷酸，其中所述Vip3Ab杀虫蛋白与SEQIDN0:6至少95%相同。32. 权利要求1的植物，其中所述Vip3Ab杀虫蛋白包含SEQIDN0:6。33. 权利要求22的方法，所述方法包括向所述昆虫提供第三杀虫蛋白。34. 权利要求1的植物的植物细胞。35. 权利要求2的植物的植物细胞。36. 权利要求18的植物的植物细胞。
【专利摘要】本发明包括用于控制秋粘虫(fall army worm)鳞翅目昆虫的方法和植物，所述植物含有Cry1Ea杀虫蛋白和选自下组的第二杀虫蛋白：Cry1Ab,Cry1Be,Cry1Ca,Cry1Da,和Vip3Ab，以延迟或防止昆虫产生抗性。
【IPC分类】A01P7/00, A01H1/00, A01H5/00
【公开号】CN104902744
【申请号】CN201380063218
【发明人】J·J·希茨, K·E·纳瓦, S·伯顿, E·A·考德威尔
【申请人】美国陶氏益农公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月4日
【公告号】CA2886787A1, EP2903413A1, US20140109263, WO2014055881A1
最新回复(0)