包含蜂毒的脂溶性分馏物的抗老化化妆品组合物及其制备方法
包含蜂毒的脂溶性分馏物的抗老化化妆品组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用蜂毒的皮肤老化改善用化妆品，更详细地涉及包含蜂毒的脂溶性成分而具有改善皮肤皱纹之类的抗老化效果的化妆品组合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]将从蜜蜂的产卵管出来的毒液称为蜂毒(Bee Venom)。蜂毒作为储存于蜜蜂腹部末端毒囊，并与蜂针相连接，从而在被刺激时所分泌的动物天然生理活性物质，据记录，上述蜂毒在埃及、巴比伦尼亚以治疗目的而使用。据记录，在韩国，在马王堆帛书(最初的针灸学文献)、东医宝鉴、民间疗法中也将活蜂针用于治疗痛症及类风湿关节炎。
[0003]众所周知，这种蜂毒减轻引发炎症的动物的浮肿，并作用于关节炎患者的滑膜细胞，以使作为其主要成分的蜂毒肽(melittin)使NF-KB非活性化，来减少一氧化氮(NO，Nitric Oxide)的量，并抑制环氧合酶_2 (COX-2，Cyclooxygenase-2)来诱发抗炎症效果。曾报告过确认将蜂毒的成分进行分离、纯化来治疗痴呆症或癌症等的蜂毒处理效果的生理研宄或干蜂毒的成分分析的研宄结果。在中医学中长期使用为炎症性疾病的治疗剂，且正在对蜂毒的抗炎症效果和抗癌效果进行研宄。利用蜂毒的动物的关节炎或抗炎症治疗剂的开发研宄已在包括农村振兴厅的很多政府机关中执行。
[0004]本发明人在制备蜂毒的提取物的过程中，发现了在以规定的比例混合蜂毒的脂溶性分馏物和水溶性分馏物来使用的情况下，抗炎症、改善皮肤皱纹之类的抗老化效果优秀，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0005]技术问题
[0006]本发明的目的在于，提供以规定的比例包含蜂毒的脂溶性分馏物而使改善皮肤皱纹、防止脱发之类的抗老化效果优秀的化妆品组合物。
[0007]并且，本发明的另一目的在于，提供以规定的比例包含上述脂溶性分馏物的抗老化用化妆品组合物的制备方法。
[0008]解决问题的手段
[0009]为了达成上述目的，根据本发明，提供化妆品组合物，上述化妆品组合物以1:0.01?0.5的体积比例包含由蜂毒的脂溶性溶剂所分馏的脂溶性分馏物和由水溶性溶剂所分馏的水溶性分馏物。优选地，在以1:0.01?0.2的比例包含上述脂溶性分馏物和水溶性分馏物的情况下，更优选地，在以1:0.1?0.2的比例包含上述脂溶性分馏物和水溶性分馏物的情况下，抗氧化损伤活性优秀。
[0010]上述脂溶性溶剂为选自由乙酸乙醋(ethyl acetate)、氯仿(chlor oform)、醚及丁醇组成的组中的至少一种。上述水溶性溶剂为选自由水、乙醇(ethyl alcohol)及甲醇(methyl alcohol)组成的组中的至少一种。上述化妆品组合物包含选自胞苷(cytidine)、腺昔(adenosine)、柯因(chrysin)、11-二十醇(11-eicosenol)及松属素(pinocembrin)中的至少一种作为非蛋白质成分。并且，上述化妆品组合物包含选自蜂毒肽、磷脂酶A-2、肥大细胞脱粒肽(MCD peptide，Mast cell degran ulating)中的至少一种作为蛋白质成分。在上述化妆品组合物中，优选地，以总化妆品组合物的0.0001?2重量百分比包含作为上述有效成分的蜂毒水溶性分馏物和脂溶性分馏物。优选地，上述化妆品组合物为皮肤皱纹改善用化妆品。
[0011]为了达成再一上述目的，根据本发明，提供化妆品组合物的制备方法，上述化妆品组合物的制备方法包括:步骤S10，利用水溶性溶剂和脂溶性溶剂来对蜂毒进行第一次分馏；步骤S20，向所分馏的第一水溶性层添加脂溶性溶剂来进行第二次分馏；步骤S30，向所分馏的第二水溶性层添加脂溶性溶剂来进行第三次分馏；步骤S40，对所分馏的第三水溶性层进行过滤来去除不溶性成分，从而准备水溶性分馏物；步骤S50，向第一次分馏的第一脂溶性层添加第二次分馏的脂溶性层和第三次分馏的脂溶性层之后进行过滤来去除不溶性成分，从而准备脂溶性分馏物；步骤S60，以0.01?0.5:1的体积比例混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物；以及步骤S70，对在上述步骤S60中得到的混合物进行浓缩及干燥。
[0012]为了达成另一上述目的，根据本发明，提供化妆品组合物的另一种制备方法，上述化妆品组合物的另一种制备方法包括:步骤S11，利用水溶性溶剂来提取蜂毒；步骤S21，对利用水溶性溶剂来提取的蜂毒进行离心分离，并取出水溶性层进行过滤，来去除不溶性成分，从而准备水溶性分馏物；步骤S31，对离心分离的残渣进行干燥来去除水溶性溶剂；步骤S41，向上述残渣添加脂溶性溶剂来进行提取；步骤S51，对利用脂溶性溶剂来提取的蜂毒进行过滤来去除不溶性成分，从而准备脂溶性分馏物；步骤S61，以0.01?0.5:1的体积比混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物；以及步骤S71，对在上述步骤S61中得到的混合物进行浓缩及干燥。
[0013]此时，上述脂溶性溶剂能够使用选自由乙酸乙酯、氯仿、醚及丁醇组成的组中的至少一种，上述水溶性溶剂可使用选自由水、乙醇及甲醇组成的组中的至少一种。
[0014]发明的效果
[0015]根据本发明的上述制备方法制备的以特定比例混合蜂毒的脂溶性分馏物和水溶性分馏物的蜂毒提取物具有改善皮肤皱纹之类的优秀的抗老化活性。
【附图说明】
[0016]图1为表不本发明一实施例的提取物的制备工序的图。
[0017]图2为表不本发明另一实施例的提取物的制备工序的图。
[0018]图3为表示本发明实施例的试样的细胞毒性试验结果的图。
[0019]图4为表示本发明实施例的试样的基质金属蛋白酶-1 (MMP-1，Matrixmetalloproteinase-1)表达抑制试验结果的图。
[0020]图5为表示本发明实施例的试样的前胶原-1合成效果试验结果的图。
[0021]图6为表示本发明实施例的试样的抗氧化损伤活性试验的结果的图。
【具体实施方式】
[0022]以下，具体说明本发明。
[0023]蜂毒由水溶性成分、脂溶性成分及不溶性成分组成。以往的蜂毒的利用主要局限于水溶性分馏物中以蜂毒肽等作为主要成分的蛋白质或肽分馏物。本发明的技术特征如下:利用蜂毒的脂溶性分馏物，从而将蜂毒的非蛋白、非肽分馏物与肽分馏物等适当地重新调节来利用，进而使用为抗老化用组合物的原料。
[0024]根据一具体例，本发明的化妆品组合物通过如下方法制备而得(图1)。
[0025]本发明提供化妆品组合物的制备方法，上述化妆品组合物的制备方法包括:步骤S10，利用水溶性溶剂和脂溶性溶剂来对蜂毒进行第一次分馏；步骤S20，向所分馏的第一水溶性层添加脂溶性溶剂来进行第二次分馏；步骤S30，向所分馏的第二水溶性层添加脂溶性溶剂来进行第三次分馏；步骤S40，对所分馏的第三水溶性层进行过滤来去除不溶性成分，从而准备水溶性分馏物；步骤S50，向第一次分馏的第一脂溶性层添加第二次分馏的脂溶性层和第三次分馏的脂溶性层之后进行过滤来去除不溶性成分，从而准备脂溶性分馏物；步骤S60，以0.01?0.5:1的体积比例混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物；以及步骤S70，对在上述步骤S60中得到的混合物进行浓缩及干燥。根据本发明的一实施例，如图1中所确认，作为水溶性溶剂使用了蒸馏水，作为脂溶性溶剂使用了乙酸乙酯(EA)。
[0026]根据另一具体例，本发明的化妆品组合物通过如下方法制备而得(图2)。
[0027]本发明提供化妆品组合物的另一种制备方法，上述化妆品组合物的另一种制备方法包括:步骤S11，利用水溶性溶剂来提取蜂毒；步骤S21，对利用水溶性溶剂来提取的蜂毒进行离心分离，并取出水溶性层进行过滤，来去除不溶性成分，从而准备水溶性分馏物；步骤S31，对离心分离的残渣进行干燥来去除水溶性溶剂；步骤S41，向上述残渣添加脂溶性溶剂来进行提取；步骤S51，对利用脂溶性溶剂来提取的蜂毒进行过滤来去除不溶性成分，从而准备脂溶性分馏物；步骤S61，以0.01?0.5:1的体积比混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物；以及步骤S71，对在上述步骤S61中得到的混合物进行浓缩及干燥。此时，作为上述脂溶性溶剂使用了氯仿，作为上述水溶性溶剂使用了蒸馏水。根据一具体例，能够通过如下方法制备而得。将1.0g的蜂毒放入烧杯，并添加10ml的蒸馏水来进行提取。在3000rpm下，离心分离10分钟来分离并取出水溶性层(DW层，蒸馏水层)之后，进行过滤来去除不溶性成分，并保管水溶性层。对离心分离的残渣进行干燥来去除残留的微量的蒸馏水。向经干燥的残渣添加200ml的氯仿来提取之后，进行过滤来去除不溶性成分，再准备氯仿层。在混合蒸馏水层和氯仿层之后进行浓缩及干燥。
[0028]调查了通过上述制备方法得到的各分馏物的成分谱(profile)。由此可知，上述提取物中，包含有胞苷(cytidine)、腺苷(adenosine)、柯因(chrysin)、11-二十醇(11-eicosenol)、松属素(pinocembrin)作为非蛋白质成分。并且，可以确认到包含有蜂毒肽、磷脂酶A-2、蜂毒明肽、肥大细胞脱粒肽作为蛋白质成分。
[0029]在混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物的过程中，改变其混合比例来进行试验，其结果，在将脂溶性分馏物和水溶性分馏物的混合比例作为1:0.01?0.2的体积比的情况下，更具体地，作为1:0.1?0.2的体积比的情况下，尤其可以确认到对氧化损伤的恢复活性优秀。
[0030]在上述化妆品组合物中，优选地，以总化妆品组合物的0.001?20重量百分比包含作为上述有效成分的蜂毒水溶性分馏物和脂溶性分馏物。
[0031]在将本发明的上述蜂毒提取物进行抗老化用化妆品制剂化的情况下，可利用通常所使用的填充剂、增量剂、粘结剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来进行调配。并且，除了作为单纯的稀释剂的水、液体石蜡之外，包含多种赋形剂、灭菌的水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制剂等。作为非水溶剂、悬浮剂可使用丙二醇(propyleneglycol)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、油酸乙醋(ethyl oleate)之类的醋及橄榄油之类的植物油。
[0032]实施例
[0033]实施例1:包含脂溶性分馏物的提取物的制备
[0034]将2.5g的未纯化的蜂毒(CBV)放入烧杯，并溶解于10ml的蒸馏水(DW)中。将所溶解的蜂毒放入分馏漏斗，并一边用150ml的蒸馏水来清洗烧杯的内壁一边添加蒸馏水。放入250ml的乙酸乙醋(EA，Ethyl acetate)，并摇勾来进行混合。通过分饱漏斗放置由此混合的乙酸乙酯和蒸馏水的混合液，并打开盖来排出压力。若这样放置，则乙酸乙酯层和蒸馏水层因性质上的差异而分离。通过烧杯接收如此分离的上层(乙酸乙酯)和下层(蒸馏水)中的位于下层的蒸馏水。此时，单独分离上层之后接收。若将所分离的蒸馏水层放入分馏漏斗，放入250ml的乙酸 乙酯，均匀混合后放置，则上层和下层会分离。单独分离了上层(乙酸乙酯)。将下层(蒸馏水)放入分馏漏斗，再放入250ml的乙酸乙酯后进行混合来分离，从而分离了上层(乙酸乙酯)和下层(蒸馏水)。将分离并放置的各乙酸乙酯层进行混合之后，去除不溶成分，从而制备了脂溶性分馏物。并且，从所分离的蒸馏水层中去除不溶成分来制备了水溶性分馏物。在以0.5:1的体积比例混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物之后，进行浓缩并干燥。
[0035]将上述试样溶解于溶剂来使用为试样。
[0036]实施例2:包含脂溶性分馏物的提取物的制备
[0037]除了在上述实施例1中以0.3:1的体积比混合水溶性分馏物和脂溶性分馏物之夕卜，以与上述实施例1相同的方法制备了提取物。
[0038]实施例3:包含脂溶性分馏物的提取物的制备
[0039]除了在上述实施例1中以0.2:1的体积比混合水溶性分馏物和脂溶性分馏物之夕卜，以与上述实施例1相同的方法制备了提取物。
[0040]实施例4:包含脂溶性分馏物的提取物的制备
[0041]除了在上述实施例1中以0.1:1的体积比混合水溶性分馏物和脂溶性分馏物之夕卜，以与上述实施例1相同的方法制备了提取物。
[0042]实施例5:包含脂溶性分馏物的提取物的制备
[0043]除了在上述实施例1中以0.01:1的体积比混合水溶性分馏物和脂溶性分馏物之夕卜，以与上述实施例1相同的方法制备了提取物。
[0044]将在上述实施例中制备的提取物作为试样，来进行了抗老化功效的试验。
[0045]试验例1:细胞毒性实验
[0046]细胞增殖使用EZ-cytox增强细胞活力检测试剂盒(EZ-cytox Enha need CellViability Assay Kit)(韩国戴伊实验室(Daeil Lab，Korea))来进行测定，并根据制造人员的指示来进行了实验。以每孔(well)有5000个细胞(cell)的方式，将成纤维细胞(正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF，normal human dermal fibroblasts))分株于48孔板(wellplate)，并在添加了 I %的胎牛血清(FBS，fetal calf serum)的达尔伯克氏必需基本培养基(DMEM，dulbecco’s minimum essential medium) (low glucose，低葡萄糖)中，在37°C温度下培养了一天。按不同浓度对实施例1的提取物(脂质及水溶性蜂毒(LWBV-Lipid andWater soluble bee venom))进行处理，并在培养24小时、48小时之后，执行了细胞计数试剂盒(CCK，Cell Counting Kit)检测(assay)。添加达到培养基的10%的检测(Assay)试剂，与培养条件相同地培养2小时，并利用GNM酶标仪(gnm microplate reader)(美国伯乐(B1-Rad，USA))来在450nm下测定了吸光度。
[0047]将其结果示于图3中。如在图3中所确认，在所使用的浓度中，脂质及水溶性蜂毒未对成纤维细胞呈现毒性。
[0048]试验例2:MMP-1表达抑制效果
[0049]对于成纤维细胞(human dermal fibroblast)，按不同浓度将上述实施例1至实施例5的蜂毒提取物进行预处理之后，使上述成纤维细胞露出于作为不引起细胞凋亡的浓度的200uM的过氧化氢中，并培养24小时之后分离信使核糖核酸(mRNA，messenger RNA)，从而通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR， reverse transcript1n-polymerase chainreact1n)方法确认了 MMP-1的基因表达水平。
[0050]将其结果示于图4中。借助过氧化氢增加了成纤维细胞的MMP-1表达(H200)，多种蜂毒提取物整体上减少了 MMP-1表达，尤其，实施例1的蜂毒提取物(BVl)呈现了优秀的效果。在图4中，乙型肝炎病毒1-1 (HBV1-1，hepatitis b virus 1-1)是指以I μ g/ml的浓度处理上述实施例1的蜂毒提取物之后露出于过氧化氢的试样。同样，HBV4-0.1是指以0.1 μ g/ml的浓度处理上述实施例4的蜂毒提取物之后露出于过氧化氢的试样。
[0051]试验例3:前胶原-1合成效果
[0052]对于成纤维细胞(human dermal fibroblast)，按不同浓度将上述实施例1至实施例5的蜂毒提取物预处理之后，使上述成纤维细胞露出于200uM的过氧化氢中，并培养24小时之后，从细胞分离蛋白质，并通过免疫印迹法(western blot)确认了前胶原-1的合成量。
[0053]将其结果示于图5中。过氧化氢抑制了成纤维细胞的胶原蛋白的合成，上述实施例的蜂毒提取物全部增加了胶原蛋白的合成。
[0054]试验例4:抗氧化损伤效果
[0055]为了确认基于特定蜂毒分馏物的氧化应激的抗氧化损伤活性，实施了如下实验。对于成纤维细胞(human dermal fibroblast)，按不同浓度将上述实施例3至实施例5的蜂毒提取物预处理之后，使上述成纤维细胞露出于400uM的过氧化氢中，并培养24小时之后，分析基于氧化损伤的MMP-1和前胶原的表达变化，从而了解了避免细胞受到氧化损伤的功能及老化调节能力。
[0056]将其结果示于图6中。在图6中，各数字表示以下条件。
[0057]I:N.C，2:H202400uM，3:实施例 5 3ug/ml，4:实施例 3 2ug/ml，5:实施例 3 3ug/ml，6:实施例 4 2ug/ml，7:实施例 4 3ug/ml，8:实施例 5 3ug/ml+H202400uM，9:实施例 32ug/ml+H202400uM，10:实施例 3 3ug/ml+H202400uM，11:实施例 4 2ug/ml+H202400uM，12:实施例 4 3ug/ml+H20240 0uM
[0058]如在图6中所确认，实施例5和实施例3的提取物呈现使被过氧化氢处理减少的前胶原的量恢复的效果。在实施例4的情况下，可知对使前胶原和MMP-1的表达全部恢复到氧化损伤之前的水平非常有效。像这样，可以确认到实施例3至实施例5的提取物具有避免细胞受到氧化损伤的非常优秀的活性。
[0059]如在上述试验例中所确认，在处理本发明实施例的组合物的情况下，真皮的组织周转(turnover)增加，从而增进胶原蛋白的合成，并抑制胶原蛋白的分解。这意味着当本发明的蜂毒提取物露出于生成自由基的应激时，不仅具有调节细胞外基质(ECM，extracellular matrix)的代谢的保护效果，而且还具有诱导新的胶原蛋白的合成的活化效应(rejuvenat1n effect)，从而可有用地使用为抗老化化妆品。
[0060]产业上的可利用性
[0061 ] 根据本发明制备的以特定比例混合有蜂毒的脂溶性分馏物和水溶性分馏物的蜂毒提取物具有优秀的抗氧化损伤活性，以使改善皮肤皱纹之类的抗老化活性优秀，从而可有用地利用于化妆品产业。
【主权项】
1.一种化妆品组合物，其特征在于，以1:0.01?0.5的体积比例包含由脂溶性溶剂所分馏的蜂毒的脂溶性分馏物和由水溶性溶剂所分馏的水溶性分馏物。2.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，以1:0.01?0.2的体积比例包含上述脂溶性分馏物和水溶性分馏物。3.根据权利要求2所述的化妆品组合物，其特征在于，以1:0.1?0.2的体积比例包含上述脂溶性分馏物和水溶性分馏物，来具有避免皮肤受到氧化损伤的功能。4.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，上述脂溶性溶剂为选自由乙酸乙酯、氯仿、醚及丁醇组成的组中的至少一种。5.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，上述水溶性溶剂为选自由水、乙醇及甲醇组成的组中的至少一种。6.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，上述化妆品组合物包含选自胞苷、腺苷、柯因、11-二十醇及松属素中的至少一种作为非蛋白质成分。7.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，上述化妆品组合物包含选自蜂毒肽、磷脂酶A-2、肥大细胞脱粒肽中的至少一种作为蛋白质成分。8.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，上述化妆品组合物为皮肤皱纹改善用化妆品。9.一种化妆品组合物的制备方法，其特征在于，包括: 步骤(SlO)，利用水溶性溶剂和脂溶性溶剂来对蜂毒进行第一次分馏； 步骤(S20)，向所分馏的第一水溶性层添加脂溶性溶剂来进行第二次分馏； 步骤(S30)，向所分馏的第二水溶性层添加脂溶性溶剂来进行第三次分馏； 步骤(S40)，对所分馏的第三水溶性层进行过滤来去除不溶性成分，从而准备水溶性分馏物； 步骤(S50)，向第一次分馏的第一脂溶性层添加第二次分馏的脂溶性层和第三次分馏的脂溶性层之后进行过滤来去除不溶性成分，从而准备脂溶性分馏物； 步骤(S60)，以0.01?0.5:1的体积比例混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物；以及 步骤(S70)，对在上述步骤(S60)中得到的混合物进行浓缩及干燥。10.一种化妆品组合物的制备方法，其特征在于，包括: 步骤(Sll)，利用水溶性溶剂来提取蜂毒； 步骤(S21)，对利用水溶性溶剂来提取的蜂毒进行离心分离，并取出水溶性层进行过滤，来去除不溶性成分，从而准备水溶性分馏物； 步骤(S31)，对离心分离的残渣进行干燥来去除水溶性溶剂； 步骤(S41)，向上述残渣添加脂溶性溶剂来进行提取； 步骤(S51)，对利用脂溶性溶剂来提取的蜂毒进行过滤来去除不溶性成分，从而准备脂溶性分馏物； 步骤(S61)，以0.01?0.5:1的体积比混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物；以及 步骤(S71)，对在上述步骤(S61)中得到的混合物进行浓缩及干燥。11.根据权利要求9或10所述的化妆品组合物的制备方法，其特征在于，上述脂溶性溶剂能够使用选自由乙酸乙酯、氯仿、醚及丁醇组成的组中的至少一种，上述水溶性溶剂使用 选自由水、乙醇及甲醇组成的组中的至少一种。
【专利摘要】本发明涉及利用蜂毒的皮肤老化改善用化妆品，更详细地涉及包含蜂毒的脂溶性成分而具有改善皮肤皱纹之类的抗老化效果的化妆品组合物。根据本发明，提供以1:0.01～0.5的体积比例包含由脂溶性溶剂所分馏的蜂毒的脂溶性分馏物和由水溶性溶剂所分馏的水溶性分馏物的化妆品组合物。
【IPC分类】A61K8/98, A61Q19/08, A61P17/14, A61Q19/00
【公开号】CN104902871
【申请号】CN201380061546
【发明人】安昌基, 朴辰奎, 全钟云
【申请人】飞森有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月25日
【公告号】EP2923693A1, US20150297505, WO2014081255A1
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用蜂毒的皮肤老化改善用化妆品，更详细地涉及包含蜂毒的脂溶性成分而具有改善皮肤皱纹之类的抗老化效果的化妆品组合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]将从蜜蜂的产卵管出来的毒液称为蜂毒(Bee Venom)。蜂毒作为储存于蜜蜂腹部末端毒囊，并与蜂针相连接，从而在被刺激时所分泌的动物天然生理活性物质，据记录，上述蜂毒在埃及、巴比伦尼亚以治疗目的而使用。据记录，在韩国，在马王堆帛书(最初的针灸学文献)、东医宝鉴、民间疗法中也将活蜂针用于治疗痛症及类风湿关节炎。
[0003]众所周知，这种蜂毒减轻引发炎症的动物的浮肿，并作用于关节炎患者的滑膜细胞，以使作为其主要成分的蜂毒肽(melittin)使NF-KB非活性化，来减少一氧化氮(NO，Nitric Oxide)的量，并抑制环氧合酶_2 (COX-2，Cyclooxygenase-2)来诱发抗炎症效果。曾报告过确认将蜂毒的成分进行分离、纯化来治疗痴呆症或癌症等的蜂毒处理效果的生理研宄或干蜂毒的成分分析的研宄结果。在中医学中长期使用为炎症性疾病的治疗剂，且正在对蜂毒的抗炎症效果和抗癌效果进行研宄。利用蜂毒的动物的关节炎或抗炎症治疗剂的开发研宄已在包括农村振兴厅的很多政府机关中执行。
[0004]本发明人在制备蜂毒的提取物的过程中，发现了在以规定的比例混合蜂毒的脂溶性分馏物和水溶性分馏物来使用的情况下，抗炎症、改善皮肤皱纹之类的抗老化效果优秀，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0005]技术问题
[0006]本发明的目的在于，提供以规定的比例包含蜂毒的脂溶性分馏物而使改善皮肤皱纹、防止脱发之类的抗老化效果优秀的化妆品组合物。
[0007]并且，本发明的另一目的在于，提供以规定的比例包含上述脂溶性分馏物的抗老化用化妆品组合物的制备方法。
[0008]解决问题的手段
[0009]为了达成上述目的，根据本发明，提供化妆品组合物，上述化妆品组合物以1:0.01?0.5的体积比例包含由蜂毒的脂溶性溶剂所分馏的脂溶性分馏物和由水溶性溶剂所分馏的水溶性分馏物。优选地，在以1:0.01?0.2的比例包含上述脂溶性分馏物和水溶性分馏物的情况下，更优选地，在以1:0.1?0.2的比例包含上述脂溶性分馏物和水溶性分馏物的情况下，抗氧化损伤活性优秀。
[0010]上述脂溶性溶剂为选自由乙酸乙醋(ethyl acetate)、氯仿(chlor oform)、醚及丁醇组成的组中的至少一种。上述水溶性溶剂为选自由水、乙醇(ethyl alcohol)及甲醇(methyl alcohol)组成的组中的至少一种。上述化妆品组合物包含选自胞苷(cytidine)、腺昔(adenosine)、柯因(chrysin)、11-二十醇(11-eicosenol)及松属素(pinocembrin)中的至少一种作为非蛋白质成分。并且，上述化妆品组合物包含选自蜂毒肽、磷脂酶A-2、肥大细胞脱粒肽(MCD peptide，Mast cell degran ulating)中的至少一种作为蛋白质成分。在上述化妆品组合物中，优选地，以总化妆品组合物的0.0001?2重量百分比包含作为上述有效成分的蜂毒水溶性分馏物和脂溶性分馏物。优选地，上述化妆品组合物为皮肤皱纹改善用化妆品。
[0011]为了达成再一上述目的，根据本发明，提供化妆品组合物的制备方法，上述化妆品组合物的制备方法包括:步骤S10，利用水溶性溶剂和脂溶性溶剂来对蜂毒进行第一次分馏；步骤S20，向所分馏的第一水溶性层添加脂溶性溶剂来进行第二次分馏；步骤S30，向所分馏的第二水溶性层添加脂溶性溶剂来进行第三次分馏；步骤S40，对所分馏的第三水溶性层进行过滤来去除不溶性成分，从而准备水溶性分馏物；步骤S50，向第一次分馏的第一脂溶性层添加第二次分馏的脂溶性层和第三次分馏的脂溶性层之后进行过滤来去除不溶性成分，从而准备脂溶性分馏物；步骤S60，以0.01?0.5:1的体积比例混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物；以及步骤S70，对在上述步骤S60中得到的混合物进行浓缩及干燥。
[0012]为了达成另一上述目的，根据本发明，提供化妆品组合物的另一种制备方法，上述化妆品组合物的另一种制备方法包括:步骤S11，利用水溶性溶剂来提取蜂毒；步骤S21，对利用水溶性溶剂来提取的蜂毒进行离心分离，并取出水溶性层进行过滤，来去除不溶性成分，从而准备水溶性分馏物；步骤S31，对离心分离的残渣进行干燥来去除水溶性溶剂；步骤S41，向上述残渣添加脂溶性溶剂来进行提取；步骤S51，对利用脂溶性溶剂来提取的蜂毒进行过滤来去除不溶性成分，从而准备脂溶性分馏物；步骤S61，以0.01?0.5:1的体积比混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物；以及步骤S71，对在上述步骤S61中得到的混合物进行浓缩及干燥。
[0013]此时，上述脂溶性溶剂能够使用选自由乙酸乙酯、氯仿、醚及丁醇组成的组中的至少一种，上述水溶性溶剂可使用选自由水、乙醇及甲醇组成的组中的至少一种。
[0014]发明的效果
[0015]根据本发明的上述制备方法制备的以特定比例混合蜂毒的脂溶性分馏物和水溶性分馏物的蜂毒提取物具有改善皮肤皱纹之类的优秀的抗老化活性。
【附图说明】
[0016]图1为表不本发明一实施例的提取物的制备工序的图。
[0017]图2为表不本发明另一实施例的提取物的制备工序的图。
[0018]图3为表示本发明实施例的试样的细胞毒性试验结果的图。
[0019]图4为表示本发明实施例的试样的基质金属蛋白酶-1 (MMP-1，Matrixmetalloproteinase-1)表达抑制试验结果的图。
[0020]图5为表示本发明实施例的试样的前胶原-1合成效果试验结果的图。
[0021]图6为表示本发明实施例的试样的抗氧化损伤活性试验的结果的图。
【具体实施方式】
[0022]以下，具体说明本发明。
[0023]蜂毒由水溶性成分、脂溶性成分及不溶性成分组成。以往的蜂毒的利用主要局限于水溶性分馏物中以蜂毒肽等作为主要成分的蛋白质或肽分馏物。本发明的技术特征如下:利用蜂毒的脂溶性分馏物，从而将蜂毒的非蛋白、非肽分馏物与肽分馏物等适当地重新调节来利用，进而使用为抗老化用组合物的原料。
[0024]根据一具体例，本发明的化妆品组合物通过如下方法制备而得(图1)。
[0025]本发明提供化妆品组合物的制备方法，上述化妆品组合物的制备方法包括:步骤S10，利用水溶性溶剂和脂溶性溶剂来对蜂毒进行第一次分馏；步骤S20，向所分馏的第一水溶性层添加脂溶性溶剂来进行第二次分馏；步骤S30，向所分馏的第二水溶性层添加脂溶性溶剂来进行第三次分馏；步骤S40，对所分馏的第三水溶性层进行过滤来去除不溶性成分，从而准备水溶性分馏物；步骤S50，向第一次分馏的第一脂溶性层添加第二次分馏的脂溶性层和第三次分馏的脂溶性层之后进行过滤来去除不溶性成分，从而准备脂溶性分馏物；步骤S60，以0.01?0.5:1的体积比例混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物；以及步骤S70，对在上述步骤S60中得到的混合物进行浓缩及干燥。根据本发明的一实施例，如图1中所确认，作为水溶性溶剂使用了蒸馏水，作为脂溶性溶剂使用了乙酸乙酯(EA)。
[0026]根据另一具体例，本发明的化妆品组合物通过如下方法制备而得(图2)。
[0027]本发明提供化妆品组合物的另一种制备方法，上述化妆品组合物的另一种制备方法包括:步骤S11，利用水溶性溶剂来提取蜂毒；步骤S21，对利用水溶性溶剂来提取的蜂毒进行离心分离，并取出水溶性层进行过滤，来去除不溶性成分，从而准备水溶性分馏物；步骤S31，对离心分离的残渣进行干燥来去除水溶性溶剂；步骤S41，向上述残渣添加脂溶性溶剂来进行提取；步骤S51，对利用脂溶性溶剂来提取的蜂毒进行过滤来去除不溶性成分，从而准备脂溶性分馏物；步骤S61，以0.01?0.5:1的体积比混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物；以及步骤S71，对在上述步骤S61中得到的混合物进行浓缩及干燥。此时，作为上述脂溶性溶剂使用了氯仿，作为上述水溶性溶剂使用了蒸馏水。根据一具体例，能够通过如下方法制备而得。将1.0g的蜂毒放入烧杯，并添加10ml的蒸馏水来进行提取。在3000rpm下，离心分离10分钟来分离并取出水溶性层(DW层，蒸馏水层)之后，进行过滤来去除不溶性成分，并保管水溶性层。对离心分离的残渣进行干燥来去除残留的微量的蒸馏水。向经干燥的残渣添加200ml的氯仿来提取之后，进行过滤来去除不溶性成分，再准备氯仿层。在混合蒸馏水层和氯仿层之后进行浓缩及干燥。
[0028]调查了通过上述制备方法得到的各分馏物的成分谱(profile)。由此可知，上述提取物中，包含有胞苷(cytidine)、腺苷(adenosine)、柯因(chrysin)、11-二十醇(11-eicosenol)、松属素(pinocembrin)作为非蛋白质成分。并且，可以确认到包含有蜂毒肽、磷脂酶A-2、蜂毒明肽、肥大细胞脱粒肽作为蛋白质成分。
[0029]在混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物的过程中，改变其混合比例来进行试验，其结果，在将脂溶性分馏物和水溶性分馏物的混合比例作为1:0.01?0.2的体积比的情况下，更具体地，作为1:0.1?0.2的体积比的情况下，尤其可以确认到对氧化损伤的恢复活性优秀。
[0030]在上述化妆品组合物中，优选地，以总化妆品组合物的0.001?20重量百分比包含作为上述有效成分的蜂毒水溶性分馏物和脂溶性分馏物。
[0031]在将本发明的上述蜂毒提取物进行抗老化用化妆品制剂化的情况下，可利用通常所使用的填充剂、增量剂、粘结剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来进行调配。并且，除了作为单纯的稀释剂的水、液体石蜡之外，包含多种赋形剂、灭菌的水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制剂等。作为非水溶剂、悬浮剂可使用丙二醇(propyleneglycol)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、油酸乙醋(ethyl oleate)之类的醋及橄榄油之类的植物油。
[0032]实施例
[0033]实施例1:包含脂溶性分馏物的提取物的制备
[0034]将2.5g的未纯化的蜂毒(CBV)放入烧杯，并溶解于10ml的蒸馏水(DW)中。将所溶解的蜂毒放入分馏漏斗，并一边用150ml的蒸馏水来清洗烧杯的内壁一边添加蒸馏水。放入250ml的乙酸乙醋(EA，Ethyl acetate)，并摇勾来进行混合。通过分饱漏斗放置由此混合的乙酸乙酯和蒸馏水的混合液，并打开盖来排出压力。若这样放置，则乙酸乙酯层和蒸馏水层因性质上的差异而分离。通过烧杯接收如此分离的上层(乙酸乙酯)和下层(蒸馏水)中的位于下层的蒸馏水。此时，单独分离上层之后接收。若将所分离的蒸馏水层放入分馏漏斗，放入250ml的乙酸 乙酯，均匀混合后放置，则上层和下层会分离。单独分离了上层(乙酸乙酯)。将下层(蒸馏水)放入分馏漏斗，再放入250ml的乙酸乙酯后进行混合来分离，从而分离了上层(乙酸乙酯)和下层(蒸馏水)。将分离并放置的各乙酸乙酯层进行混合之后，去除不溶成分，从而制备了脂溶性分馏物。并且，从所分离的蒸馏水层中去除不溶成分来制备了水溶性分馏物。在以0.5:1的体积比例混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物之后，进行浓缩并干燥。
[0035]将上述试样溶解于溶剂来使用为试样。
[0036]实施例2:包含脂溶性分馏物的提取物的制备
[0037]除了在上述实施例1中以0.3:1的体积比混合水溶性分馏物和脂溶性分馏物之夕卜，以与上述实施例1相同的方法制备了提取物。
[0038]实施例3:包含脂溶性分馏物的提取物的制备
[0039]除了在上述实施例1中以0.2:1的体积比混合水溶性分馏物和脂溶性分馏物之夕卜，以与上述实施例1相同的方法制备了提取物。
[0040]实施例4:包含脂溶性分馏物的提取物的制备
[0041]除了在上述实施例1中以0.1:1的体积比混合水溶性分馏物和脂溶性分馏物之夕卜，以与上述实施例1相同的方法制备了提取物。
[0042]实施例5:包含脂溶性分馏物的提取物的制备
[0043]除了在上述实施例1中以0.01:1的体积比混合水溶性分馏物和脂溶性分馏物之夕卜，以与上述实施例1相同的方法制备了提取物。
[0044]将在上述实施例中制备的提取物作为试样，来进行了抗老化功效的试验。
[0045]试验例1:细胞毒性实验
[0046]细胞增殖使用EZ-cytox增强细胞活力检测试剂盒(EZ-cytox Enha need CellViability Assay Kit)(韩国戴伊实验室(Daeil Lab，Korea))来进行测定，并根据制造人员的指示来进行了实验。以每孔(well)有5000个细胞(cell)的方式，将成纤维细胞(正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF，normal human dermal fibroblasts))分株于48孔板(wellplate)，并在添加了 I %的胎牛血清(FBS，fetal calf serum)的达尔伯克氏必需基本培养基(DMEM，dulbecco’s minimum essential medium) (low glucose，低葡萄糖)中，在37°C温度下培养了一天。按不同浓度对实施例1的提取物(脂质及水溶性蜂毒(LWBV-Lipid andWater soluble bee venom))进行处理，并在培养24小时、48小时之后，执行了细胞计数试剂盒(CCK，Cell Counting Kit)检测(assay)。添加达到培养基的10%的检测(Assay)试剂，与培养条件相同地培养2小时，并利用GNM酶标仪(gnm microplate reader)(美国伯乐(B1-Rad，USA))来在450nm下测定了吸光度。
[0047]将其结果示于图3中。如在图3中所确认，在所使用的浓度中，脂质及水溶性蜂毒未对成纤维细胞呈现毒性。
[0048]试验例2:MMP-1表达抑制效果
[0049]对于成纤维细胞(human dermal fibroblast)，按不同浓度将上述实施例1至实施例5的蜂毒提取物进行预处理之后，使上述成纤维细胞露出于作为不引起细胞凋亡的浓度的200uM的过氧化氢中，并培养24小时之后分离信使核糖核酸(mRNA，messenger RNA)，从而通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR， reverse transcript1n-polymerase chainreact1n)方法确认了 MMP-1的基因表达水平。
[0050]将其结果示于图4中。借助过氧化氢增加了成纤维细胞的MMP-1表达(H200)，多种蜂毒提取物整体上减少了 MMP-1表达，尤其，实施例1的蜂毒提取物(BVl)呈现了优秀的效果。在图4中，乙型肝炎病毒1-1 (HBV1-1，hepatitis b virus 1-1)是指以I μ g/ml的浓度处理上述实施例1的蜂毒提取物之后露出于过氧化氢的试样。同样，HBV4-0.1是指以0.1 μ g/ml的浓度处理上述实施例4的蜂毒提取物之后露出于过氧化氢的试样。
[0051]试验例3:前胶原-1合成效果
[0052]对于成纤维细胞(human dermal fibroblast)，按不同浓度将上述实施例1至实施例5的蜂毒提取物预处理之后，使上述成纤维细胞露出于200uM的过氧化氢中，并培养24小时之后，从细胞分离蛋白质，并通过免疫印迹法(western blot)确认了前胶原-1的合成量。
[0053]将其结果示于图5中。过氧化氢抑制了成纤维细胞的胶原蛋白的合成，上述实施例的蜂毒提取物全部增加了胶原蛋白的合成。
[0054]试验例4:抗氧化损伤效果
[0055]为了确认基于特定蜂毒分馏物的氧化应激的抗氧化损伤活性，实施了如下实验。对于成纤维细胞(human dermal fibroblast)，按不同浓度将上述实施例3至实施例5的蜂毒提取物预处理之后，使上述成纤维细胞露出于400uM的过氧化氢中，并培养24小时之后，分析基于氧化损伤的MMP-1和前胶原的表达变化，从而了解了避免细胞受到氧化损伤的功能及老化调节能力。
[0056]将其结果示于图6中。在图6中，各数字表示以下条件。
[0057]I:N.C，2:H202400uM，3:实施例 5 3ug/ml，4:实施例 3 2ug/ml，5:实施例 3 3ug/ml，6:实施例 4 2ug/ml，7:实施例 4 3ug/ml，8:实施例 5 3ug/ml+H202400uM，9:实施例 32ug/ml+H202400uM，10:实施例 3 3ug/ml+H202400uM，11:实施例 4 2ug/ml+H202400uM，12:实施例 4 3ug/ml+H20240 0uM
[0058]如在图6中所确认，实施例5和实施例3的提取物呈现使被过氧化氢处理减少的前胶原的量恢复的效果。在实施例4的情况下，可知对使前胶原和MMP-1的表达全部恢复到氧化损伤之前的水平非常有效。像这样，可以确认到实施例3至实施例5的提取物具有避免细胞受到氧化损伤的非常优秀的活性。
[0059]如在上述试验例中所确认，在处理本发明实施例的组合物的情况下，真皮的组织周转(turnover)增加，从而增进胶原蛋白的合成，并抑制胶原蛋白的分解。这意味着当本发明的蜂毒提取物露出于生成自由基的应激时，不仅具有调节细胞外基质(ECM，extracellular matrix)的代谢的保护效果，而且还具有诱导新的胶原蛋白的合成的活化效应(rejuvenat1n effect)，从而可有用地使用为抗老化化妆品。
[0060]产业上的可利用性
[0061 ] 根据本发明制备的以特定比例混合有蜂毒的脂溶性分馏物和水溶性分馏物的蜂毒提取物具有优秀的抗氧化损伤活性，以使改善皮肤皱纹之类的抗老化活性优秀，从而可有用地利用于化妆品产业。
【主权项】
1.一种化妆品组合物，其特征在于，以1:0.01?0.5的体积比例包含由脂溶性溶剂所分馏的蜂毒的脂溶性分馏物和由水溶性溶剂所分馏的水溶性分馏物。2.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，以1:0.01?0.2的体积比例包含上述脂溶性分馏物和水溶性分馏物。3.根据权利要求2所述的化妆品组合物，其特征在于，以1:0.1?0.2的体积比例包含上述脂溶性分馏物和水溶性分馏物，来具有避免皮肤受到氧化损伤的功能。4.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，上述脂溶性溶剂为选自由乙酸乙酯、氯仿、醚及丁醇组成的组中的至少一种。5.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，上述水溶性溶剂为选自由水、乙醇及甲醇组成的组中的至少一种。6.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，上述化妆品组合物包含选自胞苷、腺苷、柯因、11-二十醇及松属素中的至少一种作为非蛋白质成分。7.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，上述化妆品组合物包含选自蜂毒肽、磷脂酶A-2、肥大细胞脱粒肽中的至少一种作为蛋白质成分。8.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，上述化妆品组合物为皮肤皱纹改善用化妆品。9.一种化妆品组合物的制备方法，其特征在于，包括: 步骤(SlO)，利用水溶性溶剂和脂溶性溶剂来对蜂毒进行第一次分馏； 步骤(S20)，向所分馏的第一水溶性层添加脂溶性溶剂来进行第二次分馏； 步骤(S30)，向所分馏的第二水溶性层添加脂溶性溶剂来进行第三次分馏； 步骤(S40)，对所分馏的第三水溶性层进行过滤来去除不溶性成分，从而准备水溶性分馏物； 步骤(S50)，向第一次分馏的第一脂溶性层添加第二次分馏的脂溶性层和第三次分馏的脂溶性层之后进行过滤来去除不溶性成分，从而准备脂溶性分馏物； 步骤(S60)，以0.01?0.5:1的体积比例混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物；以及 步骤(S70)，对在上述步骤(S60)中得到的混合物进行浓缩及干燥。10.一种化妆品组合物的制备方法，其特征在于，包括: 步骤(Sll)，利用水溶性溶剂来提取蜂毒； 步骤(S21)，对利用水溶性溶剂来提取的蜂毒进行离心分离，并取出水溶性层进行过滤，来去除不溶性成分，从而准备水溶性分馏物； 步骤(S31)，对离心分离的残渣进行干燥来去除水溶性溶剂； 步骤(S41)，向上述残渣添加脂溶性溶剂来进行提取； 步骤(S51)，对利用脂溶性溶剂来提取的蜂毒进行过滤来去除不溶性成分，从而准备脂溶性分馏物； 步骤(S61)，以0.01?0.5:1的体积比混合上述水溶性分馏物和脂溶性分馏物；以及 步骤(S71)，对在上述步骤(S61)中得到的混合物进行浓缩及干燥。11.根据权利要求9或10所述的化妆品组合物的制备方法，其特征在于，上述脂溶性溶剂能够使用选自由乙酸乙酯、氯仿、醚及丁醇组成的组中的至少一种，上述水溶性溶剂使用 选自由水、乙醇及甲醇组成的组中的至少一种。
【专利摘要】本发明涉及利用蜂毒的皮肤老化改善用化妆品，更详细地涉及包含蜂毒的脂溶性成分而具有改善皮肤皱纹之类的抗老化效果的化妆品组合物。根据本发明，提供以1:0.01～0.5的体积比例包含由脂溶性溶剂所分馏的蜂毒的脂溶性分馏物和由水溶性溶剂所分馏的水溶性分馏物的化妆品组合物。
【IPC分类】A61K8/98, A61Q19/08, A61P17/14, A61Q19/00
【公开号】CN104902871
【申请号】CN201380061546
【发明人】安昌基, 朴辰奎, 全钟云
【申请人】飞森有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月25日
【公告号】EP2923693A1, US20150297505, WO2014081255A1
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