生物相容性涂层组合物的制作方法
生物相容性涂层组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请是要求2013年1月7日提交的美国临时申请61/749, 495号的优先权益的 PCT申请，其整个内容特此以引用的方式并入。
[0003] 联邦政府资助研宄的声明
[0004] 本发明受政府支持以美国国家卫生研宄院（NationalInstitutesofHealth)授 权编号R01HL082631和R42HL084807研发。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
[0005] 本发明一般地涉及生物相容性涂层组合物。更具体地，本发明涉及用于渗透膜表 面的血液相容性、抗凝血和不凝血、肝素基生物活性涂层。
[0006] 发明背景
[0007] 在美国肺病可能成为仅次于心血管疾病和癌症的第三杀手。（Lungdisease data2008.AmericanLungAssociation,http://www.lungusa.org/about~us/ publications/(2011年7月访问））。在美国每年有成千上万的死亡归因于肺部原因， 花费数千亿美元。MHL。目前，不可逆性和慢性肺病仅可通过肺移植治疗（胃w.ISHLT. 〇rR)〇每年成人呼吸窘迫综合征（ARDS)折磨着150, 000名美国患者，发病率为30-50 % (Demling,R. ,Themodernversionofadultrespiratorydistresssyndrome.AnnRev Med, 1995. 46:第 193-202 页；ZwischenbergerJB，C.S.，AlpardSK等，Percutaneous extracorporealarteriovenousC02removalforsevererespiratoryfailure.Ann ThoracSurg，1999. 68 :第181-7页）。在临床上可合理地引入人工肺作为移植的临时桥梁 和作为ARDS的急性短期治疗。
[0008] 聚合中空纤维膜（HFM)是膜式氧合器的整体部分并且具有经过极大改变的血液 氧合系统。然而HFM易于蛋白质吸附、血小板粘附及血栓沉积物形成和粘附。因此，与合成 HFM接触的血流具有活化凝血和炎症的细胞和分子组分的潜力。人造血液接触表面通过接 触活化、蛋白质吸附及元素活化和吸附的现象引起材料诱导的血液损伤，最终可导致炎症 和临床不良反应（图1)。具体而言，与任何其它接触血液的人工器官相比，血液氧合器和人 工肺使用较大表面积并延长停留时间以达到高气体交换率。当患者需要长期支撑时，这就 成问题。将血栓形成减到最少的一种解决方案是通过向患者的血液中引入抗凝血剂例如肝 素维持全身抗凝作用。然而，抗凝血剂过量可导致出血风险。
[0009] 第二种解决方案是为氧合器和人工肺的血液接触表面提供生物相容性涂层以减 少全身抗凝作用的所需量并且将表面诱导的血栓形成（或）归因于表面的血液活化和凝固 减到最少。许多研宄已经证实肝素基生物活性表面改性和非肝素基生物非活性涂层方法提 供了有益效果。然而，这些涂层中的许多的抗凝特性仅持续短时间并且不能用于长期支撑。
[0010] 因此，需要在长期使用期间维持其结构完整性和不凝血特性的不凝血生物相容性 涂层。
【发明内容】
[0011] 根据非限制性示例实施方案，本发明提供了不凝血生物相容性涂层。
[0012] 在示例实施方案中，提供了季铵盐和肝素复合物（QUAT)涂层。本文提供的QUAT涂 层的示例性实施方案包括使用溶于包括大量醇连同少量有机溶解剂例如四氢呋喃（THF)、 甲苯、石油醚等的溶剂混合物中的离子络合物进行的HFM或其它膜或表面的表面改性。 在其它实施方案中，主要涂布聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，接着稍后涂布季铵盐和肝素复合物 (PVP-QUAT)。PVP-QUAT涂层旨在血液与表面接触期间诱导混杂PVP的不凝血效应与肝素的 抗凝血效应。
[0013] 另外的示例实施方案涉及制备涂层并将涂层涂到表面，例如渗透膜表面的方法。 进一步提供了已经涂布的氧合器设备和人工肺及包括此类涂层的试剂盒。
[0014] 附图简述
[0015] 本文参考以下附图描述了非限制性示例实施方案：
[0016] 图1是描绘血液与氧合器的中空纤维膜相互作用的结果的流程图。
[0017] 图2说明了通过中空纤维膜氧合的原理。图2A显示了通过中空纤维膜和通过一 系列作为底板的一部分的此类膜的氧气和二氧化碳流。图2B显示了在放大的摄影、光学和 电子显微镜水平下，中空纤维膜的表面和横截面特征。
[0018] 图3显示了用于维持肝素涂层的血液相容性的固定表面的示意图。图3A是指出 了肝素化表面维持血液相容性的原理的示意图。图3B描绘了在中空纤维膜表面上涂布季 铵盐和肝素的原理。图3C描绘了在中空纤维膜表面上涂布PVP、季铵盐和肝素的原理。
[0019] 图4是描绘了Corline肝素表面（CHS)涂层纤维、Quat-肝素复合物涂层纤维及 PVP和Quat-肝素复合物涂层纤维上固定肝素水平的图表。
[0020] 图5显示了在HFM表面上吸附的纤维蛋白原的量。
[0021] 图6显示了在HFM表面上粘附的血小板的量。
[0022] 图7描绘了当前涂层的体外血液接触表面连同无涂层的和一些商用涂层HFM表面 的扫描电子显微镜观察结果。
[0023] 图8显示了由图7的HFM表面估计的血栓量。
[0024] 图9根据示例实施方案显示了季铵卤化物的示例结构。
【具体实施方式】
[0025] 本发明涉及不凝血和抗凝血、生物相容性涂层及制备和使用此类涂层的方法。还 提供了已经涂布的氧合器设备和人工肺及包括此类涂层的试剂盒。
[0026] 鉴于以下详细描述，连同附图一起，本发明示例实施方案另外的方面、优点和/或 其它特征将变得显而易见。本领域中的技术人员应显而易见的是，本文提供的实施方案仅 为示例性和说明性而非限制性。其修改的许多实施方案视为属于本公开及其等效方案的范 围之内。
[0027] 虽然将示例实施方案描述为连同血液氧合系统中的中空纤维膜一起使用，但是应 理解这些涂层可用于其它目的，因此本发明不限于此类应用。鉴于本文提供的教导，本领域 中的普通技术人员将认识到可使用本发明的涂层的其它应用。因此，本领域中的普通技术 人员将能够将本发明的涂层和方法用于其它应用中。因此，旨在使这些备选用途成为本发 明的一部分。
[0028]本说明书中提到的所有出版物均表明了本发明所属领域中技术人员的水平。本文 的所有专利和出版物均以引用的方式并入，如同特别单独地指出将每个单独的出版物以引 用的方式整体并入一样。
[0029]在描述示例实施方案时，为清楚起见采用了特定术语。然而，并非旨在将实施方案 限于该特定术语。除非另外指出，根据传统用法使用技术术语。
[0030] 如本文所使用，"一种"或"一个"可意为一个或多个。如本文所使用，"另一个"可 意为至少第二个或多个。此外，除非上下文另有要求，单数术语包括复数并且复数术语包括 单数。
[0031] 如本文所使用，关于要涂到例如膜（例如中空纤维膜）的至少一个表面上，形成氧 合器的一部分的涂层组合物，术语"涂层"、"涂层组合物"和"组合物"有时可交换使用。涂 层的此类应用可在首先施加的底漆或其它层或处理之上。因此涂层可能不直接接触表面。 同样，涂层可能完全或可能不完全涂布特定表面或表面的一部分。本文提供的涂层可极薄 (例如，小于100纳米厚）并且透明。经直接目测，在涂层和非涂层中空纤维膜表面之间可 能不会出现任何差异。因此，将涂层视为血液和膜表面之间透气的血液相容性界面。
[0032] 如本文所使用，术语"中空纤维膜"或"HFM"可交换用于指通过氧气向血液中和二 氧化碳向与之接触的气相中扩散的过程使血液氧合成为可能的小的半渗透毛细管。流动血 液围绕HFM且有氧流过其内腔描述了如图2A所示氧合的原理。由于血液和氧气借助于扩 散的逆流作用，二氧化碳连同残留氧气一起离开底部。可将HFM捆在一起以维持完整性和 增加血液氧合效率。
[0033] 图2B中不出了说明不例HFM的外表面特征和横截面特征的一系列光学和扫描电 子显微镜图像。HFM易于蛋白质吸附、血小板粘附及血栓沉积物形成和粘附。血栓沉积物抑 制气体转移并因此限制其使用的持续时间。本发明提供了生物相容性涂层以降低血栓沉积 的程度，这样允许长期使用氧合系统。
[0034] 图3A指出了肝素化表面在衬底301上保持其血液相容性的原理。固定在衬底301 上的肝素302提供了活性ATIII位点340。当其二者结合在一起产生血酶-抗凝血酶（AT III)复合物（TAT) 320中和结果时，凝血酶310的潜在血栓形成剂通过抗凝血酶330减少。 由此当TAT复合物与活性ATIII位点340结合时，凝血酶310灭活。
[0035] 涂层组合物
[0036] 本发明的非限制性示例实施方案提供了季铵盐和肝素复合物（QUAT)涂层组合 物。具体而言，本文提供了包括含季铵盐和肝素复合物（QUAT)的血液相容性、肝素基生物 活性涂层的生物相容性涂层组合物。例如图9中所示，所述结构可包括其正氮离子与肝素 的一些负离子经离子键结合的特定线性季铵卤化物。季铵卤化物的一些正氮离子与膜表面 获得的官能团的负离子结合。所述涂层可为抗凝血性和不凝血性。
[0037] 其它示例实施方案提供了PVP底漆季铵盐和肝素复合物（PVP-QUAT)涂层。具体 而言，这些涂层组合物的实例包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP)的涂层，接着是所述季铵盐和肝 素复合物（PVP-QUAT)的涂层以形成PVP-QUAT涂层。
[0038] HFM表面阴离子官能团的生成：
[0039]使尺寸为Icm2的PMP-Oxyplus HFM的外表面接触普通甲醇溶剂（或）70体积％甲 醇和30体积％四氢呋喃（THF)的溶剂混合物在HFM表面产生最大的负离子密度。通过在HFM上吸附甲苯胺蓝（阳离子或+离子）染料确认这些位点（或负离子）的存在和密度。 通过按0.005至0.05重量％的范围将甲苯胺蓝溶于含0.2重量％NaCl的0.OlNHCl溶 液中制备甲苯胺蓝的独立溶液。经证实，Icm2表面积的HFM能够从Iml溶液吸附最多0. 05 重量％的甲苯胺蓝。因为甲苯胺蓝是相对于带正电的氮离子，具有与阳离子季铵卤化物类 似特征的阳离子染料，所以在估计表面固定所需的季铵卤化物的量时将甲苯胺蓝用作标准 物。
[0040] 本发明人已经发现单独的醇对肝素和季铵卤化物的复合物的溶解能力有所限制。 本发明人已经发现THF或甲苯或本文的其它有机溶剂将增强溶解能力。因此，根据非限制 示例实施方案，可使用具有70-100体积％甲醇（或其它醇或包括甲醇、乙醇和/或丙醇的 醇混合物）和0-30体积％THF的溶剂混合物。根据 另外的非限制示例实施方案，溶剂混合 物可包括70-80体积％甲醇（或其它醇或包括甲醇、乙醇和/或丙醇的醇混合物）和20-30 体积％的THF。溶剂混合物也可任选地包括按体积计，量高达10%的附加少量有机试剂例 如甲苯、石油醚、醚、苯等的存在。随着添加剂例如甲苯、醚和其它有机试剂的增加，可能对 中空纤维膜的完整性存在不良影响。因此，可将其在最终涂层溶液中的量限制为低于10%。 因此，根据示例实施方案，所述混合物可主要为纯，100%醇是溶剂的极限；附加试剂预期主 要用作肝素和季铵盐的复合物的溶解剂。发现THF对膜具有更少的不良影响并且其在醇溶 剂中的浓度可高达30%。
[0041] 合成涂层组合物的方法
[0042] 季铵盐和肝素复合物（Quat-肝素复合物）的合成
[0043] 将5g肝素溶于100mL去离子水中的第一溶于按逐滴方式与含有溶于醇中的疏水 性季铵盐或一种或多种疏水性季铵盐的混合物，有或无一种或多种亲水性季铵盐的混合物 的第二溶液混合。即，第二溶液可包括例如溶于醇中的卤化季盐。第二溶液的这些卤化物 可为一种或多种。但是，根据示例实施方案，溶液的主要量应包含疏水性特征。
[0044] 所述盐可为来自于具有至少一个是从C7H^IjC18H37的普通或取代的长链脂族 基的基团的长链线性脂肪族烷基季铵盐类型的任一种（Rahn，Otto和WilliamP.Van Eseltine.''Quaternaryammoniumcompounds.''AnnualReviewsinMicrobiology 1，no.I(1947): 173-192)。维持甲醇溶液中盐的量，以致对于肝素的每个四糖单元 而言，存在阳离子线性季铵卤化物的5至15个胺位点（Falb，R.D.、Grode，G.A.、 Takahashi,M.T?和Leininger,R.I. (1968) ?CharacteristicsofHeparinizedSurfaces. InteractionofLiquidsatSolidSubstrates,Alexander,AL编辑，AmericanChemical Society,Washington,DC) 〇
[0045] 因此，根据非限制性示例实施方案，本文提供了制备不凝血生物相容性涂层的方 法，所述方法包括将溶于水中的肝素溶液与包括溶于醇中的疏水性季铵盐或包含一种或多 种疏水性季铵盐的混合物、有或无一种或多种亲水性季铵盐的混合物的溶液混合。根据另 外的实施方案，所述盐可包括具有至少一个是从C7H1^IjC18H37的普通或取代的长链脂族基 的基团的一种或多种长链线性脂肪族烷基季铵盐。所述混合可按逐滴方式进行。
[0046] 可用其它类型的有机或无机溶剂例如缓冲溶液、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、石油 醚、苯等代替或改性用于溶解肝素和（或）Quat的溶剂。经鉴定甲醇是用于溶解季铵卤化物 的优选（但非限制性）溶剂。另外，甲醇对HFM的机械完整性和结构没有破坏性影响。根 据示例实施方案，可使用其它醇或包括甲醇、乙醇和/或丙醇的醇混合物。可优选但不限于 诸如四氢呋喃、丙酮、甲苯、石脑油、正庚烷、环己烷、正己烷、醚、石油醚、苯等溶剂，作为季 铵卤化物和肝素的复合物另外的可能有机溶解剂。然而，因为过量的有机溶剂可在化学、物 理和机械上损害HFM，所以在制备最终涂层溶液时，可使用可能最低量的这些溶剂。举例而 言，根据示例实施方案，可将四氢呋喃限制为例如，总涂层溶液的最多30体积％。如果使用 甲苯，根据示例实施方案，可能不超过涂层溶液的10体积％。如果使用石油醚，根据示例实 施方案，可能不超过总涂层溶液的5体积％。
[0047] 根据示例实施方案，本文提供了涂布膜表面例如中空纤维膜（HFM)表面的方法， 所述方法包括在所述HFM的一个或多个表面产生阴离子官能团。本文还提供了通过使用溶 于溶剂混合物中的离子络合物使所述HFM的表面改性，在HFM的一个或多个表面产生的阴 离子官能团。溶剂混合物可包括大量的醇连同少量的有机溶解剂。根据非限制性示例实施 方案，有机溶解剂包含四氢呋喃（THF)、甲苯和石油醚中的一种或多种。如上所述，溶剂混合 物可包括70-100体积％甲醇和0-30体积％的THF。
[0048] 表1中呈现了季铵卤化物和肝素的详情。
[0049] 表1:涂到Oxyplus PMP-HFM外表面的季铵盐和肝素的详情
[0050]
[0051] 在混合过程中，确保搅拌后一种溶液以每次在包含Quat-肝素复合物及悬浮于水 和醇的溶剂组合中富含肝素的Quat和富含Quat的肝素的残留颗粒的胶体溶液旁边暴露全 新的高表面积接触物。使用离心和等分试样分离的方法，小心地分离这种溶液的呈致密球 粒形式的悬浮沉淀和颗粒。致密指由于离心和重力效应从液体中下降的聚合沉淀的固体形 式。每次用新鲜的去离子水和醇溶剂混合物洗涤致密沉淀。丢弃等分试样，使用冷冻干燥 法，在KT3mmHg的真空下从所述复合物中排出残留液体。在-20°C以下储存这样获得的无 水复合物。称取这种复合物，研磨成细小颗粒并且最后溶于包括60-90重量％的醇，其余为 四氢呋喃（THF)、甲苯、石油醚和/或其它试剂的溶剂组合中。
[0052] 因此，根据示例实施方案，在本方法中混合产生包含Quat-肝素复合物及悬浮于 水和醇的溶剂组合中富含肝素的Quat和富含Quat的肝素的残留颗粒的胶体溶液。所述方 法还包括使用离心和等分试样分离，分离这种溶液的呈致密球粒形式的悬浮沉淀和颗粒。 此类方法还包括用新鲜的去离子水和醇溶剂混合物洗涤致密沉淀一次或多次；并且丢弃等 分试样并从所述复合物中排出残留液体。
[0053] 如上所述，根据非限制性示例实施方案，在本方法中通过所述方法获得的复合物 储存在-20°C以下。
[0054] 所述方法还可包括称取所得复合物并将复合物研磨成细小颗粒并且将复合物溶 于包含60-90重量％的醇，其余为至少一种试剂的溶剂组合中。所述试剂可包括选自四氢 呋喃（THF)、甲苯和石油醚的至少一种试剂。
[0055] 底漆溶液的制备：
[0056] 根据非限制性示例实施方案，可先用PVP溶液为要涂布的表面涂底漆。具体而言， 单独制备包括〇. 5-0. 9重量％的溶于醇中的聚N-乙烯-2-吡咯烷酮（PVP)的溶液供初始 表面改性的应用并且将这种溶液称为'底漆溶液'。
[0057] 涂布表面或装置的方法：
[0058] 在涂布表面或装置之前，可直接使用溶于富醇溶剂中的Quat-肝素复合物的涂层 溶液涂布中空纤维膜的试验纤维样品或先用溶于醇中的PVPV为纤维涂底漆，接着使用以 上提到的涂层溶液第二次涂布。
[0059] 因此，本文提供了包括用包含PVP的底漆溶液涂布表面，之后用包含季铵盐和肝 素的QUAT溶液涂布所述表面的方法。
[0060] 通过体外抗因子Xa测定法评估底漆和复合物涂层溶液及肝素的活性。确保固定 肝素的活性之后，按照下述程序进行涂布氧合器设备。
[0061] 液体或血液流过并接触氧合器设备表面的路径称为流程。其包括入口、出口、塑性 聚碳酸酯零件、中空纤维膜、磁力驱动的金属推进器和其它塑料管或零件。主要是描述关于 在临床或实验应用期间必须保持与血液接触的所有中空纤维膜的外腔。
[0062] 根据非限制性示例实施方案，为涂布氧合器设备的血液接触表面（例如，HFM表 面），最初通过用纯酒精处理所述设备至少2分钟在所需表面上获得阴离子官能团。先通过 所述设备的血液入口将这种底漆溶液填充到所述设备中。HFM的血液接触表面保持与溶液 接触最少1秒和最多10分钟，或甚至更长。之后，丢弃所述液体并使用惰性气体例如氮气 从氧合器设备中吹出。
[0063] 用纯酒精冲洗氧合器设备的流径确保从其中去除了游离或未吸附的PVP。
[0064] 然后通过氧合器设备的血液入口将溶于醇和THF溶液的Quat-肝素复合物填充到 所述设备中。要与血液接触的所有HFM表面全部浸入涂层溶液中并润湿最少1秒至最多1 分钟。之后，丢弃涂层溶液并使用惰性气体从氧合器设备中吹出。用盐水溶液冲洗氧合器 设备的流径不但确保去除了游离或未固定的复合物，还除去了微量留下的涂层。
[0065] 因此，继续上文，本文提供了至少包括以下步骤的方法：通过氧合器设备的血液入 口，填充包含〇. 5-0. 9重量％的溶于醇中的聚N-乙烯-2-吡咯烷酮（PVP)的溶液；用醇冲 洗以去除PVP;
[0066] 通过氧合器设备的血液入口，填充包含包括溶于醇和THF溶液的季铵盐和肝素复 合物（QUAT)的血液相容性、抗凝血和不凝血、肝素基生物活性涂层的生物相容性涂层组合 物，并且使要与血液接触的表面（例如中空纤维膜（HFM)的一个或多个表面）在涂层溶液 中接触1秒至10分钟。所述方法还可包括M並使用惰性气体从氧合器设备中丢弃并吹出 涂层组合物；并且用盐水溶液冲洗氧合器设备。
[0067]氣合器和人工肺
[0068] 本发明另外的实施方案提供了包括涂有本发明涂层组合物的表面的设备。具体而 言，通过举例的方式，本文提供了包括涂有一种或多种本发明涂层的一个或多个血液接触 表面的氧合器设备。本文进一步提供了包括涂有一种或多种本发明涂层的一个或多个血液 接触表面的人工肺。
[0069] 本文还提供了试剂盒，其包括，例如包含季铵盐和肝素复合物（QUAT)的一种或多 种血液相容性、抗凝血和/或不凝血、肝素基生物活性涂层组合物；和选自例如在要供哺乳 动物使用的氧合器或人工肺上制备或使用此类涂层的说明书中的至少一种附加组分；涂层 的附加组分，可用于涂布表面和/或氧合器、人工肺、HFM或要涂布的其它表面的设备或组 件。本文提供的试剂盒可另外包括可用于形成或使用本发明涂层组合物的一种或多种附加 组分。
[0070] 本发明还包括包含季铵盐和肝素复合物（QUAT)的一种或多种血液相容性、抗凝 血和/或不凝血、肝素基生物活性涂层作为例如渗透膜上的涂层的用途。
[0071] 进一步提供了治疗患者肺病的方法。所述方法可包括例如为供患有肺病的患者使 用的氧合器和/或人工肺的至少一个血液接触表面涂布包含季铵盐和肝素复合物（QUAT) 的一种或多种血液相容性、抗凝血和/或不凝血、肝素基生物活性涂层。方法也可包括向患 有肺病的患者施用在至少一种氧合器和/或人工肺的至少一个血液接触表面具有包含季 铵盐和肝素复合物（QUAT)的一种或多种血液相容性、抗凝血和/或不凝血、肝素基生物活 性涂层的至少一种氧合器和/或人工肺。
[0072] 另外的示例方法可包括为供患有肺病的患者使用的氧合器和/或人工肺的至少 一个血液接触表面涂布包含季铵盐和肝素复合物（QUAT)的一种或多种血液相容性、抗凝 血和/或不凝血、肝素基生物活性涂层，以减少所需全身抗凝作用的量并且将表面诱导的 血栓形成（或）归因于表面的血液活化和凝固减到最少。
[0073] 提供下面的实施例是为了进一步说明各种非限制性实施方案和技术。然而 ，应理 解这些实施例意为说明性而不限制权利要求的范围。对技术人员而言显然，旨在将许多改 变和修改涵盖于本发明的精神和范围之内。
[0074] 实施例
[0075] 实施例1
[0076] 将PVP肝素（PVP-HC)涂层表面上固定肝素的量与肝素涂层表面（HC)和Corline 肝素表面（CHS)作比较。混合200yL的AT-III和25yL浓度为0. 5-15yg/mL的肝素并 且在37°C下温育2分钟。然后将200yL的FXa混入溶液中并且在37°C下温育1分钟。接 下来，将200yL的spectrozymeFXJgA溶液中并且在37°C下温育5分钟。添加200yL 冰醋酸并彻底混合。然后在405nm下测量肝素吸收，这样量化了固定在纤维表面上的肝素 的活性。图4是就通过分光光度计技术测定的吸收读数而论，描绘了已知量的肝素量的活 性的标准直线。在标准曲线上标出了来自于CHS、HC和PVP-HC涂层纤维样品的固定肝素的 量。图4证明PVP-HC具有比HC或CHS样品量高的固定肝素。这表明PVP在保持和维持比 单独肝素更高的活性上具有越来越大的影响。
[0077] 实施例2
[0078] 测试各自涂有本发明的不同示例涂层的HFM以测定其生物相容性和阻碍蛋白质 吸收、血小板粘附及血栓沉积物形成和粘附的能力。然后将这些与无涂层的HFM束及HFM 上的其它市场上可买到的生物相容性涂层比较。表2提供了不同涂层的详情。
[0079]表2
[0080]
[0081] 材料和方法
[0082] 有本发明涂层的HFM
[0083] 使用带有本发明的QUAT涂层和PVP-QUAT涂层的HFM将其功效与无涂层的HFM和 涂有其它市场上可买到的涂层的HFM作比较。使用上述方法制备QUAT和PVP-QUAT涂层 HFM。在PVP-QUAT和QUAT涂布工艺之前，HFM纤维在两端经机械性堵塞以防止血液通过HFM 的内腔进入。
[0084] 商业涂层和无涂层的中空纤维膜样品
[0085] a.无涂层的对照（NON)HFM样品
[0086]这些HFM样品是无涂层的PMP-Oxyplus-Membrana(PMP)(德国Membrana)。纤维在 两端经机械性堵塞以防止血液通过HFM的内腔进入。
[0087] b. CBAS
[0088]从商用Medtronic氧合器上切下CBAS涂层（Larm0,LarssonR，OlssonP.Anew non-thrombogenicsurfacepreparedbyselectivecovalentbindingofheparin viaamodifiedreducingterminalresidue.BiomatMedRevArtifOrgans1983 ； 11:161 - 73)HFM(Primox，Sorin/Dideco,Mirandola，Modena，Italy)DCBAS是一种具生物 活性的涂层方法，其中使用附着过程使肝素分子共价连接到表面。这种涂层不可浸出并且 其化学结构使固定肝素在涂层表面上保持其抗凝血性质更长时间（Rahn，Otto和William P.VanEseltine."Quaternaryammoniumcompounds."AnnualReviewsinMicrobiology 1，no.I(1947) : 173-192)。纤维的切割样品在两端经机械性堵塞以防止液体（血液）通过 HFM的内腔进入。
[0089]c.Phisio
[0090] 从商用Sorin/Dideco氧合器上切下Phisio(磷酰胆碱）涂层HFM(Primox，Sorin/ DidecojMirandola,Modena,Italy,GunaydinS.Emergingtechnologiesin biocompatiblesurfacemodifyingadditives:questforphysiologic cardiopulmonarybypass.CurrMedChem2004;2:295 - 302)。设计磷酰胆喊聚合物 (BiocompatiblesInternationalplc，Farnham，Surrey，UK)以模拟内壁并且为化学惰性。 不存在肝素。纤维的切割样品在两端经机械性堵塞以防止液体（血液）通过HFM的内腔进 入。
[0091] d. Bioline
[0092]从Maquet氧合器上切下Bioline涂层HFM(Quadrox，Maquet-Dynamed，Hirrlingen ，Germany，RP.Wendel等：OxygenatorThrombosis:WorstCaseAfterDevelopmentofan AbnormalPressureGradient-IncidenceandPathway；Perfusion2001，16, 271 - 278)〇 Bioline涂层结合了多肽和肝素。多肽被吸附到(PB表面的组件上。肝素分子经由稳定的 共价键和离子相互作用与多肽连接。纤维的切割样品在两端经机械性堵塞以防止液体（血 液）通过HFM的内腔进入。
[0093]e.Safeline
[0094]从Maquet氧合器上切下Safeline涂层HFM(Quadrox，Maquet-Dynamed，Hirrling en，Germany，H.P.Wendel等：OxygenatorThrombosis:WorstCaseAfterDevelopmentof anAbnormalPressureGradient-IncidenceandPathway；Perfusion2001，16,271-278)Jafeline是涉及用白蛋白添加剂物理细化，赋予暴露于血液的表面亲水性特征的新型 生物非活性涂层。白蛋白添加剂与表面的结合通过静电力和范德华力实现。这种结合高度 稳定，并且在体外循环期间没有添加剂释放到患者血液中。纤维的切割样品在两端经机械 性堵塞以防止液体（血液）通过HFM的内腔进入。
[0095]f.X-涂层
[0096]从CapioxSX18X氧合器上切下X涂层（LyneSchiel，SteveBurns，Atsuhiko Nogawa,RobertRice,TakaoAnzai,MasaruTanaka，X-Coating:ANewBiopassive PolymerCoating，2011，11(2)，第8-17页）或聚（2-甲氧基乙基丙烯酸酯）（PMEA)涂层 的HFM(Capi〇xRXSSJerUn^NJ,USA)。X-涂层具有粘附于PVC管上的疏水性聚乙烯骨架 并且具有与血液接触的亲水层。亲水层防止表面活化并且设计为生物惰性。（UeyamaK、NishimuraK、NishinaT、NakamuraT、IkedaT，、KomedaEPMEAcoatingofpumpcircuit andoxygenatormayattenuatetheearlysystemicinflammatoryresponsein cardiopulmonarybypasssurgery.ASAIOJ. 2004 年 7 月至 8 月；50 (4) :369 - 72.;Ikuta T、FujiiH、ShibataT、HattoriK、HiraiH、KumanoH、SuehiroS.Anewpoly-2-methoxye thylacrylate-coatedcardiopulmonarybypasscircuitpossessessuperiorplatelet preservationandinflammatorysuppressionefficacy.AnnThoracSurg. 2004年 5 月； 77 (5) :1678 - 83)。纤维的切割样品在两端经机械性堵塞以防止液体（血液）通过HFM的 内腔进入。
[0097]HFM的体外蛋白质（纤维蛋白原）吸附评估
[0098] 使用QuickStartBradford蛋白测定法（Bio-Rad)量化被HFM样品的外表面吸 附的纤维蛋白原的量。这种测定法的原理依赖于测量纤维蛋白原通过与考马斯亮蓝G-250 染料结合从水溶液中的损耗量。
[0099] 最初在pH:7. 4溶液的IOmM磷酸盐缓冲盐水（PBS)中冲洗HFM样品，接着在37°C 将其浸入lmg/ml溶于ImlPBS样品溶液中的纤维蛋白原中60分钟。通过混合并且使10 □ 1 样品与200 □ 1溶于PBS溶液中的染料反应，并且进一步通过在595nm下测量吸收量量化 被每个样品的HFM吸附的纤维蛋白原的量。通过线性方程比较样品的吸收量与标准品的吸 收量使得能够量化每个HFM样品表面的纤维蛋白原含量。
[0100] 血液采集及对HFM体外血液相容性的评估：
[0101] 从健康志愿者中采集新鲜的全人血。在ImL全血中用5IU的肝素浓度防止血液凝 固。将无涂层的HFM样品和带有生物相容性涂层的表面改性HFM的样品标记为独立样品并 置于各3ml体积容量的采血管中。在3mL肝素化血液中温育每个样品的纤维并且在37°C下 在血液混合器上摇动3小时，接着用IOmM磷酸盐缓冲盐水（PBS)洗涤6次。
[0102] 用于测定的全血计数分析：
[0103] 从没有纤维的管和与纤维样品接触的9根管取血样。在自动化分析仪（Hemavet) 中测量包括血小板、WBC和RBC在内的血细胞的计数。
[0104] 测定附着于HFM样品表面的血小板的数量
[0105]通过乳酸脱氢酶（LDH)测定法（QuantiChromLDH试剂盒，BioAssaySystems ，CA,DLDH-100, QuantiChrom?，乳酸脱氢酶试剂盒，乳酸脱氢酶活性的比色动力学测定， QuantiChromLDH试剂盒，BioAssaySystems,CA)测定附着于纤维样品上的血小板的数量。 因为血小板含有LDH，所以其将LDH释放到周围液体介质中，经鉴定其处于高于正常的水 平。因此，可将LDH作为估计附着于HFM上的血小板的量度。这是一种非放射性的比色LDH 测定法并且基于在NADH偶联酶促反应中MTT四唑盐还原成在565nm下表现出吸收最大值 的还原形式。形成的紫色强度与酶活性成正比。
[0106] 样品制备：
[0107] 在磷酸盐缓冲盐水（PBSpH:7. 4)中彻底洗涤接触了血液的纤维以便去除松散附 着的血小板和血栓。使纤维匀化于ImL含有IOOmM磷酸钾（pH7. 0)和2mM EDTA的缓冲液 中，接着在4°C下10,OOOg离心15分钟。含有来自于纤维的洗脱血小板的上清液用于测定。 最初，将来自于作物标准品的PRP的已知量的血小板与IOOmM磷酸钾（pH7.0)和2mM EDTA 的溶液混合以便绘制所述测定法的标准线性曲线。通过混合14yLMTT(四唑染料）溶液、 8yLNAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）溶液、 8yLPMS(吩嗪硫酸甲酯）溶液和170yL底物 缓冲液，制备用于这种测定法指示LDH活性的工作试剂。
[0108] 将具有已知量的悬浮于缓冲液中的血小板的100yL样品添加到样品池内100yL 的工作试剂中并彻底混合，注意颜色变化。在酶标仪上读取吸收量0D565nm(0D0)，并且在 25分钟后再次读取（OD25)。绘制与血小板的吸收量差，得到标准曲线。用在Iml缓冲液中 离心纤维样品后获得的IOOmL上清液代替IOOmL已知血小板样品缓冲液重复相同程序。通 过线性方程式比较样品的吸收量差与标准品的吸收量差使得能够量化附着的血小板。
[0109]HFM表面的扫描电子显微镜成像表征：
[0110] 在体外实验后经PBS洗涤的样品HFM于含有戊二醛的普通固定液中固定并准备进 行SEM成像表征。样品经冲洗、脱水、临界点干燥、固定在金属螺栓上并且溅射涂布上金和 钯。用FEIQuanta200高性能热发射柱扫描电子显微镜为样品成像。使用扫描电子显微 镜检查法（SEM)在4kV的加速电压和3-10mm的工作距离下表征沉积在样品表面的血栓的 分布和形态详情。
[0111] 结果：
[0112] HFM试验表面的纤维蛋白原吸附：
[0113] 图5中示出了按单位mg/ml计纤维蛋白原从PBS溶液中吸附的方法后，作为HFM 表面吸收量的指标的PBS中纤维蛋白原的损耗含量。无涂层的和SafeLine涂层表面均显 示出显著量的纤维蛋白原吸附，接着是X涂层、BioLine涂层和CHS涂层表面。我们实验室 的新型肝素涂层H-Q和P-H-Q通过将蛋白质的吸附限制为无涂层样品的约三分之一，对纤 维蛋白原显示出更高抗性。CBAS和Phisio表面在这些新型涂层之后。
[0114] 试验表面的血小板粘附：
[0115] 图6中示出了使用LDF活化研宄量化的粘附血小板的结果。附着于无涂层样品 的血小板大致为纤维表面的2. 50XIOVcm2级。用当前的QUAT和PVP涂层样品以及商用 BiolineXHS和X-涂层样品，显然血小板粘附值明显更低。Safeline生物非活性涂层纤维 的血小板粘附显著，而SORIN和CBAS涂层样品的血小板粘附明显并且在I. 50XIOVcm2至 2.00X105/cm2的范围内。来自于文献的体内外血小板粘附研宄（AnjaK.Zimmermann等， EffectofBiopassiveandBioactiveSurface-CoatingsontheHemocompatibility ofMembraneOxygenators,JBiomedMaterResPartB:AppIBiomater80B，2007， 第 433-439 页；WendelHP,ZiemerG，Coating-techniquestoimprovethe hemocompatibilityofartificialsurfacesusedforextracorporealcirculation. EurJCardiothoracSurg1999;16:342-350；KeurenJFjWieldersSJjWillemsGMjMorra M，LindhoutT，Fibrinogenadsorption，plateletadhesionAndthrombingernationat heparinizedsurfacesexposedtoflowingblood.ThrombHaemost2002;87:742-747; KornRL，FisherCA,LivingstonER,StenachN，FishmanSJjJeevanadamV,Addonizio VP.TheeffectsofCarmedaBioactiveSurfaceonhumanbloodcomponents duringsimulatedextracorporealcirculation.J.ThoracCardiovascSurg1996 ； 111:1073-84)也对生物活性和生物非活性涂层显示出相同结果。
[0116] HFM表面的扫描电子显微镜成像表征：
[0117] 图7示出了来自于独立体外实验的无涂层HFM的血液接触表面连同当前涂层和一 些商用涂层的结果。单独鉴定当前涂层的结果。在全部4次体外实验中，接触血液的无涂层 纤维明显促进蛋白质吸附和细胞粘附。QUAT涂层和PVP-QUAT涂层纤维仅在其表面显示出 标称水平的血栓沉积物。在第一次体外实验期间可将活化血小板区别为分离的、伪足形成 和球形形态转变类型。图8示出了通过如图7所示每个表面（放大2000X)的量化和平均 SEM图像估计的全部4次体外实验的HFM上血栓沉积物的百分比。应用具有143个矩形的 透明网格覆盖每张SEM图像的整个表面。将覆盖血栓的矩形数量表示为全单元的百分比以 描述每个纤维表面的血栓覆盖面积。在这个图8中为每种类型的无涂层或有涂层的HFM报 道了血栓沉积物的平均值连同各自的标准偏差。如同以降序方式一样的显著到不显著的血 栓水平遵循如下趋势：'SafeLine〉无涂层〉CHS涂层〉H-Q涂层〉Phisio涂层>X涂层〉CBAS 涂层〉BioLine>P-H_Q涂层'。
[0118] 在前述说明书中，已经参考其具体实施方案描述了本发明。然而，明显的是在不背 离本发明的广泛精神和范围的前提下可对其做各种修改和变化。因此，其意图是此类变化 和修改属于所附权利要求定义的本发明的范围内。因此，必须将说明书和附图视为说明书 而非限制性意义。
【主权项】
1. 一种生物相容性涂层组合物，其包含： 包含季铵盐和肝素复合物（QUAT)的血液相容性、肝素基生物活性涂层，其中所述季铵 盐选自具有至少一个是从C7HJljC18H37的普通或取代的长链脂族基的基团的一种或多种长 链线性脂肪族烷基季铵盐。2. 根据权利要求1所述的涂层组合物，其中所述涂层组合物还包含亲水性底漆层。3. 根据权利要求2所述的涂层组合物，其中所述亲水性底漆层包含聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)〇4. 一种涂布中空纤维膜（HFM)表面的方法，包括 在所述HFM的一个或多个表面上产生阴离子官能团并且此后为所述表面涂布一层所 述季铵盐和肝素复合物（QUAT)，其中所述季铵盐选自具有至少一个是从(：7氏5到C18H37的普 通或取代的长链脂族基的基团的一种或多种长链线性脂肪族烷基季铵盐。5. 根据权利要求4所述的方法，其中通过使用溶于溶剂混合物中的离子络合物使所述 HFM的表面改性，在所述HFM的表面产生所述阴离子官能团；所述溶剂混合物包含大量醇连 同少量有机溶解剂。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述有机溶解剂包含四氢呋喃（THF)、丙酮、苯、甲 苯、石脑油、环己烷、正庚烷、正己烷、醚和石油醚中的一种或多种。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述溶剂混合物包含70-100体积％甲醇和30-0 体积％的THF。8. -种方法，包括 为表面涂布包含PVP的底漆溶液，并且 此后为所述表面涂布包含季铵盐和肝素的QUAT溶液；其中所述季铵盐选自具有至少 一个是从C7HJljC18H37的普通或取代的长链脂族基的基团的一种或多种长链线性脂肪族烷 基季铵盐。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述底漆溶液包含0. 5-0. 9重量％溶于其余重 量％的醇中的聚N-乙烯-2-吡咯烷酮（PVP)。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述表面包括中空纤维膜（HFM)的一个或多个表 面。11. 一种制备不凝血生物相容性涂层的方法，包括： 混合溶于水中的肝素溶液与 包含溶于醇中的疏水性季铵盐或包含一种或多种疏水性季铵盐的混合物、有或无一种 或多种亲水性季铵盐的混合物的溶液。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述盐包含具有至少一个是从C巩5到C18H37的 普通或取代的长链脂族基的基团的一种或多种长链线性脂肪族烷基季铵盐。13. 根据权利要求11所述的方法，其中所述混合按逐滴方式进行。14. 根据权利要求11所述的方法，其中所述混合产生包含Quat-肝素复合物及悬浮于 水和醇的溶剂组合中富含肝素的Quat和富含Quat的肝素的残留颗粒的胶体溶液；所述方 法还包括： 使用离心和等分试样分离，分离溶液的呈致密沉淀球粒形式的悬浮沉淀和颗粒； 用新鲜的去离子水和醇溶剂混合物洗涤所述致密沉淀一次或多次；并且 丢弃等分试样并从所述复合物中排出残留液体。15. 根据权利要求14所述的方法，其中通过所述方法获得的复合物储存在-20°C以下。16. 根据权利要求14所述的方法，还包括称取所得复合物并将所述复合物研磨成细小 颗粒并且将所述复合物溶于包含60-90重量％的醇、其余为至少一种试剂的溶剂组合中。17. 根据权利要求16所述的方法，所述试剂包含选自四氢呋喃（THF)、丙酮、苯、甲苯、 石脑油、环己烷、正庚烷、正己烷、醚和石油醚的至少一种试剂。18. -种试剂盒，其包含 根据权利要求1所述的包含季铵盐和肝素复合物（QUAT)的血液相容性、抗凝血和/或 不凝血、肝素基生物活性涂层；和 选自使用此类涂层的说明书中的至少一种附加组分；氧合器；和人工肺。19. 一种氧合器，其包含涂有根据权利要求1所述的一种或多种涂层的一个或多个血 液接触表面。20. -种方法，包括 通过氧合器设备的血液入口，填充包含0. 5-0. 9重量％的溶于99. 5-99. 1重量％的醇 中的聚N-乙烯-2-吡咯烷酮（PVP)的溶液； 用醇冲洗以去除PVP; 通过所述氧合器设备的血液入口，填充包含含有溶于醇和THF溶液的季铵盐和肝素复 合物（QUAT)的血液相容性、抗凝血和不凝血、肝素基生物活性涂层的生物相容性涂层组合 物，并且使要与血液接触的表面在所述涂层溶液中接触1秒至10分钟； 使用惰性气体从所述氧合器设备中丢弃并吹出所述涂层组合物；并且 用盐水溶液冲洗所述氧合器设备。
【专利摘要】用于要与血液接触的表面例如氧合器设备的表面(例如中空纤维膜(HFM)表面)或人工肺的表面的血液相容性、抗凝血和不凝血、肝素基生物活性涂层，所述涂层包括季铵盐和肝素复合物(QUAT)。用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，接着用所述季铵盐和肝素复合物(QUAT)的涂层处理所述表面以形成PVP-QUAT涂层。根据其它示例实施方案，通过使用溶于包括大量醇连同少量有机溶解剂的溶剂混合物中的离子络合物使所述HFM的表面改性，在所述HFM的一个或多个表面产生阴离子官能团。还提供了制备所提供的涂层的方法、涂布表面的方法、已经涂布的设备及包括此类涂层的试剂盒。
【IPC分类】A61K31/14, A61L33/10
【公开号】CN104902884
【申请号】CN201480004000
【发明人】纳拉亚纳·加里梅拉, 忠俊·吴, 巴特利·格里菲思
【申请人】马里兰大学巴尔的摩校区
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年1月6日
【公告号】EP2941249A1, US20150352265, WO2014107690A1
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请是要求2013年1月7日提交的美国临时申请61/749, 495号的优先权益的 PCT申请，其整个内容特此以引用的方式并入。
[0003] 联邦政府资助研宄的声明
[0004] 本发明受政府支持以美国国家卫生研宄院（NationalInstitutesofHealth)授 权编号R01HL082631和R42HL084807研发。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
[0005] 本发明一般地涉及生物相容性涂层组合物。更具体地，本发明涉及用于渗透膜表 面的血液相容性、抗凝血和不凝血、肝素基生物活性涂层。
[0006] 发明背景
[0007] 在美国肺病可能成为仅次于心血管疾病和癌症的第三杀手。（Lungdisease data2008.AmericanLungAssociation,http://www.lungusa.org/about~us/ publications/(2011年7月访问））。在美国每年有成千上万的死亡归因于肺部原因， 花费数千亿美元。MHL。目前，不可逆性和慢性肺病仅可通过肺移植治疗（胃w.ISHLT. 〇rR)〇每年成人呼吸窘迫综合征（ARDS)折磨着150, 000名美国患者，发病率为30-50 % (Demling,R. ,Themodernversionofadultrespiratorydistresssyndrome.AnnRev Med, 1995. 46:第 193-202 页；ZwischenbergerJB，C.S.，AlpardSK等，Percutaneous extracorporealarteriovenousC02removalforsevererespiratoryfailure.Ann ThoracSurg，1999. 68 :第181-7页）。在临床上可合理地引入人工肺作为移植的临时桥梁 和作为ARDS的急性短期治疗。
[0008] 聚合中空纤维膜（HFM)是膜式氧合器的整体部分并且具有经过极大改变的血液 氧合系统。然而HFM易于蛋白质吸附、血小板粘附及血栓沉积物形成和粘附。因此，与合成 HFM接触的血流具有活化凝血和炎症的细胞和分子组分的潜力。人造血液接触表面通过接 触活化、蛋白质吸附及元素活化和吸附的现象引起材料诱导的血液损伤，最终可导致炎症 和临床不良反应（图1)。具体而言，与任何其它接触血液的人工器官相比，血液氧合器和人 工肺使用较大表面积并延长停留时间以达到高气体交换率。当患者需要长期支撑时，这就 成问题。将血栓形成减到最少的一种解决方案是通过向患者的血液中引入抗凝血剂例如肝 素维持全身抗凝作用。然而，抗凝血剂过量可导致出血风险。
[0009] 第二种解决方案是为氧合器和人工肺的血液接触表面提供生物相容性涂层以减 少全身抗凝作用的所需量并且将表面诱导的血栓形成（或）归因于表面的血液活化和凝固 减到最少。许多研宄已经证实肝素基生物活性表面改性和非肝素基生物非活性涂层方法提 供了有益效果。然而，这些涂层中的许多的抗凝特性仅持续短时间并且不能用于长期支撑。
[0010] 因此，需要在长期使用期间维持其结构完整性和不凝血特性的不凝血生物相容性 涂层。
【发明内容】
[0011] 根据非限制性示例实施方案，本发明提供了不凝血生物相容性涂层。
[0012] 在示例实施方案中，提供了季铵盐和肝素复合物（QUAT)涂层。本文提供的QUAT涂 层的示例性实施方案包括使用溶于包括大量醇连同少量有机溶解剂例如四氢呋喃（THF)、 甲苯、石油醚等的溶剂混合物中的离子络合物进行的HFM或其它膜或表面的表面改性。 在其它实施方案中，主要涂布聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，接着稍后涂布季铵盐和肝素复合物 (PVP-QUAT)。PVP-QUAT涂层旨在血液与表面接触期间诱导混杂PVP的不凝血效应与肝素的 抗凝血效应。
[0013] 另外的示例实施方案涉及制备涂层并将涂层涂到表面，例如渗透膜表面的方法。 进一步提供了已经涂布的氧合器设备和人工肺及包括此类涂层的试剂盒。
[0014] 附图简述
[0015] 本文参考以下附图描述了非限制性示例实施方案：
[0016] 图1是描绘血液与氧合器的中空纤维膜相互作用的结果的流程图。
[0017] 图2说明了通过中空纤维膜氧合的原理。图2A显示了通过中空纤维膜和通过一 系列作为底板的一部分的此类膜的氧气和二氧化碳流。图2B显示了在放大的摄影、光学和 电子显微镜水平下，中空纤维膜的表面和横截面特征。
[0018] 图3显示了用于维持肝素涂层的血液相容性的固定表面的示意图。图3A是指出 了肝素化表面维持血液相容性的原理的示意图。图3B描绘了在中空纤维膜表面上涂布季 铵盐和肝素的原理。图3C描绘了在中空纤维膜表面上涂布PVP、季铵盐和肝素的原理。
[0019] 图4是描绘了Corline肝素表面（CHS)涂层纤维、Quat-肝素复合物涂层纤维及 PVP和Quat-肝素复合物涂层纤维上固定肝素水平的图表。
[0020] 图5显示了在HFM表面上吸附的纤维蛋白原的量。
[0021] 图6显示了在HFM表面上粘附的血小板的量。
[0022] 图7描绘了当前涂层的体外血液接触表面连同无涂层的和一些商用涂层HFM表面 的扫描电子显微镜观察结果。
[0023] 图8显示了由图7的HFM表面估计的血栓量。
[0024] 图9根据示例实施方案显示了季铵卤化物的示例结构。
【具体实施方式】
[0025] 本发明涉及不凝血和抗凝血、生物相容性涂层及制备和使用此类涂层的方法。还 提供了已经涂布的氧合器设备和人工肺及包括此类涂层的试剂盒。
[0026] 鉴于以下详细描述，连同附图一起，本发明示例实施方案另外的方面、优点和/或 其它特征将变得显而易见。本领域中的技术人员应显而易见的是，本文提供的实施方案仅 为示例性和说明性而非限制性。其修改的许多实施方案视为属于本公开及其等效方案的范 围之内。
[0027] 虽然将示例实施方案描述为连同血液氧合系统中的中空纤维膜一起使用，但是应 理解这些涂层可用于其它目的，因此本发明不限于此类应用。鉴于本文提供的教导，本领域 中的普通技术人员将认识到可使用本发明的涂层的其它应用。因此，本领域中的普通技术 人员将能够将本发明的涂层和方法用于其它应用中。因此，旨在使这些备选用途成为本发 明的一部分。
[0028]本说明书中提到的所有出版物均表明了本发明所属领域中技术人员的水平。本文 的所有专利和出版物均以引用的方式并入，如同特别单独地指出将每个单独的出版物以引 用的方式整体并入一样。
[0029]在描述示例实施方案时，为清楚起见采用了特定术语。然而，并非旨在将实施方案 限于该特定术语。除非另外指出，根据传统用法使用技术术语。
[0030] 如本文所使用，"一种"或"一个"可意为一个或多个。如本文所使用，"另一个"可 意为至少第二个或多个。此外，除非上下文另有要求，单数术语包括复数并且复数术语包括 单数。
[0031] 如本文所使用，关于要涂到例如膜（例如中空纤维膜）的至少一个表面上，形成氧 合器的一部分的涂层组合物，术语"涂层"、"涂层组合物"和"组合物"有时可交换使用。涂 层的此类应用可在首先施加的底漆或其它层或处理之上。因此涂层可能不直接接触表面。 同样，涂层可能完全或可能不完全涂布特定表面或表面的一部分。本文提供的涂层可极薄 (例如，小于100纳米厚）并且透明。经直接目测，在涂层和非涂层中空纤维膜表面之间可 能不会出现任何差异。因此，将涂层视为血液和膜表面之间透气的血液相容性界面。
[0032] 如本文所使用，术语"中空纤维膜"或"HFM"可交换用于指通过氧气向血液中和二 氧化碳向与之接触的气相中扩散的过程使血液氧合成为可能的小的半渗透毛细管。流动血 液围绕HFM且有氧流过其内腔描述了如图2A所示氧合的原理。由于血液和氧气借助于扩 散的逆流作用，二氧化碳连同残留氧气一起离开底部。可将HFM捆在一起以维持完整性和 增加血液氧合效率。
[0033] 图2B中不出了说明不例HFM的外表面特征和横截面特征的一系列光学和扫描电 子显微镜图像。HFM易于蛋白质吸附、血小板粘附及血栓沉积物形成和粘附。血栓沉积物抑 制气体转移并因此限制其使用的持续时间。本发明提供了生物相容性涂层以降低血栓沉积 的程度，这样允许长期使用氧合系统。
[0034] 图3A指出了肝素化表面在衬底301上保持其血液相容性的原理。固定在衬底301 上的肝素302提供了活性ATIII位点340。当其二者结合在一起产生血酶-抗凝血酶（AT III)复合物（TAT) 320中和结果时，凝血酶310的潜在血栓形成剂通过抗凝血酶330减少。 由此当TAT复合物与活性ATIII位点340结合时，凝血酶310灭活。
[0035] 涂层组合物
[0036] 本发明的非限制性示例实施方案提供了季铵盐和肝素复合物（QUAT)涂层组合 物。具体而言，本文提供了包括含季铵盐和肝素复合物（QUAT)的血液相容性、肝素基生物 活性涂层的生物相容性涂层组合物。例如图9中所示，所述结构可包括其正氮离子与肝素 的一些负离子经离子键结合的特定线性季铵卤化物。季铵卤化物的一些正氮离子与膜表面 获得的官能团的负离子结合。所述涂层可为抗凝血性和不凝血性。
[0037] 其它示例实施方案提供了PVP底漆季铵盐和肝素复合物（PVP-QUAT)涂层。具体 而言，这些涂层组合物的实例包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP)的涂层，接着是所述季铵盐和肝 素复合物（PVP-QUAT)的涂层以形成PVP-QUAT涂层。
[0038] HFM表面阴离子官能团的生成：
[0039]使尺寸为Icm2的PMP-Oxyplus HFM的外表面接触普通甲醇溶剂（或）70体积％甲 醇和30体积％四氢呋喃（THF)的溶剂混合物在HFM表面产生最大的负离子密度。通过在HFM上吸附甲苯胺蓝（阳离子或+离子）染料确认这些位点（或负离子）的存在和密度。 通过按0.005至0.05重量％的范围将甲苯胺蓝溶于含0.2重量％NaCl的0.OlNHCl溶 液中制备甲苯胺蓝的独立溶液。经证实，Icm2表面积的HFM能够从Iml溶液吸附最多0. 05 重量％的甲苯胺蓝。因为甲苯胺蓝是相对于带正电的氮离子，具有与阳离子季铵卤化物类 似特征的阳离子染料，所以在估计表面固定所需的季铵卤化物的量时将甲苯胺蓝用作标准 物。
[0040] 本发明人已经发现单独的醇对肝素和季铵卤化物的复合物的溶解能力有所限制。 本发明人已经发现THF或甲苯或本文的其它有机溶剂将增强溶解能力。因此，根据非限制 示例实施方案，可使用具有70-100体积％甲醇（或其它醇或包括甲醇、乙醇和/或丙醇的 醇混合物）和0-30体积％THF的溶剂混合物。根据 另外的非限制示例实施方案，溶剂混合 物可包括70-80体积％甲醇（或其它醇或包括甲醇、乙醇和/或丙醇的醇混合物）和20-30 体积％的THF。溶剂混合物也可任选地包括按体积计，量高达10%的附加少量有机试剂例 如甲苯、石油醚、醚、苯等的存在。随着添加剂例如甲苯、醚和其它有机试剂的增加，可能对 中空纤维膜的完整性存在不良影响。因此，可将其在最终涂层溶液中的量限制为低于10%。 因此，根据示例实施方案，所述混合物可主要为纯，100%醇是溶剂的极限；附加试剂预期主 要用作肝素和季铵盐的复合物的溶解剂。发现THF对膜具有更少的不良影响并且其在醇溶 剂中的浓度可高达30%。
[0041] 合成涂层组合物的方法
[0042] 季铵盐和肝素复合物（Quat-肝素复合物）的合成
[0043] 将5g肝素溶于100mL去离子水中的第一溶于按逐滴方式与含有溶于醇中的疏水 性季铵盐或一种或多种疏水性季铵盐的混合物，有或无一种或多种亲水性季铵盐的混合物 的第二溶液混合。即，第二溶液可包括例如溶于醇中的卤化季盐。第二溶液的这些卤化物 可为一种或多种。但是，根据示例实施方案，溶液的主要量应包含疏水性特征。
[0044] 所述盐可为来自于具有至少一个是从C7H^IjC18H37的普通或取代的长链脂族 基的基团的长链线性脂肪族烷基季铵盐类型的任一种（Rahn，Otto和WilliamP.Van Eseltine.''Quaternaryammoniumcompounds.''AnnualReviewsinMicrobiology 1，no.I(1947): 173-192)。维持甲醇溶液中盐的量，以致对于肝素的每个四糖单元 而言，存在阳离子线性季铵卤化物的5至15个胺位点（Falb，R.D.、Grode，G.A.、 Takahashi,M.T?和Leininger,R.I. (1968) ?CharacteristicsofHeparinizedSurfaces. InteractionofLiquidsatSolidSubstrates,Alexander,AL编辑，AmericanChemical Society,Washington,DC) 〇
[0045] 因此，根据非限制性示例实施方案，本文提供了制备不凝血生物相容性涂层的方 法，所述方法包括将溶于水中的肝素溶液与包括溶于醇中的疏水性季铵盐或包含一种或多 种疏水性季铵盐的混合物、有或无一种或多种亲水性季铵盐的混合物的溶液混合。根据另 外的实施方案，所述盐可包括具有至少一个是从C7H1^IjC18H37的普通或取代的长链脂族基 的基团的一种或多种长链线性脂肪族烷基季铵盐。所述混合可按逐滴方式进行。
[0046] 可用其它类型的有机或无机溶剂例如缓冲溶液、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、石油 醚、苯等代替或改性用于溶解肝素和（或）Quat的溶剂。经鉴定甲醇是用于溶解季铵卤化物 的优选（但非限制性）溶剂。另外，甲醇对HFM的机械完整性和结构没有破坏性影响。根 据示例实施方案，可使用其它醇或包括甲醇、乙醇和/或丙醇的醇混合物。可优选但不限于 诸如四氢呋喃、丙酮、甲苯、石脑油、正庚烷、环己烷、正己烷、醚、石油醚、苯等溶剂，作为季 铵卤化物和肝素的复合物另外的可能有机溶解剂。然而，因为过量的有机溶剂可在化学、物 理和机械上损害HFM，所以在制备最终涂层溶液时，可使用可能最低量的这些溶剂。举例而 言，根据示例实施方案，可将四氢呋喃限制为例如，总涂层溶液的最多30体积％。如果使用 甲苯，根据示例实施方案，可能不超过涂层溶液的10体积％。如果使用石油醚，根据示例实 施方案，可能不超过总涂层溶液的5体积％。
[0047] 根据示例实施方案，本文提供了涂布膜表面例如中空纤维膜（HFM)表面的方法， 所述方法包括在所述HFM的一个或多个表面产生阴离子官能团。本文还提供了通过使用溶 于溶剂混合物中的离子络合物使所述HFM的表面改性，在HFM的一个或多个表面产生的阴 离子官能团。溶剂混合物可包括大量的醇连同少量的有机溶解剂。根据非限制性示例实施 方案，有机溶解剂包含四氢呋喃（THF)、甲苯和石油醚中的一种或多种。如上所述，溶剂混合 物可包括70-100体积％甲醇和0-30体积％的THF。
[0048] 表1中呈现了季铵卤化物和肝素的详情。
[0049] 表1:涂到Oxyplus PMP-HFM外表面的季铵盐和肝素的详情
[0050]
[0051] 在混合过程中，确保搅拌后一种溶液以每次在包含Quat-肝素复合物及悬浮于水 和醇的溶剂组合中富含肝素的Quat和富含Quat的肝素的残留颗粒的胶体溶液旁边暴露全 新的高表面积接触物。使用离心和等分试样分离的方法，小心地分离这种溶液的呈致密球 粒形式的悬浮沉淀和颗粒。致密指由于离心和重力效应从液体中下降的聚合沉淀的固体形 式。每次用新鲜的去离子水和醇溶剂混合物洗涤致密沉淀。丢弃等分试样，使用冷冻干燥 法，在KT3mmHg的真空下从所述复合物中排出残留液体。在-20°C以下储存这样获得的无 水复合物。称取这种复合物，研磨成细小颗粒并且最后溶于包括60-90重量％的醇，其余为 四氢呋喃（THF)、甲苯、石油醚和/或其它试剂的溶剂组合中。
[0052] 因此，根据示例实施方案，在本方法中混合产生包含Quat-肝素复合物及悬浮于 水和醇的溶剂组合中富含肝素的Quat和富含Quat的肝素的残留颗粒的胶体溶液。所述方 法还包括使用离心和等分试样分离，分离这种溶液的呈致密球粒形式的悬浮沉淀和颗粒。 此类方法还包括用新鲜的去离子水和醇溶剂混合物洗涤致密沉淀一次或多次；并且丢弃等 分试样并从所述复合物中排出残留液体。
[0053] 如上所述，根据非限制性示例实施方案，在本方法中通过所述方法获得的复合物 储存在-20°C以下。
[0054] 所述方法还可包括称取所得复合物并将复合物研磨成细小颗粒并且将复合物溶 于包含60-90重量％的醇，其余为至少一种试剂的溶剂组合中。所述试剂可包括选自四氢 呋喃（THF)、甲苯和石油醚的至少一种试剂。
[0055] 底漆溶液的制备：
[0056] 根据非限制性示例实施方案，可先用PVP溶液为要涂布的表面涂底漆。具体而言， 单独制备包括〇. 5-0. 9重量％的溶于醇中的聚N-乙烯-2-吡咯烷酮（PVP)的溶液供初始 表面改性的应用并且将这种溶液称为'底漆溶液'。
[0057] 涂布表面或装置的方法：
[0058] 在涂布表面或装置之前，可直接使用溶于富醇溶剂中的Quat-肝素复合物的涂层 溶液涂布中空纤维膜的试验纤维样品或先用溶于醇中的PVPV为纤维涂底漆，接着使用以 上提到的涂层溶液第二次涂布。
[0059] 因此，本文提供了包括用包含PVP的底漆溶液涂布表面，之后用包含季铵盐和肝 素的QUAT溶液涂布所述表面的方法。
[0060] 通过体外抗因子Xa测定法评估底漆和复合物涂层溶液及肝素的活性。确保固定 肝素的活性之后，按照下述程序进行涂布氧合器设备。
[0061] 液体或血液流过并接触氧合器设备表面的路径称为流程。其包括入口、出口、塑性 聚碳酸酯零件、中空纤维膜、磁力驱动的金属推进器和其它塑料管或零件。主要是描述关于 在临床或实验应用期间必须保持与血液接触的所有中空纤维膜的外腔。
[0062] 根据非限制性示例实施方案，为涂布氧合器设备的血液接触表面（例如，HFM表 面），最初通过用纯酒精处理所述设备至少2分钟在所需表面上获得阴离子官能团。先通过 所述设备的血液入口将这种底漆溶液填充到所述设备中。HFM的血液接触表面保持与溶液 接触最少1秒和最多10分钟，或甚至更长。之后，丢弃所述液体并使用惰性气体例如氮气 从氧合器设备中吹出。
[0063] 用纯酒精冲洗氧合器设备的流径确保从其中去除了游离或未吸附的PVP。
[0064] 然后通过氧合器设备的血液入口将溶于醇和THF溶液的Quat-肝素复合物填充到 所述设备中。要与血液接触的所有HFM表面全部浸入涂层溶液中并润湿最少1秒至最多1 分钟。之后，丢弃涂层溶液并使用惰性气体从氧合器设备中吹出。用盐水溶液冲洗氧合器 设备的流径不但确保去除了游离或未固定的复合物，还除去了微量留下的涂层。
[0065] 因此，继续上文，本文提供了至少包括以下步骤的方法：通过氧合器设备的血液入 口，填充包含〇. 5-0. 9重量％的溶于醇中的聚N-乙烯-2-吡咯烷酮（PVP)的溶液；用醇冲 洗以去除PVP;
[0066] 通过氧合器设备的血液入口，填充包含包括溶于醇和THF溶液的季铵盐和肝素复 合物（QUAT)的血液相容性、抗凝血和不凝血、肝素基生物活性涂层的生物相容性涂层组合 物，并且使要与血液接触的表面（例如中空纤维膜（HFM)的一个或多个表面）在涂层溶液 中接触1秒至10分钟。所述方法还可包括M並使用惰性气体从氧合器设备中丢弃并吹出 涂层组合物；并且用盐水溶液冲洗氧合器设备。
[0067]氣合器和人工肺
[0068] 本发明另外的实施方案提供了包括涂有本发明涂层组合物的表面的设备。具体而 言，通过举例的方式，本文提供了包括涂有一种或多种本发明涂层的一个或多个血液接触 表面的氧合器设备。本文进一步提供了包括涂有一种或多种本发明涂层的一个或多个血液 接触表面的人工肺。
[0069] 本文还提供了试剂盒，其包括，例如包含季铵盐和肝素复合物（QUAT)的一种或多 种血液相容性、抗凝血和/或不凝血、肝素基生物活性涂层组合物；和选自例如在要供哺乳 动物使用的氧合器或人工肺上制备或使用此类涂层的说明书中的至少一种附加组分；涂层 的附加组分，可用于涂布表面和/或氧合器、人工肺、HFM或要涂布的其它表面的设备或组 件。本文提供的试剂盒可另外包括可用于形成或使用本发明涂层组合物的一种或多种附加 组分。
[0070] 本发明还包括包含季铵盐和肝素复合物（QUAT)的一种或多种血液相容性、抗凝 血和/或不凝血、肝素基生物活性涂层作为例如渗透膜上的涂层的用途。
[0071] 进一步提供了治疗患者肺病的方法。所述方法可包括例如为供患有肺病的患者使 用的氧合器和/或人工肺的至少一个血液接触表面涂布包含季铵盐和肝素复合物（QUAT) 的一种或多种血液相容性、抗凝血和/或不凝血、肝素基生物活性涂层。方法也可包括向患 有肺病的患者施用在至少一种氧合器和/或人工肺的至少一个血液接触表面具有包含季 铵盐和肝素复合物（QUAT)的一种或多种血液相容性、抗凝血和/或不凝血、肝素基生物活 性涂层的至少一种氧合器和/或人工肺。
[0072] 另外的示例方法可包括为供患有肺病的患者使用的氧合器和/或人工肺的至少 一个血液接触表面涂布包含季铵盐和肝素复合物（QUAT)的一种或多种血液相容性、抗凝 血和/或不凝血、肝素基生物活性涂层，以减少所需全身抗凝作用的量并且将表面诱导的 血栓形成（或）归因于表面的血液活化和凝固减到最少。
[0073] 提供下面的实施例是为了进一步说明各种非限制性实施方案和技术。然而 ，应理 解这些实施例意为说明性而不限制权利要求的范围。对技术人员而言显然，旨在将许多改 变和修改涵盖于本发明的精神和范围之内。
[0074] 实施例
[0075] 实施例1
[0076] 将PVP肝素（PVP-HC)涂层表面上固定肝素的量与肝素涂层表面（HC)和Corline 肝素表面（CHS)作比较。混合200yL的AT-III和25yL浓度为0. 5-15yg/mL的肝素并 且在37°C下温育2分钟。然后将200yL的FXa混入溶液中并且在37°C下温育1分钟。接 下来，将200yL的spectrozymeFXJgA溶液中并且在37°C下温育5分钟。添加200yL 冰醋酸并彻底混合。然后在405nm下测量肝素吸收，这样量化了固定在纤维表面上的肝素 的活性。图4是就通过分光光度计技术测定的吸收读数而论，描绘了已知量的肝素量的活 性的标准直线。在标准曲线上标出了来自于CHS、HC和PVP-HC涂层纤维样品的固定肝素的 量。图4证明PVP-HC具有比HC或CHS样品量高的固定肝素。这表明PVP在保持和维持比 单独肝素更高的活性上具有越来越大的影响。
[0077] 实施例2
[0078] 测试各自涂有本发明的不同示例涂层的HFM以测定其生物相容性和阻碍蛋白质 吸收、血小板粘附及血栓沉积物形成和粘附的能力。然后将这些与无涂层的HFM束及HFM 上的其它市场上可买到的生物相容性涂层比较。表2提供了不同涂层的详情。
[0079]表2
[0080]
[0081] 材料和方法
[0082] 有本发明涂层的HFM
[0083] 使用带有本发明的QUAT涂层和PVP-QUAT涂层的HFM将其功效与无涂层的HFM和 涂有其它市场上可买到的涂层的HFM作比较。使用上述方法制备QUAT和PVP-QUAT涂层 HFM。在PVP-QUAT和QUAT涂布工艺之前，HFM纤维在两端经机械性堵塞以防止血液通过HFM 的内腔进入。
[0084] 商业涂层和无涂层的中空纤维膜样品
[0085] a.无涂层的对照（NON)HFM样品
[0086]这些HFM样品是无涂层的PMP-Oxyplus-Membrana(PMP)(德国Membrana)。纤维在 两端经机械性堵塞以防止血液通过HFM的内腔进入。
[0087] b. CBAS
[0088]从商用Medtronic氧合器上切下CBAS涂层（Larm0,LarssonR，OlssonP.Anew non-thrombogenicsurfacepreparedbyselectivecovalentbindingofheparin viaamodifiedreducingterminalresidue.BiomatMedRevArtifOrgans1983 ； 11:161 - 73)HFM(Primox，Sorin/Dideco,Mirandola，Modena，Italy)DCBAS是一种具生物 活性的涂层方法，其中使用附着过程使肝素分子共价连接到表面。这种涂层不可浸出并且 其化学结构使固定肝素在涂层表面上保持其抗凝血性质更长时间（Rahn，Otto和William P.VanEseltine."Quaternaryammoniumcompounds."AnnualReviewsinMicrobiology 1，no.I(1947) : 173-192)。纤维的切割样品在两端经机械性堵塞以防止液体（血液）通过 HFM的内腔进入。
[0089]c.Phisio
[0090] 从商用Sorin/Dideco氧合器上切下Phisio(磷酰胆碱）涂层HFM(Primox，Sorin/ DidecojMirandola,Modena,Italy,GunaydinS.Emergingtechnologiesin biocompatiblesurfacemodifyingadditives:questforphysiologic cardiopulmonarybypass.CurrMedChem2004;2:295 - 302)。设计磷酰胆喊聚合物 (BiocompatiblesInternationalplc，Farnham，Surrey，UK)以模拟内壁并且为化学惰性。 不存在肝素。纤维的切割样品在两端经机械性堵塞以防止液体（血液）通过HFM的内腔进 入。
[0091] d. Bioline
[0092]从Maquet氧合器上切下Bioline涂层HFM(Quadrox，Maquet-Dynamed，Hirrlingen ，Germany，RP.Wendel等：OxygenatorThrombosis:WorstCaseAfterDevelopmentofan AbnormalPressureGradient-IncidenceandPathway；Perfusion2001，16, 271 - 278)〇 Bioline涂层结合了多肽和肝素。多肽被吸附到(PB表面的组件上。肝素分子经由稳定的 共价键和离子相互作用与多肽连接。纤维的切割样品在两端经机械性堵塞以防止液体（血 液）通过HFM的内腔进入。
[0093]e.Safeline
[0094]从Maquet氧合器上切下Safeline涂层HFM(Quadrox，Maquet-Dynamed，Hirrling en，Germany，H.P.Wendel等：OxygenatorThrombosis:WorstCaseAfterDevelopmentof anAbnormalPressureGradient-IncidenceandPathway；Perfusion2001，16,271-278)Jafeline是涉及用白蛋白添加剂物理细化，赋予暴露于血液的表面亲水性特征的新型 生物非活性涂层。白蛋白添加剂与表面的结合通过静电力和范德华力实现。这种结合高度 稳定，并且在体外循环期间没有添加剂释放到患者血液中。纤维的切割样品在两端经机械 性堵塞以防止液体（血液）通过HFM的内腔进入。
[0095]f.X-涂层
[0096]从CapioxSX18X氧合器上切下X涂层（LyneSchiel，SteveBurns，Atsuhiko Nogawa,RobertRice,TakaoAnzai,MasaruTanaka，X-Coating:ANewBiopassive PolymerCoating，2011，11(2)，第8-17页）或聚（2-甲氧基乙基丙烯酸酯）（PMEA)涂层 的HFM(Capi〇xRXSSJerUn^NJ,USA)。X-涂层具有粘附于PVC管上的疏水性聚乙烯骨架 并且具有与血液接触的亲水层。亲水层防止表面活化并且设计为生物惰性。（UeyamaK、NishimuraK、NishinaT、NakamuraT、IkedaT，、KomedaEPMEAcoatingofpumpcircuit andoxygenatormayattenuatetheearlysystemicinflammatoryresponsein cardiopulmonarybypasssurgery.ASAIOJ. 2004 年 7 月至 8 月；50 (4) :369 - 72.;Ikuta T、FujiiH、ShibataT、HattoriK、HiraiH、KumanoH、SuehiroS.Anewpoly-2-methoxye thylacrylate-coatedcardiopulmonarybypasscircuitpossessessuperiorplatelet preservationandinflammatorysuppressionefficacy.AnnThoracSurg. 2004年 5 月； 77 (5) :1678 - 83)。纤维的切割样品在两端经机械性堵塞以防止液体（血液）通过HFM的 内腔进入。
[0097]HFM的体外蛋白质（纤维蛋白原）吸附评估
[0098] 使用QuickStartBradford蛋白测定法（Bio-Rad)量化被HFM样品的外表面吸 附的纤维蛋白原的量。这种测定法的原理依赖于测量纤维蛋白原通过与考马斯亮蓝G-250 染料结合从水溶液中的损耗量。
[0099] 最初在pH:7. 4溶液的IOmM磷酸盐缓冲盐水（PBS)中冲洗HFM样品，接着在37°C 将其浸入lmg/ml溶于ImlPBS样品溶液中的纤维蛋白原中60分钟。通过混合并且使10 □ 1 样品与200 □ 1溶于PBS溶液中的染料反应，并且进一步通过在595nm下测量吸收量量化 被每个样品的HFM吸附的纤维蛋白原的量。通过线性方程比较样品的吸收量与标准品的吸 收量使得能够量化每个HFM样品表面的纤维蛋白原含量。
[0100] 血液采集及对HFM体外血液相容性的评估：
[0101] 从健康志愿者中采集新鲜的全人血。在ImL全血中用5IU的肝素浓度防止血液凝 固。将无涂层的HFM样品和带有生物相容性涂层的表面改性HFM的样品标记为独立样品并 置于各3ml体积容量的采血管中。在3mL肝素化血液中温育每个样品的纤维并且在37°C下 在血液混合器上摇动3小时，接着用IOmM磷酸盐缓冲盐水（PBS)洗涤6次。
[0102] 用于测定的全血计数分析：
[0103] 从没有纤维的管和与纤维样品接触的9根管取血样。在自动化分析仪（Hemavet) 中测量包括血小板、WBC和RBC在内的血细胞的计数。
[0104] 测定附着于HFM样品表面的血小板的数量
[0105]通过乳酸脱氢酶（LDH)测定法（QuantiChromLDH试剂盒，BioAssaySystems ，CA,DLDH-100, QuantiChrom?，乳酸脱氢酶试剂盒，乳酸脱氢酶活性的比色动力学测定， QuantiChromLDH试剂盒，BioAssaySystems,CA)测定附着于纤维样品上的血小板的数量。 因为血小板含有LDH，所以其将LDH释放到周围液体介质中，经鉴定其处于高于正常的水 平。因此，可将LDH作为估计附着于HFM上的血小板的量度。这是一种非放射性的比色LDH 测定法并且基于在NADH偶联酶促反应中MTT四唑盐还原成在565nm下表现出吸收最大值 的还原形式。形成的紫色强度与酶活性成正比。
[0106] 样品制备：
[0107] 在磷酸盐缓冲盐水（PBSpH:7. 4)中彻底洗涤接触了血液的纤维以便去除松散附 着的血小板和血栓。使纤维匀化于ImL含有IOOmM磷酸钾（pH7. 0)和2mM EDTA的缓冲液 中，接着在4°C下10,OOOg离心15分钟。含有来自于纤维的洗脱血小板的上清液用于测定。 最初，将来自于作物标准品的PRP的已知量的血小板与IOOmM磷酸钾（pH7.0)和2mM EDTA 的溶液混合以便绘制所述测定法的标准线性曲线。通过混合14yLMTT(四唑染料）溶液、 8yLNAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）溶液、 8yLPMS(吩嗪硫酸甲酯）溶液和170yL底物 缓冲液，制备用于这种测定法指示LDH活性的工作试剂。
[0108] 将具有已知量的悬浮于缓冲液中的血小板的100yL样品添加到样品池内100yL 的工作试剂中并彻底混合，注意颜色变化。在酶标仪上读取吸收量0D565nm(0D0)，并且在 25分钟后再次读取（OD25)。绘制与血小板的吸收量差，得到标准曲线。用在Iml缓冲液中 离心纤维样品后获得的IOOmL上清液代替IOOmL已知血小板样品缓冲液重复相同程序。通 过线性方程式比较样品的吸收量差与标准品的吸收量差使得能够量化附着的血小板。
[0109]HFM表面的扫描电子显微镜成像表征：
[0110] 在体外实验后经PBS洗涤的样品HFM于含有戊二醛的普通固定液中固定并准备进 行SEM成像表征。样品经冲洗、脱水、临界点干燥、固定在金属螺栓上并且溅射涂布上金和 钯。用FEIQuanta200高性能热发射柱扫描电子显微镜为样品成像。使用扫描电子显微 镜检查法（SEM)在4kV的加速电压和3-10mm的工作距离下表征沉积在样品表面的血栓的 分布和形态详情。
[0111] 结果：
[0112] HFM试验表面的纤维蛋白原吸附：
[0113] 图5中示出了按单位mg/ml计纤维蛋白原从PBS溶液中吸附的方法后，作为HFM 表面吸收量的指标的PBS中纤维蛋白原的损耗含量。无涂层的和SafeLine涂层表面均显 示出显著量的纤维蛋白原吸附，接着是X涂层、BioLine涂层和CHS涂层表面。我们实验室 的新型肝素涂层H-Q和P-H-Q通过将蛋白质的吸附限制为无涂层样品的约三分之一，对纤 维蛋白原显示出更高抗性。CBAS和Phisio表面在这些新型涂层之后。
[0114] 试验表面的血小板粘附：
[0115] 图6中示出了使用LDF活化研宄量化的粘附血小板的结果。附着于无涂层样品 的血小板大致为纤维表面的2. 50XIOVcm2级。用当前的QUAT和PVP涂层样品以及商用 BiolineXHS和X-涂层样品，显然血小板粘附值明显更低。Safeline生物非活性涂层纤维 的血小板粘附显著，而SORIN和CBAS涂层样品的血小板粘附明显并且在I. 50XIOVcm2至 2.00X105/cm2的范围内。来自于文献的体内外血小板粘附研宄（AnjaK.Zimmermann等， EffectofBiopassiveandBioactiveSurface-CoatingsontheHemocompatibility ofMembraneOxygenators,JBiomedMaterResPartB:AppIBiomater80B，2007， 第 433-439 页；WendelHP,ZiemerG，Coating-techniquestoimprovethe hemocompatibilityofartificialsurfacesusedforextracorporealcirculation. EurJCardiothoracSurg1999;16:342-350；KeurenJFjWieldersSJjWillemsGMjMorra M，LindhoutT，Fibrinogenadsorption，plateletadhesionAndthrombingernationat heparinizedsurfacesexposedtoflowingblood.ThrombHaemost2002;87:742-747; KornRL，FisherCA,LivingstonER,StenachN，FishmanSJjJeevanadamV,Addonizio VP.TheeffectsofCarmedaBioactiveSurfaceonhumanbloodcomponents duringsimulatedextracorporealcirculation.J.ThoracCardiovascSurg1996 ； 111:1073-84)也对生物活性和生物非活性涂层显示出相同结果。
[0116] HFM表面的扫描电子显微镜成像表征：
[0117] 图7示出了来自于独立体外实验的无涂层HFM的血液接触表面连同当前涂层和一 些商用涂层的结果。单独鉴定当前涂层的结果。在全部4次体外实验中，接触血液的无涂层 纤维明显促进蛋白质吸附和细胞粘附。QUAT涂层和PVP-QUAT涂层纤维仅在其表面显示出 标称水平的血栓沉积物。在第一次体外实验期间可将活化血小板区别为分离的、伪足形成 和球形形态转变类型。图8示出了通过如图7所示每个表面（放大2000X)的量化和平均 SEM图像估计的全部4次体外实验的HFM上血栓沉积物的百分比。应用具有143个矩形的 透明网格覆盖每张SEM图像的整个表面。将覆盖血栓的矩形数量表示为全单元的百分比以 描述每个纤维表面的血栓覆盖面积。在这个图8中为每种类型的无涂层或有涂层的HFM报 道了血栓沉积物的平均值连同各自的标准偏差。如同以降序方式一样的显著到不显著的血 栓水平遵循如下趋势：'SafeLine〉无涂层〉CHS涂层〉H-Q涂层〉Phisio涂层>X涂层〉CBAS 涂层〉BioLine>P-H_Q涂层'。
[0118] 在前述说明书中，已经参考其具体实施方案描述了本发明。然而，明显的是在不背 离本发明的广泛精神和范围的前提下可对其做各种修改和变化。因此，其意图是此类变化 和修改属于所附权利要求定义的本发明的范围内。因此，必须将说明书和附图视为说明书 而非限制性意义。
【主权项】
1. 一种生物相容性涂层组合物，其包含： 包含季铵盐和肝素复合物（QUAT)的血液相容性、肝素基生物活性涂层，其中所述季铵 盐选自具有至少一个是从C7HJljC18H37的普通或取代的长链脂族基的基团的一种或多种长 链线性脂肪族烷基季铵盐。2. 根据权利要求1所述的涂层组合物，其中所述涂层组合物还包含亲水性底漆层。3. 根据权利要求2所述的涂层组合物，其中所述亲水性底漆层包含聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)〇4. 一种涂布中空纤维膜（HFM)表面的方法，包括 在所述HFM的一个或多个表面上产生阴离子官能团并且此后为所述表面涂布一层所 述季铵盐和肝素复合物（QUAT)，其中所述季铵盐选自具有至少一个是从(：7氏5到C18H37的普 通或取代的长链脂族基的基团的一种或多种长链线性脂肪族烷基季铵盐。5. 根据权利要求4所述的方法，其中通过使用溶于溶剂混合物中的离子络合物使所述 HFM的表面改性，在所述HFM的表面产生所述阴离子官能团；所述溶剂混合物包含大量醇连 同少量有机溶解剂。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述有机溶解剂包含四氢呋喃（THF)、丙酮、苯、甲 苯、石脑油、环己烷、正庚烷、正己烷、醚和石油醚中的一种或多种。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述溶剂混合物包含70-100体积％甲醇和30-0 体积％的THF。8. -种方法，包括 为表面涂布包含PVP的底漆溶液，并且 此后为所述表面涂布包含季铵盐和肝素的QUAT溶液；其中所述季铵盐选自具有至少 一个是从C7HJljC18H37的普通或取代的长链脂族基的基团的一种或多种长链线性脂肪族烷 基季铵盐。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述底漆溶液包含0. 5-0. 9重量％溶于其余重 量％的醇中的聚N-乙烯-2-吡咯烷酮（PVP)。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述表面包括中空纤维膜（HFM)的一个或多个表 面。11. 一种制备不凝血生物相容性涂层的方法，包括： 混合溶于水中的肝素溶液与 包含溶于醇中的疏水性季铵盐或包含一种或多种疏水性季铵盐的混合物、有或无一种 或多种亲水性季铵盐的混合物的溶液。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述盐包含具有至少一个是从C巩5到C18H37的 普通或取代的长链脂族基的基团的一种或多种长链线性脂肪族烷基季铵盐。13. 根据权利要求11所述的方法，其中所述混合按逐滴方式进行。14. 根据权利要求11所述的方法，其中所述混合产生包含Quat-肝素复合物及悬浮于 水和醇的溶剂组合中富含肝素的Quat和富含Quat的肝素的残留颗粒的胶体溶液；所述方 法还包括： 使用离心和等分试样分离，分离溶液的呈致密沉淀球粒形式的悬浮沉淀和颗粒； 用新鲜的去离子水和醇溶剂混合物洗涤所述致密沉淀一次或多次；并且 丢弃等分试样并从所述复合物中排出残留液体。15. 根据权利要求14所述的方法，其中通过所述方法获得的复合物储存在-20°C以下。16. 根据权利要求14所述的方法，还包括称取所得复合物并将所述复合物研磨成细小 颗粒并且将所述复合物溶于包含60-90重量％的醇、其余为至少一种试剂的溶剂组合中。17. 根据权利要求16所述的方法，所述试剂包含选自四氢呋喃（THF)、丙酮、苯、甲苯、 石脑油、环己烷、正庚烷、正己烷、醚和石油醚的至少一种试剂。18. -种试剂盒，其包含 根据权利要求1所述的包含季铵盐和肝素复合物（QUAT)的血液相容性、抗凝血和/或 不凝血、肝素基生物活性涂层；和 选自使用此类涂层的说明书中的至少一种附加组分；氧合器；和人工肺。19. 一种氧合器，其包含涂有根据权利要求1所述的一种或多种涂层的一个或多个血 液接触表面。20. -种方法，包括 通过氧合器设备的血液入口，填充包含0. 5-0. 9重量％的溶于99. 5-99. 1重量％的醇 中的聚N-乙烯-2-吡咯烷酮（PVP)的溶液； 用醇冲洗以去除PVP; 通过所述氧合器设备的血液入口，填充包含含有溶于醇和THF溶液的季铵盐和肝素复 合物（QUAT)的血液相容性、抗凝血和不凝血、肝素基生物活性涂层的生物相容性涂层组合 物，并且使要与血液接触的表面在所述涂层溶液中接触1秒至10分钟； 使用惰性气体从所述氧合器设备中丢弃并吹出所述涂层组合物；并且 用盐水溶液冲洗所述氧合器设备。
【专利摘要】用于要与血液接触的表面例如氧合器设备的表面(例如中空纤维膜(HFM)表面)或人工肺的表面的血液相容性、抗凝血和不凝血、肝素基生物活性涂层，所述涂层包括季铵盐和肝素复合物(QUAT)。用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，接着用所述季铵盐和肝素复合物(QUAT)的涂层处理所述表面以形成PVP-QUAT涂层。根据其它示例实施方案，通过使用溶于包括大量醇连同少量有机溶解剂的溶剂混合物中的离子络合物使所述HFM的表面改性，在所述HFM的一个或多个表面产生阴离子官能团。还提供了制备所提供的涂层的方法、涂布表面的方法、已经涂布的设备及包括此类涂层的试剂盒。
【IPC分类】A61K31/14, A61L33/10
【公开号】CN104902884
【申请号】CN201480004000
【发明人】纳拉亚纳·加里梅拉, 忠俊·吴, 巴特利·格里菲思
【申请人】马里兰大学巴尔的摩校区
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年1月6日
【公告号】EP2941249A1, US20150352265, WO2014107690A1
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