包含稀有脂肪酸的代谢改善剂的制作方法
包含稀有脂肪酸的代谢改善剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及含有稀有脂肪酸的代谢改善剂。更具体而言，本发明涉及利用稀有脂 肪酸诸如氧代脂肪酸、羟基脂肪酸等的生理功能，例如改善脂质、糖和能量的代谢的作用的 代谢改善剂。本发明还涉及含有所述制剂的食品、药品、饲料等。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于暴食、缺乏锻炼等导致的肥胖，特别是伴随内脏脂肪积累的生活方式 相关疾病，已经成为一种社会问题。代谢综合征是指如下病症，其中高血糖、高血压和脂质 异常中的至少两种是并发的并且由于内脏脂肪肥胖而容易发展为动脉硬化。在40-74岁的 日本人中，二分之一的男性和五分之一的女性估计有或可能有代谢综合征。因此，已经提 出了目的在于预防或解决代谢综合征中的脂质积累进展的通过饮食疗法来调节卡路里摄 取的重要性。
[0003] 对摄取、进食功能性脂质存在相当大的兴趣，其中报道所述功能性脂质具有脂质 代谢改善效果、糖尿病改善效果等，包括共轭脂肪酸诸如共轭亚油酸等（非专利文件1)， ?3多不饱和脂肪酸诸如二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等（专利文件1)，中链脂肪酸（专 利文件2)等。
[0004] 此外，近年来已报道，番茄中含有的部分氧代脂肪酸诸如9-氧代-十八碳二烯酸、 13-氧代-十八碳二烯酸等具有改善生活方式相关疾病的活性，诸如脂质代谢改善等（专利 文件3,非专利文件2、3)。因此，稀有脂肪酸诸如氧代脂肪酸、羟基脂肪酸等的生理功能也 引起注意。
[0005] 然而，各种现存的稀有脂肪酸的更详细生理功能是未知的。
[0006][文件列表]
[专利文件] 专利文件I:JP-A-2006-521368 专利文件 2 :W0 2009/096570 专利文件 3 :JP-A-2011-184411 [非专利文件] 非专利文件I:NagaoK，（2005)，J.Biosci.Bioeng.，vol. 100,no. 2,p. 152-157 非专利文件 2:KimY-I，（2011)，Mol.Nutr.FoodRes.，vol. 55,p. 585-593 非专利文件 3:KimY-I，（2012)，PLoSONE，vol. 7,no. 2,e31317。
[0007] 发明概述 本发明要解决的问题 本发明的目的是提供一种含有稀有脂肪酸的改善脂质和/或糖等的代谢的新颖的代 谢改善剂。
[0008] 解决问题的手段 本发明人已对上述问题进行了深入研宄并发现氧代脂肪酸，例如，10-氧代-顺 式-12-十八碳烯酸（下文中还称为"KetoA"），或羟基脂肪酸，例如，10-羟基-顺 式-12-十八碳烯酸（下文中还称为"HYA"）具有过氧化物酶体增生物活化受体（下文中还 称为"PPAR"）-活化作用、血糖水平升高-抑制作用、血液中性脂肪-降低作用、葡萄糖耐 量-改善作用、能量代谢-促进作用等，其是传统上未知的生理功能。
[0009] 此外，本发明人还发现，稀有脂肪酸诸如HYA、KetoA等对肝X受体（下文中还称为 "LXR"）激动剂诱导的脂质合成促进具有抑制作用。
[0010] 基于以上发现完成本发明。
[0011] 因此，本发明提供以下：
[1] 一种代谢改善剂，其包含具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/ 或具有18个碳原子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸。
[0012] [2] [1]的试剂，其中前述氧代脂肪酸和/或羟基脂肪酸具有11-位反式双键或 12-位顺式双键。
[0013] [3] [1]的试剂，其中所述氧代脂肪酸为选自10-氧代-顺式-12-十八碳烯酸 (KetoA)、10-氧代-顺式-12，顺式-15-十八碳二條酸（aKetoA)、10-氧代-顺式_6，川页 式-12-十八碳二烯酸（yKetoA)、10-氧代-顺式-6,顺式-12,顺式-15-十八碳三烯酸 (sKetoA)、10-氧代十八烧酸（KetoB)、10-氧代-顺式_6_十八碳條酸（yKetoB)、10-氧 代-顺式-15-十八碳烯酸（aKetoB)或10-氧代-顺式-6,顺式-15-十八碳二烯酸 (sKetoB)、12_氧代十八烧酸（rKetoB)、l〇-氧代-反式-11-十八碳條酸（KetoC)、l〇-氧 代-顺式_6，反式-11-十八碳二稀酸（yKetoC)、10_氧代-反式-11，顺式-15-十八碳二 條酸（aKetoC)、10-氧代-顺式_6，反式-11，顺式-15-十八碳二條酸（sKetoC)和12-氧 代-顺式-9-十八碳烯酸（KetoRA)的至少一种。
[0014] [4] [1]的试剂，其中所述羟基脂肪酸为选自10-羟基-顺式-12-十八碳烯 酸（HYA)、10-羟基-顺式-12,顺式-15-十八碳二烯酸（aHYA)、10-羟基-顺式-6， 顺式-12-十八碳二烯酸（YHYA)、10-羟基-顺式-6,顺式-12,顺式-15-十八碳三 烯酸（sHYA)、10, 12-二羟基十八烷酸（rHYA)、10-羟基十八烷酸（HYB)、10-羟基-顺 式-15-十八碳烯酸（aHYB)、10-羟基-顺式-6-十八碳烯酸（YHYB)、10-羟基-顺式-6， 顺式-15-十八碳二烯酸（sHYB)、12-羟基十八烷酸（rHYB)、10-羟基-反式-11-十八碳 烯酸（HYC)、10-羟基-反式-11，顺式-15-十八碳二烯酸（aHYC)、10-羟基-顺式-6， 反式-11-十八碳二烯酸（YHYC)UO-羟基-顺式-6,反式-11，顺式-15-十八碳三烯酸 (sHYC)和蓖麻油酸（RA)的至少一种。
[0015] [5] [1]-[4]中任一项的试剂，其用于预防或改善选自肥胖、糖尿病、脂质代谢异 常、高脂血症和脂肪肝的至少一种。
[0016] [6] [1]-[4]中任一项的试剂，其为食品或食品添加剂。
[0017] [7] [1]_[4]中任一项的试剂，其为药品。
[0018] [8] [1]_[4]中任一项的试剂，其为饲料或饲料添加剂。
[0019] [9] 一种改善哺乳动物代谢的方法，其包括将具有18个碳原子和10-或12-位羰 基的氧代脂肪酸和/或具有18个碳原子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸给予所述 哺乳动物。
[0020] [10]具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/或具有18个碳原 子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸，其用作代谢改善剂。
[0021] [11]具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/或具有18个碳原 子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸在制备代谢改善剂中的用途。
[0022] 在本发明中，"和/或"用于表示它们中的任一个或它们二者。
[0023] 发明效果 在本发明中，发现氧代脂肪酸或羟基脂肪酸诸如KetoA或HYA(下文中还称为氧代脂 肪酸等）具有传统上未知的生理功能，例如，PPAR活化作用、血糖水平升高-抑制作用、血 液中性脂肪-降低作用、葡萄糖耐量-改善作用、能量代谢-促进作用等。此外，他们还发 现，由于对LXR的拮抗作用，这些氧代脂肪酸等具有很强的脂质合成抑制作用。
[0024] 基于所述功能，本发明提供含有稀有脂肪酸氧代脂肪酸等的代谢改善剂。由于所 述试剂可在各种领域诸如药品、食品、饲料等中使用，因此本发明在工业中是非常有用的。
[0025] 附图简述 图1显示KetoA或HYA的PPARa/Y报告活性的结果，其中cont.显示阴性对照（添 加乙醇），Posi显示阳性对照（添加PPAR激动剂），并且纵轴显示相对荧光素酶活性。
[0026]图2显示喂食KetoA或HYA后小鼠的体重变化，其中纵轴显示体重（g)，横轴显示 经过时间（周）。
[0027] 图3显示喂食KetoA或HYA后小鼠的血糖水平变化，其中纵轴显示血浆葡萄糖浓 度（mg/dL)，并且横轴显示经过时间（周）。
[0028] 图4显示喂食KetoA或HYA后小鼠的氧消耗，其中纵轴显示耗氧量（mL/kg/hr)，暗 显示暗周期的测定值，并且光显示光周期的测定值。
[0029] 图5显示喂食小鼠KetoA或HYA后的直肠温度，其中纵轴显示直肠温度（°C)。
[0030] 图6显示喂食小鼠KetoA或HYA后的白色脂肪重量，其中纵轴显示腹膜内白色脂 肪重量（g)。
[0031] 图7显示喂食小鼠KetoA或HYA后的中性脂肪，其中纵轴显示血浆甘油三酯浓度 (mg/dL)。
[0032] 图8显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的SREBP-IcmRNA表达的影响，其中纵 轴显示SREBP-IcmRNA的相对表达。
[0033] 图9显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的未成熟SREBP-I表达的影响，其中纵 轴显示未成熟SREBP-Ic的相对表达，并且上图显示Western印迹图。
[0034] 图10显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的成熟SREBP-I表达的影响，其中纵轴 显示成熟SREBP-Ic的相对表达，并且上图显示Western印迹图。
[0035] 图11显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的S⑶-1mRNA表达的影响，其中纵轴 显示S⑶-1mRNA的相对表达。
[0036] 图12显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的FASmRNA表达的影响，其中纵轴显 示FASmRNA的相对表达。
[0037] 图13显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的ACClmRNA表达的影响，其中纵轴显 示ACClmRNA的相对表达。
[0038] 图14显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的ACC2mRNA表达的影响，其中纵轴显 示ACC2mRNA的相对表达。
[0039] 图15显示KetoA或HYA对LXR激动剂导致的三酰基甘油积累的影响，其中纵轴显 示三酰基甘油水平（Ug/mg蛋白质）。
[0040] 图16显示通过荧光素酶试验评价对LXR的拮抗作用，其中纵轴显示相对荧光素酶 活性。
[0041] 实施方案的描述 下面详细说明本发明。
[0042] 在本发明中，"代谢改善"是指脂质和/或糖和/或能量的代谢得到改善。具体而 言，例如，脂质代谢改善是指促进身体组织、血液或淋巴组织中存在的脂质的分解，抑制脂 质合成、预防和/或抑制身体组织诸如脂肪组织等中的脂质的积累，或减少身体组织中积 累的脂质等。"脂质"为甘油三酯和/或胆固醇，包括脂肪酸。
[0043]糖代谢改善是指抑制血液中存在的糖和/或糖化血红蛋白（HbAlc)、空腹血糖水 平的增加，或促进餐后糖代谢。此外，糖代谢改善还包括葡萄糖耐量受损（不包括在正常型 或糖尿病型以及糖尿病前期中的病理学）的改善。"糖"是指单糖、二 糖或多糖。
[0044]能量代谢改善是指使摄入能量水平与释放能量水平的异常平衡状态，或摄入能量 水平与释放能量水平的平衡的不可控状态，达到正常状态或接近正常状态。
[0045] 作为前述代谢改善的指标，可测量PPAR活性。已知PPAR包括至少3种亚型： PPARa、PPARS(与0相同）和PPARy。PPARa主要在肝脏、心脏、肾脏、骨骼肌、褐色脂 肪细胞等中表达，并参与涉及脂肪酸0氧化的许多基因的控制。PPARS几乎在全身（脑、 脂肪组织、皮肤等）表达。PPARy具有至少3种亚型，主要在白色脂肪细胞和巨噬细胞中表 达，并参与脂肪细胞分化等。当确认对于这些PPARs中的至少一种存在或不存在配体（激 动剂，拮抗剂）活性并发现激动剂活性时，判定具有代谢改善效果的可能性高或存在代谢 改善效果。作为一个实例，可进行FEBS Letters 514 (2002) p.315-322中描述的PPAR报 告基因试验。然而，所述方法不限于此。
[0046] 可替代地，可将氧代脂肪酸等给予肥胖或糖尿病动物模型，测量体重、器官重量、 血糖水平、中性脂肪值、耗氧水平、直肠温度等，并可确认其变化的存在或不存在。肥胖或糖 尿病动物模型没有限制，只要它是显示出所述性质的动物。例如，作为前述动物模型，可列 举市售KKAy小鼠、NOD小鼠、NSY小鼠、TSOD小鼠、ZDF/Crl-L印rfa大鼠、SDT/Jcl大鼠等。 可通过已知方法测量体重、器官重量、血糖水平、中性脂肪值、耗氧水平、直肠温度等。使用 这些作为指标，当观察到体重或器官重量或血糖水平、中性脂肪值降低时，或观察到耗氧水 平或直肠温度增加时，判定具有代谢改善效果的可能性高或存在代谢改善效果。
[0047] 可替代地，如下述实例所述，可确认通过加入氧代脂肪酸等，LXR激动剂诱导的脂 质合成-促进作用是否得到抑制。作为此类方法，例如，可参考JournalofLipidResearch 47 (2006) 2712-2717,但方法不限于此。前述文件中描述的方法包括加入LXR激动剂，和 ⑴测量脂质合成-相关因子，例如，SREBP-lc、成熟和未成熟SREBP-1、SCD-1、FAS、ACC1和 /或ACC2的mRNA和/或蛋白表达水平，（2)测量细胞内三酰基甘油水平或（3)使用LXR响 应序列进行荧光素酶试验。LXR激动剂的实例包括但不限于T0901317、22 (R)-羟基胆固醇、 24(S)_羟基胆固醇等。当脂质合成-相关因子的mRNA和/或蛋白表达水平等降低时，判定 脂质合成得到抑制，并且具有代谢改善效果的可能性高或存在代谢改善效果。
[0048] 在本发明中，氧代脂肪酸为具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸 (下文中有时缩写为" 10-氧代脂肪酸"或" 12-氧代脂肪酸"）。它进一步包括10-位羰基 和12-位顺式双键（下文中有时缩写为" 10-氧代，顺式-12脂肪酸")、具有18个碳原子、 10-位羰基及11-位反式双键的氧代脂肪酸（下文中有时缩写为" 10-氧代，反式-11脂肪 酸"）以及具有18个碳原子和10-位羰基但不具有11-和12-位双键的氧代脂肪酸（下文 中有时缩写为" 10-氧代，11，12-饱和脂肪酸"）。
[0049] 更具体而言，它包括10-氧代-顺式-12-十八碳烯酸（KetoA)UO-氧代-顺 式-12，顺式-15-十八碳二烯酸（下文中还称为"(11(6如4"）、10-氧代-顺式-6，顺 式-12-十八碳二烯酸（下文中还称为"yKetoA"）、10-氧代-顺式-6,顺式-12,顺 式-15-十八碳三烯酸（下文中还称为"sKet〇A"）、10-氧代十八烷酸（下文中还称为 "KetoB"）、10-氧代-顺式-6-十八碳烯酸（下文中还称为"YKetoB"）、10-氧代-顺 式-15-十八碳烯酸（下文中还称为"aKetoB"）、10-氧代-顺式-6,顺式-15-十八碳 二烯酸（下文中还称为"sKet〇B"）、12-氧代十八烷酸（下文中还称为"rKet〇B"）、10-氧 代-反式-11-十八碳烯酸（下文中还称为"KetoC"）、10-氧代-顺式-6,反式-11-十八 碳二烯酸（下文中还称为"YKetoC"）、10-氧代-反式-11，顺式-15-十八碳二烯酸（下 文中还称为"aKetoC"）、10-氧代-顺式-6,反式-11，顺式-15-十八碳三烯酸（下文中 还称为"sKet〇C"）、12-氧代-顺式-9-十八烷酸（下文中还称为"KetoRA"）等。
[0050] 在本发明中，羟基脂肪酸是指具有18个碳原子和10-位羟基的羟基脂肪酸（下文 中有时缩写为"10-羟基脂肪酸"）或具有18个碳原子和12-位羟基的羟基脂肪酸（下文 中有时缩写为" 12-羟基脂肪酸")。此处，也涵盖具有10-和12-位羟基的" 10, 12-二羟基 脂肪酸"作为"10-羟基脂肪酸"、"12-羟基脂肪酸"的一个实施方案。此外，也涵盖具有18 个碳原子、10-位羟基和12-位顺式双键的羟基脂肪酸（下文中有时缩写为"10-羟基，顺 式-12脂肪酸"）、具有18个碳原子、10-位羟基和11-位反式双键的羟基脂肪酸（下文中 有时缩写为"10-羟基，反式-11脂肪酸"）以及具有18个碳原子和10-位羟基但不具有 11和12-位双键的羟基脂肪酸（下文中有时缩写为" 10-羟基，11，12-饱和脂肪酸"）。
[0051] 更具体的实例包括但不限于10-羟基-顺式-12-十八碳烯酸（HYA)UO-羟 基-顺式-12,顺式-15-十八碳二烯酸（下文中还称为"aHYA"）、10-羟基-顺式-6， 顺式-12-十八碳二烯酸（下文中还称为"yHYA"）、10-羟基-顺式-6,顺式-12,顺 式-15-十八碳三烯酸（下文中还称为"别￥4"）、10，12-二羟基十八烷酸（下文中还称为 "rHYA")、10-羟基十八烷酸（下文中还称为"HYB")、10-羟基-顺式-15-十八碳烯酸（下 文中还称为"aHYB"）、10-羟基-顺式-6-十八碳烯酸（下文中还称为"YHYB"）、10-羟 基-顺式-6,顺式-15-十八碳二烯酸（下文中还称为"sHYB")、12-羟基十八烷酸（下文中 还称为"rHYB"）、蓖麻油酸（下文中还称为"RA"）、10-羟基-反式-11-十八碳烯酸（下文 中还称为"HYC")、10_羟基-反式-11，顺式-15-十八碳二烯酸（下文中还称为"aHYC")、 10-羟基-顺式-6,反式-11-十八碳二烯酸（下文中还称为"YHYC")、10-羟基-顺式-6， 反式-11，顺式-15-十八碳三烯酸（下文中还称为"sHYC"）等。
[0052] 本发明中使用的稀有脂肪酸诸如氧代脂肪酸、羟基脂肪酸等可通过日本专利申 请号2012-108928中描述的方法制备，并且HYA可参照BiochemicalandBiophysical ResearchCommunications416 (2011)p. 188-193 等制备。RA、rHYB等可使用市售产品。 KetoRA、rKetoB可通过利用以下络酸氧化等从RA制备。
[0053] 日本专利申请号2012-108928中描述的具体方法如下。
[0054] 10-氧代脂肪酸从具有18个碳原子和9-位顺式双键的不饱和脂肪酸（下文中有 时缩写为"顺式-9不饱和脂肪酸"）通过两步反应产生。在第一反应（反应1)中，10-羟 基脂肪酸从顺式-9不饱和脂肪酸通过水合酶反应产生。
[0055] "反应1"中的底物没有特别限制，只要它是具有18个碳原子和9-位顺式双键 的不饱和脂肪酸，并且其实例包括一烯酸（18:1)、二烯酸（18:2)、三烯酸（18:3)、四烯酸 (18:4)、五烯酸（18:5)等。更优选的是二烯酸、三烯酸和四烯酸，并且特别优选的是二烯酸 和三烯酸。在本说明书中，"脂肪酸"不仅涵盖游离酸，还涵盖酯形式、与碱性化合物形成的 盐等。
[0056] -烯酸的实例包括油酸、蓖麻油酸等。
[0057] 二烯酸的实例包括亚油酸，顺式_9,反式-11-十八碳二烯酸等。
[0058] 三烯酸的实例包括a-亚麻酸、Y-亚麻酸等。
[0059] 四烯酸的实例包括十八碳四烯酸等。
[0060] 尽管催化反应1的水合酶没有特别限制，只要它是能够利用上述顺式-9不饱和脂 肪酸作为底物并能够转化成10-羟基脂肪酸的酶，但例如，优选的是乳酸菌-来源的脂肪 酸-水合酶（CLA-HY)。更优选的是植物乳杆菌-来源的CLA-HY，并且特别优选的是植物乳 杆菌FERMBP-10549菌株-来源的CLA-HY。CLA-HY可通过JP-A-2007-259712等描述的方 法得到。
[0061] 要加入的水合酶的量为，例如，0.001-10mg/ml，优选0? 1-5mg/ml，更优选0.2-2 mg/ml〇
[0062] "辅因子"可用于反应1，并且例如，可使用NADH、NADPH、FADH^。加入浓度可以 是任意的，只要水合反应有效进行。优选0.001-20mM，更优选0.01-10mM。
[0063] 此外，"活化剂"可用于酶反应，并且例如，可提及一种或多种选自以下的化合物： 钼酸钾、无水钼酸二钠（VI)、钼酸二钠（VI)二水合物、正钒酸钠（V)、偏钒酸钠（V)、钨酸钾 (VI)、无水钨酸钠（VI)和钨酸钠（VI)二水合物。其加入浓度可以是任意的，只要水合反应 有效进行。优选0. 1-20mM，更优选1-10mM。
[0064] 例如，rHYA可通过将下列物质加入到RA中至总量为10ml，并在37°C、225rpm下 进行无氧振荡反应63hr获得：100mM磷酸钾缓冲液（pH6. 5)，其含有在大肠杆菌中表达的 水合酶（湿菌体重 〇? 7g)，NADH(33mg)，FAD(0. 8mg)，蓖麻油酸（Ig)，BSA(0. 2g)。 [0065]另一方面，12-羟基脂肪酸可，例如，通过含有甘油三酯作为主要成分的天然油的 水解获得，其中甘油三酯含有12-羟基脂肪酸作为组成脂肪酸。例如，RA可通过蓖麻油的 水解获得，并且rHYB可通过氢化蓖麻油的水解获得。
[0066]在第二反应（反应2)中，10-氧代脂肪酸从10-羟基脂肪酸通过脱氢酶反应或使 用铬酸的化学氧化产生。
[0067]尽管催化反应2的脱氢酶没有特别限制，只要它是能够利用10-羟基脂肪酸作为 底物并能够转化为10-氧代脂肪酸的酶，但例如，优选的是乳酸菌-来源的羟基脂肪酸-脱 氢酶（CLA-DH)。更优选的是植物乳杆菌-来源的CLA-DH，并且特别优选的是植物乳杆菌 FERMBP-10549菌株-来源的CLA-DH。CLA-DH可通过JP-A-2007-259712等描述的方法得 到。
[0068] 要加入的脱氢酶的量为，例如，0.001-10mg/ml，优选0? 1-5mg/ml，更优选0.2-2 mg/ml〇
[0069] "辅因子"可用于反应2 ,并且例如，可使用NAD、NADP、FAD等。加入浓度可以是任 意的，只要氧化反应有效进行。优选0.001-20mM，更优选0.01-10mM。
[0070] 此外，"活化剂"可用于酶反应，并且例如，可以类似的加入浓度使用与上述反应1 中的实例所述的那些类似的化合物。
[0071] 第二反应可通过化学氧化进行。
[0072] 作为化学氧化，可提及本身已知的方法，例如铬酸氧化，优选琼斯氧化等。作为铬 酸，可使用化合物的盐和复合物诸如无水铬酸CrO3、铬酸H2CrO4和重铬酸H2Cr207。
[0073] 类似地，12-氧代脂肪酸可从12-羟基脂肪酸获得。例如，KetoRA可通过以下方法 获得。
[0074] 具体而言，将硫酸（2. 3ml)和水（7. 7ml)加入到无水铬酸（2. 67g)中，并将丙 酮（90ml)加入到混合物中以得到络酸溶液。将5gRA和100ml丙酮加入到Erlenmeyer 烧瓶中，并在冰上在搅拌器中搅拌下滴加上述铬酸溶液。当溶液从蓝绿色变为浅橙色时，停 止滴加铬酸溶液，用异丙醇停止反应。通过离心除去沉淀的沉淀物，将获得的离心上清液置 于分液漏斗中并与己烷（100ml)和Milli-Q水（100ml)充分混合。通过离心回收己烷 层，用Mi11i-Q水洗涤数次并通过旋转蒸发仪浓缩以提取反应产物和未反应的底物。约98% 的提取物可确认为KetoRA。用己烷溶胀提取物（含有KetoRA的混合物）的20至30倍重 量的硅胶（Wakogel(r)C-100)，装入玻璃柱中，并将硫酸钠（无水）置于其上。将上述获得 的提取物（含有KetoRA的混合物）悬浮于己烷：乙醚=8:2洗脱液中并加到柱中。洗脱液 以约2ml的流速流动，并分级和回收从柱中排出的溶液。通过LC/MS和气相色谱法分析回 收的各级分。收集仅含有KetoRA的级分并通过旋转蒸发仪浓缩以得到纯度不小于99%的 KetoRA。
[0075] 另外，rKetoB可以与rHYB中相同的方式通过铬酸氧化获得。
[0076] 10-氧代，反式-11脂肪酸从具有18个碳原子、10-位羰基和12-位顺式双键的 氧代脂肪酸通过异构酶反应（反应3)产生。
[0077] 反应3的"底物"没有特别限制，只要它是通过上述反应1和2从具有18个碳原 子以及9-和12-位顺式双键的不饱和脂肪酸诱导的10-氧代，顺式-12脂肪酸。其实例 包括亚油酸诱导的KetoA、a-亚麻酸诱导的aKetoA、y-亚麻酸诱导的yKetoA、十八碳 四烯酸诱导的sKetoA等。底物可通过反应1和2以外的方法获得。
[0078] 尽管催化反应3的异构酶没有特别限制，只要它是能够利用上述10-氧代，顺 式-12脂肪酸作为底物且能够转化成10-氧代，反式-11脂肪酸的酶，但例如，优选的是乳 酸菌-来源的氧代脂肪酸-异构酶（CLA-DC)。更优选的是植物乳杆菌-来源的CLA-DC， 并且特别优选的是植物乳杆菌FERMBP-10549菌株-来源的CLA-DC。CLA-DC可通过 JP-A-2007-259712等描述的方法得到。
[0079] 要加入的异构酶的量为，例如，0.001-10mg/ml，优选0? 1-5mg/ml，更优选0.2-2 mg/ml〇
[0080] "活化剂"可用于异构酶反应，并且例如，可以类似的加入浓度使用与上述反应1中 的实例所述的那些类似的化合物。
[0081] 10-氧代，11，12-饱和脂肪酸从具有18个碳原子、10-位羰基和11-位反式双键 的氧代脂肪酸（10-氧代，反式-11脂肪酸）通过饱和酶（saturase)反应（反应4)产生。 [0082]反应4的"底物"没有特别限制，只要它是通过上述反应3产生的10-氧代，反 式-11脂肪酸。其实例包括KetoA诱导的KetoC、aKetoA诱导的aKetoC、yKetoA诱导的 yKetoC、sKetoA诱导的sKetoC等。底物可通过反应3以外的方法获得。
[0083] 尽管催化反应4的饱和酶没有特别限制，只要它是能够利用上述10-氧代，反 式-11脂肪酸作为底物且能够转化成10-氧代，11，12-饱和脂肪酸的酶，但例如，优选的 是乳酸菌来源的氧代脂肪酸-烯酮还原酶（CLA-ER)。更优选的是植物乳杆菌-来源的 CLA-ER，并且特别优选的是植物乳杆菌FERMBP-10549菌株-来源的CLA-ER。
[0084]上述酶 "CLA-ER" 为 (a) 由SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列组成的酶蛋白质， (b) 蛋白质，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列， 其中一个或多个氨基酸经缺失和/或取代和/或插入和/或添加，并具有催化上述反应4 的酶活性，或 (C)蛋白质，其由碱基序列编码，所述碱基序列在严格条件下与SEQIDNO: 1所示的 碱基序列的互补链序列组成的核酸杂交，并具有催化上述反应4的酶活性。
[0085]上述（b)的更具体实例包括蛋白质，其含有⑴氨基酸序列，其为SEQIDNO: 2所 示的氨基酸序列，其中1-20,优选1-10,更优选1-若干（5、4、3或2)个氨基酸被缺失，（ii) 氨基酸序列，其为SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列，其中1-20,优选1-10,更优选1-若干 (5、4、3或2)个氨基酸被添加，（iii)氨基酸序列，其为SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列， 其中1-20,优选1-10,更优选1-若干（5、4、3或2)个氨基酸被插入，（iv)氨基酸序列，其 为SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列，其中1-20,优选1-10,更优选1-若干（5、4、3或2)个 氨基酸被其它氨基酸取代，或（V)通过将它们组合所获得的氨基酸序列。当具有类似特性 的氨基酸（例如，甘氨酸和丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸和异亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸、天冬氨 酸和谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、赖氨酸和精氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸、苯丙氨酸和酪 氨酸等）互相取代等时，更大数目的取代等是可能的。
[0086] 当如上所述氨基酸经缺失、取代或插入时，缺失、取代和插入的位置没有特别限 制，只要保持上述酶活性。
[0087]在上述（C)中，"严格条件"为如下条件，在该条件下具有高同一性（例如，70%、 80%、90%、95%或99%或以上的同一性）的核苷酸序列彼此杂交且具有低于上述同一性的核 苷酸序列不杂交；具体而言，为在对应于一般Southern杂交等的洗绦条件（60°C，lxSSC， 0.1%505，优选地，0.&55(：，0.1%505，更优选地，681：，0.1155(：，0.1%505)的盐浓度和温 度下洗涤1次，更优选2-3次的条件。
[0088]CLA-ER可通过本身已知的蛋白质分离和纯化技术，例如通过使用催化上述反应4 的酶活性作为指标，从例如植物乳杆菌FERMBP-10549菌株的真菌和培养基中分离。可替代 地，它也可通过基于SEQIDNO: 1所示的碱基序列的信息，合成CLA-ER的编码区的总碱基 序列，或设计能够扩增含有编码区的CLA-ER基因片段的引物，使用从上述菌株制备的cDNA 或基因组DNA作为模板进行PCR，克隆所得的扩增片段为合适的表达载体并将其引入宿主 细胞中，以及培养细胞而重组产生。
[0089] 作为含有编码上述CLA-ER的核酸的载体，可根据对象（例如，蛋白质表达）适当 地选择适合于要被载体导入的宿主细胞的载体并使用。表达载体可含有适当的启动子、转 录终止信号和选择性标记基因（药物抗性基因、补充营养缺陷型突变的基因等）。此外，它 可含有编码用于表达的蛋白质等的分离和纯化的标签序列的序列。可替代地，载体可并入 靶宿主细胞的基因组中。可通过本身已知的转化方法诸如感受态细胞法、原生质体法、磷酸 钙共沉淀法等，将载体引入到靶宿主细胞。
[0090] 上述"宿主细胞"可以是任何细胞，只要它能够表达含有编码上述CLA-ER的核酸 的载体，并且可提及细菌、酵母、真菌、高等真核细胞等。细菌的实例包括革兰氏阳性菌诸如 芽孢杆菌属、链霉菌属等，以及革兰氏阴性菌诸如大肠杆菌等。可通过本身已知的适于宿主 细胞的方法培养用含有编码CLA-ER的核酸的载体引入的重组细胞。
[0091] 上述CLA-ER的"纯化"可通过本身已知的方法进行，例如，使通过离心等收集的真 菌通过超声或玻璃珠等破裂，固体诸如细胞碎片等通过离心等除去，以得到粗酶溶液，对其 进行使用硫酸铵、硫酸钠等的盐析法，层析法诸如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析 等，凝胶电泳等。
[0092] 要加入的饱和酶的量为，例如，0.001-10mg/ml，优选0? 1-5mg/ml，更优选0.2-2 mg/ml〇
[0093]"辅因子"可用于反应4,并且例如，可以使用NADH等。加入浓度可以是任意的，只 要氧化反应有效进行。它优选为0.001-20mM，更优选0.01-10mM。
[0094] 此外，"活化剂"可用于酶反应，并且例如，可以类似的加入浓度使用与上述反应1 中的实例所述的那些类似的化合物。
[0095] 10-羟基，反式-11脂肪酸从具有18个碳原子、10-位羰基和11-位反式双键 的氧代脂肪酸（10-氧代，反式-11脂肪酸）通过脱氢酶反应（反应5)产生或10-羟 基，11，12-饱和脂肪酸从具有18个碳原子和10-位羰基但不具有11-和12-位双键的氧 代脂肪酸（10-氧代，11，12-饱和脂肪酸）通过脱氢酶反应（反应6)产生。
[0096]反应5的"底物"没有特别限制，只要它是通过上述反应3产生的10-氧代，反 式-11脂肪酸。其实例包括KetoA诱导的KetoC、aKetoA诱导的aKetoC、yKetoA诱导的 yKetoC、sKetoA诱导的sKetoC等。底物可通过反应3以外的方法获得。
[0097] 另一方面，反应6的"底物"没有特别限制，只要它是通过上述反应4产生的10-氧 代，11，12-饱和脂肪酸。其实例包括KetoC诱导的KetoB、aKetoC诱导的aKetoB、yKetoC诱导的YKetoB、sKetoC诱导的sKetoB等。底物可通过反应4以外的方法获得。
[0098] 尽管催化反应5或反应6的脱氢酶没有特别限制，只要它是能够利用10-氧代，反 式-11脂肪酸或10-氧代，11，12-饱和脂肪酸作为底物且能够转化成10-羟基，反式-11月旨 肪酸或10-羟基，11，12-饱和脂肪酸的酶，但例如，优选的是乳酸菌来源的羟基脂肪酸-脱 氢酶（CLA-DH)。更优选的是植物乳杆菌-来源的CLA-DH，并且特别优选的是植物乳杆菌 FERMBP-10549菌株-来源的CLA-DH。尽管CLA-DH催化上述反应2中的氧化反应，但它也 可以催化作为逆反应的反应5或反应6中的还原反应。
[0099] 要加入的脱氢酶的量为，例如，0.001-10mg/ml，优选0? 1-5mg/ ml，更优选0.2-2 mg/ml〇
[0100] "辅因子"可用于反应5和反应6,并且例如，可以使用NADH、NADPH、FADH^〇WA 浓度可以是任意的，只要还原反应有效进行。它优选为0.001-20mM，更优选0.01-10mM。
[0101] 此外，"活化剂"可用于酶反应，并且例如，可以类似的加入浓度使用与上述反应1 中的实例所述的那些类似的化合物。
[0102] 在上述各反应中，酶（水合酶、脱氢酶、异构酶、饱和酶）以引入含有编码所述酶 的核酸的表达载体的重组细胞（例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞 等）的形式经受反应体系。在这种情况下，反应也可通过在适合于细胞培养，并加入底物， 必要时加入辅因子和活化剂的液体培养基中培养细胞来进行。此外，任何上述酶可以是纯 化的酶或粗纯化的酶。可替代地，水合酶可在真菌诸如大肠杆菌等中表达，并可以使用真菌 本身或可以使用其培养基。此外，酶可以是游离型的，或通过各种载体固定。
[0103] 含有氧代脂肪酸等的本发明的代谢改善剂也可应用于生活方式相关的疾病的改 善。"生活方式相关的疾病"为生活习惯诸如饮食习惯、运动习惯、休息、吸烟、饮酒等涉及其 发生和发展的疾病组，并且包括病理学诸如成人肥胖、儿童肥胖、营养共济失调、食欲减退、 胃癌、大肠癌、痛风、高血压、动脉硬化、肾结石、心肌梗塞、心绞痛、胃溃疡、肾脏疾病、骨质 疏松症、牙周炎、酒精性肝炎、肝硬化、肝癌、肺癌、支气管炎、肺气肿、牙周疾病、脑中风、脑 梗塞、动脉瘤、过劳死、失眠等。
[0104] 此外，本发明的代谢改善剂也可用于糖尿病（1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病 等）、糖尿病并发症（动脉硬化性疾病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病、糖尿病性神经 病等）、脂质代谢异常、高脂血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗和脂肪肝的 预防或改善。
[0105] 可替代地，本发明的代谢改善剂可通过给予人或除人以外的动物（例如，狗、猫、 小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猪、牛、鸡、长尾小鹦鹉、鹩哥、山羊、马、绵羊、猴等）用于选自肥 胖、糖尿病、脂质代谢异常、尚脂血症、尚胆固醇血症、尚甘油二醋血症、膜岛素抵抗和脂肪 肝的至少一种的预防或治疗。
[0106] 含有氧代脂肪酸等的本发明的代谢改善剂可用作，例如，药品、食品、饲料、化妆品 等，或通过将试剂加入到它们中使用。
[0107] 药品的剂型包括分散剂、颗粒剂、丸剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片剂、快速崩解 片剂、糖浆、液体、悬浮液、栓剂、软膏、乳膏、凝胶、粘合剂、吸入剂、注射剂等。其制剂根据常 规方法制备。由于氧代脂肪酸等难溶于水，将它们溶解在非亲水性的有机溶剂中，例如植物 来源的油、动物来源的油等或通过均化器（高压均化器）与乳化剂、分散剂、表面活性剂等 一起在水溶液中分散或乳化并使用。
[0108] 可用于配制的添加剂的实例包括动物和植物油诸如大豆油、红花油、橄榄油、胚芽 油、向日葵油、牛脂、沙丁鱼油等，多元醇诸如聚乙二醇、丙二醇、甘油、山梨醇等，表面活性 剂诸如脂肪酸脱水山梨醇酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸甘油酯、脂肪酸聚甘油酯等，赋形剂诸 如纯净水、乳糖、淀粉、结晶纤维素、D-甘露醇、卵磷脂、阿拉伯胶、山梨醇溶液、碳水化合物 溶液等，甜味剂、着色剂、PH调节剂、香料等。使用时可将液体制剂溶解或悬浮于水或其它 合适的介质中。另外，片剂和颗粒剂可通过熟知的方法进行包衣。
[0109] 对于注射形式给药，静脉内、腹膜内、肌内、皮下、经皮、关节内、滑膜内、鞘内、骨膜 内（intraperiosteum)、舌下、口服给药等是优选的，并且静脉内给药或腹膜内给药是特别 优选的。静脉内给药可以是滴注给药和推注（bolus)给药的任一种。
[0110] 当本发明的代谢改善剂用作食品或食品添加剂时，食品的形式没有特别限制，只 要它允许口服食用，诸如溶液、悬浮液、粉末、固体成形制品等。具体的实例包括补充剂（粉 末、颗粒剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片剂、快速崩解片剂、糖浆、液体等）、饮料（碳酸饮 料、乳酸饮料、运动饮料、果汁饮料、蔬菜饮料、豆奶饮料、咖啡饮料、茶饮料、粉末饮料、浓缩 饮料、营养饮料、酒精饮料等）、甜食（橡皮糖、果冻、口香糖、巧克力、饼干、糖果、焦糖、曰本 甜食、点心等）、方便食品（方便面、蒸煮食品、罐头、微波食品、速食汤、味增汤、冻干食品 等）、油、脂肪和油食品（蛋黄酱、调味品、黄油、稀奶油、人造奶油等）、小麦粉制品（面包、 面食、面条、蛋糕粉、面包肩等），调味品（沙司、番茄加工调味品、风味调味料、烹调混合物、 汤等）、加工肉制品（火腿肉、香肠等）。
[0111] 上述食品可含有（必要时）各种营养素、各种维生素（维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K等）、各种矿物质（镁、锌、铁、钠、钾、 硒等）、膳食纤维、分散剂、稳定剂诸如乳化剂等、甜味剂、香料组分（柠檬酸、苹果酸等）、香 料、蜂王衆、蜂胶、Agaricus等。
[0112] 当本发明的代谢改善剂用作饲料或饲料添加剂时，饲料为，例如，宠物食品、畜牧 业或水产业饲料添加剂等。
[0113] 当本发明的代谢改善剂用作化妆品或化妆品添加剂时，化妆品为，例如，乳膏、凝 胶、乳液、精华液、化妆水、微乳精华（microemulsionessence)、面膜、粉底、口红、眼影、洗 发剂、护发素、沐浴添加剂等，并且香料等可与其混合。
[0114] 仅一种氧代脂肪酸等可与本发明的药品、食品、饲料、化妆品等混合或其两种或更 多种可组合使用。
[0115] 本发明的药品的剂量或本发明的食品的摄取量可根据患者或摄取其的那些的年 龄和体重、症状、给药时间、剂型、给药方法、药物组合等来适当确定。例如，当本发明的药 品口服给药时，作为活性成分的氧代脂肪酸等的总量对于成人为每天0. 02-100mg/kg体 重，优选0.2-50mg/kg体重，或通过肠胃外给药为0.002mg-50mg/kg体重，优选0.02-50 mg/kg体重，其可每天给药一次或每天给药数次（2-5)。当它作为食品摄取时，可将它加入 到食品中使得作为活性成分的氧代脂肪酸等的总摄取量对于成人为每天1-6000mg，优选 10-3000mg。本发明的饲料的摄取量和本发明的化妆品的使用量可根据上述食品的摄取量 和上述药品的剂量各自适当确定。
[0116] 通过参考实施例在下面对本发明进行更详细地解释。实施例仅为本发明的示例而 不以任何方式限制本发明的范围。 实施例
[0117] 基于上述方法（日本专利申请号2012-108928中描述的方法）制备本发明中使用 的稀有脂肪酸诸如1^(^、1^、丫1^、丫1^(^、1'1^等。1^0狀基于上述方法从蓖麻油 酸（RA)制备。GW7647(PPARa激动剂）、曲格列酮（PPARy激动剂）购自Sigma-Aldrich， T0901317(LXR激动剂）购自CaymanChemical，RA购自NU-CHEKPREP，INC. (USA)(产品号： U-50-A)，EPA购自NU-CHEKPREP，INC. (USA)(产品号：U-99-A)，LA购自Sigma-Aldrich(产 品号：L1376)，其它试剂购自WakoPureChemicalIndustries，Ltd?或NacalaiTesque 等。
[0118] [实施例1] PPAR a , Y配体活生的测量 为了评估氧代脂肪酸等的功能，首先测定PPARa,y-活化作用。参照Nobuyuki Takahashi等人，FEBSLetters514 (2002)p. 315-322,"Dualactionofisoprenols fromherbalmedicinesonbothPPARgammaandPPARalphain3T3-L1adipocytesand HepG2hepatocytes^?MaterialsandMethods章节"Reporterplasmidsandluciferase assays"进行测定。具体而言，将含有编码PPARa，Y配体结合区域和GAL4DNA结合区 域的融合蛋白的DNA的质粒（pM-hPPARa或pM-hPPARY)、含有连接到荧光素酶的GAL4 结合DNA序列的报告质粒（p4xUASg-tk-luc)以及标准化转染效率的内部控制（internal control) (pRL-CMV)引入源自非洲绿猴肾的CV-I细胞中。将下面描述的配体加入到细胞 中，并在培养24hr后，测定荧光素酶活性。作为配体，分别加入30yM的KetoA和HYA。
[0119] 用乙醇调节样品浓度。乙醇用作阴性对照，PPARa用作阳性对照，GW7647(10nm) 和曲格列酮（5yM)用作y激动剂。结果示于图1中。
[0120] 从图1看出，在KetoA中发现强PPARa和y激动剂活性，在HYA中发现PPARa 激动剂活性和一些PPARy激动剂活性。
[0121] 通过类似的方法，还测定aKetoA、yKetoA、sKetoA、KetoB、yKetoB、aKetoB、 sKetoB、rKetoB、KetoC、yKetoC、aKetoC、sKetoC、KetoRA、aHYA、yHYA、sHYA、rHYA、HYB、 aHYB、yHYB、sHYB、rHYB、RA、HYC、aHYC、yHYC和sHYC的荧光素酶活性。结果是，KetoC、 RA、rKetoB和rHYA显示PPARa激动剂活性，aKetoA和yKetoA显示PPARy激动剂活性。
[0122] [实施例2] 对肥胖或糖尿病樽塑小鼠的影晌 (1)使用KKAy小鼠作为肥胖或糖尿病模型小鼠，评估KetoA、HYA的影响。KKAy小鼠 (KKAy/TaJcl，雄性，4周龄，购自CLEAJapan，Inc.且单独饲养）用市售的普通饲料（ND)预 先饲养1周，分成5组，每组用高脂饮食（HFD)作为基本饲料，并给予无添加饲料（对照组） 或添加不同量的KetoA和HYA的饲料饲养4周。添加KetoA、HYA的饲料通过将KetoA、HYA 加入到HFD中使得加入量为0? 05%(w/w) (0? 05%组）或0?l%(w/w) (0? 1%组）来制备。
[0123] (2)测定KKAy小鼠的体重和血糖水平的演变（profile)。试验饲料饲养开始后， 在第16-19天测量氧消耗水平，第24天进行口服葡萄糖负荷试验，并在第26天测量直肠温 度。在实验饲养完成的第二天，解剖KKAy小鼠，并测量器官重量和血浆中性脂肪水平。
[0124] (3)KKAy小鼠的体重演变示于图2中。在添加KetoA的饲料组中，在0. 05%组中 发现体重增加的抑制倾向，在0. 1%组中发现体重增加的显著抑制。在添加HYA的饲料组中， 在0.05%组中发现体重增加的显著抑制。在图中，*表示P〈0.05,林表示P〈0.01 (下文 中这对于图3-7是相同的）。
[0125]KKAy小鼠的血糖水平演变示于图3中。在试验饮食摄入4周时，与对照组相比，在 0.05%KetoA组中发现血糖升高的抑制倾向。此外，在0.1%KetoA组中发现更强的显著降 血糖作用。另一方面，HYA组显示血糖水平升高的抑制倾向，即使未发现显著差异。KKAy小 鼠的氧消耗水平示于图4中。此外，KKAy小鼠的直肠温度的结果示于图5中。与对照组相 比，在KetoA组中发现氧消耗水平增加，并且也发现直肠温度升高。结果显示，KetoA组促 进热量生成。KKAy小鼠的器官重量（腹膜内白色脂肪重量）的结果示于图6中，血浆中性 脂肪的结果示于图7中。在0.1%KetoA组中证实了腹膜内白色脂肪重量和血浆中性脂肪 水平的显著降低。
[0126] (4)从上述结果看出，与肥胖有关的代谢异常在KetoA摄入组中得到改善。由于 发现氧消耗水平增加和直肠温度升高，认为通过KetoA促进热量生成有助于代谢异常的改 善。
[0127][实施例3] 对LXR激动剂诱导脂肪酸合成的影晌 使用人肝癌来源的H印G2细胞（细胞号JCRB1054,HealthScienceResearch ResourcesBank)，通过参照Zaima等人（JournalofLipidResearch47,2712_2717， 2006)的方法评估对经LXR激动剂诱导的脂肪酸合成促进的抑制效果。
[0128]HepG2细胞（2.OxlO5个细胞/mL)在含有10%FBS的DMEM培养基中培养24hr，并 将培养基用含有10nMLXR激动剂T0901317(CaymanChemicals)和60yM各种脂肪酸的 含0. 1%BSA的DMEM培养基替换。培养24hr后，回收细胞，并使用S印asol试剂（Nacalai Tesque)提取总RNA。DNA酶处理后，使用SuperScriptll(Invitrogen)进行反转录以得到 cDNA溶液。使用SYBRGreenMix(Bio-Rad，Richmond，CA)和基因特异性引物（表1)，如下 进行实时PCR。
[0129] L在96°C下反应 15min，2.在96°C下反应 15sec，3?在60°C下反应30sec，4. 荧光测量，5?将2-4重复40次，6?以0.4°C间隔测量65°C至95°C的熔解曲线。18SrRNA 用作内标。测量的脂肪酸合成所涉及的基因为留醇调节因子结合蛋白-Ic(SREBP-Ic)J^ 脂酰辅酶A去饱和酶-I(S⑶-1)、脂肪酸合酶（FAS)和乙酰辅酶A羧化酶-1和-2 (ACC-1， 2)。对于积累的细胞内TG的量，用氯仿-甲醇提取脂质，并通过甘油三酯-E试验Wako(Wako PureChemicalIndustries，Ltd.)定量。
[0130] 此外，测定未成熟和成熟SREBP-lc的蛋白表达水平。将按照上述处理的细胞分散 于含有蛋白酶抑制剂的缓冲液A(250mM蔗糖，10mMHEPES-K0H，10mMKC1，1.5mMMgCl2, ImMEDTA-Na，lmMEGTA-Na，pH7.6)中，通过 23 号注射针 20 次，并离心（l，000xg，4°C，5 min)以分离成上清液1和沉淀物1。将沉淀物1再溶于缓冲液B(20mMHEPES-K0H，0. 42M 恥(：1，2.5%甘油，1.511111%(：12，11111￡0丁六-似，11111￡6丁六-似，？117.6)中，并离心（10 5叉8，4°C，15min)。得到的上清液2用作核部分（包括成熟形式）。将上清液1进一步离心 (105xg，4°C，15min)，将得到的沉淀物 2 溶于细胞溶解液（10mMTris-HCl，100mMNaCl， l%SDS，lmMEDTA-Na，lmMEGTA-Na)中并用作膜部分（包括未成熟形式）。使用这些作为 样品，使用抗SREBP-I多克隆抗体（SantaCruz)通过Western印迹方法进行测量。使用双 焚光素酶系统（Promega)，通过焚光素酶试验评估对LXR的诘抗作用。将p3xIRl-tk_Luc、 PCMX-hLXRa、pRL-CMX引入H印G2细胞中。在含有各种脂肪酸和T0901317的含0. 1%BSA的 无血清培养基中培养24hr后，测量荧光素酶活性。
[0131] 图8显示SREBP-IcmRNA表达的变化。T0901317使表达增加至约7倍，但在HYA和 KetoA中发现强烈抑制作用。Western印迹的结果还显示，HYA和KetoA强烈抑制T0901317 诱导的成熟和未成熟的SREBP-I的表达的促进（图9、10)。也显示在由SREBP-Ic进行的 转录调控下的脂质合成相关基因（S⑶_1、FAS、ACC1，2)也显示通过这些脂肪酸导致的下调 (图11-14)。尽管细胞内三酰基甘油水平也通过T0901317增加（图15)，但该增加被共同 存在的这些脂肪酸显著抑制。通过荧光素酶试验检查对调节SREBP-Ic的细胞核受体LXR 的拮抗作用发现，这些脂肪酸显著抑制T0901317的作用，从而拮抗LXR(图16)。
[0132]在图8-16中，*表示？〈0.05，**表示？〈0.001，***表示卩〈0.0001&8.1'0901317 添加，无脂肪酸添加）。
[0133]通过类似的方法还测量aKetoA、yKetoA、sKetoA、KetoB、yKetoB、aKetoB、 sKetoB、rKetoB、KetoC、yKetoC、aKetoC、sKetoC、KetoRA、aHYA、yHYA、sHYA、rHYA、HYB、 aHYB、yHYB、sHYB、rHYB、RA、HYC、aHYC、yHYC和sHYC的SREBP-lc、成熟和未成熟的 SREBP-I表达、S⑶-1、?八5、八〇：1，2、细胞内三酰基甘油水平和对^0?的拮抗作用（通过荧光 素酶试验）。结果是，yHYA、yKetoA、aKetoA、HYB、rHYB、RA、rKetoB也通过对LXR的拮 抗作用而显示脂质合成抑制作用。
[0134] 上述结果显示，来自该时间检测的脂肪酸的HYA与KetoA通过对LXR的拮抗作用 而具有强烈的脂质合成抑制作用。类似地，稀有脂肪酸诸如yHYA、yKetoA、aKetoA、HYB、 rHYB、RA、rKetoB等也显示具有脂质合成抑制作用。
[0135] 尽管本发明已在优选的实施方案中作了重点描述，但对于本领域技术人员而言显 而易见的是，可对优选的实施方案进行修改。
[0136] 本文引用的任何出版物（包括专利和专利申请）中公开的内容在此通过引用全部 并入，如它们已在本文公开的程度。
[0137] 本申请基于2012年10月29日在日本提交的专利申请号2012-237933,其内容在 此通过引用全部并入。
[0138] 工业实用性 本发明已阐明氧代脂肪酸等具有传统上未知的脂质和/或糖和/或能量代谢改善作用 作为其生理功能。含有氧代脂肪酸等的脂质和/或糖和/或能量代谢改善剂适用于各种领 域诸如药品、食品、饲料等，并且本发明在工业上是非常有用的。
【主权项】
1. 一种代谢改善剂，其包含具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/ 或具有18个碳原子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸。2. 根据权利要求1的试剂，其中前述氧代脂肪酸和/或羟基脂肪酸具有11-位反式双 键或12-位顺式双键。3. 根据权利要求1的试剂，其中所述氧代脂肪酸为选自10-氧代-顺式-12-十八碳烯 酸、10-氧代-顺式-12,顺式-15-十八碳二烯酸、10-氧代-顺式-6,顺式-12-十八碳二烯 酸、ICK氧代-顺式-6，顺式-12，顺式-15-十八碳二稀酸、10-氧代十八烧酸、10-氧代-顺 式-6-十八碳烯酸、10-氧代-顺式-15-十八碳烯酸或10-氧代-顺式-6,顺式-15-十八 碳二稀酸、12-氧代十八烧酸、10-氧代-反式-11-十八碳稀酸、10-氧代-顺式_6，反 式 _11_十八碳二稀酸、1〇_氧代-反式_11，顺式 _15_十八碳二稀酸、10-氧代-顺式_6， 反式-11，顺式-15-十八碳三烯酸和12-氧代-顺式-9-十八碳烯酸的至少一种。4. 根据权利要求1的试剂，其中所述羟基脂肪酸为选自10-羟基-顺式-12-十八碳 烯酸、10-羟基-顺式-12,顺式-15-十八碳二烯酸、10-羟基-顺式-6,顺式-12-十八碳 二烯酸、10-羟基-顺式-6,顺式-12,顺式-15-十八碳三烯酸、10, 12-二羟基十八烷酸、 10-羟基十八烷酸、10-羟基-顺式-15-十八碳烯酸、10-羟基-顺式-6-十八碳烯酸、10-羟 基 _顺式-6，顺式-15-十八碳二稀酸、12-羟基十八烧酸、10-羟基-反式-11-十八碳稀 酸、10-羟基-反式-11，顺式-15-十八碳二烯酸、10-羟基-顺式-6,反式-11-十八碳二 烯酸、10-羟基-顺式-6,反式-11，顺式-15-十八碳三烯酸和蓖麻油酸的至少一种。5. 根据权利要求1至4中任一项的试剂，其用于选自肥胖、糖尿病、脂质代谢异常、高 脂血症和脂肪肝的至少一种的预防或改善。6. 根据权利要求1至4中任一项的试剂，其为食品或食品添加剂。7. 根据权利要求1至4中任一项的试剂，其为药品。8. 根据权利要求1至4中任一项的试剂，其为饲料或饲料添加剂。9. 一种改善哺乳动物代谢的方法，其包括将具有18个碳原子和10-或12-位羰基的 氧代脂肪酸和/或具有18个碳原子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸给予所述哺乳 动物。10. 具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/或具有18个碳原子和 10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸，其用作代谢改善剂。11. 具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/或具有18个碳原子和 10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸在制备代谢改善剂中的用途。
【专利摘要】本发明提供一种代谢改善剂，其包含具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/或具有18个碳原子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸，以及所述代谢改善剂作为食品、药品等的用途。
【IPC分类】A61P3/10, A61K31/201, A61P3/04, A61P3/06, A23L1/30, A61P1/16, A23K1/16, A61K31/202
【公开号】CN104902887
【申请号】CN201380068773
【发明人】小川顺, 岸野重信, 朴时范, 河田照雄, 高桥信之, 后藤刚, 金英一, 菅原达也, 平田孝, 米岛靖记
【申请人】国立大学法人京都大学, 日东药品工业株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月14日
【公告号】EP2913051A1, US20150342916, WO2014069227A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及含有稀有脂肪酸的代谢改善剂。更具体而言，本发明涉及利用稀有脂 肪酸诸如氧代脂肪酸、羟基脂肪酸等的生理功能，例如改善脂质、糖和能量的代谢的作用的 代谢改善剂。本发明还涉及含有所述制剂的食品、药品、饲料等。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于暴食、缺乏锻炼等导致的肥胖，特别是伴随内脏脂肪积累的生活方式 相关疾病，已经成为一种社会问题。代谢综合征是指如下病症，其中高血糖、高血压和脂质 异常中的至少两种是并发的并且由于内脏脂肪肥胖而容易发展为动脉硬化。在40-74岁的 日本人中，二分之一的男性和五分之一的女性估计有或可能有代谢综合征。因此，已经提 出了目的在于预防或解决代谢综合征中的脂质积累进展的通过饮食疗法来调节卡路里摄 取的重要性。
[0003] 对摄取、进食功能性脂质存在相当大的兴趣，其中报道所述功能性脂质具有脂质 代谢改善效果、糖尿病改善效果等，包括共轭脂肪酸诸如共轭亚油酸等（非专利文件1)， ?3多不饱和脂肪酸诸如二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等（专利文件1)，中链脂肪酸（专 利文件2)等。
[0004] 此外，近年来已报道，番茄中含有的部分氧代脂肪酸诸如9-氧代-十八碳二烯酸、 13-氧代-十八碳二烯酸等具有改善生活方式相关疾病的活性，诸如脂质代谢改善等（专利 文件3,非专利文件2、3)。因此，稀有脂肪酸诸如氧代脂肪酸、羟基脂肪酸等的生理功能也 引起注意。
[0005] 然而，各种现存的稀有脂肪酸的更详细生理功能是未知的。
[0006][文件列表]
[专利文件] 专利文件I:JP-A-2006-521368 专利文件 2 :W0 2009/096570 专利文件 3 :JP-A-2011-184411 [非专利文件] 非专利文件I:NagaoK，（2005)，J.Biosci.Bioeng.，vol. 100,no. 2,p. 152-157 非专利文件 2:KimY-I，（2011)，Mol.Nutr.FoodRes.，vol. 55,p. 585-593 非专利文件 3:KimY-I，（2012)，PLoSONE，vol. 7,no. 2,e31317。
[0007] 发明概述 本发明要解决的问题 本发明的目的是提供一种含有稀有脂肪酸的改善脂质和/或糖等的代谢的新颖的代 谢改善剂。
[0008] 解决问题的手段 本发明人已对上述问题进行了深入研宄并发现氧代脂肪酸，例如，10-氧代-顺 式-12-十八碳烯酸（下文中还称为"KetoA"），或羟基脂肪酸，例如，10-羟基-顺 式-12-十八碳烯酸（下文中还称为"HYA"）具有过氧化物酶体增生物活化受体（下文中还 称为"PPAR"）-活化作用、血糖水平升高-抑制作用、血液中性脂肪-降低作用、葡萄糖耐 量-改善作用、能量代谢-促进作用等，其是传统上未知的生理功能。
[0009] 此外，本发明人还发现，稀有脂肪酸诸如HYA、KetoA等对肝X受体（下文中还称为 "LXR"）激动剂诱导的脂质合成促进具有抑制作用。
[0010] 基于以上发现完成本发明。
[0011] 因此，本发明提供以下：
[1] 一种代谢改善剂，其包含具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/ 或具有18个碳原子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸。
[0012] [2] [1]的试剂，其中前述氧代脂肪酸和/或羟基脂肪酸具有11-位反式双键或 12-位顺式双键。
[0013] [3] [1]的试剂，其中所述氧代脂肪酸为选自10-氧代-顺式-12-十八碳烯酸 (KetoA)、10-氧代-顺式-12，顺式-15-十八碳二條酸（aKetoA)、10-氧代-顺式_6，川页 式-12-十八碳二烯酸（yKetoA)、10-氧代-顺式-6,顺式-12,顺式-15-十八碳三烯酸 (sKetoA)、10-氧代十八烧酸（KetoB)、10-氧代-顺式_6_十八碳條酸（yKetoB)、10-氧 代-顺式-15-十八碳烯酸（aKetoB)或10-氧代-顺式-6,顺式-15-十八碳二烯酸 (sKetoB)、12_氧代十八烧酸（rKetoB)、l〇-氧代-反式-11-十八碳條酸（KetoC)、l〇-氧 代-顺式_6，反式-11-十八碳二稀酸（yKetoC)、10_氧代-反式-11，顺式-15-十八碳二 條酸（aKetoC)、10-氧代-顺式_6，反式-11，顺式-15-十八碳二條酸（sKetoC)和12-氧 代-顺式-9-十八碳烯酸（KetoRA)的至少一种。
[0014] [4] [1]的试剂，其中所述羟基脂肪酸为选自10-羟基-顺式-12-十八碳烯 酸（HYA)、10-羟基-顺式-12,顺式-15-十八碳二烯酸（aHYA)、10-羟基-顺式-6， 顺式-12-十八碳二烯酸（YHYA)、10-羟基-顺式-6,顺式-12,顺式-15-十八碳三 烯酸（sHYA)、10, 12-二羟基十八烷酸（rHYA)、10-羟基十八烷酸（HYB)、10-羟基-顺 式-15-十八碳烯酸（aHYB)、10-羟基-顺式-6-十八碳烯酸（YHYB)、10-羟基-顺式-6， 顺式-15-十八碳二烯酸（sHYB)、12-羟基十八烷酸（rHYB)、10-羟基-反式-11-十八碳 烯酸（HYC)、10-羟基-反式-11，顺式-15-十八碳二烯酸（aHYC)、10-羟基-顺式-6， 反式-11-十八碳二烯酸（YHYC)UO-羟基-顺式-6,反式-11，顺式-15-十八碳三烯酸 (sHYC)和蓖麻油酸（RA)的至少一种。
[0015] [5] [1]-[4]中任一项的试剂，其用于预防或改善选自肥胖、糖尿病、脂质代谢异 常、高脂血症和脂肪肝的至少一种。
[0016] [6] [1]-[4]中任一项的试剂，其为食品或食品添加剂。
[0017] [7] [1]_[4]中任一项的试剂，其为药品。
[0018] [8] [1]_[4]中任一项的试剂，其为饲料或饲料添加剂。
[0019] [9] 一种改善哺乳动物代谢的方法，其包括将具有18个碳原子和10-或12-位羰 基的氧代脂肪酸和/或具有18个碳原子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸给予所述 哺乳动物。
[0020] [10]具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/或具有18个碳原 子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸，其用作代谢改善剂。
[0021] [11]具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/或具有18个碳原 子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸在制备代谢改善剂中的用途。
[0022] 在本发明中，"和/或"用于表示它们中的任一个或它们二者。
[0023] 发明效果 在本发明中，发现氧代脂肪酸或羟基脂肪酸诸如KetoA或HYA(下文中还称为氧代脂 肪酸等）具有传统上未知的生理功能，例如，PPAR活化作用、血糖水平升高-抑制作用、血 液中性脂肪-降低作用、葡萄糖耐量-改善作用、能量代谢-促进作用等。此外，他们还发 现，由于对LXR的拮抗作用，这些氧代脂肪酸等具有很强的脂质合成抑制作用。
[0024] 基于所述功能，本发明提供含有稀有脂肪酸氧代脂肪酸等的代谢改善剂。由于所 述试剂可在各种领域诸如药品、食品、饲料等中使用，因此本发明在工业中是非常有用的。
[0025] 附图简述 图1显示KetoA或HYA的PPARa/Y报告活性的结果，其中cont.显示阴性对照（添 加乙醇），Posi显示阳性对照（添加PPAR激动剂），并且纵轴显示相对荧光素酶活性。
[0026]图2显示喂食KetoA或HYA后小鼠的体重变化，其中纵轴显示体重（g)，横轴显示 经过时间（周）。
[0027] 图3显示喂食KetoA或HYA后小鼠的血糖水平变化，其中纵轴显示血浆葡萄糖浓 度（mg/dL)，并且横轴显示经过时间（周）。
[0028] 图4显示喂食KetoA或HYA后小鼠的氧消耗，其中纵轴显示耗氧量（mL/kg/hr)，暗 显示暗周期的测定值，并且光显示光周期的测定值。
[0029] 图5显示喂食小鼠KetoA或HYA后的直肠温度，其中纵轴显示直肠温度（°C)。
[0030] 图6显示喂食小鼠KetoA或HYA后的白色脂肪重量，其中纵轴显示腹膜内白色脂 肪重量（g)。
[0031] 图7显示喂食小鼠KetoA或HYA后的中性脂肪，其中纵轴显示血浆甘油三酯浓度 (mg/dL)。
[0032] 图8显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的SREBP-IcmRNA表达的影响，其中纵 轴显示SREBP-IcmRNA的相对表达。
[0033] 图9显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的未成熟SREBP-I表达的影响，其中纵 轴显示未成熟SREBP-Ic的相对表达，并且上图显示Western印迹图。
[0034] 图10显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的成熟SREBP-I表达的影响，其中纵轴 显示成熟SREBP-Ic的相对表达，并且上图显示Western印迹图。
[0035] 图11显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的S⑶-1mRNA表达的影响，其中纵轴 显示S⑶-1mRNA的相对表达。
[0036] 图12显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的FASmRNA表达的影响，其中纵轴显 示FASmRNA的相对表达。
[0037] 图13显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的ACClmRNA表达的影响，其中纵轴显 示ACClmRNA的相对表达。
[0038] 图14显示KetoA或HYA对LXR激动剂诱导的ACC2mRNA表达的影响，其中纵轴显 示ACC2mRNA的相对表达。
[0039] 图15显示KetoA或HYA对LXR激动剂导致的三酰基甘油积累的影响，其中纵轴显 示三酰基甘油水平（Ug/mg蛋白质）。
[0040] 图16显示通过荧光素酶试验评价对LXR的拮抗作用，其中纵轴显示相对荧光素酶 活性。
[0041] 实施方案的描述 下面详细说明本发明。
[0042] 在本发明中，"代谢改善"是指脂质和/或糖和/或能量的代谢得到改善。具体而 言，例如，脂质代谢改善是指促进身体组织、血液或淋巴组织中存在的脂质的分解，抑制脂 质合成、预防和/或抑制身体组织诸如脂肪组织等中的脂质的积累，或减少身体组织中积 累的脂质等。"脂质"为甘油三酯和/或胆固醇，包括脂肪酸。
[0043]糖代谢改善是指抑制血液中存在的糖和/或糖化血红蛋白（HbAlc)、空腹血糖水 平的增加，或促进餐后糖代谢。此外，糖代谢改善还包括葡萄糖耐量受损（不包括在正常型 或糖尿病型以及糖尿病前期中的病理学）的改善。"糖"是指单糖、二 糖或多糖。
[0044]能量代谢改善是指使摄入能量水平与释放能量水平的异常平衡状态，或摄入能量 水平与释放能量水平的平衡的不可控状态，达到正常状态或接近正常状态。
[0045] 作为前述代谢改善的指标，可测量PPAR活性。已知PPAR包括至少3种亚型： PPARa、PPARS(与0相同）和PPARy。PPARa主要在肝脏、心脏、肾脏、骨骼肌、褐色脂 肪细胞等中表达，并参与涉及脂肪酸0氧化的许多基因的控制。PPARS几乎在全身（脑、 脂肪组织、皮肤等）表达。PPARy具有至少3种亚型，主要在白色脂肪细胞和巨噬细胞中表 达，并参与脂肪细胞分化等。当确认对于这些PPARs中的至少一种存在或不存在配体（激 动剂，拮抗剂）活性并发现激动剂活性时，判定具有代谢改善效果的可能性高或存在代谢 改善效果。作为一个实例，可进行FEBS Letters 514 (2002) p.315-322中描述的PPAR报 告基因试验。然而，所述方法不限于此。
[0046] 可替代地，可将氧代脂肪酸等给予肥胖或糖尿病动物模型，测量体重、器官重量、 血糖水平、中性脂肪值、耗氧水平、直肠温度等，并可确认其变化的存在或不存在。肥胖或糖 尿病动物模型没有限制，只要它是显示出所述性质的动物。例如，作为前述动物模型，可列 举市售KKAy小鼠、NOD小鼠、NSY小鼠、TSOD小鼠、ZDF/Crl-L印rfa大鼠、SDT/Jcl大鼠等。 可通过已知方法测量体重、器官重量、血糖水平、中性脂肪值、耗氧水平、直肠温度等。使用 这些作为指标，当观察到体重或器官重量或血糖水平、中性脂肪值降低时，或观察到耗氧水 平或直肠温度增加时，判定具有代谢改善效果的可能性高或存在代谢改善效果。
[0047] 可替代地，如下述实例所述，可确认通过加入氧代脂肪酸等，LXR激动剂诱导的脂 质合成-促进作用是否得到抑制。作为此类方法，例如，可参考JournalofLipidResearch 47 (2006) 2712-2717,但方法不限于此。前述文件中描述的方法包括加入LXR激动剂，和 ⑴测量脂质合成-相关因子，例如，SREBP-lc、成熟和未成熟SREBP-1、SCD-1、FAS、ACC1和 /或ACC2的mRNA和/或蛋白表达水平，（2)测量细胞内三酰基甘油水平或（3)使用LXR响 应序列进行荧光素酶试验。LXR激动剂的实例包括但不限于T0901317、22 (R)-羟基胆固醇、 24(S)_羟基胆固醇等。当脂质合成-相关因子的mRNA和/或蛋白表达水平等降低时，判定 脂质合成得到抑制，并且具有代谢改善效果的可能性高或存在代谢改善效果。
[0048] 在本发明中，氧代脂肪酸为具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸 (下文中有时缩写为" 10-氧代脂肪酸"或" 12-氧代脂肪酸"）。它进一步包括10-位羰基 和12-位顺式双键（下文中有时缩写为" 10-氧代，顺式-12脂肪酸")、具有18个碳原子、 10-位羰基及11-位反式双键的氧代脂肪酸（下文中有时缩写为" 10-氧代，反式-11脂肪 酸"）以及具有18个碳原子和10-位羰基但不具有11-和12-位双键的氧代脂肪酸（下文 中有时缩写为" 10-氧代，11，12-饱和脂肪酸"）。
[0049] 更具体而言，它包括10-氧代-顺式-12-十八碳烯酸（KetoA)UO-氧代-顺 式-12，顺式-15-十八碳二烯酸（下文中还称为"(11(6如4"）、10-氧代-顺式-6，顺 式-12-十八碳二烯酸（下文中还称为"yKetoA"）、10-氧代-顺式-6,顺式-12,顺 式-15-十八碳三烯酸（下文中还称为"sKet〇A"）、10-氧代十八烷酸（下文中还称为 "KetoB"）、10-氧代-顺式-6-十八碳烯酸（下文中还称为"YKetoB"）、10-氧代-顺 式-15-十八碳烯酸（下文中还称为"aKetoB"）、10-氧代-顺式-6,顺式-15-十八碳 二烯酸（下文中还称为"sKet〇B"）、12-氧代十八烷酸（下文中还称为"rKet〇B"）、10-氧 代-反式-11-十八碳烯酸（下文中还称为"KetoC"）、10-氧代-顺式-6,反式-11-十八 碳二烯酸（下文中还称为"YKetoC"）、10-氧代-反式-11，顺式-15-十八碳二烯酸（下 文中还称为"aKetoC"）、10-氧代-顺式-6,反式-11，顺式-15-十八碳三烯酸（下文中 还称为"sKet〇C"）、12-氧代-顺式-9-十八烷酸（下文中还称为"KetoRA"）等。
[0050] 在本发明中，羟基脂肪酸是指具有18个碳原子和10-位羟基的羟基脂肪酸（下文 中有时缩写为"10-羟基脂肪酸"）或具有18个碳原子和12-位羟基的羟基脂肪酸（下文 中有时缩写为" 12-羟基脂肪酸")。此处，也涵盖具有10-和12-位羟基的" 10, 12-二羟基 脂肪酸"作为"10-羟基脂肪酸"、"12-羟基脂肪酸"的一个实施方案。此外，也涵盖具有18 个碳原子、10-位羟基和12-位顺式双键的羟基脂肪酸（下文中有时缩写为"10-羟基，顺 式-12脂肪酸"）、具有18个碳原子、10-位羟基和11-位反式双键的羟基脂肪酸（下文中 有时缩写为"10-羟基，反式-11脂肪酸"）以及具有18个碳原子和10-位羟基但不具有 11和12-位双键的羟基脂肪酸（下文中有时缩写为" 10-羟基，11，12-饱和脂肪酸"）。
[0051] 更具体的实例包括但不限于10-羟基-顺式-12-十八碳烯酸（HYA)UO-羟 基-顺式-12,顺式-15-十八碳二烯酸（下文中还称为"aHYA"）、10-羟基-顺式-6， 顺式-12-十八碳二烯酸（下文中还称为"yHYA"）、10-羟基-顺式-6,顺式-12,顺 式-15-十八碳三烯酸（下文中还称为"别￥4"）、10，12-二羟基十八烷酸（下文中还称为 "rHYA")、10-羟基十八烷酸（下文中还称为"HYB")、10-羟基-顺式-15-十八碳烯酸（下 文中还称为"aHYB"）、10-羟基-顺式-6-十八碳烯酸（下文中还称为"YHYB"）、10-羟 基-顺式-6,顺式-15-十八碳二烯酸（下文中还称为"sHYB")、12-羟基十八烷酸（下文中 还称为"rHYB"）、蓖麻油酸（下文中还称为"RA"）、10-羟基-反式-11-十八碳烯酸（下文 中还称为"HYC")、10_羟基-反式-11，顺式-15-十八碳二烯酸（下文中还称为"aHYC")、 10-羟基-顺式-6,反式-11-十八碳二烯酸（下文中还称为"YHYC")、10-羟基-顺式-6， 反式-11，顺式-15-十八碳三烯酸（下文中还称为"sHYC"）等。
[0052] 本发明中使用的稀有脂肪酸诸如氧代脂肪酸、羟基脂肪酸等可通过日本专利申 请号2012-108928中描述的方法制备，并且HYA可参照BiochemicalandBiophysical ResearchCommunications416 (2011)p. 188-193 等制备。RA、rHYB等可使用市售产品。 KetoRA、rKetoB可通过利用以下络酸氧化等从RA制备。
[0053] 日本专利申请号2012-108928中描述的具体方法如下。
[0054] 10-氧代脂肪酸从具有18个碳原子和9-位顺式双键的不饱和脂肪酸（下文中有 时缩写为"顺式-9不饱和脂肪酸"）通过两步反应产生。在第一反应（反应1)中，10-羟 基脂肪酸从顺式-9不饱和脂肪酸通过水合酶反应产生。
[0055] "反应1"中的底物没有特别限制，只要它是具有18个碳原子和9-位顺式双键 的不饱和脂肪酸，并且其实例包括一烯酸（18:1)、二烯酸（18:2)、三烯酸（18:3)、四烯酸 (18:4)、五烯酸（18:5)等。更优选的是二烯酸、三烯酸和四烯酸，并且特别优选的是二烯酸 和三烯酸。在本说明书中，"脂肪酸"不仅涵盖游离酸，还涵盖酯形式、与碱性化合物形成的 盐等。
[0056] -烯酸的实例包括油酸、蓖麻油酸等。
[0057] 二烯酸的实例包括亚油酸，顺式_9,反式-11-十八碳二烯酸等。
[0058] 三烯酸的实例包括a-亚麻酸、Y-亚麻酸等。
[0059] 四烯酸的实例包括十八碳四烯酸等。
[0060] 尽管催化反应1的水合酶没有特别限制，只要它是能够利用上述顺式-9不饱和脂 肪酸作为底物并能够转化成10-羟基脂肪酸的酶，但例如，优选的是乳酸菌-来源的脂肪 酸-水合酶（CLA-HY)。更优选的是植物乳杆菌-来源的CLA-HY，并且特别优选的是植物乳 杆菌FERMBP-10549菌株-来源的CLA-HY。CLA-HY可通过JP-A-2007-259712等描述的方 法得到。
[0061] 要加入的水合酶的量为，例如，0.001-10mg/ml，优选0? 1-5mg/ml，更优选0.2-2 mg/ml〇
[0062] "辅因子"可用于反应1，并且例如，可使用NADH、NADPH、FADH^。加入浓度可以 是任意的，只要水合反应有效进行。优选0.001-20mM，更优选0.01-10mM。
[0063] 此外，"活化剂"可用于酶反应，并且例如，可提及一种或多种选自以下的化合物： 钼酸钾、无水钼酸二钠（VI)、钼酸二钠（VI)二水合物、正钒酸钠（V)、偏钒酸钠（V)、钨酸钾 (VI)、无水钨酸钠（VI)和钨酸钠（VI)二水合物。其加入浓度可以是任意的，只要水合反应 有效进行。优选0. 1-20mM，更优选1-10mM。
[0064] 例如，rHYA可通过将下列物质加入到RA中至总量为10ml，并在37°C、225rpm下 进行无氧振荡反应63hr获得：100mM磷酸钾缓冲液（pH6. 5)，其含有在大肠杆菌中表达的 水合酶（湿菌体重 〇? 7g)，NADH(33mg)，FAD(0. 8mg)，蓖麻油酸（Ig)，BSA(0. 2g)。 [0065]另一方面，12-羟基脂肪酸可，例如，通过含有甘油三酯作为主要成分的天然油的 水解获得，其中甘油三酯含有12-羟基脂肪酸作为组成脂肪酸。例如，RA可通过蓖麻油的 水解获得，并且rHYB可通过氢化蓖麻油的水解获得。
[0066]在第二反应（反应2)中，10-氧代脂肪酸从10-羟基脂肪酸通过脱氢酶反应或使 用铬酸的化学氧化产生。
[0067]尽管催化反应2的脱氢酶没有特别限制，只要它是能够利用10-羟基脂肪酸作为 底物并能够转化为10-氧代脂肪酸的酶，但例如，优选的是乳酸菌-来源的羟基脂肪酸-脱 氢酶（CLA-DH)。更优选的是植物乳杆菌-来源的CLA-DH，并且特别优选的是植物乳杆菌 FERMBP-10549菌株-来源的CLA-DH。CLA-DH可通过JP-A-2007-259712等描述的方法得 到。
[0068] 要加入的脱氢酶的量为，例如，0.001-10mg/ml，优选0? 1-5mg/ml，更优选0.2-2 mg/ml〇
[0069] "辅因子"可用于反应2 ,并且例如，可使用NAD、NADP、FAD等。加入浓度可以是任 意的，只要氧化反应有效进行。优选0.001-20mM，更优选0.01-10mM。
[0070] 此外，"活化剂"可用于酶反应，并且例如，可以类似的加入浓度使用与上述反应1 中的实例所述的那些类似的化合物。
[0071] 第二反应可通过化学氧化进行。
[0072] 作为化学氧化，可提及本身已知的方法，例如铬酸氧化，优选琼斯氧化等。作为铬 酸，可使用化合物的盐和复合物诸如无水铬酸CrO3、铬酸H2CrO4和重铬酸H2Cr207。
[0073] 类似地，12-氧代脂肪酸可从12-羟基脂肪酸获得。例如，KetoRA可通过以下方法 获得。
[0074] 具体而言，将硫酸（2. 3ml)和水（7. 7ml)加入到无水铬酸（2. 67g)中，并将丙 酮（90ml)加入到混合物中以得到络酸溶液。将5gRA和100ml丙酮加入到Erlenmeyer 烧瓶中，并在冰上在搅拌器中搅拌下滴加上述铬酸溶液。当溶液从蓝绿色变为浅橙色时，停 止滴加铬酸溶液，用异丙醇停止反应。通过离心除去沉淀的沉淀物，将获得的离心上清液置 于分液漏斗中并与己烷（100ml)和Milli-Q水（100ml)充分混合。通过离心回收己烷 层，用Mi11i-Q水洗涤数次并通过旋转蒸发仪浓缩以提取反应产物和未反应的底物。约98% 的提取物可确认为KetoRA。用己烷溶胀提取物（含有KetoRA的混合物）的20至30倍重 量的硅胶（Wakogel(r)C-100)，装入玻璃柱中，并将硫酸钠（无水）置于其上。将上述获得 的提取物（含有KetoRA的混合物）悬浮于己烷：乙醚=8:2洗脱液中并加到柱中。洗脱液 以约2ml的流速流动，并分级和回收从柱中排出的溶液。通过LC/MS和气相色谱法分析回 收的各级分。收集仅含有KetoRA的级分并通过旋转蒸发仪浓缩以得到纯度不小于99%的 KetoRA。
[0075] 另外，rKetoB可以与rHYB中相同的方式通过铬酸氧化获得。
[0076] 10-氧代，反式-11脂肪酸从具有18个碳原子、10-位羰基和12-位顺式双键的 氧代脂肪酸通过异构酶反应（反应3)产生。
[0077] 反应3的"底物"没有特别限制，只要它是通过上述反应1和2从具有18个碳原 子以及9-和12-位顺式双键的不饱和脂肪酸诱导的10-氧代，顺式-12脂肪酸。其实例 包括亚油酸诱导的KetoA、a-亚麻酸诱导的aKetoA、y-亚麻酸诱导的yKetoA、十八碳 四烯酸诱导的sKetoA等。底物可通过反应1和2以外的方法获得。
[0078] 尽管催化反应3的异构酶没有特别限制，只要它是能够利用上述10-氧代，顺 式-12脂肪酸作为底物且能够转化成10-氧代，反式-11脂肪酸的酶，但例如，优选的是乳 酸菌-来源的氧代脂肪酸-异构酶（CLA-DC)。更优选的是植物乳杆菌-来源的CLA-DC， 并且特别优选的是植物乳杆菌FERMBP-10549菌株-来源的CLA-DC。CLA-DC可通过 JP-A-2007-259712等描述的方法得到。
[0079] 要加入的异构酶的量为，例如，0.001-10mg/ml，优选0? 1-5mg/ml，更优选0.2-2 mg/ml〇
[0080] "活化剂"可用于异构酶反应，并且例如，可以类似的加入浓度使用与上述反应1中 的实例所述的那些类似的化合物。
[0081] 10-氧代，11，12-饱和脂肪酸从具有18个碳原子、10-位羰基和11-位反式双键 的氧代脂肪酸（10-氧代，反式-11脂肪酸）通过饱和酶（saturase)反应（反应4)产生。 [0082]反应4的"底物"没有特别限制，只要它是通过上述反应3产生的10-氧代，反 式-11脂肪酸。其实例包括KetoA诱导的KetoC、aKetoA诱导的aKetoC、yKetoA诱导的 yKetoC、sKetoA诱导的sKetoC等。底物可通过反应3以外的方法获得。
[0083] 尽管催化反应4的饱和酶没有特别限制，只要它是能够利用上述10-氧代，反 式-11脂肪酸作为底物且能够转化成10-氧代，11，12-饱和脂肪酸的酶，但例如，优选的 是乳酸菌来源的氧代脂肪酸-烯酮还原酶（CLA-ER)。更优选的是植物乳杆菌-来源的 CLA-ER，并且特别优选的是植物乳杆菌FERMBP-10549菌株-来源的CLA-ER。
[0084]上述酶 "CLA-ER" 为 (a) 由SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列组成的酶蛋白质， (b) 蛋白质，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列， 其中一个或多个氨基酸经缺失和/或取代和/或插入和/或添加，并具有催化上述反应4 的酶活性，或 (C)蛋白质，其由碱基序列编码，所述碱基序列在严格条件下与SEQIDNO: 1所示的 碱基序列的互补链序列组成的核酸杂交，并具有催化上述反应4的酶活性。
[0085]上述（b)的更具体实例包括蛋白质，其含有⑴氨基酸序列，其为SEQIDNO: 2所 示的氨基酸序列，其中1-20,优选1-10,更优选1-若干（5、4、3或2)个氨基酸被缺失，（ii) 氨基酸序列，其为SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列，其中1-20,优选1-10,更优选1-若干 (5、4、3或2)个氨基酸被添加，（iii)氨基酸序列，其为SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列， 其中1-20,优选1-10,更优选1-若干（5、4、3或2)个氨基酸被插入，（iv)氨基酸序列，其 为SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列，其中1-20,优选1-10,更优选1-若干（5、4、3或2)个 氨基酸被其它氨基酸取代，或（V)通过将它们组合所获得的氨基酸序列。当具有类似特性 的氨基酸（例如，甘氨酸和丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸和异亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸、天冬氨 酸和谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、赖氨酸和精氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸、苯丙氨酸和酪 氨酸等）互相取代等时，更大数目的取代等是可能的。
[0086] 当如上所述氨基酸经缺失、取代或插入时，缺失、取代和插入的位置没有特别限 制，只要保持上述酶活性。
[0087]在上述（C)中，"严格条件"为如下条件，在该条件下具有高同一性（例如，70%、 80%、90%、95%或99%或以上的同一性）的核苷酸序列彼此杂交且具有低于上述同一性的核 苷酸序列不杂交；具体而言，为在对应于一般Southern杂交等的洗绦条件（60°C，lxSSC， 0.1%505，优选地，0.&55(：，0.1%505，更优选地，681：，0.1155(：，0.1%505)的盐浓度和温 度下洗涤1次，更优选2-3次的条件。
[0088]CLA-ER可通过本身已知的蛋白质分离和纯化技术，例如通过使用催化上述反应4 的酶活性作为指标，从例如植物乳杆菌FERMBP-10549菌株的真菌和培养基中分离。可替代 地，它也可通过基于SEQIDNO: 1所示的碱基序列的信息，合成CLA-ER的编码区的总碱基 序列，或设计能够扩增含有编码区的CLA-ER基因片段的引物，使用从上述菌株制备的cDNA 或基因组DNA作为模板进行PCR，克隆所得的扩增片段为合适的表达载体并将其引入宿主 细胞中，以及培养细胞而重组产生。
[0089] 作为含有编码上述CLA-ER的核酸的载体，可根据对象（例如，蛋白质表达）适当 地选择适合于要被载体导入的宿主细胞的载体并使用。表达载体可含有适当的启动子、转 录终止信号和选择性标记基因（药物抗性基因、补充营养缺陷型突变的基因等）。此外，它 可含有编码用于表达的蛋白质等的分离和纯化的标签序列的序列。可替代地，载体可并入 靶宿主细胞的基因组中。可通过本身已知的转化方法诸如感受态细胞法、原生质体法、磷酸 钙共沉淀法等，将载体引入到靶宿主细胞。
[0090] 上述"宿主细胞"可以是任何细胞，只要它能够表达含有编码上述CLA-ER的核酸 的载体，并且可提及细菌、酵母、真菌、高等真核细胞等。细菌的实例包括革兰氏阳性菌诸如 芽孢杆菌属、链霉菌属等，以及革兰氏阴性菌诸如大肠杆菌等。可通过本身已知的适于宿主 细胞的方法培养用含有编码CLA-ER的核酸的载体引入的重组细胞。
[0091] 上述CLA-ER的"纯化"可通过本身已知的方法进行，例如，使通过离心等收集的真 菌通过超声或玻璃珠等破裂，固体诸如细胞碎片等通过离心等除去，以得到粗酶溶液，对其 进行使用硫酸铵、硫酸钠等的盐析法，层析法诸如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析 等，凝胶电泳等。
[0092] 要加入的饱和酶的量为，例如，0.001-10mg/ml，优选0? 1-5mg/ml，更优选0.2-2 mg/ml〇
[0093]"辅因子"可用于反应4,并且例如，可以使用NADH等。加入浓度可以是任意的，只 要氧化反应有效进行。它优选为0.001-20mM，更优选0.01-10mM。
[0094] 此外，"活化剂"可用于酶反应，并且例如，可以类似的加入浓度使用与上述反应1 中的实例所述的那些类似的化合物。
[0095] 10-羟基，反式-11脂肪酸从具有18个碳原子、10-位羰基和11-位反式双键 的氧代脂肪酸（10-氧代，反式-11脂肪酸）通过脱氢酶反应（反应5)产生或10-羟 基，11，12-饱和脂肪酸从具有18个碳原子和10-位羰基但不具有11-和12-位双键的氧 代脂肪酸（10-氧代，11，12-饱和脂肪酸）通过脱氢酶反应（反应6)产生。
[0096]反应5的"底物"没有特别限制，只要它是通过上述反应3产生的10-氧代，反 式-11脂肪酸。其实例包括KetoA诱导的KetoC、aKetoA诱导的aKetoC、yKetoA诱导的 yKetoC、sKetoA诱导的sKetoC等。底物可通过反应3以外的方法获得。
[0097] 另一方面，反应6的"底物"没有特别限制，只要它是通过上述反应4产生的10-氧 代，11，12-饱和脂肪酸。其实例包括KetoC诱导的KetoB、aKetoC诱导的aKetoB、yKetoC诱导的YKetoB、sKetoC诱导的sKetoB等。底物可通过反应4以外的方法获得。
[0098] 尽管催化反应5或反应6的脱氢酶没有特别限制，只要它是能够利用10-氧代，反 式-11脂肪酸或10-氧代，11，12-饱和脂肪酸作为底物且能够转化成10-羟基，反式-11月旨 肪酸或10-羟基，11，12-饱和脂肪酸的酶，但例如，优选的是乳酸菌来源的羟基脂肪酸-脱 氢酶（CLA-DH)。更优选的是植物乳杆菌-来源的CLA-DH，并且特别优选的是植物乳杆菌 FERMBP-10549菌株-来源的CLA-DH。尽管CLA-DH催化上述反应2中的氧化反应，但它也 可以催化作为逆反应的反应5或反应6中的还原反应。
[0099] 要加入的脱氢酶的量为，例如，0.001-10mg/ml，优选0? 1-5mg/ ml，更优选0.2-2 mg/ml〇
[0100] "辅因子"可用于反应5和反应6,并且例如，可以使用NADH、NADPH、FADH^〇WA 浓度可以是任意的，只要还原反应有效进行。它优选为0.001-20mM，更优选0.01-10mM。
[0101] 此外，"活化剂"可用于酶反应，并且例如，可以类似的加入浓度使用与上述反应1 中的实例所述的那些类似的化合物。
[0102] 在上述各反应中，酶（水合酶、脱氢酶、异构酶、饱和酶）以引入含有编码所述酶 的核酸的表达载体的重组细胞（例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞 等）的形式经受反应体系。在这种情况下，反应也可通过在适合于细胞培养，并加入底物， 必要时加入辅因子和活化剂的液体培养基中培养细胞来进行。此外，任何上述酶可以是纯 化的酶或粗纯化的酶。可替代地，水合酶可在真菌诸如大肠杆菌等中表达，并可以使用真菌 本身或可以使用其培养基。此外，酶可以是游离型的，或通过各种载体固定。
[0103] 含有氧代脂肪酸等的本发明的代谢改善剂也可应用于生活方式相关的疾病的改 善。"生活方式相关的疾病"为生活习惯诸如饮食习惯、运动习惯、休息、吸烟、饮酒等涉及其 发生和发展的疾病组，并且包括病理学诸如成人肥胖、儿童肥胖、营养共济失调、食欲减退、 胃癌、大肠癌、痛风、高血压、动脉硬化、肾结石、心肌梗塞、心绞痛、胃溃疡、肾脏疾病、骨质 疏松症、牙周炎、酒精性肝炎、肝硬化、肝癌、肺癌、支气管炎、肺气肿、牙周疾病、脑中风、脑 梗塞、动脉瘤、过劳死、失眠等。
[0104] 此外，本发明的代谢改善剂也可用于糖尿病（1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病 等）、糖尿病并发症（动脉硬化性疾病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病、糖尿病性神经 病等）、脂质代谢异常、高脂血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗和脂肪肝的 预防或改善。
[0105] 可替代地，本发明的代谢改善剂可通过给予人或除人以外的动物（例如，狗、猫、 小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猪、牛、鸡、长尾小鹦鹉、鹩哥、山羊、马、绵羊、猴等）用于选自肥 胖、糖尿病、脂质代谢异常、尚脂血症、尚胆固醇血症、尚甘油二醋血症、膜岛素抵抗和脂肪 肝的至少一种的预防或治疗。
[0106] 含有氧代脂肪酸等的本发明的代谢改善剂可用作，例如，药品、食品、饲料、化妆品 等，或通过将试剂加入到它们中使用。
[0107] 药品的剂型包括分散剂、颗粒剂、丸剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片剂、快速崩解 片剂、糖浆、液体、悬浮液、栓剂、软膏、乳膏、凝胶、粘合剂、吸入剂、注射剂等。其制剂根据常 规方法制备。由于氧代脂肪酸等难溶于水，将它们溶解在非亲水性的有机溶剂中，例如植物 来源的油、动物来源的油等或通过均化器（高压均化器）与乳化剂、分散剂、表面活性剂等 一起在水溶液中分散或乳化并使用。
[0108] 可用于配制的添加剂的实例包括动物和植物油诸如大豆油、红花油、橄榄油、胚芽 油、向日葵油、牛脂、沙丁鱼油等，多元醇诸如聚乙二醇、丙二醇、甘油、山梨醇等，表面活性 剂诸如脂肪酸脱水山梨醇酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸甘油酯、脂肪酸聚甘油酯等，赋形剂诸 如纯净水、乳糖、淀粉、结晶纤维素、D-甘露醇、卵磷脂、阿拉伯胶、山梨醇溶液、碳水化合物 溶液等，甜味剂、着色剂、PH调节剂、香料等。使用时可将液体制剂溶解或悬浮于水或其它 合适的介质中。另外，片剂和颗粒剂可通过熟知的方法进行包衣。
[0109] 对于注射形式给药，静脉内、腹膜内、肌内、皮下、经皮、关节内、滑膜内、鞘内、骨膜 内（intraperiosteum)、舌下、口服给药等是优选的，并且静脉内给药或腹膜内给药是特别 优选的。静脉内给药可以是滴注给药和推注（bolus)给药的任一种。
[0110] 当本发明的代谢改善剂用作食品或食品添加剂时，食品的形式没有特别限制，只 要它允许口服食用，诸如溶液、悬浮液、粉末、固体成形制品等。具体的实例包括补充剂（粉 末、颗粒剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片剂、快速崩解片剂、糖浆、液体等）、饮料（碳酸饮 料、乳酸饮料、运动饮料、果汁饮料、蔬菜饮料、豆奶饮料、咖啡饮料、茶饮料、粉末饮料、浓缩 饮料、营养饮料、酒精饮料等）、甜食（橡皮糖、果冻、口香糖、巧克力、饼干、糖果、焦糖、曰本 甜食、点心等）、方便食品（方便面、蒸煮食品、罐头、微波食品、速食汤、味增汤、冻干食品 等）、油、脂肪和油食品（蛋黄酱、调味品、黄油、稀奶油、人造奶油等）、小麦粉制品（面包、 面食、面条、蛋糕粉、面包肩等），调味品（沙司、番茄加工调味品、风味调味料、烹调混合物、 汤等）、加工肉制品（火腿肉、香肠等）。
[0111] 上述食品可含有（必要时）各种营养素、各种维生素（维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K等）、各种矿物质（镁、锌、铁、钠、钾、 硒等）、膳食纤维、分散剂、稳定剂诸如乳化剂等、甜味剂、香料组分（柠檬酸、苹果酸等）、香 料、蜂王衆、蜂胶、Agaricus等。
[0112] 当本发明的代谢改善剂用作饲料或饲料添加剂时，饲料为，例如，宠物食品、畜牧 业或水产业饲料添加剂等。
[0113] 当本发明的代谢改善剂用作化妆品或化妆品添加剂时，化妆品为，例如，乳膏、凝 胶、乳液、精华液、化妆水、微乳精华（microemulsionessence)、面膜、粉底、口红、眼影、洗 发剂、护发素、沐浴添加剂等，并且香料等可与其混合。
[0114] 仅一种氧代脂肪酸等可与本发明的药品、食品、饲料、化妆品等混合或其两种或更 多种可组合使用。
[0115] 本发明的药品的剂量或本发明的食品的摄取量可根据患者或摄取其的那些的年 龄和体重、症状、给药时间、剂型、给药方法、药物组合等来适当确定。例如，当本发明的药 品口服给药时，作为活性成分的氧代脂肪酸等的总量对于成人为每天0. 02-100mg/kg体 重，优选0.2-50mg/kg体重，或通过肠胃外给药为0.002mg-50mg/kg体重，优选0.02-50 mg/kg体重，其可每天给药一次或每天给药数次（2-5)。当它作为食品摄取时，可将它加入 到食品中使得作为活性成分的氧代脂肪酸等的总摄取量对于成人为每天1-6000mg，优选 10-3000mg。本发明的饲料的摄取量和本发明的化妆品的使用量可根据上述食品的摄取量 和上述药品的剂量各自适当确定。
[0116] 通过参考实施例在下面对本发明进行更详细地解释。实施例仅为本发明的示例而 不以任何方式限制本发明的范围。 实施例
[0117] 基于上述方法（日本专利申请号2012-108928中描述的方法）制备本发明中使用 的稀有脂肪酸诸如1^(^、1^、丫1^、丫1^(^、1'1^等。1^0狀基于上述方法从蓖麻油 酸（RA)制备。GW7647(PPARa激动剂）、曲格列酮（PPARy激动剂）购自Sigma-Aldrich， T0901317(LXR激动剂）购自CaymanChemical，RA购自NU-CHEKPREP，INC. (USA)(产品号： U-50-A)，EPA购自NU-CHEKPREP，INC. (USA)(产品号：U-99-A)，LA购自Sigma-Aldrich(产 品号：L1376)，其它试剂购自WakoPureChemicalIndustries，Ltd?或NacalaiTesque 等。
[0118] [实施例1] PPAR a , Y配体活生的测量 为了评估氧代脂肪酸等的功能，首先测定PPARa,y-活化作用。参照Nobuyuki Takahashi等人，FEBSLetters514 (2002)p. 315-322,"Dualactionofisoprenols fromherbalmedicinesonbothPPARgammaandPPARalphain3T3-L1adipocytesand HepG2hepatocytes^?MaterialsandMethods章节"Reporterplasmidsandluciferase assays"进行测定。具体而言，将含有编码PPARa，Y配体结合区域和GAL4DNA结合区 域的融合蛋白的DNA的质粒（pM-hPPARa或pM-hPPARY)、含有连接到荧光素酶的GAL4 结合DNA序列的报告质粒（p4xUASg-tk-luc)以及标准化转染效率的内部控制（internal control) (pRL-CMV)引入源自非洲绿猴肾的CV-I细胞中。将下面描述的配体加入到细胞 中，并在培养24hr后，测定荧光素酶活性。作为配体，分别加入30yM的KetoA和HYA。
[0119] 用乙醇调节样品浓度。乙醇用作阴性对照，PPARa用作阳性对照，GW7647(10nm) 和曲格列酮（5yM)用作y激动剂。结果示于图1中。
[0120] 从图1看出，在KetoA中发现强PPARa和y激动剂活性，在HYA中发现PPARa 激动剂活性和一些PPARy激动剂活性。
[0121] 通过类似的方法，还测定aKetoA、yKetoA、sKetoA、KetoB、yKetoB、aKetoB、 sKetoB、rKetoB、KetoC、yKetoC、aKetoC、sKetoC、KetoRA、aHYA、yHYA、sHYA、rHYA、HYB、 aHYB、yHYB、sHYB、rHYB、RA、HYC、aHYC、yHYC和sHYC的荧光素酶活性。结果是，KetoC、 RA、rKetoB和rHYA显示PPARa激动剂活性，aKetoA和yKetoA显示PPARy激动剂活性。
[0122] [实施例2] 对肥胖或糖尿病樽塑小鼠的影晌 (1)使用KKAy小鼠作为肥胖或糖尿病模型小鼠，评估KetoA、HYA的影响。KKAy小鼠 (KKAy/TaJcl，雄性，4周龄，购自CLEAJapan，Inc.且单独饲养）用市售的普通饲料（ND)预 先饲养1周，分成5组，每组用高脂饮食（HFD)作为基本饲料，并给予无添加饲料（对照组） 或添加不同量的KetoA和HYA的饲料饲养4周。添加KetoA、HYA的饲料通过将KetoA、HYA 加入到HFD中使得加入量为0? 05%(w/w) (0? 05%组）或0?l%(w/w) (0? 1%组）来制备。
[0123] (2)测定KKAy小鼠的体重和血糖水平的演变（profile)。试验饲料饲养开始后， 在第16-19天测量氧消耗水平，第24天进行口服葡萄糖负荷试验，并在第26天测量直肠温 度。在实验饲养完成的第二天，解剖KKAy小鼠，并测量器官重量和血浆中性脂肪水平。
[0124] (3)KKAy小鼠的体重演变示于图2中。在添加KetoA的饲料组中，在0. 05%组中 发现体重增加的抑制倾向，在0. 1%组中发现体重增加的显著抑制。在添加HYA的饲料组中， 在0.05%组中发现体重增加的显著抑制。在图中，*表示P〈0.05,林表示P〈0.01 (下文 中这对于图3-7是相同的）。
[0125]KKAy小鼠的血糖水平演变示于图3中。在试验饮食摄入4周时，与对照组相比，在 0.05%KetoA组中发现血糖升高的抑制倾向。此外，在0.1%KetoA组中发现更强的显著降 血糖作用。另一方面，HYA组显示血糖水平升高的抑制倾向，即使未发现显著差异。KKAy小 鼠的氧消耗水平示于图4中。此外，KKAy小鼠的直肠温度的结果示于图5中。与对照组相 比，在KetoA组中发现氧消耗水平增加，并且也发现直肠温度升高。结果显示，KetoA组促 进热量生成。KKAy小鼠的器官重量（腹膜内白色脂肪重量）的结果示于图6中，血浆中性 脂肪的结果示于图7中。在0.1%KetoA组中证实了腹膜内白色脂肪重量和血浆中性脂肪 水平的显著降低。
[0126] (4)从上述结果看出，与肥胖有关的代谢异常在KetoA摄入组中得到改善。由于 发现氧消耗水平增加和直肠温度升高，认为通过KetoA促进热量生成有助于代谢异常的改 善。
[0127][实施例3] 对LXR激动剂诱导脂肪酸合成的影晌 使用人肝癌来源的H印G2细胞（细胞号JCRB1054,HealthScienceResearch ResourcesBank)，通过参照Zaima等人（JournalofLipidResearch47,2712_2717， 2006)的方法评估对经LXR激动剂诱导的脂肪酸合成促进的抑制效果。
[0128]HepG2细胞（2.OxlO5个细胞/mL)在含有10%FBS的DMEM培养基中培养24hr，并 将培养基用含有10nMLXR激动剂T0901317(CaymanChemicals)和60yM各种脂肪酸的 含0. 1%BSA的DMEM培养基替换。培养24hr后，回收细胞，并使用S印asol试剂（Nacalai Tesque)提取总RNA。DNA酶处理后，使用SuperScriptll(Invitrogen)进行反转录以得到 cDNA溶液。使用SYBRGreenMix(Bio-Rad，Richmond，CA)和基因特异性引物（表1)，如下 进行实时PCR。
[0129] L在96°C下反应 15min，2.在96°C下反应 15sec，3?在60°C下反应30sec，4. 荧光测量，5?将2-4重复40次，6?以0.4°C间隔测量65°C至95°C的熔解曲线。18SrRNA 用作内标。测量的脂肪酸合成所涉及的基因为留醇调节因子结合蛋白-Ic(SREBP-Ic)J^ 脂酰辅酶A去饱和酶-I(S⑶-1)、脂肪酸合酶（FAS)和乙酰辅酶A羧化酶-1和-2 (ACC-1， 2)。对于积累的细胞内TG的量，用氯仿-甲醇提取脂质，并通过甘油三酯-E试验Wako(Wako PureChemicalIndustries，Ltd.)定量。
[0130] 此外，测定未成熟和成熟SREBP-lc的蛋白表达水平。将按照上述处理的细胞分散 于含有蛋白酶抑制剂的缓冲液A(250mM蔗糖，10mMHEPES-K0H，10mMKC1，1.5mMMgCl2, ImMEDTA-Na，lmMEGTA-Na，pH7.6)中，通过 23 号注射针 20 次，并离心（l，000xg，4°C，5 min)以分离成上清液1和沉淀物1。将沉淀物1再溶于缓冲液B(20mMHEPES-K0H，0. 42M 恥(：1，2.5%甘油，1.511111%(：12，11111￡0丁六-似，11111￡6丁六-似，？117.6)中，并离心（10 5叉8，4°C，15min)。得到的上清液2用作核部分（包括成熟形式）。将上清液1进一步离心 (105xg，4°C，15min)，将得到的沉淀物 2 溶于细胞溶解液（10mMTris-HCl，100mMNaCl， l%SDS，lmMEDTA-Na，lmMEGTA-Na)中并用作膜部分（包括未成熟形式）。使用这些作为 样品，使用抗SREBP-I多克隆抗体（SantaCruz)通过Western印迹方法进行测量。使用双 焚光素酶系统（Promega)，通过焚光素酶试验评估对LXR的诘抗作用。将p3xIRl-tk_Luc、 PCMX-hLXRa、pRL-CMX引入H印G2细胞中。在含有各种脂肪酸和T0901317的含0. 1%BSA的 无血清培养基中培养24hr后，测量荧光素酶活性。
[0131] 图8显示SREBP-IcmRNA表达的变化。T0901317使表达增加至约7倍，但在HYA和 KetoA中发现强烈抑制作用。Western印迹的结果还显示，HYA和KetoA强烈抑制T0901317 诱导的成熟和未成熟的SREBP-I的表达的促进（图9、10)。也显示在由SREBP-Ic进行的 转录调控下的脂质合成相关基因（S⑶_1、FAS、ACC1，2)也显示通过这些脂肪酸导致的下调 (图11-14)。尽管细胞内三酰基甘油水平也通过T0901317增加（图15)，但该增加被共同 存在的这些脂肪酸显著抑制。通过荧光素酶试验检查对调节SREBP-Ic的细胞核受体LXR 的拮抗作用发现，这些脂肪酸显著抑制T0901317的作用，从而拮抗LXR(图16)。
[0132]在图8-16中，*表示？〈0.05，**表示？〈0.001，***表示卩〈0.0001&8.1'0901317 添加，无脂肪酸添加）。
[0133]通过类似的方法还测量aKetoA、yKetoA、sKetoA、KetoB、yKetoB、aKetoB、 sKetoB、rKetoB、KetoC、yKetoC、aKetoC、sKetoC、KetoRA、aHYA、yHYA、sHYA、rHYA、HYB、 aHYB、yHYB、sHYB、rHYB、RA、HYC、aHYC、yHYC和sHYC的SREBP-lc、成熟和未成熟的 SREBP-I表达、S⑶-1、?八5、八〇：1，2、细胞内三酰基甘油水平和对^0?的拮抗作用（通过荧光 素酶试验）。结果是，yHYA、yKetoA、aKetoA、HYB、rHYB、RA、rKetoB也通过对LXR的拮 抗作用而显示脂质合成抑制作用。
[0134] 上述结果显示，来自该时间检测的脂肪酸的HYA与KetoA通过对LXR的拮抗作用 而具有强烈的脂质合成抑制作用。类似地，稀有脂肪酸诸如yHYA、yKetoA、aKetoA、HYB、 rHYB、RA、rKetoB等也显示具有脂质合成抑制作用。
[0135] 尽管本发明已在优选的实施方案中作了重点描述，但对于本领域技术人员而言显 而易见的是，可对优选的实施方案进行修改。
[0136] 本文引用的任何出版物（包括专利和专利申请）中公开的内容在此通过引用全部 并入，如它们已在本文公开的程度。
[0137] 本申请基于2012年10月29日在日本提交的专利申请号2012-237933,其内容在 此通过引用全部并入。
[0138] 工业实用性 本发明已阐明氧代脂肪酸等具有传统上未知的脂质和/或糖和/或能量代谢改善作用 作为其生理功能。含有氧代脂肪酸等的脂质和/或糖和/或能量代谢改善剂适用于各种领 域诸如药品、食品、饲料等，并且本发明在工业上是非常有用的。
【主权项】
1. 一种代谢改善剂，其包含具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/ 或具有18个碳原子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸。2. 根据权利要求1的试剂，其中前述氧代脂肪酸和/或羟基脂肪酸具有11-位反式双 键或12-位顺式双键。3. 根据权利要求1的试剂，其中所述氧代脂肪酸为选自10-氧代-顺式-12-十八碳烯 酸、10-氧代-顺式-12,顺式-15-十八碳二烯酸、10-氧代-顺式-6,顺式-12-十八碳二烯 酸、ICK氧代-顺式-6，顺式-12，顺式-15-十八碳二稀酸、10-氧代十八烧酸、10-氧代-顺 式-6-十八碳烯酸、10-氧代-顺式-15-十八碳烯酸或10-氧代-顺式-6,顺式-15-十八 碳二稀酸、12-氧代十八烧酸、10-氧代-反式-11-十八碳稀酸、10-氧代-顺式_6，反 式 _11_十八碳二稀酸、1〇_氧代-反式_11，顺式 _15_十八碳二稀酸、10-氧代-顺式_6， 反式-11，顺式-15-十八碳三烯酸和12-氧代-顺式-9-十八碳烯酸的至少一种。4. 根据权利要求1的试剂，其中所述羟基脂肪酸为选自10-羟基-顺式-12-十八碳 烯酸、10-羟基-顺式-12,顺式-15-十八碳二烯酸、10-羟基-顺式-6,顺式-12-十八碳 二烯酸、10-羟基-顺式-6,顺式-12,顺式-15-十八碳三烯酸、10, 12-二羟基十八烷酸、 10-羟基十八烷酸、10-羟基-顺式-15-十八碳烯酸、10-羟基-顺式-6-十八碳烯酸、10-羟 基 _顺式-6，顺式-15-十八碳二稀酸、12-羟基十八烧酸、10-羟基-反式-11-十八碳稀 酸、10-羟基-反式-11，顺式-15-十八碳二烯酸、10-羟基-顺式-6,反式-11-十八碳二 烯酸、10-羟基-顺式-6,反式-11，顺式-15-十八碳三烯酸和蓖麻油酸的至少一种。5. 根据权利要求1至4中任一项的试剂，其用于选自肥胖、糖尿病、脂质代谢异常、高 脂血症和脂肪肝的至少一种的预防或改善。6. 根据权利要求1至4中任一项的试剂，其为食品或食品添加剂。7. 根据权利要求1至4中任一项的试剂，其为药品。8. 根据权利要求1至4中任一项的试剂，其为饲料或饲料添加剂。9. 一种改善哺乳动物代谢的方法，其包括将具有18个碳原子和10-或12-位羰基的 氧代脂肪酸和/或具有18个碳原子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸给予所述哺乳 动物。10. 具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/或具有18个碳原子和 10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸，其用作代谢改善剂。11. 具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/或具有18个碳原子和 10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸在制备代谢改善剂中的用途。
【专利摘要】本发明提供一种代谢改善剂，其包含具有18个碳原子和10-或12-位羰基的氧代脂肪酸和/或具有18个碳原子和10-和/或12-位羟基的羟基脂肪酸，以及所述代谢改善剂作为食品、药品等的用途。
【IPC分类】A61P3/10, A61K31/201, A61P3/04, A61P3/06, A23L1/30, A61P1/16, A23K1/16, A61K31/202
【公开号】CN104902887
【申请号】CN201380068773
【发明人】小川顺, 岸野重信, 朴时范, 河田照雄, 高桥信之, 后藤刚, 金英一, 菅原达也, 平田孝, 米岛靖记
【申请人】国立大学法人京都大学, 日东药品工业株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月14日
【公告号】EP2913051A1, US20150342916, WO2014069227A1
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