用于降低头痛的频率和/或严重性的组合物及方法
用于降低头痛的频率和/或严重性的组合物及方法
【专利说明】用于降低头痛的频率和/或严重性的组合物及方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2012年6月26日提交的申请号为2012902720的澳大利亚临时专利申请的优先权，其全部通过引用并入本文。
技术领域
[0003]本发明涉及一种用于降低头痛的频率和/或严重性的组合物及方法。
[0004]开发本发明主要用于通过给药包含成人干细胞的组合物来治疗偏头痛、紧张性头痛、三叉神经痛、丛集性头痛、或者头痛，且下面将关于该应用描述本发明。然而，应理解为本发明不被限制于该特定使用领域。
【背景技术】
[0005]说明书中的任何现有技术的讨论绝对不会被认为，承认这样的现有技术是广为人知的或者形成本领域的公知常识的一部分。
[0006]头痛是在头部，诸如在头皮、面部、如额或者颈部中的疼痛。头痛可能是原发性头痛或者是继发性头痛。原发性头痛是不通过另一疾病引起的头痛。相反地，继发性头痛是由病症或者病况，诸如生病、传染、损伤、中风或者其他异常引起的。因此，伴随着继发性头痛有潜在疾病，其产生作为潜在疾病症状的头痛。
[0007]紧张性头痛是原发性头痛的最常见的类型并且占所有头痛的约90%。紧张性头痛经常体验在前额，在头部和颈部的后面，或者在两者区域。它被描述为紧紧的感觉，仿佛头部被夹住。双肩或者颈部中的酸痛是常见的。对于紧张性头痛，恶心是不常见的。紧张型头痛可能是间断性的或者是慢性的。间断性紧张型头痛被定义为在一个月里发生少于15日的紧张型头痛，而慢性的紧张性头痛在至少在6个月间发生15日或者多于一个月。尽管典型的紧张性头痛持续4 - 6小时，但是紧张型头痛可能持续几分钟到几天，几个月或者甚至几年。
[0008]偏头痛可以是单侧或者双侧复现的头痛。偏头痛可以与前驱症状一起或者不与前驱症状一起发生。偏头痛的病兆包括神经性症状，诸如眩晕、耳鸣、暗点、畏光、或者视觉闪光(例如，明亮曲折线)。没有病兆的偏头痛是最常见的，占所有偏头痛的多于80%。估计10-20%的人口遭受偏头痛的痛苦。在美国，估计6%的男性和15% -17%的女性具有偏头痛。在女性中更常见地发现偏头痛，具有3:1的女性对男性的比例。
[0009]典型的偏头痛是单侧的(影响头部的一半)，实质上是脉动的并且持续2小时至72小时。症状包括恶心、呕吐、畏光(对光增加的敏感性)并且高声恐怖(对声音增加的敏感性)。
[0010]偏头痛的原因不清楚。人之间偏头痛不同并且治疗也如此。初期的治疗使用用于头痛的镇痛药、用于恶心的止吐药、和触发物的回避。
[0011]如果其降低偏头痛发作的频率或者严重性至少50%，则认为预防偏头痛药物有效。可以利用很多药物以预防或者降低偏头痛发作的频率、持续时间和严重性。阻滞剂，诸如普萘洛尔、阿替洛尔、及美托洛尔；钙通道阻滞剂，诸如氨氯地平、氟桂利嗪及维拉帕米；抗惊厥药丙戊酸钠、双丙戊酸钠、加巴喷丁及托吡酯；以及三环抗抑郁剂是一些通常使用的药物。除了它们的暂时的性质和相关的无效之外，偏头痛预防药物的主要问题是通常不希望的副作用是常见的。这种副作用包括失眠、镇静作用或者性功能障碍。
[0012]丛集性头痛比偏头痛或者紧张性头痛很不常见。丛集性头痛显示超过许多周期间的一组疼痛发作。丛集性头痛的疼痛在约5分钟内达到最高点并且可以持续I个小时。具有丛集性头痛的某人可以每次在几周间-也许是几个月-每天受到几种头痛，通常被可变长度的无痛期中断。与具有偏头痛的人对比，也许多达女人的5-8倍的男人具有丛集性头痛。尽管他们在他们的青少年至50岁出头可能经历他们第一次发作，但是大多数人在25岁时受到他们的第一次丛集性头痛。丛集性头痛有间断性的和慢性的两种类型。间断性的类型是更常见的并且特征为在约两个月间每天头痛2次或者3次，然后接着是长周期(例如，一年)的未处理的持续的缓解期间。然后可以重复该模式。慢性类型行为与间断性的相似，但是没有未处理的持续的缓解期间。
[0013]三叉神经痛为神经性疾病，特征为源于三叉神经的面部的强烈疼痛的发作。疾病特征为强烈的面部疼痛的发作，其持续几秒至几分钟或者几小时。强烈疼痛的发作可能突发性地发生。个体的发作每次通常影响面部的一侧并且趋向于发生在以缓解持续几个月或者甚至几年的循环中。某些药物时常帮助减少疼痛和发作率。这些药物包括抗癫痫药物(ant1-seizure drug)(卡马西平、加巴喷丁、拉莫三嘆、苯妥英、丙戊酸盐、及普瑞巴林)、肌肉松弛药(巴氯芬、氯硝西泮)及三环抗抑郁剂(阿米替林、去甲替林、或者卡马西平)。一些患者可能需要外科手术以释放神经上的压力。技术包括割开或者破坏三叉神经的一部分、立体定位性放射外科手术或者去除在三叉神经上施压的血管或者肿瘤的外科手术。
[0014]所有头痛的约2%为继发性头痛。例如，颈椎性头痛是由颈部问题，诸如颈部肌肉异常引起的头痛，该颈部问题由持续时间长的不良的人体姿势、关节炎、上部脊骨的损伤、或者颈椎疾病引起。窦性头痛是继发性头痛的另一种类型。鼻旁窦中的炎症和/或感染能够引起窦性头痛。
[0015]本发明的目的在于克服或者改善现有技术的至少一个缺点，或者提供有用的替代物。
【发明内容】
[0016]令人惊讶地，本发明的发明人发现注射脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者骨髓来源的细胞制品(其都包含成人干细胞)降低头痛的频率和/或严重性。
[0017]一个方面，本发明涉及一种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将组合物给药至受试者，组合物包含:
[0018]脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞；或者
[0019]骨髓来源的细胞制品。
[0020]另一个方面，脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者骨髓来源的细胞制品包含成人干细胞。
[0021]另一个方面，本发明涉及一种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含成人干细胞的组合物给药至受试者。
[0022]另一个方面，成人干细胞获得自脂肪组织、骨髓或者血液。
[0023]另一个方面，成人干细胞为间充质干细胞和/或早期间充质/间质前体细胞，和/或脂肪来源的间质细胞/干细胞和/或骨髓间质细胞/干细胞。
[0024]另一个方面，头痛选自由偏头痛、紧张性头痛、三叉神经痛及丛集性头痛组成的组。
[0025]另一个方面，脂肪组织、骨髓或者干细胞为自体的或者同种异体的。
[0026]另一个方面，脂肪组织为脂肪抽吸组织。
[0027]另一个方面，脂肪抽吸组织为腹部的脂肪抽吸组织。
[0028]另一个方面，用酶和/或离解试剂，诸如胶原酶或者卵磷脂处理脂肪组织，以弄破组织。
[0029]另一个方面，脂肪组织经受机械搅拌以便弄破组织。
[0030]另一个方面，用超声空化处理脂肪组织，以溶解脂肪细胞，析出间质细胞/干细胞和/或析出细胞外基质。
[0031]另一个方面，用干细胞激活剂，诸如富含血小板的血浆、富含生长因子的血浆、LED或者低强度激光或者其他处理脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人间质细胞/干细胞。
[0032]另一个方面，脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人间质细胞/干细胞通过静脉内、皮下、肌内或者关节内给药至受试者，或者被加入至脂肪用于脂肪移植。
[0033]另一个方面，本发明涉及一种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含从脐带(沃顿胶)、脐带血或者胎盘获得的干细胞的组合物给药至受试者。这种干细胞可以是同种异体的并且任选地用富含血小板的血浆或者其他干细胞激活剂，诸如LED或者低强度激光处理。
[0034]另一个方面，本发明涉及一种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包括脂肪来源的和/或间质来源的细胞外基质的组合物给药至受试者。
[0035]另一个方面，本发明涉及组合物用于制备用于降低头痛的频率和/或严重性的药剂的用途，组合物包含:
[0036]脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞；或者
[0037]骨髓来源的细胞制品。
[0038]另一个方面，本发明涉及包含成人干细胞的组合物用于制备用于降低头痛的频率和/或严重性的药剂的用途。
[0039]另一个方面，本发明涉及包含从脐带(沃顿胶)、脐带血或者胎盘获得的干细胞的组合物用于制备用于降低头痛的频率和/或严重性的药剂的用途。这种干细胞可以是同种异体的并且任选地用富含血小板的血浆或者其他干细胞激活剂，诸如LED或者低强度激光处理。
[0040]另一个方面，本发明涉及包含脂肪组织来源的和/或间质来源的细胞外基质的组合物用于制备用于降低头痛的频率和/或严重性的药剂的用途。
[0041]另一个方面，本发明涉及一种用于降低头痛的频率和/或严重性的组合物，组合物包含:
[0042]脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞；或者
[0043]骨髓来源的细胞制品。
[0044]另一个方面，本发明涉及一种用于降低头痛的频率和/或严重性的包含成人干细胞的组合物。
[0045]另一个方面，本发明涉及一种用于在降低头痛的频率和 /或严重性的包含从脐带(沃顿胶)、脐带血或者胎盘获得的干细胞的组合物。
[0046]另一个方面，本发明涉及一种用于在降低头痛的频率和/或严重性的包含脂肪组织来源的和/或间质来源的细胞外基质的组合物。
[0047]如本文中使用，术语“脂肪组织”是指任何脂肪组织。脂肪组织可以是褐色或者白色脂肪组织。脂肪组织可以是间充质的或者间质的。优选地，脂肪组织为皮下的白色脂肪组织。脂肪组织可以来自具有脂肪组织的任何生物体。优选地，脂肪组织为哺乳动物的，更优选地，脂肪组织为人类的。方便的人类脂肪组织的来源为源于脂肪抽吸外科手术或者其他外科手术的。然而，脂肪组织的来源或者脂肪组织分离的方法对本发明不是关键的。
[0048]如本文中使用，术语“间质血管成分”是指源于脂肪组织或者骨髓中发现的血管和外围组织的包含细胞的成分。成分可以包含不同细胞种类，以举例的方式包括间充质干细胞、早期间充质/间质前体细胞、脂肪来源的间质干细胞、Muse-AT细胞、造血细胞、造血干细胞、血小板、枯否细胞、破骨细胞、巨核细胞、粒细胞、NK细胞、内皮前体细胞或者祖细胞、祖细胞、CD34+细胞、Stro-1+细胞、Stro-3+细胞、CD29+细胞、CD166+细胞、Thy-1+或者⑶90+干细胞、⑶44+细胞、免疫细胞(诸如单核细胞、白细胞、淋巴细胞、BandT细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性白细胞、嗜中性粒细胞、中性粒细胞等等)。间质血管成分还包括本文中公开的表达任何标记物的细胞或者其任何组合。如本文中使用，术语“间质血管成分”包括在它的范围的术语，诸如“间充质血管成分”、“间充质成分”、“间质成分”、“前间充质成分”，“间充质如体”等等。
[0049]如本文中使用，术语“成人干细胞”是指未分化的细胞，胚胎发育之后在孩子和成人中的身体中发现的细胞，其划分为补充快死的细胞和更新损坏的组织。如本文中使用，术语“成人干细胞”不包括获得自胎儿或者胚胎的细胞。
[0050]如本文中使用，术语“分化的”是指细胞达到了成熟的终态，使得细胞发育完全并且证明生物学特殊化和/或适于特殊环境和/或功能。典型地，分化细胞的特征为基因的表达，该基因在该细胞中编码了分化相关的蛋白质。例如，在白细胞中的GALC的表达是晚期分化的白细胞的典型的例子。
[0051]如本文中使用，术语“间充质干细胞”是指间质或者间充质细胞或者早期间充质/间质前体细胞或者脂肪组织来源的间质细胞/干细胞，其为多能的并且能够作为各种不同细胞类型(诸如但不限于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉和神经元/神经胶质细胞谱系)的干细胞样的前体。间充质干细胞组成可来源于，例如，脂肪组织和骨髓的亚群。如本文中使用，术语“间充质干细胞”包括在它的范围术语，诸如“间质干细胞”、“骨髓间质细胞”、“多能间质细胞”、“间充质前体细胞”等等。
[0052]术语“前体细胞”、“祖细胞”和“干细胞”在本领域和本文中可互换地使用并且是指多能性、或者谱系未定型的，祖细胞，其潜在地有无限数的有丝分裂的能力以更新它本身或产生分化为所需的细胞类型的后代细胞。相对于多能性干细胞，谱系定型的祖细胞通常被认为没有引起很多彼此表现型不同的细胞类型的能力。反而，祖细胞产生一种或者也许两种谱系定型的细胞类型。
[0053]如本文中使用，术语“多能的”，“多潜能”或者“多潜能性”意指干细胞分化为多于一种细胞类型的干细胞的能力。
[0054]如本文中使用，术语“同种异体的”意指来源于同类的不同的哺乳动物的任何物质。
[0055]如本文中使用，术语“自体的”意指来源于个体和再引入至个体的任何物质。
[0056]除非上下文中明确要求其他，则整个说明书和权利要求书中词语“包括”、“包含”等等被解释为包括在内的意思，与排外或者穷举的意思相反，换句话说，是“包括，但不限于”的意思。
【附图说明】
[0057]图1:获得自超声空化处理的脂肪组织的细胞FACS分析-其中通过40克的通过超声空化分离的脂肪组织的荧光细胞核进行细胞计数。
[0058]图2:从超声空化处理的脂肪组织生长的细胞的吉姆萨染色的群体。
[0059]图3:从超声空化处理的脂肪组织生长的间充质干细胞的细胞培养。
【具体实施方式】
[0060]本发明基于脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者骨髓来源的细胞制品(其均含有成人干细胞)的注射降低偏头痛的频率和严重性的惊奇的发现。
[0061]脂肪组织可以通过脂肪抽吸外科手术、脂肪的吸出或者通过其他外科方法分离来获得。供体优选为将以间质血管成分或者间充质干细胞处理的同一患者或者与被处理的个体免疫一致的同种异体的供体。本领域的普通技术人员能够使用标准技术和指标容易识别配对的供体。
[0062]使用标准脂肪抽吸技术可以收获脂肪组织，且通过超声空化和/或酶处理和/或机械搅拌可以收获与脂肪组织分离的间质血管成分。
[0063]在一个实施例中，本发明的方法使用具有探针的超声空化装置，探针放置在与脂肪组织接触的位置，因此破除或者溶解在脂肪组织中的大部分脂肪细胞并且释放间质血管成分。使用特殊的超声空化装置对于本发明不是关键的。一个适合的选择是HIELSCHLER超声波处理器，其为技术上先进的高强度的超声波处理器。这个装置能够安全地处理从微升至升的宽量程的有机和无机物质。可以使用的其他装置包括Vibra-Cell?装置(Sonics)、VASER(SoltaMedical)或者 QSonica 超声波处理器。
[0064]在另一个实施例中，在生物溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液或者生理盐水溶液)中的脂肪组织可以放置于冷藏的环境中(组织/细胞不应低于2°C)。超声空化装置探针可以放置在脂肪组织中并且将振幅设置为约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约 80%，周期约 0.2、约 0.3、约 0.4、约 0.5、约 0.6、约 0.7、约 0.8、约 0.9，用约 10 秒、约20秒、约30秒、约40秒、约50秒、约60秒、约I分10秒、约I分20秒、约I分30秒、约I分40秒、约I分50秒、约2分、约3分、约4分、约5分、约6分、约7分、约8分、约9分、约10分。在操作期间可以将探针调节在管内的不同的位置。可以在室温下进行该过程并且调节振幅、周期和时间以防止脂肪组织的温度上升至大于约43°C至约45°C。超声空化的顺序和计时(具体地，振幅、周期和应用时间)可以变化，但是被确定至通过防止脂肪组织的温度上升至大于理想的37°C或者不超过约43°C至约45°C而确保在间质血管成分中干细胞的最佳的细胞数量和生存能力的程度。通过简单的试错法能够容易地确定这些参数。典型地，振幅为约50%，周期为约0.4至约0.5并且时间为约I分30秒。如果振幅增加，周期或者时间能够因而减少(或者反之亦然)以确保脂肪组织的温度不会上升至大于约43°C至约45°C。超声处理后，管中存在浓溶液(其不能被过滤或者容易分为间质血管成分)并可以用离心机分离该浓溶液。
[0065]离心作用导致3层-上部脂质层、含有细胞外基质和间质血管细胞的中间浮动层、以及底部流体层。必须去除并且排出上部脂质层，并且将管中剩下的内含物充分混合以分离细胞外基质并加入0.9%生理盐水。进一步的离心作用引起细胞和细胞外基质沉降和在底部沉淀-沉淀物含有细胞外基质和包括可存活的和功能的干细胞(包括间充质干细胞)的间质血管成分。可以过滤沉淀物以去除任何大的碎片。
[0066]在另一个实施例中，本发明涉及从脂肪组织回收间质血管成分或者间质细胞，该方法包括用超声空化处理脂肪组织一段时间，振幅和周期，维持间质血管成分中的成人干细胞的生存能力。
[0067]在另一个实施例中，用振幅设置为约20%至约75%并且周期设置为约0.2至约0.9的超声波装置，将脂肪组织用超声空化处理约10秒至约10分钟。
[0068]在另一个实施例中，脂肪组织的温度不超过约43 °C。
[0069]在另一个实施例中，本发明的方法使用酶，诸如胶原酶，并且搅拌以产生脂肪来源的细胞悬液，将细胞悬液使用离心机分离并洗涤以分离间质血管成分或者间质细胞。
[0070]在另一个实施例中，本发明的方法使用卵磷脂，并搅拌以生产脂肪来源的细胞悬液，将细胞悬液使用离心机分离并洗涤以分离间质血管成分或者间质细胞。
[0071]可以通过传统的给药途径，诸如静脉注射，将脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人干细胞直接注入于需要其的受试者中，或者在给药之前能够进一步地处理脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人干细胞以纯化(以及如果需要，在培养物中扩增)所需的细胞类型，诸如间充质干细胞、STRO-1+细胞、STRO-3+细胞、脂肪来源的间质干细胞、间充质前体细胞或者Muse-AT细胞。
[0072]在一些实施例中，能够从脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者骨髓来源的细胞制品通过使用独特的细胞表面抗原和用于体外扩增的荧光激活细胞分选术(FACS)的分级分离来分离、纯化或者浓缩出间充质干细胞。
[0073]在其他实施例中，可以在给药之前培养、扩增和/或分化脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人干细胞。
[0074]在其他实施例中，可 以储存脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人干细胞用于以后的植入/注入。在细胞库中的适度至长期的储存也在本发明的范围内。
[0075]在处理的最后，可以将脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人干细胞装在通过皮下、关节内、静脉内、肌肉内、或者腹膜内技术给药至受体的递送装置，诸如注射器或者静脉注射袋。换句话说，通过本领域的普通技术人员所知的任何方式将细胞放入至患者内，例如，细胞可以注射在血管内用于全身性或者局部递送，注射在组织(例如，心肌、或者骨骼肌)内，注射在关节(关节内的)内，注射在真皮(皮下的)内，注射在组织间隙(例如，心包或者腹膜)内，或者注射在组织(例如，尿道周位置)内，或者其他位置。优选的实施例包括通过针或者导管放入，或者与添加剂(诸如预制成的基质或者脂肪来源的或者间质来源的细胞外基质)结合的直接的外科植入放入。
[0076]脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人干细胞可以单独或者与其他细胞、组织、组织片段、去矿物质骨、生长因子(诸如胰岛素)或者药物(诸如噻格列酮(thiaglitazone)族的成员)、生物活性的或者惰性的化合物、可吸收性塑料支架、脂肪来源的或者间质来源的格子和/或细胞外基质或者其他用于提高细胞群的递送、效能、耐受性、或者功能的添加剂组合应用。在本发明的某些实施例中，将细胞给药至具有一种或者多种的细胞分化因子(诸如细胞因子类和生长因子)的患者。在其他实施例中，用富含血小板的血浆或者富含生长因子的血浆处理细胞。
[0077]现在将参考描述了具体的组合物和使用方法的具体的但非限制性的示例来更详细地描述本发明。然而，应理解的是，包括具体的过程、组合物和方法的详细描述，仅仅用于举例说明本发明的目的。其不应该理解为，以任何方式对如以上陈述的本发明构思的广泛的描述的限制。
[0078]示例
[0079]示例1-通过脂肪抽吸制备脂肪组织
[0080]将过量的肿胀溶液(I升的生理盐水中，含有Img肾上腺素，800mg利多卡因和1mL的8.4%碳酸氢钠溶液，该肿胀溶液超过在脂肪抽吸操作之前待吸出的脂肪抽吸的量)注入至皮下脂肪层(肿胀方法)内，然后使用具有例如2-3_内径的套管(由金属制成，带抽吸器)用于脂肪抽吸操作。脂肪抽吸操作在本领域中是众所周知的，并且例如，能够参考 BUNK0D0，第 429-469 页出版的 Biyo Seikei Shujutsu Practice 2 (CosmeticOperat1n Practice2)，编辑 Masanari ICHIDA、Ryusaburo TANINO 和 Yoshiaki HOSAKA,其通过参考全部合并到本文中。
[0081]用盐水洗涤吸出的脂肪。可以产生约50ml至1L的洗涤吸出物，并且得到的脂肪组织来源的细胞物质用于获得间质血管成分。
[0082]示例2-通过外科手术制备脂肪组织
[0083]通过外科手术，从给予了他们的知情同意的人受试者中获得脂肪组织。用本领域熟知的技术进行分离。简单地，从给予了他们的知情同意的人受试者抽出的脂肪组织中无菌分离人脂肪组织。得到的脂肪组织来源的细胞物质用于获得间质血管成分。
[0084]示例3-富含血小板的血浆和富含生长因子的血浆的制备
[0085]I)麻醉之前采集血液。用2x9mL柠檬酸葡萄糖(AOT-A)填充血液采集管(BDvacutainer)(真空压力)。使用18G或者更大的针抽血液以避免通过剪切激活血小板。通过将管换向3-4次混合血液管的内含物。
[0086]2) 450gxl0min离心ACD-A血液填充的管。
[0087]3)用相同的移液管从每个管去除血浆层(上部层)并且将血浆层放置在15ml的灭菌管中。血液不应受到干扰并且应消除静止在血液上的白细胞薄层。在红血细胞上最好留下5mm血浆层。含有富集血小板的血浆(PRP)可以按原样使用或者进行如下进一步处理。
[0088]4)2000g/10min离心含有血浆的管-在管的底部应形成血小板的小的沉淀物。
[0089]5)用移液管将上部贫血小板的血浆移除至1.5ml并排出。应使用同一移液管在剩下的1.5ml中再悬浮沉淀物。这是富含血小板的血浆(PRP)。
[0090]6)可以按原样使用PRP，或者如果需要，PRP与加入至PRP的150 μ I的葡萄糖酸钙(ImL注射器和针)粘在一起并充分混合。应将管放置在水浴中(37°C -不摇动)或者留在室温更长时间段。PRP会形成固体凝胶。
[0091]7)固化之后，可以将PRP留在37°C (以加快过程)或者室温以在接下来的1_2小时部分地溶解-这被称作富含生长因子的血浆(PRGF)。
[0092]示例4 -通过胶原酶和/或卵磷脂治疗制备脂肪组织的间质血管成分
[0093]I)使用3mm套管和改性克莱因溶液(在I升生理盐水中含有，Img肾上腺素，400mg至800mg利多卡因和1mL的8.4%碳酸氢钠溶液)，从患者的腹部获得50_1000mL之间的脂肪抽吸物。脂肪抽吸物用生理盐水漂洗并放置在500mL的离心机的罐中。
[0094]2)加入胶原酶(Serva)以获得0.05 %的最终浓度(通过0.22 μ m消毒滤纸消毒的过滤法)和/或卵磷脂10% (Adistem)。
[0095]3)样品在水浴(37°C )中在37°C下培养30_90分钟，并轻轻搅动。在培养期间每15分钟将样品用手轻轻倒转。
[0096]4)培养以后将样品在500g下离心5min。离心之后出现三层。上部黄色/澄清层(脂质层)。白色纤维性中间层，和红色/白色底层，其在管的底部具有细胞沉淀物。
[0097]5)通过用混合套管和注射器抽沉淀物而从罐移除细胞沉淀物。
[0098]6)将细胞沉淀物排出至50mL离心管并加入PBS至40mL。使用真空泵通过100 μ mSteriflip (Millipore)将管内含物无菌过滤至50mL管。
[0099]7)将滤液在500g下离心5分钟。
[0100]8)不干扰沉淀物情况下将上清液移除并将所有细胞沉淀物组合在一个离心管中。将得到的沉淀物再悬浮并加入40mL PBSo
[0101]9)将细胞悬液在500g下离心5分钟并将上清液移除。
[0102]10)加入 20mL PBS 并通过 60μηι Steriflip (Millipore)过滤细胞悬液。
[0103]11)将滤液在500g下离心5分钟并将上清液移除。将样品移除用于细胞计数(将充分混合的50 μ I的细胞样品加入至0.4%的锥虫蓝，混合并在将样品放置在血球计数器的腔内之前允许静置1-2分钟。通过在格子区域中计算至少100个细胞确定细胞数和生存能力。通过锥虫蓝的排斥确定可存活的细胞)。
[0104]12)可以加入5-10mL PRP或者PRGF，或者生理盐水。
[0105]13)将样品抽入至注射器内并注射入至I升生理盐水静脉注射袋，用于注入患者。
[0106]示例5-通过超声空化制备脂肪组织的间质血管成分
[0107]I)将如示例I或者2中描述的来源于脂肪抽吸吸出物或者用外科手术方法获得的脂肪组织放置在合适的管和生物溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液或者生理盐水溶液)中。
[0108]2)通过注射器末端的引流来去除过量的流体，或者将管在200g下离心2分钟以分离出过量的流体和脂肪组织。将在管的底部的过量的流体去除。
[0109]3)(任选的)将管放置在冷藏的环境中并注意确保组织/细胞的温度不降到低于2。。。
[0110]4)将超声空化装置探针放置于脂肪组织并将振幅设置在50%，周期为0.4至0.5。在管的一个或者两个不同位置(即，管的底部和上部)升降探针I分钟，然后约30-40秒。3分钟后任选地重复该过程。
[0111]5)注意确保使脂肪组织温度不要上升至大于理想的37°C或者最多不超过约43。。。
[0112]6)超声处理之后，在管内观察到浓溶液并在800g下离心浓溶液5min。
[0113]7)离心之后有3层-上部脂质层、含有细胞外基质和间质血管细胞的中间浮动层、以及底部流体层。
[0114]8)上部脂质层使用混合套管和注射器移除和排出，并将管的剩下的内含物充分混合以进一步破裂细胞外基质。
[0115]9)将等渗溶液(生理盐水)加入到管至45ml并将管在800g下离心5min，引发细胞和细胞外基质在底部沉降和沉淀。
[0116]10)在管的底部观察到大的沉淀物，大的沉淀物含有细胞外基质和包括可存活的和功能的干细胞的间质血管成分。然后使用混合套管和注射器移除沉淀物，并通过100 μπι滤纸过滤沉淀物以去除任何大的碎片。
[0117]11)将样品移开用于细胞计数-典型的，使用这个方法的、来源于20g的脂肪组织的细胞数在约40至约200x106之间，即，约2至约10x106/克，其大于来自典型地导致约0.5x106/克的脂肪组织的胶原酶分离的细胞数。
[0118]12)可以在注射之前或者在注射时将PRP、PRGF或者其他细胞生长因子/细胞因子类加入细 胞沉淀物。
[0119]13)将样品抽到注射器内并注射到患者的关节内、肌内、或者腹膜内或者到用于注入的I升生理盐水静脉注射袋内。
[0120]细胞沉淀物的分析显示能够在培养物中生长(见示例7和图2)并含有间充质干细胞(图3)的可存活的细胞(图1)的存在。
[0121]示例6-骨髓的制备
[0122]从胸骨、后面的髂骨、或者前面的髂骨提取骨髓。用聚维酮碘溶液准备位点并在皮肤下面进行局部麻醉。使用较长的针以识别髂嵴的中点并且在骨膜下面沉积3_4mL 2%利多卡因。将“J”针插入于前面的/后面的髂骨翼内。将针轻轻地旋转进入至骨髓腔的Icm处。从针和附加的5-cc注射器移开通管丝。通过注射器活塞的缩回吸出骨髓。采集了2-3mL的骨髓之后，如果想获得更多的骨髓，则能够改变针的位置。
[0123]将通过灌流或吸出方法收获的骨髓细胞离心并悬浮在15mL的PBS中。将骨髓细胞放置在15mL的(1.077g/mL)稠密溶液(淋巴细胞分离剂(Lymphoprep))中。在室温下在2，OOOrpm下离心30分钟后，从界面处的确定层采集骨髓细胞。
[0124]示例7-制备扩增的间充质干细胞
[0125]能够通过任何适合的方法从脂肪组织获得成人干细胞，并且使用标准细胞培养基(例如，10%胎牛血清或者人血清补充的alphaMEM (Gibco)、或者无血清培养基(Gibco))没有分化地培养成人干细胞。将初级培养物以Ix 106/100_接种至平板。优选地细胞被扩增为1-2传代，但可以在5% CO2或者低氧环境下传代高达7倍。如果需要，这种细胞可以同种细胞地传代。将分离的、自体的或者同种异体的细胞培养至适合的点，通常为2传代，通过标准方法评估生存能力和产率。通过阳性干细胞标记物⑶29+、⑶44+、⑶90+、⑶105+进行扩增的细胞的标准试验。分离的细胞能够被分化为软骨、骨头和脂肪细胞-证明它们的分化为不同组织细胞的潜在性。关于良好的医疗实践过程，除了对肝炎、HIV和密螺旋体属的标准血清学试验，还有对用于细菌和真菌的16s亚基的PCR试验，用于支原体属、杂质和细胞生存能力的4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚染色，以及低温保存之前微观形态的评估。可以在应用之前执行上述提到的PCR试验和用鲎变形细胞溶解物试验法(LAL)对内毒素类/热原的试验。
[0126]示例8-将脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞给药至具有偏头痛病史的患者
[0127]患者I
[0128]该患者具有长期的满足头痛症第2版第I次修订1.5.1慢性偏头痛(HeadacheDisorders2nd Edit1n 1st Revis1n 1.5.1Chronic Migraine)的国际分类的偏头痛和头痛的病史，即，患者典型地遭受多于20天/月的偏头痛。混合的紧张和偏头痛不存在病兆。
[0129]将根据示例5(外加PRGF)制备的脂肪组织来源的间质血管成分(来自700mL脂肪组织的5.46亿个细胞)单次静脉内给药之后，I个月之后患者仅头痛一次。
[0130]患者2
[0131]该患者具有长期的满足头痛症第2版第I次修订1.5.1慢性偏头痛的国际分类的偏头痛/头痛的病史，即，患者典型地遭受多于20天/月的偏头痛。患者消耗吗啡片、扑热息痛和磷酸可待因(每天高达8片)、或者盐酸羟考酮。
[0132]将根据示例4(胶原酶)制备的脂肪组织来源的间质血管成分(来自1，005mL脂肪组织的4.95亿个细胞)单次静脉内给药之后，在5个月期间，患者记录了 I次偏头痛和一些不严重的头痛。治疗3天后通知结果并停了吗啡片。5个月之后复发不严重的头痛，并在7个月时用根据示例4制备的6.38亿个细胞重新由静脉内治疗患者。从第一天看到改善。扑热息痛剂量降低至每周一次。在18个月里仅经历了偏头痛7次和一些正常头痛。
[0133]患者3
[0134]该患者具有长期的满足头痛症第2版第I次修订1.2.1偏头痛的典型病兆和 2.2 频繁间断性的紧张型头痛(headache Disorders 2nd Edit1n 1st revis1n1.2.1Typical Aura with Migraine headache and 2.2Frequent episodic tens1n-typeheadache)的国际分类的偏头痛和紧张性头痛的病史。该患者具有终身的头痛病史，典型地，伴随典型病兆的每天2次的偏头痛和频繁间断性的紧张型头痛。
[0135]将根据示例4 (胶原酶和卵磷脂)和示例5 (外加PRGF)制备的脂肪组织来源的间质血管成分(29.3亿个细胞)单次静脉内给药。
[0136]治疗3天后通知结果。在I个月停止了所有头痛药。在3个月里紧张性头痛仅有I次。在4个月期间偶有轻的紧张性头痛。
[0137]患者4
[0138]该患者具有长期的满足头痛症第2版第I次修订1.5.1慢性的偏头痛的国际分类的偏头痛和头痛，即，患者典型地遭受多于20天/月的偏头痛。
[0139]将根据示例5制备的脂肪组织来源的间质血管成分(4千I百万细胞)单次静脉内给药之后，过去的12月里患者重头痛仅有2次，约2个月之前相隔3周(没有偏头痛严重，但具有与偏头痛一致的坏窦)。去年没有偏头痛。过去需要医生家访注射以减轻疼痛。患者现在仅仅偶尔服扑热息痛。
【主权项】
1.一种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将组合物给药至所述受试者，所述组合物包含: 脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞；或者 骨髓来源的细胞制品。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者所述骨髓来源的细胞制品包含成人干细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述成人干细胞为间充质干细胞和/或早期间充质/间质前体细胞，和/或脂肪组织来源的间质细胞/干细胞。4.一种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含成人干细胞的组合物给药至所述受试者。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述成人干细胞为间充质干细胞和/或早期间充质/间质前体细胞和/或脂肪组织来源的间质细胞/干细胞。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述间充质干细胞和/或早期间充质/间质前体细胞获得自脂肪组织、骨髓或者血液。7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述成人干细胞已被扩增和/或培养。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述头痛选自由偏头痛、紧张性头痛、三叉神经痛、丛集性头痛和头痛所组成的组。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织或者骨髓为自体的。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织或者骨髓为同种异体的。11.根据权利要求4所述的方法，其中所述成人干细胞为自体的。12.根据权利要求4所述的方法，其中所述成人干细胞为同种异体的。13.根据权利要求1所述的方法，其中用酶和/或离解试剂处理所述脂肪组织。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶为胶原酶并且所述离解试剂为卵磷脂。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织经受超声空化。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述超声空化溶解脂肪细胞。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织经受机械搅拌。18.根据权利要求1所述的方法，其中用富含血小板的血浆或者富含生长因子的血浆处理所述脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者所述骨髓来源的细胞制品。19.根据权利要求4所述的方法，其中用富含血小板的血浆或者富含生长因子的血浆处理所述成人干细胞。20.根据权利要求1所述的方法，其中将所述脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者所述骨髓来源的细胞制品通过静脉给药至所述受试者。21.根据权利要求4所述的方法，其中所述成人干细胞通过静脉给药。22.—种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含从脐带(沃顿胶)、脐带血或者胎盘获得的干细胞的组合物给药至所述受试者。23.—种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含脂肪组织来源的和/或间质来源的细胞外基质的组合物给药至所述受试者。
【专利摘要】在一个实施例中，本发明涉及一种用于降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞的组合物给药至受试者。在另一个实施例中，本发明涉及一种用于降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含将骨髓的组合物给药至受试者。在另一个实施例中，本发明涉及一种用于降低受试者头痛的频率或者严重性的方法，包括将包含成人干细胞的组合物给药至受试者。
【IPC分类】A61K35/28, C12N5/077, C12N5/0775, A61K35/44, A61P25/06, A61K35/51, A61K35/35
【公开号】CN104902909
【申请号】CN201380044736
【发明人】拉尔夫·布莱特, 佩林·布莱特, 布鲁斯·汉森, 韦恩·托马斯
【申请人】拉斯提地产控股企业有限公司, 安柏定企业有限公司, 他唯帝企业有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年6月26日
【公告号】CA2877022A1, EP2863927A1, EP2863927A4, US20150174172, WO2014000029A1
【专利说明】用于降低头痛的频率和/或严重性的组合物及方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2012年6月26日提交的申请号为2012902720的澳大利亚临时专利申请的优先权，其全部通过引用并入本文。
技术领域
[0003]本发明涉及一种用于降低头痛的频率和/或严重性的组合物及方法。
[0004]开发本发明主要用于通过给药包含成人干细胞的组合物来治疗偏头痛、紧张性头痛、三叉神经痛、丛集性头痛、或者头痛，且下面将关于该应用描述本发明。然而，应理解为本发明不被限制于该特定使用领域。
【背景技术】
[0005]说明书中的任何现有技术的讨论绝对不会被认为，承认这样的现有技术是广为人知的或者形成本领域的公知常识的一部分。
[0006]头痛是在头部，诸如在头皮、面部、如额或者颈部中的疼痛。头痛可能是原发性头痛或者是继发性头痛。原发性头痛是不通过另一疾病引起的头痛。相反地，继发性头痛是由病症或者病况，诸如生病、传染、损伤、中风或者其他异常引起的。因此，伴随着继发性头痛有潜在疾病，其产生作为潜在疾病症状的头痛。
[0007]紧张性头痛是原发性头痛的最常见的类型并且占所有头痛的约90%。紧张性头痛经常体验在前额，在头部和颈部的后面，或者在两者区域。它被描述为紧紧的感觉，仿佛头部被夹住。双肩或者颈部中的酸痛是常见的。对于紧张性头痛，恶心是不常见的。紧张型头痛可能是间断性的或者是慢性的。间断性紧张型头痛被定义为在一个月里发生少于15日的紧张型头痛，而慢性的紧张性头痛在至少在6个月间发生15日或者多于一个月。尽管典型的紧张性头痛持续4 - 6小时，但是紧张型头痛可能持续几分钟到几天，几个月或者甚至几年。
[0008]偏头痛可以是单侧或者双侧复现的头痛。偏头痛可以与前驱症状一起或者不与前驱症状一起发生。偏头痛的病兆包括神经性症状，诸如眩晕、耳鸣、暗点、畏光、或者视觉闪光(例如，明亮曲折线)。没有病兆的偏头痛是最常见的，占所有偏头痛的多于80%。估计10-20%的人口遭受偏头痛的痛苦。在美国，估计6%的男性和15% -17%的女性具有偏头痛。在女性中更常见地发现偏头痛，具有3:1的女性对男性的比例。
[0009]典型的偏头痛是单侧的(影响头部的一半)，实质上是脉动的并且持续2小时至72小时。症状包括恶心、呕吐、畏光(对光增加的敏感性)并且高声恐怖(对声音增加的敏感性)。
[0010]偏头痛的原因不清楚。人之间偏头痛不同并且治疗也如此。初期的治疗使用用于头痛的镇痛药、用于恶心的止吐药、和触发物的回避。
[0011]如果其降低偏头痛发作的频率或者严重性至少50%，则认为预防偏头痛药物有效。可以利用很多药物以预防或者降低偏头痛发作的频率、持续时间和严重性。阻滞剂，诸如普萘洛尔、阿替洛尔、及美托洛尔；钙通道阻滞剂，诸如氨氯地平、氟桂利嗪及维拉帕米；抗惊厥药丙戊酸钠、双丙戊酸钠、加巴喷丁及托吡酯；以及三环抗抑郁剂是一些通常使用的药物。除了它们的暂时的性质和相关的无效之外，偏头痛预防药物的主要问题是通常不希望的副作用是常见的。这种副作用包括失眠、镇静作用或者性功能障碍。
[0012]丛集性头痛比偏头痛或者紧张性头痛很不常见。丛集性头痛显示超过许多周期间的一组疼痛发作。丛集性头痛的疼痛在约5分钟内达到最高点并且可以持续I个小时。具有丛集性头痛的某人可以每次在几周间-也许是几个月-每天受到几种头痛，通常被可变长度的无痛期中断。与具有偏头痛的人对比，也许多达女人的5-8倍的男人具有丛集性头痛。尽管他们在他们的青少年至50岁出头可能经历他们第一次发作，但是大多数人在25岁时受到他们的第一次丛集性头痛。丛集性头痛有间断性的和慢性的两种类型。间断性的类型是更常见的并且特征为在约两个月间每天头痛2次或者3次，然后接着是长周期(例如，一年)的未处理的持续的缓解期间。然后可以重复该模式。慢性类型行为与间断性的相似，但是没有未处理的持续的缓解期间。
[0013]三叉神经痛为神经性疾病，特征为源于三叉神经的面部的强烈疼痛的发作。疾病特征为强烈的面部疼痛的发作，其持续几秒至几分钟或者几小时。强烈疼痛的发作可能突发性地发生。个体的发作每次通常影响面部的一侧并且趋向于发生在以缓解持续几个月或者甚至几年的循环中。某些药物时常帮助减少疼痛和发作率。这些药物包括抗癫痫药物(ant1-seizure drug)(卡马西平、加巴喷丁、拉莫三嘆、苯妥英、丙戊酸盐、及普瑞巴林)、肌肉松弛药(巴氯芬、氯硝西泮)及三环抗抑郁剂(阿米替林、去甲替林、或者卡马西平)。一些患者可能需要外科手术以释放神经上的压力。技术包括割开或者破坏三叉神经的一部分、立体定位性放射外科手术或者去除在三叉神经上施压的血管或者肿瘤的外科手术。
[0014]所有头痛的约2%为继发性头痛。例如，颈椎性头痛是由颈部问题，诸如颈部肌肉异常引起的头痛，该颈部问题由持续时间长的不良的人体姿势、关节炎、上部脊骨的损伤、或者颈椎疾病引起。窦性头痛是继发性头痛的另一种类型。鼻旁窦中的炎症和/或感染能够引起窦性头痛。
[0015]本发明的目的在于克服或者改善现有技术的至少一个缺点，或者提供有用的替代物。
【发明内容】
[0016]令人惊讶地，本发明的发明人发现注射脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者骨髓来源的细胞制品(其都包含成人干细胞)降低头痛的频率和/或严重性。
[0017]一个方面，本发明涉及一种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将组合物给药至受试者，组合物包含:
[0018]脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞；或者
[0019]骨髓来源的细胞制品。
[0020]另一个方面，脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者骨髓来源的细胞制品包含成人干细胞。
[0021]另一个方面，本发明涉及一种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含成人干细胞的组合物给药至受试者。
[0022]另一个方面，成人干细胞获得自脂肪组织、骨髓或者血液。
[0023]另一个方面，成人干细胞为间充质干细胞和/或早期间充质/间质前体细胞，和/或脂肪来源的间质细胞/干细胞和/或骨髓间质细胞/干细胞。
[0024]另一个方面，头痛选自由偏头痛、紧张性头痛、三叉神经痛及丛集性头痛组成的组。
[0025]另一个方面，脂肪组织、骨髓或者干细胞为自体的或者同种异体的。
[0026]另一个方面，脂肪组织为脂肪抽吸组织。
[0027]另一个方面，脂肪抽吸组织为腹部的脂肪抽吸组织。
[0028]另一个方面，用酶和/或离解试剂，诸如胶原酶或者卵磷脂处理脂肪组织，以弄破组织。
[0029]另一个方面，脂肪组织经受机械搅拌以便弄破组织。
[0030]另一个方面，用超声空化处理脂肪组织，以溶解脂肪细胞，析出间质细胞/干细胞和/或析出细胞外基质。
[0031]另一个方面，用干细胞激活剂，诸如富含血小板的血浆、富含生长因子的血浆、LED或者低强度激光或者其他处理脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人间质细胞/干细胞。
[0032]另一个方面，脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人间质细胞/干细胞通过静脉内、皮下、肌内或者关节内给药至受试者，或者被加入至脂肪用于脂肪移植。
[0033]另一个方面，本发明涉及一种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含从脐带(沃顿胶)、脐带血或者胎盘获得的干细胞的组合物给药至受试者。这种干细胞可以是同种异体的并且任选地用富含血小板的血浆或者其他干细胞激活剂，诸如LED或者低强度激光处理。
[0034]另一个方面，本发明涉及一种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包括脂肪来源的和/或间质来源的细胞外基质的组合物给药至受试者。
[0035]另一个方面，本发明涉及组合物用于制备用于降低头痛的频率和/或严重性的药剂的用途，组合物包含:
[0036]脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞；或者
[0037]骨髓来源的细胞制品。
[0038]另一个方面，本发明涉及包含成人干细胞的组合物用于制备用于降低头痛的频率和/或严重性的药剂的用途。
[0039]另一个方面，本发明涉及包含从脐带(沃顿胶)、脐带血或者胎盘获得的干细胞的组合物用于制备用于降低头痛的频率和/或严重性的药剂的用途。这种干细胞可以是同种异体的并且任选地用富含血小板的血浆或者其他干细胞激活剂，诸如LED或者低强度激光处理。
[0040]另一个方面，本发明涉及包含脂肪组织来源的和/或间质来源的细胞外基质的组合物用于制备用于降低头痛的频率和/或严重性的药剂的用途。
[0041]另一个方面，本发明涉及一种用于降低头痛的频率和/或严重性的组合物，组合物包含:
[0042]脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞；或者
[0043]骨髓来源的细胞制品。
[0044]另一个方面，本发明涉及一种用于降低头痛的频率和/或严重性的包含成人干细胞的组合物。
[0045]另一个方面，本发明涉及一种用于在降低头痛的频率和 /或严重性的包含从脐带(沃顿胶)、脐带血或者胎盘获得的干细胞的组合物。
[0046]另一个方面，本发明涉及一种用于在降低头痛的频率和/或严重性的包含脂肪组织来源的和/或间质来源的细胞外基质的组合物。
[0047]如本文中使用，术语“脂肪组织”是指任何脂肪组织。脂肪组织可以是褐色或者白色脂肪组织。脂肪组织可以是间充质的或者间质的。优选地，脂肪组织为皮下的白色脂肪组织。脂肪组织可以来自具有脂肪组织的任何生物体。优选地，脂肪组织为哺乳动物的，更优选地，脂肪组织为人类的。方便的人类脂肪组织的来源为源于脂肪抽吸外科手术或者其他外科手术的。然而，脂肪组织的来源或者脂肪组织分离的方法对本发明不是关键的。
[0048]如本文中使用，术语“间质血管成分”是指源于脂肪组织或者骨髓中发现的血管和外围组织的包含细胞的成分。成分可以包含不同细胞种类，以举例的方式包括间充质干细胞、早期间充质/间质前体细胞、脂肪来源的间质干细胞、Muse-AT细胞、造血细胞、造血干细胞、血小板、枯否细胞、破骨细胞、巨核细胞、粒细胞、NK细胞、内皮前体细胞或者祖细胞、祖细胞、CD34+细胞、Stro-1+细胞、Stro-3+细胞、CD29+细胞、CD166+细胞、Thy-1+或者⑶90+干细胞、⑶44+细胞、免疫细胞(诸如单核细胞、白细胞、淋巴细胞、BandT细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性白细胞、嗜中性粒细胞、中性粒细胞等等)。间质血管成分还包括本文中公开的表达任何标记物的细胞或者其任何组合。如本文中使用，术语“间质血管成分”包括在它的范围的术语，诸如“间充质血管成分”、“间充质成分”、“间质成分”、“前间充质成分”，“间充质如体”等等。
[0049]如本文中使用，术语“成人干细胞”是指未分化的细胞，胚胎发育之后在孩子和成人中的身体中发现的细胞，其划分为补充快死的细胞和更新损坏的组织。如本文中使用，术语“成人干细胞”不包括获得自胎儿或者胚胎的细胞。
[0050]如本文中使用，术语“分化的”是指细胞达到了成熟的终态，使得细胞发育完全并且证明生物学特殊化和/或适于特殊环境和/或功能。典型地，分化细胞的特征为基因的表达，该基因在该细胞中编码了分化相关的蛋白质。例如，在白细胞中的GALC的表达是晚期分化的白细胞的典型的例子。
[0051]如本文中使用，术语“间充质干细胞”是指间质或者间充质细胞或者早期间充质/间质前体细胞或者脂肪组织来源的间质细胞/干细胞，其为多能的并且能够作为各种不同细胞类型(诸如但不限于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉和神经元/神经胶质细胞谱系)的干细胞样的前体。间充质干细胞组成可来源于，例如，脂肪组织和骨髓的亚群。如本文中使用，术语“间充质干细胞”包括在它的范围术语，诸如“间质干细胞”、“骨髓间质细胞”、“多能间质细胞”、“间充质前体细胞”等等。
[0052]术语“前体细胞”、“祖细胞”和“干细胞”在本领域和本文中可互换地使用并且是指多能性、或者谱系未定型的，祖细胞，其潜在地有无限数的有丝分裂的能力以更新它本身或产生分化为所需的细胞类型的后代细胞。相对于多能性干细胞，谱系定型的祖细胞通常被认为没有引起很多彼此表现型不同的细胞类型的能力。反而，祖细胞产生一种或者也许两种谱系定型的细胞类型。
[0053]如本文中使用，术语“多能的”，“多潜能”或者“多潜能性”意指干细胞分化为多于一种细胞类型的干细胞的能力。
[0054]如本文中使用，术语“同种异体的”意指来源于同类的不同的哺乳动物的任何物质。
[0055]如本文中使用，术语“自体的”意指来源于个体和再引入至个体的任何物质。
[0056]除非上下文中明确要求其他，则整个说明书和权利要求书中词语“包括”、“包含”等等被解释为包括在内的意思，与排外或者穷举的意思相反，换句话说，是“包括，但不限于”的意思。
【附图说明】
[0057]图1:获得自超声空化处理的脂肪组织的细胞FACS分析-其中通过40克的通过超声空化分离的脂肪组织的荧光细胞核进行细胞计数。
[0058]图2:从超声空化处理的脂肪组织生长的细胞的吉姆萨染色的群体。
[0059]图3:从超声空化处理的脂肪组织生长的间充质干细胞的细胞培养。
【具体实施方式】
[0060]本发明基于脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者骨髓来源的细胞制品(其均含有成人干细胞)的注射降低偏头痛的频率和严重性的惊奇的发现。
[0061]脂肪组织可以通过脂肪抽吸外科手术、脂肪的吸出或者通过其他外科方法分离来获得。供体优选为将以间质血管成分或者间充质干细胞处理的同一患者或者与被处理的个体免疫一致的同种异体的供体。本领域的普通技术人员能够使用标准技术和指标容易识别配对的供体。
[0062]使用标准脂肪抽吸技术可以收获脂肪组织，且通过超声空化和/或酶处理和/或机械搅拌可以收获与脂肪组织分离的间质血管成分。
[0063]在一个实施例中，本发明的方法使用具有探针的超声空化装置，探针放置在与脂肪组织接触的位置，因此破除或者溶解在脂肪组织中的大部分脂肪细胞并且释放间质血管成分。使用特殊的超声空化装置对于本发明不是关键的。一个适合的选择是HIELSCHLER超声波处理器，其为技术上先进的高强度的超声波处理器。这个装置能够安全地处理从微升至升的宽量程的有机和无机物质。可以使用的其他装置包括Vibra-Cell?装置(Sonics)、VASER(SoltaMedical)或者 QSonica 超声波处理器。
[0064]在另一个实施例中，在生物溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液或者生理盐水溶液)中的脂肪组织可以放置于冷藏的环境中(组织/细胞不应低于2°C)。超声空化装置探针可以放置在脂肪组织中并且将振幅设置为约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约 80%，周期约 0.2、约 0.3、约 0.4、约 0.5、约 0.6、约 0.7、约 0.8、约 0.9，用约 10 秒、约20秒、约30秒、约40秒、约50秒、约60秒、约I分10秒、约I分20秒、约I分30秒、约I分40秒、约I分50秒、约2分、约3分、约4分、约5分、约6分、约7分、约8分、约9分、约10分。在操作期间可以将探针调节在管内的不同的位置。可以在室温下进行该过程并且调节振幅、周期和时间以防止脂肪组织的温度上升至大于约43°C至约45°C。超声空化的顺序和计时(具体地，振幅、周期和应用时间)可以变化，但是被确定至通过防止脂肪组织的温度上升至大于理想的37°C或者不超过约43°C至约45°C而确保在间质血管成分中干细胞的最佳的细胞数量和生存能力的程度。通过简单的试错法能够容易地确定这些参数。典型地，振幅为约50%，周期为约0.4至约0.5并且时间为约I分30秒。如果振幅增加，周期或者时间能够因而减少(或者反之亦然)以确保脂肪组织的温度不会上升至大于约43°C至约45°C。超声处理后，管中存在浓溶液(其不能被过滤或者容易分为间质血管成分)并可以用离心机分离该浓溶液。
[0065]离心作用导致3层-上部脂质层、含有细胞外基质和间质血管细胞的中间浮动层、以及底部流体层。必须去除并且排出上部脂质层，并且将管中剩下的内含物充分混合以分离细胞外基质并加入0.9%生理盐水。进一步的离心作用引起细胞和细胞外基质沉降和在底部沉淀-沉淀物含有细胞外基质和包括可存活的和功能的干细胞(包括间充质干细胞)的间质血管成分。可以过滤沉淀物以去除任何大的碎片。
[0066]在另一个实施例中，本发明涉及从脂肪组织回收间质血管成分或者间质细胞，该方法包括用超声空化处理脂肪组织一段时间，振幅和周期，维持间质血管成分中的成人干细胞的生存能力。
[0067]在另一个实施例中，用振幅设置为约20%至约75%并且周期设置为约0.2至约0.9的超声波装置，将脂肪组织用超声空化处理约10秒至约10分钟。
[0068]在另一个实施例中，脂肪组织的温度不超过约43 °C。
[0069]在另一个实施例中，本发明的方法使用酶，诸如胶原酶，并且搅拌以产生脂肪来源的细胞悬液，将细胞悬液使用离心机分离并洗涤以分离间质血管成分或者间质细胞。
[0070]在另一个实施例中，本发明的方法使用卵磷脂，并搅拌以生产脂肪来源的细胞悬液，将细胞悬液使用离心机分离并洗涤以分离间质血管成分或者间质细胞。
[0071]可以通过传统的给药途径，诸如静脉注射，将脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人干细胞直接注入于需要其的受试者中，或者在给药之前能够进一步地处理脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人干细胞以纯化(以及如果需要，在培养物中扩增)所需的细胞类型，诸如间充质干细胞、STRO-1+细胞、STRO-3+细胞、脂肪来源的间质干细胞、间充质前体细胞或者Muse-AT细胞。
[0072]在一些实施例中，能够从脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者骨髓来源的细胞制品通过使用独特的细胞表面抗原和用于体外扩增的荧光激活细胞分选术(FACS)的分级分离来分离、纯化或者浓缩出间充质干细胞。
[0073]在其他实施例中，可以在给药之前培养、扩增和/或分化脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人干细胞。
[0074]在其他实施例中，可 以储存脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人干细胞用于以后的植入/注入。在细胞库中的适度至长期的储存也在本发明的范围内。
[0075]在处理的最后，可以将脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人干细胞装在通过皮下、关节内、静脉内、肌肉内、或者腹膜内技术给药至受体的递送装置，诸如注射器或者静脉注射袋。换句话说，通过本领域的普通技术人员所知的任何方式将细胞放入至患者内，例如，细胞可以注射在血管内用于全身性或者局部递送，注射在组织(例如，心肌、或者骨骼肌)内，注射在关节(关节内的)内，注射在真皮(皮下的)内，注射在组织间隙(例如，心包或者腹膜)内，或者注射在组织(例如，尿道周位置)内，或者其他位置。优选的实施例包括通过针或者导管放入，或者与添加剂(诸如预制成的基质或者脂肪来源的或者间质来源的细胞外基质)结合的直接的外科植入放入。
[0076]脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞、骨髓来源的细胞制品或者成人干细胞可以单独或者与其他细胞、组织、组织片段、去矿物质骨、生长因子(诸如胰岛素)或者药物(诸如噻格列酮(thiaglitazone)族的成员)、生物活性的或者惰性的化合物、可吸收性塑料支架、脂肪来源的或者间质来源的格子和/或细胞外基质或者其他用于提高细胞群的递送、效能、耐受性、或者功能的添加剂组合应用。在本发明的某些实施例中，将细胞给药至具有一种或者多种的细胞分化因子(诸如细胞因子类和生长因子)的患者。在其他实施例中，用富含血小板的血浆或者富含生长因子的血浆处理细胞。
[0077]现在将参考描述了具体的组合物和使用方法的具体的但非限制性的示例来更详细地描述本发明。然而，应理解的是，包括具体的过程、组合物和方法的详细描述，仅仅用于举例说明本发明的目的。其不应该理解为，以任何方式对如以上陈述的本发明构思的广泛的描述的限制。
[0078]示例
[0079]示例1-通过脂肪抽吸制备脂肪组织
[0080]将过量的肿胀溶液(I升的生理盐水中，含有Img肾上腺素，800mg利多卡因和1mL的8.4%碳酸氢钠溶液，该肿胀溶液超过在脂肪抽吸操作之前待吸出的脂肪抽吸的量)注入至皮下脂肪层(肿胀方法)内，然后使用具有例如2-3_内径的套管(由金属制成，带抽吸器)用于脂肪抽吸操作。脂肪抽吸操作在本领域中是众所周知的，并且例如，能够参考 BUNK0D0，第 429-469 页出版的 Biyo Seikei Shujutsu Practice 2 (CosmeticOperat1n Practice2)，编辑 Masanari ICHIDA、Ryusaburo TANINO 和 Yoshiaki HOSAKA,其通过参考全部合并到本文中。
[0081]用盐水洗涤吸出的脂肪。可以产生约50ml至1L的洗涤吸出物，并且得到的脂肪组织来源的细胞物质用于获得间质血管成分。
[0082]示例2-通过外科手术制备脂肪组织
[0083]通过外科手术，从给予了他们的知情同意的人受试者中获得脂肪组织。用本领域熟知的技术进行分离。简单地，从给予了他们的知情同意的人受试者抽出的脂肪组织中无菌分离人脂肪组织。得到的脂肪组织来源的细胞物质用于获得间质血管成分。
[0084]示例3-富含血小板的血浆和富含生长因子的血浆的制备
[0085]I)麻醉之前采集血液。用2x9mL柠檬酸葡萄糖(AOT-A)填充血液采集管(BDvacutainer)(真空压力)。使用18G或者更大的针抽血液以避免通过剪切激活血小板。通过将管换向3-4次混合血液管的内含物。
[0086]2) 450gxl0min离心ACD-A血液填充的管。
[0087]3)用相同的移液管从每个管去除血浆层(上部层)并且将血浆层放置在15ml的灭菌管中。血液不应受到干扰并且应消除静止在血液上的白细胞薄层。在红血细胞上最好留下5mm血浆层。含有富集血小板的血浆(PRP)可以按原样使用或者进行如下进一步处理。
[0088]4)2000g/10min离心含有血浆的管-在管的底部应形成血小板的小的沉淀物。
[0089]5)用移液管将上部贫血小板的血浆移除至1.5ml并排出。应使用同一移液管在剩下的1.5ml中再悬浮沉淀物。这是富含血小板的血浆(PRP)。
[0090]6)可以按原样使用PRP，或者如果需要，PRP与加入至PRP的150 μ I的葡萄糖酸钙(ImL注射器和针)粘在一起并充分混合。应将管放置在水浴中(37°C -不摇动)或者留在室温更长时间段。PRP会形成固体凝胶。
[0091]7)固化之后，可以将PRP留在37°C (以加快过程)或者室温以在接下来的1_2小时部分地溶解-这被称作富含生长因子的血浆(PRGF)。
[0092]示例4 -通过胶原酶和/或卵磷脂治疗制备脂肪组织的间质血管成分
[0093]I)使用3mm套管和改性克莱因溶液(在I升生理盐水中含有，Img肾上腺素，400mg至800mg利多卡因和1mL的8.4%碳酸氢钠溶液)，从患者的腹部获得50_1000mL之间的脂肪抽吸物。脂肪抽吸物用生理盐水漂洗并放置在500mL的离心机的罐中。
[0094]2)加入胶原酶(Serva)以获得0.05 %的最终浓度(通过0.22 μ m消毒滤纸消毒的过滤法)和/或卵磷脂10% (Adistem)。
[0095]3)样品在水浴(37°C )中在37°C下培养30_90分钟，并轻轻搅动。在培养期间每15分钟将样品用手轻轻倒转。
[0096]4)培养以后将样品在500g下离心5min。离心之后出现三层。上部黄色/澄清层(脂质层)。白色纤维性中间层，和红色/白色底层，其在管的底部具有细胞沉淀物。
[0097]5)通过用混合套管和注射器抽沉淀物而从罐移除细胞沉淀物。
[0098]6)将细胞沉淀物排出至50mL离心管并加入PBS至40mL。使用真空泵通过100 μ mSteriflip (Millipore)将管内含物无菌过滤至50mL管。
[0099]7)将滤液在500g下离心5分钟。
[0100]8)不干扰沉淀物情况下将上清液移除并将所有细胞沉淀物组合在一个离心管中。将得到的沉淀物再悬浮并加入40mL PBSo
[0101]9)将细胞悬液在500g下离心5分钟并将上清液移除。
[0102]10)加入 20mL PBS 并通过 60μηι Steriflip (Millipore)过滤细胞悬液。
[0103]11)将滤液在500g下离心5分钟并将上清液移除。将样品移除用于细胞计数(将充分混合的50 μ I的细胞样品加入至0.4%的锥虫蓝，混合并在将样品放置在血球计数器的腔内之前允许静置1-2分钟。通过在格子区域中计算至少100个细胞确定细胞数和生存能力。通过锥虫蓝的排斥确定可存活的细胞)。
[0104]12)可以加入5-10mL PRP或者PRGF，或者生理盐水。
[0105]13)将样品抽入至注射器内并注射入至I升生理盐水静脉注射袋，用于注入患者。
[0106]示例5-通过超声空化制备脂肪组织的间质血管成分
[0107]I)将如示例I或者2中描述的来源于脂肪抽吸吸出物或者用外科手术方法获得的脂肪组织放置在合适的管和生物溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液或者生理盐水溶液)中。
[0108]2)通过注射器末端的引流来去除过量的流体，或者将管在200g下离心2分钟以分离出过量的流体和脂肪组织。将在管的底部的过量的流体去除。
[0109]3)(任选的)将管放置在冷藏的环境中并注意确保组织/细胞的温度不降到低于2。。。
[0110]4)将超声空化装置探针放置于脂肪组织并将振幅设置在50%，周期为0.4至0.5。在管的一个或者两个不同位置(即，管的底部和上部)升降探针I分钟，然后约30-40秒。3分钟后任选地重复该过程。
[0111]5)注意确保使脂肪组织温度不要上升至大于理想的37°C或者最多不超过约43。。。
[0112]6)超声处理之后，在管内观察到浓溶液并在800g下离心浓溶液5min。
[0113]7)离心之后有3层-上部脂质层、含有细胞外基质和间质血管细胞的中间浮动层、以及底部流体层。
[0114]8)上部脂质层使用混合套管和注射器移除和排出，并将管的剩下的内含物充分混合以进一步破裂细胞外基质。
[0115]9)将等渗溶液(生理盐水)加入到管至45ml并将管在800g下离心5min，引发细胞和细胞外基质在底部沉降和沉淀。
[0116]10)在管的底部观察到大的沉淀物，大的沉淀物含有细胞外基质和包括可存活的和功能的干细胞的间质血管成分。然后使用混合套管和注射器移除沉淀物，并通过100 μπι滤纸过滤沉淀物以去除任何大的碎片。
[0117]11)将样品移开用于细胞计数-典型的，使用这个方法的、来源于20g的脂肪组织的细胞数在约40至约200x106之间，即，约2至约10x106/克，其大于来自典型地导致约0.5x106/克的脂肪组织的胶原酶分离的细胞数。
[0118]12)可以在注射之前或者在注射时将PRP、PRGF或者其他细胞生长因子/细胞因子类加入细 胞沉淀物。
[0119]13)将样品抽到注射器内并注射到患者的关节内、肌内、或者腹膜内或者到用于注入的I升生理盐水静脉注射袋内。
[0120]细胞沉淀物的分析显示能够在培养物中生长(见示例7和图2)并含有间充质干细胞(图3)的可存活的细胞(图1)的存在。
[0121]示例6-骨髓的制备
[0122]从胸骨、后面的髂骨、或者前面的髂骨提取骨髓。用聚维酮碘溶液准备位点并在皮肤下面进行局部麻醉。使用较长的针以识别髂嵴的中点并且在骨膜下面沉积3_4mL 2%利多卡因。将“J”针插入于前面的/后面的髂骨翼内。将针轻轻地旋转进入至骨髓腔的Icm处。从针和附加的5-cc注射器移开通管丝。通过注射器活塞的缩回吸出骨髓。采集了2-3mL的骨髓之后，如果想获得更多的骨髓，则能够改变针的位置。
[0123]将通过灌流或吸出方法收获的骨髓细胞离心并悬浮在15mL的PBS中。将骨髓细胞放置在15mL的(1.077g/mL)稠密溶液(淋巴细胞分离剂(Lymphoprep))中。在室温下在2，OOOrpm下离心30分钟后，从界面处的确定层采集骨髓细胞。
[0124]示例7-制备扩增的间充质干细胞
[0125]能够通过任何适合的方法从脂肪组织获得成人干细胞，并且使用标准细胞培养基(例如，10%胎牛血清或者人血清补充的alphaMEM (Gibco)、或者无血清培养基(Gibco))没有分化地培养成人干细胞。将初级培养物以Ix 106/100_接种至平板。优选地细胞被扩增为1-2传代，但可以在5% CO2或者低氧环境下传代高达7倍。如果需要，这种细胞可以同种细胞地传代。将分离的、自体的或者同种异体的细胞培养至适合的点，通常为2传代，通过标准方法评估生存能力和产率。通过阳性干细胞标记物⑶29+、⑶44+、⑶90+、⑶105+进行扩增的细胞的标准试验。分离的细胞能够被分化为软骨、骨头和脂肪细胞-证明它们的分化为不同组织细胞的潜在性。关于良好的医疗实践过程，除了对肝炎、HIV和密螺旋体属的标准血清学试验，还有对用于细菌和真菌的16s亚基的PCR试验，用于支原体属、杂质和细胞生存能力的4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚染色，以及低温保存之前微观形态的评估。可以在应用之前执行上述提到的PCR试验和用鲎变形细胞溶解物试验法(LAL)对内毒素类/热原的试验。
[0126]示例8-将脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞给药至具有偏头痛病史的患者
[0127]患者I
[0128]该患者具有长期的满足头痛症第2版第I次修订1.5.1慢性偏头痛(HeadacheDisorders2nd Edit1n 1st Revis1n 1.5.1Chronic Migraine)的国际分类的偏头痛和头痛的病史，即，患者典型地遭受多于20天/月的偏头痛。混合的紧张和偏头痛不存在病兆。
[0129]将根据示例5(外加PRGF)制备的脂肪组织来源的间质血管成分(来自700mL脂肪组织的5.46亿个细胞)单次静脉内给药之后，I个月之后患者仅头痛一次。
[0130]患者2
[0131]该患者具有长期的满足头痛症第2版第I次修订1.5.1慢性偏头痛的国际分类的偏头痛/头痛的病史，即，患者典型地遭受多于20天/月的偏头痛。患者消耗吗啡片、扑热息痛和磷酸可待因(每天高达8片)、或者盐酸羟考酮。
[0132]将根据示例4(胶原酶)制备的脂肪组织来源的间质血管成分(来自1，005mL脂肪组织的4.95亿个细胞)单次静脉内给药之后，在5个月期间，患者记录了 I次偏头痛和一些不严重的头痛。治疗3天后通知结果并停了吗啡片。5个月之后复发不严重的头痛，并在7个月时用根据示例4制备的6.38亿个细胞重新由静脉内治疗患者。从第一天看到改善。扑热息痛剂量降低至每周一次。在18个月里仅经历了偏头痛7次和一些正常头痛。
[0133]患者3
[0134]该患者具有长期的满足头痛症第2版第I次修订1.2.1偏头痛的典型病兆和 2.2 频繁间断性的紧张型头痛(headache Disorders 2nd Edit1n 1st revis1n1.2.1Typical Aura with Migraine headache and 2.2Frequent episodic tens1n-typeheadache)的国际分类的偏头痛和紧张性头痛的病史。该患者具有终身的头痛病史，典型地，伴随典型病兆的每天2次的偏头痛和频繁间断性的紧张型头痛。
[0135]将根据示例4 (胶原酶和卵磷脂)和示例5 (外加PRGF)制备的脂肪组织来源的间质血管成分(29.3亿个细胞)单次静脉内给药。
[0136]治疗3天后通知结果。在I个月停止了所有头痛药。在3个月里紧张性头痛仅有I次。在4个月期间偶有轻的紧张性头痛。
[0137]患者4
[0138]该患者具有长期的满足头痛症第2版第I次修订1.5.1慢性的偏头痛的国际分类的偏头痛和头痛，即，患者典型地遭受多于20天/月的偏头痛。
[0139]将根据示例5制备的脂肪组织来源的间质血管成分(4千I百万细胞)单次静脉内给药之后，过去的12月里患者重头痛仅有2次，约2个月之前相隔3周(没有偏头痛严重，但具有与偏头痛一致的坏窦)。去年没有偏头痛。过去需要医生家访注射以减轻疼痛。患者现在仅仅偶尔服扑热息痛。
【主权项】
1.一种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将组合物给药至所述受试者，所述组合物包含: 脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞；或者 骨髓来源的细胞制品。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者所述骨髓来源的细胞制品包含成人干细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述成人干细胞为间充质干细胞和/或早期间充质/间质前体细胞，和/或脂肪组织来源的间质细胞/干细胞。4.一种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含成人干细胞的组合物给药至所述受试者。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述成人干细胞为间充质干细胞和/或早期间充质/间质前体细胞和/或脂肪组织来源的间质细胞/干细胞。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述间充质干细胞和/或早期间充质/间质前体细胞获得自脂肪组织、骨髓或者血液。7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述成人干细胞已被扩增和/或培养。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述头痛选自由偏头痛、紧张性头痛、三叉神经痛、丛集性头痛和头痛所组成的组。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织或者骨髓为自体的。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织或者骨髓为同种异体的。11.根据权利要求4所述的方法，其中所述成人干细胞为自体的。12.根据权利要求4所述的方法，其中所述成人干细胞为同种异体的。13.根据权利要求1所述的方法，其中用酶和/或离解试剂处理所述脂肪组织。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶为胶原酶并且所述离解试剂为卵磷脂。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织经受超声空化。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述超声空化溶解脂肪细胞。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织经受机械搅拌。18.根据权利要求1所述的方法，其中用富含血小板的血浆或者富含生长因子的血浆处理所述脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者所述骨髓来源的细胞制品。19.根据权利要求4所述的方法，其中用富含血小板的血浆或者富含生长因子的血浆处理所述成人干细胞。20.根据权利要求1所述的方法，其中将所述脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞或者所述骨髓来源的细胞制品通过静脉给药至所述受试者。21.根据权利要求4所述的方法，其中所述成人干细胞通过静脉给药。22.—种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含从脐带(沃顿胶)、脐带血或者胎盘获得的干细胞的组合物给药至所述受试者。23.—种降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含脂肪组织来源的和/或间质来源的细胞外基质的组合物给药至所述受试者。
【专利摘要】在一个实施例中，本发明涉及一种用于降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含脂肪组织的间质血管成分或者间质细胞的组合物给药至受试者。在另一个实施例中，本发明涉及一种用于降低受试者头痛的频率和/或严重性的方法，包括将包含将骨髓的组合物给药至受试者。在另一个实施例中，本发明涉及一种用于降低受试者头痛的频率或者严重性的方法，包括将包含成人干细胞的组合物给药至受试者。
【IPC分类】A61K35/28, C12N5/077, C12N5/0775, A61K35/44, A61P25/06, A61K35/51, A61K35/35
【公开号】CN104902909
【申请号】CN201380044736
【发明人】拉尔夫·布莱特, 佩林·布莱特, 布鲁斯·汉森, 韦恩·托马斯
【申请人】拉斯提地产控股企业有限公司, 安柏定企业有限公司, 他唯帝企业有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年6月26日
【公告号】CA2877022A1, EP2863927A1, EP2863927A4, US20150174172, WO2014000029A1
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