高纯度和优异产量的正确折叠的依那西普的制作方法
高纯度和优异产量的正确折叠的依那西普的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明通常涉及用于纯化重组表达的蛋白质的层析分离方法，和从该方法得到的 产物。更具体地，本发明涉及使用混合模式的层析法以纯化重组蛋白表达产物，包括，例如， 可能包括不期望量的非正确折叠的和/或聚集的蛋白质和适当折叠的蛋白质的融合蛋白。 本发明的混合模式层析方法特别有用于从不正确折叠的依那西普（如本文所定义的）中分 离正确折叠的依那西普。本发明也涉及依那西普制备物和药物制剂，其中已使用本公开的 方法高产率和高纯度地制备供应其中的依那西普。本发明进一步涉及采用高纯度的以非常 低水平的错误折叠的/聚集的蛋白质为特征的依那西普治疗TNF病况的方法。
【背景技术】
[0002] 依那西普（Enbrel?，Immunex Corporation制造）是由与人类免疫球蛋白 G( "IgGl"）的Fc受体[片段，可结晶的]区域连接的人类75千道尔顿（p75)肿瘤坏死因 子受体（"TNFR"）的细胞外配体结合部分组成的二聚融合多肽。依那西普由934个氨基 酸组成并具有约150千道尔顿的表观分子量（Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company, Inc.)。依那西普的Fe成分包含重链恒定结构域2 (CH2)、重链恒定结 构域3 (CH3)和铰链区，但不包括人类IgGl的重链恒定结构域I (CHl)。一个Fc域可包括一 个或所有的上述域。
[0003] 患有一些类型的炎性疾病例如风湿性关节炎、斑块状银肩病、银肩病关节炎、幼年 特发性关节炎和强直性脊柱炎的人具有过度产生肿瘤坏死因子（"TNF"）的免疫系统。已 发现施用依那西普对治疗一些炎性疾病是有效的，因为它可通过作为诱饵受体结合TNF而 降低受试者中活化型TNF的水平。
[0004] 可通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢（"CH0"）的哺乳动物细胞表达系统中以已 知的方式产生依那西普。不幸的是，由CHO细胞产生的产物包含大量的不正确或错误折叠 和/或聚集的依那西普。对于药物应用，需要提供相对没有不正确折叠的和聚集的蛋白质 的依那西普，因为所述不正确折叠的/聚集的蛋白质将不具有与正确折叠的蛋白质相同的 治疗效果，且可能实际上对患者是有害的。
[0005] 错误折叠和聚集经常发生在产生重组蛋白的过程中，并因此必须通过能够从错误 折叠或聚集的蛋白质中分离正确折叠的蛋白质的下游过程进行处理。错误折叠减少或消除 蛋白质的治疗效果。通常被理解为涉及两种或更多种依那西普同源二聚体的非共价联合以 形成非常高分子量物种的聚集导致相似的治疗效果的损失，且当蛋白质（包括错误折叠的 蛋白质）积累并聚在一起时，聚集发生。如上所述，这样的错误折叠的蛋白质和蛋白质聚集 体不仅是治疗无效的，也可能是对患者有害的。相应地，纯化含依那西普的蛋白质表达产物 以使适当折叠的依那西普从错误和/或积聚的依那西普中分离的能力对于得到提供最高 可能程度的药物可接受性的依那西普是重要的。
[0006] 错误折叠和聚集的蛋白质的产生不是特定于依那西普的问题。具有许多治疗性蛋 白质，对其来说错误折叠可能是一个问题。例如，在来自大肠杆菌包涵体的重组蛋白重折叠 的过程中，含二硫化物的蛋白质的错误折叠是难以避免的，但其可通过高分辨率的反相色 谱法而被有效分离。然而，在反相色谱法中低pH和有机溶剂的使用在色谱分析过程中可使 蛋白质变性并可能引起纯化的蛋白质的聚集。
[0007]即使当错误折叠被认为在制备药物蛋白质中是可忽略的时，例如在哺乳 动物分泌性表达的情况下，仍可能发生聚集和一些错误折叠（参见，例如，Chi，E. Y.,Krishnan,S. , Randolph, T. W. and Carpenter, J. F. , Physical Stability of Proteins in Aqueous Solution:Mechanism and Driving Forces in Nonnative Protein Aggregation,Pharm.Res.,20, 1325-1336 (2003) ；Kiese,S.,Pappenber ger,A.,Friess, W. , and Mahler,H. C. , Shaken, Not Stirred:Mechanical Stress Testing of an IgGlAntibodyj J. Pharm. Sci. , 97, 4347-4366 (2008)) 〇 研究者已 在非变性条件下成功分离出非原生的、错误折叠的蛋白质，所述分离使用利用离子 交换的水性色谱分析法（"IEC"）（参见，例如，Gagnon，P. J.，Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography in the Presence of Polyethylene Glycol，Immunol. Methods，336, 222-228 (2008) ;Gagnon，P.，Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems，Tucson，AZ，57-87(1996) ；Shukla,A. A. , and Yigzaw, Y. , Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry,Shukla,A.,Etzel,M., and Gadam，S.，eds.，179-227, CRC Press, Boca Raton (2007) ；Staby, A. , Jacobsen, J. H. , Hansen, R. G. , Bruus, U. K. , Jensen, I. H., Comparison of Chromatographic Ion-exchange Resins. V. Strong and Weak Cation-Exchange Resins,J.Chromatogr. A, 1118, 168-179(2006) ；ShukIa,A. A. , Hub bard,B. ,Tressel,T. ,Guhan, S. , Low, D. J. , Downstream Processing of Monoclonal Antibodies-Application of Platform Approaches，Chromatogr. B，848,28-39 (2007)； Shihara,T.,Kadoya, T. J. , Accelerated Purification Process Development of Monoclonal Antibodies for Shortening Time to Clinic:Design and Case Study of Chromatography Processes，Chromatogr.A，1176，149-156 (2007) ；Fahrner,R. L. , Knudsen, H. L. , Basey, C. D. , Galan, W. , Feuerhelm, D. , Vanderlaan, M. , Blank, G. S., Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies:Development,Ope ration,and Validation of Chromatography Processes, Biotechnol. Genet. Eng. Rev.，18, 301-27 (2001);和 Yigzaw，Y.，Hinckley，P.，Hewig，A. and Vedantham，G.，Ion Exchange Chromatography of Proteins and Clearance of Aggregates, Curr. Pharm. Biotech.，10, 421-426 (2009))、利用疏水相互作用的水性色谱分析法（"HIC"）（参见， 例 如，Chen，J.，Tetrault，J.，Ley，A.，Comparison of Standard and New Generation Hydrophobic Interaction Chromatography Resins in the Monoclonal Antibody Purification Process,J.Chromatogr.A., 1177,272-81 (2008) ;Gagnon，P.，and Grund，E.，Large Scale Process Development for Hydrophobic Interaction Chromatography, Part 4:Controlling Selectivity,BioPharmj 9, 54-64(1996)； 和 Lu,Y. , Williamson, B. , and Gillespie, R. , Recent Advancement in Application of Hydrophobic Interaction Chromatography for Aggregate Removal in Industrial Purification Process，Curr. Pharm. Biotech.，10, 427-33(2009))和羟基磷灰石（"HA"） 色谱分析法（参见，例如Aoyama，K.，Chiba，J.，Separation of Molecular Forms of Mouse IgG and IgM Monoclonal Antibodies in High Performance Liquid Chromatography on Spherical Hydroxyapatite Beads,J. Immunol. Methods, 162, 201-210 (1993)； Luellau,E. ,Marison, W. , von Stockar，IL，Ceramic Hydroxapatite: A New Tool for Separation and Analysis of IgA Monocolonal Antibodies, in Animal Cell Techn ology, Carondo, M. , ed. ,Kluwer Academic Publishers, Netherlands,265-269 (1997)； Luellau,E., von Stockar, U. , Vogt, S. , Freitag, R. , Development of a Downstream Process for the Isolation and Separation of Monoclonal Immunoglobulin A Monomer, Dimers, and Polymers from Cell Culture Supernatant, J. Chomatogr. A.，796，165-175 (1998) ;Yamakawa，Y.，Chiba，J.，High Performance Liquid Chromatography of Mouse Monoclonal Antibodies on Spherical Hydroxyapatite Beads, J. Liquid. Chromatogr. , 11, 665-681 (1998) ；Coppola, G. , Underwood, J. , Cartwrigh t, G. , Hearn, M. T. , High-performance Liquid Chromatography of Amino Acids，Peptides and Proteins:XCIII. Comparison of Methods for the Purification of Mouse Monoclonal Immunoglobulin M Autoantibodies,J. Chromatogr. A. , 476, 269-290(1989)； Josics, D. , Loster, K. , Kuhlj R. , Noll, F. , Reusch, J. , Purification of Monoclonal Antibodies by Hydroxylapatite HPLC and Size Exclusion HPLCj Biol.Chem. Hoppe-Seylars，372，149-156 (1991) ;Gagnon，P.，and Beam,K. , Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography，Curr. Pharm. Biotech. (2008))〇 [0008] 现有教导例如上述引用的这些还未证实对于从不正确折叠的依那西普中分离正 确折叠的依那西普的应用是有用的，因为它们不能提供定性和/或定量充足的样品。相应 地，在本领域中需要有效和高效的分离技术，以与能够提供非常高纯度（即，不正确折叠的 依那西普不存在或以非常低的水平存在）和在商业上有吸引力的产量的依那西普制备物 的、CHO细胞产生的依那西普联用。
[0009] 本发明采用号称的"混合模式"色谱分析法。当采用至少两种不同的力以结合蛋 白质时，用于纯化重组表达的蛋白质的色谱分析法可通常被称为"混合模式"，并可从不需 要的物质中分离所需的蛋白质产物，所述不需要的物质可存在于含所需蛋白质和不需要的 杂质的相对不纯的表达产物中。这些力可包括，例如，静电力和疏水力。
[0010] 混合模式色谱分析法以与更加传统的色谱分析技术相似的方式运作，因为具有固 定相和流动相。所述固定相通常为不溶性树脂或凝胶，通常被称为色谱树脂，其提供分离的 基础。所述树脂包含在允许液体通过并接触所述树脂的柱中。与树脂连接的选择的化学基 团或结构部分（moiety)的存在使所述色谱树脂从不需要的物质中分离所需物质的能力成 为可能。这些连接的基团，通常称为配体，赋予树脂必要的亲和性质（即，由配体中存在的 离子交换结构部分产生的静电吸引性质，和由配体中存在的疏水结构部分产生的疏水引力 性质），从而使所述树脂能够结合不纯样品中的一些蛋白质材料，而不是其它材料，当允许 含所述不纯样品的溶液流经所述色谱柱与所述树脂接触时。
[0011] 包含具有这些亲和基团的树脂的色谱柱的固定相塞满所述色谱柱的内部，所述色 谱柱通常是一个刚性圆柱体容器，流体可在一端被引入其中，接触所述树脂，然后在另一端 离开所述柱。通过将蛋白质产物放入适当的溶液中并允许所述溶液（称为流动相）经过所 述柱，可将含将被纯化的蛋白质的溶液引入（并因此允许其流过）所述柱。当将被纯化的 蛋白质产物（称为分析物）以流动相存在于柱中中时，在所述柱和所述流动相间达到平衡 状态，意味着蛋白质溶液中的一些物质将依附、结合或粘贴或被亲合基团捕捉到所述柱树 脂上，而所述产物中剩余的物质将不附在所述柱上，而是将流过并流出所述柱，在那儿其可 被收集用于分析、进一步加工，或其可被排放。
[0012] 一旦蛋白质分析物已以上述的方式结合到所述柱上，将使用洗涤步骤（通常称为 洗脱步骤）以从所述柱上洗脱或释放所结合的分析物。根据存在于树脂上以使分析物和所 述柱结合的亲和配体的类型（例如，基于电荷的结构部分或疏水部分，或它们的组合，等）， 用于从所述柱上洗脱或释放分析物的溶液必须对分析物和/或配体具有可克服分析物对 所述树脂的亲和力或吸引力的亲和力或吸引力（例如电荷性质、疏水性质、pH特性、盐浓度 等），从而使所述分析物从所述树脂（上述提到的固定相）上释放并进入洗脱介质（流动 相）。一旦被释放或洗脱至流动相，然后所述分析物可流过并流出所述色谱柱用于最后的收 集、分析等，或转移到进一步纯化的方法或过滤步骤。可理解的是，无论吸引性能或亲和性 能引起分析物结合至色谱树脂上（例如，电荷性能或疏水性能），后续用于洗脱或释放所述 分析物的流动相溶液都必须具有相互矛盾的一套性质以使所述分析物然后"优选"存在于 所述洗脱介质中而不是保持被捕获在所述柱树脂上。
[0013] 与其它单模式色谱分析技术相比，所谓的混合模式色谱分析法独特之处在于多种 结合和洗脱因素可相互依赖并可彼此相对。例如，当分析物的带电特性相对于所述柱树脂 的吸引力具有更强的对于洗脱介质的吸引力（倾向）时，在传统单一模式的离子交换色谱 分析法中，增加流动相的离子强度可引起树脂结合的分析物的洗脱或释放。然而，在混合 模式的色谱分析方法中，其中色谱树脂使用静电引力和疏水引力以结合分析物，增加流动 (洗脱）相的离子强度可引起样品物质从所述柱中释放，这是基于所述物质的电荷性质，同 时引起或增强分析物中疏水物质的结合，因为这样的疏水蛋白物质一在基于电荷的洗脱介 质存在下一相对于所述洗脱介质的带电环境，将倾向于具有更强的吸引力或优选以与所述 柱的疏水配体结合。相应地，虽然盐浓度的增加可确实引起从固定相置换带电蛋白物质的 倾向，当流动相中的带电离子与蛋白质竞争固定相上的结合位点时一然而，可能具有更高 程度的疏水性能的分析物产物混合物的那些部分可具有增强的保持与所述混合模式的色 谱柱的疏水结构部分结合的倾向。在任何给定的蛋白质分离情况下，利用这些现象的能力 几乎不能被认为是可预测的。
[0014] 混合模式树脂的两个实例为Capto? MMC和Capto? Adhere (可购自 GEHealthcare) oCapto? MMC利用附着于固体支撑基质的配体，其可通过阳离子交换（使用 它的羧基基团）、氢键结合和疏水作用与分析物相互作用。Capto? MMC的配体示例如下：
[0015]
[0016] Capto? Adhere与Capto? MMC相似之处在于它也米用附着于固体支撑基质的配 体。所述配体，N-苄基-N-甲基乙醇胺，也通过阴离子交换、氢键结合和疏水作用与分析物 相互作用。Capto? Adhere配体示例如下：
[0018] 在这两个配体中，疏水作用预期是弱的。因此，如果这些配体仅具有疏水结构部分 (没有电荷），那么它们将最可能需要盐析（蛋白质沉淀）条件用于蛋白质结合。然而，具 有静电作用可使如此弱的疏水作用足以提供额外的结合力。
【发明内容】
[0019] 本发明的前提是根据如下事实：可使用混合模式色谱分析法，例如使用Capto? MMC和Capto? Adhere作为混合模式色谱树脂，以纯化含正确折叠和不正确折叠蛋白质的 混合物的分析物，包括，例如，含正确折叠和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物，借此 正确折叠的蛋白质可以高效的方式和优异的产量从不正确或错误折叠的蛋白质中有效分 离，以得到高度富集所需的、正确折叠的蛋白质的蛋白质制备物。此外，本发明包含实践本 文描述的混合模式的色谱分离的能力，所述实践以使从所述色谱分离中得到可不含或基本 不含错误折叠产物（如果需要的话）的洗脱产物的方式进行，虽然可以理解，为了平衡产量 和纯度的目的，可能发现包括非常低水平的不正确折叠的产物（例如，少于5wt%并优选少 于3wt% )是可接受的以使产量最大化至所需的范围。
[0020] 相应地，在第一实施方案中，本发明是用于从不正确折叠的蛋白质中分离正确折 叠的蛋白质的混合模式色谱法，其包含以下步骤：(a)将同时含给定蛋白的正确折叠和不 正确折叠构象的第一蛋白混合物与同时具有离子交换结构部分和疏水结构部分的混合模 式色谱树脂结合；(b)从混合模式树脂上洗脱正确折叠的蛋白质以得到第二蛋白混合物， 所述第二蛋白混合物包含比所述第一蛋白混合物更高比例的正确折叠蛋白。术语"更高比 例"指在步骤（b)的洗脱液中正确与不正确折叠蛋白的比例至少高于1:1，但最优选高于 约8:2并优选高于约9:1。所述第二蛋白混合物最优选以构成第二蛋白混合物的至少约 95wt %的量包含正确折叠的蛋白。
[0021] 在第二实施方案中，所述方法涉及用于纯化蛋白质混合物以从存在于所述混合物 中的不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的混合模式色谱法，所述方法包括 以下步骤：(a)使具有疏水结构部分和离子交换结构部分的混合模式的色谱树脂与含包含 正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的溶液接触，以使正确和不 正确折叠的依那西普粘附、结合或捕获在所述混合模式的色谱树脂上；和（b)使所述混合 模式的树脂与能够从所述混合模式的色谱树脂上洗脱依那西普蛋白质的溶液接触以得到 洗脱液，在该洗脱液中，正确折叠的依那西普的量与不正确折叠的依那西普的量的比率较 高，并优选比在步骤（a)中引入所述树脂的蛋白质混合物中的比率要高很多。
[0022] 第三实施方案中，本发明涉及一种含依那西普的蛋白质混合物，或含所述混合物 的药学上可接受的制剂，其是根据上述方法的实施方案得到且其中所述蛋白质混合物以构 成大于约90wt%的蛋白质混合物的量包含不正确折叠的依那西普；并以构成少于约5wt% 的蛋白质混合物的量包含不正确折叠的依那西普；且其中所述蛋白质混合物具有构成至少 约95wt. %并优选至少约98wt. %的含依那西普的蛋白质混合物的正确折叠和不正确折叠 的依那西普的组合量。可使用疏水作用色谱（单模式）确定正确折叠和不正确折叠的依那 西普的量。可使用尺寸排阻色谱（"SEC"）确定正确折叠和不正确折叠的依那西普的组合 量。如本文所用，术语"依那西普基蛋白质混合物"或"含依那西普的蛋白质混合物"或"依 那西普制备物"或"依那西普基物质"等，应理解为同义词且意在表示这样的一种蛋白质混 合物，其中主要成分包含正确折叠的依那西普且次要成分可包含截短的（clipped)依那西 普、不正确折叠的依那西普、聚集的依那西普（例如由正确和/或不正确折叠的依那西普组 成的聚集体），或依那西普片段。本发明提供产生在药物制剂中用作活性成分的依那西普基 蛋白质混合物（或依那西普制备物）的能力，其中在所述药物制剂中需要使正确折叠的依 那西普的量最大化，同时使不正确折叠的（包括聚集的）依那西普的量最小化，至比目前已 达到的更高的范围。
[0023] 在第四实施方案中，本发明涉及一种药物上可接受的制剂，其包含适用于向需要 对TNF介导的病况进行治疗的受试者施用高纯度的依那西普，所述制剂含包含主要量的正 确折叠的依那西普和次要量的不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物，其中：（i)所述不 正确折叠的依那西普构成少于约IOwt. %，优选少于约8wt. %且最优选少于约5wt. %的蛋 白质混合物；（ii)所述正确折叠的依那西普构成多于90wt. %且优选多于约92wt%且最优 选多于约95wt%的蛋白质混合物；和（iii)所述正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那 西普（但不包括其聚集体）的总量构成至少95wt %且优选至少98wt %的蛋白质混合物；其 中所述制剂进一步包括使所述制剂适用于施用于受试者的药学上可接受的非活性成分、赋 形剂或载体。
[0024] 在第五实施方案中，本发明是一种用于制备关于存在其中的正确折叠的相对于不 正确折叠的依那西普的量具有高纯度的含依那西普的蛋白质混合物的方法，所述方法包含 以下步骤：（1)在哺乳动物表达系统中表达依那西普以得到包含含依那西普的蛋白质混合 物的收获的细胞培养流体，所述含依那西普的蛋白质混合物包含正确折叠的和不正确折叠 的依那西普；（2)使在步骤1中得到的收获的细胞培养流体进行纯化过程，借此得到含依那 西普的蛋白质混合物，同时，步骤（1)中产生的收获的细胞培养流体中具有减少量的不需 要的杂质，或基本不含不需要的杂质（即，非依那西普基蛋白质）的；（3)使步骤（2)中得到 的含依那西普蛋白质混合物与同时具有离子交换结构部分和疏水作用结构部分的混合模 式的色谱树脂接触一次或多次，以使包括在混合物中的蛋白质附在所述树脂上；和（4)使 来自步骤3的具有结合在其上的蛋白质的混合模式树脂与能够从所述混合模式树脂上洗 脱正确折叠的依那西普的溶液接触，以得到包含含依那西普的蛋白质混合物的洗脱液，所 述含依那西普的蛋白质混合物具有比步骤3中引入树脂的含依那西普的混合物更高的正 确折叠的依那西普对不正确折叠的依那西普比例；且其中（i)存在于由步骤2纯化得到的 含依那西普蛋白质混合物中的蛋白质的量为存在于步骤1中得到的收获的细胞培养流体 中的依那西普基蛋白质混合物的量的至少约80wt%并最优选至少约85wt% ;(ii)存在于 步骤4中洗脱的蛋白质混合物中的正确折叠和不正确折叠的依那西普蛋白质的组合量为 其存在于由步骤2得到的蛋白质混合物中的量的至少约60wt. %; (iii)存在于步骤4的洗 脱液中的正确折叠的依那西普的量为存在于步骤1中得到的收获的细胞培养流体中的含 依那西普蛋白质混合物的量的至少约30wt. %并优选至少约34wt. % ;和（iv)所述正确折 叠的依那西普构成步骤4中得到的洗脱液的至少约90wt%并优选至少约95wt%的。
[0025] 在第六实施方案中，本发明涉及用于治疗患有TNF介导的疾病的受试者的方法， 其包含将含包含正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的药物制 剂施用于这样的个体的步骤，所述混合物为通过上述任一方法得到的，且其中在所述蛋白 质混合物中不正确折叠的依那西普的量为少于约IOwt. %并优选少于约5wt%的所述混合 物。
[0026] 在第七实施方案中，本发明涉及一种治疗患有TNF介导的疾病的受试者的方法， 其包含将含包含正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的药物制 剂施用于这样的个体的步骤，其中在所述蛋白质混合物中不正确折叠的依那西普的量为少 于约IOwt. %并优选少于约5wt %的所述混合物。
[0027] 在第八实施方案中，本发明涉及用于将正确折叠的依那西普与不正确折叠的依那 西普分离开的方法，其中使用色谱法以实现所述分离，且其中所述色谱法仅由混合模式的 色谱分析组成，其中含正确折叠和不正确折叠的依那西普的混合物与具有离子交换结构部 分和疏水结构部分的混合模式的色谱树脂接触，然后由此被洗脱，以得到含至少约85wt% 并优选至少约90wt%，且最优选约95wt%的正确折叠的依那西普的洗脱液。对于该实施方 案，当在这里陈述"色谱法仅由混合模式的色谱层析组成"，应该理解当仅用于分析目的时， 这样的措辞不排除可选择的多种色谱方法（例如，HIC，SEC等）的使用。该实施方案的优 点在于除了这里描述的混合模式方法外，它不需要使用用于分离正确和不正确折叠的蛋白 质的分离技术。
[0028] 在另一个方面，可以下面的方式实践上述适用于依那西普的方法两次或更多次以 得到高纯度的依那西普制备物：通过实施所述的（例如在上面实施方案1和2中所述）的 步骤（a)和（b)，以实施第一混合模式分离（分离#1);然后通过再次实施步骤（a)和（b)， 实施第二混合模式分离（分离#2);其中分离#1的步骤（b)中得到的洗脱液然后用作分离 #2的步骤（a)的分析物（即，含蛋白质混合物的溶液）。在分离#1和分离#2中使用的混 合模式的树脂可相同或不同。在该方面一个特别优选的实践中，用CAPTO MMC混合模式树 脂实施分离#1，用CAPTO ADHERE混合模式树脂实施分离#2。
[0029] 任选地，由本发明的方法形成的，或在上述的制备物、制剂或治疗实施方案中提供 的依那西普制备物（如果希望这样的话）可不含或基本不含不正确折叠的依那西普，尽管 可理解的是，这里提供具有非常低水平的不正确折叠的依那西普（优选小于约IOwt. %且 最优选小于约5wt%的存在于药物制剂中的依那西普基蛋白质混合物总量）的依那西普制 备物的能力相对于目前可市购的含依那西普基混合物的药物制剂代表一个显著的进步，其 中在该混合物中不正确折叠的依那西普的量基于HIC分析可大于在该药物制剂中发现的 依那西普基蛋白质的约10%。
[0030] 在本发明中供使用的优选的混合模式树脂为CAPTO MMC和CAPTO ADHERE ;然而， 应理解的是用离子交换结构部分和疏水结构部分功能化的任何混合模式的树脂均可预期 用于本发明中。
[0031] 不被任何具体的理论束缚，如果根本不是可预见的，认为一个人可能能够在混合 模式色谱法中的带电特性和疏水特性之间采用这两种亲和类型开发相互依赖的和相对的 作用，以发展适当折叠的蛋白质物种和不正确折叠的和/或聚集的物种的高效分离是可能 的。令人惊奇的是，本发明的混合模式方法不需要与任何其它分离方法结合或用其它任何 其它分离方法补充以以优异产率和高纯度从不正确折叠的蛋白质中分离正确折叠的蛋白 质。例如，不必要使用附加的HIC步骤以进一步实现从不正确折叠的蛋白质中分离正确折 叠的蛋白质的该分离。
[0032] 随着应用于依那西普，根据本发明的混合模式色谱法涉及下面通常的现象顺序的 发生：第一，将不纯的含依那西普的样品（即含正确折叠的、不正确折叠的或其它杂质的样 品）引入混合模式树脂时，例如如从依那西普的CHO表达中得到的那些，本发明的方法允许 依那西普（正确和不正确折叠的）与所述混合模式树脂结合。第二，在后续的洗脱和冲洗 步骤期间（例如，使用盐梯度，优选以渐增浓度的梯度使用），本发明允许从依那西普基混 合物的树脂中释放（即，洗脱），其中含在其中的依那西普主要是正确折叠的，而基本允许 不正确折叠的依那西普保持结合或捕获在混合模式树脂上；从而在从所述树脂上洗脱得到 的材料中可得到非常高比例的适当折叠的依那西普（相对于存在于在初始引入并与所述 树脂结合的含依那西普蛋白样品中的它的更低比例）。依据本发明的混合模式色谱法的物 理操作，所述混合模式树脂可被包含（即包装）在刚性柱状容纳器或容器中，所述刚性柱状 容纳器或容器可包含所述树脂，且具有入口和出口构件以允许流体溶液在所述柱形物的一 端进入，流动并与所述树脂接触，然后在所述容器的相对端离开以被收集用于进一步的分 析或加工或被排放。
[0033] 可用已知的方法从哺乳动物细胞培养物例如CHO细胞中的依那西普蛋白质的表 达中得到上述方法的步骤（a)中使用的含正确折叠和不正确折叠的依那西普的蛋白质混 合物的溶液。在本发明的混合模式色谱法纯化之前，来自所述哺乳动物表达的收获的蛋白 质（收获的细胞培养流体）可进行初步的纯化步骤，例如蛋白质A亲和纯化，以移除杂质。 当需要该步骤用于移除非依那西普基杂质时，该纯化将通常不产生可观的正确折叠的依那 西普从不正确折叠的依那西普的分离（即，拆分（resolution))。相应地，蛋白质A池然后 进行本发明的混合模式技术以完成该分离。
[0034] 本发明的方法提供正确折叠的依那西普的商业上有用的回收率（产率）。例如， 在其中优选以通过在蛋白质A柱中纯化哺乳动物表达产物依那西普得到的蛋白质A层析法 产物的形式提供在本方法步骤（a)中使用的正确折叠和不正确折叠的依那西普的依那西 普基蛋白质溶液的情况下，在蛋白质A纯化步骤中回收的材料的量优选为存在于引入所述 蛋白质A柱中的收获的细胞培养物中的依那西普基表达产物的至少约80wt. %并优选至少 约85wt% (其中可通过Fe Elisa确定存在于收获的细胞培养物中的依那西普基蛋白质的 量，且可通过在A280nm处的UV吸光度确定蛋白质A洗脱池中得到的依那西普基蛋白质的 量）。然后，当使用上面引用的蛋白质A纯化的材料实践本发明的混合模式色谱法时，在本 发明的步骤（b)的洗脱液中得到的依那西普基蛋白质的量优选为在本发明步骤（a)中引入 混合模式树脂的依那西普基材料的量的至少约60wt. %并优选至少约70wt%。
[0035] 相应地在高度富含正确折叠的依那西普（即，按洗脱液的重量计含不多于10wt% 并优选不多于约5wt%的错误折叠物质）的本文步骤（b)的混合模式洗脱液中高纯度的依 那西普混合物的总产量可为在其纯化（例如，蛋白质A纯化）之前原始存在于收获的细胞 培养流体中的依那西普基混合物的约30至约50wt%中的任何值。
[0036] 也可通过其它色谱法，例如使用具有离子交换结构部分和疏水作用结构部分的色 谱树脂的混合模式色谱层析，实现收获的细胞培养流体的纯化。
[0037] 在实践本发明的方法中，可用已知的方式实施附加的过滤步骤（例如，病毒过滤 和切向流过滤）以进一步加工上述混合模式色谱法的步骤（b)中产生的洗脱液。
[0038] 本发明提供用于从给定蛋白质的不正确折叠的构象（包括聚集体）中分离正确折 叠构象的极大改进的分离方法，且，特别地，从由含高度异源的依那西普基物种混合物的哺 乳动物细胞培养获得物得到的错误折叠的（和聚集的）依那西普中拆分适当折叠的依那西 普。
【附图说明】
[0039] 图1示出了 Capto-MMC和Capto-Adhere混合模式树脂的化学结构。
[0040] 图2A(从Protein A的洗脱图谱）示出了来自含正确折叠的和错误折叠的依那西 普蛋白的CHO收获培养物的蛋白-A的洗脱图谱，使用含IM精氨酸的所指示pH的0.1 M柠 檬酸盐的洗脱液。实曲线UV吸收吸光度；虚线是导电率（这与下面图中相同）。
[0041] 图2B (从蛋白质A的洗脱图谱）示出了从蛋白质A洗脱的样品的非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳（Native-PAGE，下文也称为"非变性PAGE"）结果，其中条带1是标准的（商业 的Enbrel);条带2是负载（Load);条带3是FT (流通）；条带4, pH 6. 0 ;条带5, pH 4. 2 ; 条带 6, pH 3.7 ;条带 7, pH 3.0。
[0042] 图3A(来自Capto MMC的蛋白质A池的洗脱图谱）显示了通过在IOmM的磷酸盐 (pH 7. 5)中的NaCl或精氨酸洗脱的CAPTO MMC色谱图。
[0043] 图3B(来自Capto MMC的蛋白质A池的洗脱图谱）洗脱样品的SDS-PAGE和非变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中条带0,标准；条带1，负载；条带2，FT ;条带3,0. 15M NaCl ;条 带4,0.3M NaCl ;条带5, IM精氨酸。
[0044] 图4A(来自CaptoMMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了通过pH7.5的0-0.5M NaCl梯度的洗脱色谱。在梯度洗脱之前用pH7. 5、IOmM磷酸盐平衡所述柱。
[0045] 图4B(来自CaptoMMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了洗脱样品的非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳，其中：条带0,标准；条带1，负载；条带2至条带8,洗脱的部分；条带9, IM 精氨酸。
[0046] 图4C(来自Capto MMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了对于不同蛋白质A池的 洗脱样品的SDS-PAGE和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中条带0,标准；条带1，负载；条带 2, FT;条带3至条带8,洗脱的部分；条带9, IM精氨酸。
[0047] 图5A(来自CaptoMMC的蛋白质A池的洗脱图谱）通过pH 7. 5的0-0? 4MNa2SO4 梯度洗脱的色谱图。在梯度洗脱之前用pH 7. 5、10mM磷酸盐平衡所述柱。
[0048] 图5B(来自Capto MMC的蛋白质A池的洗脱图谱）洗脱样品的SDS-PAGE和非变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中：条带1，负载；条带2，FT;条带3,缓冲液洗涤；条带4至条带 9,洗脱的部分；条带10, IM精氨酸。
[0049] 图6示出了 Capto-MMC洗脱部分的HIC分析。
[0050] 图7A(来自CaptoMMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了通过pH和盐梯度洗脱 的色谱图。
[0051] 图7B(来自Capto MMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了洗脱样品的SDS-PAGE 和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中：条带〇,标准；条带1，负载；条带2和3，FT;条带4至 条带8,洗脱的部分；条带9, IM精氨酸。
[0052] 图8A(来自CaptoMMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了通过pH和Na2SO4梯度 洗脱的色谱图。
[0053] 图8B(来自Capto MMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了洗脱样品的SDS-PAGE 和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中：条带〇,标准；条带1，负载；条带2，FT ;条带3至条带 5，洗脱的部分；条带6，IM精氨酸。
[0054] 图9示出了来自Capto-Adhere的蛋白质A池的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳，其 中：条带〇,标准；条带1，负载；条带2, 5mM柠檬酸盐（pH 4, 5);条带3和4,0.1 M精氨酸（pH 4. 5);条带5,0.5M精氨酸。观察到的低分子量物质用框标出。
[0055] 图IOA(来自Capto-Adhere的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了通过pH和精氨酸 梯度洗脱的色谱图。
[0056] 图IOB (来自Capto-Adhere的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了洗脱样品的 SDS-PAGE和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中：条带0,标准；条带1，负载；条带2至条带4， FT;条带5至条带7,洗脱的部分；条带8,0. 5M精氨酸。
[0057] 图IlA(来自Capto-Adhere的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了通过pH和精氨酸 梯度洗脱的色谱图。
[0058] 图IlB (来自Capto-Adhere的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了洗脱样品的非变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中：条带〇,标准；条带1，负载；条带2, FT;条带3至条带5,洗脱的 部分；条带6, IM精氨酸。
[0059] 图12是在实施例12的步骤3B中得到的Capto-Adhere混合模式树脂洗脱部分的 HIC(疏水作用色谱法）分析的示意图，其中负载样品是在实施例12的步骤3A中得到的材 料。在垂直坐标轴上显示正确折叠的依那西普的百分比，在水平坐标轴上表示随时间应用 的盐梯度。在梯度早期得到的洗脱部分含100%正确折叠的依那西普。
[0060] 图13 (来自Capto-Adhere的Capto-MMC池的洗脱图谱）示出了洗脱样品的SDS 和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。用精氨酸梯度在pH 7. 5下完成洗脱。其中条带0,标准； 条带1，负载；条带2和3, FT ;条带4至条带7,洗脱的部分；条带8, IM精氨酸。
[0061] 图14是来自Capto-Adhere的Capto-MMC池的洗脱色谱图。通过NaCl梯度在pH 7. 5下完成洗脱。
[0062] 图15A(来自Capto-Adhere的Capto-MMC池的洗脱图谱）示出了通过盐/精氨酸 梯度在pH 7. 5下洗脱的色谱图。
[0063] 图15B (来自Capto-Adhere的Capto-MMC池的洗脱图谱）洗脱样品的SDS-PAGE 和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中：条带〇,标准；条带1，负载；条带2，FT ;条带3至条带 6，洗脱的部分；条带7，IM精氨酸。
[0064] 图16是对应于在实施例12中产生的依那西普物质的HIC色谱图，其中基本不显 示第二个较小的峰（错误折叠的物质）的曲线对应于根据本发明（实施例12)产生的物 质；且其中在图中的附加曲线对应于商购的依那西普，用于对比的目的，可以看到其显示了 代表错误折叠和/或聚集物质的第二较小的峰。
【具体实施方式】
[0065] 本发明的前提是根据如下事实：同时使用离子交换和疏水作用的原理的混合模式 树脂，例如Capto? MMC和Capto? Adhere，可用于结合然后优选地（即，有选择地）洗脱给 定蛋白质分析物的正确折叠的构象（相对于不正确折叠的构象）。前述混合模式树脂均包 含具有提供两种不同模式用于吸引和结合蛋白质分析物的结构部分（即，化学基团）的配 体，所述两种不同模式即离子交换吸引和疏水作用。
[0066] 定义
[0067] 本说明书中所使用的术语在本发明的语境中和各术语使用的特定的语境中具有 它们在本领域中的普通含义。用于描述本发明的某些术语讨论如下，或者在本发明的其它 地方，以对实际工作者提供关于本发明说明书的额外指导。提供了某些术语的同义词。一 个或多个同义词的详述并不排除其他同义词的使用。包括这里讨论的任何术语实例的在本 说明书中任何地方的实例的使用仅是示例性的，并不以任何方式限制本发明或任何示例性 术语的范围和含义。本发明不限于在本说明书中给出的各种事实方案。
[0068] 除非另有定义，这里使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人 员通常理解的含义相同。在冲突的情况下，以本文件（包括定义）为准。
[0069] "约（around) "、"约（about) "或"约（approximately) "应通常表示在给定值或范 围的20%之内，10%之内，5、4、3、2或1%之内。给定的数值量是大约的，意味着如果不特别 载明，可推断术语"约（around) "、"约（about)" 或"约（approximately)"。
[0070] 这里使用的术语"依那西普"指含在Enbrel?商业制剂中的活性成分，即由与人类 免疫球蛋白G("IgGl"）的Fc部分[片段，可结晶的]连接的人类75千道尔顿（p75)肿瘤 坏死因子受体（"TNFR"）的细胞外配体结合部分组成的融合多肽的同源二聚体。依那西普 是如下的同源二聚体：如上所述的75千道尔顿TNFR = Fc分子的两个链在Fc部分的铰链区 通过二硫键连接。依那西普由934个氨基酸组成并具有约150千道尔顿的表观分子量，且 其所述Fc组分包含重链恒定结构域2 (CH2)、重链恒定结构域3 (CH3)和铰链区，但不包括人 类IgGl的重链恒定结构域I (CHl)。对于本申请的目的，术语"依那西普"也可包含在氨基 酸结构中具有次要修饰的依那西普（包括氨基酸的缺失、添加和/或取代），所述次要修饰 不显著影响上述多肽的功能。术语依那西普也应被理解为包括意在或被认为是所谓的依那 西普的生物仿制或生物改良的变体的蛋白质。
[0071] 这里使用的术语"正确折叠的依那西普"意在表示具有抑制TNF的生物活性的依 那西普同源二聚体（如上所述）的折叠构象和与Enbrel?中活性成分的构象和生物活性相 同或基本相同的构象。
[0072] 这里使用的术语"不正确折叠的依那西普"意在包含：（i)具有与依那西普（如上 所定义的）相同或基本相同的氨基酸序列，但具有与正确折叠的依那西普不同的构象的同 源二聚蛋白质，其中所述不同的构象致使所述蛋白质缺乏或基本缺乏作为TNF抑制剂的生 物活性；和/或（ii)聚集体，其中两种或更多种正确和/或不正确折叠的依那西普同源二 聚体已以形成具有比正确折叠的依那西普更高的分子量的物种的方式相关联（即，聚集的 或成簇的（clumped));和/或（iii) (i)和（ii)的混合物；和/或（iv)聚集的，即成簇的 蛋白质组合物，其包含与正确折叠的依那西普相同或基本相同的序列，或其部分，但其相对 于正确折叠的依那西普在HIC柱上显示下降的洗脱位置（由于较高的疏水性）。
[0073] 术语"治疗"指对于哺乳动物疾病的治疗方法的任何实施或应用，并包括抑制所述 疾病、阻止其发展、减轻所述疾病（例如，通过引起复原，或恢复或修复损失、缺失或缺陷的 功能）或刺激无效过程。所述术语包括得到期望的药理学和/或生理学的效果并覆盖哺乳 动物中病理状态或疾病的任何治疗。所述效果在完全或部分阻止疾病或其症状方面可为预 防性的和/或在局部或完全治愈病症和/或由所述病症引起的不利影响方面可为治疗性 的。它包括（1)阻止所述病症在易患所述病症但还没有症状的受试者中发生或复发，（2)抑 制所述病症，例如阻止其发展，（3)停止或终止所述病症或至少它的相关症状，以使宿主不 再遭受上述病症或其症状，例如引起病症或其症状的复原，例如，通过恢复或修复损失、缺 失或缺陷的功能，或刺激无效过程，或（4)减轻、缓解或改善所述病症或与其相关的症状， 其中改善在广义上讲用于指至少参数量级的下降，所述参数例如炎症、疼痛和/或肿瘤大 小。
[0074] 术语"药学上可接受的载体"指任何常规类型的无毒的固体、半固体或液体填充 剂、稀释剂、封装材料、制剂助剂或赋形剂。药学上可接受的载体在所使用的剂量和浓度对 受体是无毒的且与所述制剂的其它成分相容。
[0075] 术语"组合物"或"制剂"指通常包含载体的混合物，所述载体例如为本领域常规的 且适用于施用于受试者以用于治疗、诊断或预防的目的的药学上可接受的载体或赋形剂。 它可包括细胞培养物，其中多肽或多核苷酸存在于细胞或培养介质中。例如，用于口服给药 的组合物可形成溶液、悬浮液、药片、丸剂、胶囊、缓释制剂、口服灌洗剂或粉剂。
[0076] 本发明适用于从给定蛋白质的不正确折叠的构象中分离正确折叠的构象。可依 据本发明的方法进行处理的蛋白质的实例包括任何需要重折叠的含二硫化物蛋白质，例如 G_CSF、IGF、胰岛素、生长激素等，和工程化抗体，例如单链可变区抗体片段。
[0077] 可由表达依那西普的活的宿主细胞，例如抗体的情况下的杂交瘤，或在融合多肽 或抗体情况下已被基因工程化以产生所述多肽的宿主细胞产生适用于根据本发明的混合 模式色谱法纯化的依那西普。产生多肽的基因工程化细胞的方法是本领域周知的。参见， 例如Ausubel等人，eds.(1990),CurrentProtocolsinMolecularBiology(Wiley,New York)。这样的方法包括将编码并允许多肽表达的核酸引入到活的宿主细胞中。这些宿主细 胞可为细菌细胞，真菌细胞，或，优选地，在培养物中生长的动物细胞。细菌宿主细胞包括， 但不仅限于，大肠杆菌细胞。合适的大肠杆菌菌株的实例包括：HB101、DH5.alpha、GM2929、 JM109、KW251、NM538、NM539和任何不能切割外来DNA的大肠杆菌菌株。可使用的真菌宿主 细胞包括，但不仅限于，酿酒酵母、毕赤酵母和曲霉细胞。可使用的动物细胞系的一些实例 是CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3和W138。可使用本领域技术人员周知的方法 创立新的动物细胞系（例如，通过转化，病毒感染，和/或选择）。任选地，依那西普可被宿 主细胞分泌至介质中。
[0078]在从错误折叠的依那西普中混合模式色谱分离正确折叠的依那西普之前，可通过 任何标准方法实施表达的依那西普的纯化。当细胞内产生依那西普时，微粒碎片被移除，例 如，通过离心分离或超滤。当依那西普被分泌至介质中时，可使用标准多肽浓缩过滤器首先 将来自该表达系统的上清液浓缩。也可添加蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解作用且可包括抗 生素以阻止微生物的生长。
[0079] 可使用例如如下的方法纯化依那西普：羟磷灰石色谱法，凝胶电泳，透析，和亲和 色谱法，和任何已知或尚未被发现的纯化技术的组合，包括但不仅限于蛋白质A层析法、在 离子交换柱上的分馏法、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶柱层析、肝素SEPHAROSET?柱层 析、阴离子或阳离子交换树脂层析（例如聚天冬氨酸柱）、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉 淀。
[0080] 在非常普通的术语中，如应用到依那西普（但不仅限于对此）的，本发明提供含如 下步骤的蛋白质分离方法：(a)将含同时具有正确折叠和不正确折叠的依那西普的依那西 普基蛋白混合物的溶液引入用离子交换结构部分和疏水作用结构部分功能化的混合模式 色谱树脂中，所述引入在能够允许正确折叠和不正确折叠的依那西普与所述树脂结合的条 件下进行；然后（b)用能够从所述树脂上洗脱正确折叠的依那西普的洗脱介质冲洗所述树 月旨，以使所形成的洗脱液具有比在步骤（a)中引入的蛋白质溶液更高比例的正确折叠的依 那西普。
[0081] 任选地，所述方法可进一步包括如下准备步骤：在例如CHO细胞培养物的哺乳动 物细胞培养物中表达依那西普，然后使用例如蛋白质A层析法纯化表达的产物，因此蛋白 质A产品输出物变为本发明步骤（a)中使用的蛋白质溶液。应该理解的是，可以以下方式 实施本发明的方法：可通过第一实体在给定的制造点实施产生本发明步骤（a)中使用的起 始溶液的哺乳动物表达和蛋白质A步骤，同时可通过相同或不同的实体在相同或不同的制 造点实施本发明的混合模式分离方法。
[0082] 步骤（a)_与CAPTOMMC混合樽式树脂结合的备件
[0083] 在本发明的步骤（a)中，含正确折叠和不正确折叠的依那西普的蛋白质溶液应在 约4至约8的pH下，优选在约4至约6的pH下被引入CAPTO MMC混合模式树脂用于结合 到其上。或者，在使用CAPTO ADHERE混合模式树脂时，含正确折叠和不正确折叠的依那西 普的步骤（a)中的蛋白质溶液应在约6至约8. 5的pH下，优选在约7至约8的pH下被引 入CAPTO ADHERE混合模式树脂用于结合到其上。
[0084] 步骤（b)_从混合樽式树脂h洗脱的备件
[0085] 在步骤（b)中，所述洗脱介质包含预定浓度的盐，并以预定的有效于相对于不正 确折叠的依那西普优先洗脱正确折叠的依那西普的方式应用于柱。同时，一般来说，洗脱 液应包含更高的正确折叠与不正确折叠的依那西普的比率，所述盐溶液和其应用于所述树 脂的方式优选如此选择，以使步骤（b)的洗脱液中正确折叠的依那西普的量大大超出不正 确折叠的依那西普的量。早期洗脱的部分可包含基本上100%正确折叠的蛋白质。可通过 改变（增加）所述盐溶液的摩尔浓度，例如通过梯度，完成盐溶液的洗脱步骤。可逐步完 成所述梯度，但优选连续并线性完成。在一个优选的实施方案中，所述盐溶液包含氯化钠 ("NaCl "）。所述NaCl线性梯度可为从约0至约1M。
[0086] 在一个供选择的实施方案中，所述盐溶液可包含硫酸钠（"Na2S04"）。所述Na 2SO4 溶液也可以逐步或线性梯度应用，优选线性并最优选从约〇至约1摩尔的浓度梯度。
[0087] 可通过在CHO细胞中培养得到依那西普。
[0088] 在一个优选的实施方案中，所述盐溶液包含NaCl。
[0089] 遵循下面的程序用于表达、纯化所表达的产物，并分析从本发明的混合模式色谱 方法中得到的含依那西普的洗脱液：
[0090] 依那西普的表汰。在用编码在羧基端与人类Fc融合的人类TNFR胞外域的基因 转染的重组CHO细胞的条件培养基（"CM"）中表达依那西普。在用于依那西普的哺乳动 物表达的领域内的实例可发现于下列通过引用并入本文的美国专利：RE 36755、US专利号 5, 605, 690、EP 464, 533、EP 417, 563、US 专利号 8. 063, 182 和 US 专利号 7, 294, 481。
[0091]蛋白质 A 层析。使用具有 Iml HiTrap rProtein A 柱（可购自 GE Healthcare) 的蛋白质A柱处理以上得到的CM，并用IOmM磷酸盐、0.1 M NaCl、pH 7.0溶液平衡。在用 IM精氨酸-盐酸盐（"精氨酸"）、0.1 M柠檬酸盐、pH 6.0的溶液冲洗所述柱后，逐步用pH 4. 2, 3. 7和3. 0含IM精氨酸和0.1 M柠檬酸盐的溶液洗脱结合的蛋白质。或者，可在逐渐下 降的PH下用0.1 M的柠檬酸盐在不使用精氨酸下处理所述柱。在不存在精氨酸的情况下，大 多数的依那西普在PH 3. 85下被洗脱以提供在该pH以下流出的含污染物和不正确折叠的 依那西普、依那西普片段、依那西普聚集体等的洗脱液。然后使蛋白质A洗脱液如下面实施 例中描述的在HiTrap柱（可购自GE Healthcare)中进行Capto? MMC或Capto? Adhere。
[0092]蛋白质A洗脱液的分析。图2A和2B中示出了以上得到的蛋白质A洗脱液的分 析。图2A示出了用含IM精氨酸的低pH缓冲剂从蛋白质A的洗脱图谱。在pH 6.0处观察 到大的UV吸收峰（峰标记为6. 0)并不含对应于商购的依那西普的条带（图2B，条带4)如 用非变性PAGE (条带1)检测的：注意没有流经蛋白质A柱的依那西普（对比条带2和3)。 虽然在pH 6.0处（条带4)未观察到蛋白质条带，然而所观察到的大的UV吸收峰表明了颜 料的洗脱。在达到基线吸光度后（图2A)，用0.1 M精氨酸、0.1 M柠檬酸盐，pH 4. 2,洗脱所 述柱，形成尖锐的洗脱峰（图2A，标记为4. 2)。该峰的非变性PAGE分析显示了强的依那西 普条带，和模糊的（smearing)低泳动度条带（条带5)。洗脱的蛋白质的HIC分析显示了 2个峰，第一个峰对应于商业依那西普的主要的峰且第二个峰对应于存在于商业依那西普 中的次要物种。虽然第二个峰的性质不清楚，然而好像是错误折叠的依那西普物种，因为它 结合于蛋白质A并因此应该含所述Fc域。用pH 3. 7和然后用pH 3. 0的溶液（均含IM精 氨酸）洗脱剩余的结合的蛋白质。这些低PH溶剂导致如图2A(3.7和3.0)的小峰的洗脱。 pH 3. 7峰包含少量的依那西普（条带6)，而pH 3.0峰主要包含低泳动度物种，对应于错误 折叠的物种和也可能在聚集的物种（条带7)。在不含精氨酸的情况下观察到了相似的洗脱 模式。需要低pH，例如pH 3. 85,以洗脱依那西普并进一步降低在低泳动度物种洗脱中产生 的pH。事实是这些与蛋白质A结合的低泳动度物种意味着它们也可为Fc融合蛋白。因为 这些物种在比依那西普更低PH下洗脱，它们更紧密地结合蛋白质A。这些分析证实了在重 组CHO细胞中依那西普的表达形成对应于正确折叠的物种的天然的（正确折叠的）依那西 普，和对应于不正确地错误折叠物种的低泳动度物种，正如通过分析性HIC所分析的。由于 错误折叠的物种在HIC中较迟洗脱，其应比天然的依那西普更具疏水性。根据CHO克隆和 发酵条件，正确折叠的物种的量为蛋白质A洗脱液的40-60wt%。在下面的实施例中，评估 了混合模式色谱分析法从不正确折叠物种中分离折叠物种的能力。
[0093] 分析方法
[0094] 可使用多种本领域已知的方法，例如尺寸排除色谱（SEC)、变性的SEC(dSEC)、疏 水作用色谱（HIC)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)和非变性PAGE， 分析来自蛋白质A、Capto? MMC和Capto? Adhere组合物的洗脱部分。例如在Hawe等 人，Pharm. Res. 2011，28:2302 和 / 或 van Marrschalkerweerd 等人，Eur.J. Pharm. Biopharm. 2011，78:213中描述了尺寸排除色谱技术。
[0095] SDS-PAGEo例如，可用十二烷基硫酸钠或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（分别为 SDS-PAGE或非变性PAGE)分析来自蛋白质A、Capto? MMC和Capto? Adhere的洗脱部分。 使用6% Tris-甘氨酸凝胶（可购于Life Technology)实施SDS-PAGE和非变性PAGE。可 在非还原条件下完成SDS-PAGE以使可观察到二硫化物连接的聚集体。
[0096]尺寸棑除色谱。可使用周知的技术如尺寸排除色谱（SEC)、高效液相色谱 ("HPLC"）法分析使用本发明的混合模式色谱法得到的洗脱部分，其中通过尺寸分离所 述分析物（参见 Rogner, M. (2〇00) ? Size Exclusion Chromatography. Protein Liquid Chromatography. M. Kastner. Amsterdam, Elsevier. 61:89-145.)。例如，但不是作为限制， 流动相缓冲剂可被制备成包含50mM磷酸二氢钠一水合物和150mM精氨酸。用IM HCl将pH 调节至 6. 5。可使用线性依附于 Tosoh TSK-Gel G4000SWxl 7. 8mm x 30cm(cat. no. 8542) 的Tosoh TSK-Gel SWxl 6mm x 4cm保护柱（cat. no. 8543)实施分离。为实施分离，将所述 柱放在室温下（23°C )并用移动相以0. 5mL/min流速平衡。用自动进样器将5微升50mg/ mL的含依那西普的溶液注入所述柱上。在约0. 5mL/分钟的流速下分离可在约30分钟完 成。在该时间内在280nm波长处监测柱洗脱液。可使用Chromeleon软件（Dionex)实施整 合。在整合之前，从所有色谱图中减去不含依那西普的缓冲剂的SEC色谱图。所有整合均 可在12分钟至26分钟的保持时间内实施。使用多个参数定义峰。所监测峰的最小面积设 为0. 05mAu*min。用于检测峰值的二维敏感性设为0.0 lmAu和75秒。使用手动整合工具手 动添加峰肩。以两个步骤手工调整所检测的峰。首先，将峰基线（峰的底部边界）调整为 水平。第二，将峰基线的垂直位置调整为色谱图基线的垂直位置。色谱图基线值定义为无 分析物的信号。无分析物的信号定义为在12分钟保留时间处以mAu表示的吸光度。
[0097] 疏水作用代谱法（HIC)〇可使用1. 8至OM的硫酸按梯度在Butyl-Sepharose?上 实施疏水作用色谱（HIC)分析。也可用美国专利7, 294,481(参见19栏，49-55行）中描述 的方法实施 HIC 色谱法。也参考 US 专利号 7, 157, 557 ;Chen J, Tetrault J, Ley A. (2008) J Chromatogr A. 1177, 272-81 ;Gagnon P. and Grund E. (1996)BioPharm, 9, 54-64;和 Lu, Y. , Williamson, B. , and Gillespie,R. Recent advancement in application of hydrophobicinteractionchromatographyforaggregateremovalinindustrial purificationprocess.Curr.Pharm.Biotech.
[0098] 对于根据本发明的混合模式色谱方法制备的依那西普制备物的HIC分析，应注意 的是在通过引用并入本文的美国专利7, 294, 481中的图4包含依那西普制备物的HIC色谱 图，其中具有三个峰，最大的峰（在'481专利中标定为"峰2"）被公开为代表适当折叠的 依那西普融合蛋白；而较小的峰（在481专利中标定为"峰3"）被专利权人假定为含"杂 乱的"（即，在本讨论中认为与不正确折叠的同义词）依那西普和聚集的依那西普（参见美 国专利7, 294, 481，22栏，13-66行，和其图5)。本发明的一个显著优势是以商业上诱人的 产量提供非常高纯度的含依那西普的制备物的能力，其中可充分减小或实质上消除如'481 专利中的图4和图5所提及的且在本文中被认为包含不正确折叠的依那西普的HIC色谱图 的"峰3"。
[0099] 本发明进一步涉及依那西普的药物制剂，其中在该制剂中使用的高纯度的依那西 普是使用本发明的方法得到的。本发明的制剂也可包括缓冲剂、张力调节剂、赋形剂、药学 上可接受的载体和其他常用的所述药物组合物的非活性成分。为简单起见，这些随后将在 本申请中更充分描述。
[0100] 缓冲剂使pH保持在需要范围内。合适的缓冲剂包括组氨酸、磷酸钾、柠檬酸钠或 柠檬酸钾、顺丁烯二酸、醋酸铵、三_(羟甲基）氨基甲烷（tris)、多种形式的乙酸盐和二乙 醇胺。制剂中缓冲剂的浓度优选在约ImM至约IM之间，更优选约IOmM至约200mM。缓冲剂 是本领域中周知的，且通过已知的方法制造和从商业供应商购买。
[0101] 合适缓冲剂的实例包括磷酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸 盐、乙酸盐、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris)、碳酸氢盐。
[0102] 在一个优选的实施方案中，所述缓冲剂是磷酸钠。
[0103] 在一个优选的实施方案中，药物组合物的pH是或接近生理水平。因此，优选地，所 提供组合物的pH在约5. 8和约8. 4之间；且甚至更优选地，在约6. 2和约7. 4之间。本领 域中的普通技术人员将理解可根据需要调整所述PH以使依那西普在特定制剂中的稳定性 和溶解性最大化。因此，PH在生理范围外的仍能被患者容忍的依那西普制剂也在本发明的 范围内。
[0104] 张力调节剂是有助于溶液渗透度的分子。药物组合物的渗透度优选被调节以使活 性成分的稳定性最大化和/或使给药时患者的不适最小化。通常优选药物组合物是与血清 等张的，即具有相同或相似的渗透度，这可通过添加张力调节剂实现。
[0105] 在一个优选的实施方案中，所提供制剂的渗透度为从约180至约420m0sM。然而， 应理解的是所述渗透度可根据具体条件的需要而更高或更低。
[0106] 适合用于调节渗透度的张力调节剂的实例包括，但不限于氨基酸（不包括精氨 酸）（例如，半胱氨酸、组氨酸和甘氨酸）、盐（例如，氯化钠、氯化钾和柠檬酸钠）和/或糖 类/多元醇（例如，蔗糖、葡萄糖和甘露醇）。
[0107] 优选的张力调节剂为甘氨酸、丙氨酸、氯化钠、氯化钾和硫酸钠。
[0108] 在一个优选的实施方案中，在制剂中的张力调节剂的浓度优选在约ImM至约IM之 间，更优选在约IOmM至约200mM之间。张力调节剂是本领域中周知的，且通过已知的方法 制造和从商业供应商购买。
[0109] 赋形剂，也称为化学添加剂、共溶质或共溶剂，在溶液中（也在干燥或冷冻的形式 中）稳定多肽，其也可被添加至药物组合物中。赋形剂是本领域中周知的，且通过已知的方 法制造和从商业供应商购买。
[0110] 合适的赋形剂的实例包括但不限于糖类/多元醇，例如：蔗糖、乳糖、甘油、木糖 醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖；聚合物，例如：血清白蛋白（牛血清白 蛋白（BSA)，人类SA或重组HA)、葡聚糖，聚（乙烯醇）PVA、羟丙基甲基纤维素（HPMC)、 聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、羟乙基纤维素（HEC);无水溶剂，例如：PEG、甘 油和二甲基甲酰胺（DMF);氨基酸例如：脯氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、赖 氨酸盐酸盐、肌氨酸和Y-氨基丁酸；表面活性剂，例如Tween?-80 (聚山梨酯80)、 Tween ?-20 (聚山梨酯20)、SDS、聚山梨酯、泊洛沙姆；和其它赋形剂，例如磷酸钾、醋 酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、金属离子（例如，锌、钙和镁）、 CHAPS、单月桂酸醋、2-〇-beta-单酸甘油脂（2-〇-beta-mannoglycerate)或上述任何组合。
[0111] 优选的赋形剂为蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、海藻糖、 葡萄糖、牛血清白蛋白（BSA)、人血清白蛋白（HSA)、重组白蛋白、葡聚糖、PVA、羟丙基甲基 纤维素（HPMC)、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、羟乙基纤维素（HEC)、PEG、乙烯 乙二醇、甘油、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、SDS、聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊 洛沙姆188、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、锌离子、钙离子、镁离子、CHAPS、蔗糖单月桂酸酯和 2-O-beta-单酸甘油脂。
[0112] 在本发明的制剂中一种或多种赋形剂的浓度优选在约0. 001至5wt%之间，更优 选在约0. 1至2wt%之间。
[0113] 如果需要，根据本发明制备的依那西普制备物可用在其中已提供商业Enbrel的 相同的制剂中，这样的制剂包括约25至约75mg/ml的所述制剂，且进一步包括鹿糖、氯化 钠、L-精氨酸盐酸盐和磷酸钠。
[0114]作为一种选择，根据本发明得到的依那西普制备物可被提供在不含精氨酸的药物 制剂中；例如在2011年10月18号和2012年7月9号分别提交的Manning等人的临时申 请USSN 61/548, 518和61/669480中描述的任何不含精氨酸的制剂，所述两个临时申请通 过引用全部内容并入本文。
[0115]在另一个实 施方案中，本发明提供一种治疗哺乳动物的方法，包括将治疗有效量 的本发明的组合物施用于哺乳动物，其中所述哺乳动物具有可有利地用依那西普治疗的疾 病或病症。
[0116]在一个优选的实施方案中，所述依那西普源自与将用所述组合物治疗的相同的哺 乳动物物种。
[0117]在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是人类。
[0118]可用所提供的组合物治疗的疾病或病症包括但不限于风湿性关节炎、银肩病性关 节炎、强直性脊柱炎、韦格纳氏病（肉芽肿病）、克罗恩病（或炎症性肠病）、慢性阻塞性肺 疾病（COPD)、C型肝炎、子宫内膜异位症、哮喘、恶病质、牛皮癣和特应性皮炎。可用本发明 的组合物治疗的额外的疾病或病症包括但不限于在WO 00/62790、WO 01/62272、美国专利 申请第2001/0021380号和美国专利7, 648, 702B2中描述的那些，这些专利的相关部分通过 引用并入本文。
[0119] 可以通过系统注射，例如通过静脉注射，或通过注射或应用到相关位点，例如通过 直接注射，或当所述位点在外科中暴露时直接应用到所述位点，或通过局部施用将提供的 药物组合物施用到需要治疗的受试者。
[0120] 在一个实施方案中，本发明提供治疗和/或预防风湿性关节炎的方法，包括将治 疗有效量的所提供的依那西普组合物的一种施用于需要其的哺乳动物。
[0121] 所提供的组合物中依那西普的治疗有效量将取决于将被治疗的病况、病况的严重 性、先前的治疗和患者的病史和对治疗剂的反应。可根据主治医师的判断调整合适的量，以 使其可一次或多次施用于患者。
[0122] 在一个实施方案中，每成人剂量的有效的依那西普的量为从约l_500mg/m2,或从 约 l_200mg/m2,或从约 l_40mg/m2或约 5_25mg/m2。
[0123] 或者，可施用平剂量（a flat dose)，其量可为2_500mg/剂量，2-100mg/剂量或约 10-80mg/剂量。
[0124] 如果每周多于一次施用所述剂量，那么示例性的剂量范围与前述的剂量范围相同 或更低，并优选以25-100mg/剂量的每剂量范围每周施用两次或更多次。
[0125] 在另一个实施方案中，用于通过注射施用的可接受的剂量包含80-100mg/剂量， 或作为选择，包含80mg/剂量。
[0126] 可每周，每两周，或每隔数周（例如2-8)施用所述剂量。
[0127] 在一个实施方案中，通过单次皮下（SC)注射以25-75mg/ml的量施用依那西普。
[0128] 在某些情况下，通过在至少三周的时期内，每周一次至三次施用高达约IOOmg的 药物组合物的剂量将得到患者病况的改善。较长时间的治疗对于诱导所需的改善程度可能 是必要的。对于不能治愈的慢性病况，所述治疗方案可能会一直持续下去。对于儿科患者 (年龄4-17)，合适的治疗方案可能涉及施用0. 4mg/kg至5mg/kg的依那西普的剂量，每周 一次或多次。
[0129] 在另一个实施方案中，可以散装制剂（a bulk formulation)制备本发明的药物组 合物，且照此，所述药物组合物的成分被调节至比施用所需的更高，且在施用之前被适当地 稀释。
[0130] 所述药物组合物可作为单独的治疗剂施用或根据需要与额外的治疗方案结合。因 此，在一个实施方案中，所述提供的治疗和/或预防方法与施用治疗有效量的另一种活性 剂组合使用。可在施用本发明的药物组合物之前、之中或之后施用所述其它活性剂。另一 种活性剂可作为所提供组合物的一部分或作为单独的制剂施用。
[0131] 可以多种方式实现所提供的药物组合物的施用，包括肠胃外、口服、口腔、鼻、直 肠、腹膜内、皮内、经皮的、皮下、静脉内、动脉内、心脏内、心室内、炉内、气管内、鞘内给药， 肌肉注射，玻璃体内注射，和局部施用。
[0132] 本发明的药物组合物特别有用于肠胃外给药，即皮下给药、肌内给药、静脉内给 药、腹膜内给药、脑脊髓内给药、关节内给药、滑膜内给药和/或鞘内给药。可通过快速浓 注或连续输注进行肠胃外给药。用于注射的药物组合物可以单位剂量的形式存在，例如 在安瓿或多剂量容器中，具有添加的防腐剂。此外，已发展许多新的给药途径且本发明的 药物组合物适用于用这些新的方法给药，例如，Inject-ease?、Genject?、注射笔例如 GenPen?、和无针装置例如MediJector?和BioJector?。也可为正在发现的给药方法 调整本发明的药物组合物。参见Langer, 1990, Science, 249:1527-1533。
[0133] 所提供的药物组合物也可被配制成长效制剂（depot preparation)。可通过植入 (例如皮下或肌内给药）或通过肌内注射施用此类长效制剂。因此，例如，所述制剂可用适 当的聚合材料或疏水材料（例如在可接受油内的乳剂）或离子交换树脂进行修饰或修饰为 例如微溶盐的微溶衍生物。
[0134] 如果需要，所述药物组合物可以存在于小瓶、包装或分散设备中，其可包含含活性 成分的一种或多种单位剂量形式。在一个实施方案中，所述分配设备可包含具有为注射准 备的单剂量液体制剂的注射器。所述注射器可附有给药说明。
[0135] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种套件或容器，其包含本发明的水性药物 组合物，在所述水性药物组合物中多肽的浓度可在宽范围内变化，但通常在约0. 05至约 20, 000微克/毫升（μg/ml)水性制剂的范围内。所述套件也可附有使用说明。
[0136] 本发明更特别地在下面实施例中描述，下面实施例仅作为示例的目的，因为对其 的多种修饰或变体对本领域技术人员将是显而易见的。附录A进一步提供了本发明代表性 的实施方案。
[0137] 实施例1
[0138]伸用NaCl洗脱的CaDtoniMMC混合樽式纯化
[0139] 在该实施例中，使如上描述得到的蛋白质A洗脱液进行Capto? MMC色谱分析。用 5mM柠檬酸盐、pH 4. 5溶液平衡Capto? MMC柱。用5mM柠檬酸盐的蛋白质A洗脱液的合适 的稀释（如，3-6倍稀释，取决于蛋白质A步骤的洗脱缓冲剂）引起与所述柱的完全结合。 如在SDS-PAGE分析中所示，负载样品（pH 4. 2,蛋白质A洗脱液）是高度异质的且无蛋白质 流经Capto? MMC柱。然后用在IOmM磷酸盐、pH 7. 5溶液中的0. 15M NaCl洗脱结合的蛋 白质，这导致pH(从4. 5至7. 5)和NaCl浓度（从0-0. 15M)的同时变化。从洗脱液的分析 中观察到含正确折叠的依那西普的强的洗脱峰。然而，回收率为约40-50%。在刚刚所述 的洗脱步骤后，将含剩余的结合蛋白质物质的树脂与在IOmM磷酸盐、pH 7. 5溶液中的0. 3M NaCl和IM精氨酸接触，这形成主要含错误折叠的物种和二硫化物连接的聚集体的洗脱液。 该实施例说明了 Capto? MMC在分离错误折叠物种和正确折叠物种方面是有效的。错误折 叠物种在较高盐浓度（0.3M vs.O. 1M)下洗脱的事实意味着它们与所述柱具有较强的静电 作用。此外，IM精氨酸进一步增加了错误折叠的和聚集的蛋白质的洗脱，说明了这些蛋白质 不仅通过静电作用也通过疏水作用与Capto? MMC结合，且精氨酸增强了静电和疏水作用的 破坏。图3A和3B中示出了在该实施例中得到的洗脱部分的分析。
[0140] 实施例2
[0141] 伸用NaCl、平衡至DH7. 5的树脂的CaDtoniMMC混合樽式纯化
[0142] 在前述实施例中，含正确折叠和不正确折叠的依那西普的蛋白质溶液初始在pH 4. 5下与CAPTO MMC树脂接触。在该实施例中，当所述Capto? MMC柱用IOmM磷酸盐、pH 7. 5溶液平衡然后用NaCl随后用精氨酸洗脱时，观察到与实施例1中观察的洗脱相似的洗 脱。特别地，在该pH平衡过程中依那西普不被洗脱。该结果是不期望的，因为依那西普在 pH 7. 5下是带负电的；由于重链糖基化，依那西普的pi为4. 9-5. 4。因此，在pH 4. 5或低 于pH 4. 5下，依那西普是带正电的且因此应与带负电的Capto? MMC配体结合，尽管疏水作 用也可有助于结合。在pH 7. 5时，带负电的依那西普应从带负电的Capto? MMC解离，但发 现这并不发生。这可解释如下：依那西普和Capto? MMC间的疏水作用压倒了带负电的柱和 依那西普间的静电排斥。或者，Capto? MMC可通过结合蛋白质结构部分（蛋白质结构部分 的Pl为~8. 1)上的局部正电荷保持所述结合蛋白质。
[0143] 实施例3
[0144]伸用NaCl梯度以用于洗脱的CaDtoni混合樽式纯化
[0145] 在该实施例中，使用NaCl浓度梯度完成连续的洗脱。特别地，在用IOmM磷酸盐、 PH 7.5溶液洗涤所述柱后，用从0至0.5M的线性盐梯度洗脱结合的蛋白质。负载样品（pH 4. 2蛋白质A洗脱液）是高度异质的（含正确折叠和不正确折叠的依那西普），正如前述情 况，并用渐增离子强度的NaCl梯度洗脱结合的蛋白质。ISOmin后，终止梯度并将盐浓度调 为0.5M，这引起蛋白质洗脱轻微增加。如通过后续分析所确定的，低盐部分包含更多的正确 折叠的依那西普且更高的盐部分富含低泳动度（错误折叠的和聚集的）物种。最后，用IM 精氨酸、IOmM磷酸盐、pH 7. 5溶液洗脱剩余的蛋白质。该部分不含依那西普，但全部为低 泳动度（错误折叠的和聚集的）物种。对不同蛋白质A洗脱液使用Capto? MMC的NaCl梯 度洗脱，结合树脂的预平衡，导致在正确折叠的依那西普方面更高纯度的洗脱液。在洗脱介 质中低NaCl浓度下，洗脱的样品富含折叠的依那西普。随着上述盐梯度应用至所述树脂， 在洗脱液中错误折叠的物种逐渐增加。在完成所述盐梯度后，所述树脂与IM精氨酸溶液接 触，且发现由其形成的洗脱部分包含错误折叠的物种（其不仅包括错误折叠的物种还包括 聚集的物种），正如在后续SDS-PAGE分析中显而易见的。在SDS-PAGE上一些低泳动度物种 被认为是不正确折叠的（但不是聚集的）依那西普，表明了一部分错误折叠的物种随着错 误折叠的依那西普同源二聚体泳动，在非变性PAGE上具有比正确折叠的依那西普同源二 聚体更慢的泳动度。图4A、4B和4C中提供了在该实施例中得到的洗脱液部分的分析。
[0146] 实施例4
[0147]伸用Na2SOi弟度以用于洗脱的CaDtoMMMC混合樽式纯化
[0148] 在该实施例中，Na2SC^f度取代NaCl用作用于从混合模式树脂上洗脱正确折叠的 依那西普的盐梯度。虽然NaCl通常专用于洗脱IEC中的蛋白质，但是通常已知不同的盐具 有不同程度的盐析（蛋白质沉淀）效果。NaCl是例如1%(：1 2的盐溶盐和例如Na2SO4的盐析 盐之间的中间物。NaCl在减弱依那西普和Capto? MMC之间的静电作用方面可能是有效的， 但在减弱疏水作用方面可能是中立的。本文认为Na2SO4在减弱静电作用方式应该也是有效 的，但应增强疏水作用，因为已知它为强的盐析盐。因此，如果所述低泳动度物种如上所述 通过疏水作用被所述柱结合，那么它们的洗脱可被Na 2SO4抑制。在用IOmM磷酸盐、pH 7. 5 溶液pH平衡CAPTO MMC树脂柱后，通过用0-0. 4M的Na2SO4梯度洗脱含正确折叠和不正确折 叠的依那西普的蛋白质溶液对此进行测验。在蛋白质的Na 2SC^f度洗脱完成后，用IM精氨 酸、pH 7. 5溶液洗涤所述柱。图5A示出了洗脱色谱图，图5B示出了洗脱部分的SDS-PAGE 和非变性PAGE。在低Na2SO 4部分（图5B条带6和7)观察到了相对强的正确折叠的依那 西普条带且这些部分的纯度高于负载（条带1)。较高的Na 2SCV^度导致非变性PAGE上低 泳动度物种的洗脱（图5B条带8和9)。在pH 7. 5下最终的IM精氨酸洗脱导致低泳动度 (错误折叠的/聚集的）物种的洗脱。在该部分中似乎有一些依那西普（图5B条带10)， 表明Na 2SO4*可抑制天然依那西普的洗脱。可得出结论=Na2SO4在分离折叠物种和错误折 叠物种方面是同等有效的（如果不是更有效的话），虽然它可能引起天然依那西普的保留 (条带10)。
[0149] 实施例5
[0150] 用NaCl和DH梯度洗脱的CaDtoniMMC混合樽式纯化
[0151] 在前述实施例中，在pH平衡步骤中，即pH从4. 5 (5mM柠檬酸盐）变化至7. 5 (IOmM 磷酸盐），没有观察到蛋白质的洗脱。然而，当增加蛋白质负载量超过IOmg每1ml柱时，不 再发生该情况。在较高的负载下在PH变化期间蛋白质的洗脱逐渐增加，虽然该现象的原因 是不明的。该洗脱样品的纯度高于负载样品，但远小于低盐部分。例如，当负载样品（蛋白 质A洗脱液）仅含51 %正确折叠的依那西普物种时，在pH平衡期间发生的洗脱仅为65% 纯，比所述负载高但远低于所述低盐部分，然而，在盐梯度开始时，上述实施例中的盐洗脱 能给出96%纯度，正如用分析性HIC所确定的（图6)。正如在图6中所标绘的，洗脱部分 的纯度随着盐浓度的增加从96%至20%逐渐下降，这与Capto? MMC的非变性PAGE结果一 致（图3B、4B、5B)。IM精氨酸部分的纯度（就正确折叠的依那西普而言）低（仅11%)， 也与非变性PAGE分析（参见图4B条带9和图5B条带10) -致。鉴于前面的观察结果，与 这里呈现的观察结果一起，假设使PH梯度与盐梯度组合以抵消在柱pH平衡期间较大蛋白 负载的任何正确折叠物种的潜在损失可能是有益的。相应地，在下面的该实施例5中，当实 施本发明方法的上面定义的步骤（b)时，将pH梯度与盐梯度组合。在该实施例中，通过使 PH变化与盐梯度组合，抵消了在混合模式树脂柱的初始pH平衡期间少量的适当折叠的依 那西普可被不希望地洗脱的可能性。特别地，通过同时进行的PH和NaCl浓度的梯度洗脱 结合的蛋白质，即，所述柱从5mM柠檬酸盐、pH 4. 5溶液发展为IOmM磷酸盐、含NaCl的pH 7.5溶液。这导致pH和盐浓度的同时变化，均引起结合蛋白质的洗脱。这与在pH平衡后 观察到的盐洗脱图类似，在于低泳动度的物种洗脱在较后面的部分（即，较高的PH和盐浓 度）和在最终的IM精氨酸、pH 7. 5洗涤中。例如，蛋白质A洗脱液（24mg)在pH 4. 5下与 所述柱结合并用从5mM柠檬酸盐、pH 4. 5至含0. 5M NaCl的pH 7. 5 IOmM磷酸盐的梯度洗 脱。假设用PH平衡的大的负载可在pH转换期间导致结合的蛋白质的洗脱。在pH和盐梯 度期间的洗脱图谱确实在梯度开始时显示了较小的峰并在梯度中间显示了主要的峰（所 需的正确折叠的依那西普）。所观察到的小峰可能对应于如果初始没有用PH/盐梯度进行 PH平衡所观察到的洗脱。在NaCl/pH梯度洗脱完成后，所述柱然后进行使用IM精氨酸溶 液的进一步洗脱，这导致最终的对应于低泳动度物种的强峰。早期洗脱的低盐和低PH部分 富含依那西普，而高盐和高pH部分显示了低泳动度物种的洗脱；在中间的盐浓度所述pH逐 渐从4. 5增加至7. 5,例如从4. 1增加至5. 1和在梯度结束时为pH 6. 6。用IM精氨酸、pH 7. 5溶液的最终洗涤在非变性PAGE上显示了模糊的条带并在SDS-PAGE上显示了多重条带， 基本与在用IOmM磷酸盐、pH 7. 5洗涤引起pH变化的初始柱平衡后的发生的洗脱相同。在 所述池中适当折叠的依那西普的回收率为~70%。当用与IOmM磷酸盐、pH 7. 5溶液相同 的PH/盐梯度实施所述洗脱但以更低的含0.25M NaCl的盐结束时，得到相似的结果。使用 更低盐浓度的梯度导致依那西普的不完全洗脱，产率为~50%。正如在前述实施例中的，用 IM精氨酸洗涤观察到大的峰，对应于低泳动度（错误折叠的/聚集的）依那西普物种。图 7A和7B示出了在该实施例中得到的洗脱液的分析。
[0152] 实施例6
[0153]伸用Na2SaZoH梯度以用于洗脱的CaDtonMMC混合樽式纯化
[0154] 与上述实施例5中使用的程序相似，也使用0.5M Na2SO4溶液最为最终的溶剂实施 PH/盐梯度洗脱，据认为这改善了折叠物种从错误折叠的物种中的拆分。池中依那西普的 回收率为~50 %，认为所述低的回收率是由于通过0. 5M Na2SOdI强的疏水作用，不仅导致 主要在IM精氨酸洗涤中洗脱的错误折叠的物种的保留，还导致也出现在IM精氨酸洗涤中 的依那西普的保留。因此，Na 2SO4的使用可增强从正确折叠物种中的错误折叠物种的分离 (即，拆分），但也降低了依那西普的回收率。对于该实施例中洗脱液的分析，可参考图8A 和8B。
[0155] 实施例7
[0156] Captoia Adhere :在dH7. 5 和dH4. 5 下用 NaCl 洗月兑
[0157] 在该实施例中，使含正确折叠和不正确折叠的依那西普物种的蛋白质A洗脱液进 行使用Capto? Adhere作为混合模式树脂的混合模式色谱分析。在pH 7. 5下实施含正确 折叠和不正确折叠的依那西普物种的蛋白质溶液的结合，在该pH下依那西普带负电荷并 因此应结合带正电的Capto? Adhere配体。当pH 4. 2蛋白质A洗脱液相对于IOmM磷酸 盐、PH 7. 5溶液透析时，蛋白质结合完全，但发现只通过盐的洗脱（pH 7. 5下）是无效的，表 明Capto? Adhere是相当疏水的。因此认为，因为依那西普的pi是4. 9-5. 4,在或许是pH 4. 5的较低的洗脱pH下，依那西普物种将是带正电的并因此在pH 4. 5下从带正电的Capto? Adhere树脂中排除出去。通过在pH 4. 5下实施依那西普物种从Capto? Adhere上的洗脱 研宄该可能性。pH 4. 2蛋白质A洗脱液（已被透析至pH 7. 5)与用IOmM磷酸盐、pH 7. 5 的溶液平衡的Capto? Adhere结合。在蛋白质负载后，用在相同缓冲剂中的0和0.2M NaCl 洗涤所述柱，在这些洗涤中无蛋白质洗脱。
[0158] 实施例8
[0159]CaptoTM Adhere :在dH4. 5下使用/不使用精氨酸的洗月兑
[0160] 鉴于实施例7的结果，然后用具有和不具有精氨酸的5mM柠檬酸盐、pH 4. 5溶液 洗脱所结合的蛋白质。在该实施例中使用精氨酸取代NaCl以研宄更加疏水的物种（精氨 酸）可能影响洗脱的方式，考虑到Capto? Adhere配体的疏水性质。发现，低泳动度（错 误折叠的/聚集的）物种与正确折叠的依那西普被5mM柠檬酸盐、pH 4. 5的洗涤溶液（不 含精氨酸）洗脱。在该部分中低泳动度物种的洗脱可归因于PH的突变，如该部分中所测的 pH为3. 0。当用在5mM柠檬酸盐、pH 4. 5溶液中的0. 1和0. 2M精氨酸重复该步骤时，只观 察到边际量的正确折叠的依那西普。正确折叠的依那西普的完全洗脱需要0. 5M精氨酸，然 而，洗脱液包括不期望量的低泳动度物种。因此发现，即使在PH 4.5下，精氨酸在低浓度下 是无效的，且在较高的精氨酸浓度下，导致折叠的和错误折叠的物种之间的差的拆分。参见 图9,用于分析在该实施例中得到的洗脱液。
[0161] 实施例9
[0162] Capto11Adhere:用两种精氨酸梯度和7. 5至4. 5的pH梯度的洗月兑
[0163] 然后假设pH/精氨酸梯度组合可引起适当折叠的物种和错误折叠的物种之间的 拆分。如在对于CAPTOMMC的前述实施例中的，可通过应用同时发生的pH梯度，其然后可 与精氨酸浓度梯度（例如从IOmM磷酸盐、pH7. 5至5mM柠檬酸盐、pH4. 5含精氨酸的梯 度）配合，来阻止在使用5mM柠檬酸盐从7. 5至4. 5的pH平衡期间的pH下降。使用该pH 梯度研宄两种精氨酸梯度。在精氨酸梯度至0. 25M精氨酸的情况下，（图IOA和10B)发现 最后的0. 5M精氨酸洗涤导致低泳动度物种和依那西普的洗脱，表明了至仅0. 25M精氨酸的 精氨酸浓度的梯度的使用将对正确折叠的依那西普的完全洗脱是不充足的。相应地，研宄 了 0-0. 5M的精氨酸梯度（与上述7. 5-4. 5的pH梯度配合）（图IlA和11B)。从后续的非 变性PAGE分析中显而易见的是，用比先前的0. 25M精氨酸梯度高的精氨酸梯度的最后的IM 精氨酸洗涤的相对峰高度较小。没有观察到第二峰，表明拆分可能已被破坏。PH是这样的， 以使被洗脱部分的pH逐渐从7. 5降至6. 0、5. 7、5. 2并最终至4. 5。对于0. 5M精氨酸和pH 梯度，主要洗脱峰中的两个部分富含正确折叠的依那西普，蛋白质回收率为~65%。梯度的 更后面的部分显示了含依那西普的模糊的条带。因此，虽然0. 5M精氨酸梯度连同pH梯度 增强了结合的依那西普的洗脱，然而在精氨酸/pH梯度更后面的部分，正确折叠的依那西 普与错误折叠的物种共洗脱。最后的IM精氨酸洗涤仅显示了模糊的条带。
[0164] 实施例10
[0165]Captoia Adhere :用精氨酸梯度和7. 5-4. 5的pH梯度的洗月兑
[0166] 也在pH 7. 5下使用Capto? MMC池实施精氨酸梯度洗脱。用IOmM磷酸盐、pH 7. 5 至〇. 6M精氨酸、IOmM磷酸盐、pH 7. 5的梯度洗脱结合的蛋白质。SDS-PAGE和非变性PAGE 的图显示了在中间部分（0.2-0. 4M精氨酸）的正确折叠的依那西普的洗脱（图13)。在较 后面的部分和最后的IM精氨酸pH 7. 0洗涤中观察到如在两个凝胶中所见的低泳动度物 种。通过比较，当在pH 7. 5下的梯度洗脱中将0.6M精氨酸替换为0.5M NaCl时，依那西普 的洗脱大大下降。图14显示了在pH 7. 5下在所述盐梯度至0. 5M NaCl期间的洗脱图谱。 在该梯度过程中观察到两个峰，主要包含依那西普但具有低的产率。大量的依那西普在最 后的IM精氨酸洗涤中被洗脱，表明了结合pH 7. 5的0. 5M NaCl的盐浓度对于从错误折叠 的/聚集的物质中分离正确折叠的依那西普来说不是最佳的。如上所述，IM精氨酸在洗脱 正确折叠的依那西普方面是高效的，虽然存在低泳动度的物种。注意到，改变盐洗脱梯度以 应用约0至约IM NaCal的梯度和在pH 8下实施洗脱导致在该梯度的早期洗脱产物中正确 折叠的依那西普相对于高低泳动度（错误折叠的/聚集的）物种的优异拆分，如在实施例 12中所示。似乎是在pH 8. 0下与Capto Adhere结合的依那西普的疏水贡献下降，导致单 独使用NaCl时正确折叠的依那西普的有效的洗脱。
[0167] 实施例11
[0168] Capton Adhere :在dH7. 5下用精氨酸/NaCl梯度的洗月兑
[0169] 在该实施例中，在pH 7.5下研宄组合的NaCl/精氨酸梯度。研宄了两种这样的梯 度：用于洗脱介质的被研宄的第一梯度是其中最终NaCl和精氨酸浓度分别为0. 4和0. 2 ; 研宄的第二梯度是其中最终NaCl和精氨酸浓度分别为0. 25M NaCl和0. 5M精氨酸。在这 两种情况下，均在IOmM磷酸盐、pH 7. 5溶液中应用所述梯度。第一梯度仍然是太弱而不能 减少疏水作用并因此洗脱依那西普。第二梯度是更有效的，如在最后IM精氨酸洗涤中的较 小的峰所指示的。特别地，如用SDS-PAGE证实的，在直至0. 25M NaCl、0. 5M精氨酸的测试 的第二梯度中，始终发生依那西普的洗脱而无高分子量（低泳动度/错误折叠的/聚集的） 物种。然后在最后的IM精氨酸洗涤中洗脱所述高分子量物种。在非变性PAGE上，多数天然 的正确折叠的依那西普显示在中间部分洗脱。用IM精氨酸洗涤观察到了模糊的条带。因 此精氨酸和NaCl的组合可导致依那西普的洗脱和对应于错误折叠物种的低泳动度和高分 子量物种的分离是显而易见的。用于Capto? MMC池（60-80%纯度）的Capto? Adhere部 分的HIC分析显示，在梯度中（除了尾部部分）被洗脱部分通常具有高于95%的纯度。图 15A和15B示出了在该实施例中得到的洗脱液的分析。
[0170]实施例 12-CaDto11 Adhere 和 Captoia MMC
[0171] 在该实施例中，通过与上述蛋白质A方法相似的方法得到含正确折叠和错误折叠 的依那西普的蛋白质A洗脱液。然后将所述洗脱液应用于Capto? MMCe柱，然后将所述产 物池应用于Capto? ADHERE柱以提供定量和定性上均优越的依那西普产物。
[0172]步骤1.细胞扩增。用本领域中已知的方法，使用表达依那西普融合蛋白的CHO细 胞的克隆实施细胞扩增，所述细胞扩增对于产生足够数量的细胞以用于生产生物反应器接 种是必要的。该表达过程的产物（收获的细胞培养流体）形成正确折叠的依那西普和不正 确折叠的和/或聚集的依那西普和额外杂质的混合物。将含该蛋白质混合物的所述收获的 细胞培养流体进行清洁剂病毒灭活。
[0173]步骤2.亲和忾谱分析。以周知的方式使用常规的蛋白质A亲和柱对步骤1中得 到的收获的细胞培养物实施亲和色谱分析。产物回收率为约85%。得到的产物是含正确 折叠的依那西普、不正确折叠的依那西普、和/或正确和/或不正确折叠的依那西普的聚集 体、或蛋白质片段的复杂蛋白质混合物。将从该蛋白质A亲和柱纯化步骤得到的产物调节 至pH 3. 5,然后使其经受病毒灭活步骤。病毒灭活之后，将所述产物调节至pH 5. 5,然后使 用商购的囊式过滤器用已知的方式对其进一步澄清（clarified)。
[0174]步骤3A.混合樽式阳离子夺换色谱分析。31. 8L (45cm直径X 20cm床高）填充床 GE Healthcare Capto MMC色谱柱用于纯化上述步骤2中得到的产物。在使用之前，所述柱 用2CV的25mM乙酸盐pH 5. 5平衡并用2CV的0? IN NaOH、IM NaCl消毒（sanitized)，并用 2CV的25mM乙酸盐、0. 7M NaCl、pH 5. 5中和。然后用8-10CV的25mM乙酸盐pH 5. 5平衡 所述柱直至流出物为pH 5. 5和3. 5mS/cm。用WFI将来自上面步骤2的蛋白质A池稀释至 < 6mS/cm并将其应用于负载有高达15g/L介质的柱用于各循环。在200cm/h的线速率下 操作所述柱以给予6分钟的停留时间。负载后，用2CV的25mM乙酸盐pH 5. 5洗涤所述柱， 然后用8.5(^，15%至85%的251111乙酸盐口115.5至251111乙酸盐，0.7]\1恥(：1邛115.5的梯 度稀释所述产物。在〇. 150D(A280, LOcm路径长度）处开始收集产物并在最大峰值的50 % 处停止收集。洗脱液的体积约为5CV。用2CV的IOmM Tris，IM NaCl，pH 8. 0从所述柱上 剥离残余产物和污染物并将其丢弃。使用Millipore Opticap XL10, 0.22 ym Durapore囊 式过滤器，（0.69m2)过滤从所述混合模式柱上得到的产物。由该步骤得到的产物显示了约 70%的步骤2中得到的蛋白质A材料的回收率。
[0175]步骤3B.混合模式阴离子交换色谱分析。27. OL (45cm直径X 17cm床高）填充床 GE Healthcare Capto Adhere色谱柱用于进一步纯化上述步骤3A中得到的产物。在使用之 前，用2CV的25mM Tris，pH 8. 0平衡所述柱并用2CV的0.1 N NaOH，IM NaCl消毒并用2CV 的25mM Tris，pH 8. 0中和和平衡。在产物负载之前，用3CV的IOmM Tris，pH 8. 0平衡所 述柱。用每kg池~0.045kg的IM Tris, pH 8. 3将来自上面步骤3A的Capto MMC池调节 至pH 8. 1。用WFI将来自上述步骤3A的产物在线（in-line)稀释1:3. 8以调节电导率至 12.01115/〇]1且。118.0。然后将所产生的物质应用于负载多达158/1介质的柱。在170〇11/11 的线速率下操作所述柱以给予6分钟的停留时间。负载后，用2CV的25mM Tris，pH 8. 0洗 涤所述柱。然后用 IOCV 的 25mM Tris, pH 8. O 至 IOmM Tris, IM NaCl, pH 8. O 的梯度（20% to 90% )洗脱所述产物。在0. 150D(A280, 1.0 cm路径长度）处开始收集产物并在最大峰 值的25%处停止收集。洗脱液的体积为4-6CV。使用可商购的囊式过滤器过滤洗脱的产 物，然后用已知的方式使其经受病毒过滤和切向流过滤步骤。来自步骤3B (包括最后的病 毒和切向流过滤步骤）的全部产物回收率为约68%。在过滤步骤前测得的产物回收率为约 75%。图12中示出了来自该步骤的在洗脱部分上得到的HIC数据示意图。
[0176]分析：发现在该实施例中获得的最终的经过滤的产物具有大于约90wt%的正确 折叠的依那西普，正如通过HIC所测定的；少于5wt%的不正确折叠的依那西普物种，正如 通过HIC所测定的；少于约3wt%的截短的材料（认为是依那西普片段，其中其TNFR部分 已被截短），如由HIC分析的；且正确和不正确折叠的依那西普的组合量高于95wt %，正如 通过尺寸排阻色谱法所测定的。
[0177] ---------------------
[0178] 在存在盐析条件下发生的蛋白质结合的事实表明了在依那西普结合Capto?MMC 和CaptoTMAdhere中不涉及疏水作用的可能性，考虑到疏水性蛋白结合HIC通常需要强的 盐析。然而，可在蛋白质和这些混合模式树脂间的静电作用存在促进疏水作用。因此，无意 愿受任何特定的理论的束缚，即使在缺乏盐析条件下，仍可通过静电和疏水作用模式介导 依那西普与混合模式树脂的结合。分析性HIC清楚地表明了在较低的硫酸铵浓度下洗脱的 错误折叠的物种比折叠的物种更具有疏水性。假定折叠的物种和错误折叠的物种均具有 相同的静电性质，并同样很好地结合Capto?MMC或Capto?Adhere配体的带电基团，那么 错误折叠物种的较强的疏水贡献使它们更紧地与混合模式树脂结合是可能的，因此使更强 的对于错误折叠物种的洗脱条件成为必需，正如在上述实施例中所观察到的。对于Capto? MMC，这可在较高的盐浓度下实现，该较高的盐浓度可能不足以显著增强疏水作用，但可能 足以破坏Capto?MMC和正确与不正确折叠物种二者间的附加的静电作用。相反地，Capto? Adhere似乎比Capto?MMC具有更高的疏水性，需要精氨酸，或具有更高pH的更高的盐浓 度，以洗脱正确折叠的物种。需要更高的精氨酸浓度或更苛刻的条件以洗脱错误折叠的物 种。
[0179] 虽然本发明使用可交换的术语"错误折叠的（misfolded)"或"不正确折叠的 (incorrectly folded)"或"不适当折叠的（improperly folded)"，但是也应理解的是这些 术语旨在包含聚集的物质，因为也发现混合模式树脂在移除在被发现包含错误折叠物种的 相同洗脱部分中的聚集物种方面是有效的。实际上，依那西普形成二硫化物连接的低聚物， 如在SDS-PAGE中所示。这样的低聚物主要在IM精氨酸洗涤中洗脱，表明它们与树脂更强 的疏水作用。相应地，对于依那西普，似乎Capto? MMC和Capto? Adhere均可引起错误折 叠的和聚集的物种的同时去除。由于聚集物质（无论是正确折叠的还是不正确折叠的）潜 在的免疫原性，错误折叠和聚集体（无论是共价的还是非共价的）的去除是高度需要的，以 提供更安全的生技药品。
[0180] 对于前述实施例中精氨酸的效果，显然精氨酸（精氨酸盐酸盐）不仅起盐的作用 也减弱疏水作用。本领域中已知精氨酸抑制蛋白质聚集和表面吸附。此外，精氨酸与芳香 基团相互作用并因此干扰蛋白质之间或蛋白质与所述表面之间的芳香族-芳香族或芳香 族-阳离子相互作用。Capto? MMC和Capto? Adhere均拥有可有助于蛋白质结合的芳香 基团。还不能够预测这样的结合模式可被精氨酸而不是NaCl有效地破坏。精氨酸也可减 弱脂肪酸间的相互作用，表明它可破坏疏水作用，这不通过芳香基团介导。虽然机制上不能 清楚地理解，然而精氨酸的疏水性质可因此在调节蛋白-蛋白相互作用和表面吸附并因此 从所述混合模式树脂上的蛋白质洗脱方面发挥着重要的作用。然而，如在上述实施例12中 所示，不需要使用精氨酸以实践本发明以提供极高纯度的依那西普制备物。这也许是由于 Capto MMC和Capto Adhere树脂对蛋白质结合的弱的疏水贡献。然而，与NaCl组合使用精 氨酸可提高混合模式色谱对于蛋白质的回收和拆分。
[0181]附录 A
[0182] 讲一步的代表件卖施方案
[0183](在优先权申请USSN61/699, 552中公开）
[0184] A.用于从不正确折叠的蛋白质中分离正确折叠的蛋白质的混合模式色谱方法，其 包含以下步骤：
[0185] (a)将同时含正确折叠和不正确折叠构象的给定蛋白质的第一蛋白质混合物与同 时具有离子交换结构部分和疏水结构部分的混合模式色谱树脂结合；
[0186] (b)从所述混合模式树脂中洗脱正确折叠的蛋白质，以得到含比第一蛋白质混合 物更高比例的正确折叠蛋白质的第二蛋白质混合物。
[0187] B.根据实施方案A的方法，其中，所述混合模式色谱树脂是Capto? MMC混合模式 色谱树脂。
[0188] C.根据实施方案A的方法，其中，所述混合模式色谱树脂是Capto? Adhere混合 模式色谱树脂。
[0189] D.根据实施方案A-C任一项所述方法，其中，所述正确折叠和不正确折叠的蛋白 质构象包含正确折叠和不正确折叠的依那西普。
[0190] E.根据实施方案D的方法，其中，所述不正确折叠的依那西普构成少于约 IOwt. %，并优选少于约5wt. %的步骤（b)中得到的洗脱液；所述正确折叠的依那西普构成 多于约90wt%并优选多于约95wt%的步骤（b)中得到的洗脱液；且正确折叠和不正确折叠 的依那西普的组合量构成至少约95wt%并优选至少约98wt%的步骤（b)中得到的洗脱液。
[0191] F.根据实施方案A-E任一项所述方法，其中，所述混合模式树脂是Capto? MMC且 在约4. 5至约7. 5之间的pH下实施所述方法的步骤（a)和（b);且通过使所述混合模式树 脂与盐溶液接触实施洗脱步骤（b)。
[0192] G.根据实施方案A-E任一项所述方法，其中，所述混合模式树脂是Capto? Adhere 且在约4. 5至约8. 5的pH下实施步骤（a)和（b);且通过使所述混合模式树脂与盐溶液接 触实施洗脱步骤（b)，所述溶液任选地进一步包含精氨酸。
[0193] H.根据实施方案F或G所述方法，其中，通过所述盐浓度逐渐增加的梯度在步骤 (b)应用所述盐溶液。
[0194] I.根据实施方案H所述方法，其中，步骤（b)中的盐浓度梯度引起盐浓度从约0至 约IM增加。
[0195] J.根据实施方案F-I任一项所述方法，其中，所述盐选自氯化钠和硫酸钠。
[0196] K.根据实施方案A-J任一项所述方法，其中，在步骤（b)中，与步骤（b)中所述树 脂接触的所述溶液的PH是逐渐变化的。
[0197] L根据实施方案K所述方法，其中所述pH是逐渐增加的。
[0198] M.根据实施方案K所述方法，其中所述pH是逐渐下降的。
[0199] N.根据实施方案A-M任一项所述方法，其中，在步骤（b)的洗脱液中得到的正确折 叠的蛋白质的量为在步骤（a)中引入所述树脂的蛋白质混合物中存在的蛋白质的量的至 少约60wt%。
[0200] 0.根据实施方案N所述方法，其中，正确折叠的蛋白质的量为在步骤（a)中引入所 述树脂的蛋白质混合物中存在的蛋白质的量的至少约70wt. %。
[0201] P.根据实施方案A-O任一项所述方法，其中，得到包含至少90wt%正确折叠的依 那西普且优选少于约5wt. %不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物，而不实施，或不需要 实施任何色谱分离或纯化步骤以从不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普，除 了下面的步骤：
[0202] (1) 一个或多个纯化步骤，优选包含蛋白质A色谱纯化步骤，其中使用这样的步骤 以纯化含依那西普基蛋白质的收获的细胞培养流体，且其中这样的纯化步骤不做从不正确 折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的任何可评估的分离。
[0203] (2)在实施方案1中描述的混合模式色谱法步骤（a)和（b);和
[0204] (3)仅为了分析目的而实施的SEC、HIC或其它分析性色谱步骤。
[0205] Q.根据实施方案A-P任一项所述方法，其中，通过在A280处的UV吸光度测定步 骤（b)洗脱液中存在的蛋白质的量；通过疏水作用色谱法测定步骤B洗脱液中的正确折叠 的依那西普的量；且通过尺寸排阻色谱法测定步骤（b)洗脱液中的正确折叠和不正确折叠 的依那西普的组合量。
[0206] R.用于纯化蛋白质混合物以从存在于所述混合物中的不正确折叠的依那西普中 分离正确折叠的依那西普的混合模式色谱方法，所述方法包含以下步骤：
[0207] (a)使具有疏水结构部分和离子交换结构部分的混合模式色谱树脂与含包含正确 折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的溶液接触，以使正确折叠的和 不正确折叠的依那西普变为粘附、结合或被捕获在所述混合模式色谱树脂上；和
[0208] (b)使所述混合模式树脂与能够从所述混合模式色谱树脂上洗脱依那西普蛋白质 的溶液接触以得到洗脱液，在所述洗脱液中，正确折叠的依那西普与不正确折叠的依那西 普的量的比例高于在步骤（a)中引入所述树脂的蛋白质混合物中的比例。
[0209] S.根据实施方案R所述方法，其中，所述混合模式色谱树脂是Capto? MMC混合模 式色谱树脂。
[0210] L根据实施方案R所述方法，其中，所述混合模式色谱树脂是Capto? Adhere混 合模式色谱树脂。
[0211] U.根据实施方案A-T所述方法，其中
[0212] (A)不正确折叠的依那西普构成少于约5wt. %的步骤（b)中得到的洗脱液；正确 折叠的依那西普构成多于约90wt%的步骤（b)中得到的洗脱液；且正确折叠和不正确折叠 的依那西普的组合量构成至少约95wt%的步骤（b)中得到的洗脱液；或
[0213] (B)在步骤（b)中得到的洗脱液或其部分包含正确折叠的依那西普且不含或基本 不含不正确折叠的依那西普。
[0214] V.根据实施方案A-U任一项所述方法，其中，所述混合模式树脂是Capto? MMC且 在约4. 5至约7. 5间的pH下实施所述方法的步骤（a)和（b);且通过使所述混合模式树脂 与盐溶液接触实施洗脱步骤（b)。
[0215] W.根据实施方案R-V任一项所述方法，其中，所述混合模式树脂是Capto? Adhere 且在约4. 5至约8. 5的pH下实施步骤（a)和（b);且通过使所述混合模式树脂与盐溶液接 触实施洗脱步骤（b)，所述溶液任选地进一步包含精氨酸。
[0216] X.根据实施方案V或W所述方法，其中，通过盐浓度逐渐增加的梯度将所述盐溶液 应用至步骤（b)中。
[0217] Y.根据实施方案X所述方法，其中，步骤（b)的盐浓度梯度引起盐浓度从约0增加 至约1M。
[0218] Z.根据实施方案V-Y任一项所述方法，其中，所述盐选自氯化钠和硫酸钠。
[0219] AA.根据实施方案R-Z任一项所述方法，其中，在步骤（b)中，接触步骤（b)中所述 树脂的所述溶液的PH逐渐增加或逐渐下降。
[0220] BB.根据实施方案R-AA任一项所述方法，其中，在步骤（b)的洗脱液中得到的正确 折叠的蛋白质的量为存在于在步骤（a)引入所述树脂的蛋白质混合物中的蛋白质的量的 至少约60wt%并优选至少约70wt. %。
[0221] CC.根据实施方案A-BB任一项所述方法，其中，以下面的方式实践所述方法两次 或更多次：
[0222] 通过实施步骤（a)和（b)实施第一混合模式分离（分离#1);然后
[0223] 通过再次实施步骤（a)和（b)实施第二混合模式分离（分离#2);
[0224] 其中，在分离#1的步骤（b)中得到的洗脱液用作在分离#2的步骤（a)中含蛋白 质混合物的溶液。
[0225] DD.根据实施方案CC所述方法，其中，在分离#1中使用的混合模式树脂与在分离 #2中使用的混合模式树脂相同或不同。
[0226] EE.根据实施方案DD所述方法，其中，以选自下面组合的方式实施分离#1和分离 #2 ：
[0227] 分离#1使用CAPTO MMC作为所述混合模式色谱树脂和分离#2使用CAPTO ADHERE 作为所述混合模式色谱树脂；
[0228] ---------
[0229] 分离#1使用CAPTO ADHERE作为所述混合模式色谱树脂和分离#2使用CAPTO MMC 作为所述混合模式色谱树脂；
[0230] --------
[0231] 分离#1使用CAPTO MMC作为所述混合模式色谱树脂和分离#2使用CAPTO MMC作 为所述混合模式色谱树脂；或
[0232] --------
[0233] 分离#1使用CAPTO ADHERE作为所述混合模式色谱树脂
[0234] 分离#2使用CAPTO ADHERE作为所述混合模式色谱树脂。
[0235] FF.根据实施方案EE所述方法，其中，以下面的方式实施分离#1和分离#2 :分离 #1使用CAPTO MMC作为所述混合模式色谱树脂；且分离#2使用CAPTO ADHERE作为所述混 合模式色谱树脂。
[0236] GG.由实施方案A-FF任一项的方法得到的含依那西普的蛋白质混合物，或含所 述混合物的药学上可接受的制剂，其中所述蛋白质混合物以构成大于约90wt.%的蛋白质 混合物的量包含正确折叠的依那西普；且以构成少于约5wt%的蛋白质混合物的量包含 不正确折叠的依那西普；且其中所述蛋白质混合物具有构成至少约95wt.%并优选至少约 98wt.%的含依那西普的蛋白质混合物的正确折叠和不正确折叠的依那西普的组合量。
[0237] HH.适用于施用至需要治疗TNFalpha介导的病况的受试者的含高纯度的依那西 普的药学上可接受的制剂，所述制剂包含含主要量的正确折叠的依那西普和次要量的不正 确折叠的依那西普的蛋白质混合物，其中
[0238] (i)所述不正确折叠的依那西普构成少于约IOwt.%，优选少于约8wt.%且最优 选优选少于约5wt.%的蛋白质混合物；
[0239] (ii)所述正确折叠的依那西普构成多于90wt.%且优选多于约92wt%且最优选 多于约95wt%的蛋白质混合物；和
[0240] (iii)所述正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普（但不包括其聚集体） 的总量构成至少95wt%且优选至少98wt%的蛋白质混合物；
[0241] 其中，所述制剂进一步包括使所述制剂适用于施用至受试者的药学上可接受的非 活性成分、赋形剂或载体。
[0242] II.根据实施方案HH的制剂，其中，所述依那西普制备物构成约25至约75mg/ml 的所述制剂，且所述制剂进一步包含蔗糖、氯化钠、L-精氨酸盐酸盐和磷酸钠。
[0243] JJ.一种制备关于存在其中的正确折叠的相对于不正确折叠的依那西普的量具有 高纯度的含依那西普的蛋白质混合物的方法，所述方法包含以下步骤：
[0244] (1)在哺乳动物表达系统中表达依那西普以得到包含含依那西普的蛋白质混合物 的收获的细胞培养流体，所述含依那西普的蛋白质混合物包含正确折叠的和不正确折叠的 依那西普；
[0245] (2)使在步骤1中得到的收获的细胞培养流体进行纯化过程，借此得到具有减少 量的，或基本无不期望的杂质的存在于步骤1中得到的收获的细胞培养流体中的含依那西 普的蛋白质混合物；
[0246] (3)使步骤⑵中得到的含依那西普的蛋白质混合物与同时具有离子交换结构部 分和疏水作用结构部分的混合模式的色谱树脂接触一次或多次，以使包括在混合物中的蛋 白质附在所述树脂上；和
[0247] (4)使来自步骤3的具有结合在其上的蛋白质的树脂与溶液接触以从所述混合模 式树脂上洗脱正确折叠的依那西普，以得到包含比在步骤3中引入树脂的含依那西普的混 合物具有更高的正确折叠的依那西普对不正确折叠的依那西普比例的含依那西普的蛋白 质混合物的洗脱液；其中
[0248] (i)存在于由步骤2纯化得到的含依那西普的蛋白质混合物中的蛋白质的量为 存在于步骤1中得到的收获的细胞培养流体中的依那西普基蛋白质混合物的量的至少约 80wt% ；
[0249] (ii)存在于步骤4中洗脱的蛋白质混合物中的正确折叠和不正确折叠的依那西 普蛋白质的组合量为其存在于由步骤2得到的蛋白质混合物中的量的至少约60wt.%;
[0250] (iii)存在于步骤4的洗脱液中的正确折叠的依那西普的量为存在于步骤1中得 到的收获的细胞培养流体中的含依那西普的蛋白质混合物的量的至少约30wt. %并优选至 少约35wt. % ;和
[0251] (iv)所述正确折叠的依那西普构成至少约90wt%并优选至少约95wt%的步骤4 中得到的洗出液。
[0252] KK.根据实施方案JJ所述方法，其中，所述混合模式树脂选自由CAPTOMMC和CAPTO ADHERE组成的组。
[0253] LL.根据实施方案JJ或KK所述方法，其包含下面附加的步骤：
[0254] 步骤（5):使在步骤4的洗脱液中得到的蛋白质混合物与同时具有离子交换结构 部分和疏水作用结构部分的混合模式色谱树脂接触，以使包括在所述混合物中的蛋白质附 在所述树脂上，然后；
[0255] 步骤（6):使所述树脂与溶液接触以从中洗脱正确折叠的依那西普，以得到含具 有更高的正确折叠对不正确折叠的依那西普的比例的蛋白质混合物的洗脱液；
[0256] 其中，在所述附加步骤5和6中使用的混合模式树脂与在步骤3和4中使用的混 合模式树脂相同或不同。
[0257] MM.根据实施方案LL所述方法，其中，在步骤⑶和⑷使用的混合模式树脂为 CAPTOMMC且在步骤（5)和（6)中使用的树脂为CAPTOADHERE。
[0258] NN.根据实施方案JJ-MM任一项所述方法，其中，通过使所述混合模式树脂与盐溶 液接触实施步骤4 (和/或在实施方案LL的情况下的步骤6)以从所述混合模式树脂上洗 脱正确折叠的依那西普，且任选地（i)其中在所述溶液与树脂的所述接触期间在步骤（4) 或（6)中盐溶液的浓度逐渐增加；且任选地（ii)在所述溶液与树脂的所述接触期间在步骤 (4)和/或（6)中洗脱溶液的pH逐渐增加或减小。
[0259] 00.根据实施方案JJ-NN任一项所述方法，其中，将在所述方法的一个或多个步骤 中得到的产物进行过滤，例如病毒过滤和/或切向流过滤。
[0260] PP.根据实施方案JJ-OO任一项所述方法，其中，使用蛋白质A色谱柱实施步骤2。
[0261] QQ.根据实施方案JJ-OO任一项所述方法，其中，使用具有疏水和离子交换结构部 分的混合模式树脂实施步骤2。
[0262] RR.根据实施方案A-PP任一项所述方法，其中，得到含至少90wt%正确折叠的依 那西普并优选少于约5wt. %不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物，而不实施任何色谱分 离或纯化步骤以从不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普，除了一个或多个下 面的步骤：
[0263] (1)任选地，一个或多个纯化步骤，优选包含蛋白质A色谱纯化步骤，使用这样的 步骤以纯化含依那西普基蛋白质的收获的细胞培养流体，其中所述纯化步骤不从不正确折 叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普；
[0264] (2)在实施方案A中描述的混合模式色谱法步骤（3)和（4)(或按照实施方案LL 的步骤3, 4, 5和6)中的一个或多个事件；和
[0265] (3)任选地，仅为了分析目的而实施的SEC、HIC或其它分析性色谱步骤的一个或 多个。
[0266] SS.根据实施方案A-RR任一项所述方法，其排除了单一模式疏水作用色谱作为从 不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的方法的使用，除了当实施仅用于分析 的目的时。
[0267] TT.用于治疗患有TNF介导的疾病的受试者的方法，其包含如下步骤：将含包含正 确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的药物制剂施用于这样的个 体，通过实施方案A-SS任一项所述方法得到所述混合物，其中在所述蛋白质混合物中不正 确折叠的依那西普的量为少于约5wt%的所述混合物。
[0268] UU.根据实施方案TT所述方法，其中，蛋白质混合物中不正确折叠的依那西普的 量为少于约3wt%的所述混合物，且所述混合物中正确折叠的依那西普的量大于约95wt% 的所述混合物。
[0269] VV.用于治疗患有TNF介导的疾病的受试者的方法，其包含如下步骤：将含包含正 确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的药物制剂施用于这样的个 体，其中在所述蛋白质混合物中不正确折叠的依那西普的量为少于约5wt%的所述混合物。
[0270] Wff.根据实施方案TT-VV所述方法，其中，蛋白质混合物中不正确折叠的依那西 普的量为少于约3wt%的所述混合物，且所述混合物中正确折叠的依那西普的量大于约 95wt %的所述混合物。
[0271] XX.根据实施方案TT-VV任一项所述方法，其中，正确折叠和不正确折叠的依那西 普（不包括其聚集体）的组合量为所述混合物的至少约95wt%。
[0272] YY.根据实施方案XX所述方法，其中，正确折叠和不正确折叠的依那西普（不包括 其聚集体）的组合量为所述混合物的至少约98wt%。
[0273] ZZ.根据实施方案A-YY任一项所述方法或组合物，其中，除非另有说明，术语"不 正确折叠的依那西普"理解为包括含正确折叠和/或不正确折叠的依那西普的聚集体。
[0274] AAA.根据实施方案JJ-QQ所述方法，其中，用Fc酶联免疫吸附测定法测定包括在 步骤1的收获的细胞培养物中的依那西普基蛋白质的量。
[0275] BBB.根据实施方案JJ-QQ任一项所述方法，其中，通过在A280处的UV吸光度测定 存在于由步骤4 (或在实施方案LL的情况下，步骤4和6)中混合模式树脂得到的洗脱液中 的依那西普基蛋白质的量。
[0276] CCC.根据实施方案BBB所述方法，其中，通过在A280处的UV吸光度或Fc酶联免 疫吸附测定法测定存在于由步骤2的纯化过程得到的产物中的依那西普基蛋白质的量。
[0277] DDD.用于从不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的方法，其中，使 用色谱方法以实现该分离，且其中所述色谱方法仅由或基本由混合模式色谱法组成，所述 混合模式色谱法中包含正确折叠和不正确折叠的依那西普的混合物与具有离子交换结构 部分和疏水结构部分的混合模式色谱树脂接触，然后从其洗脱，以得到含至少约85wt%并 优选至少约90wt%并最优选至少约95wt%正确折叠的依那西普的洗脱液。
[0278] EEE.根据实施方案DDD所述方法，其中，所述混合模式树脂选自CAPTO MMC和 CAPTO ADHERE ;用盐溶液实施洗脱，任选地使用渐增的盐浓度的梯度实施洗脱；盐溶液的 pH在约4至约8. 5的范围内，任选地以pH逐渐增加或下降的梯度实施；且其中在一段时间 内从所述树脂得到洗脱液，且在所述时间段的早期收集的洗脱液不含或基本不含不正确折 叠的依那西普。
【主权项】
1. 一种用于从不正确折叠的蛋白质中分离正确折叠的蛋白质的混合模式色谱分析方 法，其包含以下步骤： (a) 将同时含给定蛋白的正确折叠和不正确折叠构象的第一蛋白混合物与同时具有离 子交换结构部分和疏水结构部分的混合模式色谱树脂结合； (b) 从所述混合模式树脂上洗脱正确折叠的蛋白质以得到第二蛋白混合物，所述第二 蛋白混合物含比所述第一蛋白混合物更高比例的正确折叠蛋白。2. 根据权利要求1所述方法，其中，所述混合模式色谱树脂是Capto?MMC混合模式色 谱树脂。3. 根据权利要求1所述方法，其中，所述混合模式色谱树脂是Capto?Adhere混合模 式色谱树脂。4. 根据权利要求1所述方法，其中，所述正确折叠和不正确折叠的蛋白质构象包含正 确折叠的和不正确折叠的依那西普。5. 根据权利要求4所述方法，其中，所述不正确折叠的依那西普构成少于约IOwt. %， 并优选少于约5wt. %的步骤（b)中得到的洗脱液；所述正确折叠的依那西普构成多于约 90wt%并优选多于约95wt%的步骤（b)中得到的洗脱液；且正确折叠的和不正确折叠的依 那西普的组合量构成至少约95wt%并优选至少约98wt%的步骤（b)中得到的洗脱液。6. 根据权利要求5所述方法，其中，所述混合模式树脂是Capto?MMC且在约4. 5至约 7. 5间的pH下实施所述方法的步骤（a)和（b);且通过使所述混合模式树脂与盐溶液接触 实施洗脱步骤（b)。7. 根据权利要求5所述方法，其中，所述混合模式树脂是CaptoTMAdhere且在约4. 5 至约8. 5的pH下实施步骤（a)和（b);且通过使所述混合模式树脂与盐溶液接触实施洗脱 步骤（b)，所述溶液任选地进一步包含精氨酸。8. 根据权利要求6所述方法，其中，通过盐浓度逐渐增加的梯度将所述盐溶液应用至 步骤（b)中。9. 根据权利要求8所述方法，其中，步骤（b)的盐浓度梯度引起盐浓度从约0增加至约 IM010. 根据权利要求6所述方法，其中，所述盐选自氯化钠和硫酸钠。11. 根据权利要求1所述方法，其中，在步骤（b)中，与步骤（b)中树脂接触的溶液的 pH是逐渐变化的。12. 根据权利要求1所述方法，其中，在步骤（b)的洗脱液中得到的正确折叠的蛋白质 的量为在步骤（a)中引入所述树脂的蛋白质混合物中存在的蛋白质的量的至少约60wt%。13. 根据权利要求12所述方法，其中，正确折叠的蛋白质的量为在步骤（a)中引入所述 树脂的蛋白质混合物中存在的蛋白质的量的至少约70wt. %。14. 根据权利要求1所述方法，其中，得到包含至少90wt%正确折叠的依那西普且优 选少于约5wt. %不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物，而不实施，或不需要实施任何色 谱分离或纯化步骤以从不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普，除了下面的步 骤： (1) 一个或多个纯化步骤，优选包含蛋白质A色谱纯化步骤，其中使用这样的步骤以纯 化含依那西普基蛋白质的收获的细胞培养流体，且其中这样的纯化步骤不导致从不正确折 叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的任何可评估的分离； (2) 在权利要求1中描述的混合模式色谱法步骤（a)和（b);和 (3) 仅为了分析目的而实施的SEC、HIC或其它分析性色谱步骤。15. 根据权利要求1所述方法，其中，通过在A280处的UV吸光度测定步骤（b)的洗脱 液中存在的蛋白质的量；通过疏水作用色谱法测定步骤（b)的洗脱液中正确折叠的依那西 普的量；且通过尺寸排阻色谱法测定步骤（b)的洗脱液中存在的正确折叠的和不正确折叠 的依那西普的组合量。16. 根据权利要求1所述方法，其中，以下面的方式实践所述方法两次或更多次： 通过实施步骤（a)和（b)实施第一混合模式分离（分离#1);然后 通过再次实施步骤（a)和（b)实施第二混合模式分离（分离#2); 其中，在分离#1的步骤（b)中得到的洗脱液用作在分离#2的步骤（a)中的含蛋白质 混合物的溶液。17. 根据权利要求16所述方法，其中，在分离#1中使用的混合模式树脂与在分离#2中 使用的混合模式树脂相同或不同。18. 根据权利要求16所述方法，其中，以选自下面组合的方式实施分离#1和分离#2 : 分离#1使用CAPTOMMC作为所述混合模式色谱树脂且分离#2使用CAPTOADHERE作 为所述混合模式色谱树脂； 分离#1使用CAPTOADHERE作为所述混合模式色谱树脂且分离#2使用CAPTOMMC作 为所述混合模式色谱树脂； 分离#1使用CAPTOMMC作为所述混合模式色谱树脂且分离#2使用CAPTOMMC作为所 述混合模式色谱树脂；或 分离#1使用CAPTOADHERE作为所述混合模式色谱树脂 分离#2使用CAPTOADHERE作为所述混合模式色谱树脂。19. 根据权利要求18所述方法，其中，以下面的方式实施分离#1和分离#2 :分离#1使 用CAPTOMMC作为所述混合模式色谱树脂；且分离#2使用CAPT0ADHERE作为所述混合模式 色谱树脂。20. -种根据权利要求1的方法得到的含依那西普的蛋白质混合物，或含所述混合物 的药学上可接受的制剂，其中所述蛋白质混合物以构成大于约90wt. %的蛋白质混合物的 量包含正确折叠的依那西普；且以构成少于约5wt%的蛋白质混合物的量包含不正确折叠 的依那西普；且其中所述蛋白质混合物具有构成至少约95wt. %并优选至少约98wt. %的 含依那西普的蛋白质混合物的正确折叠和不正确折叠的依那西普的组合量。21. 适用于施用至需要治疗TNFalpha介导的病况的受试者的含高纯度依那西普的药 学上可接受的制剂，所述制剂包含含主要量的正确折叠的依那西普和次要量的不正确折叠 的依那西普的蛋白质混合物，其中 (i)所述不正确折叠的依那西普构成少于约IOwt. %，优选少于约8wt. %且最优选少 于约5wt. %的所述蛋白质混合物； (ii) 所述正确折叠的依那西普构成多于90wt. %且优选多于约92wt%且优选多于约 95wt%的所述蛋白质混合物；和 (iii) 正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普（但不包括其聚集体）的总量构 成至少95wt%且优选至少98wt%的所述蛋白质混合物； 其中，所述制剂进一步包括使所述制剂适用于施用于受试者的药学上可接受的非活性 成分、赋形剂或载体。22. 根据权利要求21所述制剂，其中，所述依那西普制备物构成约25至约75mg/ml的 所述制剂，且所述制剂进一步包含蔗糖、氯化钠、L-精氨酸盐酸盐和磷酸钠。23. -种用于制备关于存在其中的正确折叠依那西普相对于不正确折叠的依那西普的 量具有高纯度的含依那西普的蛋白质混合物的方法，所述方法包含以下步骤： (1) 在哺乳动物表达系统中表达依那西普以得到包含含依那西普的蛋白质混合物的收 获的细胞培养流体，所述含依那西普的蛋白质混合物包含正确折叠的和不正确折叠的依那 西普； (2) 使在步骤1中得到的收获的细胞培养流体进行纯化过程，借此得到具有减少量的， 或基本无不期望的杂质的存在于在步骤1中得到的收获的细胞培养流体中的含依那西普 的蛋白质混合物； (3) 使步骤（2)中得到的含依那西普的蛋白质混合物与同时具有离子交换结构部分和 疏水作用结构部分的混合模式的色谱树脂接触一次或多次，以使包括在混合物中的蛋白质 附在所述树脂上；和 (4) 使来自步骤3的具有结合在其上的蛋白质的树脂与溶液接触以从所述混合物模式 树脂上洗脱正确折叠的依那西普，以得到比在步骤3中引入树脂的含依那西普的混合物具 有更高的正确折叠的依那西普对不正确折叠的依那西普的比例的含依那西普的蛋白质混 合物的洗脱液； 其中： (i) 存在于由步骤2纯化得到的含依那西普的蛋白质混合物中的蛋白质的量为存在于 步骤1中得到的收获的细胞培养流体中的依那西普基蛋白质混合物的量的至少约80wt% ; (ii) 存在于步骤4中洗脱的蛋白质混合物中的正确折叠和不正确折叠的依那西普蛋 白质的组合量为其存在于由步骤2得到的蛋白质混合物中的量的至少约60wt. % ; (iii) 存在于步骤4的洗脱液中的正确折叠的依那西普的量为存在于步骤1中得到的 收获的细胞培养流体中的含依那西普的蛋白质混合物的量的至少约30wt. %并优选至少约 35wt. % ;和 (iv) 所述正确折叠的依那西普构成至少约90wt%并优选至少约95wt%的步骤4中得 到的洗脱液。24. 根据权利要求23所述方法，其中所述混合模式树脂选自由CAPTOMMC和CAPTO ADHERE组成的组。25. 根据权利要求24所述方法，其包括下面附加的步骤： 步骤（5):使在步骤4的洗脱液中得到的蛋白质混合物与同时具有离子交换结构部分 和疏水作用结构部分的混合模式色谱树脂接触，以使包括在所述混合物中的蛋白质附在所 述树脂上，然后； 步骤（6):使所述树脂与溶液接触以从中洗脱正确折叠的依那西普，以得到含具有更 高的正确折叠对不正确折叠的依那西普的比例的蛋白质混合物的洗脱液； 其中，在所述附加步骤5和6中使用的混合模式树脂与在步骤3和4中使用的混合模 式树脂相同或不同。26. 根据权利要求25所述方法，其中，在步骤（3)和（4)中使用的混合模式树脂为 CAPTOMMC且在步骤（5)和（6)中使用的树脂为CAPTOADHERE。27. 根据权利要求1所述方法，其排除了单一模式疏水作用色谱作为从不正确折叠的 依那西普中分离正确折叠的依那西普的方法的使用，除了当实施仅用于分析的目的时。28. 用于治疗患有TNF介导的疾病的受试者的方法，其包含如下步骤：将含包含正确折 叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的药物制剂施用于这样的个体，其 中在所述蛋白质混合物中不正确折叠的依那西普的量为少于约5wt%的所述混合物。29. 根据权利要求28所述方法，其中，蛋白质混合物中不正确折叠的依那西普的量为 少于所述混合物的约3wt%，且所述混合物中正确折叠的依那西普的量大于所述混合物的 约 95wt%。30. 用于从不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的方法，其中使用色谱 方法以实现该分离，且其中所述色谱方法仅由或基本由混合模式色谱法组成，所述混合模 式色谱法中包含正确折叠和不正确折叠的依那西普的混合物与具有离子交换结构部分和 疏水结构部分的混合模式色谱树脂接触，然后从其洗脱，以得到含至少约85wt%并优选至 少约90wt%并最优选至少约95wt%正确折叠的依那西普的洗脱液。31. 根据权利要求30所述方法，其中，所述混合模式树脂选自CAPTOMMC和CAPTO ADHERE;用盐溶液实施洗脱，任选地使用渐增的盐浓度的梯度实施洗脱；盐溶液的pH在约4 至约8. 5的范围内，任选地以pH逐渐增加或下降的梯度实施；且其中在一段时间内从所述 树脂得到洗脱液，且在所述时间段的早期收集的洗脱液不含或基本不含不正确折叠的依那 西普。
【专利摘要】提供了一种用于从给定蛋白质的不正确折叠的构象中分离正确折叠的构象的混合模式色谱方法。所述方法在以商业上吸引人的产量从不正确折叠的依那西普和聚集体中分离正确折叠的依那西普方面是高度有效的，能够提供在正确折叠的依那西普对不正确折叠的依那西普方面具有非常高纯度的依那西普制备物。本发明进一步涉及通过本发明方法得到的含正确折叠的蛋白质的蛋白质制备物和制剂，和使用由所述混合模式方法得到的高纯度制备物治疗的方法。
【IPC分类】A61K38/16
【公开号】CN104902914
【申请号】CN201380058650
【发明人】荒川力, 道格拉斯·法勒
【申请人】科荣生生物科学公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年9月10日
【公告号】CA2882551A1, EP2895188A1, US20140072560, WO2014043103A1
【技术领域】
[0001] 本发明通常涉及用于纯化重组表达的蛋白质的层析分离方法，和从该方法得到的 产物。更具体地，本发明涉及使用混合模式的层析法以纯化重组蛋白表达产物，包括，例如， 可能包括不期望量的非正确折叠的和/或聚集的蛋白质和适当折叠的蛋白质的融合蛋白。 本发明的混合模式层析方法特别有用于从不正确折叠的依那西普（如本文所定义的）中分 离正确折叠的依那西普。本发明也涉及依那西普制备物和药物制剂，其中已使用本公开的 方法高产率和高纯度地制备供应其中的依那西普。本发明进一步涉及采用高纯度的以非常 低水平的错误折叠的/聚集的蛋白质为特征的依那西普治疗TNF病况的方法。
【背景技术】
[0002] 依那西普（Enbrel?，Immunex Corporation制造）是由与人类免疫球蛋白 G( "IgGl"）的Fc受体[片段，可结晶的]区域连接的人类75千道尔顿（p75)肿瘤坏死因 子受体（"TNFR"）的细胞外配体结合部分组成的二聚融合多肽。依那西普由934个氨基 酸组成并具有约150千道尔顿的表观分子量（Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company, Inc.)。依那西普的Fe成分包含重链恒定结构域2 (CH2)、重链恒定结 构域3 (CH3)和铰链区，但不包括人类IgGl的重链恒定结构域I (CHl)。一个Fc域可包括一 个或所有的上述域。
[0003] 患有一些类型的炎性疾病例如风湿性关节炎、斑块状银肩病、银肩病关节炎、幼年 特发性关节炎和强直性脊柱炎的人具有过度产生肿瘤坏死因子（"TNF"）的免疫系统。已 发现施用依那西普对治疗一些炎性疾病是有效的，因为它可通过作为诱饵受体结合TNF而 降低受试者中活化型TNF的水平。
[0004] 可通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢（"CH0"）的哺乳动物细胞表达系统中以已 知的方式产生依那西普。不幸的是，由CHO细胞产生的产物包含大量的不正确或错误折叠 和/或聚集的依那西普。对于药物应用，需要提供相对没有不正确折叠的和聚集的蛋白质 的依那西普，因为所述不正确折叠的/聚集的蛋白质将不具有与正确折叠的蛋白质相同的 治疗效果，且可能实际上对患者是有害的。
[0005] 错误折叠和聚集经常发生在产生重组蛋白的过程中，并因此必须通过能够从错误 折叠或聚集的蛋白质中分离正确折叠的蛋白质的下游过程进行处理。错误折叠减少或消除 蛋白质的治疗效果。通常被理解为涉及两种或更多种依那西普同源二聚体的非共价联合以 形成非常高分子量物种的聚集导致相似的治疗效果的损失，且当蛋白质（包括错误折叠的 蛋白质）积累并聚在一起时，聚集发生。如上所述，这样的错误折叠的蛋白质和蛋白质聚集 体不仅是治疗无效的，也可能是对患者有害的。相应地，纯化含依那西普的蛋白质表达产物 以使适当折叠的依那西普从错误和/或积聚的依那西普中分离的能力对于得到提供最高 可能程度的药物可接受性的依那西普是重要的。
[0006] 错误折叠和聚集的蛋白质的产生不是特定于依那西普的问题。具有许多治疗性蛋 白质，对其来说错误折叠可能是一个问题。例如，在来自大肠杆菌包涵体的重组蛋白重折叠 的过程中，含二硫化物的蛋白质的错误折叠是难以避免的，但其可通过高分辨率的反相色 谱法而被有效分离。然而，在反相色谱法中低pH和有机溶剂的使用在色谱分析过程中可使 蛋白质变性并可能引起纯化的蛋白质的聚集。
[0007]即使当错误折叠被认为在制备药物蛋白质中是可忽略的时，例如在哺乳 动物分泌性表达的情况下，仍可能发生聚集和一些错误折叠（参见，例如，Chi，E. Y.,Krishnan,S. , Randolph, T. W. and Carpenter, J. F. , Physical Stability of Proteins in Aqueous Solution:Mechanism and Driving Forces in Nonnative Protein Aggregation,Pharm.Res.,20, 1325-1336 (2003) ；Kiese,S.,Pappenber ger,A.,Friess, W. , and Mahler,H. C. , Shaken, Not Stirred:Mechanical Stress Testing of an IgGlAntibodyj J. Pharm. Sci. , 97, 4347-4366 (2008)) 〇 研究者已 在非变性条件下成功分离出非原生的、错误折叠的蛋白质，所述分离使用利用离子 交换的水性色谱分析法（"IEC"）（参见，例如，Gagnon，P. J.，Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography in the Presence of Polyethylene Glycol，Immunol. Methods，336, 222-228 (2008) ;Gagnon，P.，Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems，Tucson，AZ，57-87(1996) ；Shukla,A. A. , and Yigzaw, Y. , Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry,Shukla,A.,Etzel,M., and Gadam，S.，eds.，179-227, CRC Press, Boca Raton (2007) ；Staby, A. , Jacobsen, J. H. , Hansen, R. G. , Bruus, U. K. , Jensen, I. H., Comparison of Chromatographic Ion-exchange Resins. V. Strong and Weak Cation-Exchange Resins,J.Chromatogr. A, 1118, 168-179(2006) ；ShukIa,A. A. , Hub bard,B. ,Tressel,T. ,Guhan, S. , Low, D. J. , Downstream Processing of Monoclonal Antibodies-Application of Platform Approaches，Chromatogr. B，848,28-39 (2007)； Shihara,T.,Kadoya, T. J. , Accelerated Purification Process Development of Monoclonal Antibodies for Shortening Time to Clinic:Design and Case Study of Chromatography Processes，Chromatogr.A，1176，149-156 (2007) ；Fahrner,R. L. , Knudsen, H. L. , Basey, C. D. , Galan, W. , Feuerhelm, D. , Vanderlaan, M. , Blank, G. S., Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies:Development,Ope ration,and Validation of Chromatography Processes, Biotechnol. Genet. Eng. Rev.，18, 301-27 (2001);和 Yigzaw，Y.，Hinckley，P.，Hewig，A. and Vedantham，G.，Ion Exchange Chromatography of Proteins and Clearance of Aggregates, Curr. Pharm. Biotech.，10, 421-426 (2009))、利用疏水相互作用的水性色谱分析法（"HIC"）（参见， 例 如，Chen，J.，Tetrault，J.，Ley，A.，Comparison of Standard and New Generation Hydrophobic Interaction Chromatography Resins in the Monoclonal Antibody Purification Process,J.Chromatogr.A., 1177,272-81 (2008) ;Gagnon，P.，and Grund，E.，Large Scale Process Development for Hydrophobic Interaction Chromatography, Part 4:Controlling Selectivity,BioPharmj 9, 54-64(1996)； 和 Lu,Y. , Williamson, B. , and Gillespie, R. , Recent Advancement in Application of Hydrophobic Interaction Chromatography for Aggregate Removal in Industrial Purification Process，Curr. Pharm. Biotech.，10, 427-33(2009))和羟基磷灰石（"HA"） 色谱分析法（参见，例如Aoyama，K.，Chiba，J.，Separation of Molecular Forms of Mouse IgG and IgM Monoclonal Antibodies in High Performance Liquid Chromatography on Spherical Hydroxyapatite Beads,J. Immunol. Methods, 162, 201-210 (1993)； Luellau,E. ,Marison, W. , von Stockar，IL，Ceramic Hydroxapatite: A New Tool for Separation and Analysis of IgA Monocolonal Antibodies, in Animal Cell Techn ology, Carondo, M. , ed. ,Kluwer Academic Publishers, Netherlands,265-269 (1997)； Luellau,E., von Stockar, U. , Vogt, S. , Freitag, R. , Development of a Downstream Process for the Isolation and Separation of Monoclonal Immunoglobulin A Monomer, Dimers, and Polymers from Cell Culture Supernatant, J. Chomatogr. A.，796，165-175 (1998) ;Yamakawa，Y.，Chiba，J.，High Performance Liquid Chromatography of Mouse Monoclonal Antibodies on Spherical Hydroxyapatite Beads, J. Liquid. Chromatogr. , 11, 665-681 (1998) ；Coppola, G. , Underwood, J. , Cartwrigh t, G. , Hearn, M. T. , High-performance Liquid Chromatography of Amino Acids，Peptides and Proteins:XCIII. Comparison of Methods for the Purification of Mouse Monoclonal Immunoglobulin M Autoantibodies,J. Chromatogr. A. , 476, 269-290(1989)； Josics, D. , Loster, K. , Kuhlj R. , Noll, F. , Reusch, J. , Purification of Monoclonal Antibodies by Hydroxylapatite HPLC and Size Exclusion HPLCj Biol.Chem. Hoppe-Seylars，372，149-156 (1991) ;Gagnon，P.，and Beam,K. , Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography，Curr. Pharm. Biotech. (2008))〇 [0008] 现有教导例如上述引用的这些还未证实对于从不正确折叠的依那西普中分离正 确折叠的依那西普的应用是有用的，因为它们不能提供定性和/或定量充足的样品。相应 地，在本领域中需要有效和高效的分离技术，以与能够提供非常高纯度（即，不正确折叠的 依那西普不存在或以非常低的水平存在）和在商业上有吸引力的产量的依那西普制备物 的、CHO细胞产生的依那西普联用。
[0009] 本发明采用号称的"混合模式"色谱分析法。当采用至少两种不同的力以结合蛋 白质时，用于纯化重组表达的蛋白质的色谱分析法可通常被称为"混合模式"，并可从不需 要的物质中分离所需的蛋白质产物，所述不需要的物质可存在于含所需蛋白质和不需要的 杂质的相对不纯的表达产物中。这些力可包括，例如，静电力和疏水力。
[0010] 混合模式色谱分析法以与更加传统的色谱分析技术相似的方式运作，因为具有固 定相和流动相。所述固定相通常为不溶性树脂或凝胶，通常被称为色谱树脂，其提供分离的 基础。所述树脂包含在允许液体通过并接触所述树脂的柱中。与树脂连接的选择的化学基 团或结构部分（moiety)的存在使所述色谱树脂从不需要的物质中分离所需物质的能力成 为可能。这些连接的基团，通常称为配体，赋予树脂必要的亲和性质（即，由配体中存在的 离子交换结构部分产生的静电吸引性质，和由配体中存在的疏水结构部分产生的疏水引力 性质），从而使所述树脂能够结合不纯样品中的一些蛋白质材料，而不是其它材料，当允许 含所述不纯样品的溶液流经所述色谱柱与所述树脂接触时。
[0011] 包含具有这些亲和基团的树脂的色谱柱的固定相塞满所述色谱柱的内部，所述色 谱柱通常是一个刚性圆柱体容器，流体可在一端被引入其中，接触所述树脂，然后在另一端 离开所述柱。通过将蛋白质产物放入适当的溶液中并允许所述溶液（称为流动相）经过所 述柱，可将含将被纯化的蛋白质的溶液引入（并因此允许其流过）所述柱。当将被纯化的 蛋白质产物（称为分析物）以流动相存在于柱中中时，在所述柱和所述流动相间达到平衡 状态，意味着蛋白质溶液中的一些物质将依附、结合或粘贴或被亲合基团捕捉到所述柱树 脂上，而所述产物中剩余的物质将不附在所述柱上，而是将流过并流出所述柱，在那儿其可 被收集用于分析、进一步加工，或其可被排放。
[0012] 一旦蛋白质分析物已以上述的方式结合到所述柱上，将使用洗涤步骤（通常称为 洗脱步骤）以从所述柱上洗脱或释放所结合的分析物。根据存在于树脂上以使分析物和所 述柱结合的亲和配体的类型（例如，基于电荷的结构部分或疏水部分，或它们的组合，等）， 用于从所述柱上洗脱或释放分析物的溶液必须对分析物和/或配体具有可克服分析物对 所述树脂的亲和力或吸引力的亲和力或吸引力（例如电荷性质、疏水性质、pH特性、盐浓度 等），从而使所述分析物从所述树脂（上述提到的固定相）上释放并进入洗脱介质（流动 相）。一旦被释放或洗脱至流动相，然后所述分析物可流过并流出所述色谱柱用于最后的收 集、分析等，或转移到进一步纯化的方法或过滤步骤。可理解的是，无论吸引性能或亲和性 能引起分析物结合至色谱树脂上（例如，电荷性能或疏水性能），后续用于洗脱或释放所述 分析物的流动相溶液都必须具有相互矛盾的一套性质以使所述分析物然后"优选"存在于 所述洗脱介质中而不是保持被捕获在所述柱树脂上。
[0013] 与其它单模式色谱分析技术相比，所谓的混合模式色谱分析法独特之处在于多种 结合和洗脱因素可相互依赖并可彼此相对。例如，当分析物的带电特性相对于所述柱树脂 的吸引力具有更强的对于洗脱介质的吸引力（倾向）时，在传统单一模式的离子交换色谱 分析法中，增加流动相的离子强度可引起树脂结合的分析物的洗脱或释放。然而，在混合 模式的色谱分析方法中，其中色谱树脂使用静电引力和疏水引力以结合分析物，增加流动 (洗脱）相的离子强度可引起样品物质从所述柱中释放，这是基于所述物质的电荷性质，同 时引起或增强分析物中疏水物质的结合，因为这样的疏水蛋白物质一在基于电荷的洗脱介 质存在下一相对于所述洗脱介质的带电环境，将倾向于具有更强的吸引力或优选以与所述 柱的疏水配体结合。相应地，虽然盐浓度的增加可确实引起从固定相置换带电蛋白物质的 倾向，当流动相中的带电离子与蛋白质竞争固定相上的结合位点时一然而，可能具有更高 程度的疏水性能的分析物产物混合物的那些部分可具有增强的保持与所述混合模式的色 谱柱的疏水结构部分结合的倾向。在任何给定的蛋白质分离情况下，利用这些现象的能力 几乎不能被认为是可预测的。
[0014] 混合模式树脂的两个实例为Capto? MMC和Capto? Adhere (可购自 GEHealthcare) oCapto? MMC利用附着于固体支撑基质的配体，其可通过阳离子交换（使用 它的羧基基团）、氢键结合和疏水作用与分析物相互作用。Capto? MMC的配体示例如下：
[0015]
[0016] Capto? Adhere与Capto? MMC相似之处在于它也米用附着于固体支撑基质的配 体。所述配体，N-苄基-N-甲基乙醇胺，也通过阴离子交换、氢键结合和疏水作用与分析物 相互作用。Capto? Adhere配体示例如下：
[0018] 在这两个配体中，疏水作用预期是弱的。因此，如果这些配体仅具有疏水结构部分 (没有电荷），那么它们将最可能需要盐析（蛋白质沉淀）条件用于蛋白质结合。然而，具 有静电作用可使如此弱的疏水作用足以提供额外的结合力。
【发明内容】
[0019] 本发明的前提是根据如下事实：可使用混合模式色谱分析法，例如使用Capto? MMC和Capto? Adhere作为混合模式色谱树脂，以纯化含正确折叠和不正确折叠蛋白质的 混合物的分析物，包括，例如，含正确折叠和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物，借此 正确折叠的蛋白质可以高效的方式和优异的产量从不正确或错误折叠的蛋白质中有效分 离，以得到高度富集所需的、正确折叠的蛋白质的蛋白质制备物。此外，本发明包含实践本 文描述的混合模式的色谱分离的能力，所述实践以使从所述色谱分离中得到可不含或基本 不含错误折叠产物（如果需要的话）的洗脱产物的方式进行，虽然可以理解，为了平衡产量 和纯度的目的，可能发现包括非常低水平的不正确折叠的产物（例如，少于5wt%并优选少 于3wt% )是可接受的以使产量最大化至所需的范围。
[0020] 相应地，在第一实施方案中，本发明是用于从不正确折叠的蛋白质中分离正确折 叠的蛋白质的混合模式色谱法，其包含以下步骤：(a)将同时含给定蛋白的正确折叠和不 正确折叠构象的第一蛋白混合物与同时具有离子交换结构部分和疏水结构部分的混合模 式色谱树脂结合；(b)从混合模式树脂上洗脱正确折叠的蛋白质以得到第二蛋白混合物， 所述第二蛋白混合物包含比所述第一蛋白混合物更高比例的正确折叠蛋白。术语"更高比 例"指在步骤（b)的洗脱液中正确与不正确折叠蛋白的比例至少高于1:1，但最优选高于 约8:2并优选高于约9:1。所述第二蛋白混合物最优选以构成第二蛋白混合物的至少约 95wt %的量包含正确折叠的蛋白。
[0021] 在第二实施方案中，所述方法涉及用于纯化蛋白质混合物以从存在于所述混合物 中的不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的混合模式色谱法，所述方法包括 以下步骤：(a)使具有疏水结构部分和离子交换结构部分的混合模式的色谱树脂与含包含 正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的溶液接触，以使正确和不 正确折叠的依那西普粘附、结合或捕获在所述混合模式的色谱树脂上；和（b)使所述混合 模式的树脂与能够从所述混合模式的色谱树脂上洗脱依那西普蛋白质的溶液接触以得到 洗脱液，在该洗脱液中，正确折叠的依那西普的量与不正确折叠的依那西普的量的比率较 高，并优选比在步骤（a)中引入所述树脂的蛋白质混合物中的比率要高很多。
[0022] 第三实施方案中，本发明涉及一种含依那西普的蛋白质混合物，或含所述混合物 的药学上可接受的制剂，其是根据上述方法的实施方案得到且其中所述蛋白质混合物以构 成大于约90wt%的蛋白质混合物的量包含不正确折叠的依那西普；并以构成少于约5wt% 的蛋白质混合物的量包含不正确折叠的依那西普；且其中所述蛋白质混合物具有构成至少 约95wt. %并优选至少约98wt. %的含依那西普的蛋白质混合物的正确折叠和不正确折叠 的依那西普的组合量。可使用疏水作用色谱（单模式）确定正确折叠和不正确折叠的依那 西普的量。可使用尺寸排阻色谱（"SEC"）确定正确折叠和不正确折叠的依那西普的组合 量。如本文所用，术语"依那西普基蛋白质混合物"或"含依那西普的蛋白质混合物"或"依 那西普制备物"或"依那西普基物质"等，应理解为同义词且意在表示这样的一种蛋白质混 合物，其中主要成分包含正确折叠的依那西普且次要成分可包含截短的（clipped)依那西 普、不正确折叠的依那西普、聚集的依那西普（例如由正确和/或不正确折叠的依那西普组 成的聚集体），或依那西普片段。本发明提供产生在药物制剂中用作活性成分的依那西普基 蛋白质混合物（或依那西普制备物）的能力，其中在所述药物制剂中需要使正确折叠的依 那西普的量最大化，同时使不正确折叠的（包括聚集的）依那西普的量最小化，至比目前已 达到的更高的范围。
[0023] 在第四实施方案中，本发明涉及一种药物上可接受的制剂，其包含适用于向需要 对TNF介导的病况进行治疗的受试者施用高纯度的依那西普，所述制剂含包含主要量的正 确折叠的依那西普和次要量的不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物，其中：（i)所述不 正确折叠的依那西普构成少于约IOwt. %，优选少于约8wt. %且最优选少于约5wt. %的蛋 白质混合物；（ii)所述正确折叠的依那西普构成多于90wt. %且优选多于约92wt%且最优 选多于约95wt%的蛋白质混合物；和（iii)所述正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那 西普（但不包括其聚集体）的总量构成至少95wt %且优选至少98wt %的蛋白质混合物；其 中所述制剂进一步包括使所述制剂适用于施用于受试者的药学上可接受的非活性成分、赋 形剂或载体。
[0024] 在第五实施方案中，本发明是一种用于制备关于存在其中的正确折叠的相对于不 正确折叠的依那西普的量具有高纯度的含依那西普的蛋白质混合物的方法，所述方法包含 以下步骤：（1)在哺乳动物表达系统中表达依那西普以得到包含含依那西普的蛋白质混合 物的收获的细胞培养流体，所述含依那西普的蛋白质混合物包含正确折叠的和不正确折叠 的依那西普；（2)使在步骤1中得到的收获的细胞培养流体进行纯化过程，借此得到含依那 西普的蛋白质混合物，同时，步骤（1)中产生的收获的细胞培养流体中具有减少量的不需 要的杂质，或基本不含不需要的杂质（即，非依那西普基蛋白质）的；（3)使步骤（2)中得到 的含依那西普蛋白质混合物与同时具有离子交换结构部分和疏水作用结构部分的混合模 式的色谱树脂接触一次或多次，以使包括在混合物中的蛋白质附在所述树脂上；和（4)使 来自步骤3的具有结合在其上的蛋白质的混合模式树脂与能够从所述混合模式树脂上洗 脱正确折叠的依那西普的溶液接触，以得到包含含依那西普的蛋白质混合物的洗脱液，所 述含依那西普的蛋白质混合物具有比步骤3中引入树脂的含依那西普的混合物更高的正 确折叠的依那西普对不正确折叠的依那西普比例；且其中（i)存在于由步骤2纯化得到的 含依那西普蛋白质混合物中的蛋白质的量为存在于步骤1中得到的收获的细胞培养流体 中的依那西普基蛋白质混合物的量的至少约80wt%并最优选至少约85wt% ;(ii)存在于 步骤4中洗脱的蛋白质混合物中的正确折叠和不正确折叠的依那西普蛋白质的组合量为 其存在于由步骤2得到的蛋白质混合物中的量的至少约60wt. %; (iii)存在于步骤4的洗 脱液中的正确折叠的依那西普的量为存在于步骤1中得到的收获的细胞培养流体中的含 依那西普蛋白质混合物的量的至少约30wt. %并优选至少约34wt. % ;和（iv)所述正确折 叠的依那西普构成步骤4中得到的洗脱液的至少约90wt%并优选至少约95wt%的。
[0025] 在第六实施方案中，本发明涉及用于治疗患有TNF介导的疾病的受试者的方法， 其包含将含包含正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的药物制 剂施用于这样的个体的步骤，所述混合物为通过上述任一方法得到的，且其中在所述蛋白 质混合物中不正确折叠的依那西普的量为少于约IOwt. %并优选少于约5wt%的所述混合 物。
[0026] 在第七实施方案中，本发明涉及一种治疗患有TNF介导的疾病的受试者的方法， 其包含将含包含正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的药物制 剂施用于这样的个体的步骤，其中在所述蛋白质混合物中不正确折叠的依那西普的量为少 于约IOwt. %并优选少于约5wt %的所述混合物。
[0027] 在第八实施方案中，本发明涉及用于将正确折叠的依那西普与不正确折叠的依那 西普分离开的方法，其中使用色谱法以实现所述分离，且其中所述色谱法仅由混合模式的 色谱分析组成，其中含正确折叠和不正确折叠的依那西普的混合物与具有离子交换结构部 分和疏水结构部分的混合模式的色谱树脂接触，然后由此被洗脱，以得到含至少约85wt% 并优选至少约90wt%，且最优选约95wt%的正确折叠的依那西普的洗脱液。对于该实施方 案，当在这里陈述"色谱法仅由混合模式的色谱层析组成"，应该理解当仅用于分析目的时， 这样的措辞不排除可选择的多种色谱方法（例如，HIC，SEC等）的使用。该实施方案的优 点在于除了这里描述的混合模式方法外，它不需要使用用于分离正确和不正确折叠的蛋白 质的分离技术。
[0028] 在另一个方面，可以下面的方式实践上述适用于依那西普的方法两次或更多次以 得到高纯度的依那西普制备物：通过实施所述的（例如在上面实施方案1和2中所述）的 步骤（a)和（b)，以实施第一混合模式分离（分离#1);然后通过再次实施步骤（a)和（b)， 实施第二混合模式分离（分离#2);其中分离#1的步骤（b)中得到的洗脱液然后用作分离 #2的步骤（a)的分析物（即，含蛋白质混合物的溶液）。在分离#1和分离#2中使用的混 合模式的树脂可相同或不同。在该方面一个特别优选的实践中，用CAPTO MMC混合模式树 脂实施分离#1，用CAPTO ADHERE混合模式树脂实施分离#2。
[0029] 任选地，由本发明的方法形成的，或在上述的制备物、制剂或治疗实施方案中提供 的依那西普制备物（如果希望这样的话）可不含或基本不含不正确折叠的依那西普，尽管 可理解的是，这里提供具有非常低水平的不正确折叠的依那西普（优选小于约IOwt. %且 最优选小于约5wt%的存在于药物制剂中的依那西普基蛋白质混合物总量）的依那西普制 备物的能力相对于目前可市购的含依那西普基混合物的药物制剂代表一个显著的进步，其 中在该混合物中不正确折叠的依那西普的量基于HIC分析可大于在该药物制剂中发现的 依那西普基蛋白质的约10%。
[0030] 在本发明中供使用的优选的混合模式树脂为CAPTO MMC和CAPTO ADHERE ;然而， 应理解的是用离子交换结构部分和疏水结构部分功能化的任何混合模式的树脂均可预期 用于本发明中。
[0031] 不被任何具体的理论束缚，如果根本不是可预见的，认为一个人可能能够在混合 模式色谱法中的带电特性和疏水特性之间采用这两种亲和类型开发相互依赖的和相对的 作用，以发展适当折叠的蛋白质物种和不正确折叠的和/或聚集的物种的高效分离是可能 的。令人惊奇的是，本发明的混合模式方法不需要与任何其它分离方法结合或用其它任何 其它分离方法补充以以优异产率和高纯度从不正确折叠的蛋白质中分离正确折叠的蛋白 质。例如，不必要使用附加的HIC步骤以进一步实现从不正确折叠的蛋白质中分离正确折 叠的蛋白质的该分离。
[0032] 随着应用于依那西普，根据本发明的混合模式色谱法涉及下面通常的现象顺序的 发生：第一，将不纯的含依那西普的样品（即含正确折叠的、不正确折叠的或其它杂质的样 品）引入混合模式树脂时，例如如从依那西普的CHO表达中得到的那些，本发明的方法允许 依那西普（正确和不正确折叠的）与所述混合模式树脂结合。第二，在后续的洗脱和冲洗 步骤期间（例如，使用盐梯度，优选以渐增浓度的梯度使用），本发明允许从依那西普基混 合物的树脂中释放（即，洗脱），其中含在其中的依那西普主要是正确折叠的，而基本允许 不正确折叠的依那西普保持结合或捕获在混合模式树脂上；从而在从所述树脂上洗脱得到 的材料中可得到非常高比例的适当折叠的依那西普（相对于存在于在初始引入并与所述 树脂结合的含依那西普蛋白样品中的它的更低比例）。依据本发明的混合模式色谱法的物 理操作，所述混合模式树脂可被包含（即包装）在刚性柱状容纳器或容器中，所述刚性柱状 容纳器或容器可包含所述树脂，且具有入口和出口构件以允许流体溶液在所述柱形物的一 端进入，流动并与所述树脂接触，然后在所述容器的相对端离开以被收集用于进一步的分 析或加工或被排放。
[0033] 可用已知的方法从哺乳动物细胞培养物例如CHO细胞中的依那西普蛋白质的表 达中得到上述方法的步骤（a)中使用的含正确折叠和不正确折叠的依那西普的蛋白质混 合物的溶液。在本发明的混合模式色谱法纯化之前，来自所述哺乳动物表达的收获的蛋白 质（收获的细胞培养流体）可进行初步的纯化步骤，例如蛋白质A亲和纯化，以移除杂质。 当需要该步骤用于移除非依那西普基杂质时，该纯化将通常不产生可观的正确折叠的依那 西普从不正确折叠的依那西普的分离（即，拆分（resolution))。相应地，蛋白质A池然后 进行本发明的混合模式技术以完成该分离。
[0034] 本发明的方法提供正确折叠的依那西普的商业上有用的回收率（产率）。例如， 在其中优选以通过在蛋白质A柱中纯化哺乳动物表达产物依那西普得到的蛋白质A层析法 产物的形式提供在本方法步骤（a)中使用的正确折叠和不正确折叠的依那西普的依那西 普基蛋白质溶液的情况下，在蛋白质A纯化步骤中回收的材料的量优选为存在于引入所述 蛋白质A柱中的收获的细胞培养物中的依那西普基表达产物的至少约80wt. %并优选至少 约85wt% (其中可通过Fe Elisa确定存在于收获的细胞培养物中的依那西普基蛋白质的 量，且可通过在A280nm处的UV吸光度确定蛋白质A洗脱池中得到的依那西普基蛋白质的 量）。然后，当使用上面引用的蛋白质A纯化的材料实践本发明的混合模式色谱法时，在本 发明的步骤（b)的洗脱液中得到的依那西普基蛋白质的量优选为在本发明步骤（a)中引入 混合模式树脂的依那西普基材料的量的至少约60wt. %并优选至少约70wt%。
[0035] 相应地在高度富含正确折叠的依那西普（即，按洗脱液的重量计含不多于10wt% 并优选不多于约5wt%的错误折叠物质）的本文步骤（b)的混合模式洗脱液中高纯度的依 那西普混合物的总产量可为在其纯化（例如，蛋白质A纯化）之前原始存在于收获的细胞 培养流体中的依那西普基混合物的约30至约50wt%中的任何值。
[0036] 也可通过其它色谱法，例如使用具有离子交换结构部分和疏水作用结构部分的色 谱树脂的混合模式色谱层析，实现收获的细胞培养流体的纯化。
[0037] 在实践本发明的方法中，可用已知的方式实施附加的过滤步骤（例如，病毒过滤 和切向流过滤）以进一步加工上述混合模式色谱法的步骤（b)中产生的洗脱液。
[0038] 本发明提供用于从给定蛋白质的不正确折叠的构象（包括聚集体）中分离正确折 叠构象的极大改进的分离方法，且，特别地，从由含高度异源的依那西普基物种混合物的哺 乳动物细胞培养获得物得到的错误折叠的（和聚集的）依那西普中拆分适当折叠的依那西 普。
【附图说明】
[0039] 图1示出了 Capto-MMC和Capto-Adhere混合模式树脂的化学结构。
[0040] 图2A(从Protein A的洗脱图谱）示出了来自含正确折叠的和错误折叠的依那西 普蛋白的CHO收获培养物的蛋白-A的洗脱图谱，使用含IM精氨酸的所指示pH的0.1 M柠 檬酸盐的洗脱液。实曲线UV吸收吸光度；虚线是导电率（这与下面图中相同）。
[0041] 图2B (从蛋白质A的洗脱图谱）示出了从蛋白质A洗脱的样品的非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳（Native-PAGE，下文也称为"非变性PAGE"）结果，其中条带1是标准的（商业 的Enbrel);条带2是负载（Load);条带3是FT (流通）；条带4, pH 6. 0 ;条带5, pH 4. 2 ; 条带 6, pH 3.7 ;条带 7, pH 3.0。
[0042] 图3A(来自Capto MMC的蛋白质A池的洗脱图谱）显示了通过在IOmM的磷酸盐 (pH 7. 5)中的NaCl或精氨酸洗脱的CAPTO MMC色谱图。
[0043] 图3B(来自Capto MMC的蛋白质A池的洗脱图谱）洗脱样品的SDS-PAGE和非变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中条带0,标准；条带1，负载；条带2，FT ;条带3,0. 15M NaCl ;条 带4,0.3M NaCl ;条带5, IM精氨酸。
[0044] 图4A(来自CaptoMMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了通过pH7.5的0-0.5M NaCl梯度的洗脱色谱。在梯度洗脱之前用pH7. 5、IOmM磷酸盐平衡所述柱。
[0045] 图4B(来自CaptoMMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了洗脱样品的非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳，其中：条带0,标准；条带1，负载；条带2至条带8,洗脱的部分；条带9, IM 精氨酸。
[0046] 图4C(来自Capto MMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了对于不同蛋白质A池的 洗脱样品的SDS-PAGE和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中条带0,标准；条带1，负载；条带 2, FT;条带3至条带8,洗脱的部分；条带9, IM精氨酸。
[0047] 图5A(来自CaptoMMC的蛋白质A池的洗脱图谱）通过pH 7. 5的0-0? 4MNa2SO4 梯度洗脱的色谱图。在梯度洗脱之前用pH 7. 5、10mM磷酸盐平衡所述柱。
[0048] 图5B(来自Capto MMC的蛋白质A池的洗脱图谱）洗脱样品的SDS-PAGE和非变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中：条带1，负载；条带2，FT;条带3,缓冲液洗涤；条带4至条带 9,洗脱的部分；条带10, IM精氨酸。
[0049] 图6示出了 Capto-MMC洗脱部分的HIC分析。
[0050] 图7A(来自CaptoMMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了通过pH和盐梯度洗脱 的色谱图。
[0051] 图7B(来自Capto MMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了洗脱样品的SDS-PAGE 和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中：条带〇,标准；条带1，负载；条带2和3，FT;条带4至 条带8,洗脱的部分；条带9, IM精氨酸。
[0052] 图8A(来自CaptoMMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了通过pH和Na2SO4梯度 洗脱的色谱图。
[0053] 图8B(来自Capto MMC的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了洗脱样品的SDS-PAGE 和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中：条带〇,标准；条带1，负载；条带2，FT ;条带3至条带 5，洗脱的部分；条带6，IM精氨酸。
[0054] 图9示出了来自Capto-Adhere的蛋白质A池的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳，其 中：条带〇,标准；条带1，负载；条带2, 5mM柠檬酸盐（pH 4, 5);条带3和4,0.1 M精氨酸（pH 4. 5);条带5,0.5M精氨酸。观察到的低分子量物质用框标出。
[0055] 图IOA(来自Capto-Adhere的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了通过pH和精氨酸 梯度洗脱的色谱图。
[0056] 图IOB (来自Capto-Adhere的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了洗脱样品的 SDS-PAGE和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中：条带0,标准；条带1，负载；条带2至条带4， FT;条带5至条带7,洗脱的部分；条带8,0. 5M精氨酸。
[0057] 图IlA(来自Capto-Adhere的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了通过pH和精氨酸 梯度洗脱的色谱图。
[0058] 图IlB (来自Capto-Adhere的蛋白质A池的洗脱图谱）示出了洗脱样品的非变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中：条带〇,标准；条带1，负载；条带2, FT;条带3至条带5,洗脱的 部分；条带6, IM精氨酸。
[0059] 图12是在实施例12的步骤3B中得到的Capto-Adhere混合模式树脂洗脱部分的 HIC(疏水作用色谱法）分析的示意图，其中负载样品是在实施例12的步骤3A中得到的材 料。在垂直坐标轴上显示正确折叠的依那西普的百分比，在水平坐标轴上表示随时间应用 的盐梯度。在梯度早期得到的洗脱部分含100%正确折叠的依那西普。
[0060] 图13 (来自Capto-Adhere的Capto-MMC池的洗脱图谱）示出了洗脱样品的SDS 和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。用精氨酸梯度在pH 7. 5下完成洗脱。其中条带0,标准； 条带1，负载；条带2和3, FT ;条带4至条带7,洗脱的部分；条带8, IM精氨酸。
[0061] 图14是来自Capto-Adhere的Capto-MMC池的洗脱色谱图。通过NaCl梯度在pH 7. 5下完成洗脱。
[0062] 图15A(来自Capto-Adhere的Capto-MMC池的洗脱图谱）示出了通过盐/精氨酸 梯度在pH 7. 5下洗脱的色谱图。
[0063] 图15B (来自Capto-Adhere的Capto-MMC池的洗脱图谱）洗脱样品的SDS-PAGE 和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中：条带〇,标准；条带1，负载；条带2，FT ;条带3至条带 6，洗脱的部分；条带7，IM精氨酸。
[0064] 图16是对应于在实施例12中产生的依那西普物质的HIC色谱图，其中基本不显 示第二个较小的峰（错误折叠的物质）的曲线对应于根据本发明（实施例12)产生的物 质；且其中在图中的附加曲线对应于商购的依那西普，用于对比的目的，可以看到其显示了 代表错误折叠和/或聚集物质的第二较小的峰。
【具体实施方式】
[0065] 本发明的前提是根据如下事实：同时使用离子交换和疏水作用的原理的混合模式 树脂，例如Capto? MMC和Capto? Adhere，可用于结合然后优选地（即，有选择地）洗脱给 定蛋白质分析物的正确折叠的构象（相对于不正确折叠的构象）。前述混合模式树脂均包 含具有提供两种不同模式用于吸引和结合蛋白质分析物的结构部分（即，化学基团）的配 体，所述两种不同模式即离子交换吸引和疏水作用。
[0066] 定义
[0067] 本说明书中所使用的术语在本发明的语境中和各术语使用的特定的语境中具有 它们在本领域中的普通含义。用于描述本发明的某些术语讨论如下，或者在本发明的其它 地方，以对实际工作者提供关于本发明说明书的额外指导。提供了某些术语的同义词。一 个或多个同义词的详述并不排除其他同义词的使用。包括这里讨论的任何术语实例的在本 说明书中任何地方的实例的使用仅是示例性的，并不以任何方式限制本发明或任何示例性 术语的范围和含义。本发明不限于在本说明书中给出的各种事实方案。
[0068] 除非另有定义，这里使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人 员通常理解的含义相同。在冲突的情况下，以本文件（包括定义）为准。
[0069] "约（around) "、"约（about) "或"约（approximately) "应通常表示在给定值或范 围的20%之内，10%之内，5、4、3、2或1%之内。给定的数值量是大约的，意味着如果不特别 载明，可推断术语"约（around) "、"约（about)" 或"约（approximately)"。
[0070] 这里使用的术语"依那西普"指含在Enbrel?商业制剂中的活性成分，即由与人类 免疫球蛋白G("IgGl"）的Fc部分[片段，可结晶的]连接的人类75千道尔顿（p75)肿瘤 坏死因子受体（"TNFR"）的细胞外配体结合部分组成的融合多肽的同源二聚体。依那西普 是如下的同源二聚体：如上所述的75千道尔顿TNFR = Fc分子的两个链在Fc部分的铰链区 通过二硫键连接。依那西普由934个氨基酸组成并具有约150千道尔顿的表观分子量，且 其所述Fc组分包含重链恒定结构域2 (CH2)、重链恒定结构域3 (CH3)和铰链区，但不包括人 类IgGl的重链恒定结构域I (CHl)。对于本申请的目的，术语"依那西普"也可包含在氨基 酸结构中具有次要修饰的依那西普（包括氨基酸的缺失、添加和/或取代），所述次要修饰 不显著影响上述多肽的功能。术语依那西普也应被理解为包括意在或被认为是所谓的依那 西普的生物仿制或生物改良的变体的蛋白质。
[0071] 这里使用的术语"正确折叠的依那西普"意在表示具有抑制TNF的生物活性的依 那西普同源二聚体（如上所述）的折叠构象和与Enbrel?中活性成分的构象和生物活性相 同或基本相同的构象。
[0072] 这里使用的术语"不正确折叠的依那西普"意在包含：（i)具有与依那西普（如上 所定义的）相同或基本相同的氨基酸序列，但具有与正确折叠的依那西普不同的构象的同 源二聚蛋白质，其中所述不同的构象致使所述蛋白质缺乏或基本缺乏作为TNF抑制剂的生 物活性；和/或（ii)聚集体，其中两种或更多种正确和/或不正确折叠的依那西普同源二 聚体已以形成具有比正确折叠的依那西普更高的分子量的物种的方式相关联（即，聚集的 或成簇的（clumped));和/或（iii) (i)和（ii)的混合物；和/或（iv)聚集的，即成簇的 蛋白质组合物，其包含与正确折叠的依那西普相同或基本相同的序列，或其部分，但其相对 于正确折叠的依那西普在HIC柱上显示下降的洗脱位置（由于较高的疏水性）。
[0073] 术语"治疗"指对于哺乳动物疾病的治疗方法的任何实施或应用，并包括抑制所述 疾病、阻止其发展、减轻所述疾病（例如，通过引起复原，或恢复或修复损失、缺失或缺陷的 功能）或刺激无效过程。所述术语包括得到期望的药理学和/或生理学的效果并覆盖哺乳 动物中病理状态或疾病的任何治疗。所述效果在完全或部分阻止疾病或其症状方面可为预 防性的和/或在局部或完全治愈病症和/或由所述病症引起的不利影响方面可为治疗性 的。它包括（1)阻止所述病症在易患所述病症但还没有症状的受试者中发生或复发，（2)抑 制所述病症，例如阻止其发展，（3)停止或终止所述病症或至少它的相关症状，以使宿主不 再遭受上述病症或其症状，例如引起病症或其症状的复原，例如，通过恢复或修复损失、缺 失或缺陷的功能，或刺激无效过程，或（4)减轻、缓解或改善所述病症或与其相关的症状， 其中改善在广义上讲用于指至少参数量级的下降，所述参数例如炎症、疼痛和/或肿瘤大 小。
[0074] 术语"药学上可接受的载体"指任何常规类型的无毒的固体、半固体或液体填充 剂、稀释剂、封装材料、制剂助剂或赋形剂。药学上可接受的载体在所使用的剂量和浓度对 受体是无毒的且与所述制剂的其它成分相容。
[0075] 术语"组合物"或"制剂"指通常包含载体的混合物，所述载体例如为本领域常规的 且适用于施用于受试者以用于治疗、诊断或预防的目的的药学上可接受的载体或赋形剂。 它可包括细胞培养物，其中多肽或多核苷酸存在于细胞或培养介质中。例如，用于口服给药 的组合物可形成溶液、悬浮液、药片、丸剂、胶囊、缓释制剂、口服灌洗剂或粉剂。
[0076] 本发明适用于从给定蛋白质的不正确折叠的构象中分离正确折叠的构象。可依 据本发明的方法进行处理的蛋白质的实例包括任何需要重折叠的含二硫化物蛋白质，例如 G_CSF、IGF、胰岛素、生长激素等，和工程化抗体，例如单链可变区抗体片段。
[0077] 可由表达依那西普的活的宿主细胞，例如抗体的情况下的杂交瘤，或在融合多肽 或抗体情况下已被基因工程化以产生所述多肽的宿主细胞产生适用于根据本发明的混合 模式色谱法纯化的依那西普。产生多肽的基因工程化细胞的方法是本领域周知的。参见， 例如Ausubel等人，eds.(1990),CurrentProtocolsinMolecularBiology(Wiley,New York)。这样的方法包括将编码并允许多肽表达的核酸引入到活的宿主细胞中。这些宿主细 胞可为细菌细胞，真菌细胞，或，优选地，在培养物中生长的动物细胞。细菌宿主细胞包括， 但不仅限于，大肠杆菌细胞。合适的大肠杆菌菌株的实例包括：HB101、DH5.alpha、GM2929、 JM109、KW251、NM538、NM539和任何不能切割外来DNA的大肠杆菌菌株。可使用的真菌宿主 细胞包括，但不仅限于，酿酒酵母、毕赤酵母和曲霉细胞。可使用的动物细胞系的一些实例 是CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3和W138。可使用本领域技术人员周知的方法 创立新的动物细胞系（例如，通过转化，病毒感染，和/或选择）。任选地，依那西普可被宿 主细胞分泌至介质中。
[0078]在从错误折叠的依那西普中混合模式色谱分离正确折叠的依那西普之前，可通过 任何标准方法实施表达的依那西普的纯化。当细胞内产生依那西普时，微粒碎片被移除，例 如，通过离心分离或超滤。当依那西普被分泌至介质中时，可使用标准多肽浓缩过滤器首先 将来自该表达系统的上清液浓缩。也可添加蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解作用且可包括抗 生素以阻止微生物的生长。
[0079] 可使用例如如下的方法纯化依那西普：羟磷灰石色谱法，凝胶电泳，透析，和亲和 色谱法，和任何已知或尚未被发现的纯化技术的组合，包括但不仅限于蛋白质A层析法、在 离子交换柱上的分馏法、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶柱层析、肝素SEPHAROSET?柱层 析、阴离子或阳离子交换树脂层析（例如聚天冬氨酸柱）、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉 淀。
[0080] 在非常普通的术语中，如应用到依那西普（但不仅限于对此）的，本发明提供含如 下步骤的蛋白质分离方法：(a)将含同时具有正确折叠和不正确折叠的依那西普的依那西 普基蛋白混合物的溶液引入用离子交换结构部分和疏水作用结构部分功能化的混合模式 色谱树脂中，所述引入在能够允许正确折叠和不正确折叠的依那西普与所述树脂结合的条 件下进行；然后（b)用能够从所述树脂上洗脱正确折叠的依那西普的洗脱介质冲洗所述树 月旨，以使所形成的洗脱液具有比在步骤（a)中引入的蛋白质溶液更高比例的正确折叠的依 那西普。
[0081] 任选地，所述方法可进一步包括如下准备步骤：在例如CHO细胞培养物的哺乳动 物细胞培养物中表达依那西普，然后使用例如蛋白质A层析法纯化表达的产物，因此蛋白 质A产品输出物变为本发明步骤（a)中使用的蛋白质溶液。应该理解的是，可以以下方式 实施本发明的方法：可通过第一实体在给定的制造点实施产生本发明步骤（a)中使用的起 始溶液的哺乳动物表达和蛋白质A步骤，同时可通过相同或不同的实体在相同或不同的制 造点实施本发明的混合模式分离方法。
[0082] 步骤（a)_与CAPTOMMC混合樽式树脂结合的备件
[0083] 在本发明的步骤（a)中，含正确折叠和不正确折叠的依那西普的蛋白质溶液应在 约4至约8的pH下，优选在约4至约6的pH下被引入CAPTO MMC混合模式树脂用于结合 到其上。或者，在使用CAPTO ADHERE混合模式树脂时，含正确折叠和不正确折叠的依那西 普的步骤（a)中的蛋白质溶液应在约6至约8. 5的pH下，优选在约7至约8的pH下被引 入CAPTO ADHERE混合模式树脂用于结合到其上。
[0084] 步骤（b)_从混合樽式树脂h洗脱的备件
[0085] 在步骤（b)中，所述洗脱介质包含预定浓度的盐，并以预定的有效于相对于不正 确折叠的依那西普优先洗脱正确折叠的依那西普的方式应用于柱。同时，一般来说，洗脱 液应包含更高的正确折叠与不正确折叠的依那西普的比率，所述盐溶液和其应用于所述树 脂的方式优选如此选择，以使步骤（b)的洗脱液中正确折叠的依那西普的量大大超出不正 确折叠的依那西普的量。早期洗脱的部分可包含基本上100%正确折叠的蛋白质。可通过 改变（增加）所述盐溶液的摩尔浓度，例如通过梯度，完成盐溶液的洗脱步骤。可逐步完 成所述梯度，但优选连续并线性完成。在一个优选的实施方案中，所述盐溶液包含氯化钠 ("NaCl "）。所述NaCl线性梯度可为从约0至约1M。
[0086] 在一个供选择的实施方案中，所述盐溶液可包含硫酸钠（"Na2S04"）。所述Na 2SO4 溶液也可以逐步或线性梯度应用，优选线性并最优选从约〇至约1摩尔的浓度梯度。
[0087] 可通过在CHO细胞中培养得到依那西普。
[0088] 在一个优选的实施方案中，所述盐溶液包含NaCl。
[0089] 遵循下面的程序用于表达、纯化所表达的产物，并分析从本发明的混合模式色谱 方法中得到的含依那西普的洗脱液：
[0090] 依那西普的表汰。在用编码在羧基端与人类Fc融合的人类TNFR胞外域的基因 转染的重组CHO细胞的条件培养基（"CM"）中表达依那西普。在用于依那西普的哺乳动 物表达的领域内的实例可发现于下列通过引用并入本文的美国专利：RE 36755、US专利号 5, 605, 690、EP 464, 533、EP 417, 563、US 专利号 8. 063, 182 和 US 专利号 7, 294, 481。
[0091]蛋白质 A 层析。使用具有 Iml HiTrap rProtein A 柱（可购自 GE Healthcare) 的蛋白质A柱处理以上得到的CM，并用IOmM磷酸盐、0.1 M NaCl、pH 7.0溶液平衡。在用 IM精氨酸-盐酸盐（"精氨酸"）、0.1 M柠檬酸盐、pH 6.0的溶液冲洗所述柱后，逐步用pH 4. 2, 3. 7和3. 0含IM精氨酸和0.1 M柠檬酸盐的溶液洗脱结合的蛋白质。或者，可在逐渐下 降的PH下用0.1 M的柠檬酸盐在不使用精氨酸下处理所述柱。在不存在精氨酸的情况下，大 多数的依那西普在PH 3. 85下被洗脱以提供在该pH以下流出的含污染物和不正确折叠的 依那西普、依那西普片段、依那西普聚集体等的洗脱液。然后使蛋白质A洗脱液如下面实施 例中描述的在HiTrap柱（可购自GE Healthcare)中进行Capto? MMC或Capto? Adhere。
[0092]蛋白质A洗脱液的分析。图2A和2B中示出了以上得到的蛋白质A洗脱液的分 析。图2A示出了用含IM精氨酸的低pH缓冲剂从蛋白质A的洗脱图谱。在pH 6.0处观察 到大的UV吸收峰（峰标记为6. 0)并不含对应于商购的依那西普的条带（图2B，条带4)如 用非变性PAGE (条带1)检测的：注意没有流经蛋白质A柱的依那西普（对比条带2和3)。 虽然在pH 6.0处（条带4)未观察到蛋白质条带，然而所观察到的大的UV吸收峰表明了颜 料的洗脱。在达到基线吸光度后（图2A)，用0.1 M精氨酸、0.1 M柠檬酸盐，pH 4. 2,洗脱所 述柱，形成尖锐的洗脱峰（图2A，标记为4. 2)。该峰的非变性PAGE分析显示了强的依那西 普条带，和模糊的（smearing)低泳动度条带（条带5)。洗脱的蛋白质的HIC分析显示了 2个峰，第一个峰对应于商业依那西普的主要的峰且第二个峰对应于存在于商业依那西普 中的次要物种。虽然第二个峰的性质不清楚，然而好像是错误折叠的依那西普物种，因为它 结合于蛋白质A并因此应该含所述Fc域。用pH 3. 7和然后用pH 3. 0的溶液（均含IM精 氨酸）洗脱剩余的结合的蛋白质。这些低PH溶剂导致如图2A(3.7和3.0)的小峰的洗脱。 pH 3. 7峰包含少量的依那西普（条带6)，而pH 3.0峰主要包含低泳动度物种，对应于错误 折叠的物种和也可能在聚集的物种（条带7)。在不含精氨酸的情况下观察到了相似的洗脱 模式。需要低pH，例如pH 3. 85,以洗脱依那西普并进一步降低在低泳动度物种洗脱中产生 的pH。事实是这些与蛋白质A结合的低泳动度物种意味着它们也可为Fc融合蛋白。因为 这些物种在比依那西普更低PH下洗脱，它们更紧密地结合蛋白质A。这些分析证实了在重 组CHO细胞中依那西普的表达形成对应于正确折叠的物种的天然的（正确折叠的）依那西 普，和对应于不正确地错误折叠物种的低泳动度物种，正如通过分析性HIC所分析的。由于 错误折叠的物种在HIC中较迟洗脱，其应比天然的依那西普更具疏水性。根据CHO克隆和 发酵条件，正确折叠的物种的量为蛋白质A洗脱液的40-60wt%。在下面的实施例中，评估 了混合模式色谱分析法从不正确折叠物种中分离折叠物种的能力。
[0093] 分析方法
[0094] 可使用多种本领域已知的方法，例如尺寸排除色谱（SEC)、变性的SEC(dSEC)、疏 水作用色谱（HIC)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)和非变性PAGE， 分析来自蛋白质A、Capto? MMC和Capto? Adhere组合物的洗脱部分。例如在Hawe等 人，Pharm. Res. 2011，28:2302 和 / 或 van Marrschalkerweerd 等人，Eur.J. Pharm. Biopharm. 2011，78:213中描述了尺寸排除色谱技术。
[0095] SDS-PAGEo例如，可用十二烷基硫酸钠或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（分别为 SDS-PAGE或非变性PAGE)分析来自蛋白质A、Capto? MMC和Capto? Adhere的洗脱部分。 使用6% Tris-甘氨酸凝胶（可购于Life Technology)实施SDS-PAGE和非变性PAGE。可 在非还原条件下完成SDS-PAGE以使可观察到二硫化物连接的聚集体。
[0096]尺寸棑除色谱。可使用周知的技术如尺寸排除色谱（SEC)、高效液相色谱 ("HPLC"）法分析使用本发明的混合模式色谱法得到的洗脱部分，其中通过尺寸分离所 述分析物（参见 Rogner, M. (2〇00) ? Size Exclusion Chromatography. Protein Liquid Chromatography. M. Kastner. Amsterdam, Elsevier. 61:89-145.)。例如，但不是作为限制， 流动相缓冲剂可被制备成包含50mM磷酸二氢钠一水合物和150mM精氨酸。用IM HCl将pH 调节至 6. 5。可使用线性依附于 Tosoh TSK-Gel G4000SWxl 7. 8mm x 30cm(cat. no. 8542) 的Tosoh TSK-Gel SWxl 6mm x 4cm保护柱（cat. no. 8543)实施分离。为实施分离，将所述 柱放在室温下（23°C )并用移动相以0. 5mL/min流速平衡。用自动进样器将5微升50mg/ mL的含依那西普的溶液注入所述柱上。在约0. 5mL/分钟的流速下分离可在约30分钟完 成。在该时间内在280nm波长处监测柱洗脱液。可使用Chromeleon软件（Dionex)实施整 合。在整合之前，从所有色谱图中减去不含依那西普的缓冲剂的SEC色谱图。所有整合均 可在12分钟至26分钟的保持时间内实施。使用多个参数定义峰。所监测峰的最小面积设 为0. 05mAu*min。用于检测峰值的二维敏感性设为0.0 lmAu和75秒。使用手动整合工具手 动添加峰肩。以两个步骤手工调整所检测的峰。首先，将峰基线（峰的底部边界）调整为 水平。第二，将峰基线的垂直位置调整为色谱图基线的垂直位置。色谱图基线值定义为无 分析物的信号。无分析物的信号定义为在12分钟保留时间处以mAu表示的吸光度。
[0097] 疏水作用代谱法（HIC)〇可使用1. 8至OM的硫酸按梯度在Butyl-Sepharose?上 实施疏水作用色谱（HIC)分析。也可用美国专利7, 294,481(参见19栏，49-55行）中描述 的方法实施 HIC 色谱法。也参考 US 专利号 7, 157, 557 ;Chen J, Tetrault J, Ley A. (2008) J Chromatogr A. 1177, 272-81 ;Gagnon P. and Grund E. (1996)BioPharm, 9, 54-64;和 Lu, Y. , Williamson, B. , and Gillespie,R. Recent advancement in application of hydrophobicinteractionchromatographyforaggregateremovalinindustrial purificationprocess.Curr.Pharm.Biotech.
[0098] 对于根据本发明的混合模式色谱方法制备的依那西普制备物的HIC分析，应注意 的是在通过引用并入本文的美国专利7, 294, 481中的图4包含依那西普制备物的HIC色谱 图，其中具有三个峰，最大的峰（在'481专利中标定为"峰2"）被公开为代表适当折叠的 依那西普融合蛋白；而较小的峰（在481专利中标定为"峰3"）被专利权人假定为含"杂 乱的"（即，在本讨论中认为与不正确折叠的同义词）依那西普和聚集的依那西普（参见美 国专利7, 294, 481，22栏，13-66行，和其图5)。本发明的一个显著优势是以商业上诱人的 产量提供非常高纯度的含依那西普的制备物的能力，其中可充分减小或实质上消除如'481 专利中的图4和图5所提及的且在本文中被认为包含不正确折叠的依那西普的HIC色谱图 的"峰3"。
[0099] 本发明进一步涉及依那西普的药物制剂，其中在该制剂中使用的高纯度的依那西 普是使用本发明的方法得到的。本发明的制剂也可包括缓冲剂、张力调节剂、赋形剂、药学 上可接受的载体和其他常用的所述药物组合物的非活性成分。为简单起见，这些随后将在 本申请中更充分描述。
[0100] 缓冲剂使pH保持在需要范围内。合适的缓冲剂包括组氨酸、磷酸钾、柠檬酸钠或 柠檬酸钾、顺丁烯二酸、醋酸铵、三_(羟甲基）氨基甲烷（tris)、多种形式的乙酸盐和二乙 醇胺。制剂中缓冲剂的浓度优选在约ImM至约IM之间，更优选约IOmM至约200mM。缓冲剂 是本领域中周知的，且通过已知的方法制造和从商业供应商购买。
[0101] 合适缓冲剂的实例包括磷酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸 盐、乙酸盐、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris)、碳酸氢盐。
[0102] 在一个优选的实施方案中，所述缓冲剂是磷酸钠。
[0103] 在一个优选的实施方案中，药物组合物的pH是或接近生理水平。因此，优选地，所 提供组合物的pH在约5. 8和约8. 4之间；且甚至更优选地，在约6. 2和约7. 4之间。本领 域中的普通技术人员将理解可根据需要调整所述PH以使依那西普在特定制剂中的稳定性 和溶解性最大化。因此，PH在生理范围外的仍能被患者容忍的依那西普制剂也在本发明的 范围内。
[0104] 张力调节剂是有助于溶液渗透度的分子。药物组合物的渗透度优选被调节以使活 性成分的稳定性最大化和/或使给药时患者的不适最小化。通常优选药物组合物是与血清 等张的，即具有相同或相似的渗透度，这可通过添加张力调节剂实现。
[0105] 在一个优选的实施方案中，所提供制剂的渗透度为从约180至约420m0sM。然而， 应理解的是所述渗透度可根据具体条件的需要而更高或更低。
[0106] 适合用于调节渗透度的张力调节剂的实例包括，但不限于氨基酸（不包括精氨 酸）（例如，半胱氨酸、组氨酸和甘氨酸）、盐（例如，氯化钠、氯化钾和柠檬酸钠）和/或糖 类/多元醇（例如，蔗糖、葡萄糖和甘露醇）。
[0107] 优选的张力调节剂为甘氨酸、丙氨酸、氯化钠、氯化钾和硫酸钠。
[0108] 在一个优选的实施方案中，在制剂中的张力调节剂的浓度优选在约ImM至约IM之 间，更优选在约IOmM至约200mM之间。张力调节剂是本领域中周知的，且通过已知的方法 制造和从商业供应商购买。
[0109] 赋形剂，也称为化学添加剂、共溶质或共溶剂，在溶液中（也在干燥或冷冻的形式 中）稳定多肽，其也可被添加至药物组合物中。赋形剂是本领域中周知的，且通过已知的方 法制造和从商业供应商购买。
[0110] 合适的赋形剂的实例包括但不限于糖类/多元醇，例如：蔗糖、乳糖、甘油、木糖 醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖；聚合物，例如：血清白蛋白（牛血清白 蛋白（BSA)，人类SA或重组HA)、葡聚糖，聚（乙烯醇）PVA、羟丙基甲基纤维素（HPMC)、 聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、羟乙基纤维素（HEC);无水溶剂，例如：PEG、甘 油和二甲基甲酰胺（DMF);氨基酸例如：脯氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、赖 氨酸盐酸盐、肌氨酸和Y-氨基丁酸；表面活性剂，例如Tween?-80 (聚山梨酯80)、 Tween ?-20 (聚山梨酯20)、SDS、聚山梨酯、泊洛沙姆；和其它赋形剂，例如磷酸钾、醋 酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、金属离子（例如，锌、钙和镁）、 CHAPS、单月桂酸醋、2-〇-beta-单酸甘油脂（2-〇-beta-mannoglycerate)或上述任何组合。
[0111] 优选的赋形剂为蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、海藻糖、 葡萄糖、牛血清白蛋白（BSA)、人血清白蛋白（HSA)、重组白蛋白、葡聚糖、PVA、羟丙基甲基 纤维素（HPMC)、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、羟乙基纤维素（HEC)、PEG、乙烯 乙二醇、甘油、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、SDS、聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊 洛沙姆188、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、锌离子、钙离子、镁离子、CHAPS、蔗糖单月桂酸酯和 2-O-beta-单酸甘油脂。
[0112] 在本发明的制剂中一种或多种赋形剂的浓度优选在约0. 001至5wt%之间，更优 选在约0. 1至2wt%之间。
[0113] 如果需要，根据本发明制备的依那西普制备物可用在其中已提供商业Enbrel的 相同的制剂中，这样的制剂包括约25至约75mg/ml的所述制剂，且进一步包括鹿糖、氯化 钠、L-精氨酸盐酸盐和磷酸钠。
[0114]作为一种选择，根据本发明得到的依那西普制备物可被提供在不含精氨酸的药物 制剂中；例如在2011年10月18号和2012年7月9号分别提交的Manning等人的临时申 请USSN 61/548, 518和61/669480中描述的任何不含精氨酸的制剂，所述两个临时申请通 过引用全部内容并入本文。
[0115]在另一个实 施方案中，本发明提供一种治疗哺乳动物的方法，包括将治疗有效量 的本发明的组合物施用于哺乳动物，其中所述哺乳动物具有可有利地用依那西普治疗的疾 病或病症。
[0116]在一个优选的实施方案中，所述依那西普源自与将用所述组合物治疗的相同的哺 乳动物物种。
[0117]在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是人类。
[0118]可用所提供的组合物治疗的疾病或病症包括但不限于风湿性关节炎、银肩病性关 节炎、强直性脊柱炎、韦格纳氏病（肉芽肿病）、克罗恩病（或炎症性肠病）、慢性阻塞性肺 疾病（COPD)、C型肝炎、子宫内膜异位症、哮喘、恶病质、牛皮癣和特应性皮炎。可用本发明 的组合物治疗的额外的疾病或病症包括但不限于在WO 00/62790、WO 01/62272、美国专利 申请第2001/0021380号和美国专利7, 648, 702B2中描述的那些，这些专利的相关部分通过 引用并入本文。
[0119] 可以通过系统注射，例如通过静脉注射，或通过注射或应用到相关位点，例如通过 直接注射，或当所述位点在外科中暴露时直接应用到所述位点，或通过局部施用将提供的 药物组合物施用到需要治疗的受试者。
[0120] 在一个实施方案中，本发明提供治疗和/或预防风湿性关节炎的方法，包括将治 疗有效量的所提供的依那西普组合物的一种施用于需要其的哺乳动物。
[0121] 所提供的组合物中依那西普的治疗有效量将取决于将被治疗的病况、病况的严重 性、先前的治疗和患者的病史和对治疗剂的反应。可根据主治医师的判断调整合适的量，以 使其可一次或多次施用于患者。
[0122] 在一个实施方案中，每成人剂量的有效的依那西普的量为从约l_500mg/m2,或从 约 l_200mg/m2,或从约 l_40mg/m2或约 5_25mg/m2。
[0123] 或者，可施用平剂量（a flat dose)，其量可为2_500mg/剂量，2-100mg/剂量或约 10-80mg/剂量。
[0124] 如果每周多于一次施用所述剂量，那么示例性的剂量范围与前述的剂量范围相同 或更低，并优选以25-100mg/剂量的每剂量范围每周施用两次或更多次。
[0125] 在另一个实施方案中，用于通过注射施用的可接受的剂量包含80-100mg/剂量， 或作为选择，包含80mg/剂量。
[0126] 可每周，每两周，或每隔数周（例如2-8)施用所述剂量。
[0127] 在一个实施方案中，通过单次皮下（SC)注射以25-75mg/ml的量施用依那西普。
[0128] 在某些情况下，通过在至少三周的时期内，每周一次至三次施用高达约IOOmg的 药物组合物的剂量将得到患者病况的改善。较长时间的治疗对于诱导所需的改善程度可能 是必要的。对于不能治愈的慢性病况，所述治疗方案可能会一直持续下去。对于儿科患者 (年龄4-17)，合适的治疗方案可能涉及施用0. 4mg/kg至5mg/kg的依那西普的剂量，每周 一次或多次。
[0129] 在另一个实施方案中，可以散装制剂（a bulk formulation)制备本发明的药物组 合物，且照此，所述药物组合物的成分被调节至比施用所需的更高，且在施用之前被适当地 稀释。
[0130] 所述药物组合物可作为单独的治疗剂施用或根据需要与额外的治疗方案结合。因 此，在一个实施方案中，所述提供的治疗和/或预防方法与施用治疗有效量的另一种活性 剂组合使用。可在施用本发明的药物组合物之前、之中或之后施用所述其它活性剂。另一 种活性剂可作为所提供组合物的一部分或作为单独的制剂施用。
[0131] 可以多种方式实现所提供的药物组合物的施用，包括肠胃外、口服、口腔、鼻、直 肠、腹膜内、皮内、经皮的、皮下、静脉内、动脉内、心脏内、心室内、炉内、气管内、鞘内给药， 肌肉注射，玻璃体内注射，和局部施用。
[0132] 本发明的药物组合物特别有用于肠胃外给药，即皮下给药、肌内给药、静脉内给 药、腹膜内给药、脑脊髓内给药、关节内给药、滑膜内给药和/或鞘内给药。可通过快速浓 注或连续输注进行肠胃外给药。用于注射的药物组合物可以单位剂量的形式存在，例如 在安瓿或多剂量容器中，具有添加的防腐剂。此外，已发展许多新的给药途径且本发明的 药物组合物适用于用这些新的方法给药，例如，Inject-ease?、Genject?、注射笔例如 GenPen?、和无针装置例如MediJector?和BioJector?。也可为正在发现的给药方法 调整本发明的药物组合物。参见Langer, 1990, Science, 249:1527-1533。
[0133] 所提供的药物组合物也可被配制成长效制剂（depot preparation)。可通过植入 (例如皮下或肌内给药）或通过肌内注射施用此类长效制剂。因此，例如，所述制剂可用适 当的聚合材料或疏水材料（例如在可接受油内的乳剂）或离子交换树脂进行修饰或修饰为 例如微溶盐的微溶衍生物。
[0134] 如果需要，所述药物组合物可以存在于小瓶、包装或分散设备中，其可包含含活性 成分的一种或多种单位剂量形式。在一个实施方案中，所述分配设备可包含具有为注射准 备的单剂量液体制剂的注射器。所述注射器可附有给药说明。
[0135] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种套件或容器，其包含本发明的水性药物 组合物，在所述水性药物组合物中多肽的浓度可在宽范围内变化，但通常在约0. 05至约 20, 000微克/毫升（μg/ml)水性制剂的范围内。所述套件也可附有使用说明。
[0136] 本发明更特别地在下面实施例中描述，下面实施例仅作为示例的目的，因为对其 的多种修饰或变体对本领域技术人员将是显而易见的。附录A进一步提供了本发明代表性 的实施方案。
[0137] 实施例1
[0138]伸用NaCl洗脱的CaDtoniMMC混合樽式纯化
[0139] 在该实施例中，使如上描述得到的蛋白质A洗脱液进行Capto? MMC色谱分析。用 5mM柠檬酸盐、pH 4. 5溶液平衡Capto? MMC柱。用5mM柠檬酸盐的蛋白质A洗脱液的合适 的稀释（如，3-6倍稀释，取决于蛋白质A步骤的洗脱缓冲剂）引起与所述柱的完全结合。 如在SDS-PAGE分析中所示，负载样品（pH 4. 2,蛋白质A洗脱液）是高度异质的且无蛋白质 流经Capto? MMC柱。然后用在IOmM磷酸盐、pH 7. 5溶液中的0. 15M NaCl洗脱结合的蛋 白质，这导致pH(从4. 5至7. 5)和NaCl浓度（从0-0. 15M)的同时变化。从洗脱液的分析 中观察到含正确折叠的依那西普的强的洗脱峰。然而，回收率为约40-50%。在刚刚所述 的洗脱步骤后，将含剩余的结合蛋白质物质的树脂与在IOmM磷酸盐、pH 7. 5溶液中的0. 3M NaCl和IM精氨酸接触，这形成主要含错误折叠的物种和二硫化物连接的聚集体的洗脱液。 该实施例说明了 Capto? MMC在分离错误折叠物种和正确折叠物种方面是有效的。错误折 叠物种在较高盐浓度（0.3M vs.O. 1M)下洗脱的事实意味着它们与所述柱具有较强的静电 作用。此外，IM精氨酸进一步增加了错误折叠的和聚集的蛋白质的洗脱，说明了这些蛋白质 不仅通过静电作用也通过疏水作用与Capto? MMC结合，且精氨酸增强了静电和疏水作用的 破坏。图3A和3B中示出了在该实施例中得到的洗脱部分的分析。
[0140] 实施例2
[0141] 伸用NaCl、平衡至DH7. 5的树脂的CaDtoniMMC混合樽式纯化
[0142] 在前述实施例中，含正确折叠和不正确折叠的依那西普的蛋白质溶液初始在pH 4. 5下与CAPTO MMC树脂接触。在该实施例中，当所述Capto? MMC柱用IOmM磷酸盐、pH 7. 5溶液平衡然后用NaCl随后用精氨酸洗脱时，观察到与实施例1中观察的洗脱相似的洗 脱。特别地，在该pH平衡过程中依那西普不被洗脱。该结果是不期望的，因为依那西普在 pH 7. 5下是带负电的；由于重链糖基化，依那西普的pi为4. 9-5. 4。因此，在pH 4. 5或低 于pH 4. 5下，依那西普是带正电的且因此应与带负电的Capto? MMC配体结合，尽管疏水作 用也可有助于结合。在pH 7. 5时，带负电的依那西普应从带负电的Capto? MMC解离，但发 现这并不发生。这可解释如下：依那西普和Capto? MMC间的疏水作用压倒了带负电的柱和 依那西普间的静电排斥。或者，Capto? MMC可通过结合蛋白质结构部分（蛋白质结构部分 的Pl为~8. 1)上的局部正电荷保持所述结合蛋白质。
[0143] 实施例3
[0144]伸用NaCl梯度以用于洗脱的CaDtoni混合樽式纯化
[0145] 在该实施例中，使用NaCl浓度梯度完成连续的洗脱。特别地，在用IOmM磷酸盐、 PH 7.5溶液洗涤所述柱后，用从0至0.5M的线性盐梯度洗脱结合的蛋白质。负载样品（pH 4. 2蛋白质A洗脱液）是高度异质的（含正确折叠和不正确折叠的依那西普），正如前述情 况，并用渐增离子强度的NaCl梯度洗脱结合的蛋白质。ISOmin后，终止梯度并将盐浓度调 为0.5M，这引起蛋白质洗脱轻微增加。如通过后续分析所确定的，低盐部分包含更多的正确 折叠的依那西普且更高的盐部分富含低泳动度（错误折叠的和聚集的）物种。最后，用IM 精氨酸、IOmM磷酸盐、pH 7. 5溶液洗脱剩余的蛋白质。该部分不含依那西普，但全部为低 泳动度（错误折叠的和聚集的）物种。对不同蛋白质A洗脱液使用Capto? MMC的NaCl梯 度洗脱，结合树脂的预平衡，导致在正确折叠的依那西普方面更高纯度的洗脱液。在洗脱介 质中低NaCl浓度下，洗脱的样品富含折叠的依那西普。随着上述盐梯度应用至所述树脂， 在洗脱液中错误折叠的物种逐渐增加。在完成所述盐梯度后，所述树脂与IM精氨酸溶液接 触，且发现由其形成的洗脱部分包含错误折叠的物种（其不仅包括错误折叠的物种还包括 聚集的物种），正如在后续SDS-PAGE分析中显而易见的。在SDS-PAGE上一些低泳动度物种 被认为是不正确折叠的（但不是聚集的）依那西普，表明了一部分错误折叠的物种随着错 误折叠的依那西普同源二聚体泳动，在非变性PAGE上具有比正确折叠的依那西普同源二 聚体更慢的泳动度。图4A、4B和4C中提供了在该实施例中得到的洗脱液部分的分析。
[0146] 实施例4
[0147]伸用Na2SOi弟度以用于洗脱的CaDtoMMMC混合樽式纯化
[0148] 在该实施例中，Na2SC^f度取代NaCl用作用于从混合模式树脂上洗脱正确折叠的 依那西普的盐梯度。虽然NaCl通常专用于洗脱IEC中的蛋白质，但是通常已知不同的盐具 有不同程度的盐析（蛋白质沉淀）效果。NaCl是例如1%(：1 2的盐溶盐和例如Na2SO4的盐析 盐之间的中间物。NaCl在减弱依那西普和Capto? MMC之间的静电作用方面可能是有效的， 但在减弱疏水作用方面可能是中立的。本文认为Na2SO4在减弱静电作用方式应该也是有效 的，但应增强疏水作用，因为已知它为强的盐析盐。因此，如果所述低泳动度物种如上所述 通过疏水作用被所述柱结合，那么它们的洗脱可被Na 2SO4抑制。在用IOmM磷酸盐、pH 7. 5 溶液pH平衡CAPTO MMC树脂柱后，通过用0-0. 4M的Na2SO4梯度洗脱含正确折叠和不正确折 叠的依那西普的蛋白质溶液对此进行测验。在蛋白质的Na 2SC^f度洗脱完成后，用IM精氨 酸、pH 7. 5溶液洗涤所述柱。图5A示出了洗脱色谱图，图5B示出了洗脱部分的SDS-PAGE 和非变性PAGE。在低Na2SO 4部分（图5B条带6和7)观察到了相对强的正确折叠的依那 西普条带且这些部分的纯度高于负载（条带1)。较高的Na 2SCV^度导致非变性PAGE上低 泳动度物种的洗脱（图5B条带8和9)。在pH 7. 5下最终的IM精氨酸洗脱导致低泳动度 (错误折叠的/聚集的）物种的洗脱。在该部分中似乎有一些依那西普（图5B条带10)， 表明Na 2SO4*可抑制天然依那西普的洗脱。可得出结论=Na2SO4在分离折叠物种和错误折 叠物种方面是同等有效的（如果不是更有效的话），虽然它可能引起天然依那西普的保留 (条带10)。
[0149] 实施例5
[0150] 用NaCl和DH梯度洗脱的CaDtoniMMC混合樽式纯化
[0151] 在前述实施例中，在pH平衡步骤中，即pH从4. 5 (5mM柠檬酸盐）变化至7. 5 (IOmM 磷酸盐），没有观察到蛋白质的洗脱。然而，当增加蛋白质负载量超过IOmg每1ml柱时，不 再发生该情况。在较高的负载下在PH变化期间蛋白质的洗脱逐渐增加，虽然该现象的原因 是不明的。该洗脱样品的纯度高于负载样品，但远小于低盐部分。例如，当负载样品（蛋白 质A洗脱液）仅含51 %正确折叠的依那西普物种时，在pH平衡期间发生的洗脱仅为65% 纯，比所述负载高但远低于所述低盐部分，然而，在盐梯度开始时，上述实施例中的盐洗脱 能给出96%纯度，正如用分析性HIC所确定的（图6)。正如在图6中所标绘的，洗脱部分 的纯度随着盐浓度的增加从96%至20%逐渐下降，这与Capto? MMC的非变性PAGE结果一 致（图3B、4B、5B)。IM精氨酸部分的纯度（就正确折叠的依那西普而言）低（仅11%)， 也与非变性PAGE分析（参见图4B条带9和图5B条带10) -致。鉴于前面的观察结果，与 这里呈现的观察结果一起，假设使PH梯度与盐梯度组合以抵消在柱pH平衡期间较大蛋白 负载的任何正确折叠物种的潜在损失可能是有益的。相应地，在下面的该实施例5中，当实 施本发明方法的上面定义的步骤（b)时，将pH梯度与盐梯度组合。在该实施例中，通过使 PH变化与盐梯度组合，抵消了在混合模式树脂柱的初始pH平衡期间少量的适当折叠的依 那西普可被不希望地洗脱的可能性。特别地，通过同时进行的PH和NaCl浓度的梯度洗脱 结合的蛋白质，即，所述柱从5mM柠檬酸盐、pH 4. 5溶液发展为IOmM磷酸盐、含NaCl的pH 7.5溶液。这导致pH和盐浓度的同时变化，均引起结合蛋白质的洗脱。这与在pH平衡后 观察到的盐洗脱图类似，在于低泳动度的物种洗脱在较后面的部分（即，较高的PH和盐浓 度）和在最终的IM精氨酸、pH 7. 5洗涤中。例如，蛋白质A洗脱液（24mg)在pH 4. 5下与 所述柱结合并用从5mM柠檬酸盐、pH 4. 5至含0. 5M NaCl的pH 7. 5 IOmM磷酸盐的梯度洗 脱。假设用PH平衡的大的负载可在pH转换期间导致结合的蛋白质的洗脱。在pH和盐梯 度期间的洗脱图谱确实在梯度开始时显示了较小的峰并在梯度中间显示了主要的峰（所 需的正确折叠的依那西普）。所观察到的小峰可能对应于如果初始没有用PH/盐梯度进行 PH平衡所观察到的洗脱。在NaCl/pH梯度洗脱完成后，所述柱然后进行使用IM精氨酸溶 液的进一步洗脱，这导致最终的对应于低泳动度物种的强峰。早期洗脱的低盐和低PH部分 富含依那西普，而高盐和高pH部分显示了低泳动度物种的洗脱；在中间的盐浓度所述pH逐 渐从4. 5增加至7. 5,例如从4. 1增加至5. 1和在梯度结束时为pH 6. 6。用IM精氨酸、pH 7. 5溶液的最终洗涤在非变性PAGE上显示了模糊的条带并在SDS-PAGE上显示了多重条带， 基本与在用IOmM磷酸盐、pH 7. 5洗涤引起pH变化的初始柱平衡后的发生的洗脱相同。在 所述池中适当折叠的依那西普的回收率为~70%。当用与IOmM磷酸盐、pH 7. 5溶液相同 的PH/盐梯度实施所述洗脱但以更低的含0.25M NaCl的盐结束时，得到相似的结果。使用 更低盐浓度的梯度导致依那西普的不完全洗脱，产率为~50%。正如在前述实施例中的，用 IM精氨酸洗涤观察到大的峰，对应于低泳动度（错误折叠的/聚集的）依那西普物种。图 7A和7B示出了在该实施例中得到的洗脱液的分析。
[0152] 实施例6
[0153]伸用Na2SaZoH梯度以用于洗脱的CaDtonMMC混合樽式纯化
[0154] 与上述实施例5中使用的程序相似，也使用0.5M Na2SO4溶液最为最终的溶剂实施 PH/盐梯度洗脱，据认为这改善了折叠物种从错误折叠的物种中的拆分。池中依那西普的 回收率为~50 %，认为所述低的回收率是由于通过0. 5M Na2SOdI强的疏水作用，不仅导致 主要在IM精氨酸洗涤中洗脱的错误折叠的物种的保留，还导致也出现在IM精氨酸洗涤中 的依那西普的保留。因此，Na 2SO4的使用可增强从正确折叠物种中的错误折叠物种的分离 (即，拆分），但也降低了依那西普的回收率。对于该实施例中洗脱液的分析，可参考图8A 和8B。
[0155] 实施例7
[0156] Captoia Adhere :在dH7. 5 和dH4. 5 下用 NaCl 洗月兑
[0157] 在该实施例中，使含正确折叠和不正确折叠的依那西普物种的蛋白质A洗脱液进 行使用Capto? Adhere作为混合模式树脂的混合模式色谱分析。在pH 7. 5下实施含正确 折叠和不正确折叠的依那西普物种的蛋白质溶液的结合，在该pH下依那西普带负电荷并 因此应结合带正电的Capto? Adhere配体。当pH 4. 2蛋白质A洗脱液相对于IOmM磷酸 盐、PH 7. 5溶液透析时，蛋白质结合完全，但发现只通过盐的洗脱（pH 7. 5下）是无效的，表 明Capto? Adhere是相当疏水的。因此认为，因为依那西普的pi是4. 9-5. 4,在或许是pH 4. 5的较低的洗脱pH下，依那西普物种将是带正电的并因此在pH 4. 5下从带正电的Capto? Adhere树脂中排除出去。通过在pH 4. 5下实施依那西普物种从Capto? Adhere上的洗脱 研宄该可能性。pH 4. 2蛋白质A洗脱液（已被透析至pH 7. 5)与用IOmM磷酸盐、pH 7. 5 的溶液平衡的Capto? Adhere结合。在蛋白质负载后，用在相同缓冲剂中的0和0.2M NaCl 洗涤所述柱，在这些洗涤中无蛋白质洗脱。
[0158] 实施例8
[0159]CaptoTM Adhere :在dH4. 5下使用/不使用精氨酸的洗月兑
[0160] 鉴于实施例7的结果，然后用具有和不具有精氨酸的5mM柠檬酸盐、pH 4. 5溶液 洗脱所结合的蛋白质。在该实施例中使用精氨酸取代NaCl以研宄更加疏水的物种（精氨 酸）可能影响洗脱的方式，考虑到Capto? Adhere配体的疏水性质。发现，低泳动度（错 误折叠的/聚集的）物种与正确折叠的依那西普被5mM柠檬酸盐、pH 4. 5的洗涤溶液（不 含精氨酸）洗脱。在该部分中低泳动度物种的洗脱可归因于PH的突变，如该部分中所测的 pH为3. 0。当用在5mM柠檬酸盐、pH 4. 5溶液中的0. 1和0. 2M精氨酸重复该步骤时，只观 察到边际量的正确折叠的依那西普。正确折叠的依那西普的完全洗脱需要0. 5M精氨酸，然 而，洗脱液包括不期望量的低泳动度物种。因此发现，即使在PH 4.5下，精氨酸在低浓度下 是无效的，且在较高的精氨酸浓度下，导致折叠的和错误折叠的物种之间的差的拆分。参见 图9,用于分析在该实施例中得到的洗脱液。
[0161] 实施例9
[0162] Capto11Adhere:用两种精氨酸梯度和7. 5至4. 5的pH梯度的洗月兑
[0163] 然后假设pH/精氨酸梯度组合可引起适当折叠的物种和错误折叠的物种之间的 拆分。如在对于CAPTOMMC的前述实施例中的，可通过应用同时发生的pH梯度，其然后可 与精氨酸浓度梯度（例如从IOmM磷酸盐、pH7. 5至5mM柠檬酸盐、pH4. 5含精氨酸的梯 度）配合，来阻止在使用5mM柠檬酸盐从7. 5至4. 5的pH平衡期间的pH下降。使用该pH 梯度研宄两种精氨酸梯度。在精氨酸梯度至0. 25M精氨酸的情况下，（图IOA和10B)发现 最后的0. 5M精氨酸洗涤导致低泳动度物种和依那西普的洗脱，表明了至仅0. 25M精氨酸的 精氨酸浓度的梯度的使用将对正确折叠的依那西普的完全洗脱是不充足的。相应地，研宄 了 0-0. 5M的精氨酸梯度（与上述7. 5-4. 5的pH梯度配合）（图IlA和11B)。从后续的非 变性PAGE分析中显而易见的是，用比先前的0. 25M精氨酸梯度高的精氨酸梯度的最后的IM 精氨酸洗涤的相对峰高度较小。没有观察到第二峰，表明拆分可能已被破坏。PH是这样的， 以使被洗脱部分的pH逐渐从7. 5降至6. 0、5. 7、5. 2并最终至4. 5。对于0. 5M精氨酸和pH 梯度，主要洗脱峰中的两个部分富含正确折叠的依那西普，蛋白质回收率为~65%。梯度的 更后面的部分显示了含依那西普的模糊的条带。因此，虽然0. 5M精氨酸梯度连同pH梯度 增强了结合的依那西普的洗脱，然而在精氨酸/pH梯度更后面的部分，正确折叠的依那西 普与错误折叠的物种共洗脱。最后的IM精氨酸洗涤仅显示了模糊的条带。
[0164] 实施例10
[0165]Captoia Adhere :用精氨酸梯度和7. 5-4. 5的pH梯度的洗月兑
[0166] 也在pH 7. 5下使用Capto? MMC池实施精氨酸梯度洗脱。用IOmM磷酸盐、pH 7. 5 至〇. 6M精氨酸、IOmM磷酸盐、pH 7. 5的梯度洗脱结合的蛋白质。SDS-PAGE和非变性PAGE 的图显示了在中间部分（0.2-0. 4M精氨酸）的正确折叠的依那西普的洗脱（图13)。在较 后面的部分和最后的IM精氨酸pH 7. 0洗涤中观察到如在两个凝胶中所见的低泳动度物 种。通过比较，当在pH 7. 5下的梯度洗脱中将0.6M精氨酸替换为0.5M NaCl时，依那西普 的洗脱大大下降。图14显示了在pH 7. 5下在所述盐梯度至0. 5M NaCl期间的洗脱图谱。 在该梯度过程中观察到两个峰，主要包含依那西普但具有低的产率。大量的依那西普在最 后的IM精氨酸洗涤中被洗脱，表明了结合pH 7. 5的0. 5M NaCl的盐浓度对于从错误折叠 的/聚集的物质中分离正确折叠的依那西普来说不是最佳的。如上所述，IM精氨酸在洗脱 正确折叠的依那西普方面是高效的，虽然存在低泳动度的物种。注意到，改变盐洗脱梯度以 应用约0至约IM NaCal的梯度和在pH 8下实施洗脱导致在该梯度的早期洗脱产物中正确 折叠的依那西普相对于高低泳动度（错误折叠的/聚集的）物种的优异拆分，如在实施例 12中所示。似乎是在pH 8. 0下与Capto Adhere结合的依那西普的疏水贡献下降，导致单 独使用NaCl时正确折叠的依那西普的有效的洗脱。
[0167] 实施例11
[0168] Capton Adhere :在dH7. 5下用精氨酸/NaCl梯度的洗月兑
[0169] 在该实施例中，在pH 7.5下研宄组合的NaCl/精氨酸梯度。研宄了两种这样的梯 度：用于洗脱介质的被研宄的第一梯度是其中最终NaCl和精氨酸浓度分别为0. 4和0. 2 ; 研宄的第二梯度是其中最终NaCl和精氨酸浓度分别为0. 25M NaCl和0. 5M精氨酸。在这 两种情况下，均在IOmM磷酸盐、pH 7. 5溶液中应用所述梯度。第一梯度仍然是太弱而不能 减少疏水作用并因此洗脱依那西普。第二梯度是更有效的，如在最后IM精氨酸洗涤中的较 小的峰所指示的。特别地，如用SDS-PAGE证实的，在直至0. 25M NaCl、0. 5M精氨酸的测试 的第二梯度中，始终发生依那西普的洗脱而无高分子量（低泳动度/错误折叠的/聚集的） 物种。然后在最后的IM精氨酸洗涤中洗脱所述高分子量物种。在非变性PAGE上，多数天然 的正确折叠的依那西普显示在中间部分洗脱。用IM精氨酸洗涤观察到了模糊的条带。因 此精氨酸和NaCl的组合可导致依那西普的洗脱和对应于错误折叠物种的低泳动度和高分 子量物种的分离是显而易见的。用于Capto? MMC池（60-80%纯度）的Capto? Adhere部 分的HIC分析显示，在梯度中（除了尾部部分）被洗脱部分通常具有高于95%的纯度。图 15A和15B示出了在该实施例中得到的洗脱液的分析。
[0170]实施例 12-CaDto11 Adhere 和 Captoia MMC
[0171] 在该实施例中，通过与上述蛋白质A方法相似的方法得到含正确折叠和错误折叠 的依那西普的蛋白质A洗脱液。然后将所述洗脱液应用于Capto? MMCe柱，然后将所述产 物池应用于Capto? ADHERE柱以提供定量和定性上均优越的依那西普产物。
[0172]步骤1.细胞扩增。用本领域中已知的方法，使用表达依那西普融合蛋白的CHO细 胞的克隆实施细胞扩增，所述细胞扩增对于产生足够数量的细胞以用于生产生物反应器接 种是必要的。该表达过程的产物（收获的细胞培养流体）形成正确折叠的依那西普和不正 确折叠的和/或聚集的依那西普和额外杂质的混合物。将含该蛋白质混合物的所述收获的 细胞培养流体进行清洁剂病毒灭活。
[0173]步骤2.亲和忾谱分析。以周知的方式使用常规的蛋白质A亲和柱对步骤1中得 到的收获的细胞培养物实施亲和色谱分析。产物回收率为约85%。得到的产物是含正确 折叠的依那西普、不正确折叠的依那西普、和/或正确和/或不正确折叠的依那西普的聚集 体、或蛋白质片段的复杂蛋白质混合物。将从该蛋白质A亲和柱纯化步骤得到的产物调节 至pH 3. 5,然后使其经受病毒灭活步骤。病毒灭活之后，将所述产物调节至pH 5. 5,然后使 用商购的囊式过滤器用已知的方式对其进一步澄清（clarified)。
[0174]步骤3A.混合樽式阳离子夺换色谱分析。31. 8L (45cm直径X 20cm床高）填充床 GE Healthcare Capto MMC色谱柱用于纯化上述步骤2中得到的产物。在使用之前，所述柱 用2CV的25mM乙酸盐pH 5. 5平衡并用2CV的0? IN NaOH、IM NaCl消毒（sanitized)，并用 2CV的25mM乙酸盐、0. 7M NaCl、pH 5. 5中和。然后用8-10CV的25mM乙酸盐pH 5. 5平衡 所述柱直至流出物为pH 5. 5和3. 5mS/cm。用WFI将来自上面步骤2的蛋白质A池稀释至 < 6mS/cm并将其应用于负载有高达15g/L介质的柱用于各循环。在200cm/h的线速率下 操作所述柱以给予6分钟的停留时间。负载后，用2CV的25mM乙酸盐pH 5. 5洗涤所述柱， 然后用8.5(^，15%至85%的251111乙酸盐口115.5至251111乙酸盐，0.7]\1恥(：1邛115.5的梯 度稀释所述产物。在〇. 150D(A280, LOcm路径长度）处开始收集产物并在最大峰值的50 % 处停止收集。洗脱液的体积约为5CV。用2CV的IOmM Tris，IM NaCl，pH 8. 0从所述柱上 剥离残余产物和污染物并将其丢弃。使用Millipore Opticap XL10, 0.22 ym Durapore囊 式过滤器，（0.69m2)过滤从所述混合模式柱上得到的产物。由该步骤得到的产物显示了约 70%的步骤2中得到的蛋白质A材料的回收率。
[0175]步骤3B.混合模式阴离子交换色谱分析。27. OL (45cm直径X 17cm床高）填充床 GE Healthcare Capto Adhere色谱柱用于进一步纯化上述步骤3A中得到的产物。在使用之 前，用2CV的25mM Tris，pH 8. 0平衡所述柱并用2CV的0.1 N NaOH，IM NaCl消毒并用2CV 的25mM Tris，pH 8. 0中和和平衡。在产物负载之前，用3CV的IOmM Tris，pH 8. 0平衡所 述柱。用每kg池~0.045kg的IM Tris, pH 8. 3将来自上面步骤3A的Capto MMC池调节 至pH 8. 1。用WFI将来自上述步骤3A的产物在线（in-line)稀释1:3. 8以调节电导率至 12.01115/〇]1且。118.0。然后将所产生的物质应用于负载多达158/1介质的柱。在170〇11/11 的线速率下操作所述柱以给予6分钟的停留时间。负载后，用2CV的25mM Tris，pH 8. 0洗 涤所述柱。然后用 IOCV 的 25mM Tris, pH 8. O 至 IOmM Tris, IM NaCl, pH 8. O 的梯度（20% to 90% )洗脱所述产物。在0. 150D(A280, 1.0 cm路径长度）处开始收集产物并在最大峰 值的25%处停止收集。洗脱液的体积为4-6CV。使用可商购的囊式过滤器过滤洗脱的产 物，然后用已知的方式使其经受病毒过滤和切向流过滤步骤。来自步骤3B (包括最后的病 毒和切向流过滤步骤）的全部产物回收率为约68%。在过滤步骤前测得的产物回收率为约 75%。图12中示出了来自该步骤的在洗脱部分上得到的HIC数据示意图。
[0176]分析：发现在该实施例中获得的最终的经过滤的产物具有大于约90wt%的正确 折叠的依那西普，正如通过HIC所测定的；少于5wt%的不正确折叠的依那西普物种，正如 通过HIC所测定的；少于约3wt%的截短的材料（认为是依那西普片段，其中其TNFR部分 已被截短），如由HIC分析的；且正确和不正确折叠的依那西普的组合量高于95wt %，正如 通过尺寸排阻色谱法所测定的。
[0177] ---------------------
[0178] 在存在盐析条件下发生的蛋白质结合的事实表明了在依那西普结合Capto?MMC 和CaptoTMAdhere中不涉及疏水作用的可能性，考虑到疏水性蛋白结合HIC通常需要强的 盐析。然而，可在蛋白质和这些混合模式树脂间的静电作用存在促进疏水作用。因此，无意 愿受任何特定的理论的束缚，即使在缺乏盐析条件下，仍可通过静电和疏水作用模式介导 依那西普与混合模式树脂的结合。分析性HIC清楚地表明了在较低的硫酸铵浓度下洗脱的 错误折叠的物种比折叠的物种更具有疏水性。假定折叠的物种和错误折叠的物种均具有 相同的静电性质，并同样很好地结合Capto?MMC或Capto?Adhere配体的带电基团，那么 错误折叠物种的较强的疏水贡献使它们更紧地与混合模式树脂结合是可能的，因此使更强 的对于错误折叠物种的洗脱条件成为必需，正如在上述实施例中所观察到的。对于Capto? MMC，这可在较高的盐浓度下实现，该较高的盐浓度可能不足以显著增强疏水作用，但可能 足以破坏Capto?MMC和正确与不正确折叠物种二者间的附加的静电作用。相反地，Capto? Adhere似乎比Capto?MMC具有更高的疏水性，需要精氨酸，或具有更高pH的更高的盐浓 度，以洗脱正确折叠的物种。需要更高的精氨酸浓度或更苛刻的条件以洗脱错误折叠的物 种。
[0179] 虽然本发明使用可交换的术语"错误折叠的（misfolded)"或"不正确折叠的 (incorrectly folded)"或"不适当折叠的（improperly folded)"，但是也应理解的是这些 术语旨在包含聚集的物质，因为也发现混合模式树脂在移除在被发现包含错误折叠物种的 相同洗脱部分中的聚集物种方面是有效的。实际上，依那西普形成二硫化物连接的低聚物， 如在SDS-PAGE中所示。这样的低聚物主要在IM精氨酸洗涤中洗脱，表明它们与树脂更强 的疏水作用。相应地，对于依那西普，似乎Capto? MMC和Capto? Adhere均可引起错误折 叠的和聚集的物种的同时去除。由于聚集物质（无论是正确折叠的还是不正确折叠的）潜 在的免疫原性，错误折叠和聚集体（无论是共价的还是非共价的）的去除是高度需要的，以 提供更安全的生技药品。
[0180] 对于前述实施例中精氨酸的效果，显然精氨酸（精氨酸盐酸盐）不仅起盐的作用 也减弱疏水作用。本领域中已知精氨酸抑制蛋白质聚集和表面吸附。此外，精氨酸与芳香 基团相互作用并因此干扰蛋白质之间或蛋白质与所述表面之间的芳香族-芳香族或芳香 族-阳离子相互作用。Capto? MMC和Capto? Adhere均拥有可有助于蛋白质结合的芳香 基团。还不能够预测这样的结合模式可被精氨酸而不是NaCl有效地破坏。精氨酸也可减 弱脂肪酸间的相互作用，表明它可破坏疏水作用，这不通过芳香基团介导。虽然机制上不能 清楚地理解，然而精氨酸的疏水性质可因此在调节蛋白-蛋白相互作用和表面吸附并因此 从所述混合模式树脂上的蛋白质洗脱方面发挥着重要的作用。然而，如在上述实施例12中 所示，不需要使用精氨酸以实践本发明以提供极高纯度的依那西普制备物。这也许是由于 Capto MMC和Capto Adhere树脂对蛋白质结合的弱的疏水贡献。然而，与NaCl组合使用精 氨酸可提高混合模式色谱对于蛋白质的回收和拆分。
[0181]附录 A
[0182] 讲一步的代表件卖施方案
[0183](在优先权申请USSN61/699, 552中公开）
[0184] A.用于从不正确折叠的蛋白质中分离正确折叠的蛋白质的混合模式色谱方法，其 包含以下步骤：
[0185] (a)将同时含正确折叠和不正确折叠构象的给定蛋白质的第一蛋白质混合物与同 时具有离子交换结构部分和疏水结构部分的混合模式色谱树脂结合；
[0186] (b)从所述混合模式树脂中洗脱正确折叠的蛋白质，以得到含比第一蛋白质混合 物更高比例的正确折叠蛋白质的第二蛋白质混合物。
[0187] B.根据实施方案A的方法，其中，所述混合模式色谱树脂是Capto? MMC混合模式 色谱树脂。
[0188] C.根据实施方案A的方法，其中，所述混合模式色谱树脂是Capto? Adhere混合 模式色谱树脂。
[0189] D.根据实施方案A-C任一项所述方法，其中，所述正确折叠和不正确折叠的蛋白 质构象包含正确折叠和不正确折叠的依那西普。
[0190] E.根据实施方案D的方法，其中，所述不正确折叠的依那西普构成少于约 IOwt. %，并优选少于约5wt. %的步骤（b)中得到的洗脱液；所述正确折叠的依那西普构成 多于约90wt%并优选多于约95wt%的步骤（b)中得到的洗脱液；且正确折叠和不正确折叠 的依那西普的组合量构成至少约95wt%并优选至少约98wt%的步骤（b)中得到的洗脱液。
[0191] F.根据实施方案A-E任一项所述方法，其中，所述混合模式树脂是Capto? MMC且 在约4. 5至约7. 5之间的pH下实施所述方法的步骤（a)和（b);且通过使所述混合模式树 脂与盐溶液接触实施洗脱步骤（b)。
[0192] G.根据实施方案A-E任一项所述方法，其中，所述混合模式树脂是Capto? Adhere 且在约4. 5至约8. 5的pH下实施步骤（a)和（b);且通过使所述混合模式树脂与盐溶液接 触实施洗脱步骤（b)，所述溶液任选地进一步包含精氨酸。
[0193] H.根据实施方案F或G所述方法，其中，通过所述盐浓度逐渐增加的梯度在步骤 (b)应用所述盐溶液。
[0194] I.根据实施方案H所述方法，其中，步骤（b)中的盐浓度梯度引起盐浓度从约0至 约IM增加。
[0195] J.根据实施方案F-I任一项所述方法，其中，所述盐选自氯化钠和硫酸钠。
[0196] K.根据实施方案A-J任一项所述方法，其中，在步骤（b)中，与步骤（b)中所述树 脂接触的所述溶液的PH是逐渐变化的。
[0197] L根据实施方案K所述方法，其中所述pH是逐渐增加的。
[0198] M.根据实施方案K所述方法，其中所述pH是逐渐下降的。
[0199] N.根据实施方案A-M任一项所述方法，其中，在步骤（b)的洗脱液中得到的正确折 叠的蛋白质的量为在步骤（a)中引入所述树脂的蛋白质混合物中存在的蛋白质的量的至 少约60wt%。
[0200] 0.根据实施方案N所述方法，其中，正确折叠的蛋白质的量为在步骤（a)中引入所 述树脂的蛋白质混合物中存在的蛋白质的量的至少约70wt. %。
[0201] P.根据实施方案A-O任一项所述方法，其中，得到包含至少90wt%正确折叠的依 那西普且优选少于约5wt. %不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物，而不实施，或不需要 实施任何色谱分离或纯化步骤以从不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普，除 了下面的步骤：
[0202] (1) 一个或多个纯化步骤，优选包含蛋白质A色谱纯化步骤，其中使用这样的步骤 以纯化含依那西普基蛋白质的收获的细胞培养流体，且其中这样的纯化步骤不做从不正确 折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的任何可评估的分离。
[0203] (2)在实施方案1中描述的混合模式色谱法步骤（a)和（b);和
[0204] (3)仅为了分析目的而实施的SEC、HIC或其它分析性色谱步骤。
[0205] Q.根据实施方案A-P任一项所述方法，其中，通过在A280处的UV吸光度测定步 骤（b)洗脱液中存在的蛋白质的量；通过疏水作用色谱法测定步骤B洗脱液中的正确折叠 的依那西普的量；且通过尺寸排阻色谱法测定步骤（b)洗脱液中的正确折叠和不正确折叠 的依那西普的组合量。
[0206] R.用于纯化蛋白质混合物以从存在于所述混合物中的不正确折叠的依那西普中 分离正确折叠的依那西普的混合模式色谱方法，所述方法包含以下步骤：
[0207] (a)使具有疏水结构部分和离子交换结构部分的混合模式色谱树脂与含包含正确 折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的溶液接触，以使正确折叠的和 不正确折叠的依那西普变为粘附、结合或被捕获在所述混合模式色谱树脂上；和
[0208] (b)使所述混合模式树脂与能够从所述混合模式色谱树脂上洗脱依那西普蛋白质 的溶液接触以得到洗脱液，在所述洗脱液中，正确折叠的依那西普与不正确折叠的依那西 普的量的比例高于在步骤（a)中引入所述树脂的蛋白质混合物中的比例。
[0209] S.根据实施方案R所述方法，其中，所述混合模式色谱树脂是Capto? MMC混合模 式色谱树脂。
[0210] L根据实施方案R所述方法，其中，所述混合模式色谱树脂是Capto? Adhere混 合模式色谱树脂。
[0211] U.根据实施方案A-T所述方法，其中
[0212] (A)不正确折叠的依那西普构成少于约5wt. %的步骤（b)中得到的洗脱液；正确 折叠的依那西普构成多于约90wt%的步骤（b)中得到的洗脱液；且正确折叠和不正确折叠 的依那西普的组合量构成至少约95wt%的步骤（b)中得到的洗脱液；或
[0213] (B)在步骤（b)中得到的洗脱液或其部分包含正确折叠的依那西普且不含或基本 不含不正确折叠的依那西普。
[0214] V.根据实施方案A-U任一项所述方法，其中，所述混合模式树脂是Capto? MMC且 在约4. 5至约7. 5间的pH下实施所述方法的步骤（a)和（b);且通过使所述混合模式树脂 与盐溶液接触实施洗脱步骤（b)。
[0215] W.根据实施方案R-V任一项所述方法，其中，所述混合模式树脂是Capto? Adhere 且在约4. 5至约8. 5的pH下实施步骤（a)和（b);且通过使所述混合模式树脂与盐溶液接 触实施洗脱步骤（b)，所述溶液任选地进一步包含精氨酸。
[0216] X.根据实施方案V或W所述方法，其中，通过盐浓度逐渐增加的梯度将所述盐溶液 应用至步骤（b)中。
[0217] Y.根据实施方案X所述方法，其中，步骤（b)的盐浓度梯度引起盐浓度从约0增加 至约1M。
[0218] Z.根据实施方案V-Y任一项所述方法，其中，所述盐选自氯化钠和硫酸钠。
[0219] AA.根据实施方案R-Z任一项所述方法，其中，在步骤（b)中，接触步骤（b)中所述 树脂的所述溶液的PH逐渐增加或逐渐下降。
[0220] BB.根据实施方案R-AA任一项所述方法，其中，在步骤（b)的洗脱液中得到的正确 折叠的蛋白质的量为存在于在步骤（a)引入所述树脂的蛋白质混合物中的蛋白质的量的 至少约60wt%并优选至少约70wt. %。
[0221] CC.根据实施方案A-BB任一项所述方法，其中，以下面的方式实践所述方法两次 或更多次：
[0222] 通过实施步骤（a)和（b)实施第一混合模式分离（分离#1);然后
[0223] 通过再次实施步骤（a)和（b)实施第二混合模式分离（分离#2);
[0224] 其中，在分离#1的步骤（b)中得到的洗脱液用作在分离#2的步骤（a)中含蛋白 质混合物的溶液。
[0225] DD.根据实施方案CC所述方法，其中，在分离#1中使用的混合模式树脂与在分离 #2中使用的混合模式树脂相同或不同。
[0226] EE.根据实施方案DD所述方法，其中，以选自下面组合的方式实施分离#1和分离 #2 ：
[0227] 分离#1使用CAPTO MMC作为所述混合模式色谱树脂和分离#2使用CAPTO ADHERE 作为所述混合模式色谱树脂；
[0228] ---------
[0229] 分离#1使用CAPTO ADHERE作为所述混合模式色谱树脂和分离#2使用CAPTO MMC 作为所述混合模式色谱树脂；
[0230] --------
[0231] 分离#1使用CAPTO MMC作为所述混合模式色谱树脂和分离#2使用CAPTO MMC作 为所述混合模式色谱树脂；或
[0232] --------
[0233] 分离#1使用CAPTO ADHERE作为所述混合模式色谱树脂
[0234] 分离#2使用CAPTO ADHERE作为所述混合模式色谱树脂。
[0235] FF.根据实施方案EE所述方法，其中，以下面的方式实施分离#1和分离#2 :分离 #1使用CAPTO MMC作为所述混合模式色谱树脂；且分离#2使用CAPTO ADHERE作为所述混 合模式色谱树脂。
[0236] GG.由实施方案A-FF任一项的方法得到的含依那西普的蛋白质混合物，或含所 述混合物的药学上可接受的制剂，其中所述蛋白质混合物以构成大于约90wt.%的蛋白质 混合物的量包含正确折叠的依那西普；且以构成少于约5wt%的蛋白质混合物的量包含 不正确折叠的依那西普；且其中所述蛋白质混合物具有构成至少约95wt.%并优选至少约 98wt.%的含依那西普的蛋白质混合物的正确折叠和不正确折叠的依那西普的组合量。
[0237] HH.适用于施用至需要治疗TNFalpha介导的病况的受试者的含高纯度的依那西 普的药学上可接受的制剂，所述制剂包含含主要量的正确折叠的依那西普和次要量的不正 确折叠的依那西普的蛋白质混合物，其中
[0238] (i)所述不正确折叠的依那西普构成少于约IOwt.%，优选少于约8wt.%且最优 选优选少于约5wt.%的蛋白质混合物；
[0239] (ii)所述正确折叠的依那西普构成多于90wt.%且优选多于约92wt%且最优选 多于约95wt%的蛋白质混合物；和
[0240] (iii)所述正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普（但不包括其聚集体） 的总量构成至少95wt%且优选至少98wt%的蛋白质混合物；
[0241] 其中，所述制剂进一步包括使所述制剂适用于施用至受试者的药学上可接受的非 活性成分、赋形剂或载体。
[0242] II.根据实施方案HH的制剂，其中，所述依那西普制备物构成约25至约75mg/ml 的所述制剂，且所述制剂进一步包含蔗糖、氯化钠、L-精氨酸盐酸盐和磷酸钠。
[0243] JJ.一种制备关于存在其中的正确折叠的相对于不正确折叠的依那西普的量具有 高纯度的含依那西普的蛋白质混合物的方法，所述方法包含以下步骤：
[0244] (1)在哺乳动物表达系统中表达依那西普以得到包含含依那西普的蛋白质混合物 的收获的细胞培养流体，所述含依那西普的蛋白质混合物包含正确折叠的和不正确折叠的 依那西普；
[0245] (2)使在步骤1中得到的收获的细胞培养流体进行纯化过程，借此得到具有减少 量的，或基本无不期望的杂质的存在于步骤1中得到的收获的细胞培养流体中的含依那西 普的蛋白质混合物；
[0246] (3)使步骤⑵中得到的含依那西普的蛋白质混合物与同时具有离子交换结构部 分和疏水作用结构部分的混合模式的色谱树脂接触一次或多次，以使包括在混合物中的蛋 白质附在所述树脂上；和
[0247] (4)使来自步骤3的具有结合在其上的蛋白质的树脂与溶液接触以从所述混合模 式树脂上洗脱正确折叠的依那西普，以得到包含比在步骤3中引入树脂的含依那西普的混 合物具有更高的正确折叠的依那西普对不正确折叠的依那西普比例的含依那西普的蛋白 质混合物的洗脱液；其中
[0248] (i)存在于由步骤2纯化得到的含依那西普的蛋白质混合物中的蛋白质的量为 存在于步骤1中得到的收获的细胞培养流体中的依那西普基蛋白质混合物的量的至少约 80wt% ；
[0249] (ii)存在于步骤4中洗脱的蛋白质混合物中的正确折叠和不正确折叠的依那西 普蛋白质的组合量为其存在于由步骤2得到的蛋白质混合物中的量的至少约60wt.%;
[0250] (iii)存在于步骤4的洗脱液中的正确折叠的依那西普的量为存在于步骤1中得 到的收获的细胞培养流体中的含依那西普的蛋白质混合物的量的至少约30wt. %并优选至 少约35wt. % ;和
[0251] (iv)所述正确折叠的依那西普构成至少约90wt%并优选至少约95wt%的步骤4 中得到的洗出液。
[0252] KK.根据实施方案JJ所述方法，其中，所述混合模式树脂选自由CAPTOMMC和CAPTO ADHERE组成的组。
[0253] LL.根据实施方案JJ或KK所述方法，其包含下面附加的步骤：
[0254] 步骤（5):使在步骤4的洗脱液中得到的蛋白质混合物与同时具有离子交换结构 部分和疏水作用结构部分的混合模式色谱树脂接触，以使包括在所述混合物中的蛋白质附 在所述树脂上，然后；
[0255] 步骤（6):使所述树脂与溶液接触以从中洗脱正确折叠的依那西普，以得到含具 有更高的正确折叠对不正确折叠的依那西普的比例的蛋白质混合物的洗脱液；
[0256] 其中，在所述附加步骤5和6中使用的混合模式树脂与在步骤3和4中使用的混 合模式树脂相同或不同。
[0257] MM.根据实施方案LL所述方法，其中，在步骤⑶和⑷使用的混合模式树脂为 CAPTOMMC且在步骤（5)和（6)中使用的树脂为CAPTOADHERE。
[0258] NN.根据实施方案JJ-MM任一项所述方法，其中，通过使所述混合模式树脂与盐溶 液接触实施步骤4 (和/或在实施方案LL的情况下的步骤6)以从所述混合模式树脂上洗 脱正确折叠的依那西普，且任选地（i)其中在所述溶液与树脂的所述接触期间在步骤（4) 或（6)中盐溶液的浓度逐渐增加；且任选地（ii)在所述溶液与树脂的所述接触期间在步骤 (4)和/或（6)中洗脱溶液的pH逐渐增加或减小。
[0259] 00.根据实施方案JJ-NN任一项所述方法，其中，将在所述方法的一个或多个步骤 中得到的产物进行过滤，例如病毒过滤和/或切向流过滤。
[0260] PP.根据实施方案JJ-OO任一项所述方法，其中，使用蛋白质A色谱柱实施步骤2。
[0261] QQ.根据实施方案JJ-OO任一项所述方法，其中，使用具有疏水和离子交换结构部 分的混合模式树脂实施步骤2。
[0262] RR.根据实施方案A-PP任一项所述方法，其中，得到含至少90wt%正确折叠的依 那西普并优选少于约5wt. %不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物，而不实施任何色谱分 离或纯化步骤以从不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普，除了一个或多个下 面的步骤：
[0263] (1)任选地，一个或多个纯化步骤，优选包含蛋白质A色谱纯化步骤，使用这样的 步骤以纯化含依那西普基蛋白质的收获的细胞培养流体，其中所述纯化步骤不从不正确折 叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普；
[0264] (2)在实施方案A中描述的混合模式色谱法步骤（3)和（4)(或按照实施方案LL 的步骤3, 4, 5和6)中的一个或多个事件；和
[0265] (3)任选地，仅为了分析目的而实施的SEC、HIC或其它分析性色谱步骤的一个或 多个。
[0266] SS.根据实施方案A-RR任一项所述方法，其排除了单一模式疏水作用色谱作为从 不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的方法的使用，除了当实施仅用于分析 的目的时。
[0267] TT.用于治疗患有TNF介导的疾病的受试者的方法，其包含如下步骤：将含包含正 确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的药物制剂施用于这样的个 体，通过实施方案A-SS任一项所述方法得到所述混合物，其中在所述蛋白质混合物中不正 确折叠的依那西普的量为少于约5wt%的所述混合物。
[0268] UU.根据实施方案TT所述方法，其中，蛋白质混合物中不正确折叠的依那西普的 量为少于约3wt%的所述混合物，且所述混合物中正确折叠的依那西普的量大于约95wt% 的所述混合物。
[0269] VV.用于治疗患有TNF介导的疾病的受试者的方法，其包含如下步骤：将含包含正 确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的药物制剂施用于这样的个 体，其中在所述蛋白质混合物中不正确折叠的依那西普的量为少于约5wt%的所述混合物。
[0270] Wff.根据实施方案TT-VV所述方法，其中，蛋白质混合物中不正确折叠的依那西 普的量为少于约3wt%的所述混合物，且所述混合物中正确折叠的依那西普的量大于约 95wt %的所述混合物。
[0271] XX.根据实施方案TT-VV任一项所述方法，其中，正确折叠和不正确折叠的依那西 普（不包括其聚集体）的组合量为所述混合物的至少约95wt%。
[0272] YY.根据实施方案XX所述方法，其中，正确折叠和不正确折叠的依那西普（不包括 其聚集体）的组合量为所述混合物的至少约98wt%。
[0273] ZZ.根据实施方案A-YY任一项所述方法或组合物，其中，除非另有说明，术语"不 正确折叠的依那西普"理解为包括含正确折叠和/或不正确折叠的依那西普的聚集体。
[0274] AAA.根据实施方案JJ-QQ所述方法，其中，用Fc酶联免疫吸附测定法测定包括在 步骤1的收获的细胞培养物中的依那西普基蛋白质的量。
[0275] BBB.根据实施方案JJ-QQ任一项所述方法，其中，通过在A280处的UV吸光度测定 存在于由步骤4 (或在实施方案LL的情况下，步骤4和6)中混合模式树脂得到的洗脱液中 的依那西普基蛋白质的量。
[0276] CCC.根据实施方案BBB所述方法，其中，通过在A280处的UV吸光度或Fc酶联免 疫吸附测定法测定存在于由步骤2的纯化过程得到的产物中的依那西普基蛋白质的量。
[0277] DDD.用于从不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的方法，其中，使 用色谱方法以实现该分离，且其中所述色谱方法仅由或基本由混合模式色谱法组成，所述 混合模式色谱法中包含正确折叠和不正确折叠的依那西普的混合物与具有离子交换结构 部分和疏水结构部分的混合模式色谱树脂接触，然后从其洗脱，以得到含至少约85wt%并 优选至少约90wt%并最优选至少约95wt%正确折叠的依那西普的洗脱液。
[0278] EEE.根据实施方案DDD所述方法，其中，所述混合模式树脂选自CAPTO MMC和 CAPTO ADHERE ;用盐溶液实施洗脱，任选地使用渐增的盐浓度的梯度实施洗脱；盐溶液的 pH在约4至约8. 5的范围内，任选地以pH逐渐增加或下降的梯度实施；且其中在一段时间 内从所述树脂得到洗脱液，且在所述时间段的早期收集的洗脱液不含或基本不含不正确折 叠的依那西普。
【主权项】
1. 一种用于从不正确折叠的蛋白质中分离正确折叠的蛋白质的混合模式色谱分析方 法，其包含以下步骤： (a) 将同时含给定蛋白的正确折叠和不正确折叠构象的第一蛋白混合物与同时具有离 子交换结构部分和疏水结构部分的混合模式色谱树脂结合； (b) 从所述混合模式树脂上洗脱正确折叠的蛋白质以得到第二蛋白混合物，所述第二 蛋白混合物含比所述第一蛋白混合物更高比例的正确折叠蛋白。2. 根据权利要求1所述方法，其中，所述混合模式色谱树脂是Capto?MMC混合模式色 谱树脂。3. 根据权利要求1所述方法，其中，所述混合模式色谱树脂是Capto?Adhere混合模 式色谱树脂。4. 根据权利要求1所述方法，其中，所述正确折叠和不正确折叠的蛋白质构象包含正 确折叠的和不正确折叠的依那西普。5. 根据权利要求4所述方法，其中，所述不正确折叠的依那西普构成少于约IOwt. %， 并优选少于约5wt. %的步骤（b)中得到的洗脱液；所述正确折叠的依那西普构成多于约 90wt%并优选多于约95wt%的步骤（b)中得到的洗脱液；且正确折叠的和不正确折叠的依 那西普的组合量构成至少约95wt%并优选至少约98wt%的步骤（b)中得到的洗脱液。6. 根据权利要求5所述方法，其中，所述混合模式树脂是Capto?MMC且在约4. 5至约 7. 5间的pH下实施所述方法的步骤（a)和（b);且通过使所述混合模式树脂与盐溶液接触 实施洗脱步骤（b)。7. 根据权利要求5所述方法，其中，所述混合模式树脂是CaptoTMAdhere且在约4. 5 至约8. 5的pH下实施步骤（a)和（b);且通过使所述混合模式树脂与盐溶液接触实施洗脱 步骤（b)，所述溶液任选地进一步包含精氨酸。8. 根据权利要求6所述方法，其中，通过盐浓度逐渐增加的梯度将所述盐溶液应用至 步骤（b)中。9. 根据权利要求8所述方法，其中，步骤（b)的盐浓度梯度引起盐浓度从约0增加至约 IM010. 根据权利要求6所述方法，其中，所述盐选自氯化钠和硫酸钠。11. 根据权利要求1所述方法，其中，在步骤（b)中，与步骤（b)中树脂接触的溶液的 pH是逐渐变化的。12. 根据权利要求1所述方法，其中，在步骤（b)的洗脱液中得到的正确折叠的蛋白质 的量为在步骤（a)中引入所述树脂的蛋白质混合物中存在的蛋白质的量的至少约60wt%。13. 根据权利要求12所述方法，其中，正确折叠的蛋白质的量为在步骤（a)中引入所述 树脂的蛋白质混合物中存在的蛋白质的量的至少约70wt. %。14. 根据权利要求1所述方法，其中，得到包含至少90wt%正确折叠的依那西普且优 选少于约5wt. %不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物，而不实施，或不需要实施任何色 谱分离或纯化步骤以从不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普，除了下面的步 骤： (1) 一个或多个纯化步骤，优选包含蛋白质A色谱纯化步骤，其中使用这样的步骤以纯 化含依那西普基蛋白质的收获的细胞培养流体，且其中这样的纯化步骤不导致从不正确折 叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的任何可评估的分离； (2) 在权利要求1中描述的混合模式色谱法步骤（a)和（b);和 (3) 仅为了分析目的而实施的SEC、HIC或其它分析性色谱步骤。15. 根据权利要求1所述方法，其中，通过在A280处的UV吸光度测定步骤（b)的洗脱 液中存在的蛋白质的量；通过疏水作用色谱法测定步骤（b)的洗脱液中正确折叠的依那西 普的量；且通过尺寸排阻色谱法测定步骤（b)的洗脱液中存在的正确折叠的和不正确折叠 的依那西普的组合量。16. 根据权利要求1所述方法，其中，以下面的方式实践所述方法两次或更多次： 通过实施步骤（a)和（b)实施第一混合模式分离（分离#1);然后 通过再次实施步骤（a)和（b)实施第二混合模式分离（分离#2); 其中，在分离#1的步骤（b)中得到的洗脱液用作在分离#2的步骤（a)中的含蛋白质 混合物的溶液。17. 根据权利要求16所述方法，其中，在分离#1中使用的混合模式树脂与在分离#2中 使用的混合模式树脂相同或不同。18. 根据权利要求16所述方法，其中，以选自下面组合的方式实施分离#1和分离#2 : 分离#1使用CAPTOMMC作为所述混合模式色谱树脂且分离#2使用CAPTOADHERE作 为所述混合模式色谱树脂； 分离#1使用CAPTOADHERE作为所述混合模式色谱树脂且分离#2使用CAPTOMMC作 为所述混合模式色谱树脂； 分离#1使用CAPTOMMC作为所述混合模式色谱树脂且分离#2使用CAPTOMMC作为所 述混合模式色谱树脂；或 分离#1使用CAPTOADHERE作为所述混合模式色谱树脂 分离#2使用CAPTOADHERE作为所述混合模式色谱树脂。19. 根据权利要求18所述方法，其中，以下面的方式实施分离#1和分离#2 :分离#1使 用CAPTOMMC作为所述混合模式色谱树脂；且分离#2使用CAPT0ADHERE作为所述混合模式 色谱树脂。20. -种根据权利要求1的方法得到的含依那西普的蛋白质混合物，或含所述混合物 的药学上可接受的制剂，其中所述蛋白质混合物以构成大于约90wt. %的蛋白质混合物的 量包含正确折叠的依那西普；且以构成少于约5wt%的蛋白质混合物的量包含不正确折叠 的依那西普；且其中所述蛋白质混合物具有构成至少约95wt. %并优选至少约98wt. %的 含依那西普的蛋白质混合物的正确折叠和不正确折叠的依那西普的组合量。21. 适用于施用至需要治疗TNFalpha介导的病况的受试者的含高纯度依那西普的药 学上可接受的制剂，所述制剂包含含主要量的正确折叠的依那西普和次要量的不正确折叠 的依那西普的蛋白质混合物，其中 (i)所述不正确折叠的依那西普构成少于约IOwt. %，优选少于约8wt. %且最优选少 于约5wt. %的所述蛋白质混合物； (ii) 所述正确折叠的依那西普构成多于90wt. %且优选多于约92wt%且优选多于约 95wt%的所述蛋白质混合物；和 (iii) 正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普（但不包括其聚集体）的总量构 成至少95wt%且优选至少98wt%的所述蛋白质混合物； 其中，所述制剂进一步包括使所述制剂适用于施用于受试者的药学上可接受的非活性 成分、赋形剂或载体。22. 根据权利要求21所述制剂，其中，所述依那西普制备物构成约25至约75mg/ml的 所述制剂，且所述制剂进一步包含蔗糖、氯化钠、L-精氨酸盐酸盐和磷酸钠。23. -种用于制备关于存在其中的正确折叠依那西普相对于不正确折叠的依那西普的 量具有高纯度的含依那西普的蛋白质混合物的方法，所述方法包含以下步骤： (1) 在哺乳动物表达系统中表达依那西普以得到包含含依那西普的蛋白质混合物的收 获的细胞培养流体，所述含依那西普的蛋白质混合物包含正确折叠的和不正确折叠的依那 西普； (2) 使在步骤1中得到的收获的细胞培养流体进行纯化过程，借此得到具有减少量的， 或基本无不期望的杂质的存在于在步骤1中得到的收获的细胞培养流体中的含依那西普 的蛋白质混合物； (3) 使步骤（2)中得到的含依那西普的蛋白质混合物与同时具有离子交换结构部分和 疏水作用结构部分的混合模式的色谱树脂接触一次或多次，以使包括在混合物中的蛋白质 附在所述树脂上；和 (4) 使来自步骤3的具有结合在其上的蛋白质的树脂与溶液接触以从所述混合物模式 树脂上洗脱正确折叠的依那西普，以得到比在步骤3中引入树脂的含依那西普的混合物具 有更高的正确折叠的依那西普对不正确折叠的依那西普的比例的含依那西普的蛋白质混 合物的洗脱液； 其中： (i) 存在于由步骤2纯化得到的含依那西普的蛋白质混合物中的蛋白质的量为存在于 步骤1中得到的收获的细胞培养流体中的依那西普基蛋白质混合物的量的至少约80wt% ; (ii) 存在于步骤4中洗脱的蛋白质混合物中的正确折叠和不正确折叠的依那西普蛋 白质的组合量为其存在于由步骤2得到的蛋白质混合物中的量的至少约60wt. % ; (iii) 存在于步骤4的洗脱液中的正确折叠的依那西普的量为存在于步骤1中得到的 收获的细胞培养流体中的含依那西普的蛋白质混合物的量的至少约30wt. %并优选至少约 35wt. % ;和 (iv) 所述正确折叠的依那西普构成至少约90wt%并优选至少约95wt%的步骤4中得 到的洗脱液。24. 根据权利要求23所述方法，其中所述混合模式树脂选自由CAPTOMMC和CAPTO ADHERE组成的组。25. 根据权利要求24所述方法，其包括下面附加的步骤： 步骤（5):使在步骤4的洗脱液中得到的蛋白质混合物与同时具有离子交换结构部分 和疏水作用结构部分的混合模式色谱树脂接触，以使包括在所述混合物中的蛋白质附在所 述树脂上，然后； 步骤（6):使所述树脂与溶液接触以从中洗脱正确折叠的依那西普，以得到含具有更 高的正确折叠对不正确折叠的依那西普的比例的蛋白质混合物的洗脱液； 其中，在所述附加步骤5和6中使用的混合模式树脂与在步骤3和4中使用的混合模 式树脂相同或不同。26. 根据权利要求25所述方法，其中，在步骤（3)和（4)中使用的混合模式树脂为 CAPTOMMC且在步骤（5)和（6)中使用的树脂为CAPTOADHERE。27. 根据权利要求1所述方法，其排除了单一模式疏水作用色谱作为从不正确折叠的 依那西普中分离正确折叠的依那西普的方法的使用，除了当实施仅用于分析的目的时。28. 用于治疗患有TNF介导的疾病的受试者的方法，其包含如下步骤：将含包含正确折 叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的药物制剂施用于这样的个体，其 中在所述蛋白质混合物中不正确折叠的依那西普的量为少于约5wt%的所述混合物。29. 根据权利要求28所述方法，其中，蛋白质混合物中不正确折叠的依那西普的量为 少于所述混合物的约3wt%，且所述混合物中正确折叠的依那西普的量大于所述混合物的 约 95wt%。30. 用于从不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的方法，其中使用色谱 方法以实现该分离，且其中所述色谱方法仅由或基本由混合模式色谱法组成，所述混合模 式色谱法中包含正确折叠和不正确折叠的依那西普的混合物与具有离子交换结构部分和 疏水结构部分的混合模式色谱树脂接触，然后从其洗脱，以得到含至少约85wt%并优选至 少约90wt%并最优选至少约95wt%正确折叠的依那西普的洗脱液。31. 根据权利要求30所述方法，其中，所述混合模式树脂选自CAPTOMMC和CAPTO ADHERE;用盐溶液实施洗脱，任选地使用渐增的盐浓度的梯度实施洗脱；盐溶液的pH在约4 至约8. 5的范围内，任选地以pH逐渐增加或下降的梯度实施；且其中在一段时间内从所述 树脂得到洗脱液，且在所述时间段的早期收集的洗脱液不含或基本不含不正确折叠的依那 西普。
【专利摘要】提供了一种用于从给定蛋白质的不正确折叠的构象中分离正确折叠的构象的混合模式色谱方法。所述方法在以商业上吸引人的产量从不正确折叠的依那西普和聚集体中分离正确折叠的依那西普方面是高度有效的，能够提供在正确折叠的依那西普对不正确折叠的依那西普方面具有非常高纯度的依那西普制备物。本发明进一步涉及通过本发明方法得到的含正确折叠的蛋白质的蛋白质制备物和制剂，和使用由所述混合模式方法得到的高纯度制备物治疗的方法。
【IPC分类】A61K38/16
【公开号】CN104902914
【申请号】CN201380058650
【发明人】荒川力, 道格拉斯·法勒
【申请人】科荣生生物科学公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年9月10日
【公告号】CA2882551A1, EP2895188A1, US20140072560, WO2014043103A1
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