治疗杜兴氏肌营养不良的卵泡抑素的制作方法
治疗杜兴氏肌营养不良的卵泡抑素的制作方法
【专利说明】治疗杜兴氏肌营养不良的卵泡抑素
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年1月25日提交的美国临时专利申请序列号61/756, 996和2013 年12月13日提交的美国临时专利申请序列号61/915, 733的优先权，所述美国临时专利申 请的公开内容据此整体并入本文。
[0003] 背景
[0004] 杜兴氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD)是隐性X染色体关联形 式的肌营养不良，其导致肌肉退化以及最终死亡。所述病症是由位于人X染色体上的肌营 养不良蛋白（dystrophin)基因的突变引起，所述基因编码蛋白质肌营养不良蛋白，所述肌 营养不良蛋白是肌肉组织内的一种对细胞膜的肌营养不良蛋白聚糖复合物（DGC)提供结 构稳定性的重要结构组分。肌营养不良蛋白连接内部细胞质肌动蛋白微丝网状结构和细胞 外基质，从而对肌肉纤维提供物理强度。因此，改变肌营养不良蛋白或不存在肌营养不良蛋 白会导致肌纤维膜功能异常。尽管两种性别的人士均可携带突变，但男孩通常具有伴有早 期失能和死亡的重度表型，而携带突变的女性通常展现轻度得多的表型。
[0005] 目前，不存在用于DMD的已知治愈方法。已探宄许多治疗途径，包括基因疗法和皮 质类固醇的各种施用方案。尽管这些治疗中的一些可延迟某些征象和症状，但目前不存在 用于DMD患者的满意治疗选项。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明尤其提供用于基于卵泡抑素（follistatin)蛋白疗法来治疗肌营养 不良，具体来说杜兴氏肌营养不良（DMD)和/或贝克尔肌营养不良（Becker Muscular Dystrophy)的改进方法和组合物。如本文中，包括以下实施例中所述，本发明者首次证明 向DMD动物模型中全身性施用重组卵泡抑素蛋白（例如卵泡抑素-Fc重组融合蛋白）导致 全身各种组织中的有效肌肉生长，并且减轻DMD的特征性症状肌肉纤维化和/或坏死。此 外，本发明者也已证明本发明的卵泡抑素-Fc融合蛋白具有多达约5天的延长血清半衰期。 在不希望受任何理论束缚下，预期出乎意料长久的血清半衰期可已促成优越体内功效。实 际上，在本发明之前，已知卵泡抑素是肌抑素和活化素的调节剂，所述肌抑素和活化素均是 肌肉生长的重要负性调控剂。然而，在本发明之前，据报道卵泡抑素具有特别短暂的血清半 衰期，此构成将卵泡抑素开发成蛋白质治疗剂的重大障碍。举例来说，典型可商购获得的野 生型卵泡抑素（FS315)蛋白具有血清半衰期约1小时。Fc-融合蛋白已用于延长卵泡抑素 的血清半衰期。然而，由于Fc结构域的尺寸较大，以及卵泡抑素蛋白的尺寸相对较小，认为 Fc结构域直接融合于卵泡抑素蛋白可干扰野生型卵泡抑素蛋白的正常结构和功能。所报道 的卵泡抑素的不良药物动力学/药力学（PK/PD)性质和与卵泡抑素-Fc融合蛋白相关的不 确定性已阻碍科学家和临床医师进一步将卵泡抑素开发成用于DMD或其它肌营养不良的 蛋白质疗法。实际上，在本发明之前，基因疗法已成为用于DMD的基于卵泡抑素的疗法的焦 点。由本发明者显示的出乎意料优越的体内功效和半衰期首次确定卵泡抑素可为用于治疗 DMD的有效蛋白质治疗剂。
[0008] 在一个方面，本发明提供治疗杜兴氏肌营养不良（DMD)的方法，其包括向罹患或 易患DMD的个体施用有效量的重组卵泡抑素蛋白以使DMD的至少一种症状或特征在强度、 严重性或频度方面得以降低，或延迟发作。在一些实施方案中，DMD的至少一种症状或特征 选自由以下组成的组：肌肉消耗、肌肉无力、肌肉脆弱、关节挛缩、骨骼变形、脂肪浸润肌肉、 肌肉被非收缩性组织替换（例如肌肉纤维化）、肌肉坏死、心肌病、吞咽受损、肠和膀胱功能 受损、肌肉缺血、认知功能损害（例如学习困难、神经行为病症的危险较高、认知缺陷）、行 为功能障碍、社交损害、脊柱侧凸和呼吸功能受损。
[0009] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋 白
[0010] GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCE NVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDV FCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCE DIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISE DTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW(SEQ ID N0:1)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同的氨基酸序列。
[0011] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1至少70%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人 卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1至少80%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑 素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1至少90%相同的氨基酸序列。在一些实 施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1至少95%相同的 氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1相同的氨基酸序列。
[0012] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白相较于野生型人卵泡抑素蛋白包含一个或 多个缺失、突变或插入。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包含SEQ ID NO: 1的氨基酸 残基212-288(其对应于结构域3)的缺失。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包含肝 素结合位点。
[0013] 在一些实施方案中，本发明提供治疗杜兴氏肌营养不良（DMD)的方法，其包括向 罹患或易患DMD的个体施用有效量的重组卵泡抑素蛋白以使DMD的至少一种症状或特征在 强度、严重性或频度方面得以降低，或延迟发作，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与GNCWLR QAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKN KPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYC VTCNRICPEPAS SEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILE W(SEQ ID N0:2)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%)相同的氨基酸序列。
[0014] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID NO:2至少70%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID NO:2至少80%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID NO:2至少90%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID NO:2至少95%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID N0:2相同的氨基酸序列。
[0015] 在一些实施方案中，DMD的至少一种症状或特征选自由以下组成的组：肌肉消耗、 肌肉无力、肌肉脆弱、肌肉肥大、肌肉假性肥大、关节挛缩、骨骼变形、心、肌病、吞咽受损、肠 和膀胱功能受损、肌肉缺血、认知损害、行为功能障碍、社交损害、脊柱侧凸和呼吸功能受 损。
[0016] 在一些实施方案中，使重组卵泡抑素蛋白融合于Fc结构域。在一些实施方案中， 适于本发明的Fc结构域包含与
[0020] 在一些实施方案中，Fc结构域包含与SEQ ID NO:3、4或14至少80%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含与SEQ ID N0:3、4或14至少90%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含与SEQ ID N0:3、4或14至少95%相同的氨基 酸序列。
[0021] 在一些实施方案中，合适的Fc结构域包含一个或多个改进Fc结构域与FcRn受体 之间的结合，从而导致血清半衰期延长的突变。在一些实施方案中，合适的Fc结构域在对 应于人 IgGl 的 Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433 和/或Asn 434的一个或多个位置处包含一个或多个突变。在特定实施方案中，合适的Fe 结构域含有突变H433K(His433Lys)和/或N434F(Asn434Phe)。在特定实施方案中，合适的 Fc结构域包含以下所示的并有突变H433K(His433Lys)和N434F(Asn434Phe)的序列：
[0023] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是通过接头融合于Fc结构域。在一些实施 方案中，接头是包含3-100个氨基酸的肽。在一些实施方案中，接头不是由ALEVLFQGP组 成的接头。在一些实施方案中，接头包含在10-100个、10-90个、10-80个、10-70个、10-60 个、10-50个、10-40个、10-30个、10-20个、10-15个之间的氨基酸。在一些实施方案中，接 头包含至少 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 或 95 个氨基酸。在 一些实施方案中，接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG接头，SEQ ID NO: 5)至少50% (例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%) 相同的序列。在一些实施方案中，接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGA ￡(GAG2 接头，SEQ ID N0:6)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%)相同的序列。在一些实施方案中，接头包含与^AEGG GGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG3 接头，SEQ ID NO:7)至 少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%)相同的序列。在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7相同的序列。
[0024] 在一些实施方案中，本发明提供一种重组卵泡抑素融合蛋白，其包括卵泡抑素多 肽、Fc结构域和使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的长度是至少10 (例如至少15、 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 或 95)个氨基酸的接头。在一些实施 方案中，本发明提供一种重组卵泡抑素融合蛋白，其包括卵泡抑素多肽、Fc结构域和使所述 卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头，其中所述接头不是由ALEVLFQGP组成的接头。 在一些实施方案中，合适的卵泡抑素多肽包含与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID N0:1)至 少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活 化素、肌抑素和/或GDF-11，并且具有在约0. 5-10天的范围内的体内半衰期。
[0025] 在特定实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白包含与SEQ ID N0:8
97%、98%、99%或100% )相同的氨基酸序列。
[0030] 在特定实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白包含与SEQ ID NO: 10
97%、98%、99%或100% )相同的氨基酸序列。
[0039] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白是由哺乳动物细胞产生。在 一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵 巢（CHO)细胞或HT1080细胞。
[0040] 应了解本发明的实施方案可通过多种途径来递送。在一些实施方案中，重组卵泡 抑素蛋白是全身性施用。在一些实施方案中，全身性施用选自静脉内、皮内、吸入、经皮（表 面）、眼内、肌肉内、皮下、肌肉内、经口和/或经粘膜施用。
[0041] 实施方案可通过许多给药方案来施用。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是 每两月、每月、每三周、每两周、每周、每日或在可变间隔下施用。
[0042] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向一种或多种选自横纹肌（例如骨骼 肌、心肌）的靶标组织递送。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向心脏递送。在一些 实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向骨骼肌递送。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是 向一种或多种选自表1的骨骼肌递送。在一些实施方案中，横纹肌（例如骨骼肌）选自由 三头肌、胫骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、二头肌、斜方肌、三角肌、四头肌和膈肌组成的组。
[0043] 在一些实施方案中，施用重组卵泡抑素蛋白会导致肌肉再生、纤维化减轻、肌肉力 量增加、灵活性增加、活动范围增加、耐力增加、易疲劳性降低、血流增加、认知改进、肺功能 改进、炎症抑制、肌肉纤维化和/或坏死减轻。
[0044] 在另一方面，本发明提供用于本文所述的各种方法中的组合物。在一些实施方案 中，本发明提供重组卵泡抑素融合蛋白，其包括卵泡抑素多肽、Fc结构域和使所述卵泡抑素 多肽与所述Fc结构域缔合的接头，其中所述卵泡抑素多肽包含与野生型人卵泡抑素蛋白 (SEQ ID N0:1)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融 合蛋白能够结合活化素、肌抑素和/或GDF-11。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋 白的体内半衰期大于约2天（例如大于约2. 5天、约3天、约3. 5天、约4天、约4. 5天、约 5天、约5. 5天、约6天）。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋白的体内半衰期在约 2-10天的范围内（例如在约2. 5-10天、约3-10天、约3. 5-10天、约4-10天、约4. 5-10天、 约5-10天、约3-8天、约3. 5-8天、约4-8天、约4. 5-8天、约5-8天、约3-6天、约3. 5-6天、 约4-6天、约4. 5-6天、约5-6天的范围内）。在一些实施方案中，体内半衰期是在小鼠、大 鼠、非人灵长类动物和/或人中的一个或多个中测量。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽具 有与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID NO: 1)至少70%相同的氨基酸序列。在一些实施方 案中，卵泡抑素多肽具有与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID NO: 1)至少80%相同的氨基酸 序列。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽具有与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID N0:1)至 少90 %相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽具有与野生型人卵泡抑素蛋 白（SEQ ID NO: 1)至少95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽具有与 野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID NO: 1)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，卵泡抑素 多肽含有SEQ ID NO: 1的氨基酸残基212-288(其对应于结构域3)的缺失。在各种实施方 案中，卵泡抑素多肽含有硫酸肝素结合位点。
[0045] 在一些实施方案中，本发明提供重组卵泡抑素融合蛋白，其包括卵泡抑素多肽、Fc 结构域和使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头，其中所述卵泡抑素多肽包含
[0046] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活化素、肌抑素和/或 GDF-11。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋白的体内半衰期大于约2天（例如大于 约2. 5天、约3天、约3. 5天、约4天、约4. 5天、约5天、约5. 5天、约6天）。在一些实施方 案中，重组卵泡抑素融合蛋白的体内半衰期在约2-10天的范围内（例如在约2. 5-10天、约 3-10天、约3. 5-10天、约4-10天、约4. 5-10天、约5-10天、约3-8天、约3. 5-8天、约4-8 天、约4. 5-8天、约5-8天、约3-6天、约3. 5-6天、约4-6天、约4. 5-6天、约5-6天的范围 内）。在一些实施方案中，体内半衰期是在小鼠、大鼠、非人灵长类动物和/或人中的一个或 多个中测量。
[0047] 在一些实施方案中，Fc结构域是IgGlFc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域具
[0050] 在一些实施方案中，合适的Fc结构域包含一个或多个改进Fc结构域与FcRn受体 之间的结合，从而导致血清半衰期延长的突变。在一些实施方案中，Fc结构域在对应于人 IgGl 的 Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433和 /或 Asn 434的一个或多个位置处包含一个或多个突变。在特定实施方案中，合适的Fe结构域 含有突变H433K(His433Lys)和/或N434F(Asn434Phe)。在特定实施方案中，合适的Fc结 构域包含以下所示的并有突变H433K(His433Lys)和N434F(Asn434Phe)的序列：
[0052] 在一些实施方案中，本发明的重组卵泡抑素融合蛋白包括接头以使通过所述接头 达成的Fc融合不实质上改变卵泡抑素与同源配体的结合性质，包括维持缺乏与肝素结合。 在一些实施方案中，合适的接头是包含3-60个氨基酸的肽。在一些实施方案中，合适的接 头是包含至少 1〇(例如至少 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 或 95) 个氨基酸的肽。在一些实施方案中，合适的接头包含与eAEGGGGGAAAAAGGGGGSAE(GAG接头， SEQ ID NO:5)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%)相同的序列。在一些实施方案中，合适的接头包含与GAP GGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG2 接头，SEQ ID NO: 6)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同 的序列。在一些实施方案中，合适的接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGG GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG3 接头，SEQ ID NO: 7)至少 50 % (例如至少 55 %、60 %、65 %、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同的序列。
[0053] 在特定实施方案中，由本发明提供的重组卵泡抑素融合蛋白包含与SEQIDN0:8、 9、10、11、16 或 17 至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同的氨基酸序列。
[0054] 在一些实施方案中，本发明提供包含编码本文所述的重组卵泡抑素融合蛋白的核 苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核酸的细胞，所述核酸包含编码 本文所述的重组卵泡抑素融合蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含本 文所述的重组卵泡抑素融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0055] 如本申请中所用，术语"约"和"近似"用作等效语。与或不与约/近似一起用于 本申请中的任何数字都意图涵盖由相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动。
[0056] 本发明的其它特征、目标和优势在以下详细描述中显而易知。然而，应了解尽管指 示本发明的实施方案，但详细描述是通过仅仅说明而非限制的方式给出。在本发明的范围 内的各种变化和修改将根据详细描述而变得为本领域技术人员显而易知。
[0057] 附图简述
[0058] 图式仅出于说明目的而出于非限制目的。
[0059] 图1显示说明相较于可商购获得的可溶性活化素受体（sActRIIB)，FS315_Fc不通 过Smad 1/5/8路径抑制BMP-9或BMP-10信号传导的示例性结果。图IA显示BMP-9抑制 测定的示例性结果，而图IB显示BMP-10抑制测定的示例性结果。
[0060] 图2显示说明FS315-FC抑制肌抑素和活化素介导的Smad 2/3信号传导的示例性 结果。图2A显示肌抑素抑制测定的示例性结果，而图2B显示活化素A抑制测定的示例性 结果。
[0061] 图3显示说明跨越各组织的PK曲线的示例性结果。一示例性卵泡抑素-Fc蛋白 具有于小鼠血清中的血清半衰期~5天（图3A)和组织半衰期2 - 5天（图3B)。
[0062] 图4显不说明在4和10周暴露于lmg/kg FS315_mFc以及6周暴露于8mg/kg之 后，示例性卵泡抑素-Fc蛋白对四头肌（图4A)、腓肠肌（图4B)、胫骨 前肌（图4C)和三头 肌（图4D)的肌肉重量的影响的示例性结果。肌肉重量是相对于基线体重加以校正。
[0063] 图5显示说明示例性卵泡抑素-Fc蛋白随时间对血清卵泡抑素水平的影响的示例 性结果。图5A显示在历经10周用lmg/kg FS315-mFc治疗之后于血清中的水平，而图5B 显示在历经6周用8mg/kg FS315-mFc治疗之后于血清中的水平。
[0064] 图6显示说明在暴露于FS315-mFc、sActRIIB-mFc或PBS对照之后，示例性卵泡抑 素-Fe蛋白对腓肠肌的肌肉重量的影响的示例性结果。
[0065] 图7显示说明野生型卵泡抑素和变体对体重的影响的示例性结果。图片A显示各 组中动物随时间的示例性平均体重，而图片B显示各组中动物在注射后第6周的示例性平 均体重。
[0066] 图8显示说明在注射后第2周卵泡抑素变体对注射的肌肉的重量的影响的示例性 结果。图片A显示注射的肌肉腓肠肌的质量，而图片B显示注射的肌肉四头肌的质量。
[0067] 图9显示说明在注射后2周结构域3缺失对注射的肌肉和远离注射部位的肌肉的 影响的示例性结果。左侧四头肌是注射部位，而右侧四头肌是对侧动物内对照肌肉。
[0068] 图10显示说明在注射后第4周卵泡抑素变体对注射部位中以及远离注射部位的 具体肌肉的重量的影响的示例性结果。图片A(腓肠肌）和图片B(四头肌）是注射的肌肉。 图片C (胫骨前肌）、图片D (三头肌）和图片E (膈肌）是远离注射部位的肌肉。
[0069] 图11显示说明在注射后4周结构域3缺失对注射的肌肉和远离注射部位的肌肉 的影响的示例性结果。左侧四头肌是注射部位，而右侧四头肌是对侧动物内对照肌肉。
[0070] 图12显示说明在注射后第2周卵泡抑素变体对注射的肌肉与远端肌肉两者中，即 (A)四头肌、（B)腓肠肌、（C)胫骨前肌、（D)三头肌和（E)膈肌中纤维尺寸的影响的示例性 结果
[0071]图13显示说明在注射后第4周卵泡抑素变体对注射的肌肉与远端肌肉两者中，即 (A)四头肌、（B)腓肠肌、（C)胫骨前肌、（D)三头肌和（E)膈肌中纤维尺寸的影响的示例性 结果
[0072] 图14显示说明在注射后第6周卵泡抑素变体对注射的肌肉与远端肌肉两者中，即 (A)四头肌、（B)腓肠肌、（C)胫骨前肌、（D)三头肌和（E)膈肌中纤维尺寸的影响的示例性 结果
[0073] 图15显示说明在4周暴露之后示例性卵泡抑素-Fe蛋白对A)C57小鼠和B)mdx 小鼠的腓肠肌中的肌纤维的直径的影响的示例性结果。
[0074] 图16显示说明相较于媒介物对照动物，在2、4、6或8周暴露之后示例性卵泡抑 素-Fe蛋白对治疗的C57小鼠的体重的影响的示例性结果。
[0075] 图17以超过媒介物对照动物的增加百分比形式显示说明在4和8周暴露之后示 例性卵泡抑素-Fe蛋白对治疗的动物的三头肌和四头肌的重量的影响的示例性结果。
[0076] 图18以超过媒介物对照动物的增加百分比形式显示说明在4和8周暴露之后示 例性卵泡抑素-Fe蛋白对治疗的动物的三头肌和四头肌中的肌纤维的直径的影响的示例 性结果。
[0077] 图19显示在1、3、4、6或8周暴露之后，通过每周两次皮下注射施用融合蛋白的动 物的血清中的卵泡抑素-Fe蛋白的示例性水平。图片A)显示在4周之后安乐死的动物的 结果，而图片B)显示在8周暴露之后安乐死的动物的结果。
[0078] 图20显示说明在6或12周暴露之后，相较于媒介物对照动物，卵泡抑素-Fe蛋白 对治疗的动物的四头肌中的三种纤维化标记：a -平滑肌肌动蛋白、含有胶原蛋白三螺旋 重复序列的蛋白质l(cthrcl)和胶原蛋白I的mRNA表达的影响的示例性结果。
[0079] 图21显示用媒介物或卵泡抑素-Fe蛋白治疗6周的mdx小鼠的四头肌和三头肌 的示例性H&E染色切片。也显示C57对照小鼠的四头肌和三头肌的示例性H&E染色。
[0080] 图22显示用媒介物或卵泡抑素-Fe蛋白治疗12周的mdx小鼠的四头肌、三头肌 和膈肌的示例性胶原蛋白I染色切片。也显示C57对照小鼠的四头肌、三头肌和膈肌的示 例性胶原蛋白I染色。
[0081] 图23显示说明相较于对侧媒介物对照肌肉，每周两次肌肉内注射两种卵泡抑素 变体，即FS315-mFc融合蛋白和dFSD3-mFc变体融合蛋白中的一个对治疗4周的C57BL/10 小鼠的肌肉重量的影响的示例性结果。
[0082] 图24显示说明FS315-GAG3-mFc和FS315-GAG3-hFc融合蛋白在CAGA-荧光素酶 测定中在与天然FS315相同的程度上抑制（A)肌抑素和（B)活化素信号传导的示例性结 果。相比较来说，含有9个氨基酸接头的Sino Biological FS315_hFc (由Sino Biological Inc?制造，目录号10685-H02H)的强力性显著较小。
[0083]图25显示以单次SC注射10mg/kg蛋白质给药的大鼠的血清中的FS315-GAG3-hFc 蛋白的水平。计算的血清半衰期是3. 5天。
[0084] 定义
[0085]为使本发明更易于理解，以下首先定义某些术语。以下术语和其它术语的其它定 义在整篇说明书中加以阐述。
[0086]动物：如本文所用，术语"动物"是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，"动 物"是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，"动物"是指处于任何发育阶段的非 人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物（例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、 猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪）。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟、 爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可为转基因动物、遗传 工程化动物和/或克隆。
[0087]近似或约：如本文所用，如应用于一个或多个目标值的术语"近似"或"约"是指 值类似于所述参照值。在某些实施方案中，除非另外陈述或另外根据上下文是明显的，否 则术语"近似"或"约"是指一定范围的值落在所述参照值在任一方向（大于或小于）上的 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、 5%、4%、3%、2%、1%或小于1%内（例外之处是当所述数值将超过可能值的100%时）。 [0088] 生物利用度：如本文所用，术语"生物利用度"通常是指到达受试者的血流的施用 剂量的百分比。
[0089]生物活性：如本文所用，短语"生物活性"是指在生物系统中，并且特别是在生物体 中具有活性的任何药剂的特征。举例来说，当向生物体施用时，对那个生物体具有生物作用 的药剂被视为具有生物活性。在特定实施方案中，当肽具有生物活性时，那个肽的共有所述 肽的至少一种生物活性的部分通常称为"生物活性"部分。
[0090]心肌：如本文所用，术语"心肌"是指见于心脏壁中的不随意横纹肌类型，并且特别 是心肌层。
[0091] 载体或稀释剂：如本文所用，术语"载体"和"稀释剂"是指适用于制备药物制剂的 药学上可接受的（例如安全和无毒用于向人施用）载体或稀释物质。示例性稀释剂包括无 菌水、抑菌注射用水（BWFI)、pH缓冲溶液（例如磷酸盐缓冲盐水）、无菌盐水溶液、林格氏 溶液（Ringer's solution)或右旋糖溶液。
[0092]卵泡抑素或重组卵泡抑素：如本文所用，除非另外规定，否则术语"卵泡抑素 (FS) "或"重组卵泡抑素"是指保留实质性卵泡抑素生物活性的任何野生型和修饰的卵泡抑 素蛋白（例如具有氨基酸突变、缺失、插入的卵泡抑素蛋白、和/或融合蛋白）。缺失的一非 限制性实例是结构域3缺失（AD3或dFSD3)。融合蛋白的一非限制性实例是Fc-融合蛋 白。
[0093]功能性等效物或衍生物：如本文所用，在氨基酸序列的功能性衍生物的情形下，术 语"功能性等效物"或"功能性衍生物"表示保留大致上类似于原始序列的生物活性的生物 活性（功能或结构）的分子。功能性衍生物或等效物可为天然衍生物，或是合成制备。示 例性功能性衍生物包括具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列，前提是 蛋白质的生物活性得以保全。取代性氨基酸合乎需要地具有与被取代的氨基酸的化学物理 性质类似的化学物理性质。合乎需要的类似化学物理性质包括电荷、体积大小、疏水性、亲 水性等方面的类似性。
[0094]融合蛋白：如本文所用，术语"融合蛋白"或"嵌合蛋白"是指通过接合两个或更多 个最初分开的蛋白质或其部分产生的蛋白质。在一些实施方案中，接头或间隔子将存在于 各蛋白质之间。
[0095]半衰期：如本文所用，术语"半衰期"是为如蛋白质浓度或活性的数量降至它的如 在某一时期开始时测量的值的一半所需的时间。
[0096]肥大：如本文所用，术语"肥大"是指器官或组织的体积由于它的组成细胞的增大 而增加。
[0097]改进、增加或降低：如本文所用，术语"改进"、"增加"或"降低"或语法等效形式指 示相对于基线测量结果的值，所述基线测量结果如同一个体中在启始本文所述的治疗之前 的测量结果，或对照受试者（或多个对照受试者）中在不存在本文所述的治疗下的测量结 果。"对照受试者"是与所治疗的受试者受相同形式的疾病折磨，与所治疗的受试者具有大 约相同的年龄的受试者。
[0098]体外：如本文所用，术语"体外"是指事件发生在人工环境中，例如试管或反应容器 中，细胞培养物中等，而非在多细胞生物体内。
[0099] 体内：如本文所用，术语"体内"是指事件发生在多细胞生物体，如人和非人动物 内。在基于细胞的系统的情形下，所述术语可用于指代事件发生在活细胞内（与例如体外 系统相反）。
[0100] 接头：如本文所用，术语"接头"是指在融合蛋白中，除出现在天然蛋白质中的特定 位置处的氨基酸序列以外的氨基酸序列，并且通常被设计来具有可挠性或插入两个蛋白质 部分之间的结构，如a-螺旋。接头也称为间隔子。接头或间隔子通常自身不具有生物功 能。
[0101] 多肽：如本文所用的术语"多肽"是指通过肽键连接在一起的氨基酸的连续链。所 述术语用于指代具有任何长度的氨基酸链，但本领域普通技术人员应了解，所述术语不限 于过长链，并且可指包含两个通过肽键连接在一起的氨基酸的最小链。如为本领域技术人 员所知，多肽可被加工和/或修饰。如本文所用，术语"多肽"和"肽"可互换使用。
[0102] 预防：如本文所用，术语"预防（prevent/prevention) "在与疾病、病症和/或病 状的发生关联使用时是指降低显现所述疾病、病症和/或病状的危险。参见对"危险"的定 义。
[0103] 蛋白质：如本文所用的术语"蛋白质"是指一个或多个充当个别单元的多肽。如果 单一多肽是个别功能性单元，并且不需要与其它多肽永久或暂时物理缔合以形成个别功能 性单元，那么术语"多肽"和"蛋白质"可互换使用。如果个别功能性单元包含一个以上彼 此物理缔合的多肽，那么术语"蛋白质"是指物理偶联，并且一起充当个别单元的多个多肽。
[0104] 危险：如将根据上下文所了解，疾病、病症和/或病状的"危险"包括特定个体将显 现疾病、病症和/或病状（例如肌营养不良）的可能性。在一些实施方案中，将危险表示为 百分比。在一些实施方案中，危险是 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90 直至100%。在一些实施方案中，将危险表不为相对于与某一参照样本或一组参照样本相 关的危险的危险。在一些实施方案中，某一参照样本或一组参照样本具有疾病、病症、病状 和/或事件（例如肌营养不良）的已知危险。在一些实施方案中，某一参照样本或一组参 照样本来自与特定个体类似的个体。在一些实施方案中，相对危险是〇、1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10或大于10。
[0105] 横纹肌：如本文所用，术语"横纹肌"是指多核肌肉组织，其中它们的细胞内收缩性 单位（即肌小节）规则排列，从而导致在使用显微术下出现条纹并处于随意控制下。通常， 横纹肌可为心肌、骨骼肌和鳃节肌。
[0106] 平滑肌：如本文所用，术语"平滑肌"是指不随意控制的非横纹肌，包括单一肌肉和 多单位肌肉。
[0107] 受试者：如本文所用，术语"受试者"是指人或任何非人动物（例如小鼠、大鼠、兔、 狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物）。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中， 受试者是人类。受试者可为患者，其是指向医疗提供者递呈以诊断或治疗疾病的人。术语 "受试者"在本文中可与"个体"或"患者"互换使用。受试者可受疾病或病症折磨或易患疾 病或病症，但可或可不显示所述疾病或病症的症状。
[0108] 大致上：如本文所用，术语"大致上"是指展现总体或接近总体范围或程度的目标 特征或性质的定性情况。生物领域普通技术人员将了解如果发生，那么生物和化学现象很 少达到完全和/或进行至完全或达成或避免绝对结果。因此，术语"大致上"在本文中用于 获取许多生物和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
[0109] 大致同源性：短语"大致同源性"在本文中用于指代氨基酸或核酸序列之间的比 较。如将由本领域普通技术人员所了解，如果两个序列在相应位置中含有同源残基，那么它 们通常被视为"大致上同源"。同源残基可为相同残基。或者，同源残基可为将具有适当类 似结构和/或功能特征的非相同残基。举例来说，如本领域普通技术人员所熟知，某些氨基 酸通常被分类为"疏水性"或"亲水性"氨基酸，和/或具有"极性"或"非极性"侧链。将一 个氨基酸取代成另一相同类型可常被视为"同源"取代。
[0110] 如本领域中所熟知，可使用多种算法中的任一个比较氨基酸或核酸序列，所 述算法包括如针对核苷酸序列的BLASTN以及针对氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST 和PSI-BLAST的商业计算机程序中可用的那些。示例性所述程序描述于Altschul 等，Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. ,215(3) :403_410，1990; Altschul 等，Methods in Enzymology ;Altschul 等，''Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"，Nucleic Acids Res.25:3389_3402, 1997 ;Baxevanis 等，Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998 ;以及 Misener 等（编），Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,第 132卷），Humana Press, 1999 中。除鉴定同源序列之外，以上提及的程序也通常提供同源性程度的指示。在一些实施方 案中，如果历经一段相关残基，两个序列的相应残基中的至少50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多是同源 的，那么它们被视为大致上同源。在一些实施方案中，相关链段是完整序列。在一些实施方 案中，相关链段是至少 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、 125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500 个或更多个残 基。
[0111] 大致同一性：短语"大致同一性"在本文中用于指代氨基酸或核酸序列之间的比 较。如将由本领域普通技术人员所了解，如果两个序列在相应位置中含有相同残基，那么它 们通常被视为"大致上相同"。如本领域中所熟知，可使用多种算法中的任一个比较氨基酸 或核酸序列，所述算法包括如针对核苷酸序列的BLASTN以及针对氨基酸序列的BLASTP、空 位BLAST和PSI-BLAST的商业计算机程序中可用的那些。示例性所述程序描述于Altschul 等，Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. ,215(3) :403_410, 1990 ;Altschul 等，Methods in Enzymology ;Altschul 等，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis 等,Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins，Wiley，1998;以及 Misener 等（编），Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,第 132 卷），Humana Press, 1999 中。除鉴定 相同序列之外，以上提及的程序也通常提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果历 经一段相关残基，两个序列的相应残基中的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于 99%是相同的，那么 它们被视为大致上相同。在一些实施方案中，相关链段是完整序列。在一些实施方案中， 相关链段是至少 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、 150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500 个或更多个残基。
[0112] 罹患：正"罹患"疾病、病症和/或病状的个体已被诊断有或显示所述疾病、病症和 /或病状的一种或多种症状。
[0113] 易患："易患"疾病、病症和/或病状的个体尚未被诊断有所述疾病、病症和/或病 状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体可不展现所述疾病、病症和/或 病状的症状。在一些实施方案中，易患疾病、病症、病状或事件（例如DMD)的个体可具有一 个或多个以下特征：（1)与显现所述疾病、病症和/或病状相关的遗传突变；（2)与显现所 述疾病、病症和/或病状相关的遗传多态性；（3)与所述疾病、病症和/或病状相关的蛋白 质的表达和/或活性增加和/或降低；(4)与显现所述疾病、病症、病状和/或事件相关的 习惯和/或生活方式；（5)已经受、计划经受或需要移植。在一些实施方案中，易患疾病、病 症和/或病状的个体将显现所述疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患疾病、病 症和/或病状的个体将不显现所述疾病、病症和/或病状。
[0114] 靶标组织：如本文所用，术语"靶标组织"是指受待治疗的疾病，如杜兴氏肌营养不 良（DMD)影响的任何组织。在一些实施方案中，靶标组织包括显示疾病相关的病变、症状或 特征，包括但不限于肌肉消耗、骨骼变形、心肌病和呼吸功能受损的那些组织。
[0115] 治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的"治疗有效量"是指当向罹患或易患疾病、 病症和/或病状的受试者施用时，足以治疗、诊断、预防所述疾病、病症和/或病状的症状和 /或延迟其发作的量。本领域普通技术人员应了解，治疗有效量通常是通过包含至少一个单 位剂量的给药方案施用。
[0116] 治疗：如本文所用，术语"治疗（treat/treatment/treating) "是指用于部分或完 全减轻、改善、缓和、抑制、预防特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征、延迟 其发作、减轻其严重性、和/或降低其发生率的任何方法。治疗可向不展现疾病的征象和 /或仅展现所述疾病的早期征象的受试者施用以达成降低显现与所述疾病相关的病变的危 险的目的。
[0117] 某些实施方案的详述
[0118] 本发明尤其提供用于基于作为蛋白质治疗剂的卵泡抑素来治疗肌营养不良，包括 杜兴氏肌营养不良（DMD)和/或贝克尔肌营养不良的方法和组合物。在一些实施方案中， 本发明提供治疗DMD的方法，其包括向罹患或易患DMD的个体施用有效量的重组卵泡抑素 蛋白以使DMD的至少一种症状或特征在强度、严重性或频度方面得以降低，或延迟发作。
[0119] 本发明的各个方面详述于以下章节中。使用所述章节不意图限制本发明。各章节 可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外陈述，否则使用"或"是指"和/或"。
[0120] 杜兴氏肌营养不良（DMD)
[0121] DMD是一种特征在于全身肌肉进行性退化以及肌肉相关功能丧失的疾病。预期本 发明提供用于再生肌肉以及治疗各种肌肉组织中与DMD和其它肌营养不良相关的纤维化、 炎症和其它症状或特征的方法和组合物。在一些实施方案中，在受试者中使用提供的方法 和组合物会导致那个受试者的纤维化和/或坏死减轻。
[0122] 肌肉组织
[0123] 在动物中存在两种主要类型的肌肉组织-横纹肌和平滑肌。如本文所用，术语 "横纹肌"是指含有重复肌小节的肌肉组织。横纹肌倾向于处于随意控制下，并且连接于骨 骼，但存在一些例外，如心肌，其具有横纹肌的若干性质，但不处于随意控制下。通常，横纹 肌允许身体随意运动，并且包括主要肌肉群，包括四头肌、腓肠肌、二头肌、三头肌、斜方肌、 三角肌和许多其它肌肉群。横纹肌倾向于是极长的，并且许多横纹肌能够独立地起作用。然 而，一些横纹肌不连接于骨骼，包括口腔、肛门、心脏和食道上部中的那些。
[0124] 另一方面，平滑肌具有极其不同的结构。并非 是具有单独骨骼连接的一系列长肌， 平滑肌倾向于组织成连续薄片，其中在平滑肌细胞之间具有机械连接。平滑肌常位于中空 器官的壁中，并且通常不处于随意控制下。衬于特定器官的平滑肌必须承担相同负荷并同 时收缩。平滑肌至少部分地起处理中空器官上由运动和/或姿势或压力变化引起的负荷变 化的作用。这个双重作用意味着平滑肌必须不仅能够像横纹肌一样收缩，而且它必须能够 紧张性收缩以针对持续负荷维持器官尺寸。平滑肌的实例是衬于血管、膀胱、胃肠道（如直 肠）的那些。
[0125] 肌肉的强度取决于肌肉细胞的数目和尺寸以及它们的解剖排列。通过现存肌原纤 维的尺寸增加（肥大）和/或更多肌肉细胞的形成（增生）来增加肌肉纤维的直径将使肌 肉的力量产生能力增加。
[0126] 肌肉也可根据位置或功能来分组。在一些实施方案中，使重组卵泡抑素蛋白靶向 面部的一种或多种肌肉、一种或多种用于咀嚼的肌肉、舌部和颈部的一种或多种肌肉、胸部 的一种或多种肌肉、胸带和手臂的一种或多种肌肉、手臂和肩部的一种或多种肌肉、一种或 多种腹侧和背侧前臂肌肉、手部的一种或多种肌肉、竖脊肌的一种或多种肌肉、骨盆带和腿 部的一种或多种肌肉、和/或前腿和足部的一种或多种肌肉。
[0127] 在一些实施方案中，面部的肌肉包括但不限于眼内肌肉，如睫状肌、虹膜开大肌、 虹膜括约肌；耳部的肌肉，如耳廓肌、颞顶肌、镫骨肌、鼓膜张肌；鼻部的肌肉，如降眉间肌、 鼻肌、鼻孔开大肌、降鼻中隔肌、提上唇鼻翼肌；口腔的肌肉，如提口角肌、降口角肌、口轮匝 肌、颊肌、颧大肌和颧小肌、颈阔肌、提上唇肌、降下唇肌、笑肌、颏肌和/或皱眉肌。
[0128] 在一些实施方案中，咀嚼肌包括但不限于咬肌、颞肌、翼内肌、翼外肌。在一些实施 方案中，舌部和颈部的肌肉包括但不限于颏舌肌、茎突舌肌、舌腭肌、舌骨舌肌、二腹肌、茎 突舌骨肌、下颁舌骨肌、颏舌骨肌、肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌、胸骨甲状肌、甲状舌骨肌、胸锁 乳突肌、前斜角肌、中斜角肌和/或后斜角肌。
[0129] 在一些实施方案中，胸部、胸带和手臂的肌肉包括但不限于锁骨下胸大肌、胸小 肌、腹直肌、外腹斜肌、内腹斜肌、腹横肌、膈肌、肋间外肌、肋间内肌、前锯肌、斜方肌、肩胛 提肌、大菱形肌、小菱形肌、背阔肌、三角肌、肩胛下肌、冈上肌、冈下肌、大圆肌、小圆肌和/ 或P彖肽肌。
[0130] 在一些实施方案中，手臂和肩部的肌肉包括但不限于肱二头肌-长头、肱二头 肌-短头、肱三头肌-长头、肱三头肌外侧头、肱三头肌-内侧头、肘肌、旋前圆肌、旋后肌和 /或肱肌。
[0131] 在一些实施方案中，腹侧和背侧前臂的肌肉包括但不限于肱桡肌、屈腕肌、尺侧腔 屈肌、掌长肌、尺侧腕伸肌、桡侧腕长伸肌、桡侧腕短伸肌、指伸肌、小指伸肌。
[0132] 在一些实施方案中，手部的肌肉包括但不限于手部的内附肌，如鱼际、拇短展肌、 拇短屈肌、拇指对掌肌、小鱼际、小指展肌、小指短屈肌、小指对掌肌、骨间掌侧肌、骨间背侧 肌和/或蚓状肌。
[0133] 在一些实施方案中，竖脊肌包括但不限于颈肌、棘肌、最长肌和/或髂肋肌。
[0134] 在一些实施方案中，骨盆带和腿部的肌肉包括但不限于腰大肌、髂肌、股方肌、长 收肌、短收肌、大收肌、股薄肌、缝匠肌、股四头肌（如股直肌、股外侧肌、股内侧肌、股中间 肌）、腓肠肌、腓骨长肌（腓长肌）、比目鱼肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、腿筋：股二头肌：长 头、腿筋：股二头肌：短头、腿筋：半腱肌、腿筋：半膜肌、阔筋膜张肌、耻骨肌和/或胫骨前 肌。
[0135] 在一些实施方案中，前腿和足部的肌肉包括但不限于趾长伸肌、拇长伸肌、腓骨短 肌、跖肌、胫骨后肌、拇长屈肌、趾短伸肌、拇短伸肌、展肌、拇短屈肌、小指展肌、小指屈肌、 小指对掌肌、趾短伸肌、足部的蚓状肌、足底方肌或副屈肌、趾短屈肌、骨间背侧肌和/或骨 间足底肌。
[0136] 示例性肌肉靶标概述于表1中。
[0137]表 1
[0138]
[0140] 肌营养不良
[0141] 肌营养不良是一组导致肌肉退化，从而导致运动无力和受损的遗传病症。所有肌 营养不良的主要特征都在于它们在性质上是进行性的。肌营养不良包括但不限于：杜兴氏 肌营养不良（DMD)、贝克尔肌营养不良、艾梅-德莱富斯（Emery-Dreifuss)肌营养不良、面 肩胛臂性肌营养不良、肢带肌营养不良、以及1型和2型肌强直性营养不良，包括先天性形 式的1型肌强直性营养不良。症状可随肌营养不良的类型而变化，其中一些或所有肌肉受 影响。肌营养不良的示例性症状包括肌肉运动技能的发展延迟、使用一个或多个肌肉群有 困难、吞咽、说话或进食有困难、垂涎、眼睑下垂、频繁跌倒、就成人而言某一肌肉或一组肌 肉的强度损失、肌肉尺寸损失、由于身体无力或生物力学改变所致的行走问题、肌肉肥大、 肌肉假性肥大、脂肪浸润肌肉、肌肉被非收缩性组织替换（例如肌肉纤维化）、肌肉坏死和/ 或认知或行为损害/精神迟缓。
[0142] 尽管不存在用于肌营养不良的已知治愈方法，但在使用包括对症性疗法与疾病 改进性疗法两者的若干支持性治疗。皮质类固醇、物理疗法、矫正装置、轮椅或针对ADL 和肺功能的其它辅助性医学装置通常用于肌营养不良中。心脏起搏器用于在肌强直性营 养不良中预防猝死于心律不整。改进肌强直（不能松驰）的症状的抗肌强直剂包括美西 律（mexilitine)，并且在一些情况下，包括苯妥英、普鲁卡因胺（procainamide)和奎宁 (quinine)〇
[0143] 杜兴氏肌营养不良
[0144] 杜兴氏肌营养不良（DMD)是隐性X染色体关联形式的肌营养不良，其导致肌肉退 化以及最终死亡。DMD的特征在于近端肌肉无力、步态异常、腓肠（小腿）肌假性肥大和肌 酸激酶（CK)升高。许多DMD患者在年龄约5岁时被确诊，此时症状/征象通常变得更明显。 受影响的个体通常在年龄约10-13岁时停止行走，并且由于心肺功能障碍而在他们的20多 岁的中期至后期时或之前死亡。
[0145] 病症DMD是由位于人X染色体上的肌营养不良蛋白基因的突变引起，所述基因编 码蛋白质肌营养不良蛋白，所述肌营养不良蛋白是肌肉组织内的一种对细胞膜的肌营养不 良蛋白聚糖复合物（DGC)提供结构稳定性的重要结构组分。肌营养不良蛋白连接内部细胞 质肌动蛋白微丝网状结构和细胞外基质，从而对肌肉纤维提供物理强度。因此，改变肌营养 不良蛋白或不存在肌营养不良蛋白会导致肌肉纤维的异常肌纤维膜撕裂和坏死。尽管两种 性别的人士均可携带突变，但女性很少展现重度疾病征象。
[0146] DMD的一主要症状是与肌肉消耗相关的肌肉无力，其中随意肌通常首先受影响，尤 其影响臀部、骨盆区域、大腿、肩部的肌肉以及小腿肌肉。肌肉无力也发生在手臂、颈部和其 它区域中。小腿常增大。征象和症状通常出现在6岁年龄之前，并且可早在婴儿期出现。其 它身体症状包括但不限于独立行走的能力延迟、进行性行走、步进或奔跑困难、以及最终丧 失行走能力（通常截至15岁年龄）；频繁跌倒；疲劳；运动技能（奔跑、弹跳、跳跃）有困难； 腰椎脊柱前凸增加，从而导致臀部屈肌缩短；因为肌肉纤维缩短以及在结缔组织中发生纤 维化所致的损害功能性的跟腱和腿筋挛缩；肌肉纤维变形；由肌肉组织被脂肪和结缔组织 替换引起的舌部和小腿肌肉的假性肥大（增大）；神经行为病症（例如ADHD)的危险较高、 学习障碍（阅读困难）、以及特定认知技能（具体来说短期言语性记忆）的非进行性薄弱； 骨骼变形（在一些情况下包括脊柱侧凸）。
[0147] 重组卵泡抑素蛋白
[0148] 如本文所用，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白包括保留实质性卵泡抑素生物活性 的任何野生型和修饰的卵泡抑素蛋白（例如具有氨基酸突变、缺失、插入的卵泡抑素蛋白、 和/或融合蛋白）。通常，重组卵泡抑素蛋白是使用重组技术产生。然而，自天然资源纯化 或化学合成的卵泡抑素蛋白（野生型或修饰）可根据本发明加以使用。通常，合适的重组 卵泡抑素蛋白的体内半衰期是或大于约12小时、18小时、24小时、36小时、2天、2. 5天、3 天、3. 5天、4天、4. 5天、5天、5. 5天、6天、6. 5天、7天、7. 5天、8天、8. 5天、9天、9. 5天或 10天。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白的体内半衰期在0. 5与10天之间、在1天与 10天之间、在1天与9天之间、在1天与8天之间、在1天与7天之间、在1天与6天之间、
[0149] 卵泡抑素（FS)是作为能够遏制垂体细胞卵泡刺激激素（FSH)分泌的蛋白质因子 而首先自卵泡液分离。FS至少部分地通过结合和中和活化素来对FSH施加它的影响。
[0150] FS存在至少两种通过在C末端处进行选择性剪接所产生的亚型：FS288和FS315。 288-氨基酸亚型具有独特结构，其包含具有63个氨基酸的N末端区域，所述区域含有对活 化素结合重要的疏水性残基；以及蛋白质的主要部分（残基64-288)，所述部分包含三个各 自具有近似73-75个氨基酸的10-半胱氨酸FS结构域。自N末端至C末端，这些10-半胱 氨酸结构域分别称为结构域1、结构域2和结构域3。FS315亚型是通过C末端的由额外外 显子编码的酸性延伸部分产生。由于存在肝素结合结构域，FS288倾向于被组织结合，而可 能因为肝素结合结构域由延伸的C末端掩蔽，所以FS315倾向于呈循环形式。
[0151] 已显示FS体外抑制肌抑素与活化素两者，并且这个抑制作用可体内导致小鼠的 肥大（Lee等，Regulation of Muscle Mass by Follista tin and Activins，（2010)，M0L. ENDOCRINOL.，24(10) : 1998-2008 ;Gilson 等，Follistatin Induces Muscle Hypertrophy Through Satellite Cell Proliferation and Inhibition of Both Myostatin and Activin, (2009)，J. PHYSIOL. ENDOCRINOL.，297(1) :E157-E164)。在不希望固守于特定理 论下，这个观察作用可至少部分地归因于FS阻止由肌抑素和活化素活化Smad2/3路径。 活化Smad2/3路径已显示会导致对肌肉生长的负性调控（Zhu等，Follistatin Improves Skeletal Muscle Healing After Injury and Disease Through an Interaction with Muscle Regeneration, Angiogenesis, and Fibrosis, (2011), MUSCUL0SKELE TAL PATHOLOGY, 179(2):915-930)。
[0152] 典型野生型或天然存在的人FS315和FS288蛋白的氨基酸序列显示于表2中。
[0153] 表2.示例性人卵泡抑素亚型
[0154]
[0155]因此，在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白是人FS315(SEQ ID NO:1)。如本文所公开，SEQ ID NO:1代表人卵泡抑素蛋白的典型氨基酸序列。在一些实施方 案中，卵泡抑素蛋白可为剪接亚型，如FS 288 (SEQ ID NO: 12)。在一些实施方案中，合适的 重组卵泡抑素蛋白可为野生型或天然存在的蛋白质的同源物或类似物。举例来说，人野生 型或天然存在的卵泡抑素蛋白的同源物或类似物相较于野生型或天然存在的卵泡抑素蛋 白（例如SEQ ID NO: 1)可含有一个或多个氨基酸或结构域取代、缺失和/或插入，同时保留 实质性卵泡抑素蛋白活性。因此，在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白与人 FS315卵泡抑素蛋白（SEQ ID NO: 1)大致上同源。在一些实施方案中，适于本发明的重组卵 泡抑素蛋白具有与 SEQ ID N0:1 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于99%同源的氨基酸序列。在一 些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白与人FS315卵泡抑素蛋白（SEQ ID N0:1) 大致上相同。在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白具有与SEQ ID NO: 1至 少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或大于99%相同的氨基酸序列。
[0156] 人卵泡抑素蛋白的同源物或类似物可根据为本领域普通技术人员所知的用于改 变多肽序列的方法制备，所述方法如见于汇编所述方法的参考文献中的方法。如将由本领 域普通技术人员所了解，如果两个序列在相应位置中含有同源残基，那么它们通常被视为 "大致上同源"。同源残基可为相同残基。或者，同源残基可为将具有适当类似结构和/或 功能特征的非相同残基。举例来说，如本领域普通技术人员所熟知，某些氨基酸通常被分类 为"疏水性"或"亲水性"氨基酸，和/或具有"极性"或"非极性"侧链。将一个氨基酸取代 成另一相同类型可常被视为"同源"取代。在一些实施方案中，保守性氨基酸取代包括在以 下群组内的氨基酸之间进行的取代：（a)M、I、L、V ; (b) F、Y、W ; (c) K、R、H ; (d) A、G ; (e) S、T ; (f)Q、N;以及（g)E、D。在一些实施方案中，"保守性氨基酸取代"是指不改变其中进行氨基 酸取代的蛋白质的相对电荷或尺寸特征的氨基酸取代。
[0157] 如本领域中所熟知，可使用多种算法中的任一个比较氨基酸或核酸序列，所 述算法包括如针对核苷酸序列的BLASTN以及针对氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST 和PSI-BLAST的商业计算机程序中可用的那些。示例性所述程序描述于Altschul 等，Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. ,215(3) :403_410，1990; Altschul 等，Methods in Enzymology ;Altschul 等，''Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs",Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997 ;Baxevanis 等，Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998 ;以及 Misener 等（编），Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,第 132卷），Humana Press, 1999 中。除鉴定同源序列之外，以上提及的程序也通常提供同源性程度的指示。
[0158] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白相较于野生型人卵泡抑素蛋 白含有一个或多个氨基酸缺失、插入或置换。举例来说，合适的重组卵泡抑素蛋白可在对应 于SEQ ID NO: 1的Y185和/或L191的位置处含有氨基酸取代。
[0159] 结构域缺失变体
[0160] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白相较于野生型人卵泡抑素蛋 白含有一个或多个结构域缺失、插入或置换（例如结构域替换）。举例来说，适于本发明的 重组卵泡抑素蛋白可含有对应于结构域1、2和/或3的氨基酸序列的缺失、插入和/或置 换。在某些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包含SEQ ID N0:1的氨基酸残基212-288(其对 应于结构域3)的缺失，如下所示：
[0162] 预期合适的重组卵泡抑素蛋白可为合适的结构域缺失变体的同源物或类似物，其 相较于所述合适的卵泡抑素结构域缺失变体（例如SEQ ID N0:2)含有一个或多个氨基酸 取代、缺失和/或插入，同时保留实质性卵泡抑素蛋白活性。因此，在一些实施方案中，适于 本发明的重组卵泡抑素蛋白具有与SEQ ID NO:2至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或大于 99% 同源或相 同的氨基酸序列。
[0163] 卵泡抑素融合蛋白
[0164] 预期合适的重组卵泡抑素蛋白可呈融合蛋白构型。举例来说，适于本发明的重组 卵泡抑素蛋白可为卵泡抑素结构域与通常可通过例如增强或增加卵泡抑素蛋白的稳定性、 效能和/或递送，或降低或消除免疫原性、清除率或毒性来促进卵泡抑素的治疗作用的另 一结构域或部分之间的融合蛋白。卵泡抑素融合蛋白的所述合适的结构域或部分包括但不 限于Fc结构域、XTEN结构域。
[0165] Fc结构域
[0166] 在一些实施方案中，合适的重组卵泡抑素蛋白含有Fc结构域或其结合FcRn受体 的部分。作为一非限制性实例，合适的Fc结构域可源于免疫球蛋白子类，如IgG。在一些实 施方案中，合适的Fc结构域源于IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，合适的Fc 结构域源于IgM、IgA、IgD或IgE。特别合适的Fc结构域包括源于人抗体或人源化抗体的 那些。在一些实施方案中，合适的Fe结构域是修饰的Fe部分，如修饰的人Fe部分。
[0167] 在一些实施方案中，合适的Fe结构域包含以下所示的氨基酸序列
[0171] 在一些实施方案中，合适的Fe结构域包含与SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4或SEQ ID 勵：14至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或大于99%同源或相同的氨基酸序列。
[0172] 预期Fe结构域与FcRn受体之间的结合改进会导致血清半衰期延长。因此，在一 些实施方案中，合适的Fe结构域包含一个或多个导致与FcRn的结合改进的氨基酸突变。 Fe结构域内实现与FcRn的结合改进的各种突变在本领域中是已知的，并且可适合于实施 本发明。在一些实施方案中，合适的Fe结构域在对应于人IgGl的Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433 和 / 或 Asn 434 的一个或多个位置处 包含一个或多个突变。
[0173] 举例来说，合适的Fe结构域可含有突变H433K(His433Lys)和/或 N434F(Asn434Phe)。作为一非限制性实例，合适的Fe结构域可含有突变H433K(His433Lys) 和N434F(Asn434Phe)。并有突变的一示例性Fe结构域序列显示如下：
[0175] 可包括在Fe结构域中的其它氨基酸取代包括例如美国专利号6, 277, 375 ; 8, 012, 476 ;和8, 163, 881中所述的那些，所述专利以引用的方式并入本文。
[0176] 接头或间隔子
[0177] 卵泡抑素结构域可直接或间接连接于Fe结构域。在一些实施方案中，合适的重组 卵泡抑素蛋白含有接合卵泡抑素结构域和Fe结构域的接头或间隔子。氨基酸接头或间隔 子通常被设计来具有可挠性或插入两个蛋白质部分之间的结构，如a-螺旋。接头或间隔 子可相对较短，或可较长。通常，在长度方面，接头或间隔子含有例如3-100 (例如5-100、 10-100,20-10030-100,40-100,50-100,60-100,70-100,80-100,90-100,5-55,10-50, 10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20)个氨基酸。在一些实施方案中，在长度方面，接头 或间隔子等于或长于 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95或100个氨基酸。通常，较长接头可降低空间位阻。在一些实施方案中，接头 将包含甘氨酸和丝氨酸残基的混合物。在一些实施方案中，接头可另外包含苏氨酸、脯氨酸 和/或丙氨酸残基。因此，在一些实施方案中，接头包含在10-100个、10-90个、10-80个、 10-70个、10-60个、10-50个、10-40个、10-30个、10-20个、10-15个之间的氨基酸。在一些 实施方案中，接头包含至少 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 或 95个氨基酸。在一些实施方案中，接头不是由ALEVLFQGP组成的接头。
[0178] 作为非限制性实例，适于本发明的接头或间隔子包括但不限于： GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG接头，SEQ ID NO: 5) ：GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGG GGGAP(GAG2 接头，SEQ ID NO:6):和 GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAA AAAGGGGGGAP(GAG3 接头，SEQ ID NO:7)。
[0179] 合适的接头或间隔子也包括具有与以上示例性接头，例如GAG接头（SEQID N0:5)、GAG2 接头（SEQIDN0:6)或GAG3 接头（SEQIDN0:7)至少 50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于 99%同源或相同的氨基酸序列的那些。适于与一些实施方案一起使用的其它接头可见于 2012年3月2日提交的US20120232021中，所述专利的公开内容据此以引用的方式整体并 入本文。
[0180] 在一些实施方案中，提供使卵泡抑素多肽与Fc结构域缔合而不实质上影响卵泡 抑素多肽结合它的任何同源配体（例如活化素、肌抑素、肝素等）的能力的接头。在一些实 施方案中，提供接头以使相较于单独卵泡抑素多肽，卵泡抑素肽与肝素的结合不改变。举例 来说，在一些实施方案中，卵泡抑素多肽是FS315多肽，其通常不结合肝素，除非它与活化 素缔合。在一些所述实施方案中，提供不导致相较于单独FS315多肽，FS315多肽与肝素的 结合增加的接头。
[0181] 示例件卵泡抑素融合蛋白
[0182] 在特定实施方案中，合适的重组卵泡抑素融合蛋白包括卵泡抑素多肽、Fc结构域 和使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头，其中所述卵泡抑素多肽包含与野生 型人FS315蛋白（SEQ ID N0:1)或结构域3缺失的FS315蛋白（SEQ ID N0:2)至少50%、 55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %, 98%、99%或100%相同的氨基酸序列。通常，合适的重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活化 素和肌抑素。在一些实施方案中，合适的重组卵泡抑素融合蛋白的体内半衰期在约〇. 5-6 天（例如约0. 5-5. 5天、约0. 5-5天、约1-5天、约1. 5-5天、约1. 5-4. 5天、约1. 5-4. 0天、 约1. 5-3. 5天、约1. 5-3天、约1. 5-2. 5天、约2-6天、约2-5. 5天、约2-5天、约2-4. 5天、 约2-4天、约2-3.5天、约2-3天）的范围内。在一些实施方案中，合适的重组卵泡抑素融合 蛋白的体内半衰期在约2-10天的范围内（例如在约2.5-10天、约3-10天、约3.5-10天、 约4-10天、约4.5-10天、约5-10天、约3-8天、约3.5-8天、约4-8天、约4.5-8天、约5-8 天、约3-6天、约3.5-6天、约4-6天、约4.5-6天、约5-6天的范围内）。
[0183] 作为非限制性实例，合适的卵泡抑素Fc融合蛋白可具有以下所示的氨基酸序列：
[0195] 在一些实施方案中，合适的重组卵泡抑素Fe融合蛋白具有与SEQIDN0:8、9、10、 11、16 或 17 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于99%同源或相同的氨基酸序列。
[0196] 预期卵泡抑素-Fe融合蛋白可以各种构型提供，包括同二聚构型或单体构型。举 例来说，合适的同二聚构型可被设计来使融合伴侣（例如卵泡抑素多肽加接头）的C末端 连接于两个Fe多肽链的N末端。合适的单体构型可被设计来使融合伴侣（例如卵泡抑素 多肽加接头）的C末端融合于一个Fe二聚体。单体构型可降低空间位阻。
[0197] 如本文所用，关于本文鉴定的参照蛋白质序列（例如参照卵泡抑素蛋白序列）的 "氨基酸序列同一性百分比"定义为在比对序列，以及必要时引入空位以达成最大序 列同一性百分比，并且不将任何保守性取代考虑为序列同一性的一部分之后，候选序列中 与参照序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分 比的目的的比对可以属于本领域中的技能的各种方式达成，所述方式例如使用可公开获得 的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Meg align (DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适 用于测量比对的参数，包括为历经所比较序列的全长达成最大对准所需的任何算法。优选 地，WU-BLAST-2软件用于确定氨基酸序列同一性（Altschul等,Methods in Enzymology 266, 460-480(1996) ;http://blast. wustl/edu/blast/README. html)。WU-BLAST-2 使用若 干搜索参数，其中大多数被设置成缺省值。可调整参数设为以下值：重叠间距=1，重叠分 数=0. 125,字阈值（T) = 11。HSP计分（S)和HSP S2参数是动态值，并且由程序自身视特 定序列的组成来确定，然而，最小值可被调整，并且如上所指示加以设置。
[0198] 产生重组卵泡抑素蛋白
[0199] 适于本发明的重组卵泡抑素蛋白可通过任何可用手段来产生。举例来说，可通过 利用被工程化来表达重组卵泡抑素蛋白编码核酸的宿主细胞系统来重组产生重组卵泡抑 素蛋白。或者或另外，可通过使内源性基因活化来产生重组卵泡抑素蛋白。或者或另外，可 通过化学合成来部分或完全制备重组卵泡抑素蛋白。
[0200] 当重组产生蛋白质时，可使用任何表达系统。仅举几例来说，已知表达系统包括例 如大肠杆菌（E. coli)、卵、杆状病毒、植物、酵母或哺乳动物细胞。
[0201] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白是在哺乳动物细胞中产 生。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括但不限于BALB/c小鼠骨髓 瘤株系（NS0/1，ECACC 编号：85110503);人成视网膜细胞（PER. C6, CruCell, Leiden, The Netherlands);由 SV40 转化的猴肾 CVl 株系（C0S-7，ATCC CRL 1651);人胚肾株系（HEK293 或被亚克隆来达成悬浮培养生长的293细胞，Graham等，J. Gen Virol.，36:59, 1977);人 纤维肉瘤细胞系（例如HT1080);幼小仓鼠肾细胞（BHK21，ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细 胞 +/-DHFR(CHO, Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980);小鼠塞尔 托利细胞（TM4, Mather, Biol. R印rod. ,23:243-251，1980);猴肾细胞（CV1 ATCC CCL 70); 非洲绿猴肾细胞（VER0-76，ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞（HeLa，ATCC CCL 2);犬肾细胞 (MDCK，ATCC CCL 34);水牛大鼠肝细胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人肺细胞（W138, ATCC CCL 75);人肝细胞 Ofep G2, HB 8065);小鼠乳腺肿瘤（MMT 060562, ATCC CCL51) ;TRI 细 胞（Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci.，383:44-68, 1982) ;MRC 5 细胞；FS4 细胞；和人肝细 胞瘤株系Ofep G2)。
[0202] 在一些实施方案中，本发明提供由人细胞产生的重组卵泡抑素蛋白。在一些实施 方案中，本发明提供由CHO细胞或HT1080细胞产生的重组卵泡抑素蛋白。
[0203] 通常，被工程化来表达重组卵泡抑素蛋白的细胞可包含编码本文所述的重组卵泡 抑素蛋白的转基因。应了解编码重组卵泡抑素蛋白的核酸可含有调控序列、基因控制序列、 启动子、非编码序列和/或用于表达重组卵泡抑素蛋白的其它适当序列。通常，编码区是可 操作地与这些核酸组分中的一个或多个连接。
[0204] 转基因的编码区可包括一个或多个沉默突变以针对特定细胞类型优化密码子使 用。举例来说，可针对在脊椎动物细胞中表达来优化卵泡抑素转基因的密码子。在一些实 施方案中，可针对在哺乳动物细胞中表达来优化卵泡抑素转基因的密码子。在一些实施方 案中，可针对在人细胞中表达来优化卵泡抑素转基因的密码子。
[0205] 药物组合物和施用
[0206] 本发明进一步提供一种药物组合物，其含有本文所述的重组卵泡抑素蛋白和生理 可接受的载体或赋形剂。
[0207] 合适的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液（例如NaCl)、盐水、缓冲盐 水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶（gumarabic)、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物 (如乳糖、直链淀粉或淀粉、糖（如甘露糖醇、蔗糖或其它糖、右旋糖））、硬脂酸镁、滑石、硅 酸、粘稠石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等以及其组合。必要时，药 物制剂可与不有害地与活性化合物反应或干扰它们的活性的助剂（例如润滑剂、防腐剂、 稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳族物质等） 混合。在一优选实施方案中，使用适于静脉内施用的水溶性载体。
[0208] 必要时，合适的药物组合物或药剂也可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。组 合物可为液体溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末。组合物也可用传 统粘合剂和载体（如甘油三酯）配制成栓剂。经口制剂可包括标准载体，如医药级甘露糖 醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
[0209] 可根据常规程序将药物组合物或药剂配制成适合于向人类施用的药物组合物。举 例来说，在一些实施方案中，用于静脉内施用的组合物通常是于无菌等张水性缓冲液中的 溶液。必要时，组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位处的疼痛。通常，分开 或以单位剂型混合在一起来将成分供应于如安瓿或药囊的指示活性剂的量的气密容器中， 所述单位剂型例如呈干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。当组合物待通过输注施用时，它可 用含有无菌医药级水、盐水或右旋糖/水的输注瓶分配。当组合物是通过注射施用时，可提 供含无菌注射用水或盐水的安瓿以使成分可在施用之前加以混合。
[0210] 本文所述的重组卵泡抑素蛋白可调配成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包 括以游离氨基形成的盐，如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等获得的那些；以及以游离羧 基形成的盐，如由钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡 因（procaine)等获得的那些。
[0211] 施用途径
[0212] 本文所述的重组卵泡抑素蛋白（或含有本文所述的重组卵泡抑素蛋白的组合物 或药剂）是通过任何适当途径施用。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白或含有其的药 物组合物是全身性施用。全身性施用可为静脉内、皮内、吸入、经皮（表面）、眼内、肌肉内、 皮下、肌肉内、经口和/或经粘膜施用。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白或含有其的 药物组合物是皮下施用。如本文所用，术语"皮下组织"定义为紧靠在皮肤下的一层松散、 不规则结缔组织。举例来说，皮下施用可通过向包括但不限于大腿区域、腹部区域、臀区域 或肩胛区域的区域中注射组合物来进行。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白或含有其 的药物组合物是静脉内施用。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白或含有其的药物组合 物是经口施用。必要时，可同时使用一种以上途径。
[0213] 在一些实施方案中，施用仅在个体中产生局部作用，而在其它实施方案中，施用遍 及个体的多个部分产生作用，例如全身性作用。通常，施用导致向一种或多种靶标组织递送 重组卵泡抑素蛋白。在一些实施方案中，向一种或多种靶标组织递送重组卵泡抑素蛋白，所 述组织包括但不限于心脏、脑、脊髓、横纹肌（例如骨骼肌）、平滑肌、肾、肝、肺和/或脾。在 一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向心脏递送。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白 是向横纹肌，具体来说骨骼肌递送。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向三头肌、胫 骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、二头肌、斜方肌、三角肌、四头肌和/或膈肌递送。
[0214] 剂型和给药方案
[0215] 在一些实施方案中，组合物是以治疗有效量和/或根据与特定所需结果相关（例 如与治疗或降低如杜兴氏肌营养不良的肌营养不良的危险相关）的给药方案施用。
[0216] 待根据本发明施用的特定剂量或量可例如随以下而变化：所需结果的性质和/或 程度、施用途径和/或时序的细节、和/或一种或多种特征（例如重量、年龄、个人史、遗传 特征、生活方式参数、心脏缺陷的严重性和/或心脏缺陷的危险水平等或其组合）。所述剂 量或量可由普通技术人员确定。在一些实施方案中，适当剂量或量是根据标准临床技术确 定。或者或另外，在一些实施方案中，适当剂量或量是通过使用一种或多种体外或体内测定 以帮助鉴定待施用的合乎需要或最优剂量范围或量来确定。
[0217] 在各种实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是在治疗有效量下施用。通常，治疗有效 量足以达成对受试者有意义的益处（例如治疗、调节、治愈、预防和/或改善潜伏疾病或病 状）。在一些特定实施方案中，待施用的适当剂量或量可根据由体外或动物模型测试系统获 得的剂量-反应曲线外推。
[0218] 在一些实施方案中，提供的组合物是以药物制剂形式提供。在一些实施方案中，药 物制剂是或包含单位给药量以根据与达成如杜兴氏肌营养不良的肌营养不良的发生率或 危险降低相关的给药方案来施用。
[0219] 在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制剂是以单次剂量形式 施用。在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制剂是在定期间隔下施用。 如本文所用，在某一"间隔"下施用指示治疗有效量是定期施用（不同于一次性给药）。可 通过标准临床技术确定间隔。在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制 剂是每两月、每月、每月两次、每三周、每两周、每周、每周两次、每周三次、每日、每日两次或 每6小时加以施用。视个体的需要而定，用于单一个体的施用间隔无需是固定间隔，而是可 随时间变化。
[0220] 如本文所用，术语"每两月"是指每两个月施用一次（即每两个月一次）；术语"每 月"是指每个月施用一次；术语"每三周"是指每三周施用一次（即每三周一次）；术语"每 两周"是指每两周施用一次（即每两周一次）；术语"每周"是指每周施用一次；并且术语 "每日"是指每天施用一次。
[0221] 在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制剂是在定期间隔下无 限期施用。在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制剂是在定期间隔下 施用确定时期。
[0222] 组合疗法
[0223] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是与一种或多种当前用于治疗肌营养不良 的已知治疗剂（例如皮质类固醇）组合施用。在一些实施方案中，已知治疗剂是根据它的 标准或核准给药方案和/或时程施用。在一些实施方案中，已知治疗剂是根据相较于它的 标准或核准给药方案和/或时程被改变的方案施用。在一些实施方案中，所述改变的方案 在以下方面不同于标准或核准给药方案：一个或多个单位剂量的量被改变（例如降低或增 加），和/或给药的频度被改变（例如单位剂量之间的一个或多个间隔被扩大，从而导致频 度较低，或所述间隔被降低，从而导致频度较高）。 实施例
[0224] 实施例1.卵泡抑素特异性靶向肌抑素和活化素
[0225] 这个实施例说明结合靶标和非靶标配体的卵泡抑素以评估卵泡抑素作为用于治 疗DMD的蛋白质治疗剂的安全性。在不希望受理论束缚下，预期由肌抑素和活化素活化 Smad2/3路径会导致抑制肌原性蛋白质表达。因此，成肌细胞不能分化成肌肉。因此，肌抑素 和活化素被视为肌肉再生的可行靶标。然而，归因于某些结构类似性，如可溶性活化素IIB 型受体（sActRIIB)的许多肌抑素和活化素拮抗剂也结合骨形态发生蛋白质（BMP)。BMP，尤 其BMP-9和BMP-10,被视为全身协调组织构造的关键性形态发生信号。抑制所述BMP可导 致非所需病理学病状。如以下详述，在这个实施例中所述的实验数据确认卵泡抑素以高亲 和力特异性靶向肌抑素和活化素，并且不以有意义的亲和力结合非靶标BMP。因此，这个实 施例证明相较于如sActRIIB的其它肌抑素调节剂，卵泡抑素可为一种非所需脱靶效应较 少的安全蛋白质治疗剂。
[0226] 具体来说，可商购获得的卵泡抑素（由R&DSystems制造的FS315和由Sino Biological制造的卵泡抑素-Fc人嵌合体FS315-hFc)和FS315-GAG3-mFc融合蛋白用于使 用Biacore测定评估与活化素、肌抑素和BMP的结合亲和力和动力学。简要来说，使FS315 固定于CM5芯片上，并且使用人或小鼠抗体捕集试剂盒（GE Healthcare)捕集卵泡抑素-Fc 融合蛋白。在胺偶联后，在25°C下添加一系列浓度的活化素、肌抑素或BMP (例如BMP-2、 BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-10 和⑶F-11)作为可溶性分析物。sActRIIB-hFc 用作对 照。使用标准方法确定结合亲和力（Kd)和动力学。示例性结果显示于表3中。
[0227] 表3?示例性结合亲和力和动力学数据
[0229] NM =由于不良曲线拟合或与参照芯片的高结合性而不可测量
[0230] 如表3中所示，卵泡抑素（例如FS315或FS315-FC)以高亲和力结合靶标肌抑素 和活化素，但不结合BMP-9和BMP-10 (Kd不可测量或大于I(T7M)，而sActRIIB-Fc以类似亲 和力结合肌抑素、活化素和BMP。惊人并且重要的是，Fc融合使卵泡抑素对主要靶标肌抑素 的亲和力增加至少10倍。
[0231] 此外，荧光素酶报道体测定用于进一步确定卵泡抑素是否特异性抑制肌抑素和活 化素信号传导（Smad 2/3路径）而非BMP信号传导（Smad 1/5/8路径）。具体来说，BMP反 应元件（BRE)-荧光素酶测定用于通过测量荧光素酶信号的降低来确定卵泡抑素是否可抑 制 Smadl/5/8 路径（Korchynskyi 等，Identification and Functional Characterization of Distinct Critically Important Bone Morphogenetic Protein-specific Response Elements in the Idl Promoter, (2002)，J BIOL CHEM., 277 (7):4883-4891)。CAGA-荧 光素酶测定用于通过测量荧光素酶信号的降低来确定卵泡抑素是否可抑制Smad 2/3路 径（Dennler 等，Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF 0 -inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type I gene, (1998)，EMBO J, 17 (II) :3091-3100)。简要来说，HEK293 细胞用 BRE (BRE-Idl-Iuc) 或CAGA-荧光素酶（p (CAGA) 12-MLP-luc载体）构建体和海肾-荧光素酶构建体（Promega pGL4. 74[hRluc/TK])共转染过夜。次日，在有或无一系列浓度的卵泡抑素下，用肌抑素 和活化素（用于Smad 2/3路径诱导，CAGA-荧光素酶报道体）或BMP-9和BMP-IO (用于 Smad 1/5/8路径诱导，BRE-荧光素酶报道体）处理细胞。在过夜孵育之后，使用Promega Dual-Glo测定试剂盒测定荧光素酶信号，其中相对于海肾对照使值标准化。在这个实验中， 测试天然卵泡抑素（R&D Systems)和卵泡抑素Fc融合蛋白（Sino Biological FS315_hFc、 FS315-GAG3-mFc)。FS315-GAG3-mFc 显示如下。
[0233] BRE-荧光素酶测定的示例性结果显示于图1中。FS315-FC不通过Smad 1/5/8路 径抑制BMP-9或BMP-IO信号传导。
[0234] CAGA-荧光素酶测定的示例性结果显示于图2中。相较于在施用生理相关水平 的已知Smad 2/3活化剂肌抑素（I. 2nM)和活化素（0. 4nM)之后观察的Smad 2/3诱导量， FS315与FS315-GAG3-mFc两者均显示在0.1 nM和高于0.1 nM的剂量下强力抑制Smad2/3信 号传导。这些结果指示卵泡抑素是肌抑素和活化素活性的强力和特异性抑制剂。Fc融合的 存在不有害影响卵泡抑素的效能，如通过天然FS315分子与FS315-GAG3-mFc融合蛋白之间 的类似抑制曲线所指示。出乎意料并且重要的是，本发明的Fc融合蛋白使卵泡抑素对主要 靶标肌抑素的结合亲和力显著增加（例如增加至少10倍，如表3中所示）。
[0235] 实施例2.卵泡抑素融合蛋白FS315-GAG3-mFc具有延长的血清半衰期
[0236] 在我们的发明之前，据报道卵泡抑素具有短暂血清半衰期，此是将卵泡抑素开发 成蛋白质治疗剂的顾虑。举例来说，典型商业FS315蛋白的血清半衰期是约1小时。在这 个实施例中，确定FS315-GAG3-mFc融合蛋白的体内半衰期，并且它具有显著延长的血清半 衰期。
[0237] 具体来说，印记控制区域（ICR)小鼠选作模型，并且在1.0mg/kg(~2 y Ci/动物） 下皮下施用I125标记的FS315-GAG3-mFc。在施用之后，获取血清和组织样本直至注射后10 天。取样的组织是：甲状腺、肝、肾、肺、脾、膈肌、心脏、四头肌和三头肌。血清样本的示例性 结果显示于图3A中。如可见，FS315-GAG3-mFc的血清半衰期是近似5天，此相较于本领域 中已知的短暂卵泡抑素血清半衰期（约1小时）是惊人长久的。跨越各种组织的PK曲线 的示例性结果显示于图3B和表4中。除甲状腺之外，跨越各组织的卵泡抑素-Fc的半衰期 在2天与5天之间。此外，延长的组织半衰期曲线是出乎意料的。
[0238] 延长的体内半衰期数据进一步确认卵泡抑素可为用于治疗DMD的有效蛋白质治 疗剂。
[0239] 表4.示例性FS315-GAG3_mFc体内PK数据
[0240]
[0242] 实施例3. FS315-GAG3_mFc的体内功效
[0243] 这个实施例证明向杜兴氏肌营养不良的mdx小鼠模型施用卵泡抑素（例如 FS315-GAG3-mFc )会产生肌肉质量增加的趋势，甚至在lmg/kg的低剂量下。在这个实施例 中，术语 " FS315-GAG3-mFc "、" FS315-Fc " 和 " FS315-mFc " 可互换使用。
[0244] 具体来说，在这个研宄中，45只mdx小鼠用空媒介物、0mg/kg、l. Omg/kg或8mg/kg FS315-GAG3-mFc治疗。媒介物组或治疗组中的动物持续研宄的持续时间每周接受两次皮下 (肩胛间）注射，并且通过眶后取样来评估卵泡抑素融合蛋白水平。
[0245] 半数媒介物治疗的对照动物与lmg/kg FS315-FC组一起被处死，并且剩余媒介物 治疗的动物以及未治疗的对照动物与8mg/kg治疗组一起被处死。示例性治疗时程是如表 5A和表5B中所不：
[0246] 表5. mdx小鼠的示例性注射和取样时程
[0247] 5A: lmg/kg FS315-GAG3_mFc 治疗过程
[0252] 媒介物治疗组相对于lmg/kg FS315-FC组的关于肌肉重量的示例性数据显示于图 4中。具体来说，图4显示在用lmg/kg治疗4和10周，以及用8mg/kg治疗6周之后，四头 肌（图4A)、腓肠肌（图4B)、胫骨前肌（图4C)和三头肌（图4D)的以克计的肌肉重量。肌 肉重量数据是关于基线体重加以调整。
[0253] 在施用之后卵泡抑素的循环水平的示例性数据显示于图5中。具体来说，图5A显 示用每周两次lmg/kg注射液治疗的动物的血清中的FS315-mFc的水平，并且图5B显示每 周两次用8mg/kg治疗的动物的血清中的FS315-mFc的水平。
[0254] 如图4-5中所示，存在FS315-FC使DMD的动物模型中的肌肉质量增加的明确指 不O
[0255] 实施例4.重组卵泡抑素-Fc融合蛋白的体内功效
[0256] 这个实施例证明施用卵泡抑素-Fc融合蛋白会体内导致肌肉肥大（例如肌肉质量 和肌纤维直径增加）。
[0257] 在这个研宄中，C57BL/10小鼠与mdx小鼠两者均用FS315-GAG3-mFc直接向腓肠肌 中（肌肉内，IM)注射。具体来说，各小鼠每周两次接受2次注射，各侧1次。左侧腓肠肌 接受20 y L lmg/mL FS315-GAG3-mFc溶液，每次注射总计20 y g蛋白质。右侧腓肠肌接受 20 y L PBS (媒介物对照）。每周两次进行注射，持续总计4周。在最终注射之后24小时， 处死小鼠，并且将腓肠肌小心解剖并称重。包括在相同剂量下接受可溶性活化素IIB型受 体-Fc小鼠嵌合体（sActRIIB-mFc，R&D Systems)的一组作为阳性对照。此外，包括未治疗 的小鼠作为阴性对照。
[0258] 图6显示在每周两次用20 y g FS315-mFc或sActRIIB-mFc治疗之后，C57对照小 鼠以及mdx小鼠中的肌肉质量均显著增加。图6中表示的研宄设计和数值数据显示于下表 6中：
[0259] 表6?肌肉重量
[0260]
[0261] *用于这个实施例中的所有卵泡抑素构建体都含有GAG3接头。
[0262] **P值由成对t检验获得，并且进行邦弗伦尼（Bonferroni)校正（校正6种统计 检验）
[0263] 通过对注射的腓肠肌进行数字完全载片扫描来测定肌纤维直径。将样本固定 在10 %中性缓冲盐水中，处理并包埋在石蜡中，切割成5 ym切片，并且用Alexa f Iuor 488缀合的麦胚凝集素（WGA)染色，这是一种染色肌肉细胞膜的方法。使用图像分析软件 (ImageScope和ImagePro Plus)分析扫描的图像。对于各肌纤维，通过在2度间隔下，穿过 肌纤维的质心来测量肌纤维横截面长度来测定平均直径。
[0264] 与图6 -致，图15说明用FS315_mFc治疗的腓肠肌的肌纤维直径增加。这个增加 发生在C57(WT，图15A)与mdx小鼠（图15B)两者中。对向较大直径转变的说明指示肌肉 重量增加是肌肉肥大的结果。表7是示例性平均直径变化和相应统计分析的概述。
[0265] 表 7
[0266]
[0267] 所用统计模型是分层线性模型（HLM)，其能够虑及在各动物内进行的多个测量。各 品系和治疗组内未治疗腿与治疗腿之间的差异是高度显著的（p〈〇. 〇〇〇 1，此确证肌肉重量 数据）。
[0268] 这些数据证明卵泡抑素，具体来说卵泡抑素-Fc融合蛋白可有效诱导肌肉生长， 并且治疗与DMD相关的肌肉萎缩。
[0269] 实施例5.示例性卵泡抑素变体的体内功效
[0270] 实施例2-4中所示的基于野生型卵泡抑素FS315蛋白的体内半衰期和功效数据证 明卵泡抑素可用作用于DMD的有效蛋白质疗法。这个实施例证明也可基于卵泡抑素变体开 发蛋白质治疗剂。
[0271] 具体来说，产生如下表8中所述的示例性卵泡抑素结构域缺失或点突变，并且使 用明确确定的頂/AAV递送系统测试它们的肌肉再生功效以有助于在变体与野生型卵泡抑 素之间进行比较。
[0272] 在这个研宄中，跨越7个组使用年龄是3-4周的总计35只C57小鼠。7个组各自 包括5只小鼠，其中测试5种卵泡抑素变体（表8)，并且野生型FS315和空载体用作对照。 编码FS315的基因具有代表信号肽的额外29个氨基酸，其在自细胞分泌后被裂解。因此， FS315和FS344是指相同野生型构建体，并且在以下实施例中可互换使用。
[0273] 表8.示例性卵泡抑素变体的功效筛选
[0274]
[0275]
[0276] 通过使用AAV9载体，在每个动物近似lxIO11个病毒粒子的剂量下向左侧四头肌 和左侧腓肠肌中进行单次单侧注射来施用卵泡抑素变体。在注射后2、4和6周考查以下终 点：血清和尿中的卵泡抑素水平、小鼠重量、个体肌肉重量（注射的肌肉群与远端肌肉群两 者）和组织学（例如纤维计数、尺寸和类型等）。对侧肌肉充当这个研宄的动物内比较物。
[0277] 如图7中所示，野生型FS315与结构域3缺失突变体两者相较于空载体对照均使 体重显著增加。具体来说，测试的结构域3缺失的卵泡抑素变体早在注射后3周即使体重 增加。
[0278] 图8显示注射后两周在同侧与对侧两者上的A)腓肠肌和B)四头肌的示例性平均 肌肉重量。截至注射后第2周，野生型FS315与结构域3缺失卵泡抑素变体两者均显示同 侧上的肌肉质量显著增加（图8)。具体来说，相较于空载体，用FS315和dFSD3注射的肌肉 在重量方面大60%至70% (图8)。在第2周时，解剖的用dFSD3注射的四头肌显著大于对 侧未治疗的肌肉（图9)。
[0279] 在第4周时，结构域3缺失的卵泡抑素和野生型卵泡抑素使注射的肌肉与远端肌 肉两者的肌肉质量增加。参见图10。如在第2周时所观察，dFSD3在第4周时产生显著肥大 作用，其中相较于未治疗侧，注射的肌肉的肌肉质量显著较大（图11)。对于野生型和dFSD3 治疗的小鼠，通过ELISA测定的血清中的卵泡抑素水平类似，并且在第2、4和6周时平均是 30ng/mL (数据未显示）。
[0280] 也在注射后第2、4和6周使用标准组织学和免疫组织化学方法测定注射的肌肉组 织与远端肌肉组织两者中的肌纤维尺寸。示例性第2、4和6周结果分别显示于图12、13和 14中。所有统计都是使用GraphPad Prism中的单因素ANOVA以及邓奈特氏多重比较检验 (Dunnett' s Multiple Comparison Test)来进行。误差棒表不 SEM。
[0281] 如图12中所示，在第2周时，在注射的肌肉中，在FS344(23% )、dFSD3(30% )、 Y185A和L191D组中的四头肌中以及在FS344(17%)和dFSD3(25%)组中的腓肠肌中观察 到肌纤维肥大。在远端肌肉群中，在dFSD2(12%)组中的TA中观察到肌纤维肥大。在三头 肌或膈肌中未观察到肥大。
[0282] 如图13中所示，在第4周时，在注射的肌肉中，在FS344(41% )、dFSD3(50% )、 dFSD113 和 L191D 组中的四头肌中以及在 FS344(42% )、dFSD2、dFSD3(73% )、dFSD113、 Y185A和L191D组中的腓肠肌中观察到肌纤维肥大。在远端肌肉群中，在dFSD3(10% )组 中的TA中以及在FS344(23% )和dFSD2(29% )组中的膈肌中观察到肥大。在三头肌中未 观察到肥大。
[0283] 如图14中所示，在第6周时，在注射的肌肉中，在FS344(41% )、dFSD3(30% )、 Y185A组中的四头肌中以及在FS344(90% )、dFSD3(49% )、Y185A、L191D组中的腓肠肌中观 察到肌纤维肥大。在远端肌肉中，在FS344(26% )、dFSD3(41% )、dFSD113、Y185A和L191D 组中的TA中以及在dFSD3(35% )组中的膈肌中观察到肌纤维肥大。在三头肌中观察到最 小限度的肥大。
[0284] 总之，这些结果指示可基于卵泡抑素变体开发蛋白质治疗剂。举例来说，卵泡抑素 结构域缺失或点突变可保留或改进肌肉再生功效。如上所示，结构域3缺失物可为用于治 疗DMD的特别适用的卵泡抑素变体。
[0285] 实施例6. FS315-GAG3_mFc的全身性功效
[0286] 如实施例4中所示，相对于对照肌肉，向腓肠肌中注射FS315_mFc导致肌肉质量增 加。这个实施例显示全身性注射FS315-mFc也能够在远离注射部位的各种部位处诱导肌肉 生长。用于这个实施例中的所有卵泡抑素构建体都含有GAG3接头。
[0287] 总计20只C57BL/6小鼠用于这个研宄中，其中半数动物每周两次持续8周接受皮 下（肩胛间）注射PBS (对照），并且另外半数每周两次持续8周接受皮下（肩胛间）注射 10mg/kg FS315-mFc。在末次注射之后24小时处死动物，并且测量左侧和右侧四头肌、腓肠 肌、胫骨前肌和三头肌的重量，也测量动物的总体重。下表9概述这个实施例的实验设计。
[0288] 表9.实验设计
[0289]
[0290] 图16显示通过8周研宄过程获得的示例性体重数据。如可见，在2周时开始，并且 在整个8周研宄期间持续，FS315-mFc治疗的动物的体重显著大于那些媒介物治疗的对照 动物。图17代表示例性肌肉重量数据。相较于媒介物对照，来自用FS315-mFc治疗的小鼠 的三头肌早在第4周即在重量方面显著较大。相较于媒介物，在治疗8周之后，三头肌群与 四头肌群两者均显示在重量方面显著增加（图17)。通过实施例4中所述的方法来测定肌 纤维尺寸。图18显示在第4和8周时三头肌群和四头肌群的肌纤维直径增加百分比。在 4周和8周时，两种肌肉群均显示在用FS315-mFc治疗之后向较大肌纤维尺寸转变。
[0291] 此外，在皮下注射之后，血清卵泡抑素水平增加。举例来说，治疗的小鼠（通过每 周两次皮下注射）的血清中的FS315-mFc水平显示于图19中。在第4和8周处死时间点收 集的血清中的FS315-mFc水平最高，所述时间点与FS315-mFc注射与血清收集之间的时间 量（24小时）一致。在这些点时，平均血清FS315-mFc水平是约200ng/mL。在注射FS315-mFc 之后3天收集每两周眶后放血，并且平均血清FS315-mFc水平在约30 - 50ng/mL之间。
[0292] 这些数据证明全身性注射FS315-mFc (例如皮下注射）可有效诱导全身各种肌肉 组织中的肌肉生长。
[0293] 实施例7.卵泡抑素-Fc融合蛋白在DMD小鼠模型中的全身性功效
[0294] 这个实施例进一步证明在DMD疾病模型中的全身性功效。具体来说，如下所示，全 身性注射FS315-mFc成功地降低各种特征DMD症状，如肌肉坏死和/或纤维化的进展。用 于这个实施例中的所有卵泡抑素构建体都含有GAG3接头。
[0295] mdx小鼠模型已广泛用作用以证明用于DMD的候选疗法的概念验证的临床前模 型。mdx小鼠的肢体肌肉群与膈肌两者均显示倾向于随年龄增加的广泛病变。所述病变的 特征在于肌肉中具有炎症性浸润、坏死和纤维化区域。在这个模型中测试FS315-mFc以评 估它对肌肉中纤维化的进展的作用。总计50只mdx小鼠用于这个实施例中，其中20个动 物接受皮下注射PBS，并且30个动物接受皮下注射10mg/kg FS315-mFc，每周两次，持续12 周。（参见表10)。在末次注射之后24小时处死动物，并且收集组织以分析坏死和纤维化 (参见表11)。
[0296] 表10?实验设计
[0297]
[0301] 图20显示在RNA层面上FS315-mFc对纤维化蛋白质表达的示例性作用。具体 来说，I型胶原蛋白、a-平滑肌肌动蛋白和含有胶原蛋白三螺旋重复序列的蛋白质1的 RT-PCR证明这些纤维化相关蛋白质的表达早在每周两次SC治疗之后6周即显著降低。
[0302] 表12和13概述对肌肉组织切片中的坏死（如通过评估H&E染色的切片来确定） 和纤维化（如通过评估FS315-mFc治疗的mdx小鼠肌肉的胶原蛋白I染色的肌肉切片来确 定）的组织病理学评估。对于FS315-mFc治疗组和媒介物治疗组，每组分别有总计15个和 10个动物。如表12中所指示，FS315-mFc治疗早在自启始每周两次注射开始的6周即显著 降低肢体肌肉中的坏死的发生率。这个坏死降低是通过四头肌和三头肌来说明于H&E切片 的图像中（图21)。在FS315-mFc治疗12周之后，通过胶原蛋白I染色肌肉组织切片所说 明的纤维化的发生率显著降低（也参见表13)。胶原蛋白沉积的这个降低说明于胶原蛋白 I染色的肌肉切片的图像中（图22)。
[0303] 这个研宄的结果证明FS315-mFc可通过有效降低DMD小鼠模型中患病肌肉病变 (包括但不限于肌肉坏死和/或纤维化）的进展来成功治疗DMD。
[0304] 表12. FS315-mFc治疗的mdx小鼠肌肉中的坏死的发生率（p值指示使用费雪氏精 确检验（Fisher' s Exact Test)得到的媒介物与FS315_mFc之间的显著性程度）
[0305]
[0306] 在总检查肌肉区域中，最小限度：〈5% ;轻度：〈30% ;显著：>30%
[0307] 表13.纤维化的发生率，（p值指示使用费雪氏精确检验得到的媒介物与 FS315-mFc之间的显著性程度）
[0308]
[0309] 实施例8.重组卵泡抑素结构域3缺失Fc融合蛋白的体内功效
[0310] 这个实施例证明类似于野生型卵泡抑素-Fc融合蛋白，卵泡抑素结构域3缺失 (dFSD3)Fc融合蛋白体内有效诱导肌肉生长。用于这个实施例中的所有卵泡抑素构建体都 含有GAG3接头。
[0311] 具体来说，使实施例5中所述的结构域3缺失的构建体融合于与用于FS315-mFc 相同的mFc。此外，相同GAG3接头序列用于使dFSD3融合于mFc。C57BL/10小鼠用两种融 合蛋白直接向腓肠肌中注射，如实施例4中所述。在每周两次注射20 y g融合蛋白4周之 后处死小鼠，并且相对腓肠肌接受相同体积的PBS。在最终注射之后24小时，处死治疗的小 鼠，并且将注射的腓肠肌小心注射并称重。如图23中所指示，dFSD3-GAG3-mFc融合蛋白导 致肌肉质量超过媒介物对照显著增加，并且所述增加类似于用FS315-mFc观察到的增加。 这个实施例指示卵泡抑素结构域3缺失Fc融合蛋白（例如dFSD3-GAG3-mFc)在体内具有 活性，并且是用于DMD治疗的另一有前途的治疗候选物。
[0312] 实施例9.较长接头关于卵泡抑素功能的优势
[0313] 这个实施例证明较长接头，特别是含有至少10个氨基酸的接头提供关于卵泡 抑素功能的出乎意料的优势。具体来说，这个实施例显示含有57个氨基酸的接头的 FS315-GAG3-FC融合蛋白（鼠类和/或人Fe)相较于可自Sino Biological商购获得的含 有9个氨基酸的接头ALEVLFQGP的FS315-hFc融合蛋白（Sino Biological Inc.目录号 10685-H02H)，在它的抑制肌抑素和活化素的能力方面更强力。用于信号传导测定的肌抑素 和活化素的浓度是I. 2nM。如图24和表14中所指示，FS315-GAG3-mFc和FS315-GAG3-hFc 融合蛋白在CAGA-荧光素酶测定中在与天然FS315相同的程度上抑制肌抑素和活化素信号 传导。相比较来说，可商购获得的FS315-hFc融合蛋白（Sino Biological)的强力性显著 较小。计算的IC50如下：
[0314] 表14 :卵泡抑素在针对Smad2/3信号传导的CAGA-荧光素酶报道体测定中抑制肌 抑素和活化素的示例性IC50值
[0315]
[0316] 在不希望固守于特定理论下，有可能的是相较于具有短得多接头（例如9个 氨基酸）的融合蛋白，FS315蛋白与Fe区域之间的较长接头（例如这个特定构建体FS315-GAG3-FC中的57个氨基酸的接头）可能允许FS315具有更天然构象，从而允许在与 用天然FS315观察到的程度类似的程度上结合靶标配体以及抑制信号传导。相比较来说， 可商购获得的FS315-hFc蛋白具有9个氨基酸的短得多的接头，其中在Fe与FS315蛋白之 间的间隔显著较小，从而潜在导致对FS315构象和生理活性的有害作用。
[0317] 实施例10.卵泡抑素融合蛋白FS315-GAG3_hFc具有延长的血清半衰期
[0318] 在这个实施例中，我们证明提供的卵泡抑素融合蛋白，特别是具有较长接头（例 如具有至少10个氨基酸的接头）的那些具有延长的血清半衰期。具体来说，我们首次在此 处证明以GAG3接头融合于人Fe的FS315 (FS315-GAG3-hFc)在10mg/kg的单次剂量下向 Sprague-D awley大鼠中皮下（SC)施用时具有延长的血清半衰期。在施用之后，在于15分 钟至5天的范围内的时间点收集血清。使用Mesoscale Di scovery (MSD)测定测量大鼠血 清中的FS315-GAG3-hFc，所述测定捕集人FS315,并且检测血清样本中完整融合蛋白的人 Fe结构域。大鼠血清中的FS315-GAG3-hFc的水平显示于图25中。PK参数概述于表15中。
[0319] 表 15. FS315-GAG3_hFc 体内 PK 数据
[0320]
[0321] 总之，以上实施例证明通过例如全身性施用，卵泡抑素，包括提供的变体，在DMD 疾病模型中高度有效诱导肌肉肥大，并且减弱肌肉坏死和纤维化。因此，卵泡抑素和提供的 变体可为用于治疗DMD的有效蛋白质治疗剂。
[0322] 等效物和范围
[0323] 本领域技术人员将仅使用常规实验即会认识到或能够确定本文所述的本发明的 具体实施方案的许多等效物。本发明的范围不意图限于以上描述，而是如以下权利要求中 所阐述。
【主权项】
1. 一种治疗杜兴氏肌营养不良（DMD)的方法，其包括 向罹患或易患DMD的个体施用有效量的重组卵泡抑素蛋白以使DMD的至少一种症状或 特征在强度、严重性或频度方面得以降低，或延迟发作。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与野生型人卵泡抑素蛋 白 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCT GGKKCLTOFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEE EEDEDQDYSFPISSILEW(SEQIDN0:1)至少 70%相同的氨基酸序列。3. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与所述野生 型人卵泡抑素蛋白SEQIDNO: 1至少80%相同的氨基酸序列。4. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与所述野生 型人卵泡抑素蛋白SEQIDNO: 1至少90%相同的氨基酸序列。5. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与所述野生 型人卵泡抑素蛋白SEQIDNO: 1至少95%相同的氨基酸序列。6. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与所述野生 型人卵泡抑素蛋白SEQIDNO: 1相同的氨基酸序列。7. 如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白相较于所述野生 型人卵泡抑素蛋白包含一个或多个缺失、突变或插入。8. 如权利要求7所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含SEQIDNO: 1的氨基酸 残基212-288的缺失。9. 如权利要求1所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATC LLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEW(SEQIDN0:2)至少70%相同的氨基酸序列。10. 如权利要求9所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与SEQIDN0:2至少 80 %相同的氨基酸序列。11. 如权利要求9所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与SEQIDN0:2至少 90 %相同的氨基酸序列。12. 如权利要求9所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与SEQIDN0:2至少 95 %相同的氨基酸序列。13. 如权利要求9所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与SEQIDN0:2相同的 氨基酸序列。14. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述重组卵泡抑素蛋白融合于Fc结 构域。15. 如权利要求15所述的方法，其中所述Fc结构域包含与 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQIDN0:3)至少80%相同的氨基酸序列。16. 如权利要求15所述的方法，其中所述Fe结构域在对应于人IgGl的Thr250、Met 252、Ser254、Thr256、Thr307、Glu380、Met428、His433 和 /或Asn434 的一个或多 个位置处包含一个或多个突变。17. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是通过接头融 合于所述Fc结构域。18. 如权利要求17所述的方法，其中所述接头是包含3-100个氨基酸的肽。19. 如权利要求18所述的方法，其中所述接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG接 头，SEQIDNO:5)至少80%相同的序列。20. 如权利要求18所述的方法，其中所述接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAA AAAGGGGGGAP(GAG2 接头，SEQIDNO:6)至少 80%相同的序列。21. 如权利要求18所述的方法，其中所述接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAA AAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG3 接头，SEQIDNO:7)至少 80%相同的序列。22. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与SEQID NO: 8 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGG KKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEffGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:8)，或 SEQIDNO:9 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGG KKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEWGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDN0:9)至少80%相同的氨基酸序列。23. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与SEQID NO: 10 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEffGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:10)，或 SEQIDNO:11 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEWGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO: 11)至少80%相同的氨基酸序列。24. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是由哺乳动物 细胞产生。25. 如权利要求24所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。26. 如权利要求24所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是HT1080细胞。27. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是全身性施用。28. 如权利要求27所述的方法，其中所述全身性施用选自静脉内、皮内、吸入、经皮（表 面）、眼内、皮下、肌肉内、经口和/或经粘膜施用。29. 如权利要求28所述的方法，其中所述全身性施用是静脉内施用。30. 如权利要求28所述的方法，其中所述全身性施用是皮下施用。31. 如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述全身性施用是经口施用。32. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是每两月、每 月、每三周、每两周、每周、每日或在可变间隔下施用。33. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是向一种或多 种选自表1的骨骼肌递送。34. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是向一种或多 种选自膈肌、三头肌、比目鱼肌、胫骨前肌、腓肠肌、趾长伸肌、腹直肌和/或四头肌的靶标 组织递送。35. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是向心脏递送。36. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是向一种或多 种选自心脏和骨骼肌，包括膈肌、三头肌、比目鱼肌、胫骨前肌、腓肠肌、趾长伸肌、腹直肌和 /或四头肌的靶标组织递送。37. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述重组卵泡抑素蛋白会导致肌 肉再生、肌肉力量增加、灵活性增加、活动范围增加、耐力增加、易疲劳性降低、血流增加、认 知改进、肺功能改进、炎症抑制、肌肉纤维化减轻和/或肌肉坏死减轻。38. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述重组卵泡抑素蛋白会导致肌 肉纤维化和/或坏死减轻。39. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中DMD的所述至少一种症状或特征选自 由以下组成的组：肌肉消耗、肌肉无力、肌肉脆弱、肌肉坏死、肌肉纤维化、关节挛缩、骨骼变 形、心肌病、吞咽受损、肠和膀胱功能受损、肌肉缺血、认知损害、行为功能障碍、社交损害、 脊柱侧凸和呼吸功能受损。40. -种重组卵泡抑素融合蛋白，其包含 卵泡抑素多肽； Fc结构域；和 使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头， 其中所述卵泡抑素多肽包含与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQIDNO: 1)至少70%相同 的氨基酸序列；并且此外其中所述重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活化素、肌抑素和/或 ⑶F-11，并且具有在约0. 5-10天的范围内的体内半衰期。41. 如权利要求40所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述卵泡抑素多肽具有与所述 野生型人卵泡抑素蛋白（SEQIDNO: 1)至少80%相同的氨基酸序列。42. 如权利要求40所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述卵泡抑素多肽具有与所述 野生型人卵泡抑素蛋白（SEQIDNO: 1)至少90%相同的氨基酸序列。43. 如权利要求40所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述卵泡抑素多肽具有与所述 野生型人卵泡抑素蛋白（SEQIDNO: 1)至少95%相同的氨基酸序列。44. 如权利要求40所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述卵泡抑素多肽具有与所述 野生型人卵泡抑素蛋白（SEQIDNO: 1)相同的氨基酸序列。45.如权利要求40所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述卵泡抑素多肽含有SEQ ID NO: 1的氨基酸残基212-288的缺失。46. -种重组卵泡抑素融合蛋白，其包含 卵泡抑素多肽； Fc结构域；和 使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头， 其中所述卵泡抑素多肽包含与 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEW(SEQ IDN0:2)至少70%相同的氨基酸序列， 并且此外其中所述重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活化素、肌抑素和/或GDF-11，并 且具有在约〇. 5-10天的范围内的体内半衰期。47. 如权利要求40-46中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述Fc结构域是 IgGlFc结构域。48. 如权利要求40-46中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述Fc结构域具 有与 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQIDN0:3)至少80%相同的氨基酸序列。49. 如权利要求48所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述Fe结构域在对应于人 IgGl的Thr250、Met252、Ser254、Thr256、Thr307、Glu380、Met428、His433和 /或 Asn434的一个或多个位置处包含一个或多个突变。50. 如权利要求40-49中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述接头是包含 3-60个氨基酸的肽。51. 如权利要求50所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述接头包含与 GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG接头，SEQIDNO: 5)至少 80%相同的序列。52. 如权利要求50所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述接头包含与GAPGGGGGAAAA AGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG2 接头，SEQIDNO:6)至少 80%相同的序列。53. 如权利要求50所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述接头包含与GAPGGGGGAAA AAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG3 接头，SEQIDNO: 7)至少 80% 相同的序列。54. 如权利要求40-53中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述重组卵泡抑 素融合蛋白包含与SEQIDNO:8 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGG KKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEffGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:8)，或 SEQIDNO:9 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGG KKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEWGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDN0:9)至少80%相同的氨基酸序列。55. 如权利要求40-53中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述重组卵泡抑 素融合蛋白包含与SEQIDNO: 10 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEffGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:10)，或 SEQIDNO:11 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEWGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO: 11)至少80%相同的氨基酸序列。56. -种核酸，其包含编码如权利要求40-50中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋白 的核苷酸序列。57. -种细胞，其包含如权利要求56所述的核酸。58. -种药物组合物，其包含如权利要求40-55中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋 白和药学上可接受的载体。
【专利摘要】本发明尤其提供用于治疗肌营养不良，具体来说杜兴氏肌营养不良(DMD)的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明的一种方法包括向罹患或易患DMD的个体施用有效量的重组卵泡抑素蛋白以使DMD的至少一种症状或特征在强度、严重性或频度方面得以降低，或延迟发作。
【IPC分类】A61K38/17, A61P21/00, A61K38/16
【公开号】CN104902915
【申请号】CN201480003715
【发明人】R·迈尼奥
【申请人】夏尔人类遗传性治疗公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年1月24日
【公告号】CA2898121A1, EP2948161A1, WO2014116981A1
【专利说明】治疗杜兴氏肌营养不良的卵泡抑素
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年1月25日提交的美国临时专利申请序列号61/756, 996和2013 年12月13日提交的美国临时专利申请序列号61/915, 733的优先权，所述美国临时专利申 请的公开内容据此整体并入本文。
[0003] 背景
[0004] 杜兴氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD)是隐性X染色体关联形 式的肌营养不良，其导致肌肉退化以及最终死亡。所述病症是由位于人X染色体上的肌营 养不良蛋白（dystrophin)基因的突变引起，所述基因编码蛋白质肌营养不良蛋白，所述肌 营养不良蛋白是肌肉组织内的一种对细胞膜的肌营养不良蛋白聚糖复合物（DGC)提供结 构稳定性的重要结构组分。肌营养不良蛋白连接内部细胞质肌动蛋白微丝网状结构和细胞 外基质，从而对肌肉纤维提供物理强度。因此，改变肌营养不良蛋白或不存在肌营养不良蛋 白会导致肌纤维膜功能异常。尽管两种性别的人士均可携带突变，但男孩通常具有伴有早 期失能和死亡的重度表型，而携带突变的女性通常展现轻度得多的表型。
[0005] 目前，不存在用于DMD的已知治愈方法。已探宄许多治疗途径，包括基因疗法和皮 质类固醇的各种施用方案。尽管这些治疗中的一些可延迟某些征象和症状，但目前不存在 用于DMD患者的满意治疗选项。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明尤其提供用于基于卵泡抑素（follistatin)蛋白疗法来治疗肌营养 不良，具体来说杜兴氏肌营养不良（DMD)和/或贝克尔肌营养不良（Becker Muscular Dystrophy)的改进方法和组合物。如本文中，包括以下实施例中所述，本发明者首次证明 向DMD动物模型中全身性施用重组卵泡抑素蛋白（例如卵泡抑素-Fc重组融合蛋白）导致 全身各种组织中的有效肌肉生长，并且减轻DMD的特征性症状肌肉纤维化和/或坏死。此 外，本发明者也已证明本发明的卵泡抑素-Fc融合蛋白具有多达约5天的延长血清半衰期。 在不希望受任何理论束缚下，预期出乎意料长久的血清半衰期可已促成优越体内功效。实 际上，在本发明之前，已知卵泡抑素是肌抑素和活化素的调节剂，所述肌抑素和活化素均是 肌肉生长的重要负性调控剂。然而，在本发明之前，据报道卵泡抑素具有特别短暂的血清半 衰期，此构成将卵泡抑素开发成蛋白质治疗剂的重大障碍。举例来说，典型可商购获得的野 生型卵泡抑素（FS315)蛋白具有血清半衰期约1小时。Fc-融合蛋白已用于延长卵泡抑素 的血清半衰期。然而，由于Fc结构域的尺寸较大，以及卵泡抑素蛋白的尺寸相对较小，认为 Fc结构域直接融合于卵泡抑素蛋白可干扰野生型卵泡抑素蛋白的正常结构和功能。所报道 的卵泡抑素的不良药物动力学/药力学（PK/PD)性质和与卵泡抑素-Fc融合蛋白相关的不 确定性已阻碍科学家和临床医师进一步将卵泡抑素开发成用于DMD或其它肌营养不良的 蛋白质疗法。实际上，在本发明之前，基因疗法已成为用于DMD的基于卵泡抑素的疗法的焦 点。由本发明者显示的出乎意料优越的体内功效和半衰期首次确定卵泡抑素可为用于治疗 DMD的有效蛋白质治疗剂。
[0008] 在一个方面，本发明提供治疗杜兴氏肌营养不良（DMD)的方法，其包括向罹患或 易患DMD的个体施用有效量的重组卵泡抑素蛋白以使DMD的至少一种症状或特征在强度、 严重性或频度方面得以降低，或延迟发作。在一些实施方案中，DMD的至少一种症状或特征 选自由以下组成的组：肌肉消耗、肌肉无力、肌肉脆弱、关节挛缩、骨骼变形、脂肪浸润肌肉、 肌肉被非收缩性组织替换（例如肌肉纤维化）、肌肉坏死、心肌病、吞咽受损、肠和膀胱功能 受损、肌肉缺血、认知功能损害（例如学习困难、神经行为病症的危险较高、认知缺陷）、行 为功能障碍、社交损害、脊柱侧凸和呼吸功能受损。
[0009] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋 白
[0010] GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCE NVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDV FCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCE DIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISE DTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW(SEQ ID N0:1)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同的氨基酸序列。
[0011] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1至少70%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人 卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1至少80%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑 素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1至少90%相同的氨基酸序列。在一些实 施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1至少95%相同的 氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1相同的氨基酸序列。
[0012] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白相较于野生型人卵泡抑素蛋白包含一个或 多个缺失、突变或插入。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包含SEQ ID NO: 1的氨基酸 残基212-288(其对应于结构域3)的缺失。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包含肝 素结合位点。
[0013] 在一些实施方案中，本发明提供治疗杜兴氏肌营养不良（DMD)的方法，其包括向 罹患或易患DMD的个体施用有效量的重组卵泡抑素蛋白以使DMD的至少一种症状或特征在 强度、严重性或频度方面得以降低，或延迟发作，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与GNCWLR QAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKN KPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYC VTCNRICPEPAS SEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILE W(SEQ ID N0:2)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%)相同的氨基酸序列。
[0014] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID NO:2至少70%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID NO:2至少80%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID NO:2至少90%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID NO:2至少95%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID N0:2相同的氨基酸序列。
[0015] 在一些实施方案中，DMD的至少一种症状或特征选自由以下组成的组：肌肉消耗、 肌肉无力、肌肉脆弱、肌肉肥大、肌肉假性肥大、关节挛缩、骨骼变形、心、肌病、吞咽受损、肠 和膀胱功能受损、肌肉缺血、认知损害、行为功能障碍、社交损害、脊柱侧凸和呼吸功能受 损。
[0016] 在一些实施方案中，使重组卵泡抑素蛋白融合于Fc结构域。在一些实施方案中， 适于本发明的Fc结构域包含与
[0020] 在一些实施方案中，Fc结构域包含与SEQ ID NO:3、4或14至少80%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含与SEQ ID N0:3、4或14至少90%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含与SEQ ID N0:3、4或14至少95%相同的氨基 酸序列。
[0021] 在一些实施方案中，合适的Fc结构域包含一个或多个改进Fc结构域与FcRn受体 之间的结合，从而导致血清半衰期延长的突变。在一些实施方案中，合适的Fc结构域在对 应于人 IgGl 的 Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433 和/或Asn 434的一个或多个位置处包含一个或多个突变。在特定实施方案中，合适的Fe 结构域含有突变H433K(His433Lys)和/或N434F(Asn434Phe)。在特定实施方案中，合适的 Fc结构域包含以下所示的并有突变H433K(His433Lys)和N434F(Asn434Phe)的序列：
[0023] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是通过接头融合于Fc结构域。在一些实施 方案中，接头是包含3-100个氨基酸的肽。在一些实施方案中，接头不是由ALEVLFQGP组 成的接头。在一些实施方案中，接头包含在10-100个、10-90个、10-80个、10-70个、10-60 个、10-50个、10-40个、10-30个、10-20个、10-15个之间的氨基酸。在一些实施方案中，接 头包含至少 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 或 95 个氨基酸。在 一些实施方案中，接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG接头，SEQ ID NO: 5)至少50% (例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%) 相同的序列。在一些实施方案中，接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGA ￡(GAG2 接头，SEQ ID N0:6)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%)相同的序列。在一些实施方案中，接头包含与^AEGG GGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG3 接头，SEQ ID NO:7)至 少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%)相同的序列。在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7相同的序列。
[0024] 在一些实施方案中，本发明提供一种重组卵泡抑素融合蛋白，其包括卵泡抑素多 肽、Fc结构域和使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的长度是至少10 (例如至少15、 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 或 95)个氨基酸的接头。在一些实施 方案中，本发明提供一种重组卵泡抑素融合蛋白，其包括卵泡抑素多肽、Fc结构域和使所述 卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头，其中所述接头不是由ALEVLFQGP组成的接头。 在一些实施方案中，合适的卵泡抑素多肽包含与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID N0:1)至 少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活 化素、肌抑素和/或GDF-11，并且具有在约0. 5-10天的范围内的体内半衰期。
[0025] 在特定实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白包含与SEQ ID N0:8
97%、98%、99%或100% )相同的氨基酸序列。
[0030] 在特定实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白包含与SEQ ID NO: 10
97%、98%、99%或100% )相同的氨基酸序列。
[0039] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白是由哺乳动物细胞产生。在 一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵 巢（CHO)细胞或HT1080细胞。
[0040] 应了解本发明的实施方案可通过多种途径来递送。在一些实施方案中，重组卵泡 抑素蛋白是全身性施用。在一些实施方案中，全身性施用选自静脉内、皮内、吸入、经皮（表 面）、眼内、肌肉内、皮下、肌肉内、经口和/或经粘膜施用。
[0041] 实施方案可通过许多给药方案来施用。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是 每两月、每月、每三周、每两周、每周、每日或在可变间隔下施用。
[0042] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向一种或多种选自横纹肌（例如骨骼 肌、心肌）的靶标组织递送。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向心脏递送。在一些 实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向骨骼肌递送。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是 向一种或多种选自表1的骨骼肌递送。在一些实施方案中，横纹肌（例如骨骼肌）选自由 三头肌、胫骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、二头肌、斜方肌、三角肌、四头肌和膈肌组成的组。
[0043] 在一些实施方案中，施用重组卵泡抑素蛋白会导致肌肉再生、纤维化减轻、肌肉力 量增加、灵活性增加、活动范围增加、耐力增加、易疲劳性降低、血流增加、认知改进、肺功能 改进、炎症抑制、肌肉纤维化和/或坏死减轻。
[0044] 在另一方面，本发明提供用于本文所述的各种方法中的组合物。在一些实施方案 中，本发明提供重组卵泡抑素融合蛋白，其包括卵泡抑素多肽、Fc结构域和使所述卵泡抑素 多肽与所述Fc结构域缔合的接头，其中所述卵泡抑素多肽包含与野生型人卵泡抑素蛋白 (SEQ ID N0:1)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融 合蛋白能够结合活化素、肌抑素和/或GDF-11。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋 白的体内半衰期大于约2天（例如大于约2. 5天、约3天、约3. 5天、约4天、约4. 5天、约 5天、约5. 5天、约6天）。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋白的体内半衰期在约 2-10天的范围内（例如在约2. 5-10天、约3-10天、约3. 5-10天、约4-10天、约4. 5-10天、 约5-10天、约3-8天、约3. 5-8天、约4-8天、约4. 5-8天、约5-8天、约3-6天、约3. 5-6天、 约4-6天、约4. 5-6天、约5-6天的范围内）。在一些实施方案中，体内半衰期是在小鼠、大 鼠、非人灵长类动物和/或人中的一个或多个中测量。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽具 有与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID NO: 1)至少70%相同的氨基酸序列。在一些实施方 案中，卵泡抑素多肽具有与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID NO: 1)至少80%相同的氨基酸 序列。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽具有与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID N0:1)至 少90 %相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽具有与野生型人卵泡抑素蛋 白（SEQ ID NO: 1)至少95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽具有与 野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID NO: 1)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，卵泡抑素 多肽含有SEQ ID NO: 1的氨基酸残基212-288(其对应于结构域3)的缺失。在各种实施方 案中，卵泡抑素多肽含有硫酸肝素结合位点。
[0045] 在一些实施方案中，本发明提供重组卵泡抑素融合蛋白，其包括卵泡抑素多肽、Fc 结构域和使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头，其中所述卵泡抑素多肽包含
[0046] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活化素、肌抑素和/或 GDF-11。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋白的体内半衰期大于约2天（例如大于 约2. 5天、约3天、约3. 5天、约4天、约4. 5天、约5天、约5. 5天、约6天）。在一些实施方 案中，重组卵泡抑素融合蛋白的体内半衰期在约2-10天的范围内（例如在约2. 5-10天、约 3-10天、约3. 5-10天、约4-10天、约4. 5-10天、约5-10天、约3-8天、约3. 5-8天、约4-8 天、约4. 5-8天、约5-8天、约3-6天、约3. 5-6天、约4-6天、约4. 5-6天、约5-6天的范围 内）。在一些实施方案中，体内半衰期是在小鼠、大鼠、非人灵长类动物和/或人中的一个或 多个中测量。
[0047] 在一些实施方案中，Fc结构域是IgGlFc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域具
[0050] 在一些实施方案中，合适的Fc结构域包含一个或多个改进Fc结构域与FcRn受体 之间的结合，从而导致血清半衰期延长的突变。在一些实施方案中，Fc结构域在对应于人 IgGl 的 Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433和 /或 Asn 434的一个或多个位置处包含一个或多个突变。在特定实施方案中，合适的Fe结构域 含有突变H433K(His433Lys)和/或N434F(Asn434Phe)。在特定实施方案中，合适的Fc结 构域包含以下所示的并有突变H433K(His433Lys)和N434F(Asn434Phe)的序列：
[0052] 在一些实施方案中，本发明的重组卵泡抑素融合蛋白包括接头以使通过所述接头 达成的Fc融合不实质上改变卵泡抑素与同源配体的结合性质，包括维持缺乏与肝素结合。 在一些实施方案中，合适的接头是包含3-60个氨基酸的肽。在一些实施方案中，合适的接 头是包含至少 1〇(例如至少 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 或 95) 个氨基酸的肽。在一些实施方案中，合适的接头包含与eAEGGGGGAAAAAGGGGGSAE(GAG接头， SEQ ID NO:5)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%)相同的序列。在一些实施方案中，合适的接头包含与GAP GGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG2 接头，SEQ ID NO: 6)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同 的序列。在一些实施方案中，合适的接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGG GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG3 接头，SEQ ID NO: 7)至少 50 % (例如至少 55 %、60 %、65 %、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同的序列。
[0053] 在特定实施方案中，由本发明提供的重组卵泡抑素融合蛋白包含与SEQIDN0:8、 9、10、11、16 或 17 至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同的氨基酸序列。
[0054] 在一些实施方案中，本发明提供包含编码本文所述的重组卵泡抑素融合蛋白的核 苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核酸的细胞，所述核酸包含编码 本文所述的重组卵泡抑素融合蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含本 文所述的重组卵泡抑素融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0055] 如本申请中所用，术语"约"和"近似"用作等效语。与或不与约/近似一起用于 本申请中的任何数字都意图涵盖由相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动。
[0056] 本发明的其它特征、目标和优势在以下详细描述中显而易知。然而，应了解尽管指 示本发明的实施方案，但详细描述是通过仅仅说明而非限制的方式给出。在本发明的范围 内的各种变化和修改将根据详细描述而变得为本领域技术人员显而易知。
[0057] 附图简述
[0058] 图式仅出于说明目的而出于非限制目的。
[0059] 图1显示说明相较于可商购获得的可溶性活化素受体（sActRIIB)，FS315_Fc不通 过Smad 1/5/8路径抑制BMP-9或BMP-10信号传导的示例性结果。图IA显示BMP-9抑制 测定的示例性结果，而图IB显示BMP-10抑制测定的示例性结果。
[0060] 图2显示说明FS315-FC抑制肌抑素和活化素介导的Smad 2/3信号传导的示例性 结果。图2A显示肌抑素抑制测定的示例性结果，而图2B显示活化素A抑制测定的示例性 结果。
[0061] 图3显示说明跨越各组织的PK曲线的示例性结果。一示例性卵泡抑素-Fc蛋白 具有于小鼠血清中的血清半衰期~5天（图3A)和组织半衰期2 - 5天（图3B)。
[0062] 图4显不说明在4和10周暴露于lmg/kg FS315_mFc以及6周暴露于8mg/kg之 后，示例性卵泡抑素-Fc蛋白对四头肌（图4A)、腓肠肌（图4B)、胫骨 前肌（图4C)和三头 肌（图4D)的肌肉重量的影响的示例性结果。肌肉重量是相对于基线体重加以校正。
[0063] 图5显示说明示例性卵泡抑素-Fc蛋白随时间对血清卵泡抑素水平的影响的示例 性结果。图5A显示在历经10周用lmg/kg FS315-mFc治疗之后于血清中的水平，而图5B 显示在历经6周用8mg/kg FS315-mFc治疗之后于血清中的水平。
[0064] 图6显示说明在暴露于FS315-mFc、sActRIIB-mFc或PBS对照之后，示例性卵泡抑 素-Fe蛋白对腓肠肌的肌肉重量的影响的示例性结果。
[0065] 图7显示说明野生型卵泡抑素和变体对体重的影响的示例性结果。图片A显示各 组中动物随时间的示例性平均体重，而图片B显示各组中动物在注射后第6周的示例性平 均体重。
[0066] 图8显示说明在注射后第2周卵泡抑素变体对注射的肌肉的重量的影响的示例性 结果。图片A显示注射的肌肉腓肠肌的质量，而图片B显示注射的肌肉四头肌的质量。
[0067] 图9显示说明在注射后2周结构域3缺失对注射的肌肉和远离注射部位的肌肉的 影响的示例性结果。左侧四头肌是注射部位，而右侧四头肌是对侧动物内对照肌肉。
[0068] 图10显示说明在注射后第4周卵泡抑素变体对注射部位中以及远离注射部位的 具体肌肉的重量的影响的示例性结果。图片A(腓肠肌）和图片B(四头肌）是注射的肌肉。 图片C (胫骨前肌）、图片D (三头肌）和图片E (膈肌）是远离注射部位的肌肉。
[0069] 图11显示说明在注射后4周结构域3缺失对注射的肌肉和远离注射部位的肌肉 的影响的示例性结果。左侧四头肌是注射部位，而右侧四头肌是对侧动物内对照肌肉。
[0070] 图12显示说明在注射后第2周卵泡抑素变体对注射的肌肉与远端肌肉两者中，即 (A)四头肌、（B)腓肠肌、（C)胫骨前肌、（D)三头肌和（E)膈肌中纤维尺寸的影响的示例性 结果
[0071]图13显示说明在注射后第4周卵泡抑素变体对注射的肌肉与远端肌肉两者中，即 (A)四头肌、（B)腓肠肌、（C)胫骨前肌、（D)三头肌和（E)膈肌中纤维尺寸的影响的示例性 结果
[0072] 图14显示说明在注射后第6周卵泡抑素变体对注射的肌肉与远端肌肉两者中，即 (A)四头肌、（B)腓肠肌、（C)胫骨前肌、（D)三头肌和（E)膈肌中纤维尺寸的影响的示例性 结果
[0073] 图15显示说明在4周暴露之后示例性卵泡抑素-Fe蛋白对A)C57小鼠和B)mdx 小鼠的腓肠肌中的肌纤维的直径的影响的示例性结果。
[0074] 图16显示说明相较于媒介物对照动物，在2、4、6或8周暴露之后示例性卵泡抑 素-Fe蛋白对治疗的C57小鼠的体重的影响的示例性结果。
[0075] 图17以超过媒介物对照动物的增加百分比形式显示说明在4和8周暴露之后示 例性卵泡抑素-Fe蛋白对治疗的动物的三头肌和四头肌的重量的影响的示例性结果。
[0076] 图18以超过媒介物对照动物的增加百分比形式显示说明在4和8周暴露之后示 例性卵泡抑素-Fe蛋白对治疗的动物的三头肌和四头肌中的肌纤维的直径的影响的示例 性结果。
[0077] 图19显示在1、3、4、6或8周暴露之后，通过每周两次皮下注射施用融合蛋白的动 物的血清中的卵泡抑素-Fe蛋白的示例性水平。图片A)显示在4周之后安乐死的动物的 结果，而图片B)显示在8周暴露之后安乐死的动物的结果。
[0078] 图20显示说明在6或12周暴露之后，相较于媒介物对照动物，卵泡抑素-Fe蛋白 对治疗的动物的四头肌中的三种纤维化标记：a -平滑肌肌动蛋白、含有胶原蛋白三螺旋 重复序列的蛋白质l(cthrcl)和胶原蛋白I的mRNA表达的影响的示例性结果。
[0079] 图21显示用媒介物或卵泡抑素-Fe蛋白治疗6周的mdx小鼠的四头肌和三头肌 的示例性H&E染色切片。也显示C57对照小鼠的四头肌和三头肌的示例性H&E染色。
[0080] 图22显示用媒介物或卵泡抑素-Fe蛋白治疗12周的mdx小鼠的四头肌、三头肌 和膈肌的示例性胶原蛋白I染色切片。也显示C57对照小鼠的四头肌、三头肌和膈肌的示 例性胶原蛋白I染色。
[0081] 图23显示说明相较于对侧媒介物对照肌肉，每周两次肌肉内注射两种卵泡抑素 变体，即FS315-mFc融合蛋白和dFSD3-mFc变体融合蛋白中的一个对治疗4周的C57BL/10 小鼠的肌肉重量的影响的示例性结果。
[0082] 图24显示说明FS315-GAG3-mFc和FS315-GAG3-hFc融合蛋白在CAGA-荧光素酶 测定中在与天然FS315相同的程度上抑制（A)肌抑素和（B)活化素信号传导的示例性结 果。相比较来说，含有9个氨基酸接头的Sino Biological FS315_hFc (由Sino Biological Inc?制造，目录号10685-H02H)的强力性显著较小。
[0083]图25显示以单次SC注射10mg/kg蛋白质给药的大鼠的血清中的FS315-GAG3-hFc 蛋白的水平。计算的血清半衰期是3. 5天。
[0084] 定义
[0085]为使本发明更易于理解，以下首先定义某些术语。以下术语和其它术语的其它定 义在整篇说明书中加以阐述。
[0086]动物：如本文所用，术语"动物"是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，"动 物"是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，"动物"是指处于任何发育阶段的非 人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物（例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、 猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪）。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟、 爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可为转基因动物、遗传 工程化动物和/或克隆。
[0087]近似或约：如本文所用，如应用于一个或多个目标值的术语"近似"或"约"是指 值类似于所述参照值。在某些实施方案中，除非另外陈述或另外根据上下文是明显的，否 则术语"近似"或"约"是指一定范围的值落在所述参照值在任一方向（大于或小于）上的 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、 5%、4%、3%、2%、1%或小于1%内（例外之处是当所述数值将超过可能值的100%时）。 [0088] 生物利用度：如本文所用，术语"生物利用度"通常是指到达受试者的血流的施用 剂量的百分比。
[0089]生物活性：如本文所用，短语"生物活性"是指在生物系统中，并且特别是在生物体 中具有活性的任何药剂的特征。举例来说，当向生物体施用时，对那个生物体具有生物作用 的药剂被视为具有生物活性。在特定实施方案中，当肽具有生物活性时，那个肽的共有所述 肽的至少一种生物活性的部分通常称为"生物活性"部分。
[0090]心肌：如本文所用，术语"心肌"是指见于心脏壁中的不随意横纹肌类型，并且特别 是心肌层。
[0091] 载体或稀释剂：如本文所用，术语"载体"和"稀释剂"是指适用于制备药物制剂的 药学上可接受的（例如安全和无毒用于向人施用）载体或稀释物质。示例性稀释剂包括无 菌水、抑菌注射用水（BWFI)、pH缓冲溶液（例如磷酸盐缓冲盐水）、无菌盐水溶液、林格氏 溶液（Ringer's solution)或右旋糖溶液。
[0092]卵泡抑素或重组卵泡抑素：如本文所用，除非另外规定，否则术语"卵泡抑素 (FS) "或"重组卵泡抑素"是指保留实质性卵泡抑素生物活性的任何野生型和修饰的卵泡抑 素蛋白（例如具有氨基酸突变、缺失、插入的卵泡抑素蛋白、和/或融合蛋白）。缺失的一非 限制性实例是结构域3缺失（AD3或dFSD3)。融合蛋白的一非限制性实例是Fc-融合蛋 白。
[0093]功能性等效物或衍生物：如本文所用，在氨基酸序列的功能性衍生物的情形下，术 语"功能性等效物"或"功能性衍生物"表示保留大致上类似于原始序列的生物活性的生物 活性（功能或结构）的分子。功能性衍生物或等效物可为天然衍生物，或是合成制备。示 例性功能性衍生物包括具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列，前提是 蛋白质的生物活性得以保全。取代性氨基酸合乎需要地具有与被取代的氨基酸的化学物理 性质类似的化学物理性质。合乎需要的类似化学物理性质包括电荷、体积大小、疏水性、亲 水性等方面的类似性。
[0094]融合蛋白：如本文所用，术语"融合蛋白"或"嵌合蛋白"是指通过接合两个或更多 个最初分开的蛋白质或其部分产生的蛋白质。在一些实施方案中，接头或间隔子将存在于 各蛋白质之间。
[0095]半衰期：如本文所用，术语"半衰期"是为如蛋白质浓度或活性的数量降至它的如 在某一时期开始时测量的值的一半所需的时间。
[0096]肥大：如本文所用，术语"肥大"是指器官或组织的体积由于它的组成细胞的增大 而增加。
[0097]改进、增加或降低：如本文所用，术语"改进"、"增加"或"降低"或语法等效形式指 示相对于基线测量结果的值，所述基线测量结果如同一个体中在启始本文所述的治疗之前 的测量结果，或对照受试者（或多个对照受试者）中在不存在本文所述的治疗下的测量结 果。"对照受试者"是与所治疗的受试者受相同形式的疾病折磨，与所治疗的受试者具有大 约相同的年龄的受试者。
[0098]体外：如本文所用，术语"体外"是指事件发生在人工环境中，例如试管或反应容器 中，细胞培养物中等，而非在多细胞生物体内。
[0099] 体内：如本文所用，术语"体内"是指事件发生在多细胞生物体，如人和非人动物 内。在基于细胞的系统的情形下，所述术语可用于指代事件发生在活细胞内（与例如体外 系统相反）。
[0100] 接头：如本文所用，术语"接头"是指在融合蛋白中，除出现在天然蛋白质中的特定 位置处的氨基酸序列以外的氨基酸序列，并且通常被设计来具有可挠性或插入两个蛋白质 部分之间的结构，如a-螺旋。接头也称为间隔子。接头或间隔子通常自身不具有生物功 能。
[0101] 多肽：如本文所用的术语"多肽"是指通过肽键连接在一起的氨基酸的连续链。所 述术语用于指代具有任何长度的氨基酸链，但本领域普通技术人员应了解，所述术语不限 于过长链，并且可指包含两个通过肽键连接在一起的氨基酸的最小链。如为本领域技术人 员所知，多肽可被加工和/或修饰。如本文所用，术语"多肽"和"肽"可互换使用。
[0102] 预防：如本文所用，术语"预防（prevent/prevention) "在与疾病、病症和/或病 状的发生关联使用时是指降低显现所述疾病、病症和/或病状的危险。参见对"危险"的定 义。
[0103] 蛋白质：如本文所用的术语"蛋白质"是指一个或多个充当个别单元的多肽。如果 单一多肽是个别功能性单元，并且不需要与其它多肽永久或暂时物理缔合以形成个别功能 性单元，那么术语"多肽"和"蛋白质"可互换使用。如果个别功能性单元包含一个以上彼 此物理缔合的多肽，那么术语"蛋白质"是指物理偶联，并且一起充当个别单元的多个多肽。
[0104] 危险：如将根据上下文所了解，疾病、病症和/或病状的"危险"包括特定个体将显 现疾病、病症和/或病状（例如肌营养不良）的可能性。在一些实施方案中，将危险表示为 百分比。在一些实施方案中，危险是 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90 直至100%。在一些实施方案中，将危险表不为相对于与某一参照样本或一组参照样本相 关的危险的危险。在一些实施方案中，某一参照样本或一组参照样本具有疾病、病症、病状 和/或事件（例如肌营养不良）的已知危险。在一些实施方案中，某一参照样本或一组参 照样本来自与特定个体类似的个体。在一些实施方案中，相对危险是〇、1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10或大于10。
[0105] 横纹肌：如本文所用，术语"横纹肌"是指多核肌肉组织，其中它们的细胞内收缩性 单位（即肌小节）规则排列，从而导致在使用显微术下出现条纹并处于随意控制下。通常， 横纹肌可为心肌、骨骼肌和鳃节肌。
[0106] 平滑肌：如本文所用，术语"平滑肌"是指不随意控制的非横纹肌，包括单一肌肉和 多单位肌肉。
[0107] 受试者：如本文所用，术语"受试者"是指人或任何非人动物（例如小鼠、大鼠、兔、 狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物）。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中， 受试者是人类。受试者可为患者，其是指向医疗提供者递呈以诊断或治疗疾病的人。术语 "受试者"在本文中可与"个体"或"患者"互换使用。受试者可受疾病或病症折磨或易患疾 病或病症，但可或可不显示所述疾病或病症的症状。
[0108] 大致上：如本文所用，术语"大致上"是指展现总体或接近总体范围或程度的目标 特征或性质的定性情况。生物领域普通技术人员将了解如果发生，那么生物和化学现象很 少达到完全和/或进行至完全或达成或避免绝对结果。因此，术语"大致上"在本文中用于 获取许多生物和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
[0109] 大致同源性：短语"大致同源性"在本文中用于指代氨基酸或核酸序列之间的比 较。如将由本领域普通技术人员所了解，如果两个序列在相应位置中含有同源残基，那么它 们通常被视为"大致上同源"。同源残基可为相同残基。或者，同源残基可为将具有适当类 似结构和/或功能特征的非相同残基。举例来说，如本领域普通技术人员所熟知，某些氨基 酸通常被分类为"疏水性"或"亲水性"氨基酸，和/或具有"极性"或"非极性"侧链。将一 个氨基酸取代成另一相同类型可常被视为"同源"取代。
[0110] 如本领域中所熟知，可使用多种算法中的任一个比较氨基酸或核酸序列，所 述算法包括如针对核苷酸序列的BLASTN以及针对氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST 和PSI-BLAST的商业计算机程序中可用的那些。示例性所述程序描述于Altschul 等，Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. ,215(3) :403_410，1990; Altschul 等，Methods in Enzymology ;Altschul 等，''Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"，Nucleic Acids Res.25:3389_3402, 1997 ;Baxevanis 等，Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998 ;以及 Misener 等（编），Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,第 132卷），Humana Press, 1999 中。除鉴定同源序列之外，以上提及的程序也通常提供同源性程度的指示。在一些实施方 案中，如果历经一段相关残基，两个序列的相应残基中的至少50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多是同源 的，那么它们被视为大致上同源。在一些实施方案中，相关链段是完整序列。在一些实施方 案中，相关链段是至少 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、 125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500 个或更多个残 基。
[0111] 大致同一性：短语"大致同一性"在本文中用于指代氨基酸或核酸序列之间的比 较。如将由本领域普通技术人员所了解，如果两个序列在相应位置中含有相同残基，那么它 们通常被视为"大致上相同"。如本领域中所熟知，可使用多种算法中的任一个比较氨基酸 或核酸序列，所述算法包括如针对核苷酸序列的BLASTN以及针对氨基酸序列的BLASTP、空 位BLAST和PSI-BLAST的商业计算机程序中可用的那些。示例性所述程序描述于Altschul 等，Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. ,215(3) :403_410, 1990 ;Altschul 等，Methods in Enzymology ;Altschul 等，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis 等,Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins，Wiley，1998;以及 Misener 等（编），Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,第 132 卷），Humana Press, 1999 中。除鉴定 相同序列之外，以上提及的程序也通常提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果历 经一段相关残基，两个序列的相应残基中的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于 99%是相同的，那么 它们被视为大致上相同。在一些实施方案中，相关链段是完整序列。在一些实施方案中， 相关链段是至少 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、 150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500 个或更多个残基。
[0112] 罹患：正"罹患"疾病、病症和/或病状的个体已被诊断有或显示所述疾病、病症和 /或病状的一种或多种症状。
[0113] 易患："易患"疾病、病症和/或病状的个体尚未被诊断有所述疾病、病症和/或病 状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体可不展现所述疾病、病症和/或 病状的症状。在一些实施方案中，易患疾病、病症、病状或事件（例如DMD)的个体可具有一 个或多个以下特征：（1)与显现所述疾病、病症和/或病状相关的遗传突变；（2)与显现所 述疾病、病症和/或病状相关的遗传多态性；（3)与所述疾病、病症和/或病状相关的蛋白 质的表达和/或活性增加和/或降低；(4)与显现所述疾病、病症、病状和/或事件相关的 习惯和/或生活方式；（5)已经受、计划经受或需要移植。在一些实施方案中，易患疾病、病 症和/或病状的个体将显现所述疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患疾病、病 症和/或病状的个体将不显现所述疾病、病症和/或病状。
[0114] 靶标组织：如本文所用，术语"靶标组织"是指受待治疗的疾病，如杜兴氏肌营养不 良（DMD)影响的任何组织。在一些实施方案中，靶标组织包括显示疾病相关的病变、症状或 特征，包括但不限于肌肉消耗、骨骼变形、心肌病和呼吸功能受损的那些组织。
[0115] 治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的"治疗有效量"是指当向罹患或易患疾病、 病症和/或病状的受试者施用时，足以治疗、诊断、预防所述疾病、病症和/或病状的症状和 /或延迟其发作的量。本领域普通技术人员应了解，治疗有效量通常是通过包含至少一个单 位剂量的给药方案施用。
[0116] 治疗：如本文所用，术语"治疗（treat/treatment/treating) "是指用于部分或完 全减轻、改善、缓和、抑制、预防特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征、延迟 其发作、减轻其严重性、和/或降低其发生率的任何方法。治疗可向不展现疾病的征象和 /或仅展现所述疾病的早期征象的受试者施用以达成降低显现与所述疾病相关的病变的危 险的目的。
[0117] 某些实施方案的详述
[0118] 本发明尤其提供用于基于作为蛋白质治疗剂的卵泡抑素来治疗肌营养不良，包括 杜兴氏肌营养不良（DMD)和/或贝克尔肌营养不良的方法和组合物。在一些实施方案中， 本发明提供治疗DMD的方法，其包括向罹患或易患DMD的个体施用有效量的重组卵泡抑素 蛋白以使DMD的至少一种症状或特征在强度、严重性或频度方面得以降低，或延迟发作。
[0119] 本发明的各个方面详述于以下章节中。使用所述章节不意图限制本发明。各章节 可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外陈述，否则使用"或"是指"和/或"。
[0120] 杜兴氏肌营养不良（DMD)
[0121] DMD是一种特征在于全身肌肉进行性退化以及肌肉相关功能丧失的疾病。预期本 发明提供用于再生肌肉以及治疗各种肌肉组织中与DMD和其它肌营养不良相关的纤维化、 炎症和其它症状或特征的方法和组合物。在一些实施方案中，在受试者中使用提供的方法 和组合物会导致那个受试者的纤维化和/或坏死减轻。
[0122] 肌肉组织
[0123] 在动物中存在两种主要类型的肌肉组织-横纹肌和平滑肌。如本文所用，术语 "横纹肌"是指含有重复肌小节的肌肉组织。横纹肌倾向于处于随意控制下，并且连接于骨 骼，但存在一些例外，如心肌，其具有横纹肌的若干性质，但不处于随意控制下。通常，横纹 肌允许身体随意运动，并且包括主要肌肉群，包括四头肌、腓肠肌、二头肌、三头肌、斜方肌、 三角肌和许多其它肌肉群。横纹肌倾向于是极长的，并且许多横纹肌能够独立地起作用。然 而，一些横纹肌不连接于骨骼，包括口腔、肛门、心脏和食道上部中的那些。
[0124] 另一方面，平滑肌具有极其不同的结构。并非 是具有单独骨骼连接的一系列长肌， 平滑肌倾向于组织成连续薄片，其中在平滑肌细胞之间具有机械连接。平滑肌常位于中空 器官的壁中，并且通常不处于随意控制下。衬于特定器官的平滑肌必须承担相同负荷并同 时收缩。平滑肌至少部分地起处理中空器官上由运动和/或姿势或压力变化引起的负荷变 化的作用。这个双重作用意味着平滑肌必须不仅能够像横纹肌一样收缩，而且它必须能够 紧张性收缩以针对持续负荷维持器官尺寸。平滑肌的实例是衬于血管、膀胱、胃肠道（如直 肠）的那些。
[0125] 肌肉的强度取决于肌肉细胞的数目和尺寸以及它们的解剖排列。通过现存肌原纤 维的尺寸增加（肥大）和/或更多肌肉细胞的形成（增生）来增加肌肉纤维的直径将使肌 肉的力量产生能力增加。
[0126] 肌肉也可根据位置或功能来分组。在一些实施方案中，使重组卵泡抑素蛋白靶向 面部的一种或多种肌肉、一种或多种用于咀嚼的肌肉、舌部和颈部的一种或多种肌肉、胸部 的一种或多种肌肉、胸带和手臂的一种或多种肌肉、手臂和肩部的一种或多种肌肉、一种或 多种腹侧和背侧前臂肌肉、手部的一种或多种肌肉、竖脊肌的一种或多种肌肉、骨盆带和腿 部的一种或多种肌肉、和/或前腿和足部的一种或多种肌肉。
[0127] 在一些实施方案中，面部的肌肉包括但不限于眼内肌肉，如睫状肌、虹膜开大肌、 虹膜括约肌；耳部的肌肉，如耳廓肌、颞顶肌、镫骨肌、鼓膜张肌；鼻部的肌肉，如降眉间肌、 鼻肌、鼻孔开大肌、降鼻中隔肌、提上唇鼻翼肌；口腔的肌肉，如提口角肌、降口角肌、口轮匝 肌、颊肌、颧大肌和颧小肌、颈阔肌、提上唇肌、降下唇肌、笑肌、颏肌和/或皱眉肌。
[0128] 在一些实施方案中，咀嚼肌包括但不限于咬肌、颞肌、翼内肌、翼外肌。在一些实施 方案中，舌部和颈部的肌肉包括但不限于颏舌肌、茎突舌肌、舌腭肌、舌骨舌肌、二腹肌、茎 突舌骨肌、下颁舌骨肌、颏舌骨肌、肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌、胸骨甲状肌、甲状舌骨肌、胸锁 乳突肌、前斜角肌、中斜角肌和/或后斜角肌。
[0129] 在一些实施方案中，胸部、胸带和手臂的肌肉包括但不限于锁骨下胸大肌、胸小 肌、腹直肌、外腹斜肌、内腹斜肌、腹横肌、膈肌、肋间外肌、肋间内肌、前锯肌、斜方肌、肩胛 提肌、大菱形肌、小菱形肌、背阔肌、三角肌、肩胛下肌、冈上肌、冈下肌、大圆肌、小圆肌和/ 或P彖肽肌。
[0130] 在一些实施方案中，手臂和肩部的肌肉包括但不限于肱二头肌-长头、肱二头 肌-短头、肱三头肌-长头、肱三头肌外侧头、肱三头肌-内侧头、肘肌、旋前圆肌、旋后肌和 /或肱肌。
[0131] 在一些实施方案中，腹侧和背侧前臂的肌肉包括但不限于肱桡肌、屈腕肌、尺侧腔 屈肌、掌长肌、尺侧腕伸肌、桡侧腕长伸肌、桡侧腕短伸肌、指伸肌、小指伸肌。
[0132] 在一些实施方案中，手部的肌肉包括但不限于手部的内附肌，如鱼际、拇短展肌、 拇短屈肌、拇指对掌肌、小鱼际、小指展肌、小指短屈肌、小指对掌肌、骨间掌侧肌、骨间背侧 肌和/或蚓状肌。
[0133] 在一些实施方案中，竖脊肌包括但不限于颈肌、棘肌、最长肌和/或髂肋肌。
[0134] 在一些实施方案中，骨盆带和腿部的肌肉包括但不限于腰大肌、髂肌、股方肌、长 收肌、短收肌、大收肌、股薄肌、缝匠肌、股四头肌（如股直肌、股外侧肌、股内侧肌、股中间 肌）、腓肠肌、腓骨长肌（腓长肌）、比目鱼肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、腿筋：股二头肌：长 头、腿筋：股二头肌：短头、腿筋：半腱肌、腿筋：半膜肌、阔筋膜张肌、耻骨肌和/或胫骨前 肌。
[0135] 在一些实施方案中，前腿和足部的肌肉包括但不限于趾长伸肌、拇长伸肌、腓骨短 肌、跖肌、胫骨后肌、拇长屈肌、趾短伸肌、拇短伸肌、展肌、拇短屈肌、小指展肌、小指屈肌、 小指对掌肌、趾短伸肌、足部的蚓状肌、足底方肌或副屈肌、趾短屈肌、骨间背侧肌和/或骨 间足底肌。
[0136] 示例性肌肉靶标概述于表1中。
[0137]表 1
[0138]
[0140] 肌营养不良
[0141] 肌营养不良是一组导致肌肉退化，从而导致运动无力和受损的遗传病症。所有肌 营养不良的主要特征都在于它们在性质上是进行性的。肌营养不良包括但不限于：杜兴氏 肌营养不良（DMD)、贝克尔肌营养不良、艾梅-德莱富斯（Emery-Dreifuss)肌营养不良、面 肩胛臂性肌营养不良、肢带肌营养不良、以及1型和2型肌强直性营养不良，包括先天性形 式的1型肌强直性营养不良。症状可随肌营养不良的类型而变化，其中一些或所有肌肉受 影响。肌营养不良的示例性症状包括肌肉运动技能的发展延迟、使用一个或多个肌肉群有 困难、吞咽、说话或进食有困难、垂涎、眼睑下垂、频繁跌倒、就成人而言某一肌肉或一组肌 肉的强度损失、肌肉尺寸损失、由于身体无力或生物力学改变所致的行走问题、肌肉肥大、 肌肉假性肥大、脂肪浸润肌肉、肌肉被非收缩性组织替换（例如肌肉纤维化）、肌肉坏死和/ 或认知或行为损害/精神迟缓。
[0142] 尽管不存在用于肌营养不良的已知治愈方法，但在使用包括对症性疗法与疾病 改进性疗法两者的若干支持性治疗。皮质类固醇、物理疗法、矫正装置、轮椅或针对ADL 和肺功能的其它辅助性医学装置通常用于肌营养不良中。心脏起搏器用于在肌强直性营 养不良中预防猝死于心律不整。改进肌强直（不能松驰）的症状的抗肌强直剂包括美西 律（mexilitine)，并且在一些情况下，包括苯妥英、普鲁卡因胺（procainamide)和奎宁 (quinine)〇
[0143] 杜兴氏肌营养不良
[0144] 杜兴氏肌营养不良（DMD)是隐性X染色体关联形式的肌营养不良，其导致肌肉退 化以及最终死亡。DMD的特征在于近端肌肉无力、步态异常、腓肠（小腿）肌假性肥大和肌 酸激酶（CK)升高。许多DMD患者在年龄约5岁时被确诊，此时症状/征象通常变得更明显。 受影响的个体通常在年龄约10-13岁时停止行走，并且由于心肺功能障碍而在他们的20多 岁的中期至后期时或之前死亡。
[0145] 病症DMD是由位于人X染色体上的肌营养不良蛋白基因的突变引起，所述基因编 码蛋白质肌营养不良蛋白，所述肌营养不良蛋白是肌肉组织内的一种对细胞膜的肌营养不 良蛋白聚糖复合物（DGC)提供结构稳定性的重要结构组分。肌营养不良蛋白连接内部细胞 质肌动蛋白微丝网状结构和细胞外基质，从而对肌肉纤维提供物理强度。因此，改变肌营养 不良蛋白或不存在肌营养不良蛋白会导致肌肉纤维的异常肌纤维膜撕裂和坏死。尽管两种 性别的人士均可携带突变，但女性很少展现重度疾病征象。
[0146] DMD的一主要症状是与肌肉消耗相关的肌肉无力，其中随意肌通常首先受影响，尤 其影响臀部、骨盆区域、大腿、肩部的肌肉以及小腿肌肉。肌肉无力也发生在手臂、颈部和其 它区域中。小腿常增大。征象和症状通常出现在6岁年龄之前，并且可早在婴儿期出现。其 它身体症状包括但不限于独立行走的能力延迟、进行性行走、步进或奔跑困难、以及最终丧 失行走能力（通常截至15岁年龄）；频繁跌倒；疲劳；运动技能（奔跑、弹跳、跳跃）有困难； 腰椎脊柱前凸增加，从而导致臀部屈肌缩短；因为肌肉纤维缩短以及在结缔组织中发生纤 维化所致的损害功能性的跟腱和腿筋挛缩；肌肉纤维变形；由肌肉组织被脂肪和结缔组织 替换引起的舌部和小腿肌肉的假性肥大（增大）；神经行为病症（例如ADHD)的危险较高、 学习障碍（阅读困难）、以及特定认知技能（具体来说短期言语性记忆）的非进行性薄弱； 骨骼变形（在一些情况下包括脊柱侧凸）。
[0147] 重组卵泡抑素蛋白
[0148] 如本文所用，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白包括保留实质性卵泡抑素生物活性 的任何野生型和修饰的卵泡抑素蛋白（例如具有氨基酸突变、缺失、插入的卵泡抑素蛋白、 和/或融合蛋白）。通常，重组卵泡抑素蛋白是使用重组技术产生。然而，自天然资源纯化 或化学合成的卵泡抑素蛋白（野生型或修饰）可根据本发明加以使用。通常，合适的重组 卵泡抑素蛋白的体内半衰期是或大于约12小时、18小时、24小时、36小时、2天、2. 5天、3 天、3. 5天、4天、4. 5天、5天、5. 5天、6天、6. 5天、7天、7. 5天、8天、8. 5天、9天、9. 5天或 10天。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白的体内半衰期在0. 5与10天之间、在1天与 10天之间、在1天与9天之间、在1天与8天之间、在1天与7天之间、在1天与6天之间、
[0149] 卵泡抑素（FS)是作为能够遏制垂体细胞卵泡刺激激素（FSH)分泌的蛋白质因子 而首先自卵泡液分离。FS至少部分地通过结合和中和活化素来对FSH施加它的影响。
[0150] FS存在至少两种通过在C末端处进行选择性剪接所产生的亚型：FS288和FS315。 288-氨基酸亚型具有独特结构，其包含具有63个氨基酸的N末端区域，所述区域含有对活 化素结合重要的疏水性残基；以及蛋白质的主要部分（残基64-288)，所述部分包含三个各 自具有近似73-75个氨基酸的10-半胱氨酸FS结构域。自N末端至C末端，这些10-半胱 氨酸结构域分别称为结构域1、结构域2和结构域3。FS315亚型是通过C末端的由额外外 显子编码的酸性延伸部分产生。由于存在肝素结合结构域，FS288倾向于被组织结合，而可 能因为肝素结合结构域由延伸的C末端掩蔽，所以FS315倾向于呈循环形式。
[0151] 已显示FS体外抑制肌抑素与活化素两者，并且这个抑制作用可体内导致小鼠的 肥大（Lee等，Regulation of Muscle Mass by Follista tin and Activins，（2010)，M0L. ENDOCRINOL.，24(10) : 1998-2008 ;Gilson 等，Follistatin Induces Muscle Hypertrophy Through Satellite Cell Proliferation and Inhibition of Both Myostatin and Activin, (2009)，J. PHYSIOL. ENDOCRINOL.，297(1) :E157-E164)。在不希望固守于特定理 论下，这个观察作用可至少部分地归因于FS阻止由肌抑素和活化素活化Smad2/3路径。 活化Smad2/3路径已显示会导致对肌肉生长的负性调控（Zhu等，Follistatin Improves Skeletal Muscle Healing After Injury and Disease Through an Interaction with Muscle Regeneration, Angiogenesis, and Fibrosis, (2011), MUSCUL0SKELE TAL PATHOLOGY, 179(2):915-930)。
[0152] 典型野生型或天然存在的人FS315和FS288蛋白的氨基酸序列显示于表2中。
[0153] 表2.示例性人卵泡抑素亚型
[0154]
[0155]因此，在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白是人FS315(SEQ ID NO:1)。如本文所公开，SEQ ID NO:1代表人卵泡抑素蛋白的典型氨基酸序列。在一些实施方 案中，卵泡抑素蛋白可为剪接亚型，如FS 288 (SEQ ID NO: 12)。在一些实施方案中，合适的 重组卵泡抑素蛋白可为野生型或天然存在的蛋白质的同源物或类似物。举例来说，人野生 型或天然存在的卵泡抑素蛋白的同源物或类似物相较于野生型或天然存在的卵泡抑素蛋 白（例如SEQ ID NO: 1)可含有一个或多个氨基酸或结构域取代、缺失和/或插入，同时保留 实质性卵泡抑素蛋白活性。因此，在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白与人 FS315卵泡抑素蛋白（SEQ ID NO: 1)大致上同源。在一些实施方案中，适于本发明的重组卵 泡抑素蛋白具有与 SEQ ID N0:1 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于99%同源的氨基酸序列。在一 些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白与人FS315卵泡抑素蛋白（SEQ ID N0:1) 大致上相同。在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白具有与SEQ ID NO: 1至 少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或大于99%相同的氨基酸序列。
[0156] 人卵泡抑素蛋白的同源物或类似物可根据为本领域普通技术人员所知的用于改 变多肽序列的方法制备，所述方法如见于汇编所述方法的参考文献中的方法。如将由本领 域普通技术人员所了解，如果两个序列在相应位置中含有同源残基，那么它们通常被视为 "大致上同源"。同源残基可为相同残基。或者，同源残基可为将具有适当类似结构和/或 功能特征的非相同残基。举例来说，如本领域普通技术人员所熟知，某些氨基酸通常被分类 为"疏水性"或"亲水性"氨基酸，和/或具有"极性"或"非极性"侧链。将一个氨基酸取代 成另一相同类型可常被视为"同源"取代。在一些实施方案中，保守性氨基酸取代包括在以 下群组内的氨基酸之间进行的取代：（a)M、I、L、V ; (b) F、Y、W ; (c) K、R、H ; (d) A、G ; (e) S、T ; (f)Q、N;以及（g)E、D。在一些实施方案中，"保守性氨基酸取代"是指不改变其中进行氨基 酸取代的蛋白质的相对电荷或尺寸特征的氨基酸取代。
[0157] 如本领域中所熟知，可使用多种算法中的任一个比较氨基酸或核酸序列，所 述算法包括如针对核苷酸序列的BLASTN以及针对氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST 和PSI-BLAST的商业计算机程序中可用的那些。示例性所述程序描述于Altschul 等，Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. ,215(3) :403_410，1990; Altschul 等，Methods in Enzymology ;Altschul 等，''Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs",Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997 ;Baxevanis 等，Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998 ;以及 Misener 等（编），Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,第 132卷），Humana Press, 1999 中。除鉴定同源序列之外，以上提及的程序也通常提供同源性程度的指示。
[0158] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白相较于野生型人卵泡抑素蛋 白含有一个或多个氨基酸缺失、插入或置换。举例来说，合适的重组卵泡抑素蛋白可在对应 于SEQ ID NO: 1的Y185和/或L191的位置处含有氨基酸取代。
[0159] 结构域缺失变体
[0160] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白相较于野生型人卵泡抑素蛋 白含有一个或多个结构域缺失、插入或置换（例如结构域替换）。举例来说，适于本发明的 重组卵泡抑素蛋白可含有对应于结构域1、2和/或3的氨基酸序列的缺失、插入和/或置 换。在某些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包含SEQ ID N0:1的氨基酸残基212-288(其对 应于结构域3)的缺失，如下所示：
[0162] 预期合适的重组卵泡抑素蛋白可为合适的结构域缺失变体的同源物或类似物，其 相较于所述合适的卵泡抑素结构域缺失变体（例如SEQ ID N0:2)含有一个或多个氨基酸 取代、缺失和/或插入，同时保留实质性卵泡抑素蛋白活性。因此，在一些实施方案中，适于 本发明的重组卵泡抑素蛋白具有与SEQ ID NO:2至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或大于 99% 同源或相 同的氨基酸序列。
[0163] 卵泡抑素融合蛋白
[0164] 预期合适的重组卵泡抑素蛋白可呈融合蛋白构型。举例来说，适于本发明的重组 卵泡抑素蛋白可为卵泡抑素结构域与通常可通过例如增强或增加卵泡抑素蛋白的稳定性、 效能和/或递送，或降低或消除免疫原性、清除率或毒性来促进卵泡抑素的治疗作用的另 一结构域或部分之间的融合蛋白。卵泡抑素融合蛋白的所述合适的结构域或部分包括但不 限于Fc结构域、XTEN结构域。
[0165] Fc结构域
[0166] 在一些实施方案中，合适的重组卵泡抑素蛋白含有Fc结构域或其结合FcRn受体 的部分。作为一非限制性实例，合适的Fc结构域可源于免疫球蛋白子类，如IgG。在一些实 施方案中，合适的Fc结构域源于IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，合适的Fc 结构域源于IgM、IgA、IgD或IgE。特别合适的Fc结构域包括源于人抗体或人源化抗体的 那些。在一些实施方案中，合适的Fe结构域是修饰的Fe部分，如修饰的人Fe部分。
[0167] 在一些实施方案中，合适的Fe结构域包含以下所示的氨基酸序列
[0171] 在一些实施方案中，合适的Fe结构域包含与SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4或SEQ ID 勵：14至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或大于99%同源或相同的氨基酸序列。
[0172] 预期Fe结构域与FcRn受体之间的结合改进会导致血清半衰期延长。因此，在一 些实施方案中，合适的Fe结构域包含一个或多个导致与FcRn的结合改进的氨基酸突变。 Fe结构域内实现与FcRn的结合改进的各种突变在本领域中是已知的，并且可适合于实施 本发明。在一些实施方案中，合适的Fe结构域在对应于人IgGl的Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433 和 / 或 Asn 434 的一个或多个位置处 包含一个或多个突变。
[0173] 举例来说，合适的Fe结构域可含有突变H433K(His433Lys)和/或 N434F(Asn434Phe)。作为一非限制性实例，合适的Fe结构域可含有突变H433K(His433Lys) 和N434F(Asn434Phe)。并有突变的一示例性Fe结构域序列显示如下：
[0175] 可包括在Fe结构域中的其它氨基酸取代包括例如美国专利号6, 277, 375 ; 8, 012, 476 ;和8, 163, 881中所述的那些，所述专利以引用的方式并入本文。
[0176] 接头或间隔子
[0177] 卵泡抑素结构域可直接或间接连接于Fe结构域。在一些实施方案中，合适的重组 卵泡抑素蛋白含有接合卵泡抑素结构域和Fe结构域的接头或间隔子。氨基酸接头或间隔 子通常被设计来具有可挠性或插入两个蛋白质部分之间的结构，如a-螺旋。接头或间隔 子可相对较短，或可较长。通常，在长度方面，接头或间隔子含有例如3-100 (例如5-100、 10-100,20-10030-100,40-100,50-100,60-100,70-100,80-100,90-100,5-55,10-50, 10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20)个氨基酸。在一些实施方案中，在长度方面，接头 或间隔子等于或长于 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95或100个氨基酸。通常，较长接头可降低空间位阻。在一些实施方案中，接头 将包含甘氨酸和丝氨酸残基的混合物。在一些实施方案中，接头可另外包含苏氨酸、脯氨酸 和/或丙氨酸残基。因此，在一些实施方案中，接头包含在10-100个、10-90个、10-80个、 10-70个、10-60个、10-50个、10-40个、10-30个、10-20个、10-15个之间的氨基酸。在一些 实施方案中，接头包含至少 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 或 95个氨基酸。在一些实施方案中，接头不是由ALEVLFQGP组成的接头。
[0178] 作为非限制性实例，适于本发明的接头或间隔子包括但不限于： GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG接头，SEQ ID NO: 5) ：GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGG GGGAP(GAG2 接头，SEQ ID NO:6):和 GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAA AAAGGGGGGAP(GAG3 接头，SEQ ID NO:7)。
[0179] 合适的接头或间隔子也包括具有与以上示例性接头，例如GAG接头（SEQID N0:5)、GAG2 接头（SEQIDN0:6)或GAG3 接头（SEQIDN0:7)至少 50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于 99%同源或相同的氨基酸序列的那些。适于与一些实施方案一起使用的其它接头可见于 2012年3月2日提交的US20120232021中，所述专利的公开内容据此以引用的方式整体并 入本文。
[0180] 在一些实施方案中，提供使卵泡抑素多肽与Fc结构域缔合而不实质上影响卵泡 抑素多肽结合它的任何同源配体（例如活化素、肌抑素、肝素等）的能力的接头。在一些实 施方案中，提供接头以使相较于单独卵泡抑素多肽，卵泡抑素肽与肝素的结合不改变。举例 来说，在一些实施方案中，卵泡抑素多肽是FS315多肽，其通常不结合肝素，除非它与活化 素缔合。在一些所述实施方案中，提供不导致相较于单独FS315多肽，FS315多肽与肝素的 结合增加的接头。
[0181] 示例件卵泡抑素融合蛋白
[0182] 在特定实施方案中，合适的重组卵泡抑素融合蛋白包括卵泡抑素多肽、Fc结构域 和使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头，其中所述卵泡抑素多肽包含与野生 型人FS315蛋白（SEQ ID N0:1)或结构域3缺失的FS315蛋白（SEQ ID N0:2)至少50%、 55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %, 98%、99%或100%相同的氨基酸序列。通常，合适的重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活化 素和肌抑素。在一些实施方案中，合适的重组卵泡抑素融合蛋白的体内半衰期在约〇. 5-6 天（例如约0. 5-5. 5天、约0. 5-5天、约1-5天、约1. 5-5天、约1. 5-4. 5天、约1. 5-4. 0天、 约1. 5-3. 5天、约1. 5-3天、约1. 5-2. 5天、约2-6天、约2-5. 5天、约2-5天、约2-4. 5天、 约2-4天、约2-3.5天、约2-3天）的范围内。在一些实施方案中，合适的重组卵泡抑素融合 蛋白的体内半衰期在约2-10天的范围内（例如在约2.5-10天、约3-10天、约3.5-10天、 约4-10天、约4.5-10天、约5-10天、约3-8天、约3.5-8天、约4-8天、约4.5-8天、约5-8 天、约3-6天、约3.5-6天、约4-6天、约4.5-6天、约5-6天的范围内）。
[0183] 作为非限制性实例，合适的卵泡抑素Fc融合蛋白可具有以下所示的氨基酸序列：
[0195] 在一些实施方案中，合适的重组卵泡抑素Fe融合蛋白具有与SEQIDN0:8、9、10、 11、16 或 17 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于99%同源或相同的氨基酸序列。
[0196] 预期卵泡抑素-Fe融合蛋白可以各种构型提供，包括同二聚构型或单体构型。举 例来说，合适的同二聚构型可被设计来使融合伴侣（例如卵泡抑素多肽加接头）的C末端 连接于两个Fe多肽链的N末端。合适的单体构型可被设计来使融合伴侣（例如卵泡抑素 多肽加接头）的C末端融合于一个Fe二聚体。单体构型可降低空间位阻。
[0197] 如本文所用，关于本文鉴定的参照蛋白质序列（例如参照卵泡抑素蛋白序列）的 "氨基酸序列同一性百分比"定义为在比对序列，以及必要时引入空位以达成最大序 列同一性百分比，并且不将任何保守性取代考虑为序列同一性的一部分之后，候选序列中 与参照序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分 比的目的的比对可以属于本领域中的技能的各种方式达成，所述方式例如使用可公开获得 的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Meg align (DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适 用于测量比对的参数，包括为历经所比较序列的全长达成最大对准所需的任何算法。优选 地，WU-BLAST-2软件用于确定氨基酸序列同一性（Altschul等,Methods in Enzymology 266, 460-480(1996) ;http://blast. wustl/edu/blast/README. html)。WU-BLAST-2 使用若 干搜索参数，其中大多数被设置成缺省值。可调整参数设为以下值：重叠间距=1，重叠分 数=0. 125,字阈值（T) = 11。HSP计分（S)和HSP S2参数是动态值，并且由程序自身视特 定序列的组成来确定，然而，最小值可被调整，并且如上所指示加以设置。
[0198] 产生重组卵泡抑素蛋白
[0199] 适于本发明的重组卵泡抑素蛋白可通过任何可用手段来产生。举例来说，可通过 利用被工程化来表达重组卵泡抑素蛋白编码核酸的宿主细胞系统来重组产生重组卵泡抑 素蛋白。或者或另外，可通过使内源性基因活化来产生重组卵泡抑素蛋白。或者或另外，可 通过化学合成来部分或完全制备重组卵泡抑素蛋白。
[0200] 当重组产生蛋白质时，可使用任何表达系统。仅举几例来说，已知表达系统包括例 如大肠杆菌（E. coli)、卵、杆状病毒、植物、酵母或哺乳动物细胞。
[0201] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白是在哺乳动物细胞中产 生。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括但不限于BALB/c小鼠骨髓 瘤株系（NS0/1，ECACC 编号：85110503);人成视网膜细胞（PER. C6, CruCell, Leiden, The Netherlands);由 SV40 转化的猴肾 CVl 株系（C0S-7，ATCC CRL 1651);人胚肾株系（HEK293 或被亚克隆来达成悬浮培养生长的293细胞，Graham等，J. Gen Virol.，36:59, 1977);人 纤维肉瘤细胞系（例如HT1080);幼小仓鼠肾细胞（BHK21，ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细 胞 +/-DHFR(CHO, Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980);小鼠塞尔 托利细胞（TM4, Mather, Biol. R印rod. ,23:243-251，1980);猴肾细胞（CV1 ATCC CCL 70); 非洲绿猴肾细胞（VER0-76，ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞（HeLa，ATCC CCL 2);犬肾细胞 (MDCK，ATCC CCL 34);水牛大鼠肝细胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人肺细胞（W138, ATCC CCL 75);人肝细胞 Ofep G2, HB 8065);小鼠乳腺肿瘤（MMT 060562, ATCC CCL51) ;TRI 细 胞（Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci.，383:44-68, 1982) ;MRC 5 细胞；FS4 细胞；和人肝细 胞瘤株系Ofep G2)。
[0202] 在一些实施方案中，本发明提供由人细胞产生的重组卵泡抑素蛋白。在一些实施 方案中，本发明提供由CHO细胞或HT1080细胞产生的重组卵泡抑素蛋白。
[0203] 通常，被工程化来表达重组卵泡抑素蛋白的细胞可包含编码本文所述的重组卵泡 抑素蛋白的转基因。应了解编码重组卵泡抑素蛋白的核酸可含有调控序列、基因控制序列、 启动子、非编码序列和/或用于表达重组卵泡抑素蛋白的其它适当序列。通常，编码区是可 操作地与这些核酸组分中的一个或多个连接。
[0204] 转基因的编码区可包括一个或多个沉默突变以针对特定细胞类型优化密码子使 用。举例来说，可针对在脊椎动物细胞中表达来优化卵泡抑素转基因的密码子。在一些实 施方案中，可针对在哺乳动物细胞中表达来优化卵泡抑素转基因的密码子。在一些实施方 案中，可针对在人细胞中表达来优化卵泡抑素转基因的密码子。
[0205] 药物组合物和施用
[0206] 本发明进一步提供一种药物组合物，其含有本文所述的重组卵泡抑素蛋白和生理 可接受的载体或赋形剂。
[0207] 合适的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液（例如NaCl)、盐水、缓冲盐 水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶（gumarabic)、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物 (如乳糖、直链淀粉或淀粉、糖（如甘露糖醇、蔗糖或其它糖、右旋糖））、硬脂酸镁、滑石、硅 酸、粘稠石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等以及其组合。必要时，药 物制剂可与不有害地与活性化合物反应或干扰它们的活性的助剂（例如润滑剂、防腐剂、 稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳族物质等） 混合。在一优选实施方案中，使用适于静脉内施用的水溶性载体。
[0208] 必要时，合适的药物组合物或药剂也可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。组 合物可为液体溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末。组合物也可用传 统粘合剂和载体（如甘油三酯）配制成栓剂。经口制剂可包括标准载体，如医药级甘露糖 醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
[0209] 可根据常规程序将药物组合物或药剂配制成适合于向人类施用的药物组合物。举 例来说，在一些实施方案中，用于静脉内施用的组合物通常是于无菌等张水性缓冲液中的 溶液。必要时，组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位处的疼痛。通常，分开 或以单位剂型混合在一起来将成分供应于如安瓿或药囊的指示活性剂的量的气密容器中， 所述单位剂型例如呈干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。当组合物待通过输注施用时，它可 用含有无菌医药级水、盐水或右旋糖/水的输注瓶分配。当组合物是通过注射施用时，可提 供含无菌注射用水或盐水的安瓿以使成分可在施用之前加以混合。
[0210] 本文所述的重组卵泡抑素蛋白可调配成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包 括以游离氨基形成的盐，如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等获得的那些；以及以游离羧 基形成的盐，如由钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡 因（procaine)等获得的那些。
[0211] 施用途径
[0212] 本文所述的重组卵泡抑素蛋白（或含有本文所述的重组卵泡抑素蛋白的组合物 或药剂）是通过任何适当途径施用。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白或含有其的药 物组合物是全身性施用。全身性施用可为静脉内、皮内、吸入、经皮（表面）、眼内、肌肉内、 皮下、肌肉内、经口和/或经粘膜施用。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白或含有其的 药物组合物是皮下施用。如本文所用，术语"皮下组织"定义为紧靠在皮肤下的一层松散、 不规则结缔组织。举例来说，皮下施用可通过向包括但不限于大腿区域、腹部区域、臀区域 或肩胛区域的区域中注射组合物来进行。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白或含有其 的药物组合物是静脉内施用。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白或含有其的药物组合 物是经口施用。必要时，可同时使用一种以上途径。
[0213] 在一些实施方案中，施用仅在个体中产生局部作用，而在其它实施方案中，施用遍 及个体的多个部分产生作用，例如全身性作用。通常，施用导致向一种或多种靶标组织递送 重组卵泡抑素蛋白。在一些实施方案中，向一种或多种靶标组织递送重组卵泡抑素蛋白，所 述组织包括但不限于心脏、脑、脊髓、横纹肌（例如骨骼肌）、平滑肌、肾、肝、肺和/或脾。在 一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向心脏递送。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白 是向横纹肌，具体来说骨骼肌递送。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向三头肌、胫 骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、二头肌、斜方肌、三角肌、四头肌和/或膈肌递送。
[0214] 剂型和给药方案
[0215] 在一些实施方案中，组合物是以治疗有效量和/或根据与特定所需结果相关（例 如与治疗或降低如杜兴氏肌营养不良的肌营养不良的危险相关）的给药方案施用。
[0216] 待根据本发明施用的特定剂量或量可例如随以下而变化：所需结果的性质和/或 程度、施用途径和/或时序的细节、和/或一种或多种特征（例如重量、年龄、个人史、遗传 特征、生活方式参数、心脏缺陷的严重性和/或心脏缺陷的危险水平等或其组合）。所述剂 量或量可由普通技术人员确定。在一些实施方案中，适当剂量或量是根据标准临床技术确 定。或者或另外，在一些实施方案中，适当剂量或量是通过使用一种或多种体外或体内测定 以帮助鉴定待施用的合乎需要或最优剂量范围或量来确定。
[0217] 在各种实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是在治疗有效量下施用。通常，治疗有效 量足以达成对受试者有意义的益处（例如治疗、调节、治愈、预防和/或改善潜伏疾病或病 状）。在一些特定实施方案中，待施用的适当剂量或量可根据由体外或动物模型测试系统获 得的剂量-反应曲线外推。
[0218] 在一些实施方案中，提供的组合物是以药物制剂形式提供。在一些实施方案中，药 物制剂是或包含单位给药量以根据与达成如杜兴氏肌营养不良的肌营养不良的发生率或 危险降低相关的给药方案来施用。
[0219] 在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制剂是以单次剂量形式 施用。在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制剂是在定期间隔下施用。 如本文所用，在某一"间隔"下施用指示治疗有效量是定期施用（不同于一次性给药）。可 通过标准临床技术确定间隔。在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制 剂是每两月、每月、每月两次、每三周、每两周、每周、每周两次、每周三次、每日、每日两次或 每6小时加以施用。视个体的需要而定，用于单一个体的施用间隔无需是固定间隔，而是可 随时间变化。
[0220] 如本文所用，术语"每两月"是指每两个月施用一次（即每两个月一次）；术语"每 月"是指每个月施用一次；术语"每三周"是指每三周施用一次（即每三周一次）；术语"每 两周"是指每两周施用一次（即每两周一次）；术语"每周"是指每周施用一次；并且术语 "每日"是指每天施用一次。
[0221] 在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制剂是在定期间隔下无 限期施用。在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制剂是在定期间隔下 施用确定时期。
[0222] 组合疗法
[0223] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是与一种或多种当前用于治疗肌营养不良 的已知治疗剂（例如皮质类固醇）组合施用。在一些实施方案中，已知治疗剂是根据它的 标准或核准给药方案和/或时程施用。在一些实施方案中，已知治疗剂是根据相较于它的 标准或核准给药方案和/或时程被改变的方案施用。在一些实施方案中，所述改变的方案 在以下方面不同于标准或核准给药方案：一个或多个单位剂量的量被改变（例如降低或增 加），和/或给药的频度被改变（例如单位剂量之间的一个或多个间隔被扩大，从而导致频 度较低，或所述间隔被降低，从而导致频度较高）。 实施例
[0224] 实施例1.卵泡抑素特异性靶向肌抑素和活化素
[0225] 这个实施例说明结合靶标和非靶标配体的卵泡抑素以评估卵泡抑素作为用于治 疗DMD的蛋白质治疗剂的安全性。在不希望受理论束缚下，预期由肌抑素和活化素活化 Smad2/3路径会导致抑制肌原性蛋白质表达。因此，成肌细胞不能分化成肌肉。因此，肌抑素 和活化素被视为肌肉再生的可行靶标。然而，归因于某些结构类似性，如可溶性活化素IIB 型受体（sActRIIB)的许多肌抑素和活化素拮抗剂也结合骨形态发生蛋白质（BMP)。BMP，尤 其BMP-9和BMP-10,被视为全身协调组织构造的关键性形态发生信号。抑制所述BMP可导 致非所需病理学病状。如以下详述，在这个实施例中所述的实验数据确认卵泡抑素以高亲 和力特异性靶向肌抑素和活化素，并且不以有意义的亲和力结合非靶标BMP。因此，这个实 施例证明相较于如sActRIIB的其它肌抑素调节剂，卵泡抑素可为一种非所需脱靶效应较 少的安全蛋白质治疗剂。
[0226] 具体来说，可商购获得的卵泡抑素（由R&DSystems制造的FS315和由Sino Biological制造的卵泡抑素-Fc人嵌合体FS315-hFc)和FS315-GAG3-mFc融合蛋白用于使 用Biacore测定评估与活化素、肌抑素和BMP的结合亲和力和动力学。简要来说，使FS315 固定于CM5芯片上，并且使用人或小鼠抗体捕集试剂盒（GE Healthcare)捕集卵泡抑素-Fc 融合蛋白。在胺偶联后，在25°C下添加一系列浓度的活化素、肌抑素或BMP (例如BMP-2、 BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-10 和⑶F-11)作为可溶性分析物。sActRIIB-hFc 用作对 照。使用标准方法确定结合亲和力（Kd)和动力学。示例性结果显示于表3中。
[0227] 表3?示例性结合亲和力和动力学数据
[0229] NM =由于不良曲线拟合或与参照芯片的高结合性而不可测量
[0230] 如表3中所示，卵泡抑素（例如FS315或FS315-FC)以高亲和力结合靶标肌抑素 和活化素，但不结合BMP-9和BMP-10 (Kd不可测量或大于I(T7M)，而sActRIIB-Fc以类似亲 和力结合肌抑素、活化素和BMP。惊人并且重要的是，Fc融合使卵泡抑素对主要靶标肌抑素 的亲和力增加至少10倍。
[0231] 此外，荧光素酶报道体测定用于进一步确定卵泡抑素是否特异性抑制肌抑素和活 化素信号传导（Smad 2/3路径）而非BMP信号传导（Smad 1/5/8路径）。具体来说，BMP反 应元件（BRE)-荧光素酶测定用于通过测量荧光素酶信号的降低来确定卵泡抑素是否可抑 制 Smadl/5/8 路径（Korchynskyi 等，Identification and Functional Characterization of Distinct Critically Important Bone Morphogenetic Protein-specific Response Elements in the Idl Promoter, (2002)，J BIOL CHEM., 277 (7):4883-4891)。CAGA-荧 光素酶测定用于通过测量荧光素酶信号的降低来确定卵泡抑素是否可抑制Smad 2/3路 径（Dennler 等，Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF 0 -inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type I gene, (1998)，EMBO J, 17 (II) :3091-3100)。简要来说，HEK293 细胞用 BRE (BRE-Idl-Iuc) 或CAGA-荧光素酶（p (CAGA) 12-MLP-luc载体）构建体和海肾-荧光素酶构建体（Promega pGL4. 74[hRluc/TK])共转染过夜。次日，在有或无一系列浓度的卵泡抑素下，用肌抑素 和活化素（用于Smad 2/3路径诱导，CAGA-荧光素酶报道体）或BMP-9和BMP-IO (用于 Smad 1/5/8路径诱导，BRE-荧光素酶报道体）处理细胞。在过夜孵育之后，使用Promega Dual-Glo测定试剂盒测定荧光素酶信号，其中相对于海肾对照使值标准化。在这个实验中， 测试天然卵泡抑素（R&D Systems)和卵泡抑素Fc融合蛋白（Sino Biological FS315_hFc、 FS315-GAG3-mFc)。FS315-GAG3-mFc 显示如下。
[0233] BRE-荧光素酶测定的示例性结果显示于图1中。FS315-FC不通过Smad 1/5/8路 径抑制BMP-9或BMP-IO信号传导。
[0234] CAGA-荧光素酶测定的示例性结果显示于图2中。相较于在施用生理相关水平 的已知Smad 2/3活化剂肌抑素（I. 2nM)和活化素（0. 4nM)之后观察的Smad 2/3诱导量， FS315与FS315-GAG3-mFc两者均显示在0.1 nM和高于0.1 nM的剂量下强力抑制Smad2/3信 号传导。这些结果指示卵泡抑素是肌抑素和活化素活性的强力和特异性抑制剂。Fc融合的 存在不有害影响卵泡抑素的效能，如通过天然FS315分子与FS315-GAG3-mFc融合蛋白之间 的类似抑制曲线所指示。出乎意料并且重要的是，本发明的Fc融合蛋白使卵泡抑素对主要 靶标肌抑素的结合亲和力显著增加（例如增加至少10倍，如表3中所示）。
[0235] 实施例2.卵泡抑素融合蛋白FS315-GAG3-mFc具有延长的血清半衰期
[0236] 在我们的发明之前，据报道卵泡抑素具有短暂血清半衰期，此是将卵泡抑素开发 成蛋白质治疗剂的顾虑。举例来说，典型商业FS315蛋白的血清半衰期是约1小时。在这 个实施例中，确定FS315-GAG3-mFc融合蛋白的体内半衰期，并且它具有显著延长的血清半 衰期。
[0237] 具体来说，印记控制区域（ICR)小鼠选作模型，并且在1.0mg/kg(~2 y Ci/动物） 下皮下施用I125标记的FS315-GAG3-mFc。在施用之后，获取血清和组织样本直至注射后10 天。取样的组织是：甲状腺、肝、肾、肺、脾、膈肌、心脏、四头肌和三头肌。血清样本的示例性 结果显示于图3A中。如可见，FS315-GAG3-mFc的血清半衰期是近似5天，此相较于本领域 中已知的短暂卵泡抑素血清半衰期（约1小时）是惊人长久的。跨越各种组织的PK曲线 的示例性结果显示于图3B和表4中。除甲状腺之外，跨越各组织的卵泡抑素-Fc的半衰期 在2天与5天之间。此外，延长的组织半衰期曲线是出乎意料的。
[0238] 延长的体内半衰期数据进一步确认卵泡抑素可为用于治疗DMD的有效蛋白质治 疗剂。
[0239] 表4.示例性FS315-GAG3_mFc体内PK数据
[0240]
[0242] 实施例3. FS315-GAG3_mFc的体内功效
[0243] 这个实施例证明向杜兴氏肌营养不良的mdx小鼠模型施用卵泡抑素（例如 FS315-GAG3-mFc )会产生肌肉质量增加的趋势，甚至在lmg/kg的低剂量下。在这个实施例 中，术语 " FS315-GAG3-mFc "、" FS315-Fc " 和 " FS315-mFc " 可互换使用。
[0244] 具体来说，在这个研宄中，45只mdx小鼠用空媒介物、0mg/kg、l. Omg/kg或8mg/kg FS315-GAG3-mFc治疗。媒介物组或治疗组中的动物持续研宄的持续时间每周接受两次皮下 (肩胛间）注射，并且通过眶后取样来评估卵泡抑素融合蛋白水平。
[0245] 半数媒介物治疗的对照动物与lmg/kg FS315-FC组一起被处死，并且剩余媒介物 治疗的动物以及未治疗的对照动物与8mg/kg治疗组一起被处死。示例性治疗时程是如表 5A和表5B中所不：
[0246] 表5. mdx小鼠的示例性注射和取样时程
[0247] 5A: lmg/kg FS315-GAG3_mFc 治疗过程
[0252] 媒介物治疗组相对于lmg/kg FS315-FC组的关于肌肉重量的示例性数据显示于图 4中。具体来说，图4显示在用lmg/kg治疗4和10周，以及用8mg/kg治疗6周之后，四头 肌（图4A)、腓肠肌（图4B)、胫骨前肌（图4C)和三头肌（图4D)的以克计的肌肉重量。肌 肉重量数据是关于基线体重加以调整。
[0253] 在施用之后卵泡抑素的循环水平的示例性数据显示于图5中。具体来说，图5A显 示用每周两次lmg/kg注射液治疗的动物的血清中的FS315-mFc的水平，并且图5B显示每 周两次用8mg/kg治疗的动物的血清中的FS315-mFc的水平。
[0254] 如图4-5中所示，存在FS315-FC使DMD的动物模型中的肌肉质量增加的明确指 不O
[0255] 实施例4.重组卵泡抑素-Fc融合蛋白的体内功效
[0256] 这个实施例证明施用卵泡抑素-Fc融合蛋白会体内导致肌肉肥大（例如肌肉质量 和肌纤维直径增加）。
[0257] 在这个研宄中，C57BL/10小鼠与mdx小鼠两者均用FS315-GAG3-mFc直接向腓肠肌 中（肌肉内，IM)注射。具体来说，各小鼠每周两次接受2次注射，各侧1次。左侧腓肠肌 接受20 y L lmg/mL FS315-GAG3-mFc溶液，每次注射总计20 y g蛋白质。右侧腓肠肌接受 20 y L PBS (媒介物对照）。每周两次进行注射，持续总计4周。在最终注射之后24小时， 处死小鼠，并且将腓肠肌小心解剖并称重。包括在相同剂量下接受可溶性活化素IIB型受 体-Fc小鼠嵌合体（sActRIIB-mFc，R&D Systems)的一组作为阳性对照。此外，包括未治疗 的小鼠作为阴性对照。
[0258] 图6显示在每周两次用20 y g FS315-mFc或sActRIIB-mFc治疗之后，C57对照小 鼠以及mdx小鼠中的肌肉质量均显著增加。图6中表示的研宄设计和数值数据显示于下表 6中：
[0259] 表6?肌肉重量
[0260]
[0261] *用于这个实施例中的所有卵泡抑素构建体都含有GAG3接头。
[0262] **P值由成对t检验获得，并且进行邦弗伦尼（Bonferroni)校正（校正6种统计 检验）
[0263] 通过对注射的腓肠肌进行数字完全载片扫描来测定肌纤维直径。将样本固定 在10 %中性缓冲盐水中，处理并包埋在石蜡中，切割成5 ym切片，并且用Alexa f Iuor 488缀合的麦胚凝集素（WGA)染色，这是一种染色肌肉细胞膜的方法。使用图像分析软件 (ImageScope和ImagePro Plus)分析扫描的图像。对于各肌纤维，通过在2度间隔下，穿过 肌纤维的质心来测量肌纤维横截面长度来测定平均直径。
[0264] 与图6 -致，图15说明用FS315_mFc治疗的腓肠肌的肌纤维直径增加。这个增加 发生在C57(WT，图15A)与mdx小鼠（图15B)两者中。对向较大直径转变的说明指示肌肉 重量增加是肌肉肥大的结果。表7是示例性平均直径变化和相应统计分析的概述。
[0265] 表 7
[0266]
[0267] 所用统计模型是分层线性模型（HLM)，其能够虑及在各动物内进行的多个测量。各 品系和治疗组内未治疗腿与治疗腿之间的差异是高度显著的（p〈〇. 〇〇〇 1，此确证肌肉重量 数据）。
[0268] 这些数据证明卵泡抑素，具体来说卵泡抑素-Fc融合蛋白可有效诱导肌肉生长， 并且治疗与DMD相关的肌肉萎缩。
[0269] 实施例5.示例性卵泡抑素变体的体内功效
[0270] 实施例2-4中所示的基于野生型卵泡抑素FS315蛋白的体内半衰期和功效数据证 明卵泡抑素可用作用于DMD的有效蛋白质疗法。这个实施例证明也可基于卵泡抑素变体开 发蛋白质治疗剂。
[0271] 具体来说，产生如下表8中所述的示例性卵泡抑素结构域缺失或点突变，并且使 用明确确定的頂/AAV递送系统测试它们的肌肉再生功效以有助于在变体与野生型卵泡抑 素之间进行比较。
[0272] 在这个研宄中，跨越7个组使用年龄是3-4周的总计35只C57小鼠。7个组各自 包括5只小鼠，其中测试5种卵泡抑素变体（表8)，并且野生型FS315和空载体用作对照。 编码FS315的基因具有代表信号肽的额外29个氨基酸，其在自细胞分泌后被裂解。因此， FS315和FS344是指相同野生型构建体，并且在以下实施例中可互换使用。
[0273] 表8.示例性卵泡抑素变体的功效筛选
[0274]
[0275]
[0276] 通过使用AAV9载体，在每个动物近似lxIO11个病毒粒子的剂量下向左侧四头肌 和左侧腓肠肌中进行单次单侧注射来施用卵泡抑素变体。在注射后2、4和6周考查以下终 点：血清和尿中的卵泡抑素水平、小鼠重量、个体肌肉重量（注射的肌肉群与远端肌肉群两 者）和组织学（例如纤维计数、尺寸和类型等）。对侧肌肉充当这个研宄的动物内比较物。
[0277] 如图7中所示，野生型FS315与结构域3缺失突变体两者相较于空载体对照均使 体重显著增加。具体来说，测试的结构域3缺失的卵泡抑素变体早在注射后3周即使体重 增加。
[0278] 图8显示注射后两周在同侧与对侧两者上的A)腓肠肌和B)四头肌的示例性平均 肌肉重量。截至注射后第2周，野生型FS315与结构域3缺失卵泡抑素变体两者均显示同 侧上的肌肉质量显著增加（图8)。具体来说，相较于空载体，用FS315和dFSD3注射的肌肉 在重量方面大60%至70% (图8)。在第2周时，解剖的用dFSD3注射的四头肌显著大于对 侧未治疗的肌肉（图9)。
[0279] 在第4周时，结构域3缺失的卵泡抑素和野生型卵泡抑素使注射的肌肉与远端肌 肉两者的肌肉质量增加。参见图10。如在第2周时所观察，dFSD3在第4周时产生显著肥大 作用，其中相较于未治疗侧，注射的肌肉的肌肉质量显著较大（图11)。对于野生型和dFSD3 治疗的小鼠，通过ELISA测定的血清中的卵泡抑素水平类似，并且在第2、4和6周时平均是 30ng/mL (数据未显示）。
[0280] 也在注射后第2、4和6周使用标准组织学和免疫组织化学方法测定注射的肌肉组 织与远端肌肉组织两者中的肌纤维尺寸。示例性第2、4和6周结果分别显示于图12、13和 14中。所有统计都是使用GraphPad Prism中的单因素ANOVA以及邓奈特氏多重比较检验 (Dunnett' s Multiple Comparison Test)来进行。误差棒表不 SEM。
[0281] 如图12中所示，在第2周时，在注射的肌肉中，在FS344(23% )、dFSD3(30% )、 Y185A和L191D组中的四头肌中以及在FS344(17%)和dFSD3(25%)组中的腓肠肌中观察 到肌纤维肥大。在远端肌肉群中，在dFSD2(12%)组中的TA中观察到肌纤维肥大。在三头 肌或膈肌中未观察到肥大。
[0282] 如图13中所示，在第4周时，在注射的肌肉中，在FS344(41% )、dFSD3(50% )、 dFSD113 和 L191D 组中的四头肌中以及在 FS344(42% )、dFSD2、dFSD3(73% )、dFSD113、 Y185A和L191D组中的腓肠肌中观察到肌纤维肥大。在远端肌肉群中，在dFSD3(10% )组 中的TA中以及在FS344(23% )和dFSD2(29% )组中的膈肌中观察到肥大。在三头肌中未 观察到肥大。
[0283] 如图14中所示，在第6周时，在注射的肌肉中，在FS344(41% )、dFSD3(30% )、 Y185A组中的四头肌中以及在FS344(90% )、dFSD3(49% )、Y185A、L191D组中的腓肠肌中观 察到肌纤维肥大。在远端肌肉中，在FS344(26% )、dFSD3(41% )、dFSD113、Y185A和L191D 组中的TA中以及在dFSD3(35% )组中的膈肌中观察到肌纤维肥大。在三头肌中观察到最 小限度的肥大。
[0284] 总之，这些结果指示可基于卵泡抑素变体开发蛋白质治疗剂。举例来说，卵泡抑素 结构域缺失或点突变可保留或改进肌肉再生功效。如上所示，结构域3缺失物可为用于治 疗DMD的特别适用的卵泡抑素变体。
[0285] 实施例6. FS315-GAG3_mFc的全身性功效
[0286] 如实施例4中所示，相对于对照肌肉，向腓肠肌中注射FS315_mFc导致肌肉质量增 加。这个实施例显示全身性注射FS315-mFc也能够在远离注射部位的各种部位处诱导肌肉 生长。用于这个实施例中的所有卵泡抑素构建体都含有GAG3接头。
[0287] 总计20只C57BL/6小鼠用于这个研宄中，其中半数动物每周两次持续8周接受皮 下（肩胛间）注射PBS (对照），并且另外半数每周两次持续8周接受皮下（肩胛间）注射 10mg/kg FS315-mFc。在末次注射之后24小时处死动物，并且测量左侧和右侧四头肌、腓肠 肌、胫骨前肌和三头肌的重量，也测量动物的总体重。下表9概述这个实施例的实验设计。
[0288] 表9.实验设计
[0289]
[0290] 图16显示通过8周研宄过程获得的示例性体重数据。如可见，在2周时开始，并且 在整个8周研宄期间持续，FS315-mFc治疗的动物的体重显著大于那些媒介物治疗的对照 动物。图17代表示例性肌肉重量数据。相较于媒介物对照，来自用FS315-mFc治疗的小鼠 的三头肌早在第4周即在重量方面显著较大。相较于媒介物，在治疗8周之后，三头肌群与 四头肌群两者均显示在重量方面显著增加（图17)。通过实施例4中所述的方法来测定肌 纤维尺寸。图18显示在第4和8周时三头肌群和四头肌群的肌纤维直径增加百分比。在 4周和8周时，两种肌肉群均显示在用FS315-mFc治疗之后向较大肌纤维尺寸转变。
[0291] 此外，在皮下注射之后，血清卵泡抑素水平增加。举例来说，治疗的小鼠（通过每 周两次皮下注射）的血清中的FS315-mFc水平显示于图19中。在第4和8周处死时间点收 集的血清中的FS315-mFc水平最高，所述时间点与FS315-mFc注射与血清收集之间的时间 量（24小时）一致。在这些点时，平均血清FS315-mFc水平是约200ng/mL。在注射FS315-mFc 之后3天收集每两周眶后放血，并且平均血清FS315-mFc水平在约30 - 50ng/mL之间。
[0292] 这些数据证明全身性注射FS315-mFc (例如皮下注射）可有效诱导全身各种肌肉 组织中的肌肉生长。
[0293] 实施例7.卵泡抑素-Fc融合蛋白在DMD小鼠模型中的全身性功效
[0294] 这个实施例进一步证明在DMD疾病模型中的全身性功效。具体来说，如下所示，全 身性注射FS315-mFc成功地降低各种特征DMD症状，如肌肉坏死和/或纤维化的进展。用 于这个实施例中的所有卵泡抑素构建体都含有GAG3接头。
[0295] mdx小鼠模型已广泛用作用以证明用于DMD的候选疗法的概念验证的临床前模 型。mdx小鼠的肢体肌肉群与膈肌两者均显示倾向于随年龄增加的广泛病变。所述病变的 特征在于肌肉中具有炎症性浸润、坏死和纤维化区域。在这个模型中测试FS315-mFc以评 估它对肌肉中纤维化的进展的作用。总计50只mdx小鼠用于这个实施例中，其中20个动 物接受皮下注射PBS，并且30个动物接受皮下注射10mg/kg FS315-mFc，每周两次，持续12 周。（参见表10)。在末次注射之后24小时处死动物，并且收集组织以分析坏死和纤维化 (参见表11)。
[0296] 表10?实验设计
[0297]
[0301] 图20显示在RNA层面上FS315-mFc对纤维化蛋白质表达的示例性作用。具体 来说，I型胶原蛋白、a-平滑肌肌动蛋白和含有胶原蛋白三螺旋重复序列的蛋白质1的 RT-PCR证明这些纤维化相关蛋白质的表达早在每周两次SC治疗之后6周即显著降低。
[0302] 表12和13概述对肌肉组织切片中的坏死（如通过评估H&E染色的切片来确定） 和纤维化（如通过评估FS315-mFc治疗的mdx小鼠肌肉的胶原蛋白I染色的肌肉切片来确 定）的组织病理学评估。对于FS315-mFc治疗组和媒介物治疗组，每组分别有总计15个和 10个动物。如表12中所指示，FS315-mFc治疗早在自启始每周两次注射开始的6周即显著 降低肢体肌肉中的坏死的发生率。这个坏死降低是通过四头肌和三头肌来说明于H&E切片 的图像中（图21)。在FS315-mFc治疗12周之后，通过胶原蛋白I染色肌肉组织切片所说 明的纤维化的发生率显著降低（也参见表13)。胶原蛋白沉积的这个降低说明于胶原蛋白 I染色的肌肉切片的图像中（图22)。
[0303] 这个研宄的结果证明FS315-mFc可通过有效降低DMD小鼠模型中患病肌肉病变 (包括但不限于肌肉坏死和/或纤维化）的进展来成功治疗DMD。
[0304] 表12. FS315-mFc治疗的mdx小鼠肌肉中的坏死的发生率（p值指示使用费雪氏精 确检验（Fisher' s Exact Test)得到的媒介物与FS315_mFc之间的显著性程度）
[0305]
[0306] 在总检查肌肉区域中，最小限度：〈5% ;轻度：〈30% ;显著：>30%
[0307] 表13.纤维化的发生率，（p值指示使用费雪氏精确检验得到的媒介物与 FS315-mFc之间的显著性程度）
[0308]
[0309] 实施例8.重组卵泡抑素结构域3缺失Fc融合蛋白的体内功效
[0310] 这个实施例证明类似于野生型卵泡抑素-Fc融合蛋白，卵泡抑素结构域3缺失 (dFSD3)Fc融合蛋白体内有效诱导肌肉生长。用于这个实施例中的所有卵泡抑素构建体都 含有GAG3接头。
[0311] 具体来说，使实施例5中所述的结构域3缺失的构建体融合于与用于FS315-mFc 相同的mFc。此外，相同GAG3接头序列用于使dFSD3融合于mFc。C57BL/10小鼠用两种融 合蛋白直接向腓肠肌中注射，如实施例4中所述。在每周两次注射20 y g融合蛋白4周之 后处死小鼠，并且相对腓肠肌接受相同体积的PBS。在最终注射之后24小时，处死治疗的小 鼠，并且将注射的腓肠肌小心注射并称重。如图23中所指示，dFSD3-GAG3-mFc融合蛋白导 致肌肉质量超过媒介物对照显著增加，并且所述增加类似于用FS315-mFc观察到的增加。 这个实施例指示卵泡抑素结构域3缺失Fc融合蛋白（例如dFSD3-GAG3-mFc)在体内具有 活性，并且是用于DMD治疗的另一有前途的治疗候选物。
[0312] 实施例9.较长接头关于卵泡抑素功能的优势
[0313] 这个实施例证明较长接头，特别是含有至少10个氨基酸的接头提供关于卵泡 抑素功能的出乎意料的优势。具体来说，这个实施例显示含有57个氨基酸的接头的 FS315-GAG3-FC融合蛋白（鼠类和/或人Fe)相较于可自Sino Biological商购获得的含 有9个氨基酸的接头ALEVLFQGP的FS315-hFc融合蛋白（Sino Biological Inc.目录号 10685-H02H)，在它的抑制肌抑素和活化素的能力方面更强力。用于信号传导测定的肌抑素 和活化素的浓度是I. 2nM。如图24和表14中所指示，FS315-GAG3-mFc和FS315-GAG3-hFc 融合蛋白在CAGA-荧光素酶测定中在与天然FS315相同的程度上抑制肌抑素和活化素信号 传导。相比较来说，可商购获得的FS315-hFc融合蛋白（Sino Biological)的强力性显著 较小。计算的IC50如下：
[0314] 表14 :卵泡抑素在针对Smad2/3信号传导的CAGA-荧光素酶报道体测定中抑制肌 抑素和活化素的示例性IC50值
[0315]
[0316] 在不希望固守于特定理论下，有可能的是相较于具有短得多接头（例如9个 氨基酸）的融合蛋白，FS315蛋白与Fe区域之间的较长接头（例如这个特定构建体FS315-GAG3-FC中的57个氨基酸的接头）可能允许FS315具有更天然构象，从而允许在与 用天然FS315观察到的程度类似的程度上结合靶标配体以及抑制信号传导。相比较来说， 可商购获得的FS315-hFc蛋白具有9个氨基酸的短得多的接头，其中在Fe与FS315蛋白之 间的间隔显著较小，从而潜在导致对FS315构象和生理活性的有害作用。
[0317] 实施例10.卵泡抑素融合蛋白FS315-GAG3_hFc具有延长的血清半衰期
[0318] 在这个实施例中，我们证明提供的卵泡抑素融合蛋白，特别是具有较长接头（例 如具有至少10个氨基酸的接头）的那些具有延长的血清半衰期。具体来说，我们首次在此 处证明以GAG3接头融合于人Fe的FS315 (FS315-GAG3-hFc)在10mg/kg的单次剂量下向 Sprague-D awley大鼠中皮下（SC)施用时具有延长的血清半衰期。在施用之后，在于15分 钟至5天的范围内的时间点收集血清。使用Mesoscale Di scovery (MSD)测定测量大鼠血 清中的FS315-GAG3-hFc，所述测定捕集人FS315,并且检测血清样本中完整融合蛋白的人 Fe结构域。大鼠血清中的FS315-GAG3-hFc的水平显示于图25中。PK参数概述于表15中。
[0319] 表 15. FS315-GAG3_hFc 体内 PK 数据
[0320]
[0321] 总之，以上实施例证明通过例如全身性施用，卵泡抑素，包括提供的变体，在DMD 疾病模型中高度有效诱导肌肉肥大，并且减弱肌肉坏死和纤维化。因此，卵泡抑素和提供的 变体可为用于治疗DMD的有效蛋白质治疗剂。
[0322] 等效物和范围
[0323] 本领域技术人员将仅使用常规实验即会认识到或能够确定本文所述的本发明的 具体实施方案的许多等效物。本发明的范围不意图限于以上描述，而是如以下权利要求中 所阐述。
【主权项】
1. 一种治疗杜兴氏肌营养不良（DMD)的方法，其包括 向罹患或易患DMD的个体施用有效量的重组卵泡抑素蛋白以使DMD的至少一种症状或 特征在强度、严重性或频度方面得以降低，或延迟发作。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与野生型人卵泡抑素蛋 白 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCT GGKKCLTOFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEE EEDEDQDYSFPISSILEW(SEQIDN0:1)至少 70%相同的氨基酸序列。3. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与所述野生 型人卵泡抑素蛋白SEQIDNO: 1至少80%相同的氨基酸序列。4. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与所述野生 型人卵泡抑素蛋白SEQIDNO: 1至少90%相同的氨基酸序列。5. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与所述野生 型人卵泡抑素蛋白SEQIDNO: 1至少95%相同的氨基酸序列。6. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与所述野生 型人卵泡抑素蛋白SEQIDNO: 1相同的氨基酸序列。7. 如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白相较于所述野生 型人卵泡抑素蛋白包含一个或多个缺失、突变或插入。8. 如权利要求7所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含SEQIDNO: 1的氨基酸 残基212-288的缺失。9. 如权利要求1所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATC LLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEW(SEQIDN0:2)至少70%相同的氨基酸序列。10. 如权利要求9所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与SEQIDN0:2至少 80 %相同的氨基酸序列。11. 如权利要求9所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与SEQIDN0:2至少 90 %相同的氨基酸序列。12. 如权利要求9所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与SEQIDN0:2至少 95 %相同的氨基酸序列。13. 如权利要求9所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与SEQIDN0:2相同的 氨基酸序列。14. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述重组卵泡抑素蛋白融合于Fc结 构域。15. 如权利要求15所述的方法，其中所述Fc结构域包含与 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQIDN0:3)至少80%相同的氨基酸序列。16. 如权利要求15所述的方法，其中所述Fe结构域在对应于人IgGl的Thr250、Met 252、Ser254、Thr256、Thr307、Glu380、Met428、His433 和 /或Asn434 的一个或多 个位置处包含一个或多个突变。17. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是通过接头融 合于所述Fc结构域。18. 如权利要求17所述的方法，其中所述接头是包含3-100个氨基酸的肽。19. 如权利要求18所述的方法，其中所述接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG接 头，SEQIDNO:5)至少80%相同的序列。20. 如权利要求18所述的方法，其中所述接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAA AAAGGGGGGAP(GAG2 接头，SEQIDNO:6)至少 80%相同的序列。21. 如权利要求18所述的方法，其中所述接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAA AAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG3 接头，SEQIDNO:7)至少 80%相同的序列。22. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与SEQID NO: 8 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGG KKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEffGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:8)，或 SEQIDNO:9 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGG KKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEWGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDN0:9)至少80%相同的氨基酸序列。23. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与SEQID NO: 10 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEffGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:10)，或 SEQIDNO:11 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEWGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO: 11)至少80%相同的氨基酸序列。24. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是由哺乳动物 细胞产生。25. 如权利要求24所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。26. 如权利要求24所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是HT1080细胞。27. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是全身性施用。28. 如权利要求27所述的方法，其中所述全身性施用选自静脉内、皮内、吸入、经皮（表 面）、眼内、皮下、肌肉内、经口和/或经粘膜施用。29. 如权利要求28所述的方法，其中所述全身性施用是静脉内施用。30. 如权利要求28所述的方法，其中所述全身性施用是皮下施用。31. 如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述全身性施用是经口施用。32. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是每两月、每 月、每三周、每两周、每周、每日或在可变间隔下施用。33. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是向一种或多 种选自表1的骨骼肌递送。34. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是向一种或多 种选自膈肌、三头肌、比目鱼肌、胫骨前肌、腓肠肌、趾长伸肌、腹直肌和/或四头肌的靶标 组织递送。35. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是向心脏递送。36. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组卵泡抑素蛋白是向一种或多 种选自心脏和骨骼肌，包括膈肌、三头肌、比目鱼肌、胫骨前肌、腓肠肌、趾长伸肌、腹直肌和 /或四头肌的靶标组织递送。37. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述重组卵泡抑素蛋白会导致肌 肉再生、肌肉力量增加、灵活性增加、活动范围增加、耐力增加、易疲劳性降低、血流增加、认 知改进、肺功能改进、炎症抑制、肌肉纤维化减轻和/或肌肉坏死减轻。38. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述重组卵泡抑素蛋白会导致肌 肉纤维化和/或坏死减轻。39. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中DMD的所述至少一种症状或特征选自 由以下组成的组：肌肉消耗、肌肉无力、肌肉脆弱、肌肉坏死、肌肉纤维化、关节挛缩、骨骼变 形、心肌病、吞咽受损、肠和膀胱功能受损、肌肉缺血、认知损害、行为功能障碍、社交损害、 脊柱侧凸和呼吸功能受损。40. -种重组卵泡抑素融合蛋白，其包含 卵泡抑素多肽； Fc结构域；和 使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头， 其中所述卵泡抑素多肽包含与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQIDNO: 1)至少70%相同 的氨基酸序列；并且此外其中所述重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活化素、肌抑素和/或 ⑶F-11，并且具有在约0. 5-10天的范围内的体内半衰期。41. 如权利要求40所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述卵泡抑素多肽具有与所述 野生型人卵泡抑素蛋白（SEQIDNO: 1)至少80%相同的氨基酸序列。42. 如权利要求40所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述卵泡抑素多肽具有与所述 野生型人卵泡抑素蛋白（SEQIDNO: 1)至少90%相同的氨基酸序列。43. 如权利要求40所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述卵泡抑素多肽具有与所述 野生型人卵泡抑素蛋白（SEQIDNO: 1)至少95%相同的氨基酸序列。44. 如权利要求40所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述卵泡抑素多肽具有与所述 野生型人卵泡抑素蛋白（SEQIDNO: 1)相同的氨基酸序列。45.如权利要求40所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述卵泡抑素多肽含有SEQ ID NO: 1的氨基酸残基212-288的缺失。46. -种重组卵泡抑素融合蛋白，其包含 卵泡抑素多肽； Fc结构域；和 使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头， 其中所述卵泡抑素多肽包含与 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEW(SEQ IDN0:2)至少70%相同的氨基酸序列， 并且此外其中所述重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活化素、肌抑素和/或GDF-11，并 且具有在约〇. 5-10天的范围内的体内半衰期。47. 如权利要求40-46中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述Fc结构域是 IgGlFc结构域。48. 如权利要求40-46中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述Fc结构域具 有与 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQIDN0:3)至少80%相同的氨基酸序列。49. 如权利要求48所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述Fe结构域在对应于人 IgGl的Thr250、Met252、Ser254、Thr256、Thr307、Glu380、Met428、His433和 /或 Asn434的一个或多个位置处包含一个或多个突变。50. 如权利要求40-49中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述接头是包含 3-60个氨基酸的肽。51. 如权利要求50所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述接头包含与 GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG接头，SEQIDNO: 5)至少 80%相同的序列。52. 如权利要求50所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述接头包含与GAPGGGGGAAAA AGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG2 接头，SEQIDNO:6)至少 80%相同的序列。53. 如权利要求50所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述接头包含与GAPGGGGGAAA AAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG3 接头，SEQIDNO: 7)至少 80% 相同的序列。54. 如权利要求40-53中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述重组卵泡抑 素融合蛋白包含与SEQIDNO:8 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGG KKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEffGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:8)，或 SEQIDNO:9 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGG KKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEWGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDN0:9)至少80%相同的氨基酸序列。55. 如权利要求40-53中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋白，其中所述重组卵泡抑 素融合蛋白包含与SEQIDNO: 10 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEffGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:10)，或 SEQIDNO:11 GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS STCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDE DQDYSFPISSILEWGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO: 11)至少80%相同的氨基酸序列。56. -种核酸，其包含编码如权利要求40-50中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋白 的核苷酸序列。57. -种细胞，其包含如权利要求56所述的核酸。58. -种药物组合物，其包含如权利要求40-55中任一项所述的重组卵泡抑素融合蛋 白和药学上可接受的载体。
【专利摘要】本发明尤其提供用于治疗肌营养不良，具体来说杜兴氏肌营养不良(DMD)的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明的一种方法包括向罹患或易患DMD的个体施用有效量的重组卵泡抑素蛋白以使DMD的至少一种症状或特征在强度、严重性或频度方面得以降低，或延迟发作。
【IPC分类】A61K38/17, A61P21/00, A61K38/16
【公开号】CN104902915
【申请号】CN201480003715
【发明人】R·迈尼奥
【申请人】夏尔人类遗传性治疗公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年1月24日
【公告号】CA2898121A1, EP2948161A1, WO2014116981A1
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