衍生自TGFβ的多肽及其用图
衍生自TGFβ的多肽及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和医学领域。特别地，本发明涉及TGF0分子的突变型变体 (其天然同源物的信号传导的拮抗剂）的用途，以及其治疗应用。
[0002] 发明背景
[0003] 细胞因子TGF |3因其刺激细胞集落形成的能力而被发现（Roberts AB等人，Proc Natl Acad Sci USA，78:5339-43, 1981)，由于该过程是细胞转化的典型标志，因而该分子被 称为转化生长因子0。现今，配体TGF0 (TGFM、TGF0 2、TGF0 3)被认为是多功能生长 因子的原型。生物体中的几乎任何细胞类型都产生它们并且表达其受体复合物。这些分 子是上皮细胞、内皮细胞和造血细胞增殖的强有力的抑制剂（Ravitz MJ等人，Adv Cancer Res, 71:165-207, 1997)，是细胞外基质的产生和沉积（Massague J. The Annu Rev Cell Biol, 6:597-641，1990)和组织修复级联（Roberts AB 等人，Plenum, 275-308, 1996)的最 强有力的调节剂之一。它们还在胚胎发育期间调节各种不同的机制，例如细胞分化、迀移 和血管发生（Taya Y?等人，Development, 126:3869-79, 1999 ;Lidral A.等人，Am J Hum Genet, 63:557-68, 1998)〇
[0004] 在免疫系统中，由TGF0介导的信号传导是一个非常重要的调节节点。其最突出 的功能之一是通过抑制在淋巴细胞减少环境中由自身抗原诱导的幼稚T细胞增殖来维持淋 巴细胞内稳态和免疫耐受（Bevan M.等人，Nat Immunol.，27, 13(7) :667-73, 2012)。该分子 还取消或改变天然杀伤细胞（Laouar, Y?等人，Nature Immunol, 6:600-607, 2005)、树突细 胞（Luo, X?等人，Proc. Natl Acad. Sci. USA, 104:2821-2826, 2007 ;Bekeredjian-Ding，I. 等人，Immunology, 128:439-450,2009)、巨细胞（Sica，A?等人，Semin.Cancer Biol.，18, 349-355, 2008 ;Torroella.M 等人，Cancer Res，69:4800-09, 2009)、嗜中 性粒细胞（Fridlender, Z. G?等人，Cancer Cell, 16:183-194, 2009)以及效应和记 忆 T 细胞群（6〇代111^，1.&卩1&￥611，1?.六.，恥七11代]^(1.，7:1118-22,2001 丨1&￥611，1?. A.，Immunity，31:131-44, 2009)的激活、成熟和分化。TGF0在天然的和诱导的调节T 细胞（⑶4+Foxp3+)和效应T细胞群T⑶4+IL17+(TH17)的诱导、分化和维持中起着必 不可少的作用（Kryczek, I?等人，J. Immunol.，178:6730-33, 2007 ;Moo_Young, T. A?等 人，J. Immunother, 32:12-21, 2009 ;Fantini, MC 等人，J. Immunol.，172:5149-53, 2004 ; Flavell, R. A. , Cell, 134:392-404, 2008)〇
[0005] 成熟的配体TGF0是具有112个氨基酸残基的同二聚体。它们衍生自由朝向 N-末端的潜伏状态相关前肽（LAP :latency associated pro-peptide)和朝向C-末端的 活性结构域形成的前体分子。这两个结构域在细胞内通过蛋白水解而分开，并且所述配 体作为无活性前体（其由可逆地与活性结构域相连接的前结构域形成）被分泌，由此调 节其向细胞受体的接近（Geoffrey D. Young 和 Joanne E. Murphy-Ullrich, JBC, Vol. 279， No. 36:38032-39, 2004)。已提出，所述潜伏状态相关前肽对于成熟结构域的分泌来说也是重 要的（Gray A?和 A Mason, Science, 247:1328-30, 1990) 〇
[0006] 三种同种型（TGF0 1、TGF0 2、TGF0 3)在质膜上与受体 T0RI、T0RII 和 T0RIII 相互作用。该最后一个（也已知为e聚糖）并非在所有的细胞类型中表达，并且尽管它 对于由配体TGFM和TGF0 3介导的信号传导来说是可有可无的，但是当T 0 RII被饱 和时它构成了这些配体的储库（Wang, X.F.等人，Cell, 67:797-805, 1991 ;Lebrin F.等 人，Cardiovasc. Res.，65:599-608, 2005)。T 0 RIII 与受体 T 0 RI 和 T 0 RII 形成复合物，以 将该配体呈递给它们。这些配体首先与T 0 RII结合，并且复合物T 0 RII/TGF0协作地且 以高亲和力招募和激活受体T0RI，这导致信号传导的异三聚体复合物的形成。TGFM和 TGF 0 3可以以高亲和力（5-30pM)与T 0 RII结合，而TGF 0 2仅可以在T 0 RIII存在下同样 地如此做（De Crescenzo 等人，J. Biol. Chem, 279:26013-18, 2004 ;De Crescenzo 等人，J. Mol. Biol, 328:1173-1183, 2003 ;Groppe 等人，Molecular Cell, 29, 157-168, 2008) 〇
[0007] 迄今还未报道，配体TGF0 1、TGF0 2和TGF0 3可以与作为T0RII所属于的 同一蛋白质家族的成员的其他II型受体相结合（Huang F和YG, Chen, Cell Biosc, Mar 15, 2:9, 2012)。但是，它们可以与数种I型受体相结合。传统地，ALK5被描述为该配体亚 家族的受体T0RI。在其被招募到复合物Tf3RII/TGF-f3中后，诱导了蛋白SMAD2/3的磷 酸化（Huang F 和 YG Chen, Cell Biosc, Mar 15,2:9,2012)。ALKl 响应于在内皮细胞中复 合物TGF 0 /T 0 RII的形成而被激活，并且通过SMADl和SMAD5来进行信号传导（Goumans MJ等人，Mol Cell, 12 (4) :817-28, 2003)。在一些上皮细胞中，SMAD1/5信号传导由受体 ALK2、ALK3 和 ALK6 诱导（Daly AC 等人，Mol Cell Biol, 28:6889-6902, 2008)。ALK2 还 与涉及体内心血管发育的过程相关（Olivey HE等人，Dev Dyn，235(1):50-9, 2006)。反 过来，应当强调，T0 RII和ALK5均是配体TGF0 1、TGF0 2和TGF0 3的家族所专有的，而 ALK1/2/6/3是更混杂的，还被激活蛋白和骨形态发生蛋白所共享（Sebald W.等人，Biol Chem.，385(8) :697-710, 2004)。
[0008] 由ALK5介导的信号传导在确定的疾病中与数种致病机制相关。例如在癌症中， 其作用是复杂的并且与其取消或促进肿瘤进展的能力有关。肿瘤进展的取消主要在肿瘤 发生的早期阶段期间运作。然而，其作为肿瘤进展剂的作用出现在癌发生的晚期阶段，这 通过诱导侵入性和转移性表型以及取消抗肿瘤免疫应答来进行（Miyazono K.，Nat. Rev. Cancer,10:415-24, 2010 ；Miyazono K., Cancer Sci,101 (2):306-12, 2010 ；HawinkeIs U.等人，Growth Factors, 29(4) : 140-52, 2011)。其中TGF 0也具有有害效应的其他例子 为由病原体例如HIV、HBV、HCV、CMV、分枝杆菌和寄生虫克氏锥虫（Tripanosoma cruzi)引 起的慢性感染。TGF0对于保护性免疫应答施加负的影响，由此有益于这些细胞内病原体 的生长和存活（Reed GS. ,Microbes and Infection, 1:1313-1325, 1999)。在许多疾病中， TGF0的过度产生有助于纤维组织的病理学过量，其危害受损器官的正常功能。一些例子尤 其为肺纤维化、结节病、心脏纤维化、心肌病、肝硬化、系统性硬化症、肾小球硬化症和原发 性胆汁性肝硬化（Kopp JB 等人，Microbes and Infection, 1:1349-1365, 1999) 〇
[0009] TGF0信号传导是多种抑制策略的目标。已经在临床前模型中评价了大多数的 抑制剂，尽管它们中的一些已开始在临床研宄中在数种类型的癌症和纤维化中进行检验 (Flavell RA.，Nat Rev Immunol.，10 (8) :554_67, 2010 ;Connolly EC 等人，Int J Biol Sci. ,8(7) :964-78, 2012 ;Hawinkels LJ?等人，Growth Factors, 29 (4) :140-52, 2011)。在 现有技术中，可以找到下列抑制策略：
[0010] 1-配体的中和，其中使用其受体的细胞外结构域的可溶性形式（US 2002/0004037 和 US 2007/0244042)、抗-TGF 0 抗体（US 2002/076858、US 2005/0276802)或阻断所述细 胞因子的基因的翻译的寡核苷酸（US 2004/0006036和US 2007/0155685);
[0011] 2-信号传导的阻断，其中使用与T0RI/ALK5的激酶结构域结合的小分子（US 2006/0057145、US 2005/0136043、US 2006/0234911);
[0012] 3-受体II的阻断，其中采用识别其细胞外结构域的抗体（US 2010/0119516、US 2009/7579186)〇
[0013] 迄今为止还没有报道过使用配体TGF0的突变蛋白作为信号传导的拮抗剂的抑 制策略。
[0014] 发明简述
[0015] 本发明基于这样的科学发现：TGFMTGFM、TGF0 2和TGF0 3)家族的突变型变 体可以抑制其天然同源物的功能。发明人首次在体外实验中发现，TGF0的突变型变体可 以相当大程度地抑制由天然变体诱导的信号传导并由此中和其生物学效应。该发现为在其 中配体TGF 0具有有害活性的疾病例如癌症、纤维化或慢性感染中调节TGF 0信号传导的 新策略奠定了基础。
[0016] 本发明涉及这样的多肽，其与人TGF0共享一级序列，除了一些氨基酸被突变，以 消除或相当大程度地降低其通过I型受体ALK5进行信号传导的能力。这些TGF0的突变 型变体保持了其以高亲和力与受体T 0 RII和T 0 RIII结合的能力，但不能够进行信号传 导，因为其不与I型受体ALK5相互作用，从而通过经由与高亲和力受体Tf3 RII和Tf3 RIII 的结合而与天然变体竞争来负地调节天然变体的信号传导。本发明还包括这些突变型变体 (单独地或者与疫苗或其他治疗形式相组合地）用于治疗其中TGF0经证明是重要的疾病 例如癌症、纤维化或慢性感染的治疗应用。
[0017] 本发明的新颖性在于提供了一种新的治疗策略，以在其中TGF0的功能降低了保 护性免疫应答（要么是天然的，要么是由疫苗接种诱导的）或者诱导了过量的组织修复和 纤维化的疾病中，调节TGF0信号传导并因此调节一些肿瘤的侵入和转移能力以及一些免 疫系统和结缔组织细胞的活性。上面所提及的抑制策略中没有一个使用配体TGF0的突 变蛋白作为信号传导的拮抗剂。本发明的TGF0的突变体是实际上自身的蛋白质并因此 具有低的免疫原性，这使得针对其的抗体应答的风险降低至最小。对于受体系统的高度特 异性降低了不希望的毒性（这是在基于小尺寸的抑制剂的策略中所共同的）。这些TGF0 的突变型变体保持了至少天然TGFM和TGF0 3的亲和力（6-10pM)这样的级别的与受体 T 0 RII的结合亲和力。该亲和力是用受体或配体抑制策略、单克隆抗体或其他药物难以超 过的。令人惊讶地，本发明的作者发现，这些TGF0的突变型变体保留了与受体T0RIII和 T 0 RII相互作用的能力，这构成了超过抗受体T 0 RII的抗体的优点，因为所述突变蛋白阻 断了天然配体与细胞表面的所有可能的结合位点。
[0018] 发明详述
[0019] 本发明涉及多肽，其拮抗由受体ALK5介导的天然配体TGF e的活性，并且具有大 于90%的相对于天然配体TGF0的氨基酸序列而言的同源性。本发明的多肽在其一级氨 基酸序列中具有至少一个在选自下列的残基之一处的突变 ：￥6、130、132、151、151、067和 LlOl。在本发明的一个特别的实施方案中，原始氨基酸残基突变为选自下列的氨基酸残基 之一：
[0020] 对于位置6 :A ;
[0021] 对于位置 30 :N、R、K、D、Q、L、S、P、V、I、G、C、T、A、E ;
[0022] 对于位置32 :A ;
[0023] 对于位置 51 :Q、W、Y、A ;
[0024] 对于位置 67 :H、F、Y、W ;和
[0025] 对于位置 101:A、E。
[0026] 本发明的另一个目标为多肽，其中在与受体TGF 0 RII和/或TGF 0 RIII的相互作 用界面处添加突变，以增加其与所述受体的亲和力。
[0027] 此外，本发明还涉及用于治疗癌症、伴有纤维化的疾病和慢性感染性疾病的药物 组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有在本发明中所描述的多肽或多肽混合物和用 于其应用的药学上合适的载料。所述多肽可以共价地连接至载体蛋白，并且该蛋白可以为 白蛋白或人免疫球蛋白的Fc区。在另一个实施方案中，本发明的多肽可以被PEG化。
[0028] 最后，本发明涉及所描述的多肽在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物在 治疗癌症、伴有纤维化的疾病和慢性感染性疾病中有用，以及对于代替天然TGF0来增强 对疫苗的细胞和/或体液应答来说有用，尤其是当待增强的疫苗为用于癌症的治疗性疫苗 时。
[0029] TGF 0的类似多肽的获得
[0030] 本发明涉及大小为112个氨基酸的多肽。这些多肽保持高的与各种不同的天然 TGF 0分子的序列同一性，大于90%的同一性。在其序列的一个区域中包括1至6个突变， 相对于天然TGF0而言。选择置换原始残基的残基，以便具有与原始氨基酸非常不同的物 理化学特性，非极性残基置换成极性残基、带电荷电的残基置换成不带电荷的残基、大残基 置换成小残基、酸性残基置换成碱性残基的改变。
[0031] 从在与其受体T 0 RII和ALK5的复合物中的天然TGF 0 I、TGF 0 2和TGF 0 3的三维 结构（存放在数据库TOB中）开始来设计这些多肽（也可以称为TGF0的突变蛋白）。仅 在这样的TGF0的位置处引入突变，所述位置相应于明显暴露于溶剂的氨基酸并且构成与 受体ALK5(但不是T 0RII)的结合区域的一部分。通过使用公有领域的生物信息学程序， 这些残基被预测为在与ALK5的相互作用中是重要的。下表显示了被预测为在相互作用中 重要的与ALK5的结合界面的残基和影响结合的可能突变。用这些结果制作了理论突变蛋 白的数据库并且选择了具有最高体外拮抗剂效力的突变蛋白。
[0032] 表1 :对于与T 0 RI/ALK5的相互作用来说重要的TGF 0序列的氨基酸和根据理论 预测将会使结合不稳定的突变。
[0033]
[0034] 本发明的多肽可以通过各种不同的途径来获得，尤其是通过蛋白质的化学合成。 还可以通过基因工程技术来获得，例如在细菌例如大肠杆菌（E. coli)中作为内含体或者 在哺乳动物细胞例如CHO和HEK293中表达它们，其中使用在现有技术中所积攒的任何转染 方案。还可以通过借助于聚合酶链式反应的定向诱变技术来获得在特定位置处的点突变。
[0035] 通过其生物学活性来选择天然TGF 0的类似多肽
[0036] 从体外和体内实验开始来选择本发明的多肽，以同时具有下列特性：
[0037]-这些TGF0的突变型变体（在本发明中也称为突变蛋白）保持了其与受体 T0RII结合的能力。该结合能力可以通过商购可得的针对受体T0RII的链的ELISA测定 法直接地来进行评价，或者在对于该受体来说阳性的细胞群上间接地来进行评价。对于受 体T0RII的识别水平应当与天然TGF0相当。
[0038] -这些突变蛋白应当阻断配体TGF 0 (TGF0 1、TGF 0 2、TGF 0 3)与受体T 0 RII的 结合。这可以通过竞争性ELISA直接地来进行测量，其中用配体TGF0中的每一种（商购 可得的）包被平板并评价所述突变蛋白抑制T 0 RII与所述配体结合的能力。
[0039]-这些TGF 0的突变型变体丧失了或相当大程度地降低了其通过受体T 0 RI进行 信号传导的能力。该特性可以在通过Western的免疫检测测定法中直接地进行评价，其中 定量在用所述突变蛋白或用天然TGF0进行处理的鼠类谱系肿瘤细胞4T1和人类谱系肿瘤 细胞MDA-MB231的裂解液中的磷酸化的Smad2和Smad3的水平。这些突变蛋白应当诱导比 天然TGF 0小至少100倍的Smad2和Smad3的磷酸化。所提及的特性还可以在体外在对于 细胞系CTLL-2的由IL-2诱导的增殖的抑制测定法中来进行评价。这些突变体应当具有比 天然TGF 0低至少100倍的抑制活性。
[0040] -这些TGF 0的突变型变体具有抑制由配体TGF 0中的每一种（TGF0 1、TGF 0 2、 TGF0 3)诱导的信号传导的能力。该特性可以在通过Western的免疫检测测定法中直接地 进行评价，其中定量在用所述突变蛋白或用天然TGF0进行处理的鼠类谱系肿瘤细胞4T1 和人类谱系肿瘤细胞MDA-MB231的裂解液中的磷酸化的Smad2和Smad3的水平。在50ng/ mL-10yg/mL的突变蛋白浓度的范围内，所述突变蛋白应当展现出至少100倍地抑制由商 业配体诱导的信号传导的能力。
[0041] -这些TGF0的突变型变体具有体外抗肿瘤效应。它们可以抑制用天然配体进行 处理或未处 理的数种肿瘤细胞系的迀移。这些肿瘤细胞系的例子为鼠类细胞系4T1和人类 细胞系MDA-MB231。在细胞迀移测定法中，这些突变蛋白应当能够显著地（从统计学观点来 看）抑制肿瘤细胞的迀移。
[0042]-这些TGF0的突变型变体丧失了或相当大程度地降低了其分别在IL-2或IL-6 和IL-23存在下诱导CD4+幼稚T细胞向Treg foxp3+或TH17表型进行分化的能力。该特 性可以在Treg和TH17细胞的体外诱导测定法中直接地来进行评价。这些突变体应当具有 比天然TGF 0低至少100倍的诱导活性。
[0043]-这些TGF0的突变型变体具有抑制由其天然同源物诱导的⑶4+幼稚T细胞向 Treg foxp3+或TH17表型进行分化的能力。该特性可以在Treg和TH17细胞的体外诱导测 定法中直接地来进行评价。在50ng/mL-10 y g/mL的突变蛋白浓度的范围内，所述突变蛋白 应当展现出至少100倍地抑制由商业配体诱导的信号传导的能力。
[0044] -这些TGF0的突变型变体具有体内抗肿瘤效应。它们可以在可移植肿瘤模型中 在体内抑制数种肿瘤品系的肿瘤生长和转移能力。该特性可以通过使用在BALB/c小鼠中 的乳腺细胞系4T1的正位原发性肿瘤模型和在免疫缺陷小鼠中的人肿瘤细胞系MDA-MB231 的正位原发性肿瘤模型来进行评价。相比于用PBS进行处理的对照组而言，这些突变蛋白 应当引起肿瘤大小和肺转移数目的在统计学上显著的降低。
[0045]-这些TGF0的突变型变体具有在可移植肿瘤模型中在体内增加天然的或由疫苗 接种诱导的抗肿瘤免疫应答的能力。该特性可以通过使用在BALB/c小鼠中的乳腺细胞系 4T1的正位原发性肿瘤模型和结肠肿瘤细胞系CT26的皮下原发性肿瘤模型来进行评价。这 些突变蛋白应当增加天然杀伤细胞和CD8+T淋巴细胞的溶细胞活性和细胞因子分泌。它们 应当增加树突细胞和THl型CD4+T细胞的活性，并且应当显著地减小调节T细胞和骨髓抑 制细胞的数目以及其促肿瘤活性。
[0046] 本发明包括所述TGF0的突变蛋白的额外修饰，其可以意味着产生缺乏LAP的 成熟结构域，而不影响其分泌。这暗示，所述突变蛋白可以以其活性形式来获得以用于与 T 0 RII的相互作用。这结果导致生产过程的简单化。
[0047] 在另一个方面，本发明涉及所述TGF0的突变蛋白的额外修饰，其增加所述突变 蛋白的半寿期。在这些修饰之中，尤其包括任一种上面所描述的免疫调节多肽与载体蛋白 (其可以为白蛋白或人免疫球蛋白的Fc区）的融合、PEG化。
[0048] 在一个更特别的实施方案中，本发明涉及与人IgGl的Fc片段相融合的TGF 0的 突变型变体（在表2中所提及的特定突变），其经过选择以显示上面所提及的特性。被选择 用于进行偶联的Fc区在结构域C Y 2中具有一组突变（ala234、ala235)，其阻止与Fe Y受 体相互作用（除了新生儿Fc受体），由此使其诱导免疫效应机制的能力沉默（Labrijn AF 等人，Curr Opin Immunol.，Aug, 20 (4) : 479-85, 2008, Epub 2008 年 7 月 9 日）。
[0049] 这些突变蛋白包括多个氨基酸置换，其显著地降低了它们通过ALK5进行信号传 导的能力。然而，它们完整地保持了其与T 0 RII结合和与T 0 RIII结合的能力，从而取得 了天然TGF0的活性的抑制能力。
[0050] 表2 :构建出的突变体，其中根据人TGF0的编号来提及突变。
[0051]
[0052] 在另一个方面，本发明还包括所述TGF0的突变蛋白的额外修饰，其要么用于增 加所述突变蛋白对于T0RII和T0RIII的亲和力，但不影响或甚至改善其抑制特征，要么 用于通过增加寿命来改善所述突变蛋白的体内药效动力学。这些额外的突变可以通过用生 物信息学工具进行合理设计，或者通过使用具有各种不同性质的组合分子文库（噬菌体文 库，在酵母或细菌中的基因表达文库）来获得。
[0053] TGF0的类似多肽的治疗应用
[0054] 本发明还包括包含由本发明所公开的TGF0的突变蛋白和其类似物或融合蛋白 作为活性成分的药物组合物，以及其可能的治疗应用，目的是在其中TGF0的功能降低了 保护性免疫应答（要么是天然的，要么是由疫苗接种诱导的）或者诱导了过量的组织修复 和纤维化的疾病中，调节一些肿瘤的侵入和转移能力以及一些免疫系统和结缔组织细胞的 活性。
[0055] 关于其治疗用途，应当向携带所述疾病的受试者施用本发明的多肽，独立地或者 与其他多肽或有利于或增强其治疗作用的其他物质相组合地。施用途径可以为在现有技术 中被描述用于肠胃外施用药物的任何施用途径。可以优选地通过静脉内、肌内、皮下或肿瘤 内途径进行施用。
[0056] 由本发明所描述的多肽或融合蛋白还可以通过成为在治疗癌症、伴有纤维化的疾 病和慢性感染性疾病中有用的药物组合物的一部分来进行施用。优选地，本发明包括包含 药学上可接受的载料的组合物，包括药物组合物。
[0057] 所述组合物包含药学上可接受的载体。在所述药学上可接受的载体中包括但不限 于：盐水、无菌水、磷酸盐缓冲盐水等。适合于给予患者的其他缓冲剂、分散剂和非毒性惰性 物质可以包括在本发明的组合物中。所述组合物可以为适合于施用的溶液，并且通常是无 菌的且没有不希望的颗粒。
[0058] 在一个方面，本发明还涉及治疗方法，其包括向具有癌症、伴有纤维化的疾病或慢 性感染性疾病的受试者施用治疗有效量的在本发明中所描述的多肽、融合蛋白或组合物。 在一个特别的实施方案中，所述受试者为人。
[0059]由本发明所描述的多肽或融合蛋白还可以与传统肿瘤学疗法（化学疗法和放射 疗法）（作为其效应的增强剂）相组合地进行施用。
[0060] 为了获得所希望的治疗效果，本发明的多肽应当以对于确保其在淋巴结或对所研 宄的疾病而言重要的外周位点处的浓度来说足够高的剂量进行施用，所述浓度在这样的浓 度范围内，对于所述浓度范围，所述突变蛋白显示出抑制天然TGF0的效应。因此，所考虑 的剂量应当进行调整以适合于所研宄的疾病类型和施用途径。例如，在肿瘤治疗的情况下， 应当调整剂量以便达到确保其抑制效应的所述突变体在肿瘤内部和/或在局部区域淋巴 结中的浓度。待探察的剂量范围可以为I. 25-20mg/Kg/周剂量或半月剂量。
[0061] 待应用的施用次数也应当进行调整以适合于所考虑的突变蛋白的生物分布。通 常，应当达到使上面提及的有效浓度持续2个至30个连续天的时间。如果所述突变蛋白与 载体蛋白相偶联，那么其施用频率应当因此进行调整。
[0062]当将本发明的化合物或组合物与其他抗癌生成试剂相组合地进行使用时，本发明 提供了例如同时的、分阶段的或交替的治疗。因此，本发明的化合物可以在分开的药物组合 物中同时施用，并且其中本发明的化合物可以在其他抗癌生成试剂之前或之后施用，例如 相差数秒、数分钟、数小时、数天或数周。
[0063] 治疗作用应当被理解为疾病症状的完全或部分缓解。在癌症中，肿瘤体积的减小 或复发时间的增加尤其是疾病缓解的标准。
[0064] 相对于其他用于调节TGF0信号传导的建议而言，该新的治疗策略的优点是多重 的。例如：
[0065] ?所述TGF0的突变体是实际上自身的蛋白质（除了很少的突变外）并因此具有 低的免疫原性。该因素使得针对其的抗体应答的风险降低至最小。
[0066] ?对于受体系统的高度特异性降低了不希望的毒性（这是在基于小尺寸的抑制剂 的策略中所共同的）。
[0067] ?这些TGF0的突变型变体保持了至少天然TGFM和TGF0 3的亲和力（6-10pM) 这样的级别的与受体Te RII的结合亲和力。该亲和力是用受体或配体抑制策略、单克隆抗 体或其他药物难以超过的。
[0068] ?这些TGF 0的突变型变体具有比单克隆抗体和与Fc相偶联的受体更小的尺寸。 这在肿瘤学疾病的治疗情形下确保了比上面所描述的抑制TGF0信号传导的药物更大的 对肿瘤的渗透性。
[0069] ?这些16?0的突变型变体抑制通过受体系统!'01?11/1'|3 1?1仏〇(5)进行信号传导 的任何配体的信号传导，这是超过泛配体抗体（pan-ligand antibody)的理论优点，因为这 些突变型变体仅针对已知的TGF0同种型，如果存在其他同种型，这些抗体可以不抑制它 们。
[0070] ?这些TGF0的突变型变体保留了与受体Tf3 RIII相互作用的能力。这构成了超 过抗受体Tf3 RII的抗体的优点，因为所述突变蛋白阻断了天然配体与细胞表面的所有可 能的结合位点。
[0071] ?与Fc片段相连接增加了所述突变蛋白的半寿期，这赋予其相对于小尺寸的药物 而言的优点，因为剂量和其频率将会更少。这降低了不希望的毒性。
[0072] ?与不与Fe Y受体（除了新生儿Fc受体）相互作用的人IgGl的Fc片段相连接 避免了引发对于非肿瘤宿主细胞的免疫效应机制，从而相比于抗受体II的抗体（其完整地 保持了其与Fcy受体相互作用的能力）而言降低了不希望的毒性潜力。
[0073] 将用下列实施例 和附图来进一步阐述本发明。然而，这些实施例不应当被解释为 对本发明的范围的限制。
[0074] 附图简述
[0075] 图1.突变蛋白G_M1和天然TGF0的通过Western的免疫检测测定法。这些蛋白 质的SDS-PAGE在非还原和还原条件下进行，并且用抗人TGFM的抗体进行染色。第一泳 道相应于低分子量标准，第二泳道相应于突变蛋白G_M1，第三泳道相应于天然TGFM，和 第四泳道相应于无关抗体hR3。
[0076] 图2.通过ELISA测定法来评价突变蛋白G_M1对受体T 0 RII的识别。作为阴性 对照，使用无关抗体hR3。突变蛋白G_M1保持了其与受体T 0 RII结合的能力，该能力与天 然TGF 0 1的相似。
[0077] 图3.由突变的或天然的TGF0诱导的IL-2依赖性细胞系（CTLL-2)的增殖的抑 制测定法。证明了，所述突变蛋白抑制细胞系CTLL-2增殖的能力比天然的人TGFM低得 多。将数据表示为3次独立实验的平均抑制百分比。
[0078] 图4.用于评价突变蛋白G_M1中和由天然TGFM诱导的IL-2依赖性细胞系 (CTLL-2)的抑制的能力的测定法。该图显示了3次独立实验的平均细胞增殖百分比。
[0079] 图5.突变蛋白G_M1在体外抑制肿瘤细胞系4T1的迀移。如在该图中所指示的那 样以不同的时间间隔拍摄愈合照片，该图显示当细胞用所述突变蛋白进行处理时，在每个 时间点处愈合是更小的。
[0080] 图6.突变蛋白G_M1抑制由天然TGF0诱导的⑶4+⑶25-Foxp3-幼稚T细胞向 CD4+CD25+Foxp3+调节细胞表型的分化/转变。当将细胞与500ng/ml的所述突变蛋白一起 温育时，从T细胞培养物中回收的调节T细胞的百分比几乎降至零（几乎完全缩减）。该浓 度仅是用于诱导转变的重组人TGF M的30倍。 实施例
[0081] 实施例1. TGF 0的突变蛋白的设计
[0082] 从生物信息学技术开始，使用所报道的人TGF M和TGF 0 3与TGF 0受体的三元 复合物的结构作为基础，采用计算机设计了所述突变蛋白。通过使用公有领域的生物信息 学程序测定了天然同种型和所有可能的突变型变体的结合能。突变蛋白G_M1在CHO-Kl细 胞中从在慢病毒载体PLW中的基因构建体开始进行表达，并且在C-末端包括人IgGl的铰 链区和结构域Cy2和Cy3以及组氨酸尾巴。G_M1通过A蛋白亲和层析来进行纯化（图 1)，并且获得了高的纯度（>95% )。
[0083] 实施例2?突变蛋白G_M1与T 0 RII结合的能力
[0084] 进行了 ELISA测定法，其中用T 0 RII (I y g/ml)进行包被并用与碱性磷酸酶相偶 联的抗人Fc的抗体进行揭示。使用无关抗体hR3作为阴性对照。图2显示，突变蛋白G_M1 保持了其与受体Tf3 RII结合的能力，该能力与天然TGF M的相似。
[0085] 实施例3.突变蛋白G_M1具有降低的通过受体T 0 RI (ALK5)进行信号传导的能力 并因此模仿天然TGF 0的生物学活性
[0086] 比较了由突变的或天然的TGF0诱导的IL-2依赖性细胞系CTLL-2的增殖的抑 制。用50U/ml的商业IL-2以及确定浓度的商业rTGFM或突变蛋白G_M1刺激5000个细 胞系CTLL-2的细胞/孔48小时。随后，向培养物添加阿尔玛蓝（Alamar Blue)试剂，并且 在540和630nm处测量还原。
[0087] 突变蛋白G_M1不能抑制细胞系CTLL-2的增殖，至少在为用作实验的阳性对照的 商业TGFM的浓度200倍的浓度下（图3)，所以所述突变蛋白抑制细胞系CTLL-2的细胞 增殖的能力比商业TGFM小得多。
[0088] 实施例4.突变蛋白G_M1是体外TGF0信号传导的拮抗剂
[0089] 用50U/ml的商业IL-2刺激5000个细胞系CTLL-2的细胞/孔，并且在2pM的商 业TGF 0 1和确定浓度的突变蛋白G_M1、同种型对照抗体hR3或阳性对照即抗-TGF 0 1抗体 存在下进行培养。在48小时后，向培养物添加阿尔玛蓝试剂，并且在540和630nm处测量 还原。
[0090] 突变蛋白G_M1(而非hR3)中和由商业TGF0 1诱导的细胞系CTLL-2增殖的抑制 (图4)。由所述突变蛋白引起的中和效应与通过用作实验的阳性对照的抗-TGFM抗体所 获得的相似。
[0091] 实施例5.突变蛋白G_M1具有体外抗肿瘤效应
[0092] 使用在单层粘附细胞中的伤口的方法（LiangCC等人，Nat Protoc.，2 (2):329-33, 2007)，在体外测定法中评价了突变蛋白G_M1抑制鼠类肿瘤细胞系 4T1迀移的能力。通过用无菌移液管刮擦细胞单层来使汇合的细胞受损伤，并且向小孔中添 加突变蛋白G_M1或商业TGFM(阴性对照）。在图5中观察到，当用所述突变蛋白处理细 胞时，闭合速度显著降低（P〈〇.〇5，Kruskal-Wallis检验以及Dunn事后检验，在每个时间点 处）。
[0093] 实施例6.突变蛋白G_M1抑制常规幼稚T细胞的分化
[0094] 通过流式细胞术纯化了 4只C57/BL6小鼠的脾的CD4+CD25-GITR-幼稚细胞群。在 3 y g/mL的附着至平板的抗-CD3和3 y g/mL的可溶性抗-CD28存在下，用5ng/mL的IL-2 和5ng/mL的TGF 0刺激5 XIO4个这些细胞。在250和500ng/mL的浓度下评价所述突变蛋 白。在这些条件下，向诱导的调节T细胞的转变百分比为55. 6%。在所述突变蛋白存在或 不存在下，测量回收的Foxp3+调节T细胞的百分比。图6显示，在突变蛋白G_M1存在下， 在T细胞培养物中回收的调节T细胞的百分比如何几乎降至零。
【主权项】
1. 拮抗由受体ALK5介导的天然配体TGF0的活性的多肽，其特征在于，所述多肽具有 大于90%的相对于天然配体TGF0的氨基酸序列而言的同源性。2. 根据权利要求1的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一个在选自下列的氨基酸 残基之一处的突变：W30、W32、L101、151、L51、Q67 和Y6。3. 根据权利要求2的多肽，其特征在于，原始残基突变为选自下列的氨基酸残基之一： 对于位置 30 :N、R、K、D、Q、L、S、P、V、I、G、C、T、A、E; 对于位置32:A; 对于位置101 :A、E; 对于位置51 :Q、W、Y、A; 对于位置67 :H、F、Y、W;和 对于位置6 :A。4. 根据权利要求3的多肽，其中在与受体TGF0RII和/或TGF0RIII的相互作用界面 处添加突变，以增加其与所述受体的亲和力。5. 根据权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含用于产生缺乏LAP的成熟结构域 而不影响成熟结构域分泌的修饰。6. 根据权利要求3的多肽，其特征在于，将所述多肽融合至在结构域Cy2中包含突变 ala234 和ala235 的人IgGl的Fc片段。7. 用于治疗癌症、伴有纤维化的疾病和慢性感染性疾病的药物组合物，其包含处于 50ng/mL-10yg/mL的范围内的至少一种根据权利要求3的多肽和药学上合适的载料。8. 根据权利要求7的药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求3的多肽的混合 物和药学上合适的载料。9. 根据权利要求7的药物组合物，其特征在于，将所述多肽共价地连接至载体蛋白。10. 根据权利要求9的药物组合物，其特征在于，所述载体蛋白为人免疫球蛋白的Fc 区。11. 根据权利要求9的药物组合物，其特征在于，所述多肽被PEG化。12. 根据权利要求1至6的多肽，其用于制备在治疗癌症、伴有纤维化的疾病和慢性感 染性疾病中有用的药物。13. 根据权利要求1至6的多肽，其用于制备对于增强对疫苗的细胞和/或体液应答来 说有用的药物。14. 根据权利要求13的多肽，当待增强的疫苗为用于癌症的治疗性疫苗时。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别地涉及TGFβ分子的突变型多肽，其一级序列与人TGFβ的序列具有高度同源性。这些突变蛋白丧失了与ALK5相互作用的能力但保留了与其余的作为受体复合物的成员的受体(TβRII和TβRIII)的相互作用。它们具有拮抗配体TGFβ的所有天然变体的依赖于将ALK5招募到受体复合物中的信号传导的特性，并且具有免疫调节效应。本发明涉及包含所公开的多肽或融合蛋白作为活性成分的药物组合物，并且涉及所公开的多肽、融合蛋白和药物组合物的治疗用途，这是由于对于病理学状态例如癌症、伴有纤维化的疾病和慢性感染性疾病的其免疫系统调节效应。
【IPC分类】A61K38/18
【公开号】CN104902916
【申请号】CN201380058181
【发明人】A·D·J·科里亚奥索里奥, K·里昂蒙松, T·卡尔梅纳特波蒂利亚, A·普波梅里诺, S·佩雷斯罗德里格斯
【申请人】分子免疫中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月30日
【公告号】CA2887455A1, EP2918284A1, US20150284441, WO2014071894A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和医学领域。特别地，本发明涉及TGF0分子的突变型变体 (其天然同源物的信号传导的拮抗剂）的用途，以及其治疗应用。
[0002] 发明背景
[0003] 细胞因子TGF |3因其刺激细胞集落形成的能力而被发现（Roberts AB等人，Proc Natl Acad Sci USA，78:5339-43, 1981)，由于该过程是细胞转化的典型标志，因而该分子被 称为转化生长因子0。现今，配体TGF0 (TGFM、TGF0 2、TGF0 3)被认为是多功能生长 因子的原型。生物体中的几乎任何细胞类型都产生它们并且表达其受体复合物。这些分 子是上皮细胞、内皮细胞和造血细胞增殖的强有力的抑制剂（Ravitz MJ等人，Adv Cancer Res, 71:165-207, 1997)，是细胞外基质的产生和沉积（Massague J. The Annu Rev Cell Biol, 6:597-641，1990)和组织修复级联（Roberts AB 等人，Plenum, 275-308, 1996)的最 强有力的调节剂之一。它们还在胚胎发育期间调节各种不同的机制，例如细胞分化、迀移 和血管发生（Taya Y?等人，Development, 126:3869-79, 1999 ;Lidral A.等人，Am J Hum Genet, 63:557-68, 1998)〇
[0004] 在免疫系统中，由TGF0介导的信号传导是一个非常重要的调节节点。其最突出 的功能之一是通过抑制在淋巴细胞减少环境中由自身抗原诱导的幼稚T细胞增殖来维持淋 巴细胞内稳态和免疫耐受（Bevan M.等人，Nat Immunol.，27, 13(7) :667-73, 2012)。该分子 还取消或改变天然杀伤细胞（Laouar, Y?等人，Nature Immunol, 6:600-607, 2005)、树突细 胞（Luo, X?等人，Proc. Natl Acad. Sci. USA, 104:2821-2826, 2007 ;Bekeredjian-Ding，I. 等人，Immunology, 128:439-450,2009)、巨细胞（Sica，A?等人，Semin.Cancer Biol.，18, 349-355, 2008 ;Torroella.M 等人，Cancer Res，69:4800-09, 2009)、嗜中 性粒细胞（Fridlender, Z. G?等人，Cancer Cell, 16:183-194, 2009)以及效应和记 忆 T 细胞群（6〇代111^，1.&卩1&￥611，1?.六.，恥七11代]^(1.，7:1118-22,2001 丨1&￥611，1?. A.，Immunity，31:131-44, 2009)的激活、成熟和分化。TGF0在天然的和诱导的调节T 细胞（⑶4+Foxp3+)和效应T细胞群T⑶4+IL17+(TH17)的诱导、分化和维持中起着必 不可少的作用（Kryczek, I?等人，J. Immunol.，178:6730-33, 2007 ;Moo_Young, T. A?等 人，J. Immunother, 32:12-21, 2009 ;Fantini, MC 等人，J. Immunol.，172:5149-53, 2004 ; Flavell, R. A. , Cell, 134:392-404, 2008)〇
[0005] 成熟的配体TGF0是具有112个氨基酸残基的同二聚体。它们衍生自由朝向 N-末端的潜伏状态相关前肽（LAP :latency associated pro-peptide)和朝向C-末端的 活性结构域形成的前体分子。这两个结构域在细胞内通过蛋白水解而分开，并且所述配 体作为无活性前体（其由可逆地与活性结构域相连接的前结构域形成）被分泌，由此调 节其向细胞受体的接近（Geoffrey D. Young 和 Joanne E. Murphy-Ullrich, JBC, Vol. 279， No. 36:38032-39, 2004)。已提出，所述潜伏状态相关前肽对于成熟结构域的分泌来说也是重 要的（Gray A?和 A Mason, Science, 247:1328-30, 1990) 〇
[0006] 三种同种型（TGF0 1、TGF0 2、TGF0 3)在质膜上与受体 T0RI、T0RII 和 T0RIII 相互作用。该最后一个（也已知为e聚糖）并非在所有的细胞类型中表达，并且尽管它 对于由配体TGFM和TGF0 3介导的信号传导来说是可有可无的，但是当T 0 RII被饱 和时它构成了这些配体的储库（Wang, X.F.等人，Cell, 67:797-805, 1991 ;Lebrin F.等 人，Cardiovasc. Res.，65:599-608, 2005)。T 0 RIII 与受体 T 0 RI 和 T 0 RII 形成复合物，以 将该配体呈递给它们。这些配体首先与T 0 RII结合，并且复合物T 0 RII/TGF0协作地且 以高亲和力招募和激活受体T0RI，这导致信号传导的异三聚体复合物的形成。TGFM和 TGF 0 3可以以高亲和力（5-30pM)与T 0 RII结合，而TGF 0 2仅可以在T 0 RIII存在下同样 地如此做（De Crescenzo 等人，J. Biol. Chem, 279:26013-18, 2004 ;De Crescenzo 等人，J. Mol. Biol, 328:1173-1183, 2003 ;Groppe 等人，Molecular Cell, 29, 157-168, 2008) 〇
[0007] 迄今还未报道，配体TGF0 1、TGF0 2和TGF0 3可以与作为T0RII所属于的 同一蛋白质家族的成员的其他II型受体相结合（Huang F和YG, Chen, Cell Biosc, Mar 15, 2:9, 2012)。但是，它们可以与数种I型受体相结合。传统地，ALK5被描述为该配体亚 家族的受体T0RI。在其被招募到复合物Tf3RII/TGF-f3中后，诱导了蛋白SMAD2/3的磷 酸化（Huang F 和 YG Chen, Cell Biosc, Mar 15,2:9,2012)。ALKl 响应于在内皮细胞中复 合物TGF 0 /T 0 RII的形成而被激活，并且通过SMADl和SMAD5来进行信号传导（Goumans MJ等人，Mol Cell, 12 (4) :817-28, 2003)。在一些上皮细胞中，SMAD1/5信号传导由受体 ALK2、ALK3 和 ALK6 诱导（Daly AC 等人，Mol Cell Biol, 28:6889-6902, 2008)。ALK2 还 与涉及体内心血管发育的过程相关（Olivey HE等人，Dev Dyn，235(1):50-9, 2006)。反 过来，应当强调，T0 RII和ALK5均是配体TGF0 1、TGF0 2和TGF0 3的家族所专有的，而 ALK1/2/6/3是更混杂的，还被激活蛋白和骨形态发生蛋白所共享（Sebald W.等人，Biol Chem.，385(8) :697-710, 2004)。
[0008] 由ALK5介导的信号传导在确定的疾病中与数种致病机制相关。例如在癌症中， 其作用是复杂的并且与其取消或促进肿瘤进展的能力有关。肿瘤进展的取消主要在肿瘤 发生的早期阶段期间运作。然而，其作为肿瘤进展剂的作用出现在癌发生的晚期阶段，这 通过诱导侵入性和转移性表型以及取消抗肿瘤免疫应答来进行（Miyazono K.，Nat. Rev. Cancer,10:415-24, 2010 ；Miyazono K., Cancer Sci,101 (2):306-12, 2010 ；HawinkeIs U.等人，Growth Factors, 29(4) : 140-52, 2011)。其中TGF 0也具有有害效应的其他例子 为由病原体例如HIV、HBV、HCV、CMV、分枝杆菌和寄生虫克氏锥虫（Tripanosoma cruzi)引 起的慢性感染。TGF0对于保护性免疫应答施加负的影响，由此有益于这些细胞内病原体 的生长和存活（Reed GS. ,Microbes and Infection, 1:1313-1325, 1999)。在许多疾病中， TGF0的过度产生有助于纤维组织的病理学过量，其危害受损器官的正常功能。一些例子尤 其为肺纤维化、结节病、心脏纤维化、心肌病、肝硬化、系统性硬化症、肾小球硬化症和原发 性胆汁性肝硬化（Kopp JB 等人，Microbes and Infection, 1:1349-1365, 1999) 〇
[0009] TGF0信号传导是多种抑制策略的目标。已经在临床前模型中评价了大多数的 抑制剂，尽管它们中的一些已开始在临床研宄中在数种类型的癌症和纤维化中进行检验 (Flavell RA.，Nat Rev Immunol.，10 (8) :554_67, 2010 ;Connolly EC 等人，Int J Biol Sci. ,8(7) :964-78, 2012 ;Hawinkels LJ?等人，Growth Factors, 29 (4) :140-52, 2011)。在 现有技术中，可以找到下列抑制策略：
[0010] 1-配体的中和，其中使用其受体的细胞外结构域的可溶性形式（US 2002/0004037 和 US 2007/0244042)、抗-TGF 0 抗体（US 2002/076858、US 2005/0276802)或阻断所述细 胞因子的基因的翻译的寡核苷酸（US 2004/0006036和US 2007/0155685);
[0011] 2-信号传导的阻断，其中使用与T0RI/ALK5的激酶结构域结合的小分子（US 2006/0057145、US 2005/0136043、US 2006/0234911);
[0012] 3-受体II的阻断，其中采用识别其细胞外结构域的抗体（US 2010/0119516、US 2009/7579186)〇
[0013] 迄今为止还没有报道过使用配体TGF0的突变蛋白作为信号传导的拮抗剂的抑 制策略。
[0014] 发明简述
[0015] 本发明基于这样的科学发现：TGFMTGFM、TGF0 2和TGF0 3)家族的突变型变 体可以抑制其天然同源物的功能。发明人首次在体外实验中发现，TGF0的突变型变体可 以相当大程度地抑制由天然变体诱导的信号传导并由此中和其生物学效应。该发现为在其 中配体TGF 0具有有害活性的疾病例如癌症、纤维化或慢性感染中调节TGF 0信号传导的 新策略奠定了基础。
[0016] 本发明涉及这样的多肽，其与人TGF0共享一级序列，除了一些氨基酸被突变，以 消除或相当大程度地降低其通过I型受体ALK5进行信号传导的能力。这些TGF0的突变 型变体保持了其以高亲和力与受体T 0 RII和T 0 RIII结合的能力，但不能够进行信号传 导，因为其不与I型受体ALK5相互作用，从而通过经由与高亲和力受体Tf3 RII和Tf3 RIII 的结合而与天然变体竞争来负地调节天然变体的信号传导。本发明还包括这些突变型变体 (单独地或者与疫苗或其他治疗形式相组合地）用于治疗其中TGF0经证明是重要的疾病 例如癌症、纤维化或慢性感染的治疗应用。
[0017] 本发明的新颖性在于提供了一种新的治疗策略，以在其中TGF0的功能降低了保 护性免疫应答（要么是天然的，要么是由疫苗接种诱导的）或者诱导了过量的组织修复和 纤维化的疾病中，调节TGF0信号传导并因此调节一些肿瘤的侵入和转移能力以及一些免 疫系统和结缔组织细胞的活性。上面所提及的抑制策略中没有一个使用配体TGF0的突 变蛋白作为信号传导的拮抗剂。本发明的TGF0的突变体是实际上自身的蛋白质并因此 具有低的免疫原性，这使得针对其的抗体应答的风险降低至最小。对于受体系统的高度特 异性降低了不希望的毒性（这是在基于小尺寸的抑制剂的策略中所共同的）。这些TGF0 的突变型变体保持了至少天然TGFM和TGF0 3的亲和力（6-10pM)这样的级别的与受体 T 0 RII的结合亲和力。该亲和力是用受体或配体抑制策略、单克隆抗体或其他药物难以超 过的。令人惊讶地，本发明的作者发现，这些TGF0的突变型变体保留了与受体T0RIII和 T 0 RII相互作用的能力，这构成了超过抗受体T 0 RII的抗体的优点，因为所述突变蛋白阻 断了天然配体与细胞表面的所有可能的结合位点。
[0018] 发明详述
[0019] 本发明涉及多肽，其拮抗由受体ALK5介导的天然配体TGF e的活性，并且具有大 于90%的相对于天然配体TGF0的氨基酸序列而言的同源性。本发明的多肽在其一级氨 基酸序列中具有至少一个在选自下列的残基之一处的突变 ：￥6、130、132、151、151、067和 LlOl。在本发明的一个特别的实施方案中，原始氨基酸残基突变为选自下列的氨基酸残基 之一：
[0020] 对于位置6 :A ;
[0021] 对于位置 30 :N、R、K、D、Q、L、S、P、V、I、G、C、T、A、E ;
[0022] 对于位置32 :A ;
[0023] 对于位置 51 :Q、W、Y、A ;
[0024] 对于位置 67 :H、F、Y、W ;和
[0025] 对于位置 101:A、E。
[0026] 本发明的另一个目标为多肽，其中在与受体TGF 0 RII和/或TGF 0 RIII的相互作 用界面处添加突变，以增加其与所述受体的亲和力。
[0027] 此外，本发明还涉及用于治疗癌症、伴有纤维化的疾病和慢性感染性疾病的药物 组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有在本发明中所描述的多肽或多肽混合物和用 于其应用的药学上合适的载料。所述多肽可以共价地连接至载体蛋白，并且该蛋白可以为 白蛋白或人免疫球蛋白的Fc区。在另一个实施方案中，本发明的多肽可以被PEG化。
[0028] 最后，本发明涉及所描述的多肽在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物在 治疗癌症、伴有纤维化的疾病和慢性感染性疾病中有用，以及对于代替天然TGF0来增强 对疫苗的细胞和/或体液应答来说有用，尤其是当待增强的疫苗为用于癌症的治疗性疫苗 时。
[0029] TGF 0的类似多肽的获得
[0030] 本发明涉及大小为112个氨基酸的多肽。这些多肽保持高的与各种不同的天然 TGF 0分子的序列同一性，大于90%的同一性。在其序列的一个区域中包括1至6个突变， 相对于天然TGF0而言。选择置换原始残基的残基，以便具有与原始氨基酸非常不同的物 理化学特性，非极性残基置换成极性残基、带电荷电的残基置换成不带电荷的残基、大残基 置换成小残基、酸性残基置换成碱性残基的改变。
[0031] 从在与其受体T 0 RII和ALK5的复合物中的天然TGF 0 I、TGF 0 2和TGF 0 3的三维 结构（存放在数据库TOB中）开始来设计这些多肽（也可以称为TGF0的突变蛋白）。仅 在这样的TGF0的位置处引入突变，所述位置相应于明显暴露于溶剂的氨基酸并且构成与 受体ALK5(但不是T 0RII)的结合区域的一部分。通过使用公有领域的生物信息学程序， 这些残基被预测为在与ALK5的相互作用中是重要的。下表显示了被预测为在相互作用中 重要的与ALK5的结合界面的残基和影响结合的可能突变。用这些结果制作了理论突变蛋 白的数据库并且选择了具有最高体外拮抗剂效力的突变蛋白。
[0032] 表1 :对于与T 0 RI/ALK5的相互作用来说重要的TGF 0序列的氨基酸和根据理论 预测将会使结合不稳定的突变。
[0033]
[0034] 本发明的多肽可以通过各种不同的途径来获得，尤其是通过蛋白质的化学合成。 还可以通过基因工程技术来获得，例如在细菌例如大肠杆菌（E. coli)中作为内含体或者 在哺乳动物细胞例如CHO和HEK293中表达它们，其中使用在现有技术中所积攒的任何转染 方案。还可以通过借助于聚合酶链式反应的定向诱变技术来获得在特定位置处的点突变。
[0035] 通过其生物学活性来选择天然TGF 0的类似多肽
[0036] 从体外和体内实验开始来选择本发明的多肽，以同时具有下列特性：
[0037]-这些TGF0的突变型变体（在本发明中也称为突变蛋白）保持了其与受体 T0RII结合的能力。该结合能力可以通过商购可得的针对受体T0RII的链的ELISA测定 法直接地来进行评价，或者在对于该受体来说阳性的细胞群上间接地来进行评价。对于受 体T0RII的识别水平应当与天然TGF0相当。
[0038] -这些突变蛋白应当阻断配体TGF 0 (TGF0 1、TGF 0 2、TGF 0 3)与受体T 0 RII的 结合。这可以通过竞争性ELISA直接地来进行测量，其中用配体TGF0中的每一种（商购 可得的）包被平板并评价所述突变蛋白抑制T 0 RII与所述配体结合的能力。
[0039]-这些TGF 0的突变型变体丧失了或相当大程度地降低了其通过受体T 0 RI进行 信号传导的能力。该特性可以在通过Western的免疫检测测定法中直接地进行评价，其中 定量在用所述突变蛋白或用天然TGF0进行处理的鼠类谱系肿瘤细胞4T1和人类谱系肿瘤 细胞MDA-MB231的裂解液中的磷酸化的Smad2和Smad3的水平。这些突变蛋白应当诱导比 天然TGF 0小至少100倍的Smad2和Smad3的磷酸化。所提及的特性还可以在体外在对于 细胞系CTLL-2的由IL-2诱导的增殖的抑制测定法中来进行评价。这些突变体应当具有比 天然TGF 0低至少100倍的抑制活性。
[0040] -这些TGF 0的突变型变体具有抑制由配体TGF 0中的每一种（TGF0 1、TGF 0 2、 TGF0 3)诱导的信号传导的能力。该特性可以在通过Western的免疫检测测定法中直接地 进行评价，其中定量在用所述突变蛋白或用天然TGF0进行处理的鼠类谱系肿瘤细胞4T1 和人类谱系肿瘤细胞MDA-MB231的裂解液中的磷酸化的Smad2和Smad3的水平。在50ng/ mL-10yg/mL的突变蛋白浓度的范围内，所述突变蛋白应当展现出至少100倍地抑制由商 业配体诱导的信号传导的能力。
[0041] -这些TGF0的突变型变体具有体外抗肿瘤效应。它们可以抑制用天然配体进行 处理或未处 理的数种肿瘤细胞系的迀移。这些肿瘤细胞系的例子为鼠类细胞系4T1和人类 细胞系MDA-MB231。在细胞迀移测定法中，这些突变蛋白应当能够显著地（从统计学观点来 看）抑制肿瘤细胞的迀移。
[0042]-这些TGF0的突变型变体丧失了或相当大程度地降低了其分别在IL-2或IL-6 和IL-23存在下诱导CD4+幼稚T细胞向Treg foxp3+或TH17表型进行分化的能力。该特 性可以在Treg和TH17细胞的体外诱导测定法中直接地来进行评价。这些突变体应当具有 比天然TGF 0低至少100倍的诱导活性。
[0043]-这些TGF0的突变型变体具有抑制由其天然同源物诱导的⑶4+幼稚T细胞向 Treg foxp3+或TH17表型进行分化的能力。该特性可以在Treg和TH17细胞的体外诱导测 定法中直接地来进行评价。在50ng/mL-10 y g/mL的突变蛋白浓度的范围内，所述突变蛋白 应当展现出至少100倍地抑制由商业配体诱导的信号传导的能力。
[0044] -这些TGF0的突变型变体具有体内抗肿瘤效应。它们可以在可移植肿瘤模型中 在体内抑制数种肿瘤品系的肿瘤生长和转移能力。该特性可以通过使用在BALB/c小鼠中 的乳腺细胞系4T1的正位原发性肿瘤模型和在免疫缺陷小鼠中的人肿瘤细胞系MDA-MB231 的正位原发性肿瘤模型来进行评价。相比于用PBS进行处理的对照组而言，这些突变蛋白 应当引起肿瘤大小和肺转移数目的在统计学上显著的降低。
[0045]-这些TGF0的突变型变体具有在可移植肿瘤模型中在体内增加天然的或由疫苗 接种诱导的抗肿瘤免疫应答的能力。该特性可以通过使用在BALB/c小鼠中的乳腺细胞系 4T1的正位原发性肿瘤模型和结肠肿瘤细胞系CT26的皮下原发性肿瘤模型来进行评价。这 些突变蛋白应当增加天然杀伤细胞和CD8+T淋巴细胞的溶细胞活性和细胞因子分泌。它们 应当增加树突细胞和THl型CD4+T细胞的活性，并且应当显著地减小调节T细胞和骨髓抑 制细胞的数目以及其促肿瘤活性。
[0046] 本发明包括所述TGF0的突变蛋白的额外修饰，其可以意味着产生缺乏LAP的 成熟结构域，而不影响其分泌。这暗示，所述突变蛋白可以以其活性形式来获得以用于与 T 0 RII的相互作用。这结果导致生产过程的简单化。
[0047] 在另一个方面，本发明涉及所述TGF0的突变蛋白的额外修饰，其增加所述突变 蛋白的半寿期。在这些修饰之中，尤其包括任一种上面所描述的免疫调节多肽与载体蛋白 (其可以为白蛋白或人免疫球蛋白的Fc区）的融合、PEG化。
[0048] 在一个更特别的实施方案中，本发明涉及与人IgGl的Fc片段相融合的TGF 0的 突变型变体（在表2中所提及的特定突变），其经过选择以显示上面所提及的特性。被选择 用于进行偶联的Fc区在结构域C Y 2中具有一组突变（ala234、ala235)，其阻止与Fe Y受 体相互作用（除了新生儿Fc受体），由此使其诱导免疫效应机制的能力沉默（Labrijn AF 等人，Curr Opin Immunol.，Aug, 20 (4) : 479-85, 2008, Epub 2008 年 7 月 9 日）。
[0049] 这些突变蛋白包括多个氨基酸置换，其显著地降低了它们通过ALK5进行信号传 导的能力。然而，它们完整地保持了其与T 0 RII结合和与T 0 RIII结合的能力，从而取得 了天然TGF0的活性的抑制能力。
[0050] 表2 :构建出的突变体，其中根据人TGF0的编号来提及突变。
[0051]
[0052] 在另一个方面，本发明还包括所述TGF0的突变蛋白的额外修饰，其要么用于增 加所述突变蛋白对于T0RII和T0RIII的亲和力，但不影响或甚至改善其抑制特征，要么 用于通过增加寿命来改善所述突变蛋白的体内药效动力学。这些额外的突变可以通过用生 物信息学工具进行合理设计，或者通过使用具有各种不同性质的组合分子文库（噬菌体文 库，在酵母或细菌中的基因表达文库）来获得。
[0053] TGF0的类似多肽的治疗应用
[0054] 本发明还包括包含由本发明所公开的TGF0的突变蛋白和其类似物或融合蛋白 作为活性成分的药物组合物，以及其可能的治疗应用，目的是在其中TGF0的功能降低了 保护性免疫应答（要么是天然的，要么是由疫苗接种诱导的）或者诱导了过量的组织修复 和纤维化的疾病中，调节一些肿瘤的侵入和转移能力以及一些免疫系统和结缔组织细胞的 活性。
[0055] 关于其治疗用途，应当向携带所述疾病的受试者施用本发明的多肽，独立地或者 与其他多肽或有利于或增强其治疗作用的其他物质相组合地。施用途径可以为在现有技术 中被描述用于肠胃外施用药物的任何施用途径。可以优选地通过静脉内、肌内、皮下或肿瘤 内途径进行施用。
[0056] 由本发明所描述的多肽或融合蛋白还可以通过成为在治疗癌症、伴有纤维化的疾 病和慢性感染性疾病中有用的药物组合物的一部分来进行施用。优选地，本发明包括包含 药学上可接受的载料的组合物，包括药物组合物。
[0057] 所述组合物包含药学上可接受的载体。在所述药学上可接受的载体中包括但不限 于：盐水、无菌水、磷酸盐缓冲盐水等。适合于给予患者的其他缓冲剂、分散剂和非毒性惰性 物质可以包括在本发明的组合物中。所述组合物可以为适合于施用的溶液，并且通常是无 菌的且没有不希望的颗粒。
[0058] 在一个方面，本发明还涉及治疗方法，其包括向具有癌症、伴有纤维化的疾病或慢 性感染性疾病的受试者施用治疗有效量的在本发明中所描述的多肽、融合蛋白或组合物。 在一个特别的实施方案中，所述受试者为人。
[0059]由本发明所描述的多肽或融合蛋白还可以与传统肿瘤学疗法（化学疗法和放射 疗法）（作为其效应的增强剂）相组合地进行施用。
[0060] 为了获得所希望的治疗效果，本发明的多肽应当以对于确保其在淋巴结或对所研 宄的疾病而言重要的外周位点处的浓度来说足够高的剂量进行施用，所述浓度在这样的浓 度范围内，对于所述浓度范围，所述突变蛋白显示出抑制天然TGF0的效应。因此，所考虑 的剂量应当进行调整以适合于所研宄的疾病类型和施用途径。例如，在肿瘤治疗的情况下， 应当调整剂量以便达到确保其抑制效应的所述突变体在肿瘤内部和/或在局部区域淋巴 结中的浓度。待探察的剂量范围可以为I. 25-20mg/Kg/周剂量或半月剂量。
[0061] 待应用的施用次数也应当进行调整以适合于所考虑的突变蛋白的生物分布。通 常，应当达到使上面提及的有效浓度持续2个至30个连续天的时间。如果所述突变蛋白与 载体蛋白相偶联，那么其施用频率应当因此进行调整。
[0062]当将本发明的化合物或组合物与其他抗癌生成试剂相组合地进行使用时，本发明 提供了例如同时的、分阶段的或交替的治疗。因此，本发明的化合物可以在分开的药物组合 物中同时施用，并且其中本发明的化合物可以在其他抗癌生成试剂之前或之后施用，例如 相差数秒、数分钟、数小时、数天或数周。
[0063] 治疗作用应当被理解为疾病症状的完全或部分缓解。在癌症中，肿瘤体积的减小 或复发时间的增加尤其是疾病缓解的标准。
[0064] 相对于其他用于调节TGF0信号传导的建议而言，该新的治疗策略的优点是多重 的。例如：
[0065] ?所述TGF0的突变体是实际上自身的蛋白质（除了很少的突变外）并因此具有 低的免疫原性。该因素使得针对其的抗体应答的风险降低至最小。
[0066] ?对于受体系统的高度特异性降低了不希望的毒性（这是在基于小尺寸的抑制剂 的策略中所共同的）。
[0067] ?这些TGF0的突变型变体保持了至少天然TGFM和TGF0 3的亲和力（6-10pM) 这样的级别的与受体Te RII的结合亲和力。该亲和力是用受体或配体抑制策略、单克隆抗 体或其他药物难以超过的。
[0068] ?这些TGF 0的突变型变体具有比单克隆抗体和与Fc相偶联的受体更小的尺寸。 这在肿瘤学疾病的治疗情形下确保了比上面所描述的抑制TGF0信号传导的药物更大的 对肿瘤的渗透性。
[0069] ?这些16?0的突变型变体抑制通过受体系统!'01?11/1'|3 1?1仏〇(5)进行信号传导 的任何配体的信号传导，这是超过泛配体抗体（pan-ligand antibody)的理论优点，因为这 些突变型变体仅针对已知的TGF0同种型，如果存在其他同种型，这些抗体可以不抑制它 们。
[0070] ?这些TGF0的突变型变体保留了与受体Tf3 RIII相互作用的能力。这构成了超 过抗受体Tf3 RII的抗体的优点，因为所述突变蛋白阻断了天然配体与细胞表面的所有可 能的结合位点。
[0071] ?与Fc片段相连接增加了所述突变蛋白的半寿期，这赋予其相对于小尺寸的药物 而言的优点，因为剂量和其频率将会更少。这降低了不希望的毒性。
[0072] ?与不与Fe Y受体（除了新生儿Fc受体）相互作用的人IgGl的Fc片段相连接 避免了引发对于非肿瘤宿主细胞的免疫效应机制，从而相比于抗受体II的抗体（其完整地 保持了其与Fcy受体相互作用的能力）而言降低了不希望的毒性潜力。
[0073] 将用下列实施例 和附图来进一步阐述本发明。然而，这些实施例不应当被解释为 对本发明的范围的限制。
[0074] 附图简述
[0075] 图1.突变蛋白G_M1和天然TGF0的通过Western的免疫检测测定法。这些蛋白 质的SDS-PAGE在非还原和还原条件下进行，并且用抗人TGFM的抗体进行染色。第一泳 道相应于低分子量标准，第二泳道相应于突变蛋白G_M1，第三泳道相应于天然TGFM，和 第四泳道相应于无关抗体hR3。
[0076] 图2.通过ELISA测定法来评价突变蛋白G_M1对受体T 0 RII的识别。作为阴性 对照，使用无关抗体hR3。突变蛋白G_M1保持了其与受体T 0 RII结合的能力，该能力与天 然TGF 0 1的相似。
[0077] 图3.由突变的或天然的TGF0诱导的IL-2依赖性细胞系（CTLL-2)的增殖的抑 制测定法。证明了，所述突变蛋白抑制细胞系CTLL-2增殖的能力比天然的人TGFM低得 多。将数据表示为3次独立实验的平均抑制百分比。
[0078] 图4.用于评价突变蛋白G_M1中和由天然TGFM诱导的IL-2依赖性细胞系 (CTLL-2)的抑制的能力的测定法。该图显示了3次独立实验的平均细胞增殖百分比。
[0079] 图5.突变蛋白G_M1在体外抑制肿瘤细胞系4T1的迀移。如在该图中所指示的那 样以不同的时间间隔拍摄愈合照片，该图显示当细胞用所述突变蛋白进行处理时，在每个 时间点处愈合是更小的。
[0080] 图6.突变蛋白G_M1抑制由天然TGF0诱导的⑶4+⑶25-Foxp3-幼稚T细胞向 CD4+CD25+Foxp3+调节细胞表型的分化/转变。当将细胞与500ng/ml的所述突变蛋白一起 温育时，从T细胞培养物中回收的调节T细胞的百分比几乎降至零（几乎完全缩减）。该浓 度仅是用于诱导转变的重组人TGF M的30倍。 实施例
[0081] 实施例1. TGF 0的突变蛋白的设计
[0082] 从生物信息学技术开始，使用所报道的人TGF M和TGF 0 3与TGF 0受体的三元 复合物的结构作为基础，采用计算机设计了所述突变蛋白。通过使用公有领域的生物信息 学程序测定了天然同种型和所有可能的突变型变体的结合能。突变蛋白G_M1在CHO-Kl细 胞中从在慢病毒载体PLW中的基因构建体开始进行表达，并且在C-末端包括人IgGl的铰 链区和结构域Cy2和Cy3以及组氨酸尾巴。G_M1通过A蛋白亲和层析来进行纯化（图 1)，并且获得了高的纯度（>95% )。
[0083] 实施例2?突变蛋白G_M1与T 0 RII结合的能力
[0084] 进行了 ELISA测定法，其中用T 0 RII (I y g/ml)进行包被并用与碱性磷酸酶相偶 联的抗人Fc的抗体进行揭示。使用无关抗体hR3作为阴性对照。图2显示，突变蛋白G_M1 保持了其与受体Tf3 RII结合的能力，该能力与天然TGF M的相似。
[0085] 实施例3.突变蛋白G_M1具有降低的通过受体T 0 RI (ALK5)进行信号传导的能力 并因此模仿天然TGF 0的生物学活性
[0086] 比较了由突变的或天然的TGF0诱导的IL-2依赖性细胞系CTLL-2的增殖的抑 制。用50U/ml的商业IL-2以及确定浓度的商业rTGFM或突变蛋白G_M1刺激5000个细 胞系CTLL-2的细胞/孔48小时。随后，向培养物添加阿尔玛蓝（Alamar Blue)试剂，并且 在540和630nm处测量还原。
[0087] 突变蛋白G_M1不能抑制细胞系CTLL-2的增殖，至少在为用作实验的阳性对照的 商业TGFM的浓度200倍的浓度下（图3)，所以所述突变蛋白抑制细胞系CTLL-2的细胞 增殖的能力比商业TGFM小得多。
[0088] 实施例4.突变蛋白G_M1是体外TGF0信号传导的拮抗剂
[0089] 用50U/ml的商业IL-2刺激5000个细胞系CTLL-2的细胞/孔，并且在2pM的商 业TGF 0 1和确定浓度的突变蛋白G_M1、同种型对照抗体hR3或阳性对照即抗-TGF 0 1抗体 存在下进行培养。在48小时后，向培养物添加阿尔玛蓝试剂，并且在540和630nm处测量 还原。
[0090] 突变蛋白G_M1(而非hR3)中和由商业TGF0 1诱导的细胞系CTLL-2增殖的抑制 (图4)。由所述突变蛋白引起的中和效应与通过用作实验的阳性对照的抗-TGFM抗体所 获得的相似。
[0091] 实施例5.突变蛋白G_M1具有体外抗肿瘤效应
[0092] 使用在单层粘附细胞中的伤口的方法（LiangCC等人，Nat Protoc.，2 (2):329-33, 2007)，在体外测定法中评价了突变蛋白G_M1抑制鼠类肿瘤细胞系 4T1迀移的能力。通过用无菌移液管刮擦细胞单层来使汇合的细胞受损伤，并且向小孔中添 加突变蛋白G_M1或商业TGFM(阴性对照）。在图5中观察到，当用所述突变蛋白处理细 胞时，闭合速度显著降低（P〈〇.〇5，Kruskal-Wallis检验以及Dunn事后检验，在每个时间点 处）。
[0093] 实施例6.突变蛋白G_M1抑制常规幼稚T细胞的分化
[0094] 通过流式细胞术纯化了 4只C57/BL6小鼠的脾的CD4+CD25-GITR-幼稚细胞群。在 3 y g/mL的附着至平板的抗-CD3和3 y g/mL的可溶性抗-CD28存在下，用5ng/mL的IL-2 和5ng/mL的TGF 0刺激5 XIO4个这些细胞。在250和500ng/mL的浓度下评价所述突变蛋 白。在这些条件下，向诱导的调节T细胞的转变百分比为55. 6%。在所述突变蛋白存在或 不存在下，测量回收的Foxp3+调节T细胞的百分比。图6显示，在突变蛋白G_M1存在下， 在T细胞培养物中回收的调节T细胞的百分比如何几乎降至零。
【主权项】
1. 拮抗由受体ALK5介导的天然配体TGF0的活性的多肽，其特征在于，所述多肽具有 大于90%的相对于天然配体TGF0的氨基酸序列而言的同源性。2. 根据权利要求1的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一个在选自下列的氨基酸 残基之一处的突变：W30、W32、L101、151、L51、Q67 和Y6。3. 根据权利要求2的多肽，其特征在于，原始残基突变为选自下列的氨基酸残基之一： 对于位置 30 :N、R、K、D、Q、L、S、P、V、I、G、C、T、A、E; 对于位置32:A; 对于位置101 :A、E; 对于位置51 :Q、W、Y、A; 对于位置67 :H、F、Y、W;和 对于位置6 :A。4. 根据权利要求3的多肽，其中在与受体TGF0RII和/或TGF0RIII的相互作用界面 处添加突变，以增加其与所述受体的亲和力。5. 根据权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含用于产生缺乏LAP的成熟结构域 而不影响成熟结构域分泌的修饰。6. 根据权利要求3的多肽，其特征在于，将所述多肽融合至在结构域Cy2中包含突变 ala234 和ala235 的人IgGl的Fc片段。7. 用于治疗癌症、伴有纤维化的疾病和慢性感染性疾病的药物组合物，其包含处于 50ng/mL-10yg/mL的范围内的至少一种根据权利要求3的多肽和药学上合适的载料。8. 根据权利要求7的药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求3的多肽的混合 物和药学上合适的载料。9. 根据权利要求7的药物组合物，其特征在于，将所述多肽共价地连接至载体蛋白。10. 根据权利要求9的药物组合物，其特征在于，所述载体蛋白为人免疫球蛋白的Fc 区。11. 根据权利要求9的药物组合物，其特征在于，所述多肽被PEG化。12. 根据权利要求1至6的多肽，其用于制备在治疗癌症、伴有纤维化的疾病和慢性感 染性疾病中有用的药物。13. 根据权利要求1至6的多肽，其用于制备对于增强对疫苗的细胞和/或体液应答来 说有用的药物。14. 根据权利要求13的多肽，当待增强的疫苗为用于癌症的治疗性疫苗时。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别地涉及TGFβ分子的突变型多肽，其一级序列与人TGFβ的序列具有高度同源性。这些突变蛋白丧失了与ALK5相互作用的能力但保留了与其余的作为受体复合物的成员的受体(TβRII和TβRIII)的相互作用。它们具有拮抗配体TGFβ的所有天然变体的依赖于将ALK5招募到受体复合物中的信号传导的特性，并且具有免疫调节效应。本发明涉及包含所公开的多肽或融合蛋白作为活性成分的药物组合物，并且涉及所公开的多肽、融合蛋白和药物组合物的治疗用途，这是由于对于病理学状态例如癌症、伴有纤维化的疾病和慢性感染性疾病的其免疫系统调节效应。
【IPC分类】A61K38/18
【公开号】CN104902916
【申请号】CN201380058181
【发明人】A·D·J·科里亚奥索里奥, K·里昂蒙松, T·卡尔梅纳特波蒂利亚, A·普波梅里诺, S·佩雷斯罗德里格斯
【申请人】分子免疫中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月30日
【公告号】CA2887455A1, EP2918284A1, US20150284441, WO2014071894A1
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