金黄色葡萄球菌sdrecnab结构域及其用于接种的用图
金黄色葡萄球菌sdre cnab结构域及其用于接种的用图
【专利说明】金黄色葡萄球菌SDRECNAB结构域及其用于接种的用途
[0001] 本申请要求2012年10月29日提交的UK临时申请1219420. 5的权益，其所有的 完整内容出于所有目的由此通过引用并入本文。
技术领域
[0002] 本发明涉及金黄色葡萄球菌免疫原的领域。
【背景技术】
[0003] 针对金黄色葡萄球菌的各种疫苗目前正在研宄，例如，参见参考文献1。如参考文 献2中公开的一种方法使用含有CnaB结构域的多肽。该结构域首次在金黄色葡萄球菌胶 原结合表面蛋白中被描述为不介导胶原结合的区域。参考文献2中的图28显示，来自金黄 色葡萄球菌SdrD蛋白的CnaB结构域在小鼠模型中赋予针对菌株USA300感染的保护。
[0004] 本发明的一个目标是提供用于引发针对金黄色葡萄球菌的免疫应答的进一步且 改进的免疫原。
【发明内容】
[0005] 参考文献2将金黄色葡萄球菌的SdrD蛋白鉴定为含有CnaB结构域。本发明人已 发现，金黄色葡萄球菌富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白（SdrE)含有三个 CnaB结构域（' CnaBEl'、' CnaBE2'和' CnaBE3'），并且这些结构域中的第三个提供针对金黄 色葡萄球菌感染的显著保护，如肾脓肿形成的减少所表明。此外，本发明人已显示甚至针对 不表达SdrE的菌株的交叉保护。此外，已显示SdrE蛋白对于胰蛋白酶消化相对耐受，这可 以与SdrE在其第三CnaB结构域内（即CnaBE3内）含有异肽键的观察联系起来。
[0006] 在第一个方面，本发明提供包含SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中所述多肽不包含 全长SdrE蛋白。
[0007] 在第二个方面，本发明提供包含SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中所述多肽具有少 于500个氨基酸。
[0008] 在第三个方面，本发明提供包含金黄色葡萄球菌SdrE蛋白的片段的多肽，其中： (a)所述片段包括SdrE CnaBE3结构域；且（b)所述多肽不包含全长SdrE蛋白。
[0009] 在第四个方面，本发明提供包含金黄色葡萄球菌CnaB结构域的多肽，其中所述 CnaB结构域包括异肽键。所述CnaB结构域优选为CnaBE3。
[0010] 在第五个方面，本发明提供包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多 肽，其中，在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有天冬酰胺残基的一个或多个 氨基酸位置，突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代。
[0011] 类似地，本发明提供包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多肽，其 中，在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有天冬氨酸残基的一个或多个氨基 酸位置，突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代。
[0012] 类似地，本发明提供包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多肽，其 中，在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有赖氨酸残基的一个或多个氨基酸 位置，突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代。
[0013] 在第六个方面，本发明提供包含至少两个CnaB结构域的多肽，其中：(a) CnaB结构 域中的至少一个是CnaBE3结构域且至少一个CnaB结构域不是SdrE CnaB结构域；或（b) 所述多肽包含至少两个CnaBE3结构域。此类多肽可包含如参考文献2 (例如，参见其中第 9-13页）中公开的氨基酸序列A (LB)n，条件是至少一个A和/或B是CnaBE3结构域。
[0014] 本发明的这些多肽可用作用于引起免疫应答例如以保护免于金黄色葡萄球菌感 染的免疫原性组合物的组分。
[0015] SdrE 金黄色葡萄球菌SdrE蛋白是富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白，如参 考文献3-8中更详细地讨论。在金黄色葡萄球菌细菌中，其被锚定在细胞壁中。在Newman NWMN_0525菌株中，其氨基酸序列是SEQ ID N0:1 :
[0016] 来自许多更多菌株的SdrE序列是本领域已知的。在申请时搜索 NCBI多肽序列数据库中的金黄色葡萄球菌SdrE序列揭示73次命中，并且使 用SEQ ID NO: 1的BLINK搜索给出至少以下菌株的SdrE序列：COL (序列登录号
[0017] BLINK命中具有1131-1166个氨基酸，其中该长度变异的大部分源自Ser-Asp重复 的长度差异。除了该变异和5聚体PSTSE序列（SEQ ID N0:44)的存在或不存在以外，该序 列另外在许多菌株之间是非常高度保守的。因此，新生序列通常可以如下代表： |SEQ ID ND; 21-Xs-ISEQIDNO; 3|-X'-[SEQ ID NO:4J (式 ） 其中： SEQ ID N0:2 为：
X1是任选的PSTSE序列（SEQ ID NO: 44)，且 X2是20-250个氨基酸长且或者是（i) SD的多个重复或（ii) SD和AD序列两者的混 合物。
[0018] 因此，SEQ ID NO: 1是式'A'的实例，其中X1存在且X 2是SD的83个重复。
[0019] 本发明可以使用任何这些已知的SdrE序列。通常，本发明使用的SdrE将包含与 SEQ ID NO: 3具有至少90%同一性（例如，之91%同一性，之92%同一性，之93%同一性，之94% 同一性，295%同一性，296%同一性，297%同一性，298%同一性，299%同一性，或100%同一 性）的序列，并且，当施用于人或小鼠时，将引发抗体，所述抗体识别作为SEQ ID N0:1表达 的野生型金黄色葡萄球菌蛋白。
[0020] 当本发明的一个实施方案利用金黄色葡萄球菌SdrE蛋白的片段时，该片段将通 常是与SEQ ID N0:3具有至少90%同一性（例如，之91%同一性，之92%同一性，之93%同一性， >94%同一性，295%同一性，》96%同一性，297%同一性，》98%同一性，299%同一性，或100% 同一性）的序列的片段。包含所述片段的多肽，当施用于人或小鼠时，将引发抗体，所述抗 体识别作为SEQ ID NO: 1表达的野生型金黄色葡萄球菌蛋白。
[0021] 金黄色葡萄球菌SdrE的一种有用片段包括CnaBE3结构域（参见下文），但包括少 于20个Ser-Asp重复。
[0022] 当本发明的一个实施方案不利用全长SdrE蛋白时，它不利用具有式'A'的蛋白。
[0023] 此外，本发明的多肽通常将不包含式'B'的氨基酸序列，其中式'B'为：
SEQ ID N0:3 为：
X1是任选的PSTSE序列（SEQ ID NO:44)(优选存在），且 X2是20-250个氨基酸长且或者是（i) SD的多个重复或（ii) SD和AD序列两者的混 合物（且其中优选的X2是由SD的83个重复组成的166聚体（mer))。
[0024] 因此，式'B'的优选实例是SEQ ID NO:7,1076聚体：
所以，本发明的多肽通常将不包含SEQ ID N0:7。
[0025] CnaB 结构域 CnaB结构域是公认的具有希腊钥匙拓扑学的两个折叠（sheets)中七股的前白蛋白 样夹心折叠的蛋白结构[9]。SCOP数据库[10]包括"Cna蛋白B型结构域"作为家族 (49479)和超家族（49478)两者。在Pfam数据库[11]中，CnaB结构域是条目PF05738。 尽管CnaB结构域基于二级蛋白结构定义，但该结构源于容易分析的氨基酸模式，并且一个 CnaB结构域的存在可以仅仅基于氨基酸序列相对容易地预测，并且它们通过保守结构域搜 索例如使用CDD (保守结构域数据库）容易鉴定，如参考文献12中所报道。
[0026] 各种细菌物种中的CnaB结构域的实例公开于参考文献2。本发明涉及包括CnaB 结构域的金黄色葡萄球菌蛋白。金黄色葡萄球菌中存在几种此类蛋白的实例，包括原型CNA 胶原粘附素（其通常不作为本发明的实施方案），但本发明的主要焦点是Sdr蛋白（富含 Ser-Asp的蛋白，诸如SdrA、B、C、D、E和/或F)，特别是SdrE 0
[0027] 金黄色葡萄球菌SdrE如上文讨论。其含有三个CnaB结构域，在参考文献3中鉴 定为"B重复"。三个CnaB结构域的边界基于Newman菌株显示于参考文献3的图3中，且 SEQ ID N0:1 中的第三 CnaB 结构域（，CnaBE3，）如下（SEQ ID N0:8):
[0028] 使用SEQ ID NO: I与来自任何其他金黄色葡萄球菌菌株的SdrE序列的比对，SEQ ID N0:8允许CnaBE3结构域在该其他菌株中容易地定位。本发明可以使用来自任何此类菌 株的CnaBE3结构域，尽管Newman菌株是优选的。
[0029] 通常，因此，本发明利用的CnaBE3结构域将与SEQ ID N0:8具有至少95%同一性 (例如，296%同一性，297%同一性，298%同一性，299%同一性，或100%同一性），并且，当施 用于人或小鼠时，将引发识别表位的抗体，所述表位（i)在SEQ ID NO: 8内或（ii)包括SEQ ID N0:8内的氨基酸。换言之，CnaBE3结构域将引发与上述鉴定的野生型CnaBE3结构域交 叉反应的抗体。在一些实施方案中，表位在SEQ ID N0:27内或包括SEQ ID N0:27内的氨 基酸。
[0030] SEQ ID NO:8的CnaBE3结构域是111聚体，因此占总SdrE蛋白的约9. 5%。因 此，包含CnaBE3结构域的本发明的多肽可以比全长SdrE蛋白实质上更短。本发明的含有 CnaBE3的多肽可以因此具有少于500个氨基酸，例如，少于400aa，少于350aa，少于300aa， 少于250aa，少于200aa，或少于150aa。
[0031] 当本发明的多肽包括CnaBE3结构域时，所述结构域上游和/或下游的任何氨基酸 可以与金黄色葡萄球菌SdrE蛋白的上游/下游残基相同，或者它们可以不同。例如，当所 述多肽包含序列{A} - {B} - {C}(其中{B}是CnaBE3结构域）时：(a) {A}的C端与SEQ ID NO: 1的残基102-111可以是相同或不同的；和/或（b) {C}的N端与SEQ ID NO: 1的残基 941-951可以是相同或不同的。因此，{B}的CnaBE3结构域可以作为来自SdrE的特定片 段，或者其可以包括作为来自SdrE的较大片段的部分。当序列{c}存在时，这理想地包括 少于20个Ser-Asp重复，例如，少于10个，少于5个，或甚至零个。在一个有用的实施方案 中，序列{A}的确包括CnaBE2结构域内对应区域的短部分，例如，至多达20个氨基酸。例 如，一种有用的序列（SEQ ID NO:27)保留来自CnaBE2的最后15个氨基酸，以得到SEQ ID NO: 1的126聚体片段：
[0032] 来自SdrE的每个CnaB结构域包括EF手环，其可提供钙的高亲和力结合。因此， 本发明的多肽可包括CnaB结构域内的Ca'
[0033] 所述CnaBE3结构域刚好在参考文献1中公开的'SdrE53_ 632 '蛋白的下游。
[0034] SEQ ID NO:8与参考文献2中作为SEQ ID NO: 134-138公开的来自SdrD的五个 CnaB结构域具有序列同一性（通过CLUSTALW计算）：
〇
[0035] 类似地：当SEQ ID NO:8针对SdrD中的对应区域（例如对于Newman菌株，针对 SdrD的氨基酸1013-1123)比对时，其具有94. 6%同一性，具有6个氨基酸差异；并且当SEQ ID NO:8针对SdrC中的对应区域（例如，针对参考文献1中SdrC的氨基酸607-717)比对 时，其也具有94. 6%同一,性，再次具有6个氨基酸差异。
[0036] 异肽键和突变体CnaBE3结构域 本发明使用的CnaB结构域（并且特别是CnaBE3结构域）可以有用地包括异肽键，即 两个氨基酸的侧链之间的键，或一个氨基酸的侧链和肽链的游离端之间的键。通常，这在一 个侧链中的氨基和另一个侧链上的羧基或甲酰胺（carboxamide)基之间，例如在Lys上的 氨基和Gln或Asn上的甲酰胺之间，或Lys上的氨基和Glu或Asp上的羧基之间形成。形 成异肽键的两个氨基酸通常都在相同CnaBE3结构域中。
[0037] 然而，在一些实施方案中，CnaB结构域（并且特别是CnaBE3结构域）被突变以去 除野生型天冬酰胺和/或赖氨酸残基，由此破坏异肽键的形成。在此类突变体CnaB结构域 中，在天然结构域具有天冬酰胺/赖氨酸残基的一个或多个氨基酸位置，突变体具有（i)氨 基酸缺失或（ii)氨基酸取代。SEQ ID NO: 9至14是其中野生型Asn残基突变的CnaBE3结 构域的实例，其中'X'不是'N'（并且理想地不是'N'、'Q'、'D'或'E'）：
[0038] 类似地，SEQIDNO: 15至26是其中野生型Lys残基突变的CnaBE3结构域的实例， 其中'X'不是'K' ：
[0039] 这些突变体可抵抗异肽键的形成。
[0040] 然而，在本发明的一些实施方案中，天然的赖氨酸和/或天冬酰胺和/或天冬氨酸 残基得到保留，使得异肽键形成得到维持。具体而言，保留对应于SEQ ID N0:8内的Asn-104 的位置（即SEQ ID NO: 14中加下划线的位置）的天冬酰胺是有用的。
[0041] 与金黄色葡萄球菌糖类的组合 本发明的多肽可以与缀合的金黄色葡萄球菌糖抗原组合使用。因此，本发明提供包含 以下的组合的免疫原性组合物：（1)本发明的多肽；和（2)金黄色葡萄球菌外泌多糖和载 体蛋白的一种或多种缀合物。
[0042] 该组合的组分（2)中使用的缀合物包括糖部分和载体部分。所述糖部分来自金黄 色葡萄球菌的外泌多糖，其是聚-N-乙酰葡糖胺（PNAG)。所述糖可以是具有在从细菌纯化 外泌多糖的过程中出现的大小的多糖，或者它可以是通过此类多糖的片段化获得的寡糖， 例如，大小可以从超过400kDa变化至75和400kDa之间，或10和75kDa之间，或至多达30 个 重复单元。所述糖部分可以具有各种程度的N-乙酰化，并且如参考文献13中所述，PNAG 可以小于40% N-乙酰化（例如，小于35、30、20、15、10或5%^乙酰化；去乙酰化？隱6也 已知为dPNAG)。PNAG的去乙酰化表位可引发能够介导调理杀死的抗体。PNAG可以被0-琥 珀酰化或可以不被〇-琥珀酰化，例如，它可以在少于25、20、15、10、5、2、1或0. 1%的残基上 被0-琥珀酰化。
[0043] 本发明还提供包含以下的组合的免疫原性组合物：（1)本发明的多肽；和（2)金 黄色葡萄球菌荚膜糖和载体蛋白的一种或多种缀合物。
[0044] 该组合的组分（2)中使用的缀合物包括糖部分和载体部分。所述糖部分来自金黄 色葡萄球菌的荚膜糖。所述糖可以是具有在从细菌纯化荚膜多糖的过程中出现的大小的多 糖，或者它可以是通过此类多糖的片段化获得的寡糖。荚膜糖可以从金黄色葡萄球菌的任 何合适的菌株（或具有相似或相同的糖的任何细菌）获得，诸如从5型和/或8型金黄色 葡萄球菌菌株和/或336型金黄色葡萄球菌菌株获得。感染性金黄色葡萄球菌的大多数菌 株含有5型或8型荚膜糖。两者都具有其重复单元中的FucNAcp以及可用于引入用于连接 的疏基的ManNAcA。5 型糖的重复单元是一4) - 0 -D-Man NAcA- (1 - 4) - a -L-FucNAc (30Ac) -(I - 3) - 0 -D-FucNAc- (I -，而 8 型糖的重复单元是一3) - 0 -D-ManNAcA (40Ac) - (I - 3) - a -L-FucNAc (I - 3) - a -D-FucNAc (I -。336型糖是没有O-乙酰化的0 -连接的己糖胺[14， 15]，并且与针对336菌株（ATCC 55804)产生的抗体交叉反应。5型和8型糖的组合是典型 的，并且336型糖可以加入该配对[16]。
[0045] 这些缀合物中的载体部分将通常是蛋白，但通常不是（1)的抗原之一。典型的载 体蛋白是细菌毒素，诸如白喉或破伤风毒素，或类毒素或其突变体或片段。CRM197白喉毒素 突变体[17]是有用的。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌外 膜蛋白复合物[18]，合成肽[19，20]，热休克蛋白[21，22]，百日咳蛋白[23，24]，细胞因 子[25]，淋巴因子[25]，激素[25]，生长因子[25]，包含来自各种病原体衍生抗原的多种人 ⑶4+ T细胞表位的人工蛋白[26]，诸如N19 [27]，来自流感嗜血杆菌此/这ae)的蛋 白D [28-30]，肺炎球菌溶血素[31]或其无毒衍生物[32]，肺炎球菌表面蛋白PspA [33]，铁 摄取蛋白[34]，来自艰难梭状芽胞杆菌（Ct/i/Zicih)的毒素A或B[35]，重组绿脓假单胞 菌的胞外蛋白A(rEPA) [36]等。在一些实施方案中，载体蛋白是金黄色葡 萄球菌蛋白，诸如选自第一、第二、第三或第四抗原组的抗原。
[0046] 当组合物包括多于一种缀合物时，每种缀合物可使用相同的载体蛋白或不同的载 体蛋白。
[0047] 缀合物可具有过量载体（w/w)或过量糖（w/w)。在一些实施方案中，缀合物可包括 基本相等重量的各物质。
[0048] 所述载体分子可以直接或经由接头共价地缀合至载体。与蛋白的直接连接可以通 过，例如，糖和载体之间的还原胺化来实现，如例如参考文献37和38中所述。所述糖可首 先需要被活化，例如通过氧化。可通过任何已知程序，例如参考文献39和40中所述的程 序，进行经由接头基团连接。连接的优选类型是己二酸接头，其可以通过以下形成：偶联游 离-NH 2基团（例如，通过胺化引入葡聚糖）与己二酸（使用，例如，二酰亚胺活化），然后 将蛋白偶联至所得糖_己二酸中间体[41，42]。连接的另一种优选类型是羰基接头，其可以 通过以下形成：使糖CDI的游离羟基反应[43, 44]，随后与蛋白反应以形成氨基甲酸酯连 接。其他接头包括0 -丙酰胺基[45]、硝基苯基-乙胺[46]、卤代酰基卤化物[47]、糖苷键
[48] 、6_氨基己酸[49]、ADH [50]、(；至C12部分[51]等。还可以使用碳二亚胺缩合[52]。
[0049] PNAG缀合物可以各种方式制备，例如，通过包括以下的方法：a)通过添加包含 马来酰亚胺基团的接头而活化PNAG以形成活化的PNAG ;b)通过添加包含巯基的接头而 活化载体蛋白以形成活化的载体蛋白；和c)使活化的PNAG和活化的载体蛋白反应以形 成PNAG-载体蛋白缀合物；或者通过包括以下的方法：a)通过添加包含巯基的接头而活 化PNAG以形成活化的PNAG ;b)通过添加包含马来酰亚胺基团的接头而活化载体蛋白以形 成活化的载体蛋白；和c)使活化的PNAG和活化的载体蛋白反应以形成PNAG-载体蛋白缀 合物；或者通过包括以下的方法：a)通过添加包含巯基的接头而活化PNAG以形成活化的 PNAG ;b)通过添加包含巯基的接头而活化载体蛋白以形成活化的载体蛋白；和c)使活化 的PNAG和活化的载体蛋白反应以形成PNAG-载体蛋白缀合物。
[0050] 本发明的多肽可以用作用于金黄色葡萄球菌糖的载体蛋白，以形成共价缀合物。 因此，本发明提供免疫原性组合物，其包含（1)本发明的多肽和（2)金黄色葡萄球菌外泌多 糖或金黄色葡萄球菌荚膜糖的缀合物。此类缀合物的进一步特征如上所述。
[0051] 与金黄色葡萄球菌多肽抗原的组合 本发明的多肽可以与其他（非SdrE)金黄色葡萄球菌多肽抗原组合使用。例如，免疫 原性组合物可包含本发明的多肽与参考文献1中公开的任何金黄色葡萄球菌抗原，诸如如 参考文献1中定义的以下抗原中的一种或多种：（I) clfA抗原；（2) clfB抗原；（3) esxA 抗原；（4) esxB 抗原；（5) Hla 抗原；（6) isdA 抗原；（7) isdB 抗原；（8) isdC 抗原；（9) isdG 抗原；（10) isdH 抗原；（11) isdl 抗原；（12) sasF 抗原；（13) sdrC 抗原；（14) sdrD 抗原；（15) spa 抗原；（16) sta006 抗原；和 / 或（17) StaOll 抗原。
[0052] 在一个实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含含有CnaBE3结构域的 本发明的多肽与以下中的一种或多种的组合：（a)突变体溶血素；(b)sta006抗原；（c) StaOll抗原；（d)EsxA抗原；和/或（e)EsxB抗原。
[0053] 金黄色葡萄球菌溶血素（'Hla'）也已知为' a毒素'。在NCTC 8325菌株中，Hla 具有氨基酸序列 SEQ ID N0:28 (GI:88194865):
[0054] Hla是大多数金黄色葡萄球菌菌株产生的重要毒力决定因子，其具有成孔和溶血 活性。抗Hla抗体可以中和毒素在动物模型中的有害作用，并且Hla特别可用于保护免于 肺炎。
[0055] Hla的天然毒性可以在本发明的组合物中通过化学灭活（例如，使用甲醛、戊二醛 或其他交联剂）得以避免，但优选使用缺乏Hla的天然毒性活性、同时保留其免疫原性的突 变体Hla。此类脱毒突变体是本领域已知的。优选的Hla抗原是这样的突变体金黄色葡萄 球菌溶血素，其在SEQ ID NO: 28的残基61、即成熟抗原（即省略前26个N端氨基酸之后） 的残基35具有突变。因此，残基61可以不是组氨酸，并且可替代地是例如Ile，Val，或优选 Leu。也可使用在该位置的His-Arg突变。例如，SEQ ID NO: 29是成熟的突变体Hla-H35L 序列：
并且有用的Hla抗原包含SEQ ID N0:29。其他有用的突变体公开于参考文献1中。
[0056] 本发明使用的Hla突变体可引发识别SEQ ID NO: 28的抗体（例如，当施用于 人时）和/或可包含以下氨基酸序列：（a)与SEQ ID NO:28具有50%或更高同一性（例 如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更 高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 28的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更多 (例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。 这些Hla抗原包括SEQ ID N0:28的变体。（b)的优选片段包含来自SEQ ID N0:28的表位。 其他优选片段缺乏SEQ ID N0:28的C端的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25或更多个）氨基酸和/或SEQ ID N0:28的N端的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25或更多个）氨基酸，同时保留5￡〇10勵:28的至少一个表位。5￡〇10 NO: 28的前26个N端氨基酸可有用地省略。也可以使用C端的截短，例如留下仅50个氨基 酸（SEQ ID NO: 28的残基27-76) [53]。其他有用的Hla抗原公开于参考文献54和55。
[0057] -种有用的Hla抗原是SEQ ID NO: 30 :
〇
[0058] 这具有N端Met，然后是来自表达载体的Ala-Ser二肽，然后是SEQ ID NO: 29。
[0059] ' Sta006'抗原被注释为'高铁色素-结合蛋白'，并且也被称为' FhuD2' [56]。 在 NCTC 8325 菌株中，Sta006 具有氨基酸序列 SEQ ID NO: 31 (GI :88196199):
[0060] 本发明使用的Sta006可引发识别SEQ ID NO: 31的抗体（例如，当施用于人时） 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)与SEQ ID NO:31具有50%或更高同一性（例如60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高）；和 / 或（b)包含SEQ ID NO: 31的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更多（例如， 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。这些 Sta006多肽包括SEQ ID N0:31的变体。（b)的优选片段包含来自SEQ ID N0:31的表位。 其他优选片段缺乏SEQ ID N0:31的C端的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25或更多个）氨基酸和/或SEQ ID N0:31的N端的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25或更多个）氨基酸，同时保留SEQ ID N0:31的至少一个表位。SEQ ID NO: 31的前17个N端氨基酸可有用地省略。Sta006的突变体形式报道于参考文献57。一 种有用的Sta006序列是SEQ ID NO: 32,其在N端具有Met-Ala-Ser-序列，且省略SEQ ID NO:31 的 N 端：
[0061] SEQ ID NO:33是另一种此类序列，但其缺乏SEQ ID NO:32中存在的半胱氨酸：
[0062] ' StaOir 抗原具有 NCTC 8325 中的氨基酸序列 SEQ ID N0:34 (GI:88193872):
[0063] 本发明使用的StaOll抗原可引发识别SEQ ID NO: 34的抗体（例如，当施用于 人时）和/或可包含以下氨基酸序列：（a)与SEQ ID NO:34具有50%或更高同一性（例 如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更 高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 34的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更多 (例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。 这些StaOll多肽包括SEQ ID N0:34的变体。（b)的优选片段包含来自SEQ ID N0:34的表 位。其他优选片段缺乏3￡〇10勵:34的(：端的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25或更多个）氨基酸和/或SEQIDN0:34的N端的一个或多个（例如l、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多个）氨基酸，同时保留SEQ ID N0:34的至少一个表位。SEQ ID NO: 34的前23个N端氨基酸可有用地省略。一种有用的StaOll序列是SEQ ID NO: 35， 其具有N端甲硫氨酸，且省略SEQ ID NO: 34的N端：
[0064] SEQ ID NO:36是另一种此类序列，但其缺乏SEQ ID NO:35中存在的半胱氨酸：
[0065] StaOll可以作为单体或寡聚体存在，其中Ca++离子有利于寡聚化。本发明可以使 用StaOll的单体和/或寡聚体。
[0066] NCTC 8325 菌株中的'EsxA' 抗原具有氨基酸序列 SEQ ID NO: 37 (GI :88194063):
[0067] 本发明使用的EsxA抗原可引发识别SEQ IDNO: 37的抗体（例如，当施用于人时） 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)与SEQ IDNO:37具有50%或更高同一性（例如60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高）；和 / 或（b)包含SEQ IDNO: 37的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更多（例如， 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90 或更多）。这些 EsxA 多肽包括 SEQ IDN0:37的变体。（b)的优选片段包含来自SEQ IDN0:37的表位。其他优选片段缺乏SEQ IDN0:37的C端的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个）氨基酸 和 / 或SEQ IDN0:37 的N 端的一个或多个（例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更 多个）氨基酸，同时保留SEQ IDNO:37的至少一个表位。
[0068] NCTC 8325 菌株中的'EsxB' 抗原具有氨基酸序列 SEQ ID NO: 38 (GI :88194070):
[0069] 本发明使用的EsxB可引发识别SEQ ID NO: 38的抗体（例如，当施用于人时） 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)与SEQ ID NO:38具有50%或更高同一性（例如60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高）；和 / 或（b)包含SEQ ID NO: 38的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更多（例如， 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100 或更多）。这些 EsxB 多肽包括 SEQ ID N0:38的变体。（b)的优选片段包含来自SEQ ID N0:38的表位。其他优选片段缺 乏 SEQ ID N0:38 的 C端的一个或多个（例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多个） 氨基酸和 / 或 SEQ ID N0:38 的 N端的一个或多个（例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多个）氨基酸，同时保留SEQ ID NO:38的至少一个表位。
[0070] 当组合物包括EsxA和EsxB抗原两者时，这些可以作为单一多肽（即作为融合多 肽）存在。因此，单一多肽可以引发抗体（例如，当施用于人时），所述抗体识别SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38两者。所述单一多肽可以包括：⑴与SEQ ID NO:37具有50%或 更高同一,性（例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%、99. 5%或更高）和/或包含SEQ ID NO: 37的至少' n'个连续氨基酸的片段的第一多 肽序列，如上述对于EsxA所定义；和（ii)与SEQ ID NO: 38具有50%或更高同一性（例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高） 和/或包含SEQ ID N0:38的至少'n'个连续氨基酸的片段的第二多肽序列，如上述对于 EsxB所定义。第一和第二多肽序列可以是任一顺序，N至C端。SEQ ID N0:39 ('EsxAB'） 是此类多肽的实例，其具有六肽接头ASGGGS (SEQ ID N0:40):
[0073] 因此，一种有用的多肽包含这样的氨基酸序列，其（a)与SEQ IDN0:41具有80% 或更高同一1性（例如，80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更 高）；和/或（b)包含来自SEQ IDNO: 41的氨基酸1-96的至少'n'个连续氨基酸的片段和 来自SEQ IDNO:41的氨基酸103-205的至少'n'个连续氨基酸的片段两者，其中'n'为7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或 更多）。这些多肽（例如，SEQ IDN0:42)可以引发抗体（例如，当施用于人时），所述抗体 识别包含SEQ IDNO: 37的野生型葡萄球菌蛋白和包含SEQ IDNO: 38的野生型葡萄球菌蛋 白两者。因此，免疫应答将识别抗原EsxA和EsxB两者。（b)的优选片段提供来自SEQ ID NO:37的表位和来自SEQ IDNO:38的表位。
[0074] 尽管SEQ IDN0:30、32、35和42是组合中有用的氨基酸序列，但本发明不限于这 些精确的序列。因此，这些序列中的1个、2个、3个或所有4个可以独立地通过至多达5个 单一氨基变化（即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或插入）而修饰，条件是修饰 的序列可引发仍结合至由未修饰的序列组成的多肽的抗体。例如，SEQ IDN0:33、36和43 是SEQ IDNO:32、35和42的此类变体。
[0075] 在一个优选的实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含：(a)本发明的多 肽，其包含CnaBE3结构域：(b)突变体溶血素，其包含SEQ ID NO: 30 ; (c) sta006抗原，其 包含 SEQ ID N0:32;(d) StaOll 抗原，其包含 SEQ ID N0:35;和（d) EsxAB 抗原，其包含 SEQ ID NO:42〇
[0076] 在另一个优选的实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含：(a)本发明的 多肽，其包含CnaBE3结构域：(b)突变体溶血素，其包含SEQID NO:30 ;(c) sta006抗原， 其包含SEQID NO:33;(d) staO11抗原，其包含SEQID NO:36;和（d) EsxAB抗原，其包含 SEQID NO:43〇
[0077] 与非葡萄球菌抗原的组合 本发明的抗原组中鉴定的个别抗原可以与非葡萄球菌抗原、和特别是与来自医院感染 相关的细菌的抗原组合使用。因此，本发明提供包含以下的组合的免疫原性组合物： (1) 本发明的多肽；和 (2) 选自以下的一种或多种抗原：艰难梭状芽胞杆菌；绿脓假单胞菌；白色念珠菌 ;和肠外致病性大肠杆菌co7i)。
[0078] 用于与本发明的金黄色葡萄球菌抗原组合使用的其他合适的抗原列于参考文献 58的第33-46页。
[0079] 本发明使用的多肽 本发明使用的多肽可采取各种形式（例如天然多肽、融合体、糖基化多肽、非糖基化多 肽、脂化（Iipidated)多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蔻酰化多肽、非 肉豆蔻酰化多肽、单体多肽、多聚体多肽、颗粒多肽、变性多肽等）。
[0080] 本发明使用的多肽可通过各种方式（例如重组表达、从细胞培养物纯化、化学合 成等）制备。优选重组表达的蛋白。
[0081] 本发明使用的多肽优选以纯化或基本纯化形式（即基本不含其他多肽（例如不含 天然存在的多肽）、特别是不含其他葡萄球菌或宿主细胞多肽）提供，并且通常至少约50% 纯（以重量计），通常至少约90%纯，即组合物的少于约50%，更优选少于约10% (例如 5%)由其他表达的多肽构成。因此，组合物中的抗原与表达该分子的完整生物体分离。
[0082] 本发明使用的多肽优选为葡萄球菌多肽。
[0083] 术语"多肽"是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，其可 包含修饰的氨基酸，且其可被非氨基酸打断。该术语也涵盖已天然或通过干预修饰的氨基 酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与 标记组分缀合。例如，还包括含有一个或多个氨基酸类似物（包括例如非天然氨基酸等） 以及本领域已知的其他修饰的多肽。多肽可以作为单链或结合链产生。
[0084] 本发明提供包含序列-P-Q-或-Q-P-的多肽，其中：-P-是如上文定义的氨基酸序 列，-Q-不是如上文定义的序列，即本发明提供融合蛋白。当-P-的N端密码子不是ATGdS 该密码子未出现在多肽的N端时，它将被翻译成该密码子的标准氨基酸，而不是Met。然而， 当该密码子在多肽的N端时，它将被翻译成Met。-Q-部分的实例包括但不限于组氨酸标签 (即His" (SEQ ID N0:45)，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多）、麦芽糖结合蛋白或谷胱 甘肽-S-转移酶（GST)。
[0085] 本发明还提供用于产生本发明的多肽的方法，其包括在诱导多肽表达的条件下培 养用本发明的核酸转化的宿主细胞的步骤。
[0086]尽管本发明的多肽的表达可以在葡萄球菌中发现，但本发明将通常使用异源宿 主用于表达（重组表达）。异源宿主可以是原核（例如细菌）或真核生物。其可以是大 肠杆菌（凡cWi)，但其他合适的宿主包括枯草芽孢杆菌霍乱弧菌 (Ki友rio cAo/erae)、伤寒沙门氏菌tjpAi)、鼠伤寒沙门氏菌 皿ritt?)、乳酰胺奈瑟氏菌（Afeisseria 7ac(a?ica)、灰色奈瑟氏菌（Afeisseria ciflerea)、分枝杆菌dcoAacteria)(例如结核分支杆菌〇K teAercWiosis))、酵母等。与 编码本发明的多肽的野生型金黄色葡萄球菌基因相比，改变密码子以优化此类宿主中的表 达效率而不影响所编码的氨基酸是有帮助的。
[0087]本发明提供用于产生本发明的多肽的方法，其包括通过化学方式合成所述多肽的 至少部分的步骤。
[0088]核酸 本发明还提供编码本发明的多肽的核酸。其还提供核酸，所述核酸包含编码一种或多 种本发明的多肽的核苷酸序列。
[0089]本发明的核酸优选以纯化或基本纯化的形式提供，即基本不含其他核酸（例如不 含天然存在的核酸），特别是不含其他葡萄球菌或宿主细胞核酸，通常至少约50%纯（以重 量计），且通常至少约90%纯。本发明的核酸优选为葡萄球菌核酸。
[0090]本发明的核酸可以多种方式制备，例如，完全或部分化学合成（例如DNA的亚磷 酰胺合成）、通过使用核酸酶（例如限制性酶）消化较长核酸、通过连接较短核酸或核苷酸 (例如使用连接酶或聚合酶）、由基因组或cDNA文库等制备。
[0091]术语"核酸"通常包括任何长度的核苷酸聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖 核苷酸和/或其类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体。它也包括DNA或RNA类似物， 诸如含有修饰骨架（例如肽核酸（PM)或硫代磷酸酯）或修饰碱基的类似物。因此，本发明 包括 mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、支链核酸（branched nucleic acids)、 质粒、载体、探针、引物等。当本发明的核酸采用RNA形式时，它可能具有或可能不具有5' 帽。
[0092]本发明的核酸可以是载体的部分，即设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的 核酸构建体的部分。载体可以是，例如，设计用于分离、增殖和复制插入的核苷酸的"克隆载 体"，设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的"表达载体"，设计用于导致产生重组病毒或 病毒样颗粒的"病毒载体"，或包含多于一种载体类型的属性的"穿梭载体"。优选的载体是 质粒。"宿主细胞"包括单一细胞或细胞培养物，其可以是或已经是外源核酸的受体。宿主 细胞包括单一宿主细胞的后代，并且由于天然、偶然或有意的突变和/或改变，所述后代与 原始亲本细胞不必需完全相同（在形态或总DNA互补方面）。宿主细胞包括用本发明的核 酸体内或体外转染或感染的细胞。
[0093]可使用本发明的核酸，例如：来产生多肽；作为用于检测生物样品中的核酸的杂 交探针；来产生额外的核酸拷贝；来产生核酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物或探针； 或作为形成三链的寡核苷酸。
[0094]本发明提供用于产生本发明的核酸的方法，其中所述核酸部分或完全使用化学方 式合成。
[0095] 本发明提供包含本发明的核苷酸序列的载体（例如克隆或表达载体）和用此类载 体转化的宿主细胞。
[0096] 根据本发明的核酸扩增可以是定量的和/或实时的。
[0097] 菌株和变体 金黄色葡萄球菌的几种菌株的基因组序列是可得的，包括MRSA菌株N315和Mu50 [59]、 MW2、N315、COL、MRSA252、MSSA476、RF122、USA300 (剧毒）、JHl 和 JH9 的那些。可使用标 准的搜索和比对技术在任何这些（或其他）进一步基因组序列中鉴定来自Newman菌株的 SdrE (SEQ ID NO: 1)的同源物。而且，可得的来自Newman菌株的序列可用于设计引物用于 扩增来自其他菌株的同源序列。因此，本发明不限于该菌株，而是涵盖来自金黄色葡萄球菌 的其他菌株的此类变体和同源物，以及非天然变体。通常，SEQ ID NO: 1的合适变体包括其 等位基因变体、其多态性形式、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其突变体等。
[0098] 因此，例如，与本文中的SEQ IDNO相比，本发明使用的多肽可包括一个或多个 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9等）氨基酸取代，诸如保守取代（即用具有相关侧链的另一种氨 基酸取代一种氨基酸）。遗传编码的氨基酸通常分为四类：（1)酸性氨基酸，即天冬氨酸、谷 氨酸；（2)碱性氨基酸，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；（3)非极性氨基酸，即丙氨酸、缬氨酸、亮 氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和（4)不带电荷的极性氨基酸，即甘 氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和 酪氨酸一起归类为芳香族氨基酸。通常，这些家族内的单一氨基酸的取代对生物活性不具 有主要影响。相对于SEQ IDNO序列，多肽还可包括一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、 9等）单一氨基酸缺失。相对于SEQ IDNO序列，多肽也可包括一个或多个（例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9等）插入（例如各1、2、3、4或5个氨基酸）。
[0099] 类似地，本发明使用的多肽可包含氨基酸序列，所述氨基酸序列： 鲁与序列表中公开的序列相同（即100%相同）； ?与序列表中公开的序列共享序列同一性（例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高）； ?与（a)或（b)的序列相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个（或更多个）单一氨 基酸改变（缺失、插入、取代），其可以在分开的位置或可以是连续的；且 鲁当使用逐对比对算法与来自序列表的特定序列比对时，每个从N端向C端移动 氨基酸的窗口（使得对于延伸至/7个氨基酸的比对，当/?>虐t，存在个此类窗口）具 有至少X .y个相同的比对氨基酸，其中：x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、 150、200 ;y 选自 0? 50、0. 60、0. 70、0. 75、0. 80、0. 85、0. 90、0. 91、0. 92、0. 93、0. 94、0. 95、 0. 96、0. 97、0. 98、0. 99;且如果x*y不是整数，则将其向上入至（rounded up to)最近的整 数。优选的成对比对算法是Needleman-Wunsch整体比对算法[60]，使用默认参数（例如缺 口开放罚分=10. 0，缺口延伸罚分=0. 5,使用EBL0SUM62积分矩阵）。该算法以EMBOSS 软件包中的工具方便地执行[61]。
[0100] 在组（C)内，缺失或取代可在N端和/或C端，或者可以在两端之间。因此，截短 是缺失的一个实例。截短可涉及在N端和/或C端缺失至多达40个（或更多个）氨基酸。 N端截短可移除前导肽，例如以促进在异源宿主中的重组表达。C端截短可移除锚定序列， 例如以促进在异源宿主中的重组表达。
[0101] 通常，当抗原包含与来自序列表的完整金黄色葡萄球菌序列不同的序列时（例 如，当它包含与之具有〈100%序列同一性的序列表时，或当它包含其片段时），优选的是， 在各种单独情况下，该抗原可引发抗体，所述抗体识别相应的完整金黄色葡萄球菌序列。
[0102] 免疫原性组合物和药物 本发明的多肽可用作免疫原性组合物中的组分。本发明的免疫原性组合物可用作疫 苗。根据本发明的疫苗可以是预防性的（即预防感染）或治疗性的（即治疗感染），但通常 是预防性的。
[0103] 因此，组合物可以是药学上可接受的。它们将通常包括除了所述抗原以外的组分， 例如它们通常包括一种或多种药物载体和/或赋形剂。对此类组分的充分讨论可见参考文 献62。
[0104] 组合物将通常是水性形式，特别是在施用点，但它们也可以非水性液体形式或以 干燥形式（例如，作为冻干物）呈现。一些疫苗以水性形式制备，然后也以水性形式填装和 分布和施用，但其他疫苗在制备过程中冻干，并在使用时重构成水性形式。因此，本发明的 组合物可以干燥，诸如冻干制剂。
[0105] 该组合物可包括防腐剂，诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，优选的是，疫苗应当基 本不含（即少于5 μg/ml)含汞物质，例如不含硫柳汞。更优选不含汞的疫苗。特别优选不 含防腐剂的疫苗。
[0106] 为了改善热稳定性，组合物可包括温度保护剂。
[0107]为了控制张度，优选包括生理盐，诸如钠盐，例如以控制张度。优选氯化钠（NaCl)， 其可以以1至20mg/ml，例如约10±2mg/ml NaCl或9 mg/ml存在。可存在的其他盐包括氯 化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
[0108]组合物将通常具有 200 mOsm/kg 至 400 mOsm/kg，优选 240-360 mOsm/kg，或 290-310 mOsm/kg 的摩尔渗透压浓度（osmolality) 〇
[0109] 组合物可包括淡水（例如，w. f. i.)中的多肽，但通常将包括一种或多种缓冲剂。 典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸 缓冲剂（特别是具有氢氧化铝佐剂）；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂通常将包括在5-20mM范 围内。
[0110] 组合物的pH将通常为5.0至8. 1，更通常6.0至8.0,例如6. 5至7. 5,或7.0至 7. 8〇
[0111] 该组合物优选是无菌的。该组合物优选无热原，例如每剂量含有〈1 EU(内毒素单 位，标准量度），优选每剂量〈0.1 EU。该组合物优选不含谷蛋白。
[0112] 组合物应当适于施用于动物（和，特别是人）患者，因此，包括人和兽医用途两者。 它们可以用于引起患者中的免疫应答的方法中，其包括将所述组合物施用于患者的步骤 (参见下文）。组合物可以在主体暴露于病原体之前和/或主体暴露于病原体之后施用。
[0113] 药物组合物可以单位剂型来制备。在一些实施方案中，单位剂量可以具有 0. 1-1. 0ml，例如，约0. 5ml的体积。
[0114] 所述组合物可包括用于单次免疫的材料，或者可包括用于多次免疫的材料（即 "多剂量"药剂盒）。多剂量配置优选包括防腐剂。作为多剂量组合物中包括防腐剂的替代 方案（或除此以外），所述组合物可包含在具有用于移取材料的无菌接头的容器中。
[0115] 人疫苗通常以约0? 5ml的剂量体积施用，尽管可将一半剂量（即约0? 25ml)施用 于儿童。
[0116] 本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物（例如，含有单位剂量）的递送装置 (例如注射器、雾化器、喷雾器、吸入器、皮肤贴片等）。该装置可用于向哺乳动物施用所述 组合物。
[0117] 本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物（例如，含有单位剂量）的无菌容器 (例如，小瓶）。
[0118] 本发明还提供本发明的免疫原性组合物的单位剂量。
[0119] 本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物的气密封容器。合适的容器包括例如 小瓶。
[0120] 金黄色葡萄球菌感染可影响身体的各个区域，所以，可将本发明的组合物以各种 形式制备。例如，可将所述组合物制备为可注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可制备适合 在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式（例如冻干组合物或喷雾冷冻干燥组合 物）。所述组合物可以制备用于局部施用。所述组合物可以制备用于口服施用。所述组合 物可以制备用于经鼻施用，例如作为喷雾剂。可将所述组合物设计为药剂盒形式，使得在临 施用于患者之前重构组合的组合物。此类药剂盒可包含一种或多种液体形式的抗原和一种 或多种冻干抗原。
[0121] 当组合物在临使用前制备（例如，当组分以冻干形式呈现时）且作为药剂盒呈现 时，该药剂盒可包含两个小瓶，或者可包含一个即填充（ready-filled)的注射器和一个小 瓶，其中注射器的内容物用于在注射前重新活化小瓶的内容物。
[0122] 用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的一种或多种抗原，以及需要的任何 其他组分。"免疫有效量"意指以单一剂量或一系列剂量的部分向个体施用该量对于治疗或 预防是有效的。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类组（例 如非人灵长类动物、灵长类动物等）、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫 苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其他相关因素而不同。预期所述量将落入可通过常 规试验确定的相对宽范围内。当组合物中包括多于一种抗原时，则两种抗原可以彼此相同 剂量或以不同剂量存在。
[0123] 本发明的免疫原性组合物将通常包括一种或多种免疫佐剂。可在本发明的组合 物中使用的佐剂包括，但不限于：⑴水包油乳液、（ii)至少一种铝盐或（iii)至少一种 TLR激动剂。在一些实施方案中，组合物包括铝盐和TLR激动剂的混合物，且TLR激动剂可 以吸附至铝盐以改善佐剂效果[86]。这可导致更好（更强、或更快速地实现）的免疫应答 和/或可允许减少组合物中铝的量，同时维持等效的佐剂作用。
[0124] 当组合物包括（一种或多种）铝盐佐剂时，则本发明的多肽可以吸附至（一种或 多种）盐。当组合物包括铝盐佐剂时，则其优选不包括水包油乳液佐剂。相反，当组合物包 括水包油乳液佐剂时，则其优选不包括铝盐佐剂。
[0125] 水包油乳液佐剂 免疫原性组合物可用水包油乳液佐剂化。各种此类乳液是已知的，例如MF59和AS03 都在欧洲被批准。
[0126] 有用的乳液佐剂，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，其中所述油 和表面活性剂是可生物降解的（可代谢的）和生物相容的。乳液中的油滴通常具有亚微米 直径，且这些小尺寸可以容易地使用提供稳定乳液的微流化床或通过替代方法（例如，相 反转）来实现。其中至少80% (以数目计）的液滴具有小于220nm的直径的乳液是优选 的，因为它们可进行过滤除菌。
[0127] 所述乳液可以包括来自动物（诸如鱼）和/或植物来源的油。植物油的来源包括 坚果、种子和谷物。最普遍可得的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油例举坚果油。可以使用 (例如获得自霍霍巴豆的）霍霍巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。 在谷物组中，玉米油是最容易获得的，但也可以使用其他谷物（诸如小麦、燕麦、黑麦、稻、 画眉草、黑小麦等）的油。可从坚果和种子油开始，通过水解、分离和酯化适当材料制备不 是种子油中天然存在的甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。来自哺乳动物乳汁的脂肪 和油类是可代谢的，因此可以与本发明使用。从动物来源获得纯油所必需的分离、纯化、皂 化和其他方式的程序是本领域众所周知的。
[0128] 大多数鱼含有可容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油（诸如鲸 蜡）例举本文中可使用的几种鱼油。以5-碳异戊二烯单元生化合成许多支链油，其统称为 萜类化合物。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲 基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳六烯，其为特别优选用于与本发明使用（参见下文）。角鲨 烯的饱和类似物角鲨烷也是有用的油。鱼油，包括角鲨烯和角鲨烷，易于从商业来源获得， 或可以通过本领域已知的方法获得。其他优选油是生育酚（参见下文）。可以使用油的混 合物。
[0129]佐剂乳液中总油（体积％ )的优选量是1至20%，例如2-10%。5体积％的角鲨烯 含量是特别有用的。
[0130] 表面活性剂可以通过其'HLB'（亲水/亲脂平衡）分类。本发明优选的表面活性 剂具有至少10,例如约15的HLB。可以与本发明使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙 烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂（通常称为吐温），特别是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80 ; 以D0WFAX?商品名销售的环氧乙烷（EO)、环氧丙烷（PO)和/或环氧丁烷（BO)的共聚物， 诸如直链EP/P0嵌段共聚物；重复的乙氧基（氧基-1，2-乙二基）基团数量不同的辛苯聚 醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇-9 (曲通（Triton) X-100,或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）； (辛基苯氧基）聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂，诸如磷脂酰胆碱（卵磷脂）； 壬基苯酚乙氧基化物，诸如Tergitol ? NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚 氧乙烯脂肪醚（已知为苄泽（Brij)表面活性剂），诸如三甘醇单月桂基醚（苄泽30);和脱 水山梨糖醇酯（通常已知为司盘（SPAN))，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯（司盘85)和脱水山 梨糖醇单月桂酸酯。
[0131] 本发明使用的乳液优选包括非离子表面活性剂。用于乳液中包括的优选表面活性 剂是聚山梨醇酯80 (聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯；吐温80)、司盘85 (脱水山梨糖醇三 油酸酯）、卵磷脂或曲通X-100。可以使用表面活性剂的混合物，例如聚山梨醇酯80和脱水 山梨糖醇三油酸酯的混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯（诸如聚山梨醇酯80 (吐温80)) 和辛苯聚醇（诸如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（曲通X-100))的组合也是有用的。另一种 有用的组合包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。当使用表面 活性剂的混合物时，则混合物的HLB根据它们的相对权重（以体积计）计算，例如，聚山梨 醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的优选1:1混合物具有8. 4的HLB。
[0132] 佐剂乳液中总表面活性剂（体积％ )的优选量是0. 1至2%，例如0. 25-2%。1体 积％的总含量是特别有用的，例如0. 5体积％的聚山梨醇酯80和0. 5体积％的脱水山梨糖 醇三油酸酯。
[0133] 有用的乳液可使用已知的技术制备，例如参见参考文献63-646984。
[0134] 可与本发明使用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于： ?角鲨烯、聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的亚微米（submicron)乳液。所 述乳液的体积组成可以是约5%角鲨烯、约0. 5%聚山梨醇酯80和约0. 5%脱水山梨糖醇 三油酸酯。在重量方面，这些比率变为4. 3%角鲨烯、0. 5%聚山梨醇酯80和0. 48%脱水山 梨糖醇三油酸酯。这种佐剂已知为'MF59' [70-72]，如参考文献83的第10章和参考文献 84的第12章中更详细描述。MF59乳液有利地包括柠檬酸根离子，例如IOmM柠檬酸钠缓冲 液。 鲁角鲨烯、生育酚和聚山梨醇酯80的乳液。所述乳液可包括磷酸盐缓冲盐水。这些 乳液可具有2-10%角鲨烯、2-10%生育酚和0. 3-3%聚山梨醇酯80,且角鲨烯：生育酚的重 量比优选< 1 (例如0. 90)，因为这可以提供更稳定的乳液。角鲨烯和聚山梨醇酯80可以 约5:2的体积比或以约11:5的重量比存在。因此，三种组分（角鲨烯、生育酚、聚山梨醇酯 80)可以1068:1186:485或约55:61:25的重量比存在。该佐剂已知为'AS03'。另一种这 种类型的有用乳液每个人剂量可包含0. 5-10 mg角鲨烯、0. 5-11 mg生育酚和0. 1-4 mg聚 山梨酸酯80 [73]，如上述讨论的比率。 鲁其中皂苷（例如QuilA或QS21)和固醇（例如胆固醇）结合为螺旋胶束的乳液
[74] 〇 ?具有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳液。如参 考文献75中所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌 醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。亚微米液滴尺寸是有利的。 ?包含角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂（例如聚氧乙 烯（12)十六十八烷基醚）和疏水性非离子型表面活性剂（例如脱水山梨糖醇酯或二缩甘 露醇酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯或'司盘80'）的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或 其中至少90%油滴（以体积计）具有小于200nm的尺寸[76]。该乳液也可包括以下中的 一种或多种：醛糖醇；冷冻保护剂（例如，糖，诸如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖）；和/或 烷基聚糖苷（alkylpolyglycoside)。它也可以包括TLR4激动剂，诸如其化学结构不包括糖 环的TLR4激动剂[77]。此类乳液可以冻干。'AF03'产品是一种此类乳液。
[0135] 本发明使用的优选的水包油乳液包含角鲨烯和聚山梨醇酯80。
[0136] 所述乳液在疫苗制造过程中可以与抗原混合，或者它们可以在递送时临时混合。 因此，在一些实施方案中，所述佐剂和抗原可单独地保存在包装或分销（distributed)的 疫苗中，其备用于在使用时的最终配制。在混合时（在批量制造过程中，或在使用点），抗原 将通常是水性形式，使得通过混合两种液体制备最终疫苗。所述两种液体的混合体积比可 变（例如5 : 1-1 : 5)，但通常约为1 : 1。如果乳液和 抗原在试剂盒中分开储存，则该产 品可作为含有乳液的小瓶和含有水性抗原的小瓶呈现，用于混合以得到佐剂化的液体疫苗 (单剂量或多剂量）。
[0137] 本发明的优选乳液包括角鲨烯油。这通常从鲨鱼油制备，但替代来源也是已知的， 例如参见参考文献78 (酵母）和79 (橄榄油）。含有少于661皮克PCB/克角鲨烯（TEQ)的 角鲨烯对于与本发明使用是优选的，如参考文献80所公开。所述乳液优选从高纯度的角鲨 烯制备，例如，如参考文献81中公开通过双蒸馏制备。
[0138] 当组合物包括生育酚时，可使用a、0、y、S、e或I生育酚中的任何一种，但 优选a-生育酚。生育酚可采用几种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，诸 如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可使用D-a-生育酚和DL-a-生育酚两者。生育酚具有 抗氧化特性，其有助于稳定该乳液[82]。优选的a-生育酚是DL-a-生育酚，该生育酚的 优选盐是琥珀酸盐。
[0139] 铝盐佐剂 本发明的组合物可包括铝盐佐剂。目前使用的铝盐佐剂通常被称为"氢氧化铝"或"磷 酸铝"佐剂。然而，这些是方便的名称，因为无一是存在的实际化合物的精确描述（例如， 参见参考文献83的第9章，和参考文献84的第4章）。本发明可使用可用作佐剂的"氢氧 化物"或"磷酸盐"中的任一者。如果TLR激动剂的吸附是期望的，则包括氢氧根离子的铝 盐是优选的，因为这些氢氧根离子可容易经受配体交换用于吸附TLR激动剂。因此，用于吸 附TLR激动剂的优选的盐是氢氧化铝和/或羟基磷酸铝。这些具有可容易经历与含磷基团 (例如磷酸盐，膦酸盐）配体交换的表面羟基部分以提供稳定的吸附。氢氧化铝佐剂因此最 优选的。
[0140] 已知为"氢氧化铝"的佐剂通常是羟基氧化铝盐，其通常是至少部分结晶的。可通 过式AlO (OH)代表的羟基氧化错（Aluminium oxyhydroxide)可通过红外（IR)光谱学，特别 是通过在K^OcnT1的吸附带和在3090 - 3100cm +1的强肩部存在与其他铝化合物诸如氢氧 化铝Al (OH) 3进行区分（参考文献83的第9章）。氢氧化铝佐剂的结晶度通过在半高的衍 射带的宽度（WHH)来反映，其中差结晶颗粒显示由于较小晶粒尺寸导致的较大线增宽。表 面积随着WHH增加而增加，且具有较高WHH值的佐剂已被视为具有对于抗原吸附的较大能 力。纤维状形态（例如，如透射电子显微照片所见）对于氢氧化铝佐剂是典型的，例如，具 有直径约2nm的针样颗粒。氢氧化铝佐剂的PZC通常为约11，即佐剂本身在生理pH具有正 表面电荷。对于氢氧化铝佐剂已经报道在PH7. 4 1.8-2. 6 mg蛋白/mg Al+++的吸附能力。
[0141] 已知为"磷酸铝"的佐剂通常是羟基磷酸铝，经常还含有少量硫酸。它们可通过沉 淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中的羟基的程度。羟基磷酸盐 通常具有〇. 3至0. 99的PO4Al摩尔比。羟基磷酸盐可通过羟基的存在与严格（strict) AlPO4E分开来。例如，在3164cm ―1 (例如，当加热至200°C时）的IR谱带表明结构性羟基 的存在（参考文献83的第9章）。
[0142] 磷酸铝佐剂的PO4Al3+摩尔比将通常为0. 3至1. 2,优选0. 8至1. 2,并且更优选 0.95土0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其对于羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4Al摩尔比为 0.84至0.92的无定形的羟基磷酸铝，其以0.6mg Al3+Ail包括。磷酸铝将通常是颗粒。在 任何抗原吸附后，颗粒的典型直径是范围0. 5-20 ym(例如约5-10 ym)。对于磷酸铝佐剂已 经报道在pH7. 4 0? 7-1. 5 mg蛋白/mg Al+++的吸附能力。
[0143] 磷酸铝的PZC与磷酸根对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度可取决于用于通 过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而不同。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度 (更多磷酸根=更酸性PZC)或通过添加缓冲剂诸如组氨酸缓冲剂（使PZC碱性更强）改 变PZC。根据本发明使用的磷酸铝将通常具有4. O至7. 0,更优选5. O至6. 5,例如约5. 7的 PZC0
[0144] 在溶液中，磷酸铝和氢氧化物佐剂两者趋于形成直径为1-10 ym的稳定的多孔聚 集体[85]。
[0145] 组合物可包括氢氧化铝和磷酸铝两者的混合物，且组分可以被吸附到这些盐中的 一种或两种。
[0146] 用于制备本发明的组合物的磷酸铝溶液可含有缓冲剂（例如，磷酸盐或组氨酸或 Tris缓冲剂），但这不总是必要的。磷酸铝溶液优选是无菌且无热原的。磷酸铝溶液可包 括游离的水性磷酸根离子，例如以I. 〇至20mM、优选5至15 mM、更优选约10 mM的浓度存 在。磷酸铝溶液还可以包含氯化钠。氯化钠的浓度优选在0. 1至100 mg/ml的范围内（例 如，0.5-50 mg/ml，1-20 mg/ml，2_10 mg/ml)，并且更优选约 3土1 mg/ml。NaCl 的存在有利 于在吸附抗原之前正确测量pH。
[0147] 本发明的组合物理想地包括小于0.85mg Al+++/单位剂量。在本发明的一些实施 方案中，组合物包括小于0. 5mg Al+++/单位剂量。Al+++的量可以小于该值，例如<25〇Mg、 <200Mg、〈150 y g、〈100 y g、〈75 y g、〈50 y g、〈25 y g、〈10 y g 等。
[0148] 当本发明的组合物包括基于铝的佐剂，组分的沉降可在储存过程中发生。所述组 合物因此应当在向患者施用之前摇动。经摇动的组合物将是混浊的白色悬浮液。
[0149] TLR激动剂 在一些实施方案中，本发明的组合物包括TLR激动剂，即，可以激动Tol 1样受体的化合 物。最优选地，TLR激动剂是人TLR的激动剂。TLR激动剂可以活化TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、 TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLRll中任一者；优选它可以活化人TLR4或人TLR7。
[0150] 在优选的实施方案中，本发明的组合物包括TLR激动剂（诸如TLR7激动剂），其包 括膦酸酯基。这种膦酸酯基可以允许激动剂吸附至不溶性铝盐[86]。
[0151] 治疗方法和疫苗的施用 本发明还提供在哺乳动物中引起免疫应答的方法，其包括施用有效量的本发明的免疫 原性组合物的步骤。所述免疫应答优选为保护性的，并且优选涉及抗体和/或细胞介导的 免疫。所述方法可以引起加强应答。
[0152] 本发明还提供本发明的免疫原性组合物，其用于治疗中，例如，用于在哺乳动物中 引起免疫应答的方法（如上所述）中。
[0153] 本发明还提供本发明的多肽在制备用于在哺乳动物引起免疫应答（如上所述）的 药物中的用途。
[0154] 通过这些用途和方法在哺乳动物中引起免疫应答，所述哺乳动物可以受保护免于 金黄色葡萄球菌感染，包括医院感染。更具体地，哺乳动物可以受保护免于皮肤感染、肺炎、 脑膜炎、骨髓炎心内膜炎、中毒性休克综合征和/或败血症。
[0155] 本发明还提供包含第一组分和第二组分的药剂盒，其中第一组分和第二组分都不 是如上所述的本发明的组合物，但其中可将第一组分和第二组分组合以提供如上所述的本 发明的组合物。所述药剂盒可以进一步包括包含以下中的一种或多种的第三组分：说明书、 注射器或其他递送装置、佐剂或药学上可接受的配制溶液。
[0156] 所述哺乳动物优选为人。当所述疫苗用于预防性用途时，人优选是儿童（例如幼 童或婴儿）或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人优选是青少年或成人。意图用于儿童的疫 苗也可施用于成人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。可以根据本发明有用地免疫的 其他哺乳动物是奶牛、狗、马和猪。
[0157] 检查治疗性治疗的效力的一种方式涉及在施用本发明的组合物之后监测金黄色 葡萄球菌感染。检查预防性治疗的效力的一种方式涉及施用所述组合物之后监测针对本发 明的组合物中的抗原的全身免疫应答（诸如监测IgGl和IgG2a产生的水平）和/或粘膜 免疫应答（诸如监测IgA产生的水平）。通常，在免疫后但在攻击前测定抗原特异性血清抗 体应答，而在免疫后且攻击后测定抗原特异性粘膜抗体应答。
[0158] 评价本发明的组合物的免疫原性的另一种方式是重组表达蛋白，其用于通过免疫 印迹和/或微阵列筛选患者血清或粘膜分泌物。蛋白和患者样品之间的阳性反应表明所述 患者已经对考虑的蛋白产生免疫应答。该方法也可用于鉴定免疫显性抗原和/或抗原内的 表位。
[0159] 通过用疫苗组合物攻击金黄色葡萄球菌感染的动物模型（例如豚鼠或小鼠），也 可在体内测定疫苗组合物的效力。具体而言，存在三种用于研宄金黄色葡萄球菌感染性疾 病的有用动物模型，即：（i)鼠脓肿模型[87]，（ii)鼠致死感染模型[87]和（iii)鼠肺炎 模型[88]。脓肿模型着眼于静脉内攻击后小鼠肾脏中的脓肿。致死感染模型着眼于通过静 脉内或腹膜内途径被通常致死剂量的金黄色葡萄球菌感染后存活的小鼠的数目。肺炎模型 还着眼于存活率，但使用鼻内感染。有用的疫苗在这些模型中的一种或多种中可以是有效 的。例如，对于一些临床情况下，其可对于保护免于肺炎是期望的，而无需防止血液传播或 促进调理作用；在其他情况下，主要愿望可以是防止血液传播。不同的抗原，和不同的抗原 组合，可有助于有效疫苗的不同方面。
[0160] 本发明的组合物将通常直接施用于患者。直接递送可通过肠胃外注射（例如皮 下、皮内、腹膜内、静脉内、肌内或至组织间隙），或经粘膜，诸如通过直肠、经口（例如片剂、 喷雾）、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其他粘膜施用完成。优选肌内注射。
[0161] 本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫，优选引发增强的全身和/或粘膜免疫。
[0162] 优选地，增强的全身和/或粘膜免疫反映为增强的THl和/或TH2免疫应答。优 选地，增强的免疫应答包括IgGl和/或IgG2a和/或IgA产生的增加。
[0163] 剂量可通过单剂量时间表或多剂量时间表。多剂量可用于初次免疫时间表和/或 加强免疫时间表。在多剂量时间表中，各个剂量可通过相同或不同的途径（例如肠胃外引 发和粘膜加强，粘膜引发和肠胃外加强等）给予。多个剂量将通常间隔至少1周（例如约 2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等）进行施用。
[0164] 根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人两者。因此，人患者可以小于1岁、 1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的优选患者为老人（例如250岁、260岁， 且优选265岁）、幼儿（例如〈5岁）、住院患者、保健护理人员、武装服务和军事人员、孕妇、 慢性病人或免疫缺陷患者。然而，所述疫苗不仅适用于这些组，还可更广泛地用于人群。
[0165] 可将本发明产生的疫苗与其他疫苗基本上同时（在相同用药咨询或访问健康护 理专业人员或疫苗接种中心期间）施用于患者，例如与流感疫苗、麻瘆疫苗、腮腺炎疫苗、 风瘆疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、缀 合的B型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌 缀合物疫苗（诸如四价A-C-W135-Y疫苗）、呼吸道合胞病毒疫苗等基本上同时施用于患者。 适于共同施用的其他非葡萄球菌疫苗可以包括参考文献58的第33-46页上列出的一种或 多种抗原。
[0166] 核酸免疫 上述免疫原性组合物包括来自金黄色葡萄球菌的多肽抗原。然而，在所有情况下，所述 多肽抗原可用编码那些多肽的核酸（通常是DNA或RNA)替换，以得到基于核酸免疫的组合 物、方法和用途。核酸免疫现在是已开发的领域（例如参见参考文献89-96等）。
[0167] 编码免疫原的核酸在递送至患者后在体内表达，然后所表达的免疫原刺激免疫系 统。活性成分将通常采用核酸载体的形式，其包含：（i)启动子；（ii)可操作地连接至启动 子的编码免疫原的序列；和任选（iii)选择性标记。优选的载体可进一步包含（iv)复制起 点；和（V)位于（ii)下游且与其可操作连接的转录终止子。通常，（i)和（V)将是真核的， (iii)和（iv)将是原核的。
[0168]优选的启动子是病毒启动子，例如来自巨细胞病毒（CMV)的启动子。除了启动子， 载体还可以包括转录调节序列（例如增强子），其与启动子功能性相互作用。优选的载体包 括立即早期CMV增强子/启动子，更优选的载体还包括CMV内含子A。将该启动子可操作地 连接至编码免疫原的下游序列，使得编码免疫原的序列的表达在该启动子的控制之下。
[0169] 当使用标记物时，其优选在微生物宿主中（例如在原核生物中、细菌中、酵母中） 发挥功能。标记物优选为原核选择性标记物（例如在原核启动子控制之下转录）。为方便 起见，典型的标记物为抗生素抗性基因。
[0170] 本发明的载体优选为自主复制游离型载体或染色体外载体，诸如质粒。
[0171] 本发明的载体优选包含复制起点。优选的是，该复制起点在原核生物中有活性而 在真核生物中无活性。
[0172] 优选的载体因此包括用于选择载体的原核标记物、原核复制起点以及驱动编码免 疫原的序列转录的真核启动子。所述载体因此将（a)在原核宿主中扩增并选择，而不表达 多肽，但（b)在真核宿主中表达，但不扩增。这种排列对于核酸免疫载体是理想的。
[0173] 本发明的载体可以在编码序列下游包含真核转录终止子序列。这可以增强转录水 平。当编码序列不具有其自身的聚腺苷酸化序列时，本发明的载体优选包含聚腺苷酸化序 列。优选的聚腺苷酸化序列来自牛生长激素。
[0174] 本发明的载体可以包含多克隆位点。
[0175] 除了编码免疫原和标记物的序列以外，载体可以包含第二真核编码序列。载体还 可在所述第二序列上游包含IRES，以允许从相同的转录物翻译第二真核多肽作为免疫原。 或者，编码免疫原的序列可以在IRES的下游。
[0176] 本发明的载体可以包含非甲基化的CpG基序，例如非甲基化DNA序列，其共同具有 胞嘧啶和随后的鸟苷，侧接有两个5'嘌呤和两个3'嘧啶。在其非甲基化形式中，已表明 这些DNA基序是几种类型的免疫细胞的有效刺激剂。
[0177] 通用 术语"包含"涵盖"包括"以及"由……组成"，例如，"包含"x的组 合物可以仅由X组成 或可包括额外物质，例如X+Y。
[0178] 词语"基本上"不排除"完全地"，例如"基本上不含"Y的组合物可以完全不含Y。 必要时，词语"基本上"可以从本发明的定义中省略。
[0179] 与数值^相关的术语"约"是任选的，并且意指，例如^±10%。
[0180] 除非特别说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求混合的任何特定 顺序。因此，组分可以任何顺序混合。当存在三种组分时，则两种组分可以彼此组合，然后 该组合可以与第三组分组合，等。
[0181] 当动物（特别是牛）材料在细胞培养中使用时，它们应当获得自不含传染性海绵 状脑病（TSE)、特别是不含牛海绵状脑病（BSE)的来源。总体上，优选在动物来源材料完全 不存在的情况下培养细胞。
[0182] 当化合物作为组合物的部分施用于机体时，则该化合物可以替代地被合适的前药 替代。
[0183] 通常，本发明将不使用参考文献1或2中公开的组合物。此外，在一些实施方案中， 本发明不利用在野生型SdrC或SdrD蛋白内发现的CnaB结构域。
[0184] 附图简述 图1显示在用Newman菌株攻击后免疫小鼠的肾脏中的Iogltl CFU/ml。三组数据，从左 至右，用以下免疫：单独的佐剂；佐剂化的SdrE ;或佐剂化的CnaBE3。每个点显示来自单一 小鼠的数据。水平线是平均值。
[0185] 图2显示在用NCTC8325菌株攻击后免疫小鼠的肾脏中的Iogltl CFU/ml。两组数 据，从左至右，用以下免疫：单独的佐剂；佐剂化的CnaBE3。
[0186] 图3显示使用多克隆抗CnaBE3血清的蛋白质印迹。印迹下面的表显示所测试的 菌株，然后是那些菌株中SdrC、SdrD和SdrE的分子量。
[0187] 图4显示使用所示血清的％调理吞噬杀死（Y轴范围为-40%至40% )。
[0188] 图5显示来自健康（左）或感染（右）供体的血清的ELISA滴度（InAU)。
[0189] 实施本发明的方式 SdrE蛋白研宄 将SdrE抗原的编码序列克隆在pET15b+载体中以编码在其N端具有六组氨酸标签的 蛋白（SEQ ID N0:46)。
[0190] 注意到，SdrE显示对胰蛋白酶消化的抗性。蛋白在37°C用测序级改良的胰蛋白酶 (Promega?)以1/25 (wt/wt)的酶/底物比率在50 mM碳酸氢按，pH 8，与0.1% (wt/ vol) Rapigest (Waters?)消化过夜。
[0191] 对于蛋白质印迹分析，细菌细胞壁提取物如先前所述[97]获得。金黄色葡萄球菌 对数生长期培养物在补充5mM CaClj^ TSB中生长至OD _ = 0. 6。细胞在PBS中洗涤一次 并再悬浮在100 U 1补充30% (w/v)棉子糖和40 y 1/ml无EDTA蛋白酶抑制剂混合物的裂解 缓冲液（50 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2, pH 7. 5)中。将溶葡球菌酶（200 μg/ml)在 37°C 应用10分钟以收获细胞壁蛋白。将样品与NuPAGE LDS样品缓冲液和NuPAGE样品还原剂煮 沸10分钟，并且在3-8% (w/v) NuPAGE Tris-乙酸盐凝胶中分离。将电泳分离的蛋白样品 用iBlot凝胶转移装置转移至硝酸纤维素膜。将膜在TPBS中的10% (w/v)脱脂乳中封闭 2小时（25°C，700 rpm)。在TPBS中三次洗涤后，添加TPBS中的小鼠多克隆抗rCnaBE3 (在 1% w/v脱脂乳中1: 1，000稀释）并将膜在25°C，700 rpm下孵育1小时。将膜在TPBS中 洗涤三次，且添加TPBS中的1% (w/v)脱脂乳中1:5, OOO稀释的多克隆兔抗小鼠免疫球蛋 白-HRP。在25°C，700 rpm下1小时后，将膜洗涤三次，且结合的抗体通过SuperSignal West Pico化学发光底物通过ECL可视化，且显色1分钟。
[0192] 在野生型细菌中，SdrE蛋白在蛋白质印迹上作为约125kDa的条带可见，并且其位 于细胞壁级分中。过夜胰蛋白酶处理提供约36kDa的强条带，其中也可见较低重量条带。然 而，甚至在37°C消化3天后，36kDa条带（和各种其他条带）保持稳定。
[0193] 主要胰蛋白酶抗性条带的MS和N端分析揭示来自CnaBE3区域的肽，其中一些序 列延伸短距离进入CnaBE2的C端部分。BE3结构域作为126聚体（SEQ ID N0:27)表达，其 包括从BE2结构域的15个上游氨基酸。重组蛋白通过SDS-PAGE在约15kDa是可见的。胰 蛋白酶消化在4小时后稍微降低其大小，但该条带甚至在消化2天后仍保持稳定。
[0194] MS研宄揭示，CnaBE3肽的质量与理论质量相差17 Da。该质量对应于在赖氨酸和 天冬酰胺残基之间的异肽键的形成过程中发生的铵的损失。金黄色葡萄球菌蛋白中的分子 内异肽键先前没有在实验中看到。
[0195] 为了研宄可能的异肽键形成，CnaBE3结构域内的六个Asn残基已经突变（SEQID N0:9至14)。基于含有CnaA和CnaB结构域的表面蛋白可形成分子内异肽键和在充当稳定 剂或催化剂的Glu/Asp存在的情况下在Lys-Asp或Lys-Asn残基之间形成所述键的事实， 野生型CnaBE3中的所有天冬酰胺被丙氨酸替代。野生型和突变体CnaBE3结构域（SEQID N0:9至13,其中'X'是'A'）显示对胰蛋白酶消化的抗性，这表明CnaBE3区域中存在一些 稳定因素。五种突变体的胰蛋白酶抗性行为表明，这五个天冬酰胺无一参与键形成。
[0196] 免疫学研宄 全长SdrE(SEQ ID N0:1)和CnaBE3结构域（SEQ ID N0:27)用氢氧化铝佐剂化，并用 于免疫小鼠。免疫小鼠用Newman菌株攻击，然后评估肾脓肿形成。
[0197] 如图1中显示，用SdrE或CnaBE3免疫导致肾脏中细菌CFU计数的显著减少（相 对于阴性对照：对于SdrE，p=0. 016,对于CnaBE3, p=0. 032)。SdrE和CnaBE3组的差异CFU 计数不显著。
[0198] SdrE并不普遍由金黄色葡萄球菌菌株表达，所以测试用CnaBE3免疫的小鼠针对 SdrE阴性菌株（NCTC8325)的保护。令人惊讶地，小鼠再次受到保护（参见图2 ;p=0. 017)， 所以CnaBE3能够提供交叉保护。这种作用可能是由于Newman菌株的这三种Sdr蛋白中 位于邻近'R'区域（参见参考文献3的图1)的CnaB结构域（SdrC的BC2、SdrD的BD5和 SdrE的BE3)之间的高序列同一性。例如，抗CnaBE3多克隆血清与来自金黄色葡萄球菌的 11种不同菌株的蛋白提取物孵育，并且其识别具有对应于SdrC、SdrD和SdrE中每一者的 MW的蛋白（参见图3)。如预期，SdrD在ScMT ve菌株MRSA252中未检测到，且SdrE在SdrE 1 菌株NCTC8325中未检测到。因此，与SdrC和SdrD的交叉反应性可解释CnaBE3保护免于 SdrE_ ve菌株的能力。
[0199] 患者血清交叉反应性 血清获得自16个血清健康新生儿（12至18个月大）、30个健康成人（21至75岁大） 和30个具有证明金黄色葡萄球菌感染为疾病的唯一微生物学病因的患者（0至81岁大）。 此外，健康成人血清购自3H Biomedical AB。
[0200] 这些血清用于ELISA中。简而言之，Nunc MaxiSorp ?平底96孔板用PBS中的2 吒/ml rCnaBE3蛋白在4°C包被（每孔100 y 1)过夜。将板用TPBS (PBS中的0? 05% (v/ v)吐温20，pH 7. 4)洗涤三次，并且在37°C用200 W/孔的PBS中含有3% (w/v) BSA (Sigma-Aldrich)的封闭缓冲液封闭2小时。血清最初在稀释缓冲液（TPBS中的1% (w/v) BSA)中1:100稀释，一式两份添加至孔（100 W/孔），且连续2倍稀释。在37°C孵育2小 时后，将板用TPBS洗涤三次，然后以100 W/孔添加含有1:2, 000稀释的山羊抗人IgG(入 链特异性）碱性磷酸酶缀合物亲和力分离的抗体（Sigma-Aldrich)的稀释缓冲液。在37°C 孵育1小时30分钟之后，将板用TPBS洗涤三次，且应用100 W/孔的含有3 mg/ml磷酸对 硝基苯酯的DEA缓冲剂（1M二乙醇胺（v/v)，0.5 mM MgCl2, 0.02% (w/v)叠氮化钠，pH 9. 8)的溶液。反应在20分钟后通过添加100 W 4N NaOH而终止。405 nm的光密度使用 配备SoftMax ? Pro数据采集和分析软件的SpectraMax 190吸光度酶标仪进行测量。抗体 滴度通过将OD内插至参考校准曲线而计算，并且以对数任意单位（InAU)表示。
[0201] 如图5中所示，血清与固定的CnaBE3结构域的平均结合值对于感染患者显著高于 来自健康患者的血清（P〈〇.05)。这些数据表明，针对CnaBE3片段的特异性免疫应答在金黄 色葡萄球菌感染过程中的确得到诱导，表明SdrE中的CnaBE3结构域是天然免疫原性的。
[0202] 调理吞噬杀死测定 人早幼粒细胞性白血病细胞HL-60 (ATCC CCL240)维持在富集培养基中，并且使用 0. 8%N，N-二甲基甲酰胺分化为吞噬细胞。热灭活（30分钟，56 °C )后，小鼠CnaBE3和SdrE 抗血清在HBSS缓冲液（具有Ca2+/Mg2+)中1:50预稀释。在TSB中生长过夜的细菌在PBS 中洗涤一次，然后与血清（75 000 CFU/孔）在4°C孵育20分钟。分化的HL-60细胞以3. 7 X IO6/孔（HL-60:细菌比率，50:1)分布，且以10%最终浓度添加兔补体。然后将板在37°C 在600 rpm搅拌下孵育1小时，并且将样品铺板在TSA板上，用于CFU计数测定。血清以 1:50、1:500或1:5000稀释度测试。
[0203] 如图4中所示，当补体存在时，HL-60细胞在抗CnaBE3血清存在的情况下杀死约 20%的Newman细胞，且在抗SdrE血清存在的情况下杀死约30%的Newman细胞，而没有任何 Newman细胞被免疫前血清杀死。
[0204] 应当理解，本发明仅通过实例的方式进行描述，并且可进行修改，而仍在本发明的 范围和精神之内。
[0205] 参考文献
【主权项】
1. 包含SdrECnaBE3结构域的多肽，其中所述多肽不包含（i)全长SdrE蛋白或（ii) 式'B'的氨基酸序列。2. 包含金黄色葡萄球菌（5：ayreM)SdrE蛋白的片段的多肽，其中：(a)所述片段包括 SdrE的CnaBE3结构域；(b)所述多肽不包含全长SdrE蛋白；且（c)所述多肽不包含式'B' 的氨基酸序列。3. 权利要求2的多肽，其中所述SdrE蛋白与SEQIDNO:3具有290%同一性。4. 任一前述权利要求的多肽，其中所述CnaBE3结构域与SEQIDNO:8具有至少95%同 一性。5. 任一前述权利要求的多肽，其包含SEQIDNO: 8或SEQIDNO: 27。6. 任一前述权利要求的多肽，其中所述多肽，当施用于人或小鼠时，引发识别SEQID N0:8内或SEQIDN0:27内的表位的抗体。7. 任一前述权利要求的多肽，其中所述多肽具有〈500个氨基酸。8. 包含突变体金黄色葡萄球菌SdrECnaBE3结构域的多肽，其中： ?在其中天然金黄色葡萄球菌SdrECnaBE3结构域具有天冬酰胺残基的一个或多个 氨基酸位置，所述突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代； 和/或 ?在其中天然金黄色葡萄球菌SdrECnaBE3结构域具有天冬氨酸残基的一个或多个 氨基酸位置，所述突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代； 和/或 ?在其中天然金黄色葡萄球菌SdrECnaBE3结构域具有赖氨酸残基的一个或多个氨 基酸位置，所述突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代。9. 权利要求8的多肽，其包含SEQIDNO:9至26中的任一者。10. 包含金黄色葡萄球菌CnaB结构域的多肽，其中所述CnaB结构域包括异肽键。11. 权利要求10的多肽，其中所述金黄色葡萄球菌CnaB结构域来自金黄色葡萄球菌 SdrE012. 权利要求11的多肽，其中所述金黄色葡萄球菌CnaB结构域是CnaBE3结构域。13. 包含至少两个CnaB结构域的多肽，其中：（a)所述CnaB结构域中的至少一个是 SdrECnaBE3结构域且至少一个CnaB结构域不是SdrECnaB结构域；或（b)所述多肽包含 至少两个SdrECnaBE3结构域。14. 免疫原性组合物，其包含任一前述权利要求的多肽。15. 权利要求14的组合物，其进一步包含以下中的一种或多种：(a)金黄色葡萄球菌 外泌多糖和载体蛋白的缀合物；(b)金黄色葡萄球菌荚膜糖和载体蛋白的缀合物；（C)除 了SdrE多肽以外的金黄色葡萄球菌多肽；和/或（d)非葡萄球菌抗原。16. 权利要求15的组合物，其包括免疫佐剂。17. 在哺乳动物中引起免疫应答的方法，其包括施用有效量的权利要求14、权利要求 15或权利要求16的免疫原性组合物的步骤。18. 核酸，其编码权利要求1-9中任一项的多肽。
【专利摘要】金黄色葡萄球菌富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白含有三个CnaB结构域，并且这些中的第三个提供针对金黄色葡萄球菌感染的显著保护。因此，有用的金黄色葡萄球菌疫苗可包括SdrE CnaB结构域。此外，已显示SdrE蛋白对于胰蛋白酶消化相对耐受，这可以与SdrE在第三CnaB结构域内含有异肽键的观察联系起来。
【IPC分类】C07K14/315, A61K39/085, C12N15/00
【公开号】CN104902924
【申请号】CN201380056728
【发明人】A.G.O.马内蒂, L.菲亚希, M.贝切雷利, P.朴拉琪, M.比亚吉尼
【申请人】葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月29日
【公告号】CA2888829A1, EP2911689A1, US20150273041, WO2014067912A1
【专利说明】金黄色葡萄球菌SDRECNAB结构域及其用于接种的用途
[0001] 本申请要求2012年10月29日提交的UK临时申请1219420. 5的权益，其所有的 完整内容出于所有目的由此通过引用并入本文。
技术领域
[0002] 本发明涉及金黄色葡萄球菌免疫原的领域。
【背景技术】
[0003] 针对金黄色葡萄球菌的各种疫苗目前正在研宄，例如，参见参考文献1。如参考文 献2中公开的一种方法使用含有CnaB结构域的多肽。该结构域首次在金黄色葡萄球菌胶 原结合表面蛋白中被描述为不介导胶原结合的区域。参考文献2中的图28显示，来自金黄 色葡萄球菌SdrD蛋白的CnaB结构域在小鼠模型中赋予针对菌株USA300感染的保护。
[0004] 本发明的一个目标是提供用于引发针对金黄色葡萄球菌的免疫应答的进一步且 改进的免疫原。
【发明内容】
[0005] 参考文献2将金黄色葡萄球菌的SdrD蛋白鉴定为含有CnaB结构域。本发明人已 发现，金黄色葡萄球菌富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白（SdrE)含有三个 CnaB结构域（' CnaBEl'、' CnaBE2'和' CnaBE3'），并且这些结构域中的第三个提供针对金黄 色葡萄球菌感染的显著保护，如肾脓肿形成的减少所表明。此外，本发明人已显示甚至针对 不表达SdrE的菌株的交叉保护。此外，已显示SdrE蛋白对于胰蛋白酶消化相对耐受，这可 以与SdrE在其第三CnaB结构域内（即CnaBE3内）含有异肽键的观察联系起来。
[0006] 在第一个方面，本发明提供包含SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中所述多肽不包含 全长SdrE蛋白。
[0007] 在第二个方面，本发明提供包含SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中所述多肽具有少 于500个氨基酸。
[0008] 在第三个方面，本发明提供包含金黄色葡萄球菌SdrE蛋白的片段的多肽，其中： (a)所述片段包括SdrE CnaBE3结构域；且（b)所述多肽不包含全长SdrE蛋白。
[0009] 在第四个方面，本发明提供包含金黄色葡萄球菌CnaB结构域的多肽，其中所述 CnaB结构域包括异肽键。所述CnaB结构域优选为CnaBE3。
[0010] 在第五个方面，本发明提供包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多 肽，其中，在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有天冬酰胺残基的一个或多个 氨基酸位置，突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代。
[0011] 类似地，本发明提供包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多肽，其 中，在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有天冬氨酸残基的一个或多个氨基 酸位置，突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代。
[0012] 类似地，本发明提供包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多肽，其 中，在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有赖氨酸残基的一个或多个氨基酸 位置，突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代。
[0013] 在第六个方面，本发明提供包含至少两个CnaB结构域的多肽，其中：(a) CnaB结构 域中的至少一个是CnaBE3结构域且至少一个CnaB结构域不是SdrE CnaB结构域；或（b) 所述多肽包含至少两个CnaBE3结构域。此类多肽可包含如参考文献2 (例如，参见其中第 9-13页）中公开的氨基酸序列A (LB)n，条件是至少一个A和/或B是CnaBE3结构域。
[0014] 本发明的这些多肽可用作用于引起免疫应答例如以保护免于金黄色葡萄球菌感 染的免疫原性组合物的组分。
[0015] SdrE 金黄色葡萄球菌SdrE蛋白是富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白，如参 考文献3-8中更详细地讨论。在金黄色葡萄球菌细菌中，其被锚定在细胞壁中。在Newman NWMN_0525菌株中，其氨基酸序列是SEQ ID N0:1 :
[0016] 来自许多更多菌株的SdrE序列是本领域已知的。在申请时搜索 NCBI多肽序列数据库中的金黄色葡萄球菌SdrE序列揭示73次命中，并且使 用SEQ ID NO: 1的BLINK搜索给出至少以下菌株的SdrE序列：COL (序列登录号
[0017] BLINK命中具有1131-1166个氨基酸，其中该长度变异的大部分源自Ser-Asp重复 的长度差异。除了该变异和5聚体PSTSE序列（SEQ ID N0:44)的存在或不存在以外，该序 列另外在许多菌株之间是非常高度保守的。因此，新生序列通常可以如下代表： |SEQ ID ND; 21-Xs-ISEQIDNO; 3|-X'-[SEQ ID NO:4J (式 ） 其中： SEQ ID N0:2 为：
X1是任选的PSTSE序列（SEQ ID NO: 44)，且 X2是20-250个氨基酸长且或者是（i) SD的多个重复或（ii) SD和AD序列两者的混 合物。
[0018] 因此，SEQ ID NO: 1是式'A'的实例，其中X1存在且X 2是SD的83个重复。
[0019] 本发明可以使用任何这些已知的SdrE序列。通常，本发明使用的SdrE将包含与 SEQ ID NO: 3具有至少90%同一性（例如，之91%同一性，之92%同一性，之93%同一性，之94% 同一性，295%同一性，296%同一性，297%同一性，298%同一性，299%同一性，或100%同一 性）的序列，并且，当施用于人或小鼠时，将引发抗体，所述抗体识别作为SEQ ID N0:1表达 的野生型金黄色葡萄球菌蛋白。
[0020] 当本发明的一个实施方案利用金黄色葡萄球菌SdrE蛋白的片段时，该片段将通 常是与SEQ ID N0:3具有至少90%同一性（例如，之91%同一性，之92%同一性，之93%同一性， >94%同一性，295%同一性，》96%同一性，297%同一性，》98%同一性，299%同一性，或100% 同一性）的序列的片段。包含所述片段的多肽，当施用于人或小鼠时，将引发抗体，所述抗 体识别作为SEQ ID NO: 1表达的野生型金黄色葡萄球菌蛋白。
[0021] 金黄色葡萄球菌SdrE的一种有用片段包括CnaBE3结构域（参见下文），但包括少 于20个Ser-Asp重复。
[0022] 当本发明的一个实施方案不利用全长SdrE蛋白时，它不利用具有式'A'的蛋白。
[0023] 此外，本发明的多肽通常将不包含式'B'的氨基酸序列，其中式'B'为：
SEQ ID N0:3 为：
X1是任选的PSTSE序列（SEQ ID NO:44)(优选存在），且 X2是20-250个氨基酸长且或者是（i) SD的多个重复或（ii) SD和AD序列两者的混 合物（且其中优选的X2是由SD的83个重复组成的166聚体（mer))。
[0024] 因此，式'B'的优选实例是SEQ ID NO:7,1076聚体：
所以，本发明的多肽通常将不包含SEQ ID N0:7。
[0025] CnaB 结构域 CnaB结构域是公认的具有希腊钥匙拓扑学的两个折叠（sheets)中七股的前白蛋白 样夹心折叠的蛋白结构[9]。SCOP数据库[10]包括"Cna蛋白B型结构域"作为家族 (49479)和超家族（49478)两者。在Pfam数据库[11]中，CnaB结构域是条目PF05738。 尽管CnaB结构域基于二级蛋白结构定义，但该结构源于容易分析的氨基酸模式，并且一个 CnaB结构域的存在可以仅仅基于氨基酸序列相对容易地预测，并且它们通过保守结构域搜 索例如使用CDD (保守结构域数据库）容易鉴定，如参考文献12中所报道。
[0026] 各种细菌物种中的CnaB结构域的实例公开于参考文献2。本发明涉及包括CnaB 结构域的金黄色葡萄球菌蛋白。金黄色葡萄球菌中存在几种此类蛋白的实例，包括原型CNA 胶原粘附素（其通常不作为本发明的实施方案），但本发明的主要焦点是Sdr蛋白（富含 Ser-Asp的蛋白，诸如SdrA、B、C、D、E和/或F)，特别是SdrE 0
[0027] 金黄色葡萄球菌SdrE如上文讨论。其含有三个CnaB结构域，在参考文献3中鉴 定为"B重复"。三个CnaB结构域的边界基于Newman菌株显示于参考文献3的图3中，且 SEQ ID N0:1 中的第三 CnaB 结构域（，CnaBE3，）如下（SEQ ID N0:8):
[0028] 使用SEQ ID NO: I与来自任何其他金黄色葡萄球菌菌株的SdrE序列的比对，SEQ ID N0:8允许CnaBE3结构域在该其他菌株中容易地定位。本发明可以使用来自任何此类菌 株的CnaBE3结构域，尽管Newman菌株是优选的。
[0029] 通常，因此，本发明利用的CnaBE3结构域将与SEQ ID N0:8具有至少95%同一性 (例如，296%同一性，297%同一性，298%同一性，299%同一性，或100%同一性），并且，当施 用于人或小鼠时，将引发识别表位的抗体，所述表位（i)在SEQ ID NO: 8内或（ii)包括SEQ ID N0:8内的氨基酸。换言之，CnaBE3结构域将引发与上述鉴定的野生型CnaBE3结构域交 叉反应的抗体。在一些实施方案中，表位在SEQ ID N0:27内或包括SEQ ID N0:27内的氨 基酸。
[0030] SEQ ID NO:8的CnaBE3结构域是111聚体，因此占总SdrE蛋白的约9. 5%。因 此，包含CnaBE3结构域的本发明的多肽可以比全长SdrE蛋白实质上更短。本发明的含有 CnaBE3的多肽可以因此具有少于500个氨基酸，例如，少于400aa，少于350aa，少于300aa， 少于250aa，少于200aa，或少于150aa。
[0031] 当本发明的多肽包括CnaBE3结构域时，所述结构域上游和/或下游的任何氨基酸 可以与金黄色葡萄球菌SdrE蛋白的上游/下游残基相同，或者它们可以不同。例如，当所 述多肽包含序列{A} - {B} - {C}(其中{B}是CnaBE3结构域）时：(a) {A}的C端与SEQ ID NO: 1的残基102-111可以是相同或不同的；和/或（b) {C}的N端与SEQ ID NO: 1的残基 941-951可以是相同或不同的。因此，{B}的CnaBE3结构域可以作为来自SdrE的特定片 段，或者其可以包括作为来自SdrE的较大片段的部分。当序列{c}存在时，这理想地包括 少于20个Ser-Asp重复，例如，少于10个，少于5个，或甚至零个。在一个有用的实施方案 中，序列{A}的确包括CnaBE2结构域内对应区域的短部分，例如，至多达20个氨基酸。例 如，一种有用的序列（SEQ ID NO:27)保留来自CnaBE2的最后15个氨基酸，以得到SEQ ID NO: 1的126聚体片段：
[0032] 来自SdrE的每个CnaB结构域包括EF手环，其可提供钙的高亲和力结合。因此， 本发明的多肽可包括CnaB结构域内的Ca'
[0033] 所述CnaBE3结构域刚好在参考文献1中公开的'SdrE53_ 632 '蛋白的下游。
[0034] SEQ ID NO:8与参考文献2中作为SEQ ID NO: 134-138公开的来自SdrD的五个 CnaB结构域具有序列同一性（通过CLUSTALW计算）：
〇
[0035] 类似地：当SEQ ID NO:8针对SdrD中的对应区域（例如对于Newman菌株，针对 SdrD的氨基酸1013-1123)比对时，其具有94. 6%同一性，具有6个氨基酸差异；并且当SEQ ID NO:8针对SdrC中的对应区域（例如，针对参考文献1中SdrC的氨基酸607-717)比对 时，其也具有94. 6%同一,性，再次具有6个氨基酸差异。
[0036] 异肽键和突变体CnaBE3结构域 本发明使用的CnaB结构域（并且特别是CnaBE3结构域）可以有用地包括异肽键，即 两个氨基酸的侧链之间的键，或一个氨基酸的侧链和肽链的游离端之间的键。通常，这在一 个侧链中的氨基和另一个侧链上的羧基或甲酰胺（carboxamide)基之间，例如在Lys上的 氨基和Gln或Asn上的甲酰胺之间，或Lys上的氨基和Glu或Asp上的羧基之间形成。形 成异肽键的两个氨基酸通常都在相同CnaBE3结构域中。
[0037] 然而，在一些实施方案中，CnaB结构域（并且特别是CnaBE3结构域）被突变以去 除野生型天冬酰胺和/或赖氨酸残基，由此破坏异肽键的形成。在此类突变体CnaB结构域 中，在天然结构域具有天冬酰胺/赖氨酸残基的一个或多个氨基酸位置，突变体具有（i)氨 基酸缺失或（ii)氨基酸取代。SEQ ID NO: 9至14是其中野生型Asn残基突变的CnaBE3结 构域的实例，其中'X'不是'N'（并且理想地不是'N'、'Q'、'D'或'E'）：
[0038] 类似地，SEQIDNO: 15至26是其中野生型Lys残基突变的CnaBE3结构域的实例， 其中'X'不是'K' ：
[0039] 这些突变体可抵抗异肽键的形成。
[0040] 然而，在本发明的一些实施方案中，天然的赖氨酸和/或天冬酰胺和/或天冬氨酸 残基得到保留，使得异肽键形成得到维持。具体而言，保留对应于SEQ ID N0:8内的Asn-104 的位置（即SEQ ID NO: 14中加下划线的位置）的天冬酰胺是有用的。
[0041] 与金黄色葡萄球菌糖类的组合 本发明的多肽可以与缀合的金黄色葡萄球菌糖抗原组合使用。因此，本发明提供包含 以下的组合的免疫原性组合物：（1)本发明的多肽；和（2)金黄色葡萄球菌外泌多糖和载 体蛋白的一种或多种缀合物。
[0042] 该组合的组分（2)中使用的缀合物包括糖部分和载体部分。所述糖部分来自金黄 色葡萄球菌的外泌多糖，其是聚-N-乙酰葡糖胺（PNAG)。所述糖可以是具有在从细菌纯化 外泌多糖的过程中出现的大小的多糖，或者它可以是通过此类多糖的片段化获得的寡糖， 例如，大小可以从超过400kDa变化至75和400kDa之间，或10和75kDa之间，或至多达30 个 重复单元。所述糖部分可以具有各种程度的N-乙酰化，并且如参考文献13中所述，PNAG 可以小于40% N-乙酰化（例如，小于35、30、20、15、10或5%^乙酰化；去乙酰化？隱6也 已知为dPNAG)。PNAG的去乙酰化表位可引发能够介导调理杀死的抗体。PNAG可以被0-琥 珀酰化或可以不被〇-琥珀酰化，例如，它可以在少于25、20、15、10、5、2、1或0. 1%的残基上 被0-琥珀酰化。
[0043] 本发明还提供包含以下的组合的免疫原性组合物：（1)本发明的多肽；和（2)金 黄色葡萄球菌荚膜糖和载体蛋白的一种或多种缀合物。
[0044] 该组合的组分（2)中使用的缀合物包括糖部分和载体部分。所述糖部分来自金黄 色葡萄球菌的荚膜糖。所述糖可以是具有在从细菌纯化荚膜多糖的过程中出现的大小的多 糖，或者它可以是通过此类多糖的片段化获得的寡糖。荚膜糖可以从金黄色葡萄球菌的任 何合适的菌株（或具有相似或相同的糖的任何细菌）获得，诸如从5型和/或8型金黄色 葡萄球菌菌株和/或336型金黄色葡萄球菌菌株获得。感染性金黄色葡萄球菌的大多数菌 株含有5型或8型荚膜糖。两者都具有其重复单元中的FucNAcp以及可用于引入用于连接 的疏基的ManNAcA。5 型糖的重复单元是一4) - 0 -D-Man NAcA- (1 - 4) - a -L-FucNAc (30Ac) -(I - 3) - 0 -D-FucNAc- (I -，而 8 型糖的重复单元是一3) - 0 -D-ManNAcA (40Ac) - (I - 3) - a -L-FucNAc (I - 3) - a -D-FucNAc (I -。336型糖是没有O-乙酰化的0 -连接的己糖胺[14， 15]，并且与针对336菌株（ATCC 55804)产生的抗体交叉反应。5型和8型糖的组合是典型 的，并且336型糖可以加入该配对[16]。
[0045] 这些缀合物中的载体部分将通常是蛋白，但通常不是（1)的抗原之一。典型的载 体蛋白是细菌毒素，诸如白喉或破伤风毒素，或类毒素或其突变体或片段。CRM197白喉毒素 突变体[17]是有用的。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌外 膜蛋白复合物[18]，合成肽[19，20]，热休克蛋白[21，22]，百日咳蛋白[23，24]，细胞因 子[25]，淋巴因子[25]，激素[25]，生长因子[25]，包含来自各种病原体衍生抗原的多种人 ⑶4+ T细胞表位的人工蛋白[26]，诸如N19 [27]，来自流感嗜血杆菌此/这ae)的蛋 白D [28-30]，肺炎球菌溶血素[31]或其无毒衍生物[32]，肺炎球菌表面蛋白PspA [33]，铁 摄取蛋白[34]，来自艰难梭状芽胞杆菌（Ct/i/Zicih)的毒素A或B[35]，重组绿脓假单胞 菌的胞外蛋白A(rEPA) [36]等。在一些实施方案中，载体蛋白是金黄色葡 萄球菌蛋白，诸如选自第一、第二、第三或第四抗原组的抗原。
[0046] 当组合物包括多于一种缀合物时，每种缀合物可使用相同的载体蛋白或不同的载 体蛋白。
[0047] 缀合物可具有过量载体（w/w)或过量糖（w/w)。在一些实施方案中，缀合物可包括 基本相等重量的各物质。
[0048] 所述载体分子可以直接或经由接头共价地缀合至载体。与蛋白的直接连接可以通 过，例如，糖和载体之间的还原胺化来实现，如例如参考文献37和38中所述。所述糖可首 先需要被活化，例如通过氧化。可通过任何已知程序，例如参考文献39和40中所述的程 序，进行经由接头基团连接。连接的优选类型是己二酸接头，其可以通过以下形成：偶联游 离-NH 2基团（例如，通过胺化引入葡聚糖）与己二酸（使用，例如，二酰亚胺活化），然后 将蛋白偶联至所得糖_己二酸中间体[41，42]。连接的另一种优选类型是羰基接头，其可以 通过以下形成：使糖CDI的游离羟基反应[43, 44]，随后与蛋白反应以形成氨基甲酸酯连 接。其他接头包括0 -丙酰胺基[45]、硝基苯基-乙胺[46]、卤代酰基卤化物[47]、糖苷键
[48] 、6_氨基己酸[49]、ADH [50]、(；至C12部分[51]等。还可以使用碳二亚胺缩合[52]。
[0049] PNAG缀合物可以各种方式制备，例如，通过包括以下的方法：a)通过添加包含 马来酰亚胺基团的接头而活化PNAG以形成活化的PNAG ;b)通过添加包含巯基的接头而 活化载体蛋白以形成活化的载体蛋白；和c)使活化的PNAG和活化的载体蛋白反应以形 成PNAG-载体蛋白缀合物；或者通过包括以下的方法：a)通过添加包含巯基的接头而活 化PNAG以形成活化的PNAG ;b)通过添加包含马来酰亚胺基团的接头而活化载体蛋白以形 成活化的载体蛋白；和c)使活化的PNAG和活化的载体蛋白反应以形成PNAG-载体蛋白缀 合物；或者通过包括以下的方法：a)通过添加包含巯基的接头而活化PNAG以形成活化的 PNAG ;b)通过添加包含巯基的接头而活化载体蛋白以形成活化的载体蛋白；和c)使活化 的PNAG和活化的载体蛋白反应以形成PNAG-载体蛋白缀合物。
[0050] 本发明的多肽可以用作用于金黄色葡萄球菌糖的载体蛋白，以形成共价缀合物。 因此，本发明提供免疫原性组合物，其包含（1)本发明的多肽和（2)金黄色葡萄球菌外泌多 糖或金黄色葡萄球菌荚膜糖的缀合物。此类缀合物的进一步特征如上所述。
[0051] 与金黄色葡萄球菌多肽抗原的组合 本发明的多肽可以与其他（非SdrE)金黄色葡萄球菌多肽抗原组合使用。例如，免疫 原性组合物可包含本发明的多肽与参考文献1中公开的任何金黄色葡萄球菌抗原，诸如如 参考文献1中定义的以下抗原中的一种或多种：（I) clfA抗原；（2) clfB抗原；（3) esxA 抗原；（4) esxB 抗原；（5) Hla 抗原；（6) isdA 抗原；（7) isdB 抗原；（8) isdC 抗原；（9) isdG 抗原；（10) isdH 抗原；（11) isdl 抗原；（12) sasF 抗原；（13) sdrC 抗原；（14) sdrD 抗原；（15) spa 抗原；（16) sta006 抗原；和 / 或（17) StaOll 抗原。
[0052] 在一个实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含含有CnaBE3结构域的 本发明的多肽与以下中的一种或多种的组合：（a)突变体溶血素；(b)sta006抗原；（c) StaOll抗原；（d)EsxA抗原；和/或（e)EsxB抗原。
[0053] 金黄色葡萄球菌溶血素（'Hla'）也已知为' a毒素'。在NCTC 8325菌株中，Hla 具有氨基酸序列 SEQ ID N0:28 (GI:88194865):
[0054] Hla是大多数金黄色葡萄球菌菌株产生的重要毒力决定因子，其具有成孔和溶血 活性。抗Hla抗体可以中和毒素在动物模型中的有害作用，并且Hla特别可用于保护免于 肺炎。
[0055] Hla的天然毒性可以在本发明的组合物中通过化学灭活（例如，使用甲醛、戊二醛 或其他交联剂）得以避免，但优选使用缺乏Hla的天然毒性活性、同时保留其免疫原性的突 变体Hla。此类脱毒突变体是本领域已知的。优选的Hla抗原是这样的突变体金黄色葡萄 球菌溶血素，其在SEQ ID NO: 28的残基61、即成熟抗原（即省略前26个N端氨基酸之后） 的残基35具有突变。因此，残基61可以不是组氨酸，并且可替代地是例如Ile，Val，或优选 Leu。也可使用在该位置的His-Arg突变。例如，SEQ ID NO: 29是成熟的突变体Hla-H35L 序列：
并且有用的Hla抗原包含SEQ ID N0:29。其他有用的突变体公开于参考文献1中。
[0056] 本发明使用的Hla突变体可引发识别SEQ ID NO: 28的抗体（例如，当施用于 人时）和/或可包含以下氨基酸序列：（a)与SEQ ID NO:28具有50%或更高同一性（例 如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更 高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 28的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更多 (例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。 这些Hla抗原包括SEQ ID N0:28的变体。（b)的优选片段包含来自SEQ ID N0:28的表位。 其他优选片段缺乏SEQ ID N0:28的C端的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25或更多个）氨基酸和/或SEQ ID N0:28的N端的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25或更多个）氨基酸，同时保留5￡〇10勵:28的至少一个表位。5￡〇10 NO: 28的前26个N端氨基酸可有用地省略。也可以使用C端的截短，例如留下仅50个氨基 酸（SEQ ID NO: 28的残基27-76) [53]。其他有用的Hla抗原公开于参考文献54和55。
[0057] -种有用的Hla抗原是SEQ ID NO: 30 :
〇
[0058] 这具有N端Met，然后是来自表达载体的Ala-Ser二肽，然后是SEQ ID NO: 29。
[0059] ' Sta006'抗原被注释为'高铁色素-结合蛋白'，并且也被称为' FhuD2' [56]。 在 NCTC 8325 菌株中，Sta006 具有氨基酸序列 SEQ ID NO: 31 (GI :88196199):
[0060] 本发明使用的Sta006可引发识别SEQ ID NO: 31的抗体（例如，当施用于人时） 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)与SEQ ID NO:31具有50%或更高同一性（例如60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高）；和 / 或（b)包含SEQ ID NO: 31的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更多（例如， 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。这些 Sta006多肽包括SEQ ID N0:31的变体。（b)的优选片段包含来自SEQ ID N0:31的表位。 其他优选片段缺乏SEQ ID N0:31的C端的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25或更多个）氨基酸和/或SEQ ID N0:31的N端的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25或更多个）氨基酸，同时保留SEQ ID N0:31的至少一个表位。SEQ ID NO: 31的前17个N端氨基酸可有用地省略。Sta006的突变体形式报道于参考文献57。一 种有用的Sta006序列是SEQ ID NO: 32,其在N端具有Met-Ala-Ser-序列，且省略SEQ ID NO:31 的 N 端：
[0061] SEQ ID NO:33是另一种此类序列，但其缺乏SEQ ID NO:32中存在的半胱氨酸：
[0062] ' StaOir 抗原具有 NCTC 8325 中的氨基酸序列 SEQ ID N0:34 (GI:88193872):
[0063] 本发明使用的StaOll抗原可引发识别SEQ ID NO: 34的抗体（例如，当施用于 人时）和/或可包含以下氨基酸序列：（a)与SEQ ID NO:34具有50%或更高同一性（例 如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更 高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 34的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更多 (例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。 这些StaOll多肽包括SEQ ID N0:34的变体。（b)的优选片段包含来自SEQ ID N0:34的表 位。其他优选片段缺乏3￡〇10勵:34的(：端的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25或更多个）氨基酸和/或SEQIDN0:34的N端的一个或多个（例如l、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多个）氨基酸，同时保留SEQ ID N0:34的至少一个表位。SEQ ID NO: 34的前23个N端氨基酸可有用地省略。一种有用的StaOll序列是SEQ ID NO: 35， 其具有N端甲硫氨酸，且省略SEQ ID NO: 34的N端：
[0064] SEQ ID NO:36是另一种此类序列，但其缺乏SEQ ID NO:35中存在的半胱氨酸：
[0065] StaOll可以作为单体或寡聚体存在，其中Ca++离子有利于寡聚化。本发明可以使 用StaOll的单体和/或寡聚体。
[0066] NCTC 8325 菌株中的'EsxA' 抗原具有氨基酸序列 SEQ ID NO: 37 (GI :88194063):
[0067] 本发明使用的EsxA抗原可引发识别SEQ IDNO: 37的抗体（例如，当施用于人时） 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)与SEQ IDNO:37具有50%或更高同一性（例如60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高）；和 / 或（b)包含SEQ IDNO: 37的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更多（例如， 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90 或更多）。这些 EsxA 多肽包括 SEQ IDN0:37的变体。（b)的优选片段包含来自SEQ IDN0:37的表位。其他优选片段缺乏SEQ IDN0:37的C端的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个）氨基酸 和 / 或SEQ IDN0:37 的N 端的一个或多个（例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更 多个）氨基酸，同时保留SEQ IDNO:37的至少一个表位。
[0068] NCTC 8325 菌株中的'EsxB' 抗原具有氨基酸序列 SEQ ID NO: 38 (GI :88194070):
[0069] 本发明使用的EsxB可引发识别SEQ ID NO: 38的抗体（例如，当施用于人时） 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)与SEQ ID NO:38具有50%或更高同一性（例如60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高）；和 / 或（b)包含SEQ ID NO: 38的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更多（例如， 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100 或更多）。这些 EsxB 多肽包括 SEQ ID N0:38的变体。（b)的优选片段包含来自SEQ ID N0:38的表位。其他优选片段缺 乏 SEQ ID N0:38 的 C端的一个或多个（例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多个） 氨基酸和 / 或 SEQ ID N0:38 的 N端的一个或多个（例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多个）氨基酸，同时保留SEQ ID NO:38的至少一个表位。
[0070] 当组合物包括EsxA和EsxB抗原两者时，这些可以作为单一多肽（即作为融合多 肽）存在。因此，单一多肽可以引发抗体（例如，当施用于人时），所述抗体识别SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38两者。所述单一多肽可以包括：⑴与SEQ ID NO:37具有50%或 更高同一,性（例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%、99. 5%或更高）和/或包含SEQ ID NO: 37的至少' n'个连续氨基酸的片段的第一多 肽序列，如上述对于EsxA所定义；和（ii)与SEQ ID NO: 38具有50%或更高同一性（例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高） 和/或包含SEQ ID N0:38的至少'n'个连续氨基酸的片段的第二多肽序列，如上述对于 EsxB所定义。第一和第二多肽序列可以是任一顺序，N至C端。SEQ ID N0:39 ('EsxAB'） 是此类多肽的实例，其具有六肽接头ASGGGS (SEQ ID N0:40):
[0073] 因此，一种有用的多肽包含这样的氨基酸序列，其（a)与SEQ IDN0:41具有80% 或更高同一1性（例如，80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更 高）；和/或（b)包含来自SEQ IDNO: 41的氨基酸1-96的至少'n'个连续氨基酸的片段和 来自SEQ IDNO:41的氨基酸103-205的至少'n'个连续氨基酸的片段两者，其中'n'为7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或 更多）。这些多肽（例如，SEQ IDN0:42)可以引发抗体（例如，当施用于人时），所述抗体 识别包含SEQ IDNO: 37的野生型葡萄球菌蛋白和包含SEQ IDNO: 38的野生型葡萄球菌蛋 白两者。因此，免疫应答将识别抗原EsxA和EsxB两者。（b)的优选片段提供来自SEQ ID NO:37的表位和来自SEQ IDNO:38的表位。
[0074] 尽管SEQ IDN0:30、32、35和42是组合中有用的氨基酸序列，但本发明不限于这 些精确的序列。因此，这些序列中的1个、2个、3个或所有4个可以独立地通过至多达5个 单一氨基变化（即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或插入）而修饰，条件是修饰 的序列可引发仍结合至由未修饰的序列组成的多肽的抗体。例如，SEQ IDN0:33、36和43 是SEQ IDNO:32、35和42的此类变体。
[0075] 在一个优选的实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含：(a)本发明的多 肽，其包含CnaBE3结构域：(b)突变体溶血素，其包含SEQ ID NO: 30 ; (c) sta006抗原，其 包含 SEQ ID N0:32;(d) StaOll 抗原，其包含 SEQ ID N0:35;和（d) EsxAB 抗原，其包含 SEQ ID NO:42〇
[0076] 在另一个优选的实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含：(a)本发明的 多肽，其包含CnaBE3结构域：(b)突变体溶血素，其包含SEQID NO:30 ;(c) sta006抗原， 其包含SEQID NO:33;(d) staO11抗原，其包含SEQID NO:36;和（d) EsxAB抗原，其包含 SEQID NO:43〇
[0077] 与非葡萄球菌抗原的组合 本发明的抗原组中鉴定的个别抗原可以与非葡萄球菌抗原、和特别是与来自医院感染 相关的细菌的抗原组合使用。因此，本发明提供包含以下的组合的免疫原性组合物： (1) 本发明的多肽；和 (2) 选自以下的一种或多种抗原：艰难梭状芽胞杆菌；绿脓假单胞菌；白色念珠菌 ;和肠外致病性大肠杆菌co7i)。
[0078] 用于与本发明的金黄色葡萄球菌抗原组合使用的其他合适的抗原列于参考文献 58的第33-46页。
[0079] 本发明使用的多肽 本发明使用的多肽可采取各种形式（例如天然多肽、融合体、糖基化多肽、非糖基化多 肽、脂化（Iipidated)多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蔻酰化多肽、非 肉豆蔻酰化多肽、单体多肽、多聚体多肽、颗粒多肽、变性多肽等）。
[0080] 本发明使用的多肽可通过各种方式（例如重组表达、从细胞培养物纯化、化学合 成等）制备。优选重组表达的蛋白。
[0081] 本发明使用的多肽优选以纯化或基本纯化形式（即基本不含其他多肽（例如不含 天然存在的多肽）、特别是不含其他葡萄球菌或宿主细胞多肽）提供，并且通常至少约50% 纯（以重量计），通常至少约90%纯，即组合物的少于约50%，更优选少于约10% (例如 5%)由其他表达的多肽构成。因此，组合物中的抗原与表达该分子的完整生物体分离。
[0082] 本发明使用的多肽优选为葡萄球菌多肽。
[0083] 术语"多肽"是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，其可 包含修饰的氨基酸，且其可被非氨基酸打断。该术语也涵盖已天然或通过干预修饰的氨基 酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与 标记组分缀合。例如，还包括含有一个或多个氨基酸类似物（包括例如非天然氨基酸等） 以及本领域已知的其他修饰的多肽。多肽可以作为单链或结合链产生。
[0084] 本发明提供包含序列-P-Q-或-Q-P-的多肽，其中：-P-是如上文定义的氨基酸序 列，-Q-不是如上文定义的序列，即本发明提供融合蛋白。当-P-的N端密码子不是ATGdS 该密码子未出现在多肽的N端时，它将被翻译成该密码子的标准氨基酸，而不是Met。然而， 当该密码子在多肽的N端时，它将被翻译成Met。-Q-部分的实例包括但不限于组氨酸标签 (即His" (SEQ ID N0:45)，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多）、麦芽糖结合蛋白或谷胱 甘肽-S-转移酶（GST)。
[0085] 本发明还提供用于产生本发明的多肽的方法，其包括在诱导多肽表达的条件下培 养用本发明的核酸转化的宿主细胞的步骤。
[0086]尽管本发明的多肽的表达可以在葡萄球菌中发现，但本发明将通常使用异源宿 主用于表达（重组表达）。异源宿主可以是原核（例如细菌）或真核生物。其可以是大 肠杆菌（凡cWi)，但其他合适的宿主包括枯草芽孢杆菌霍乱弧菌 (Ki友rio cAo/erae)、伤寒沙门氏菌tjpAi)、鼠伤寒沙门氏菌 皿ritt?)、乳酰胺奈瑟氏菌（Afeisseria 7ac(a?ica)、灰色奈瑟氏菌（Afeisseria ciflerea)、分枝杆菌dcoAacteria)(例如结核分支杆菌〇K teAercWiosis))、酵母等。与 编码本发明的多肽的野生型金黄色葡萄球菌基因相比，改变密码子以优化此类宿主中的表 达效率而不影响所编码的氨基酸是有帮助的。
[0087]本发明提供用于产生本发明的多肽的方法，其包括通过化学方式合成所述多肽的 至少部分的步骤。
[0088]核酸 本发明还提供编码本发明的多肽的核酸。其还提供核酸，所述核酸包含编码一种或多 种本发明的多肽的核苷酸序列。
[0089]本发明的核酸优选以纯化或基本纯化的形式提供，即基本不含其他核酸（例如不 含天然存在的核酸），特别是不含其他葡萄球菌或宿主细胞核酸，通常至少约50%纯（以重 量计），且通常至少约90%纯。本发明的核酸优选为葡萄球菌核酸。
[0090]本发明的核酸可以多种方式制备，例如，完全或部分化学合成（例如DNA的亚磷 酰胺合成）、通过使用核酸酶（例如限制性酶）消化较长核酸、通过连接较短核酸或核苷酸 (例如使用连接酶或聚合酶）、由基因组或cDNA文库等制备。
[0091]术语"核酸"通常包括任何长度的核苷酸聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖 核苷酸和/或其类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体。它也包括DNA或RNA类似物， 诸如含有修饰骨架（例如肽核酸（PM)或硫代磷酸酯）或修饰碱基的类似物。因此，本发明 包括 mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、支链核酸（branched nucleic acids)、 质粒、载体、探针、引物等。当本发明的核酸采用RNA形式时，它可能具有或可能不具有5' 帽。
[0092]本发明的核酸可以是载体的部分，即设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的 核酸构建体的部分。载体可以是，例如，设计用于分离、增殖和复制插入的核苷酸的"克隆载 体"，设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的"表达载体"，设计用于导致产生重组病毒或 病毒样颗粒的"病毒载体"，或包含多于一种载体类型的属性的"穿梭载体"。优选的载体是 质粒。"宿主细胞"包括单一细胞或细胞培养物，其可以是或已经是外源核酸的受体。宿主 细胞包括单一宿主细胞的后代，并且由于天然、偶然或有意的突变和/或改变，所述后代与 原始亲本细胞不必需完全相同（在形态或总DNA互补方面）。宿主细胞包括用本发明的核 酸体内或体外转染或感染的细胞。
[0093]可使用本发明的核酸，例如：来产生多肽；作为用于检测生物样品中的核酸的杂 交探针；来产生额外的核酸拷贝；来产生核酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物或探针； 或作为形成三链的寡核苷酸。
[0094]本发明提供用于产生本发明的核酸的方法，其中所述核酸部分或完全使用化学方 式合成。
[0095] 本发明提供包含本发明的核苷酸序列的载体（例如克隆或表达载体）和用此类载 体转化的宿主细胞。
[0096] 根据本发明的核酸扩增可以是定量的和/或实时的。
[0097] 菌株和变体 金黄色葡萄球菌的几种菌株的基因组序列是可得的，包括MRSA菌株N315和Mu50 [59]、 MW2、N315、COL、MRSA252、MSSA476、RF122、USA300 (剧毒）、JHl 和 JH9 的那些。可使用标 准的搜索和比对技术在任何这些（或其他）进一步基因组序列中鉴定来自Newman菌株的 SdrE (SEQ ID NO: 1)的同源物。而且，可得的来自Newman菌株的序列可用于设计引物用于 扩增来自其他菌株的同源序列。因此，本发明不限于该菌株，而是涵盖来自金黄色葡萄球菌 的其他菌株的此类变体和同源物，以及非天然变体。通常，SEQ ID NO: 1的合适变体包括其 等位基因变体、其多态性形式、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其突变体等。
[0098] 因此，例如，与本文中的SEQ IDNO相比，本发明使用的多肽可包括一个或多个 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9等）氨基酸取代，诸如保守取代（即用具有相关侧链的另一种氨 基酸取代一种氨基酸）。遗传编码的氨基酸通常分为四类：（1)酸性氨基酸，即天冬氨酸、谷 氨酸；（2)碱性氨基酸，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；（3)非极性氨基酸，即丙氨酸、缬氨酸、亮 氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和（4)不带电荷的极性氨基酸，即甘 氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和 酪氨酸一起归类为芳香族氨基酸。通常，这些家族内的单一氨基酸的取代对生物活性不具 有主要影响。相对于SEQ IDNO序列，多肽还可包括一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、 9等）单一氨基酸缺失。相对于SEQ IDNO序列，多肽也可包括一个或多个（例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9等）插入（例如各1、2、3、4或5个氨基酸）。
[0099] 类似地，本发明使用的多肽可包含氨基酸序列，所述氨基酸序列： 鲁与序列表中公开的序列相同（即100%相同）； ?与序列表中公开的序列共享序列同一性（例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高）； ?与（a)或（b)的序列相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个（或更多个）单一氨 基酸改变（缺失、插入、取代），其可以在分开的位置或可以是连续的；且 鲁当使用逐对比对算法与来自序列表的特定序列比对时，每个从N端向C端移动 氨基酸的窗口（使得对于延伸至/7个氨基酸的比对，当/?>虐t，存在个此类窗口）具 有至少X .y个相同的比对氨基酸，其中：x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、 150、200 ;y 选自 0? 50、0. 60、0. 70、0. 75、0. 80、0. 85、0. 90、0. 91、0. 92、0. 93、0. 94、0. 95、 0. 96、0. 97、0. 98、0. 99;且如果x*y不是整数，则将其向上入至（rounded up to)最近的整 数。优选的成对比对算法是Needleman-Wunsch整体比对算法[60]，使用默认参数（例如缺 口开放罚分=10. 0，缺口延伸罚分=0. 5,使用EBL0SUM62积分矩阵）。该算法以EMBOSS 软件包中的工具方便地执行[61]。
[0100] 在组（C)内，缺失或取代可在N端和/或C端，或者可以在两端之间。因此，截短 是缺失的一个实例。截短可涉及在N端和/或C端缺失至多达40个（或更多个）氨基酸。 N端截短可移除前导肽，例如以促进在异源宿主中的重组表达。C端截短可移除锚定序列， 例如以促进在异源宿主中的重组表达。
[0101] 通常，当抗原包含与来自序列表的完整金黄色葡萄球菌序列不同的序列时（例 如，当它包含与之具有〈100%序列同一性的序列表时，或当它包含其片段时），优选的是， 在各种单独情况下，该抗原可引发抗体，所述抗体识别相应的完整金黄色葡萄球菌序列。
[0102] 免疫原性组合物和药物 本发明的多肽可用作免疫原性组合物中的组分。本发明的免疫原性组合物可用作疫 苗。根据本发明的疫苗可以是预防性的（即预防感染）或治疗性的（即治疗感染），但通常 是预防性的。
[0103] 因此，组合物可以是药学上可接受的。它们将通常包括除了所述抗原以外的组分， 例如它们通常包括一种或多种药物载体和/或赋形剂。对此类组分的充分讨论可见参考文 献62。
[0104] 组合物将通常是水性形式，特别是在施用点，但它们也可以非水性液体形式或以 干燥形式（例如，作为冻干物）呈现。一些疫苗以水性形式制备，然后也以水性形式填装和 分布和施用，但其他疫苗在制备过程中冻干，并在使用时重构成水性形式。因此，本发明的 组合物可以干燥，诸如冻干制剂。
[0105] 该组合物可包括防腐剂，诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，优选的是，疫苗应当基 本不含（即少于5 μg/ml)含汞物质，例如不含硫柳汞。更优选不含汞的疫苗。特别优选不 含防腐剂的疫苗。
[0106] 为了改善热稳定性，组合物可包括温度保护剂。
[0107]为了控制张度，优选包括生理盐，诸如钠盐，例如以控制张度。优选氯化钠（NaCl)， 其可以以1至20mg/ml，例如约10±2mg/ml NaCl或9 mg/ml存在。可存在的其他盐包括氯 化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
[0108]组合物将通常具有 200 mOsm/kg 至 400 mOsm/kg，优选 240-360 mOsm/kg，或 290-310 mOsm/kg 的摩尔渗透压浓度（osmolality) 〇
[0109] 组合物可包括淡水（例如，w. f. i.)中的多肽，但通常将包括一种或多种缓冲剂。 典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸 缓冲剂（特别是具有氢氧化铝佐剂）；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂通常将包括在5-20mM范 围内。
[0110] 组合物的pH将通常为5.0至8. 1，更通常6.0至8.0,例如6. 5至7. 5,或7.0至 7. 8〇
[0111] 该组合物优选是无菌的。该组合物优选无热原，例如每剂量含有〈1 EU(内毒素单 位，标准量度），优选每剂量〈0.1 EU。该组合物优选不含谷蛋白。
[0112] 组合物应当适于施用于动物（和，特别是人）患者，因此，包括人和兽医用途两者。 它们可以用于引起患者中的免疫应答的方法中，其包括将所述组合物施用于患者的步骤 (参见下文）。组合物可以在主体暴露于病原体之前和/或主体暴露于病原体之后施用。
[0113] 药物组合物可以单位剂型来制备。在一些实施方案中，单位剂量可以具有 0. 1-1. 0ml，例如，约0. 5ml的体积。
[0114] 所述组合物可包括用于单次免疫的材料，或者可包括用于多次免疫的材料（即 "多剂量"药剂盒）。多剂量配置优选包括防腐剂。作为多剂量组合物中包括防腐剂的替代 方案（或除此以外），所述组合物可包含在具有用于移取材料的无菌接头的容器中。
[0115] 人疫苗通常以约0? 5ml的剂量体积施用，尽管可将一半剂量（即约0? 25ml)施用 于儿童。
[0116] 本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物（例如，含有单位剂量）的递送装置 (例如注射器、雾化器、喷雾器、吸入器、皮肤贴片等）。该装置可用于向哺乳动物施用所述 组合物。
[0117] 本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物（例如，含有单位剂量）的无菌容器 (例如，小瓶）。
[0118] 本发明还提供本发明的免疫原性组合物的单位剂量。
[0119] 本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物的气密封容器。合适的容器包括例如 小瓶。
[0120] 金黄色葡萄球菌感染可影响身体的各个区域，所以，可将本发明的组合物以各种 形式制备。例如，可将所述组合物制备为可注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可制备适合 在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式（例如冻干组合物或喷雾冷冻干燥组合 物）。所述组合物可以制备用于局部施用。所述组合物可以制备用于口服施用。所述组合 物可以制备用于经鼻施用，例如作为喷雾剂。可将所述组合物设计为药剂盒形式，使得在临 施用于患者之前重构组合的组合物。此类药剂盒可包含一种或多种液体形式的抗原和一种 或多种冻干抗原。
[0121] 当组合物在临使用前制备（例如，当组分以冻干形式呈现时）且作为药剂盒呈现 时，该药剂盒可包含两个小瓶，或者可包含一个即填充（ready-filled)的注射器和一个小 瓶，其中注射器的内容物用于在注射前重新活化小瓶的内容物。
[0122] 用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的一种或多种抗原，以及需要的任何 其他组分。"免疫有效量"意指以单一剂量或一系列剂量的部分向个体施用该量对于治疗或 预防是有效的。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类组（例 如非人灵长类动物、灵长类动物等）、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫 苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其他相关因素而不同。预期所述量将落入可通过常 规试验确定的相对宽范围内。当组合物中包括多于一种抗原时，则两种抗原可以彼此相同 剂量或以不同剂量存在。
[0123] 本发明的免疫原性组合物将通常包括一种或多种免疫佐剂。可在本发明的组合 物中使用的佐剂包括，但不限于：⑴水包油乳液、（ii)至少一种铝盐或（iii)至少一种 TLR激动剂。在一些实施方案中，组合物包括铝盐和TLR激动剂的混合物，且TLR激动剂可 以吸附至铝盐以改善佐剂效果[86]。这可导致更好（更强、或更快速地实现）的免疫应答 和/或可允许减少组合物中铝的量，同时维持等效的佐剂作用。
[0124] 当组合物包括（一种或多种）铝盐佐剂时，则本发明的多肽可以吸附至（一种或 多种）盐。当组合物包括铝盐佐剂时，则其优选不包括水包油乳液佐剂。相反，当组合物包 括水包油乳液佐剂时，则其优选不包括铝盐佐剂。
[0125] 水包油乳液佐剂 免疫原性组合物可用水包油乳液佐剂化。各种此类乳液是已知的，例如MF59和AS03 都在欧洲被批准。
[0126] 有用的乳液佐剂，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，其中所述油 和表面活性剂是可生物降解的（可代谢的）和生物相容的。乳液中的油滴通常具有亚微米 直径，且这些小尺寸可以容易地使用提供稳定乳液的微流化床或通过替代方法（例如，相 反转）来实现。其中至少80% (以数目计）的液滴具有小于220nm的直径的乳液是优选 的，因为它们可进行过滤除菌。
[0127] 所述乳液可以包括来自动物（诸如鱼）和/或植物来源的油。植物油的来源包括 坚果、种子和谷物。最普遍可得的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油例举坚果油。可以使用 (例如获得自霍霍巴豆的）霍霍巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。 在谷物组中，玉米油是最容易获得的，但也可以使用其他谷物（诸如小麦、燕麦、黑麦、稻、 画眉草、黑小麦等）的油。可从坚果和种子油开始，通过水解、分离和酯化适当材料制备不 是种子油中天然存在的甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。来自哺乳动物乳汁的脂肪 和油类是可代谢的，因此可以与本发明使用。从动物来源获得纯油所必需的分离、纯化、皂 化和其他方式的程序是本领域众所周知的。
[0128] 大多数鱼含有可容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油（诸如鲸 蜡）例举本文中可使用的几种鱼油。以5-碳异戊二烯单元生化合成许多支链油，其统称为 萜类化合物。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲 基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳六烯，其为特别优选用于与本发明使用（参见下文）。角鲨 烯的饱和类似物角鲨烷也是有用的油。鱼油，包括角鲨烯和角鲨烷，易于从商业来源获得， 或可以通过本领域已知的方法获得。其他优选油是生育酚（参见下文）。可以使用油的混 合物。
[0129]佐剂乳液中总油（体积％ )的优选量是1至20%，例如2-10%。5体积％的角鲨烯 含量是特别有用的。
[0130] 表面活性剂可以通过其'HLB'（亲水/亲脂平衡）分类。本发明优选的表面活性 剂具有至少10,例如约15的HLB。可以与本发明使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙 烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂（通常称为吐温），特别是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80 ; 以D0WFAX?商品名销售的环氧乙烷（EO)、环氧丙烷（PO)和/或环氧丁烷（BO)的共聚物， 诸如直链EP/P0嵌段共聚物；重复的乙氧基（氧基-1，2-乙二基）基团数量不同的辛苯聚 醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇-9 (曲通（Triton) X-100,或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）； (辛基苯氧基）聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂，诸如磷脂酰胆碱（卵磷脂）； 壬基苯酚乙氧基化物，诸如Tergitol ? NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚 氧乙烯脂肪醚（已知为苄泽（Brij)表面活性剂），诸如三甘醇单月桂基醚（苄泽30);和脱 水山梨糖醇酯（通常已知为司盘（SPAN))，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯（司盘85)和脱水山 梨糖醇单月桂酸酯。
[0131] 本发明使用的乳液优选包括非离子表面活性剂。用于乳液中包括的优选表面活性 剂是聚山梨醇酯80 (聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯；吐温80)、司盘85 (脱水山梨糖醇三 油酸酯）、卵磷脂或曲通X-100。可以使用表面活性剂的混合物，例如聚山梨醇酯80和脱水 山梨糖醇三油酸酯的混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯（诸如聚山梨醇酯80 (吐温80)) 和辛苯聚醇（诸如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（曲通X-100))的组合也是有用的。另一种 有用的组合包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。当使用表面 活性剂的混合物时，则混合物的HLB根据它们的相对权重（以体积计）计算，例如，聚山梨 醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的优选1:1混合物具有8. 4的HLB。
[0132] 佐剂乳液中总表面活性剂（体积％ )的优选量是0. 1至2%，例如0. 25-2%。1体 积％的总含量是特别有用的，例如0. 5体积％的聚山梨醇酯80和0. 5体积％的脱水山梨糖 醇三油酸酯。
[0133] 有用的乳液可使用已知的技术制备，例如参见参考文献63-646984。
[0134] 可与本发明使用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于： ?角鲨烯、聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的亚微米（submicron)乳液。所 述乳液的体积组成可以是约5%角鲨烯、约0. 5%聚山梨醇酯80和约0. 5%脱水山梨糖醇 三油酸酯。在重量方面，这些比率变为4. 3%角鲨烯、0. 5%聚山梨醇酯80和0. 48%脱水山 梨糖醇三油酸酯。这种佐剂已知为'MF59' [70-72]，如参考文献83的第10章和参考文献 84的第12章中更详细描述。MF59乳液有利地包括柠檬酸根离子，例如IOmM柠檬酸钠缓冲 液。 鲁角鲨烯、生育酚和聚山梨醇酯80的乳液。所述乳液可包括磷酸盐缓冲盐水。这些 乳液可具有2-10%角鲨烯、2-10%生育酚和0. 3-3%聚山梨醇酯80,且角鲨烯：生育酚的重 量比优选< 1 (例如0. 90)，因为这可以提供更稳定的乳液。角鲨烯和聚山梨醇酯80可以 约5:2的体积比或以约11:5的重量比存在。因此，三种组分（角鲨烯、生育酚、聚山梨醇酯 80)可以1068:1186:485或约55:61:25的重量比存在。该佐剂已知为'AS03'。另一种这 种类型的有用乳液每个人剂量可包含0. 5-10 mg角鲨烯、0. 5-11 mg生育酚和0. 1-4 mg聚 山梨酸酯80 [73]，如上述讨论的比率。 鲁其中皂苷（例如QuilA或QS21)和固醇（例如胆固醇）结合为螺旋胶束的乳液
[74] 〇 ?具有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳液。如参 考文献75中所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌 醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。亚微米液滴尺寸是有利的。 ?包含角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂（例如聚氧乙 烯（12)十六十八烷基醚）和疏水性非离子型表面活性剂（例如脱水山梨糖醇酯或二缩甘 露醇酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯或'司盘80'）的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或 其中至少90%油滴（以体积计）具有小于200nm的尺寸[76]。该乳液也可包括以下中的 一种或多种：醛糖醇；冷冻保护剂（例如，糖，诸如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖）；和/或 烷基聚糖苷（alkylpolyglycoside)。它也可以包括TLR4激动剂，诸如其化学结构不包括糖 环的TLR4激动剂[77]。此类乳液可以冻干。'AF03'产品是一种此类乳液。
[0135] 本发明使用的优选的水包油乳液包含角鲨烯和聚山梨醇酯80。
[0136] 所述乳液在疫苗制造过程中可以与抗原混合，或者它们可以在递送时临时混合。 因此，在一些实施方案中，所述佐剂和抗原可单独地保存在包装或分销（distributed)的 疫苗中，其备用于在使用时的最终配制。在混合时（在批量制造过程中，或在使用点），抗原 将通常是水性形式，使得通过混合两种液体制备最终疫苗。所述两种液体的混合体积比可 变（例如5 : 1-1 : 5)，但通常约为1 : 1。如果乳液和 抗原在试剂盒中分开储存，则该产 品可作为含有乳液的小瓶和含有水性抗原的小瓶呈现，用于混合以得到佐剂化的液体疫苗 (单剂量或多剂量）。
[0137] 本发明的优选乳液包括角鲨烯油。这通常从鲨鱼油制备，但替代来源也是已知的， 例如参见参考文献78 (酵母）和79 (橄榄油）。含有少于661皮克PCB/克角鲨烯（TEQ)的 角鲨烯对于与本发明使用是优选的，如参考文献80所公开。所述乳液优选从高纯度的角鲨 烯制备，例如，如参考文献81中公开通过双蒸馏制备。
[0138] 当组合物包括生育酚时，可使用a、0、y、S、e或I生育酚中的任何一种，但 优选a-生育酚。生育酚可采用几种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，诸 如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可使用D-a-生育酚和DL-a-生育酚两者。生育酚具有 抗氧化特性，其有助于稳定该乳液[82]。优选的a-生育酚是DL-a-生育酚，该生育酚的 优选盐是琥珀酸盐。
[0139] 铝盐佐剂 本发明的组合物可包括铝盐佐剂。目前使用的铝盐佐剂通常被称为"氢氧化铝"或"磷 酸铝"佐剂。然而，这些是方便的名称，因为无一是存在的实际化合物的精确描述（例如， 参见参考文献83的第9章，和参考文献84的第4章）。本发明可使用可用作佐剂的"氢氧 化物"或"磷酸盐"中的任一者。如果TLR激动剂的吸附是期望的，则包括氢氧根离子的铝 盐是优选的，因为这些氢氧根离子可容易经受配体交换用于吸附TLR激动剂。因此，用于吸 附TLR激动剂的优选的盐是氢氧化铝和/或羟基磷酸铝。这些具有可容易经历与含磷基团 (例如磷酸盐，膦酸盐）配体交换的表面羟基部分以提供稳定的吸附。氢氧化铝佐剂因此最 优选的。
[0140] 已知为"氢氧化铝"的佐剂通常是羟基氧化铝盐，其通常是至少部分结晶的。可通 过式AlO (OH)代表的羟基氧化错（Aluminium oxyhydroxide)可通过红外（IR)光谱学，特别 是通过在K^OcnT1的吸附带和在3090 - 3100cm +1的强肩部存在与其他铝化合物诸如氢氧 化铝Al (OH) 3进行区分（参考文献83的第9章）。氢氧化铝佐剂的结晶度通过在半高的衍 射带的宽度（WHH)来反映，其中差结晶颗粒显示由于较小晶粒尺寸导致的较大线增宽。表 面积随着WHH增加而增加，且具有较高WHH值的佐剂已被视为具有对于抗原吸附的较大能 力。纤维状形态（例如，如透射电子显微照片所见）对于氢氧化铝佐剂是典型的，例如，具 有直径约2nm的针样颗粒。氢氧化铝佐剂的PZC通常为约11，即佐剂本身在生理pH具有正 表面电荷。对于氢氧化铝佐剂已经报道在PH7. 4 1.8-2. 6 mg蛋白/mg Al+++的吸附能力。
[0141] 已知为"磷酸铝"的佐剂通常是羟基磷酸铝，经常还含有少量硫酸。它们可通过沉 淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中的羟基的程度。羟基磷酸盐 通常具有〇. 3至0. 99的PO4Al摩尔比。羟基磷酸盐可通过羟基的存在与严格（strict) AlPO4E分开来。例如，在3164cm ―1 (例如，当加热至200°C时）的IR谱带表明结构性羟基 的存在（参考文献83的第9章）。
[0142] 磷酸铝佐剂的PO4Al3+摩尔比将通常为0. 3至1. 2,优选0. 8至1. 2,并且更优选 0.95土0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其对于羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4Al摩尔比为 0.84至0.92的无定形的羟基磷酸铝，其以0.6mg Al3+Ail包括。磷酸铝将通常是颗粒。在 任何抗原吸附后，颗粒的典型直径是范围0. 5-20 ym(例如约5-10 ym)。对于磷酸铝佐剂已 经报道在pH7. 4 0? 7-1. 5 mg蛋白/mg Al+++的吸附能力。
[0143] 磷酸铝的PZC与磷酸根对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度可取决于用于通 过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而不同。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度 (更多磷酸根=更酸性PZC)或通过添加缓冲剂诸如组氨酸缓冲剂（使PZC碱性更强）改 变PZC。根据本发明使用的磷酸铝将通常具有4. O至7. 0,更优选5. O至6. 5,例如约5. 7的 PZC0
[0144] 在溶液中，磷酸铝和氢氧化物佐剂两者趋于形成直径为1-10 ym的稳定的多孔聚 集体[85]。
[0145] 组合物可包括氢氧化铝和磷酸铝两者的混合物，且组分可以被吸附到这些盐中的 一种或两种。
[0146] 用于制备本发明的组合物的磷酸铝溶液可含有缓冲剂（例如，磷酸盐或组氨酸或 Tris缓冲剂），但这不总是必要的。磷酸铝溶液优选是无菌且无热原的。磷酸铝溶液可包 括游离的水性磷酸根离子，例如以I. 〇至20mM、优选5至15 mM、更优选约10 mM的浓度存 在。磷酸铝溶液还可以包含氯化钠。氯化钠的浓度优选在0. 1至100 mg/ml的范围内（例 如，0.5-50 mg/ml，1-20 mg/ml，2_10 mg/ml)，并且更优选约 3土1 mg/ml。NaCl 的存在有利 于在吸附抗原之前正确测量pH。
[0147] 本发明的组合物理想地包括小于0.85mg Al+++/单位剂量。在本发明的一些实施 方案中，组合物包括小于0. 5mg Al+++/单位剂量。Al+++的量可以小于该值，例如<25〇Mg、 <200Mg、〈150 y g、〈100 y g、〈75 y g、〈50 y g、〈25 y g、〈10 y g 等。
[0148] 当本发明的组合物包括基于铝的佐剂，组分的沉降可在储存过程中发生。所述组 合物因此应当在向患者施用之前摇动。经摇动的组合物将是混浊的白色悬浮液。
[0149] TLR激动剂 在一些实施方案中，本发明的组合物包括TLR激动剂，即，可以激动Tol 1样受体的化合 物。最优选地，TLR激动剂是人TLR的激动剂。TLR激动剂可以活化TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、 TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLRll中任一者；优选它可以活化人TLR4或人TLR7。
[0150] 在优选的实施方案中，本发明的组合物包括TLR激动剂（诸如TLR7激动剂），其包 括膦酸酯基。这种膦酸酯基可以允许激动剂吸附至不溶性铝盐[86]。
[0151] 治疗方法和疫苗的施用 本发明还提供在哺乳动物中引起免疫应答的方法，其包括施用有效量的本发明的免疫 原性组合物的步骤。所述免疫应答优选为保护性的，并且优选涉及抗体和/或细胞介导的 免疫。所述方法可以引起加强应答。
[0152] 本发明还提供本发明的免疫原性组合物，其用于治疗中，例如，用于在哺乳动物中 引起免疫应答的方法（如上所述）中。
[0153] 本发明还提供本发明的多肽在制备用于在哺乳动物引起免疫应答（如上所述）的 药物中的用途。
[0154] 通过这些用途和方法在哺乳动物中引起免疫应答，所述哺乳动物可以受保护免于 金黄色葡萄球菌感染，包括医院感染。更具体地，哺乳动物可以受保护免于皮肤感染、肺炎、 脑膜炎、骨髓炎心内膜炎、中毒性休克综合征和/或败血症。
[0155] 本发明还提供包含第一组分和第二组分的药剂盒，其中第一组分和第二组分都不 是如上所述的本发明的组合物，但其中可将第一组分和第二组分组合以提供如上所述的本 发明的组合物。所述药剂盒可以进一步包括包含以下中的一种或多种的第三组分：说明书、 注射器或其他递送装置、佐剂或药学上可接受的配制溶液。
[0156] 所述哺乳动物优选为人。当所述疫苗用于预防性用途时，人优选是儿童（例如幼 童或婴儿）或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人优选是青少年或成人。意图用于儿童的疫 苗也可施用于成人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。可以根据本发明有用地免疫的 其他哺乳动物是奶牛、狗、马和猪。
[0157] 检查治疗性治疗的效力的一种方式涉及在施用本发明的组合物之后监测金黄色 葡萄球菌感染。检查预防性治疗的效力的一种方式涉及施用所述组合物之后监测针对本发 明的组合物中的抗原的全身免疫应答（诸如监测IgGl和IgG2a产生的水平）和/或粘膜 免疫应答（诸如监测IgA产生的水平）。通常，在免疫后但在攻击前测定抗原特异性血清抗 体应答，而在免疫后且攻击后测定抗原特异性粘膜抗体应答。
[0158] 评价本发明的组合物的免疫原性的另一种方式是重组表达蛋白，其用于通过免疫 印迹和/或微阵列筛选患者血清或粘膜分泌物。蛋白和患者样品之间的阳性反应表明所述 患者已经对考虑的蛋白产生免疫应答。该方法也可用于鉴定免疫显性抗原和/或抗原内的 表位。
[0159] 通过用疫苗组合物攻击金黄色葡萄球菌感染的动物模型（例如豚鼠或小鼠），也 可在体内测定疫苗组合物的效力。具体而言，存在三种用于研宄金黄色葡萄球菌感染性疾 病的有用动物模型，即：（i)鼠脓肿模型[87]，（ii)鼠致死感染模型[87]和（iii)鼠肺炎 模型[88]。脓肿模型着眼于静脉内攻击后小鼠肾脏中的脓肿。致死感染模型着眼于通过静 脉内或腹膜内途径被通常致死剂量的金黄色葡萄球菌感染后存活的小鼠的数目。肺炎模型 还着眼于存活率，但使用鼻内感染。有用的疫苗在这些模型中的一种或多种中可以是有效 的。例如，对于一些临床情况下，其可对于保护免于肺炎是期望的，而无需防止血液传播或 促进调理作用；在其他情况下，主要愿望可以是防止血液传播。不同的抗原，和不同的抗原 组合，可有助于有效疫苗的不同方面。
[0160] 本发明的组合物将通常直接施用于患者。直接递送可通过肠胃外注射（例如皮 下、皮内、腹膜内、静脉内、肌内或至组织间隙），或经粘膜，诸如通过直肠、经口（例如片剂、 喷雾）、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其他粘膜施用完成。优选肌内注射。
[0161] 本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫，优选引发增强的全身和/或粘膜免疫。
[0162] 优选地，增强的全身和/或粘膜免疫反映为增强的THl和/或TH2免疫应答。优 选地，增强的免疫应答包括IgGl和/或IgG2a和/或IgA产生的增加。
[0163] 剂量可通过单剂量时间表或多剂量时间表。多剂量可用于初次免疫时间表和/或 加强免疫时间表。在多剂量时间表中，各个剂量可通过相同或不同的途径（例如肠胃外引 发和粘膜加强，粘膜引发和肠胃外加强等）给予。多个剂量将通常间隔至少1周（例如约 2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等）进行施用。
[0164] 根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人两者。因此，人患者可以小于1岁、 1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的优选患者为老人（例如250岁、260岁， 且优选265岁）、幼儿（例如〈5岁）、住院患者、保健护理人员、武装服务和军事人员、孕妇、 慢性病人或免疫缺陷患者。然而，所述疫苗不仅适用于这些组，还可更广泛地用于人群。
[0165] 可将本发明产生的疫苗与其他疫苗基本上同时（在相同用药咨询或访问健康护 理专业人员或疫苗接种中心期间）施用于患者，例如与流感疫苗、麻瘆疫苗、腮腺炎疫苗、 风瘆疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、缀 合的B型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌 缀合物疫苗（诸如四价A-C-W135-Y疫苗）、呼吸道合胞病毒疫苗等基本上同时施用于患者。 适于共同施用的其他非葡萄球菌疫苗可以包括参考文献58的第33-46页上列出的一种或 多种抗原。
[0166] 核酸免疫 上述免疫原性组合物包括来自金黄色葡萄球菌的多肽抗原。然而，在所有情况下，所述 多肽抗原可用编码那些多肽的核酸（通常是DNA或RNA)替换，以得到基于核酸免疫的组合 物、方法和用途。核酸免疫现在是已开发的领域（例如参见参考文献89-96等）。
[0167] 编码免疫原的核酸在递送至患者后在体内表达，然后所表达的免疫原刺激免疫系 统。活性成分将通常采用核酸载体的形式，其包含：（i)启动子；（ii)可操作地连接至启动 子的编码免疫原的序列；和任选（iii)选择性标记。优选的载体可进一步包含（iv)复制起 点；和（V)位于（ii)下游且与其可操作连接的转录终止子。通常，（i)和（V)将是真核的， (iii)和（iv)将是原核的。
[0168]优选的启动子是病毒启动子，例如来自巨细胞病毒（CMV)的启动子。除了启动子， 载体还可以包括转录调节序列（例如增强子），其与启动子功能性相互作用。优选的载体包 括立即早期CMV增强子/启动子，更优选的载体还包括CMV内含子A。将该启动子可操作地 连接至编码免疫原的下游序列，使得编码免疫原的序列的表达在该启动子的控制之下。
[0169] 当使用标记物时，其优选在微生物宿主中（例如在原核生物中、细菌中、酵母中） 发挥功能。标记物优选为原核选择性标记物（例如在原核启动子控制之下转录）。为方便 起见，典型的标记物为抗生素抗性基因。
[0170] 本发明的载体优选为自主复制游离型载体或染色体外载体，诸如质粒。
[0171] 本发明的载体优选包含复制起点。优选的是，该复制起点在原核生物中有活性而 在真核生物中无活性。
[0172] 优选的载体因此包括用于选择载体的原核标记物、原核复制起点以及驱动编码免 疫原的序列转录的真核启动子。所述载体因此将（a)在原核宿主中扩增并选择，而不表达 多肽，但（b)在真核宿主中表达，但不扩增。这种排列对于核酸免疫载体是理想的。
[0173] 本发明的载体可以在编码序列下游包含真核转录终止子序列。这可以增强转录水 平。当编码序列不具有其自身的聚腺苷酸化序列时，本发明的载体优选包含聚腺苷酸化序 列。优选的聚腺苷酸化序列来自牛生长激素。
[0174] 本发明的载体可以包含多克隆位点。
[0175] 除了编码免疫原和标记物的序列以外，载体可以包含第二真核编码序列。载体还 可在所述第二序列上游包含IRES，以允许从相同的转录物翻译第二真核多肽作为免疫原。 或者，编码免疫原的序列可以在IRES的下游。
[0176] 本发明的载体可以包含非甲基化的CpG基序，例如非甲基化DNA序列，其共同具有 胞嘧啶和随后的鸟苷，侧接有两个5'嘌呤和两个3'嘧啶。在其非甲基化形式中，已表明 这些DNA基序是几种类型的免疫细胞的有效刺激剂。
[0177] 通用 术语"包含"涵盖"包括"以及"由……组成"，例如，"包含"x的组 合物可以仅由X组成 或可包括额外物质，例如X+Y。
[0178] 词语"基本上"不排除"完全地"，例如"基本上不含"Y的组合物可以完全不含Y。 必要时，词语"基本上"可以从本发明的定义中省略。
[0179] 与数值^相关的术语"约"是任选的，并且意指，例如^±10%。
[0180] 除非特别说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求混合的任何特定 顺序。因此，组分可以任何顺序混合。当存在三种组分时，则两种组分可以彼此组合，然后 该组合可以与第三组分组合，等。
[0181] 当动物（特别是牛）材料在细胞培养中使用时，它们应当获得自不含传染性海绵 状脑病（TSE)、特别是不含牛海绵状脑病（BSE)的来源。总体上，优选在动物来源材料完全 不存在的情况下培养细胞。
[0182] 当化合物作为组合物的部分施用于机体时，则该化合物可以替代地被合适的前药 替代。
[0183] 通常，本发明将不使用参考文献1或2中公开的组合物。此外，在一些实施方案中， 本发明不利用在野生型SdrC或SdrD蛋白内发现的CnaB结构域。
[0184] 附图简述 图1显示在用Newman菌株攻击后免疫小鼠的肾脏中的Iogltl CFU/ml。三组数据，从左 至右，用以下免疫：单独的佐剂；佐剂化的SdrE ;或佐剂化的CnaBE3。每个点显示来自单一 小鼠的数据。水平线是平均值。
[0185] 图2显示在用NCTC8325菌株攻击后免疫小鼠的肾脏中的Iogltl CFU/ml。两组数 据，从左至右，用以下免疫：单独的佐剂；佐剂化的CnaBE3。
[0186] 图3显示使用多克隆抗CnaBE3血清的蛋白质印迹。印迹下面的表显示所测试的 菌株，然后是那些菌株中SdrC、SdrD和SdrE的分子量。
[0187] 图4显示使用所示血清的％调理吞噬杀死（Y轴范围为-40%至40% )。
[0188] 图5显示来自健康（左）或感染（右）供体的血清的ELISA滴度（InAU)。
[0189] 实施本发明的方式 SdrE蛋白研宄 将SdrE抗原的编码序列克隆在pET15b+载体中以编码在其N端具有六组氨酸标签的 蛋白（SEQ ID N0:46)。
[0190] 注意到，SdrE显示对胰蛋白酶消化的抗性。蛋白在37°C用测序级改良的胰蛋白酶 (Promega?)以1/25 (wt/wt)的酶/底物比率在50 mM碳酸氢按，pH 8，与0.1% (wt/ vol) Rapigest (Waters?)消化过夜。
[0191] 对于蛋白质印迹分析，细菌细胞壁提取物如先前所述[97]获得。金黄色葡萄球菌 对数生长期培养物在补充5mM CaClj^ TSB中生长至OD _ = 0. 6。细胞在PBS中洗涤一次 并再悬浮在100 U 1补充30% (w/v)棉子糖和40 y 1/ml无EDTA蛋白酶抑制剂混合物的裂解 缓冲液（50 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2, pH 7. 5)中。将溶葡球菌酶（200 μg/ml)在 37°C 应用10分钟以收获细胞壁蛋白。将样品与NuPAGE LDS样品缓冲液和NuPAGE样品还原剂煮 沸10分钟，并且在3-8% (w/v) NuPAGE Tris-乙酸盐凝胶中分离。将电泳分离的蛋白样品 用iBlot凝胶转移装置转移至硝酸纤维素膜。将膜在TPBS中的10% (w/v)脱脂乳中封闭 2小时（25°C，700 rpm)。在TPBS中三次洗涤后，添加TPBS中的小鼠多克隆抗rCnaBE3 (在 1% w/v脱脂乳中1: 1，000稀释）并将膜在25°C，700 rpm下孵育1小时。将膜在TPBS中 洗涤三次，且添加TPBS中的1% (w/v)脱脂乳中1:5, OOO稀释的多克隆兔抗小鼠免疫球蛋 白-HRP。在25°C，700 rpm下1小时后，将膜洗涤三次，且结合的抗体通过SuperSignal West Pico化学发光底物通过ECL可视化，且显色1分钟。
[0192] 在野生型细菌中，SdrE蛋白在蛋白质印迹上作为约125kDa的条带可见，并且其位 于细胞壁级分中。过夜胰蛋白酶处理提供约36kDa的强条带，其中也可见较低重量条带。然 而，甚至在37°C消化3天后，36kDa条带（和各种其他条带）保持稳定。
[0193] 主要胰蛋白酶抗性条带的MS和N端分析揭示来自CnaBE3区域的肽，其中一些序 列延伸短距离进入CnaBE2的C端部分。BE3结构域作为126聚体（SEQ ID N0:27)表达，其 包括从BE2结构域的15个上游氨基酸。重组蛋白通过SDS-PAGE在约15kDa是可见的。胰 蛋白酶消化在4小时后稍微降低其大小，但该条带甚至在消化2天后仍保持稳定。
[0194] MS研宄揭示，CnaBE3肽的质量与理论质量相差17 Da。该质量对应于在赖氨酸和 天冬酰胺残基之间的异肽键的形成过程中发生的铵的损失。金黄色葡萄球菌蛋白中的分子 内异肽键先前没有在实验中看到。
[0195] 为了研宄可能的异肽键形成，CnaBE3结构域内的六个Asn残基已经突变（SEQID N0:9至14)。基于含有CnaA和CnaB结构域的表面蛋白可形成分子内异肽键和在充当稳定 剂或催化剂的Glu/Asp存在的情况下在Lys-Asp或Lys-Asn残基之间形成所述键的事实， 野生型CnaBE3中的所有天冬酰胺被丙氨酸替代。野生型和突变体CnaBE3结构域（SEQID N0:9至13,其中'X'是'A'）显示对胰蛋白酶消化的抗性，这表明CnaBE3区域中存在一些 稳定因素。五种突变体的胰蛋白酶抗性行为表明，这五个天冬酰胺无一参与键形成。
[0196] 免疫学研宄 全长SdrE(SEQ ID N0:1)和CnaBE3结构域（SEQ ID N0:27)用氢氧化铝佐剂化，并用 于免疫小鼠。免疫小鼠用Newman菌株攻击，然后评估肾脓肿形成。
[0197] 如图1中显示，用SdrE或CnaBE3免疫导致肾脏中细菌CFU计数的显著减少（相 对于阴性对照：对于SdrE，p=0. 016,对于CnaBE3, p=0. 032)。SdrE和CnaBE3组的差异CFU 计数不显著。
[0198] SdrE并不普遍由金黄色葡萄球菌菌株表达，所以测试用CnaBE3免疫的小鼠针对 SdrE阴性菌株（NCTC8325)的保护。令人惊讶地，小鼠再次受到保护（参见图2 ;p=0. 017)， 所以CnaBE3能够提供交叉保护。这种作用可能是由于Newman菌株的这三种Sdr蛋白中 位于邻近'R'区域（参见参考文献3的图1)的CnaB结构域（SdrC的BC2、SdrD的BD5和 SdrE的BE3)之间的高序列同一性。例如，抗CnaBE3多克隆血清与来自金黄色葡萄球菌的 11种不同菌株的蛋白提取物孵育，并且其识别具有对应于SdrC、SdrD和SdrE中每一者的 MW的蛋白（参见图3)。如预期，SdrD在ScMT ve菌株MRSA252中未检测到，且SdrE在SdrE 1 菌株NCTC8325中未检测到。因此，与SdrC和SdrD的交叉反应性可解释CnaBE3保护免于 SdrE_ ve菌株的能力。
[0199] 患者血清交叉反应性 血清获得自16个血清健康新生儿（12至18个月大）、30个健康成人（21至75岁大） 和30个具有证明金黄色葡萄球菌感染为疾病的唯一微生物学病因的患者（0至81岁大）。 此外，健康成人血清购自3H Biomedical AB。
[0200] 这些血清用于ELISA中。简而言之，Nunc MaxiSorp ?平底96孔板用PBS中的2 吒/ml rCnaBE3蛋白在4°C包被（每孔100 y 1)过夜。将板用TPBS (PBS中的0? 05% (v/ v)吐温20，pH 7. 4)洗涤三次，并且在37°C用200 W/孔的PBS中含有3% (w/v) BSA (Sigma-Aldrich)的封闭缓冲液封闭2小时。血清最初在稀释缓冲液（TPBS中的1% (w/v) BSA)中1:100稀释，一式两份添加至孔（100 W/孔），且连续2倍稀释。在37°C孵育2小 时后，将板用TPBS洗涤三次，然后以100 W/孔添加含有1:2, 000稀释的山羊抗人IgG(入 链特异性）碱性磷酸酶缀合物亲和力分离的抗体（Sigma-Aldrich)的稀释缓冲液。在37°C 孵育1小时30分钟之后，将板用TPBS洗涤三次，且应用100 W/孔的含有3 mg/ml磷酸对 硝基苯酯的DEA缓冲剂（1M二乙醇胺（v/v)，0.5 mM MgCl2, 0.02% (w/v)叠氮化钠，pH 9. 8)的溶液。反应在20分钟后通过添加100 W 4N NaOH而终止。405 nm的光密度使用 配备SoftMax ? Pro数据采集和分析软件的SpectraMax 190吸光度酶标仪进行测量。抗体 滴度通过将OD内插至参考校准曲线而计算，并且以对数任意单位（InAU)表示。
[0201] 如图5中所示，血清与固定的CnaBE3结构域的平均结合值对于感染患者显著高于 来自健康患者的血清（P〈〇.05)。这些数据表明，针对CnaBE3片段的特异性免疫应答在金黄 色葡萄球菌感染过程中的确得到诱导，表明SdrE中的CnaBE3结构域是天然免疫原性的。
[0202] 调理吞噬杀死测定 人早幼粒细胞性白血病细胞HL-60 (ATCC CCL240)维持在富集培养基中，并且使用 0. 8%N，N-二甲基甲酰胺分化为吞噬细胞。热灭活（30分钟，56 °C )后，小鼠CnaBE3和SdrE 抗血清在HBSS缓冲液（具有Ca2+/Mg2+)中1:50预稀释。在TSB中生长过夜的细菌在PBS 中洗涤一次，然后与血清（75 000 CFU/孔）在4°C孵育20分钟。分化的HL-60细胞以3. 7 X IO6/孔（HL-60:细菌比率，50:1)分布，且以10%最终浓度添加兔补体。然后将板在37°C 在600 rpm搅拌下孵育1小时，并且将样品铺板在TSA板上，用于CFU计数测定。血清以 1:50、1:500或1:5000稀释度测试。
[0203] 如图4中所示，当补体存在时，HL-60细胞在抗CnaBE3血清存在的情况下杀死约 20%的Newman细胞，且在抗SdrE血清存在的情况下杀死约30%的Newman细胞，而没有任何 Newman细胞被免疫前血清杀死。
[0204] 应当理解，本发明仅通过实例的方式进行描述，并且可进行修改，而仍在本发明的 范围和精神之内。
[0205] 参考文献
【主权项】
1. 包含SdrECnaBE3结构域的多肽，其中所述多肽不包含（i)全长SdrE蛋白或（ii) 式'B'的氨基酸序列。2. 包含金黄色葡萄球菌（5：ayreM)SdrE蛋白的片段的多肽，其中：(a)所述片段包括 SdrE的CnaBE3结构域；(b)所述多肽不包含全长SdrE蛋白；且（c)所述多肽不包含式'B' 的氨基酸序列。3. 权利要求2的多肽，其中所述SdrE蛋白与SEQIDNO:3具有290%同一性。4. 任一前述权利要求的多肽，其中所述CnaBE3结构域与SEQIDNO:8具有至少95%同 一性。5. 任一前述权利要求的多肽，其包含SEQIDNO: 8或SEQIDNO: 27。6. 任一前述权利要求的多肽，其中所述多肽，当施用于人或小鼠时，引发识别SEQID N0:8内或SEQIDN0:27内的表位的抗体。7. 任一前述权利要求的多肽，其中所述多肽具有〈500个氨基酸。8. 包含突变体金黄色葡萄球菌SdrECnaBE3结构域的多肽，其中： ?在其中天然金黄色葡萄球菌SdrECnaBE3结构域具有天冬酰胺残基的一个或多个 氨基酸位置，所述突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代； 和/或 ?在其中天然金黄色葡萄球菌SdrECnaBE3结构域具有天冬氨酸残基的一个或多个 氨基酸位置，所述突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代； 和/或 ?在其中天然金黄色葡萄球菌SdrECnaBE3结构域具有赖氨酸残基的一个或多个氨 基酸位置，所述突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代。9. 权利要求8的多肽，其包含SEQIDNO:9至26中的任一者。10. 包含金黄色葡萄球菌CnaB结构域的多肽，其中所述CnaB结构域包括异肽键。11. 权利要求10的多肽，其中所述金黄色葡萄球菌CnaB结构域来自金黄色葡萄球菌 SdrE012. 权利要求11的多肽，其中所述金黄色葡萄球菌CnaB结构域是CnaBE3结构域。13. 包含至少两个CnaB结构域的多肽，其中：（a)所述CnaB结构域中的至少一个是 SdrECnaBE3结构域且至少一个CnaB结构域不是SdrECnaB结构域；或（b)所述多肽包含 至少两个SdrECnaBE3结构域。14. 免疫原性组合物，其包含任一前述权利要求的多肽。15. 权利要求14的组合物，其进一步包含以下中的一种或多种：(a)金黄色葡萄球菌 外泌多糖和载体蛋白的缀合物；(b)金黄色葡萄球菌荚膜糖和载体蛋白的缀合物；（C)除 了SdrE多肽以外的金黄色葡萄球菌多肽；和/或（d)非葡萄球菌抗原。16. 权利要求15的组合物，其包括免疫佐剂。17. 在哺乳动物中引起免疫应答的方法，其包括施用有效量的权利要求14、权利要求 15或权利要求16的免疫原性组合物的步骤。18. 核酸，其编码权利要求1-9中任一项的多肽。
【专利摘要】金黄色葡萄球菌富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白含有三个CnaB结构域，并且这些中的第三个提供针对金黄色葡萄球菌感染的显著保护。因此，有用的金黄色葡萄球菌疫苗可包括SdrE CnaB结构域。此外，已显示SdrE蛋白对于胰蛋白酶消化相对耐受，这可以与SdrE在第三CnaB结构域内含有异肽键的观察联系起来。
【IPC分类】C07K14/315, A61K39/085, C12N15/00
【公开号】CN104902924
【申请号】CN201380056728
【发明人】A.G.O.马内蒂, L.菲亚希, M.贝切雷利, P.朴拉琪, M.比亚吉尼
【申请人】葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月29日
【公告号】CA2888829A1, EP2911689A1, US20150273041, WO2014067912A1
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