用于治疗感染性疾病的糖苷酶方案的制作方法
用于治疗感染性疾病的糖苷酶方案的制作方法
【专利说明】用于治疗感染性疾病的糖苷酶方案
[0001]优先权
[0002]本申请要求2012年9月28日提交的美国临时申请第61/707，252号的优先权和权益，所述临时申请通过引用在此整体并入。
发明领域
[0003]本发明涉及疾病的治疗和预防，并且特别是采用糖苷酶疗法预防、治疗和控制包括慢性和非慢性病毒感染在内的感染性疾病和其他感染性疾病。
[0004]发明背景
[0005]具有慢性感染(如慢性病毒感染，例如HIV、HSV、肝炎病毒、HPV等)的患者即使得到了有效地治疗以逆转疾病轨迹或疾病状态，其仍需要长期的疾病控制。然而，化疗剂、单克隆抗体或细胞因子疗法的持续施用可导致病原体抗性、对患者的毒性作用包括免疫抑制、随时间推移丧失效力，并且对于许多患者而言是费用过高的。例如，抗逆转录病毒(ARV)疗法虽然成功地减缓了 AIDS的进展，但是它已将该疾病转变成需要长期治疗以及基本接受非常显著的副作用和巨大的药物成本的慢性疾病。Atun和Bateringaya，BuildinRa during response to HIV/AIDS:1mplicat1ns for health systems, J.Acquir ImmuneDefic.Syndr.57增刊2: S91-5 (2011)。对此类感染性疾病的更有效的长期疾病控制需要随时间推移保持效力、并且基本上对患者无毒或没有免疫抑制、并且理想地具有成本效益的活性剂。
[0006]此外，治疗或预防某些感染性或流行性疾病(包括流感、SARS和普通感冒)需要长期增强免疫系统以预防感染或预防严重的疾病。这对于受损的免疫尤其如此，因为可用的小分子疗法可以加剧免疫缺陷，并且疫苗可能只是略微有效的。当疫苗供不应求或不可用时，这样的需求特别高。
[0007]需要有效地预防、治疗和/或控制感染性疾病，包括控制慢性感染，以及控制高度传染性的感染性疾病。
【发明内容】
[0008]在各个方面，本发明提供了用于治疗或预防包括慢性感染在内的感染性疾病、以及对免疫系统或公共健康普遍呈现持续挑战的高度传染性的感染因子(infect1usagent)的组合物和方法。本文中所描述的组合物和治疗方案可以与其他抗病毒或抗微生物疗法一起使用，以及与疫苗接种(例如，非含佐剂的疫苗接种)结合使用以增强疫苗效力和/或延长保护作用的持续时间。所述治疗包括对患者体内施用糖苷酶方案(例如，一种或多种糖苷酶的方案)。在各个实施方案中，所述糖苷酶方案并不被患者的免疫系统靶向。在各个实施方案中，所述糖苷酶方案提供了一种或多种对去除哺乳动物细胞(例如，免疫细胞)、受感染的细胞或其他导致免疫活化的糖基化靶标上的一个或多个末端糖基为活性的糖苷酶。所述糖苷酶疗法通过其作用于免疫细胞而引发免疫信号传导级联。靶向末端糖基可以包括，例如，唾液酸基(sialosyl)、β -半乳糖基、N-乙酰半乳糖氨基、岩藻糖基、葡糖基、N-乙酰葡糖氨基和甘露糖基残基等等。因此，在各个实施方案中，所述糖苷酶方案可以包括神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶等中的一种或多种。不希望受理论的束缚，所述方案通过从免疫细胞、受感染的细胞和/或其他糖基化靶标的表面去除有效量的糖基结构(例如，唾液酸)增加了免疫信号传导。以这种方式，所述糖苷酶方案编排或设计了有效的免疫应答，允许受感染的细胞的抗原靶向并引发适当水平的细胞因子/趋化因子级联用于治疗。在这些或其他实施方案中，所述糖苷酶包括至少一种对免疫细胞表面上的突出的末端糖基残基特异的酶(例如，神经氨酸苷酶和/或半乳糖苷酶)，和至少一种对免疫细胞表面上的突出的倒数第二的糖基残基特异的酶(例如，半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶或甘露糖苷酶)。在一些实施方案中，这样的酶与神经氨酸苷酶协同作用。所述方案并不会使患者的免疫系统失调(反而是协调)，这在抗击感染性疾病中是至关重要的，并且即使在一定水平的细胞毒性化疗的存在下也是有效的，所述化疗可对免疫细胞具有有害的影响。此外，所述方案适用于长期疗法或反复疗法，原因是在各个实施方案中所述试剂并不被免疫系统靶向。在各个实施方案中，所述方案避免了从正常细胞过多地去除唾液酸或其他糖基结构，以便它们保持正常功能。
[0009]在某些实施方案中，本文所描述的糖苷酶方案减少或消除了对施用其他传统的抗病毒或抗微生物疗法的需求。在各个实施方案中，本发明可用于免疫受损或免疫抑制的患者中以增强免疫功能。在各个实施方案中，所述糖苷酶方案不被免疫靶向，并且因此产生的糖苷酶信号传导可用于长期疗法。
[0010]在一个方面，本发明提供了通过包含糖苷酶制剂的组合物的非急性方案治疗具有慢性病毒感染的患者的方法，所述糖苷酶制剂既为免疫系统耐受的(“免疫耐受的”)又足以刺激经协调的免疫信号传导。因此所述糖苷酶组合物提供了免疫刺激，如通过一个或多个完整的免疫调节级联，同时避免了所述糖苷酶的免疫靶向，否则这种免疫靶向会随时间推移消除其效力。
[0011]所述糖苷酶组合物和方案是具有成本效益的治疗，以逆转病毒性疾病状态或轨迹和/或过渡到长期疾病控制。在一些实施方案中，患者是症状性AIDS患者，并且所述糖苷酶组合物与ARV疗法一起提供或作为ARV疗法的替代而提供，以逆转疾病轨迹。尽管ARV可以是有效的抗病毒治疗，但是ARV具有抑制免疫系统的不利影响，即一种尤其对HIV或AIDS患者有害的影响。因此，通过本文所描述的方案的持续免疫调节具有改善这些副作用的能力，同时从长远来看过渡到主要的疾病控制。可选地或另外，在状况得到改善后，所述糖苷酶组合物允许过渡到用于长期疾病控制的具有成本效益的方案，这在一些实施方案中消除了对长期ARV疗法的需求。所述方案对于控制慢性病毒感染如HIV、HSV、EBV、HAV、HBV、HCV、HPV、腺病毒等而言是普遍有效的。
[0012]在第二方面，本发明提供了治疗和/或预防感染性疾病的方法。根据这个方面，患者接受本文所述的组合物的方案，所述方案提供并随时间推移保持有效的免疫刺激，包括作为在流感季节或其他持续的感染性疾病发作或流行病期间单独的或额外的保护。在具体的实施方案中，本发明可用于免疫受损的患者，包括老人、儿童、病人、住院治疗者以及具有免疫缺陷性病症(包括遗传免疫缺陷、药物诱导的免疫缺陷或因感染性疾病如AIDS引起)的那些人。在某些实施方案中，所述组合物和/或方案充当佐剂以增强疫苗效力，从而提供更有效的疫苗接种和/或更长的疫苗保护作用的持续时间，并在一些实施方案中，允许疫苗剂量节省。
[0013]在其他方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶、N-乙酰氨基半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的至少两种以及药学上可接受的赋形剂。例如，所述组合物可以包含神经氨酸苷酶和半乳糖苷酶。所述糖苷酶可以按约10_3mg至10_8mg之间共同存在。所述组合物可以被配制用于多种施用途径，包括舌下递送。
[0014]在另外其他的方面，本发明提供了一种方便的糖苷酶剂量施用器。所述施用器递送足够数目的糖苷酶剂量用于非急性方案，例如，至少一个月的剂量，用于逆转病毒性疾病的轨迹或控制感染性疾病，或用于预防或减轻感染性疾病，或增强疫苗效力。所述施用器在所述方案的过程中保持所述组合物的稳定性，保护所述组合物免于暴露至可能的环境污染。在根据本文所描述的方案施用所述剂量所需的时间长度的过程中，所述糖苷酶组合物是稳定的。
【附图说明】
[0015]图1示出了神经氨酸苷酶和补体对受HSV-1感染的Vero细胞的感染性的影响。将所示单位的补体与神经氨酸苷酶和HSV-1孵育。然后将这些混合物加入到Vero细胞并孵育5天。在细胞固定和染色之后，对斑块进行计数，其中每个斑块对应于一个初始的感染性病毒颗粒。感染性被表示为病毒对照(与细胞在无补体或神经氨酸苷酶下孵育的病毒)的百分比。
[0016]图2示出了神经氨酸苷酶和补体对Vero细胞中的感染性HSV-1的产率的影响。将Vero细胞与HSV-1孵育。然后将这些受感染的细胞与含有所示单位的补体和神经氨酸苷酶的混合物孵育。对照由在无补体或神经氨酸苷酶下受感染的细胞(病毒对照)组成。进行24小时孵育后，测试来自细胞培养物的上清液(含有释放的病毒)形成斑块的能力。产率被表示为病毒对照的百分比。
[0017]图3总结了神经氨酸苷酶对体外细胞因子的产生的影响。在神经氨酸苷酶的存在(实验)或不存在(对照)下孵育适合于产生和测量各细胞因子的细胞。对于IL-2、IFN_a和IFN- γ而言，总的细胞的RNA被提取并与细胞因子特异性放射性探针杂交并测定每分钟的计数。对于TNF-a而言，在细胞溶解测定中测量光密度。各细胞因子的值被表示为与相应的盐水对照的差异百分比。如通过正值所表示的，所有四种受测试的细胞因子相对于对照在神经氨酸苷酶的存在下受到刺激。
[0018]发明详述
[0019]本发明提供了用于非急性免疫增强的组合物、方法和治疗方案，其应用于治疗慢性感染性疾病，包括疫苗(例如，不含佐剂的疫苗)增强。
[0020]在一个方面，本发明包括对具有感染性疾病的患者施用一种或多种糖苷酶的体内方案。所述体内方案通过从免疫细胞或其他靶标的表面去除有效量的糖苷酶类(在一些实施方案中特别是唾液酸)来刺激免疫信号传导，并避免从正常细胞过多地去除包括唾液酸的糖苷酶类。所述方案通过被引发的免疫级联允许受感染的细胞的持续性抗原靶向。在一些实施方案中，所述方案包括对去除受病毒感染的细胞上普遍存在的糖苷酶类以及在各个实施方案中是末端或倒数第二的糖苷酶类为活性的酶。在一些实施方案中，所述方案包括神经氨酸苷酶和对去除普遍存在的倒数第二的糖基残基特异的第二糖苷酶，这可以通过避免、预防或减缓糖基链的再唾液酸化和/或再加帽提供协同治疗。包括作为辅助疗法并包括涉及方便的患者剂量监测的实施方案的所述施用方案如本文所详细描述。根据这个方面，所述方法的效力并不决定性地依赖于感染因子的身份(identity)或患者的独特生物学，这不同于许多常规疗法。
[0021]在各个实施方案中，本发明提供了足以用于免疫刺激的糖苷酶组合物的施用方案，同时也避免了免疫系统对糖苷酶的靶向，否则这可能会减少或消除其效力。在某些方面，本发明进一步提供了用于施用本文所描述的方案的糖苷酶给药施用器。
[0022]在一些实施方案中，所述糖苷酶组合物包含神经氨酸苷酶，其是一种水解各种糖缀合物上的末端唾液酸残基的糖苷键的酶。神经氨酸苷酶被发现于哺乳动物细胞以及各种细菌、真菌和病毒源中。凭借它们在细胞膜的碳水化合物链上的末端位置，唾液酸是细胞之间的通讯以及免疫识别现象的关键调节剂。按照本发明，所述神经氨酸苷酶任选地与如本文所述的其他糖苷酶一起配制，并作为允许它充当信号传导级联免疫调节剂的剂量的方案提供，协调宿主的免疫应答，以有效地对抗感染性疾病(包括HIV与其他病毒和感染因子)，同时它本身不被免疫系统(显著地)靶向。在一些实施方案中，通过糖苷酶的合适的配制和/或递送改善了所述组合物的这些特性。
[0023]在各个实施方案中， 并且不希望受理论的束缚，所述糖苷酶疗法至少部分地通过补体活化增强免疫功能。例如，使用单纯疱瘆(HSV-1)作为模型病毒时，体外研宄表明:相对于对照，将适当水平的神经氨酸苷酶和补体一起孵育既显著地降低了 HSV-1对Veix)细胞的感染性又显著地减少了游离病毒自预感染的细胞的释放(图1和图2)。
[0024]在各个实施方案中，并且不希望受理论的束缚，所述糖苷酶疗法至少部分地通过细胞因子刺激增强免疫功能，所述细胞因子包括例如白细胞介素-2(IL-2)、干扰素α (IFN-α)、干扰素γ (IFN-γ )、肿瘤坏死因子a (TNF_ a )、白细胞介素-4 (IL_4)和白细胞介素-6 (IL-6)。在体外细胞系统中使用时，相对于各自的对照，至少四种细胞因子的产生在适当水平的神经氨酸苷酶的存在下受到刺激。因此，在一些实施方案中，通过神经氨酸苷酶的被保持或永久的信号级联增强了这些细胞因子的功能，产生对免疫刺激的控制。
[0025]在各个实施方案中，并且不希望受理论的束缚，所述糖苷酶疗法至少部分地通过提高免疫细胞相互作用的效率增强免疫功能。在适当水平的神经氨酸苷酶以及其他糖苷酶的存在下，所述提高的免疫细胞相互作用的效率可能是因去除带负电荷的唾液酸分子所导致，产生更大的细胞间接触。在各个实施方案中，所述糖苷酶组合物和方案通过增强细胞介导的细胞毒性和/或免疫细胞活化增强了免疫功能。
[0026]在各个实施方案中，并且不希望受理论的束缚，所述糖苷酶方案至少部分地通过提高感染因子如病毒(例如，HIV、HSV、EBV、HCV、HPV、腺病毒))和受病毒感染的细胞对免疫机制的暴露而发挥作用。除了可能的补体活化之外，通过神经氨酸苷酶从HIV或感染HIV的细胞的gpl20去除末端唾液酸残基可具有另外的免疫刺激作用。从HIV的gpl20/gpl60去除末端唾液酸残基和/或其他聚糖暴露了隐藏的表位或改变了糖蛋白的构象，使得所述病毒更容易受到宿主的免疫系统的各个部分的攻击。本文所述的糖苷酶制剂和方案使免疫防御和病毒感染之间的微妙平衡向有利于宿主一方倾斜。
[0027]在各个实施方案中，不希望受理论束缚，可以包括神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶(以及其他糖苷酶，包括本文所述的那些)中的一种或多种的糖苷酶方案将维生素D结合蛋白(也被称为组特异性组分或Ge)体内转化为有效的巨噬细胞活化因子，从而活化巨噬细胞抵抗患者的感染性疾病。参见，例如美国专利5，326，749，其在此通过引用并入；Yamamoto等人，J Immunology卷151:2794-2802 (1993)。维生素D结合蛋白(也被称为DBP)是一种进化上保守的糖蛋白并且是遗传多态性的。DBP具有约52，000的相对分子量，并且通常构成约0.5%的血浆蛋白质。如本文所述的糖苷酶的适当剂量和方案可以导致抵抗特定的致病病原体(包括其抗原状态的特异性靶向)的有效、持续和长期的体内巨噬细胞活化，这对不断地改变暴露表位的病原体而言是至关重要的。因此，体内施用所述糖苷酶组合物(包括方便的舌下给药)导致抵抗病原体的有效的巨噬细胞活化。
[0028]在一个方面，本发明提供了用于治疗具有慢性病毒感染的患者的方法。所述方法包括对患者施用免疫耐受的和免疫信号传导的糖苷酶组合物的非急性方案，以治疗、改善和/或控制所述感染。在一些实施方案中，病毒是与宿主基因组整合(例如，作为原病毒)或者是可以为隐匿性的或以其他方式逃避免疫监护的病毒，从而难以或不可能完全消除。不例性的病毒包括逆转录病毒(如HIV)、单纯疱瘆病毒(如HSV-1或HSV-2)、肝炎病毒(例如，HAV、HBV、HCV)和腺病毒。在这样的实施方案中，本文所述的糖苷酶组合物和方案可以取代抗病毒化疗或免疫疗法(例如，细胞因子或趋化因子(如干扰素)疗法或单克隆抗体治疗)用于长期疾病控制，或者可以与这样的疗法组合以改善结果，也就是说，或者同时组合或者按顺序组合。
[0029]在一些实施方案中，所述患者是HIV阳性，并且在一些实施方案中所述患者是症状性AIDS患者。HIV感染是一个世界性的问题，并且各国政府已经作出部署以让其国民有机会获得抗逆转录病毒药物。尽管付出这些努力，有时药物因为欠缺沟通和交通不便导致无法获得，这导致患者错过了用药。此外，很多时候，患者不能耐受这些药物。在一些实施方案中本发明提供了抗逆转录病毒药物的替代，并且在其他实施方案中提供了另外的药剂以减少对长期使用抗逆转录病毒剂或其他化疗疗法或抗病毒疗法的需求。
[0030]因此，在一些实施方案中，在所述糖苷酶治疗期间所述患者没有接受抗逆转录病毒疗法，例如，因为所述患者不能耐受抗逆转录病毒疗法，或这样的ARV疗法对患者而言无法获得。所述HIV可以是任何亚型，如HIV-1或HIV-2。在一些实施方案中，所述HIV耐抗病毒化疗，使得替代疗法的可获得性是至关重要的。在一些实施方案中，在抗逆转录病毒疗法之后施用或启动所述糖苷酶以控制慢性AIDS，由此提供更有效和成本敏感的长期疾病控制。
[0031]所述糖苷酶方案也可以与抗逆转录病毒化疗一起施用，例如，以帮助逆转疾病轨迹。一旦疾病轨迹被逆转，则所述糖苷酶方案可以任选地持续至少一个月、至少两个月、至少四个月、至少六个月、或至少一年、或至少两年、或至少五年或更长，以提供所述疾病的具有成本效益的控制。可以如本文所述调节用于长期治疗的频率或每日剂量。
[0032]在一些实施方案中，免疫耐受的糖苷酶信号传导补偿了 CD4细胞的损失，同时给予宿主时间来恢复和补充它的这些关键细胞的供应。在一些实施方案中，所述糖苷酶组合物允许抗逆转录病毒疗法的受试者停止抗逆转录病毒疗法一段时间(例如，约一至六个月、或约一至四个月、或约一至两个月)，由此允许所述主体从这些药物的毒性作用中恢复，同时还提供成本优势。所述方案还实现了病毒和病毒颗粒，以及优先于宿主细胞的受感染的(例如，溶原的)细胞的免疫靶向。在一些实施方案中，AVR和糖苷酶治疗的这种“周期”在整个疗法中被重复一次或多次。在另外其他的实施方案中，所述糖苷酶疗法与抗逆转录病毒疗法一起施用防止了通常由逆转录病毒疗法表现出的免疫系统的部分衰减。与其他化疗方案一起施用，如在本段落中所述，对于其他病毒感染(例如，HSV-1或HSV-2、EBV、HAV、HBV、HCV、HPV、腺病毒)可提供相同或类似的优点。
[0033]被设计成对抗HIV的药物已被集中于病毒生命周期的不同阶段。一些药物已被设计成阻断病毒对CD4T细胞的附着。其他药物以参与细胞内的组装阶段的各种酶为目标；例如，齐多夫定(zidovudine) (AZT)是一种众所周知的药物，其作用是抑制逆转录酶(即HIV使用所述酶以将其RNA基因组复制到DNA中的酶)的活性。这些合成药物中的一些药物已经减缓了至AIDS的进展，但没有药物能停止它或消除病毒。一个主要的问题是HIV的高突变率，其中最初显示出一些希望的药物变得无效，因为病毒将其形式变为不再被药物识别出的形式。所述糖苷酶方案还以允许增强ARV以及其他可能的化疗的HIV突变衍生物为目标，以降低突变病毒规避治疗剂的倾向。
[0034]如本文所用，术语抗逆转录病毒疗法指被施用于HIV和AIDS患者的活性剂(通常是活性剂的混合物)。这些包括例如包括进入抑制剂(例如，马拉韦罗(maravi1C)和/或恩夫韦地(enfuvirtide))、CCR5受体拮抗剂、逆转录酶抑制剂(例如，齐多夫定、地丹诺辛(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、勝甲酸(foscarnet)和/或拉米夫定(Iamivudine))、蛋白酶抑制剂(例如，利托那韦(ritonavir)、地瑞那韦(darunavir)、阿扎那韦(atazanavir)、沙奎那韦(saquinavir))、整合酶抑制剂(例如，雷特格韦(raltegravir))、成熟抑制剂(例如，α-干扰素、贝韦立马(bevirimat)和/或vivecon)的疗法。在一些实施方案中，逆转录病毒疗法包括两种核苷类似物和一种非核苷类似物或蛋白酶抑制剂的组合。三种药物的这种组合通常被称为“三药混合物(cocktail)”。实例包括C0MBIVIR(齐多夫定+拉米夫定)、TRIZIVIR(阿巴卡韦(abacavir) +齐多夫定+拉米夫定)、KALETRA (洛匹那韦(1pinavir) +利托那韦)、EPZIC0M (阿巴卡韦+拉米夫定)、TRUVADA (替诺福韦(tenofovir) +恩曲他滨(emtricitabine))、ATRIPLA(依非韦伦(efavirenz)+替诺福韦+恩曲他滨)。其他组合包括:替诺福韦/恩曲他?兵/雷特格韦、替诺福韦/恩曲他?兵/利托那韦、和地瑞那韦/替诺福韦/恩曲他滨/利托那韦/阿扎那韦。
[0035]在一些实施方案中，所述抗逆转录病毒疗法包括两种核苷逆转录酶抑制剂和一种非核苷酸逆转录酶抑制剂。在一些实施方案中，所述ARV疗法包括司他夫定、拉米夫定和/或奈韦拉平(Nevirapine)。在一些实施方案中，所述ARV疗法包括依法韦仑。这样的疗法，如果施用，在过渡到长期糖苷酶治疗之前被有节制地使用，或以降低初始疾病轨迹。这种采用糖苷酶疗法的长期疾病控制引发了抵抗游离病毒(包括突变病毒)和受感染的细胞的免疫级联。
[0036]在各个实施方案中，本文描述的方案适于治疗在AIDS的不同阶段的患者。在一些实施方案中，在所述方案开始时患者的CD4计数小于约500个细胞/mm3。例如，在所述方案开始时患者的CD4计数可以在约200和约400之间。在所述方案开始时患者的CD4计数可以小于约400、小于约350、小于约300、小于约200、小于约100或小于约50。在一些实施方案中，当CD4计数小于400时，单独地或与所述糖苷酶组合物一起施用抗逆转录病毒疗法，并且一旦CD4计数正常化(例如，高于约400或高于约500或高于约800)则将所述糖苷酶组合物用于长期护理。在一些实施方案中，患者可能继续具有低于正常的CD4计数，但所述糖苷酶组合物帮助免疫系统对此缺损发挥作用。在另外其他的实施方案中，所述患者具有如所述的低CD4计数，并且在无逆转录病毒疗法下施用所述糖苷酶组合物，可以使CD4计数从长远来看正常化。
[0037]在一些实施方案中，在所述方案开始时患者的病毒载量高于约10，000/ml。例如，在所述方案开始时所述病毒载量可以是至少约25，000/ml、至少约40，000/ml、至少约50，000/ml、至少约 75，000/ml、至少约 100，000/ml、至少约 500，000/ml、至少约 I 百万 /ml或至少约5百万/ml。在一些实施方案中，患者接受抗逆转录病毒疗法以将病毒载量变为小于约50，000/ml、或小于10，000/ml或检测不到的，然后再过渡到糖苷酶治疗作为长期护理。在一些实施方案中，抗病毒疗法和糖苷酶的组合可以更快地或更完全地降低病毒载量。
[0038]在一些实施方案中，糖苷酶疗法的好处可至少部分地通过患者的健康评估(包括情绪和精神状态、食欲、能量水平、继发感染/并发症、毛发生长以及其他改善整体健康的症状)来辨识。采用AIDS治疗的常规定量(例如CD4水平或病毒滴度)可辨识出或未辨识出这样的 好处。
[0039]本文所描述的糖苷酶方案适用于其他慢性病毒感染。例如，在一些实施方案中，患者具有选自单纯疱瘆病毒感染(例如，HSV-1或HSV-2)、Epstein-Barr病毒感染(例如，单核细胞增多症)、巨细胞病毒感染、水痘带状疱瘆病毒感染、甲型、乙型或丙型肝炎、腺病毒感染或者人乳头状瘤病毒感染的慢性病毒感染。在一些实施方案中，患者被诊断为患有慢性疲劳综合征。所述糖苷酶组合物治疗和/或预防疾病的发作并减少病毒载量，并且在一些实施方案中，取代了传统的抗病毒策略，例如细胞因子和/或趋化因子疗法(例如，干扰素或白细胞介素)或小分子抗病毒药物(例如，阿昔洛韦(acyclovir)、伐昔洛韦(valaciclovir)、泛昔洛韦(famciclovir))。或者，一旦病毒感染处于常规疗法(例如，干扰素或小分子病毒抑制剂或单克隆抗体治疗)的控制之下，则施用所述糖苷酶组合物用于长期控制。在一些实施方案中，所述方案降低或消除病毒性病变(例如唇疱瘆)和/或防止其复发。
[0040]例如，在一些实施方案中，患者具有HSV或水痘带状疱瘆病毒感染，并且在一些实施方案中可具有带状疱瘆。按照本发明，患者可能无法接受抗病毒药物，例如阿昔洛韦、伐昔洛韦和/或泛昔洛韦，或在其他实施方案中，在传统抗病毒药物失败后施用所述糖苷酶疗法以改善或消除感染或其症状，或在凭借患者耐受这些药物的能力使传统抗病毒药物成为规则之后施用。
[0041]在另外其他的实施方案中，患者具有丙型肝炎病毒感染，并接受了干扰素疗法。在这样的实施方案中，例如，一旦该疗法失去效力或不被病人耐受，则可提供所述糖苷酶方案以替代无效的INF疗法。在其他实施方案中，所述糖苷酶方案可与干扰素疗法并行提供，以增强其效力。所述糖苷酶方案可促进干扰素或抗体疗法的适当整合用于有效的免疫应答。
[0042]在第二方面，本发明提供了治疗和/或预防不同于如上所述的慢性病毒感染的感染性疾病的方法。在一些实施方案中，所述感染性疾病是持续性或复发性细菌感染，例如与肺炎、支气管炎、鼻窦炎、阴道炎、肠炎、结肠炎、败血症或尿路感染有关的感染。所述方案针对持续性或复发性耳、眼、鼻和/或咽喉感染是更有效的。尽管致病性感染因子的身份不一定是至关重要的，但是本发明对其可以是有效的示例性细菌试剂包括分枝杆菌属的种(包括结核分枝杆菌)、假单胞菌属的种(例如，铜绿假单胞菌，如可能伴随囊性纤维化产生)、嗜血杆菌属的种(例如，流感嗜血杆菌)、莫拉氏菌属(Moraxella)的种、衣原体属(Chlamydia)的种、奈瑟氏菌属(Neisseria)的种、链球菌属的种、葡萄球菌属的种(包括MRSA)、博德特氏菌属(Bordetella)的种、耶尔森氏菌属(Yersinia)的种等。在一些实施方案中，在至少一轮抗生素治疗未能改善或消除感染之后施用所述糖苷酶方案。在一些实施方案中，所述糖苷酶方案与抗生素疗法并行施用，以增强其效果，并减少抗性细菌的发展的可能。在这些实施方案中，示例性抗生素包括氨基糖苷、碳青霉烯、头孢菌素、大环内酯、青霉素(例如，β内酰胺)、喹诺酮(例如，氟喹诺酮如环丙沙星)、磺酰胺或四环素或上述的组合。
[0043]在另外其他的实施方案中，所述糖苷酶方案有效抵抗可能是慢性、持续或复发的真菌或寄生虫感染。这种感染包括念珠菌病(例如，酵母菌性阴道炎)、疟疾、锥虫病、曲霉菌(Aspergillus)感染、弓形虫病和贾第虫病。可以在不成功的化疗或抗微生物治疗之后施用所述方案，或者可与所述治疗并行施用所述方案以增加成功治疗的速度，在一些实施方案中包括消除感染因子或其症状。
[0044]在另外其他的实施方案中，施用所述糖苷酶方案用于预防疾病，特别是当感染性疾病是例如在流感、SARS或其他疾病发作期间的特殊风险时。按照这个方面，患者接受了本文所述的组合物的非急性方案，其在一段足以跨越疾病发作周期的时间提供了有效的糖苷酶疗法。例如，可以对处于对抗流感的风险中的患者施用所述方案，而且所述方案在整个流感季节(例如，至少两个月、至少三个月、至少四个月或至少六个月)提供了持续的免疫刺激。本发明的这一方面可用于其他流行病或疾病发作，包括保护经常暴露于高度传染性试剂的医护工作人员。
[0045]在具体实施方案中，本发明用于免疫受损的患者，包括老年人、年轻人、住院治疗者以及具有免疫缺陷病况(如由AIDS、遗传性疾病或药物治疗引起)的患者以增强免疫功能。在某些实施方案中，所述糖苷酶组合物和/或方案用作疫苗增强剂，提供更有效的疫苗接种和/或更长的保护作用的持续时间，而且在一些实施方案中允许疫苗剂量节省。在一些实施方案中，疫苗是不含佐剂的疫苗，其中所述糖苷酶组合物充当佐剂。例如，所述糖苷酶组合物和方案可在约接受流感疫苗或其他疫苗时被启动(例如，在接受疫苗的一周或三天或一天内启动)，而且持续所述糖苷酶方案以延长所述疫苗的保护作用的持续时间和/或保护性抗体滴度的水平或持续时间。
[0046]所述糖苷酶方案提供了一种或多种对去除哺乳动物细胞(例如，免疫细胞和/或受病毒感染的细胞)上的一个或多个末端和/或倒数第二的糖基为活性的糖苷酶。这种末端和倒数第二的糖基包括，例如唾液酸基、半乳糖基、N-乙酰半乳糖氨基、岩藻糖基、葡糖基、N-乙酰葡糖氨基和甘露糖基残基。因此，在各个实施方案中所述糖苷酶方案可以包括神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶(例如，β -半乳糖苷酶)、N-乙酰氨基半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的一种或多种。
[0047]在一些实施方案中，所述糖苷酶方案包括神经氨酸苷酶疗法。所述神经氨酸苷酶疗法可以采用神经氨酸苷酶或具有神经氨酸苷酶(唾液酸酶)活性的纯化级分(fract1n)或其活性部分或活性衍生物。在一些实施方案中，所述神经氨酸苷酶是微生物(例如，细菌、病毒、寄生虫或真菌源)。在另外其他的实施方案中，所述神经氨酸苷酶是哺乳动物或植物来源的。所述神经氨酸苷酶可纯化自食物材料，包括发现在食物中的微生物，包括面包酵母和乳球菌属某种(Lactococcus sp.)和乳酸杆菌属某种(Lactobacillus sp.)。在某些实施方案中，所述神经氨酸苷酶是细菌来源的。所述神经氨酸苷酶可被纯化自或分离自其天然来源，或者可以是重组的或合成的(例如，化学合成的)。在一些实施方案中，所述神经氨酸苷酶是γ -B组神经氨酸苷酶，也称为外切-α -唾液酸酶、α -B组或乙酰基B组，其从宿主细胞和病毒的表面上的碳水化合物部分裂解出末端唾液酸残基。在一些实施方案中，所述神经氨酸苷酶催化寡糖、糖脂和多聚乙酰神经氨酸中的末端唾液酸残基的α -2，3、α -2，6和/或α -2，8糖苷键的水解。
[0048]例如，在各个实施方案中，所述神经氨酸苷酶是内切或外切唾液酸酶，例如催化末端唾液酸残基的α - (2 — 3)、α - (2 — 6)和/或α - (2 — 8)糖苷键的外切水解，或催化低聚唾液酸或聚(唾液酸)中的(2 —8)-α -唾液酸基键的内切水解。示例性的神经氨酸苷酶试剂包括远超过100种已知的神经氨酸苷酶中的任一种或其活性部分或衍生物。在一些实施方案中，所述神经氨酸苷酶是来自一种或多种产气荚膜梭菌(Clostridium perfringes)、产脈节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)、霍乱弧菌(Vibr1 cholerae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或其他活性被清楚表征的酶。此类神经氨酸苷酶可被纯化自或分离自其微生物源，或通过重组或合成产生。参见 Cassidy JT, The Sialic Acids-V1.Purificat1n and properties of sialidasefrom Clostridium perfringes.T B1l.Chem.240:9:3501-3506 (1965) ；Crenne11 S.等人，Crystal structure of Vibr1 cholerae neuraminidase reveals dual lectin-likedomains in addit1n to the catalytic domain.Structure 2:535-544(1994) ；Uchida等人，Enzymatic properties of neuraminidases from Arthrobacter ureafaciens.1B1chem.106:1086-1089 (1979)，并且这些文献通过引用在此并入。当处于纯化的形式时，所述神经氨酸苷酶是所述组合物的蛋白质组分的至少10%、所述组合物的蛋白质组分的至少25%、所述组合物的蛋白质组分的50%、或总蛋白质组分的至少75%、或总蛋白质组分的至少90%、或总蛋白质组分的至少95%、或总蛋白质组分的至少99%。
[0049]针对神经氨酸苷酶蛋白质的示例性氨基酸序列包括由GenBank登录号:EIA17609.1、EIA17977.1、NP_561469.1、CAA50436.1、(产气荚膜梭菌)、AAX22758.1、BAD66680.2(产脲节杆菌)、AAW31751.2、ΑΑΑ27546.1、ΑΕΑ78761.I (霍乱弧菌)、2VW0_A (肺炎链球菌)和AAL19864(鼠伤寒沙门氏菌)界定的那些，其各自通过引用在此并入。所述神经氨酸苷酶可包含与由 EIA17609.UEIA17977.UNP_561469.K CAA50436.UAAX22758.1、BAD66680.2、AAW31751.2、AAA27546.1、AEA78761.1、2VW0_A 和 AAL19864 界定的氨基酸序列中的一个或多个具有至少70 %、80 %、90 %、95 %或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。另外的神经氨酸苷酶被描述于美国专利8，012，733、美国专利6，916，916、美国专利5，985，859、美国专利5，830, 748和美国专利4，071, 408中，所述描述通过引用在此整体并入。
[0050]合适的神经氨酸苷酶可以从商业来源获得。示例性的神经氨酸苷酶包括SigmaAldrich 产品编号 N2876、N3001、N5631、N2133 (产气荚膜梭菌)、N7885、N6514 (霍乱弧菌)、N3786和N8271 (产脲节杆菌)。
[0051]这些或其他神经氨酸苷酶的衍生物或突变体的制备可以通过任何已知的结构或石开究教导，包括通过:Kim S等人，Features and applicat1ns of bacterial sialidases，Appl Microb1l B1technol.2011，91 (I): 1-15 ;Crenne11 SJ 等人，Crystal structureof a bacterial sialidase (from Salmonella typhimurium LT2)shows the same foldas an influenza virus neuraminidase，Proc Natl Acad Sci USA 1993 90(21):9852-6 ；Chavas LM,Cryst al structure of the human cytosolic sialidase Neu2:Evidence forthe dynamic nature of substrate recognit1n,J B1l Chem.2005 280 (I):469-75 ;XuG 等人，Crystal structure of the NanB sialidase from Streptococcus pneumoniae,J Mol B1l.2008 384(2):436-49 ；Newstead SL 等人，The structure of Clostridiumperfringens NanI sialidase and its catalytic intermediates, J B1l Chem.2008283(14):9080-8 ；Chan J 等人，Bacterial and viral sialidases:contribut1n of theconserved active site glutamate to catalysis, B1chemistry 2012 51 (I):433-41 ；Chien CH等人，Site-directed mutat1ns of the catalytic and conserved amino acidsof the neuraminidase gene, nanH， of Clostridium perfringes ATCC 10543， EnzymeMicrob.Technol.19(4):267-276(1996) ；Christensen 和 Egebjerg，Cloning，express1nand characterizat1n of a sialidase gene from Arthrobacter ureafaciens，B1technol.Appl.B1chem.41:225-231 (2005)描述的那些。这些参考文献各自通过引用在此整体并入。
[0052]—般可按照单位(U)描述神经氨酸苷酶活性，通过在确定条件下(例如，pH值5.0和37°C)确定从合适的底物释放出的唾液酸的量。示例性的底物是NAN-乳糖或牛颌下腺粘蛋白。参见 Warren L，J B1l.Chem.234 1971 (1959)。
[0053]在这些和其他的独立实施方案中，所述糖苷酶方案包括施用半乳糖苷酶，其在一些实施方案中是半乳糖苷酶。在涉及两种或更多种糖苷酶的实施方案中，半乳糖苷酶可以与神经氨酸苷酶或其他酶共同配制。α-或β-半乳糖基残基(包括I —3连接的、I —4连接的)充当哺乳动物细胞(包括免疫细胞)上的末端糖苷类，和/或可以是倒数第二的糖基残基，并且在某些情况下可以被连接到末端唾液酸。Hakomori，AberantGlycosylat1n in Cancer Cell Membranes as Focused on Glycolipids:Overviewand Perspectives, Cancer Research 45? 2405-2414(1985) ;Dwek 和 Brooks，HarnesingChanges in Cellular Glycosylat1n in New Cancer Treatment Strategies, CurrentCancer Drug Targets 4:425-442(2004)。因此，半乳糖苷酶(例如，β-半乳糖苷酶)可以根据本文描述的方法单独地使用，或者可以与神经氨酸苷酶或其他糖苷酶结合使用，其在一些实施方案中防止或减缓糖基结构的再唾液酸化或再加帽，从而使所述方案更加有效，并支持不太频繁的施用和/或更低的剂量。
[0054]示例性的半乳糖苷酶是众所周知的且可商购的。例如，半乳糖苷酶可以获自大肠杆菌(Escherichia coli)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)和肺炎链球菌以及其他微生物(例如，细菌或真菌)和生物来源，包括哺乳动物来源。例如，合适的半乳糖苷酶可获自Sigma-Aldrich目录编号G5635。
[0055]在这些和其他独立实施方案中，所述糖苷酶方案包括施用N-乙酰氨基半乳糖苷酶。在涉及两种或更多种糖苷酶的实施方案中，N-乙酰氨基半乳糖苷酶可以与神经氨酸苷酶或其他酶共同配制。Hakomori, Aberant Glycosylat1n in Cancer Cell Membranesas Focused on Glycol ipids: Overview and Perspectives, Cancer Research 45，2405-2414(1985) ;Dwek 和 Brooks， Harnesing Changes in Cellular Glycosylat1n inNew Cancer Treatment Strategies, Current Cancer Drug Targets 4:425-442(2004)o因此，N-乙酰氨基半乳糖苷酶可以根据本文描述的方法单独地使用，或者可以与神经氨酸苷酶或其他糖苷酶结合使用，其在一些实施方案中防止或减缓糖基链的再唾液酸化或再加帽。
[0056]示例性的N-乙酰氨基半乳糖苷酶是众所周知的且可商购的。例如，β -N-乙酰氨基半乳糖苷酶可以获自芽孢杆菌属某种(Bacillus sp.)以及其他微生物(例如，细菌或真菌)和生物来源，包括哺乳动物来源。例如，合适的β-N-乙酰氨基半乳糖苷酶可获自Sigma-Aldrich 目录编号 Α2464。
[0057]在这些和其他独立实施方案中，所述糖苷酶方案包括施用岩藻糖苷酶，其在一些实施方案中是α-岩藻糖苷酶。在涉及两种或更多种糖苷酶的实施方案中，岩藻糖苷酶可以与神经氨酸苷酶或其他酶共同配制(例如，与半乳糖苷酶或N-乙酰氨基半乳糖苷酶共同配制)。岩藻糖基残基(包括α I — 2连接的、α I — 3连接的和α I — 4连接的)充当哺乳动物细胞(包括免疫细胞)上的末端糖苷类，和/或可以是倒数第二的糖基残基，并且在某些情况下可以被连接到末端唾液酸。Hakomori，Aberant Glycosylat1n inCancer Cell Membranes as Focused on Glycol ipids: Overview and Perspectives,Cancer Research 45，2405-2414(1985):Dwek矛口Brooks,Harnesing Changes in CellularGlycosylat1n in New Cancer Treatment Strategies, Current Cancer Drug Targets4:425-442(2004)。因此，岩藻糖苷酶(例如，α -岩藻糖苷酶)可以根据本文描述的方法单独地使用，或者可以与神经氨酸苷酶结合使用，其在一些实施方案中防止或减缓糖基链的再唾液酸化或再加帽，从而使所述方案更加有效，并支持不太频繁的施用和/或更低的剂量。
[0058]示例性的岩藻糖苷酶是众所周知的且可商购的。例如，α-岩藻糖苷酶可以获自黄单胞菌属某种(Xanthomonas sp.)(例如，木薯萎蔫病黄单胞菌(manihotis))以及其他微生物(例如，细菌或真菌)和生物来源，包括哺乳动物来源。例如，合适的α-岩藻糖苷酶可获自Sigma-Aldrich目录编号F3023和F1924。
[0059]在这些和其他独立实施方案中，所述糖苷酶方案包括施用葡糖苷酶，其在一些实施方案中是α-葡糖苷酶。在涉及两种或更多种糖苷酶的实施方案中，葡糖苷酶可与神经氨酸苷酶或其他酶共同配制(例如，与神经氨酸苷酶、甘露糖苷酶或N-乙酰氨基半乳糖苷酶共同配制)。糖基残基(包括α I — 2连接的、α I — 3连接的和α I — 4连接的)充当哺乳动物细胞(包括免疫细胞)上的末端糖苷类，和/或在某些情况下可以是内部的糖基歹戈基。Hakomori, Aberant Glycosylat1n in Cancer Cell Membranes as Focused onGlycolipids:Overview and Perspectives, Cancer Research 45，2405-2414(1985) ；Dwek和 Brooks， Harnesing Changes in Cellular Glycosylat1n in New Cancer TreatmentStrategies, Current Cancer Drug Targets 4:425-442(2004)。因此，葡糖苷酶(例如，
葡糖苷酶)可以根据本文描述的方法单独地使用，或者可以与神经氨酸苷酶、甘露糖苷酶或其他糖苷酶结合使用，其在一些实施方案中防止或减缓糖基链的再唾液酸化或再加帽，从而使所述方案更加有效，并支持不太频繁的施用和/或更低的剂量。
[0060]示例性的葡糖苷酶是众所周知的且可商购的。例如，α-葡糖苷酶可以获自酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)、黑曲霉(Aspergillus niger)或嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophilus)以及其他微生物(例如，细菌或真菌)和生物来源(包括食物来源，如大米)，并且包括哺乳动物来源。例如，合适的α-葡糖苷酶可获自Sigma-Aldrich 目录编号 G5003、G0660、70797、49291、G9259 和 G3651。
[0061]在这些和其他独立实施方案中，所述糖苷酶方案包括施用N-乙酰氨基葡糖苷酶，其在一些实施方案中是β-N-乙酰氨基匍糖苷酶。在涉及两种或更多种糖苷酶的实施方案中，N-乙酰氨基葡糖苷酶可以与神经氨酸苷酶或其他酶共同配制(例如，与神经氨酸苷酶、甘露糖苷酶和/或葡糖苷酶共同配制)。N-乙酰葡糖胺残基(包括β? —4连接的、βI — 6连接的等)充当哺乳动物细胞(包括免疫细胞)上的末端糖苷类，和/或在某些情况下可以是倒数第二的或内部的糖基残基。Hakomori，Aberant Glycosylat1nin Cancer Cell Membranes as Focused on Glycolipids:Overview and Perspectives,Cancer Research 45，2405-2414(1985):Dwek矛口Brooks,Harnesing Changes in CellularGlycosylat1n in New Cancer Treatment Strategies, Current Cancer Drug Targets4:425-442(2004)。因此，N-乙酰氨基葡糖苷酶(例如，β-N-乙酰氨基葡糖苷酶)可以根据本文描述的方法单独地使用或者可以与神经氨酸苷酶、甘露糖苷酶或葡糖苷酶结合使用，其在一些实施方案中防止或减缓糖基链的再唾液酸化或再加帽，从而使所述方案更加有效，并支持不太频繁的施用和/或更低的剂量。
[0062]示例性的N-乙酰氨基葡糖苷酶是众所周知的且可商购的。 例如，β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶可以获自肺炎链球菌和直生刀豆(Canavalia ensiformis)以及其他微生物(例如，细菌或真菌)和生物来源(包括食物来源)，并包括哺乳动物来源。例如，合适的β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶可获自Sigma-Aldrich目录编号Α2264和Α6803。
[0063]在这些和其他独立实施方案中，所述糖苷酶方案包括施用甘露糖苷酶，其在一些实施方案中为α-甘露糖苷酶。在涉及两种或更多种糖苷酶的实施方案中，甘露糖苷酶可以与神经氨酸苷酶或其他酶共同配制(例如，与神经氨酸苷酶、葡糖苷酶和/或N-乙酰氨基葡糖苷酶共同配制)。甘露糖基残基(包括α I — 2连接的、α I — 3连接的、α I — 6连接的、β I — 4连接的等)充当哺乳动物细胞(包括免疫细胞)上的末端糖苷类，和/或在某些情况下可以是倒数第二的或内部的糖基残基。Hakomori，Aberant Glycosylat1nin Cancer Cell Membranes as Focused on Glycolipids:Overview and Perspectives,Cancer Research 45，2405-2414(1985):Dwek矛口Brooks,Harnesing Changes in CellularGlycosylat1n in New Cancer Treatment Strategies, Current Cancer Drug Targets4:425-442 (2004) o因此，甘露糖苷酶(例如，α -甘露糖苷酶)可以根据本文描述的方法单独地使用或者可以与神经氨酸苷酶、葡萄糖苷酶或N-乙酰氨基葡糖苷酶结合使用，其在一些实施方案中防止或减缓糖基链的再唾液酸化或再加帽，从而使所述方案更加有效，并支持不太频繁的施用和/或更低的剂量。
[0064]示例性的甘露糖苷酶是众所周知的且可商购的。例如，甘露糖苷酶可以获自直生刀豆(α)或法国大蜗牛(Helix pomatia) ( β )以及其他微生物(例如，细菌或真菌)和生物来源(包括食物来源)，并包括哺乳动物来源。例如，合适的甘露糖苷酶可以获自Sigma-Aldrich 目录编号 M7257 或 M9400。
[0065]对人或动物施用有效量的经配制的糖苷酶有助于通过免疫功能的调节和/或直接作用于受感染的细胞或其他参与病理的组织或细胞来预防或消除感染性疾病症状。在不影响正常的细胞功能下，以表现出症状或病理的减少的剂量和频率施用所述糖苷酶。在一些实施方案中，施用的剂量和/或频率是不会引起延长的关节不舒服或不适(例如，全身的不舒服感觉)的剂量和/或频率。当患者经历关节或全身不舒服时，所述患者可调节施用的剂量或频率，直到不舒服消退或正常化。例如，当患者经历不舒服时，所述患者可以跳过一天、两天或三天的用药，和/或从所述方案中减去一个或两个每日剂量，和/或增加剂量之间的时间安排，直到不舒服消退或正常化。因此，患者发现不会诱发延长的关节不舒服或使不舒服最小化的最高施用剂量和/或频率。在一些实施方案中，当剂量的量为可控时，例如，使用带计量的剂量施用器，可以减少所述剂量但时间表被保持。因此，当给定了患者的独特生物学的状态、疾病或免疫系统状况时，每个患者可通过发现不会诱发延长的关节不舒服或不适的最高剂量和/或频率来根据需要定制剂量。在实践中，可以按每剂量单位小于约10_2mg或小于约10_3mg对人或动物施用所述糖苷酶制剂。在某些实施方案中，按约10_3mg至10_8mg之间施用所述糖苷酶。在另外其他的实施方案中，糖苷酶的剂量在约10_3mg和lCr7mg之间、lCr3mg和lCT6mg之间、lCT3mg和lCT5mg之间或约lCT4mg。在一些实施方案中，每个受试者的总的每日剂量不超过约10_3mg，或在一些实施方案中，不超过约5X10_3mg至l(T4mg。通常，表现出免疫抑制的患者(如接受ARV的那些)可能需要l(T2mg或l(T3mg范围内的更高剂量。
[0066]尽管某些糖苷酶(包括神经氨酸苷酶)可以具有形成同源二聚体(例如，三聚体、四聚体)的倾向，但是在各个实施方案中，将所述糖苷酶配制(例如，稀释)成作为单体和/或二聚体存在，其中如可通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定的基本无更高的聚集体。
[0067]可以将所述糖苷酶配制成含水制剂，包括用于舌下、鼻或颊部递送。在一些实施方案中，所述含水制剂包括盐水。在一些实施方案中，所述制剂具有约0.5至约2%盐水的离子强度，例如约0.9%盐水的离子强度。在一些实施方案中，在生理盐水(例如，约0.9%盐水)中配制所述糖苷酶。也可使用用于舌下、鼻或颊部递送的其他常规载体。所述糖苷酶还可进一步与防腐剂一起配制，所述防腐剂可以是芳族或酚类防腐剂。例如，在一些实施方案中，所述防腐剂是苯酚。例如，在一些实施方案中，神经氨酸苷酶任选地与其他的糖苷酶在0.05至0.5%的苯酚或相当量的类似起作用的防腐剂(例如)中配制。在一些实施方案中，通过苯酚(例如至少0.2%、0.3%或0.4%苯酚)的存在提高了神经氨酸苷酶和可能其他糖苷酶的活性。在一些实施方案中，在含有约0.2%至约1%苯酚(例如，0.2至0.6%苯酸或约0.4%苯酸)的溶液中孵育所述神经氨酸苷酶(例如，Sigma Aldrich目录编号N2876、N3001、N5631、N2133、N7885、N6514、N3786、N8271)，然后被稀释成或形成最终的制剂，其可含有0.05%至约0.2%的苯酚。在一些实施方案中，所述神经氨酸苷酶的这种“活化”允许以较低的剂量施用活性剂，以避免免疫靶向，同时保持活性的适当水平。
[0068]为了说明，神经氨酸苷酶以及任选与其他糖苷酶可以与0.9%盐水混合，经过过滤灭菌，并在室温下静置10分钟至五小时(例如，约30分钟至约三小时)。在室温孵育之后，加入苯酚盐水以得到在0.9%盐水中的最终苯酚浓度为约0.1%的溶液。将所述溶液贮藏在 4。。。
[0069]或者，神经氨酸苷酶以及任选的其他糖苷酶与约0.4%苯酚盐水混合。所述溶液经过过滤灭菌，并在室温下静置5分钟至5小时(例如，约30分钟、约一小时或约三小时)。在室温孵育之后，最终浓度变为约0.1 %苯酚、0.9%盐水。将所述溶液贮藏在4°C。
[0070]可通过多种途径施用所述糖苷酶制剂，包括舌下、鼻、口(port)、真皮下、灌胃、目艮内、静脉内、肌内、皮下、经真皮和颊部。在各个实施方案中，通过舌下施用所述糖苷酶。在一些通过舌下施用所述糖苷酶的实施方案中，所述神经氨酸苷酶在舌下保持约I至约5分钟，并且优选为约3、约4或约5分钟。在此期间患者应避免讲话。在施用的15分钟内患者应不吃或不喝。
[0071]根据本发明的各方面，按平均每天2至6次施用糖苷酶的方案至少两周或至少一个月，特别是针对免疫受损或晚期病例。每天的施用应基本上均匀地间隔开，但在各个实施方案中间隔约15分钟至5小时。例如，剂量可以间隔约15分钟、约30分钟、约I小时、约2小时或约3小时。例如，可以按平均每天2至8次施用所述糖苷酶制剂至少约两个月、至少约四个月或至少约五个月或至少约六个月。在一些实施方案中，按每天约2、约3或约4次施用所述糖苷酶制剂至少一个月、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月。通常，在不会表现出显著延长的关节不舒服或不适下，按有效地减少感染性疾病的病理或刺激免疫系统的剂量和频率施用所述糖苷酶制剂。当患者确实经历关节或全身不舒服时，所述患者调节剂量和/或频率(例如，跳过一天、两天或三天的神经氨酸苷酶给药，或将每日剂量减少一次或两次施用)，直到不舒服消退或正常化。因此，在一些实施方案中所述施用方案在关节不舒服时暂停。
[0072]例如，治疗的第一天可以约八个剂量开始，在首先的一个或两个小时内服用首先的三至五个剂量，其余在全天大致均匀间隔地服用。然后可以通过每天约四个剂量对患者进行治疗，定期监测恶性肿瘤。即使当恶性肿瘤为检测不到时，患者仍可以保持每天2至7个剂量的方案，如基于关节不舒服或不适的表现时不时地调节。
[0073]可以如上所述地启动疗法。然而，在一些实施方案中，所述糖苷酶方案是这些常规疗法的替代。在一些实施方案中，随后通过每天约一剂量对患者长期治疗至少约六个月、或至少约一年、或至少约两年、或至少约五年或更长，或者被选择或被规定用于此类长期治疗。在一些实施方案中，在不存在化疗或其他疗法下这种后续的长期治疗用以减少复发或疾病进展的可能性。长期糖苷酶治疗，例如，为了防止疾病复发或再发，可以每天施用I或2次。
[0074]在一些实施方案中，患者被指导监测关节僵硬或不适。这样的状况表明应对糖苷酶治疗进行调节。所述调节可以包括跳过一天或两天或多至一周的用药，或可选地通过每天一次或两次施用降低剂量，直到症状消除。其他分子测定可用于同样的效果，但是关节僵硬或不适提供了患者顺应性的缓解。因此，在所述方案的过程中，可容易地针对患者对所述糖苷酶剂量进行调节，从而保持长期的最佳护理。
[0075]在本发明的另外其他方面，提供了一种药物组合物，其包含用于根据需要施用单一的糖苷酶剂量的递送媒介物，且其中所述媒介物含有至少50个剂量、或至少100个剂量、至少150个剂量、或至少200个剂量的全糖苷酶方案。施用的每个糖苷酶剂量的量为至多约10_2mg糖苷酶和如已经描述的药学上的惰性成分。所述药物组合物可包含神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶、N-乙酰氨基半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的至少两种以及药学上可接受的赋形剂。例如，所述组合物可以包含神经氨酸苷酶和β -半乳糖苷酶。所述糖苷酶可以按约10_3mg至10_8mg之间存在(全体地)，或根据上文所公开的剂量存在。所述组合物可以被配制用于多种如本文所公开的施用途径，包括舌下递送。
[0076]在各个实施方案中，所述治疗方案包括不超过约10_3mg的糖苷酶的量的分割式施用(partit1nal administrat1n)，但是，在某些情况下，在任何一天中施用的糖苷酶的总量可以超过此限度。
[0077]可以各种途径和形式施用所述糖苷酶制剂。例如，所述糖苷酶可以作为固体施用，其中所述酶被包埋或混合在生物可降解或生物可蚀性基质中。所述基质可以是延时释放基质(time release matrix) ο这些基质是那些本领域普通技术人员所熟知的。可以通过注射或通过舌下途径施用所述糖苷酶。在一个实施方案中，所述媒介物是被包含在惰性容器中的水溶液。在另一个变型中，所述组合物是栓剂的形式。所述组合物的液体形式可以经皮下、肌内或静脉内注射。此外，可通过粘膜(如鼻膜)施用所述组合物。
[0078]在某些实施方案中，通过药物施用器施用所述糖苷酶组合物，所述施用器包括至少100个剂量、或至少150个剂量或至少200个剂量的组合物。在各个实施方案中，所述施用器用于舌下、鼻、经真皮、真皮下延时释放、眼内、灌胃、口、皮下、口服或颊部递送。例如，所述施用器用于舌下递送。
[0079]在一些实施方案中，所述施用器递送可以由患者根据需要进行调节的带计量的剂量。
[0080]所述施用器优选以维持剩余剂量的无菌条件的方式分配剂量。通过非限制性实例的方式，所述施用器可以是被描述在美国 专利4，830，284 ;4，565，302 ;5，011，046 ；5，147，087 ;5，893，484 ;6，877，672 ;6，886，556 和 7，201，296 中的那些中的任一种，所述美国专利各自通过引用在此整体并入。例如，所述施用器可以是雾化或给药泵，其可以确保存在于泵缸和排放口之间的区域中的介质不会干涸或不以其他方式受环境影响而改变。参见美国专利4，830，284，其通过引用在此并入。在一些实施方案中，所述施用器采用了 0.2 μ m的过滤器，以维持无菌内容物。此外，所述施用器可以在单一冲程排放中分配剂量。此类施用器被描述在美国专利5，893，484中，其通过引用在此并入。所述施用器可被构造用于经鼻递送、真皮递送、咽喉递送或舌下递送。在一些实施方案中，所述施用器实现了可致动的给药机构，其允许监测精确的剂量，因此在很大程度上消除了在剂量的数目和/或持续给药方面不正确的给药。参见美国专利4，565，302，其通过引用在此并入。在一些实施方案中，所述施用器递送50至100 μ I的剂量，如在例如美国专利6，886，556中描述的施用器，其通过引用在此并入。
实施例
[0081]实施例1 J^HSV-1感染件的影晌
[0082]使用HSV-1作为模型病毒，启动体外研宄以确定神经氨酸苷酶和补体对自Vero细胞的病毒感染性和病毒释放的影响。对于感染性研宄而言，将补体、病毒和神经氨酸苷酶的组合一起孵育，然后加入到Ve1细胞，并进一步孵育。然后进行细胞固定和染色后，对细胞中形成病毒的斑块进行计数。结果表明，相对于对照，将病毒与神经氨酸苷酶和补体一起孵育显著地(70-80% )降低了 Vero细胞的病毒感染性(图1)。
[0083]对于病毒释放研宄而言，使Vero细胞首先用HSV-1感染。然后将这些细胞与不同浓度的补体和神经氨酸苷酶孵育。对来自细胞培养物的上清液测试形成斑块的能力，所述斑块表明自细胞释放出的病毒。结果表明，相对于对照，在神经氨酸苷酶和补体两者的存在下，游离病毒的释放被大大降低(70-80% )(图2)。这些结果表明，神经氨酸苷酶和补体的组合既显著地降低了受HSV-1感染的Ve1细胞的感染性又显著地减少了游离病毒自预感染的细胞的释放。
[0084]实施例2:对细胞因子释放的影响
[0085]研宄了神经氨酸苷酶对某些体外细胞因子的产生的影响。细胞因子是由活化的淋巴细胞分泌的应答于感染的化学信使。任何给定的细胞因子(单独的或与其他细胞因子组合)可对免疫功能产生多重作用。白细胞介素_2(IL-2)、干扰素α (IFN-α)、干扰素γ (IFN-γ)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)是参与宿主抵抗病毒的防御的重要细胞因子。IL-2、TNF-a和IFN-γ由T细胞的T辅助(THl)子集产生，并且因此与炎症过程相关。IL-2和IFN-γ —起活化巨噬细胞，所述巨噬细胞是吞噬并消化病原体(吞噬作用)的重要的免疫细胞，并且还可以用作对T淋巴细胞的抗原提呈细胞。IL-2和IFN-γ还提高了自然杀伤(NK)细胞在清除受病毒感染的细胞中的细胞毒性。IFN-γ还增强了抗原提呈细胞上的主要组织相容性复合体(MHC) I类和II类分子的表达，从而诱导参与病毒清除的CD4+和CD8+溶细胞性细胞。IFN-γ还与TNF-α组合以刺激NK细胞。IFN-α通过阻断早期病毒蛋白的转录来抑制病毒复制。
[0086]使用细胞系统、孵育条件和其他适合于生产和测定各分子的程序对这些细胞因子进行了体外研宄。将含神经氨酸苷酶的试验样品与盐水对照进行了比较。图3总结了当对用神经氨酸苷酶处理的细胞测试IL-2、IFN-a ,IFN-γ和TNF-α的产生时获得的结果。相对于各自的对照，使用治疗剂量的神经氨酸苷酶刺激了所有四种细胞因子的产生。预期上面讨论的这些细胞因子的功能可以通过体内系统中的神经氨酸苷酶得到加强并会在患者中具有抗病毒效果是合理的。
【主权项】
1.一种用于治疗具有慢性病毒感染的患者的方法，其包括: 对所述患者施用免疫耐受的和免疫信号传导的糖苷酶组合物的非急性方案，以治疗、改善和/或控制所述感染。2.如权利要求1所述的方法，其中所述患者是HIV阳性。3.如权利要求2所述的方法，其中所述患者具有AIDS。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述患者未经受抗病毒化疗，和/或所述HIV对抗病毒疗法有抗性。5.如权利要求3所述的方法，其中在抗病毒疗法之后启动所述方案以控制慢性AIDS。6.如权利要求3所述的方法，其中所述组合物与抗病毒疗法一起施用以逆转疾病轨迹，以及任选地持续至少六个月、或至少一年、或至少两年、或至少五年来任选地在无ARV治疗的情况下控制所述感染。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在所述方案开始时所述患者的CD4计数小于500。8.如权利要求7所述的方法，其中在所述方案开始时所述患者的CD4计数在200和400之间。9.如权利要求7所述的方法，其中在所述方案开始时所述患者的CD4计数小于400、小于350、小于300、小于200、小于100或小于50。10.如权利要求2至9中任一项所述的方法，其中在所述方案开始时病毒载量为大于10，000/ml ο11.如权利要求10所述的方法，其中在所述方案开始时所述病毒载量为至少25，000/ml、至少 40，000/ml、至少 50，000/ml、至少 75，000/ml、至少 100，000/ml、至少 500，000/ml、至少I百万/ml或至少5百万/ml。12.如权利要求1所述的方法，其中所述患者具有选自单纯疱瘆病毒感染、水痘带状疱瘆病毒感染、甲型、乙型或丙型肝炎、腺病毒感染或者人乳头状瘤病毒感染的慢性病毒感染。13.如权利要求12所述的方法，其中所述患者具有带状疱瘆。14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶方案包括施用神经氨酸苷酶。15.如权利要求14所述的方法，其进一步包括施用半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的一种或多种。16.一种用于治疗具有持续性或复发性细菌感染的患者的方法，其包括对所述患者施用糖苷酶的方案。17.如权利要求16所述的方法，其中所述细菌感染与肺炎、支气管炎、鼻窦炎、肠炎、结肠炎、败血症或尿路感染相关。18.如权利要求16所述的方法，其中所述细菌感染是持续性或复发性耳、眼、鼻和/或咽喉感染。19.如权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述细菌是分枝杆菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、衣原体属、奈瑟氏菌属、链球菌属、葡萄球菌属、博德特氏菌属或耶尔森氏菌属的种。20.如权利要求19所述的方法，其中所述细菌是结核分枝杆菌。21.如权利要求16至20中任一项所述的方法，其中在至少一轮的抗生素疗法未能改善或消除所述感染之后施用所述糖苷酶方案。22.如权利要求14至18中任一项所述的方法，其中与抗生素疗法并行施用所述糖苷酶方案。23.如权利要求20所述的方法，其中所述抗生素疗法采用氨基糖苷、碳青霉烯、头孢菌素、大环内酯、β内酰胺、喹诺酮、磺酰胺或四环素中的一种或多种。24.如权利要求16至23中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶方案包括施用神经氨酸苷酶。25.如权利要求24所述的方法，其进一步包括施用半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的一种或多种。26.一种用于治疗真菌或寄生虫感染的方法，其包括对需要其的患者施用糖苷酶方案。27.如权利要求26所述的方法，其中所述感染是念珠菌病。28.如权利要求26所述的方法，其中所述感染是疟疾或锥虫病。29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶方案包括施用神经氨酸苷酶。30.如权利要求29所述的方法，其进一步包括施用半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的一种或多种。31.—种用于增强疫苗接种的方法，其包括对所述患者施用免疫信号传导的糖苷酶的方案，所述方案在疫苗接种之前、期间或之后开始。32.如权利要求31所述的方法，其中所述疫苗是不含佐剂的疫苗。33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中通过选自舌下、鼻、口、真皮下、灌胃、眼内、静脉内、肌内、皮下、经真皮和颊部的途径施用所述糖苷酶。34.如权利要求33所述的方法，其中通过舌下施用所述糖苷酶。35.如权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶方案包括施用神经氨酸苷酶。36.如权利要求35所述的方法，其进一步包括施用半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的一种或多种。37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶是生物来源的糖苷酶或保持了免疫调节活性的其衍生物或活性部分。38.如权利要求35或36所述的方法，其中所述糖苷酶来自于生物来源或是合成的。39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中按照平均每天2至6次施用所述糖苷酶至少一个月。40.如权利要求39所述的方法，其中按照平均每天2至6次施用所述糖苷酶至少两个月、至少四个月或至少六个月。41.如权利要求39所述的方法，其中随后每天用约一个剂量对所述患者长期地治疗，持续至少六个月、或至少一年、或至少两年、或至少五年或更长。42.一种用于施用糖苷酶组合物的药物施用器，所述施用器包括至少100个剂量的所述神经氨酸苷酶组合物。43.如权利要求42所述的药物施用器，其中所述施用器用于舌下、鼻、经真皮、真皮下延时释放、眼内、灌胃、口、皮下、口服或颊部递送。44.如权利要求42所述的药物施用器，其中所述施用器是用于舌下递送。45.如权利要求42至44中任一项所述的药物施用器，其中所述施用器以维持剩余剂量的无菌条件的方式分配剂量。46.如权利要求45所述的药物施用器，其中所述施用器递送50至100μ I的剂量。47.如权利要求42至46中任一项所述的药物施用器，其中所述糖苷酶包括神经氨酸苷酶。48.如权利要求42至46中任一项所述的药物施用器，其中所述糖苷酶包括神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶以及甘露糖苷酶中的至少两种。
【专利摘要】在各个方面，本发明涉及免疫耐受的糖苷酶疗法。本发明提供了用于治疗或预防包括慢性病毒感染在内的感染性疾病、以及对免疫系统呈现持续挑战的高度传染性的感染因子的方法。所述组合物和治疗方案可与其他抗病毒或抗微生物疗法一起使用，以及与疫苗接种结合使用以增强效力和/或延长保护作用的持续时间。在某些实施方案中，本文描述的方案减少或消除了对施用其他传统的抗病毒或抗微生物疗法的需求。在各个实施方案中，本发明可用于免疫受损的患者中以增强免疫功能。
【IPC分类】A61P31/04, A01N25/00, A61K39/21
【公开号】CN104902926
【申请号】CN201380053622
【发明人】艾里斯.克莱恩
【申请人】艾里斯.克莱恩
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年9月26日
【公告号】CA2886474A1, EP2900259A1, US20150238580, WO2014052621A1
【专利说明】用于治疗感染性疾病的糖苷酶方案
[0001]优先权
[0002]本申请要求2012年9月28日提交的美国临时申请第61/707，252号的优先权和权益，所述临时申请通过引用在此整体并入。
发明领域
[0003]本发明涉及疾病的治疗和预防，并且特别是采用糖苷酶疗法预防、治疗和控制包括慢性和非慢性病毒感染在内的感染性疾病和其他感染性疾病。
[0004]发明背景
[0005]具有慢性感染(如慢性病毒感染，例如HIV、HSV、肝炎病毒、HPV等)的患者即使得到了有效地治疗以逆转疾病轨迹或疾病状态，其仍需要长期的疾病控制。然而，化疗剂、单克隆抗体或细胞因子疗法的持续施用可导致病原体抗性、对患者的毒性作用包括免疫抑制、随时间推移丧失效力，并且对于许多患者而言是费用过高的。例如，抗逆转录病毒(ARV)疗法虽然成功地减缓了 AIDS的进展，但是它已将该疾病转变成需要长期治疗以及基本接受非常显著的副作用和巨大的药物成本的慢性疾病。Atun和Bateringaya，BuildinRa during response to HIV/AIDS:1mplicat1ns for health systems, J.Acquir ImmuneDefic.Syndr.57增刊2: S91-5 (2011)。对此类感染性疾病的更有效的长期疾病控制需要随时间推移保持效力、并且基本上对患者无毒或没有免疫抑制、并且理想地具有成本效益的活性剂。
[0006]此外，治疗或预防某些感染性或流行性疾病(包括流感、SARS和普通感冒)需要长期增强免疫系统以预防感染或预防严重的疾病。这对于受损的免疫尤其如此，因为可用的小分子疗法可以加剧免疫缺陷，并且疫苗可能只是略微有效的。当疫苗供不应求或不可用时，这样的需求特别高。
[0007]需要有效地预防、治疗和/或控制感染性疾病，包括控制慢性感染，以及控制高度传染性的感染性疾病。
【发明内容】
[0008]在各个方面，本发明提供了用于治疗或预防包括慢性感染在内的感染性疾病、以及对免疫系统或公共健康普遍呈现持续挑战的高度传染性的感染因子(infect1usagent)的组合物和方法。本文中所描述的组合物和治疗方案可以与其他抗病毒或抗微生物疗法一起使用，以及与疫苗接种(例如，非含佐剂的疫苗接种)结合使用以增强疫苗效力和/或延长保护作用的持续时间。所述治疗包括对患者体内施用糖苷酶方案(例如，一种或多种糖苷酶的方案)。在各个实施方案中，所述糖苷酶方案并不被患者的免疫系统靶向。在各个实施方案中，所述糖苷酶方案提供了一种或多种对去除哺乳动物细胞(例如，免疫细胞)、受感染的细胞或其他导致免疫活化的糖基化靶标上的一个或多个末端糖基为活性的糖苷酶。所述糖苷酶疗法通过其作用于免疫细胞而引发免疫信号传导级联。靶向末端糖基可以包括，例如，唾液酸基(sialosyl)、β -半乳糖基、N-乙酰半乳糖氨基、岩藻糖基、葡糖基、N-乙酰葡糖氨基和甘露糖基残基等等。因此，在各个实施方案中，所述糖苷酶方案可以包括神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶等中的一种或多种。不希望受理论的束缚，所述方案通过从免疫细胞、受感染的细胞和/或其他糖基化靶标的表面去除有效量的糖基结构(例如，唾液酸)增加了免疫信号传导。以这种方式，所述糖苷酶方案编排或设计了有效的免疫应答，允许受感染的细胞的抗原靶向并引发适当水平的细胞因子/趋化因子级联用于治疗。在这些或其他实施方案中，所述糖苷酶包括至少一种对免疫细胞表面上的突出的末端糖基残基特异的酶(例如，神经氨酸苷酶和/或半乳糖苷酶)，和至少一种对免疫细胞表面上的突出的倒数第二的糖基残基特异的酶(例如，半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶或甘露糖苷酶)。在一些实施方案中，这样的酶与神经氨酸苷酶协同作用。所述方案并不会使患者的免疫系统失调(反而是协调)，这在抗击感染性疾病中是至关重要的，并且即使在一定水平的细胞毒性化疗的存在下也是有效的，所述化疗可对免疫细胞具有有害的影响。此外，所述方案适用于长期疗法或反复疗法，原因是在各个实施方案中所述试剂并不被免疫系统靶向。在各个实施方案中，所述方案避免了从正常细胞过多地去除唾液酸或其他糖基结构，以便它们保持正常功能。
[0009]在某些实施方案中，本文所描述的糖苷酶方案减少或消除了对施用其他传统的抗病毒或抗微生物疗法的需求。在各个实施方案中，本发明可用于免疫受损或免疫抑制的患者中以增强免疫功能。在各个实施方案中，所述糖苷酶方案不被免疫靶向，并且因此产生的糖苷酶信号传导可用于长期疗法。
[0010]在一个方面，本发明提供了通过包含糖苷酶制剂的组合物的非急性方案治疗具有慢性病毒感染的患者的方法，所述糖苷酶制剂既为免疫系统耐受的(“免疫耐受的”)又足以刺激经协调的免疫信号传导。因此所述糖苷酶组合物提供了免疫刺激，如通过一个或多个完整的免疫调节级联，同时避免了所述糖苷酶的免疫靶向，否则这种免疫靶向会随时间推移消除其效力。
[0011]所述糖苷酶组合物和方案是具有成本效益的治疗，以逆转病毒性疾病状态或轨迹和/或过渡到长期疾病控制。在一些实施方案中，患者是症状性AIDS患者，并且所述糖苷酶组合物与ARV疗法一起提供或作为ARV疗法的替代而提供，以逆转疾病轨迹。尽管ARV可以是有效的抗病毒治疗，但是ARV具有抑制免疫系统的不利影响，即一种尤其对HIV或AIDS患者有害的影响。因此，通过本文所描述的方案的持续免疫调节具有改善这些副作用的能力，同时从长远来看过渡到主要的疾病控制。可选地或另外，在状况得到改善后，所述糖苷酶组合物允许过渡到用于长期疾病控制的具有成本效益的方案，这在一些实施方案中消除了对长期ARV疗法的需求。所述方案对于控制慢性病毒感染如HIV、HSV、EBV、HAV、HBV、HCV、HPV、腺病毒等而言是普遍有效的。
[0012]在第二方面，本发明提供了治疗和/或预防感染性疾病的方法。根据这个方面，患者接受本文所述的组合物的方案，所述方案提供并随时间推移保持有效的免疫刺激，包括作为在流感季节或其他持续的感染性疾病发作或流行病期间单独的或额外的保护。在具体的实施方案中，本发明可用于免疫受损的患者，包括老人、儿童、病人、住院治疗者以及具有免疫缺陷性病症(包括遗传免疫缺陷、药物诱导的免疫缺陷或因感染性疾病如AIDS引起)的那些人。在某些实施方案中，所述组合物和/或方案充当佐剂以增强疫苗效力，从而提供更有效的疫苗接种和/或更长的疫苗保护作用的持续时间，并在一些实施方案中，允许疫苗剂量节省。
[0013]在其他方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶、N-乙酰氨基半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的至少两种以及药学上可接受的赋形剂。例如，所述组合物可以包含神经氨酸苷酶和半乳糖苷酶。所述糖苷酶可以按约10_3mg至10_8mg之间共同存在。所述组合物可以被配制用于多种施用途径，包括舌下递送。
[0014]在另外其他的方面，本发明提供了一种方便的糖苷酶剂量施用器。所述施用器递送足够数目的糖苷酶剂量用于非急性方案，例如，至少一个月的剂量，用于逆转病毒性疾病的轨迹或控制感染性疾病，或用于预防或减轻感染性疾病，或增强疫苗效力。所述施用器在所述方案的过程中保持所述组合物的稳定性，保护所述组合物免于暴露至可能的环境污染。在根据本文所描述的方案施用所述剂量所需的时间长度的过程中，所述糖苷酶组合物是稳定的。
【附图说明】
[0015]图1示出了神经氨酸苷酶和补体对受HSV-1感染的Vero细胞的感染性的影响。将所示单位的补体与神经氨酸苷酶和HSV-1孵育。然后将这些混合物加入到Vero细胞并孵育5天。在细胞固定和染色之后，对斑块进行计数，其中每个斑块对应于一个初始的感染性病毒颗粒。感染性被表示为病毒对照(与细胞在无补体或神经氨酸苷酶下孵育的病毒)的百分比。
[0016]图2示出了神经氨酸苷酶和补体对Vero细胞中的感染性HSV-1的产率的影响。将Vero细胞与HSV-1孵育。然后将这些受感染的细胞与含有所示单位的补体和神经氨酸苷酶的混合物孵育。对照由在无补体或神经氨酸苷酶下受感染的细胞(病毒对照)组成。进行24小时孵育后，测试来自细胞培养物的上清液(含有释放的病毒)形成斑块的能力。产率被表示为病毒对照的百分比。
[0017]图3总结了神经氨酸苷酶对体外细胞因子的产生的影响。在神经氨酸苷酶的存在(实验)或不存在(对照)下孵育适合于产生和测量各细胞因子的细胞。对于IL-2、IFN_a和IFN- γ而言，总的细胞的RNA被提取并与细胞因子特异性放射性探针杂交并测定每分钟的计数。对于TNF-a而言，在细胞溶解测定中测量光密度。各细胞因子的值被表示为与相应的盐水对照的差异百分比。如通过正值所表示的，所有四种受测试的细胞因子相对于对照在神经氨酸苷酶的存在下受到刺激。
[0018]发明详述
[0019]本发明提供了用于非急性免疫增强的组合物、方法和治疗方案，其应用于治疗慢性感染性疾病，包括疫苗(例如，不含佐剂的疫苗)增强。
[0020]在一个方面，本发明包括对具有感染性疾病的患者施用一种或多种糖苷酶的体内方案。所述体内方案通过从免疫细胞或其他靶标的表面去除有效量的糖苷酶类(在一些实施方案中特别是唾液酸)来刺激免疫信号传导，并避免从正常细胞过多地去除包括唾液酸的糖苷酶类。所述方案通过被引发的免疫级联允许受感染的细胞的持续性抗原靶向。在一些实施方案中，所述方案包括对去除受病毒感染的细胞上普遍存在的糖苷酶类以及在各个实施方案中是末端或倒数第二的糖苷酶类为活性的酶。在一些实施方案中，所述方案包括神经氨酸苷酶和对去除普遍存在的倒数第二的糖基残基特异的第二糖苷酶，这可以通过避免、预防或减缓糖基链的再唾液酸化和/或再加帽提供协同治疗。包括作为辅助疗法并包括涉及方便的患者剂量监测的实施方案的所述施用方案如本文所详细描述。根据这个方面，所述方法的效力并不决定性地依赖于感染因子的身份(identity)或患者的独特生物学，这不同于许多常规疗法。
[0021]在各个实施方案中，本发明提供了足以用于免疫刺激的糖苷酶组合物的施用方案，同时也避免了免疫系统对糖苷酶的靶向，否则这可能会减少或消除其效力。在某些方面，本发明进一步提供了用于施用本文所描述的方案的糖苷酶给药施用器。
[0022]在一些实施方案中，所述糖苷酶组合物包含神经氨酸苷酶，其是一种水解各种糖缀合物上的末端唾液酸残基的糖苷键的酶。神经氨酸苷酶被发现于哺乳动物细胞以及各种细菌、真菌和病毒源中。凭借它们在细胞膜的碳水化合物链上的末端位置，唾液酸是细胞之间的通讯以及免疫识别现象的关键调节剂。按照本发明，所述神经氨酸苷酶任选地与如本文所述的其他糖苷酶一起配制，并作为允许它充当信号传导级联免疫调节剂的剂量的方案提供，协调宿主的免疫应答，以有效地对抗感染性疾病(包括HIV与其他病毒和感染因子)，同时它本身不被免疫系统(显著地)靶向。在一些实施方案中，通过糖苷酶的合适的配制和/或递送改善了所述组合物的这些特性。
[0023]在各个实施方案中， 并且不希望受理论的束缚，所述糖苷酶疗法至少部分地通过补体活化增强免疫功能。例如，使用单纯疱瘆(HSV-1)作为模型病毒时，体外研宄表明:相对于对照，将适当水平的神经氨酸苷酶和补体一起孵育既显著地降低了 HSV-1对Veix)细胞的感染性又显著地减少了游离病毒自预感染的细胞的释放(图1和图2)。
[0024]在各个实施方案中，并且不希望受理论的束缚，所述糖苷酶疗法至少部分地通过细胞因子刺激增强免疫功能，所述细胞因子包括例如白细胞介素-2(IL-2)、干扰素α (IFN-α)、干扰素γ (IFN-γ )、肿瘤坏死因子a (TNF_ a )、白细胞介素-4 (IL_4)和白细胞介素-6 (IL-6)。在体外细胞系统中使用时，相对于各自的对照，至少四种细胞因子的产生在适当水平的神经氨酸苷酶的存在下受到刺激。因此，在一些实施方案中，通过神经氨酸苷酶的被保持或永久的信号级联增强了这些细胞因子的功能，产生对免疫刺激的控制。
[0025]在各个实施方案中，并且不希望受理论的束缚，所述糖苷酶疗法至少部分地通过提高免疫细胞相互作用的效率增强免疫功能。在适当水平的神经氨酸苷酶以及其他糖苷酶的存在下，所述提高的免疫细胞相互作用的效率可能是因去除带负电荷的唾液酸分子所导致，产生更大的细胞间接触。在各个实施方案中，所述糖苷酶组合物和方案通过增强细胞介导的细胞毒性和/或免疫细胞活化增强了免疫功能。
[0026]在各个实施方案中，并且不希望受理论的束缚，所述糖苷酶方案至少部分地通过提高感染因子如病毒(例如，HIV、HSV、EBV、HCV、HPV、腺病毒))和受病毒感染的细胞对免疫机制的暴露而发挥作用。除了可能的补体活化之外，通过神经氨酸苷酶从HIV或感染HIV的细胞的gpl20去除末端唾液酸残基可具有另外的免疫刺激作用。从HIV的gpl20/gpl60去除末端唾液酸残基和/或其他聚糖暴露了隐藏的表位或改变了糖蛋白的构象，使得所述病毒更容易受到宿主的免疫系统的各个部分的攻击。本文所述的糖苷酶制剂和方案使免疫防御和病毒感染之间的微妙平衡向有利于宿主一方倾斜。
[0027]在各个实施方案中，不希望受理论束缚，可以包括神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶(以及其他糖苷酶，包括本文所述的那些)中的一种或多种的糖苷酶方案将维生素D结合蛋白(也被称为组特异性组分或Ge)体内转化为有效的巨噬细胞活化因子，从而活化巨噬细胞抵抗患者的感染性疾病。参见，例如美国专利5，326，749，其在此通过引用并入；Yamamoto等人，J Immunology卷151:2794-2802 (1993)。维生素D结合蛋白(也被称为DBP)是一种进化上保守的糖蛋白并且是遗传多态性的。DBP具有约52，000的相对分子量，并且通常构成约0.5%的血浆蛋白质。如本文所述的糖苷酶的适当剂量和方案可以导致抵抗特定的致病病原体(包括其抗原状态的特异性靶向)的有效、持续和长期的体内巨噬细胞活化，这对不断地改变暴露表位的病原体而言是至关重要的。因此，体内施用所述糖苷酶组合物(包括方便的舌下给药)导致抵抗病原体的有效的巨噬细胞活化。
[0028]在一个方面，本发明提供了用于治疗具有慢性病毒感染的患者的方法。所述方法包括对患者施用免疫耐受的和免疫信号传导的糖苷酶组合物的非急性方案，以治疗、改善和/或控制所述感染。在一些实施方案中，病毒是与宿主基因组整合(例如，作为原病毒)或者是可以为隐匿性的或以其他方式逃避免疫监护的病毒，从而难以或不可能完全消除。不例性的病毒包括逆转录病毒(如HIV)、单纯疱瘆病毒(如HSV-1或HSV-2)、肝炎病毒(例如，HAV、HBV、HCV)和腺病毒。在这样的实施方案中，本文所述的糖苷酶组合物和方案可以取代抗病毒化疗或免疫疗法(例如，细胞因子或趋化因子(如干扰素)疗法或单克隆抗体治疗)用于长期疾病控制，或者可以与这样的疗法组合以改善结果，也就是说，或者同时组合或者按顺序组合。
[0029]在一些实施方案中，所述患者是HIV阳性，并且在一些实施方案中所述患者是症状性AIDS患者。HIV感染是一个世界性的问题，并且各国政府已经作出部署以让其国民有机会获得抗逆转录病毒药物。尽管付出这些努力，有时药物因为欠缺沟通和交通不便导致无法获得，这导致患者错过了用药。此外，很多时候，患者不能耐受这些药物。在一些实施方案中本发明提供了抗逆转录病毒药物的替代，并且在其他实施方案中提供了另外的药剂以减少对长期使用抗逆转录病毒剂或其他化疗疗法或抗病毒疗法的需求。
[0030]因此，在一些实施方案中，在所述糖苷酶治疗期间所述患者没有接受抗逆转录病毒疗法，例如，因为所述患者不能耐受抗逆转录病毒疗法，或这样的ARV疗法对患者而言无法获得。所述HIV可以是任何亚型，如HIV-1或HIV-2。在一些实施方案中，所述HIV耐抗病毒化疗，使得替代疗法的可获得性是至关重要的。在一些实施方案中，在抗逆转录病毒疗法之后施用或启动所述糖苷酶以控制慢性AIDS，由此提供更有效和成本敏感的长期疾病控制。
[0031]所述糖苷酶方案也可以与抗逆转录病毒化疗一起施用，例如，以帮助逆转疾病轨迹。一旦疾病轨迹被逆转，则所述糖苷酶方案可以任选地持续至少一个月、至少两个月、至少四个月、至少六个月、或至少一年、或至少两年、或至少五年或更长，以提供所述疾病的具有成本效益的控制。可以如本文所述调节用于长期治疗的频率或每日剂量。
[0032]在一些实施方案中，免疫耐受的糖苷酶信号传导补偿了 CD4细胞的损失，同时给予宿主时间来恢复和补充它的这些关键细胞的供应。在一些实施方案中，所述糖苷酶组合物允许抗逆转录病毒疗法的受试者停止抗逆转录病毒疗法一段时间(例如，约一至六个月、或约一至四个月、或约一至两个月)，由此允许所述主体从这些药物的毒性作用中恢复，同时还提供成本优势。所述方案还实现了病毒和病毒颗粒，以及优先于宿主细胞的受感染的(例如，溶原的)细胞的免疫靶向。在一些实施方案中，AVR和糖苷酶治疗的这种“周期”在整个疗法中被重复一次或多次。在另外其他的实施方案中，所述糖苷酶疗法与抗逆转录病毒疗法一起施用防止了通常由逆转录病毒疗法表现出的免疫系统的部分衰减。与其他化疗方案一起施用，如在本段落中所述，对于其他病毒感染(例如，HSV-1或HSV-2、EBV、HAV、HBV、HCV、HPV、腺病毒)可提供相同或类似的优点。
[0033]被设计成对抗HIV的药物已被集中于病毒生命周期的不同阶段。一些药物已被设计成阻断病毒对CD4T细胞的附着。其他药物以参与细胞内的组装阶段的各种酶为目标；例如，齐多夫定(zidovudine) (AZT)是一种众所周知的药物，其作用是抑制逆转录酶(即HIV使用所述酶以将其RNA基因组复制到DNA中的酶)的活性。这些合成药物中的一些药物已经减缓了至AIDS的进展，但没有药物能停止它或消除病毒。一个主要的问题是HIV的高突变率，其中最初显示出一些希望的药物变得无效，因为病毒将其形式变为不再被药物识别出的形式。所述糖苷酶方案还以允许增强ARV以及其他可能的化疗的HIV突变衍生物为目标，以降低突变病毒规避治疗剂的倾向。
[0034]如本文所用，术语抗逆转录病毒疗法指被施用于HIV和AIDS患者的活性剂(通常是活性剂的混合物)。这些包括例如包括进入抑制剂(例如，马拉韦罗(maravi1C)和/或恩夫韦地(enfuvirtide))、CCR5受体拮抗剂、逆转录酶抑制剂(例如，齐多夫定、地丹诺辛(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、勝甲酸(foscarnet)和/或拉米夫定(Iamivudine))、蛋白酶抑制剂(例如，利托那韦(ritonavir)、地瑞那韦(darunavir)、阿扎那韦(atazanavir)、沙奎那韦(saquinavir))、整合酶抑制剂(例如，雷特格韦(raltegravir))、成熟抑制剂(例如，α-干扰素、贝韦立马(bevirimat)和/或vivecon)的疗法。在一些实施方案中，逆转录病毒疗法包括两种核苷类似物和一种非核苷类似物或蛋白酶抑制剂的组合。三种药物的这种组合通常被称为“三药混合物(cocktail)”。实例包括C0MBIVIR(齐多夫定+拉米夫定)、TRIZIVIR(阿巴卡韦(abacavir) +齐多夫定+拉米夫定)、KALETRA (洛匹那韦(1pinavir) +利托那韦)、EPZIC0M (阿巴卡韦+拉米夫定)、TRUVADA (替诺福韦(tenofovir) +恩曲他滨(emtricitabine))、ATRIPLA(依非韦伦(efavirenz)+替诺福韦+恩曲他滨)。其他组合包括:替诺福韦/恩曲他?兵/雷特格韦、替诺福韦/恩曲他?兵/利托那韦、和地瑞那韦/替诺福韦/恩曲他滨/利托那韦/阿扎那韦。
[0035]在一些实施方案中，所述抗逆转录病毒疗法包括两种核苷逆转录酶抑制剂和一种非核苷酸逆转录酶抑制剂。在一些实施方案中，所述ARV疗法包括司他夫定、拉米夫定和/或奈韦拉平(Nevirapine)。在一些实施方案中，所述ARV疗法包括依法韦仑。这样的疗法，如果施用，在过渡到长期糖苷酶治疗之前被有节制地使用，或以降低初始疾病轨迹。这种采用糖苷酶疗法的长期疾病控制引发了抵抗游离病毒(包括突变病毒)和受感染的细胞的免疫级联。
[0036]在各个实施方案中，本文描述的方案适于治疗在AIDS的不同阶段的患者。在一些实施方案中，在所述方案开始时患者的CD4计数小于约500个细胞/mm3。例如，在所述方案开始时患者的CD4计数可以在约200和约400之间。在所述方案开始时患者的CD4计数可以小于约400、小于约350、小于约300、小于约200、小于约100或小于约50。在一些实施方案中，当CD4计数小于400时，单独地或与所述糖苷酶组合物一起施用抗逆转录病毒疗法，并且一旦CD4计数正常化(例如，高于约400或高于约500或高于约800)则将所述糖苷酶组合物用于长期护理。在一些实施方案中，患者可能继续具有低于正常的CD4计数，但所述糖苷酶组合物帮助免疫系统对此缺损发挥作用。在另外其他的实施方案中，所述患者具有如所述的低CD4计数，并且在无逆转录病毒疗法下施用所述糖苷酶组合物，可以使CD4计数从长远来看正常化。
[0037]在一些实施方案中，在所述方案开始时患者的病毒载量高于约10，000/ml。例如，在所述方案开始时所述病毒载量可以是至少约25，000/ml、至少约40，000/ml、至少约50，000/ml、至少约 75，000/ml、至少约 100，000/ml、至少约 500，000/ml、至少约 I 百万 /ml或至少约5百万/ml。在一些实施方案中，患者接受抗逆转录病毒疗法以将病毒载量变为小于约50，000/ml、或小于10，000/ml或检测不到的，然后再过渡到糖苷酶治疗作为长期护理。在一些实施方案中，抗病毒疗法和糖苷酶的组合可以更快地或更完全地降低病毒载量。
[0038]在一些实施方案中，糖苷酶疗法的好处可至少部分地通过患者的健康评估(包括情绪和精神状态、食欲、能量水平、继发感染/并发症、毛发生长以及其他改善整体健康的症状)来辨识。采用AIDS治疗的常规定量(例如CD4水平或病毒滴度)可辨识出或未辨识出这样的 好处。
[0039]本文所描述的糖苷酶方案适用于其他慢性病毒感染。例如，在一些实施方案中，患者具有选自单纯疱瘆病毒感染(例如，HSV-1或HSV-2)、Epstein-Barr病毒感染(例如，单核细胞增多症)、巨细胞病毒感染、水痘带状疱瘆病毒感染、甲型、乙型或丙型肝炎、腺病毒感染或者人乳头状瘤病毒感染的慢性病毒感染。在一些实施方案中，患者被诊断为患有慢性疲劳综合征。所述糖苷酶组合物治疗和/或预防疾病的发作并减少病毒载量，并且在一些实施方案中，取代了传统的抗病毒策略，例如细胞因子和/或趋化因子疗法(例如，干扰素或白细胞介素)或小分子抗病毒药物(例如，阿昔洛韦(acyclovir)、伐昔洛韦(valaciclovir)、泛昔洛韦(famciclovir))。或者，一旦病毒感染处于常规疗法(例如，干扰素或小分子病毒抑制剂或单克隆抗体治疗)的控制之下，则施用所述糖苷酶组合物用于长期控制。在一些实施方案中，所述方案降低或消除病毒性病变(例如唇疱瘆)和/或防止其复发。
[0040]例如，在一些实施方案中，患者具有HSV或水痘带状疱瘆病毒感染，并且在一些实施方案中可具有带状疱瘆。按照本发明，患者可能无法接受抗病毒药物，例如阿昔洛韦、伐昔洛韦和/或泛昔洛韦，或在其他实施方案中，在传统抗病毒药物失败后施用所述糖苷酶疗法以改善或消除感染或其症状，或在凭借患者耐受这些药物的能力使传统抗病毒药物成为规则之后施用。
[0041]在另外其他的实施方案中，患者具有丙型肝炎病毒感染，并接受了干扰素疗法。在这样的实施方案中，例如，一旦该疗法失去效力或不被病人耐受，则可提供所述糖苷酶方案以替代无效的INF疗法。在其他实施方案中，所述糖苷酶方案可与干扰素疗法并行提供，以增强其效力。所述糖苷酶方案可促进干扰素或抗体疗法的适当整合用于有效的免疫应答。
[0042]在第二方面，本发明提供了治疗和/或预防不同于如上所述的慢性病毒感染的感染性疾病的方法。在一些实施方案中，所述感染性疾病是持续性或复发性细菌感染，例如与肺炎、支气管炎、鼻窦炎、阴道炎、肠炎、结肠炎、败血症或尿路感染有关的感染。所述方案针对持续性或复发性耳、眼、鼻和/或咽喉感染是更有效的。尽管致病性感染因子的身份不一定是至关重要的，但是本发明对其可以是有效的示例性细菌试剂包括分枝杆菌属的种(包括结核分枝杆菌)、假单胞菌属的种(例如，铜绿假单胞菌，如可能伴随囊性纤维化产生)、嗜血杆菌属的种(例如，流感嗜血杆菌)、莫拉氏菌属(Moraxella)的种、衣原体属(Chlamydia)的种、奈瑟氏菌属(Neisseria)的种、链球菌属的种、葡萄球菌属的种(包括MRSA)、博德特氏菌属(Bordetella)的种、耶尔森氏菌属(Yersinia)的种等。在一些实施方案中，在至少一轮抗生素治疗未能改善或消除感染之后施用所述糖苷酶方案。在一些实施方案中，所述糖苷酶方案与抗生素疗法并行施用，以增强其效果，并减少抗性细菌的发展的可能。在这些实施方案中，示例性抗生素包括氨基糖苷、碳青霉烯、头孢菌素、大环内酯、青霉素(例如，β内酰胺)、喹诺酮(例如，氟喹诺酮如环丙沙星)、磺酰胺或四环素或上述的组合。
[0043]在另外其他的实施方案中，所述糖苷酶方案有效抵抗可能是慢性、持续或复发的真菌或寄生虫感染。这种感染包括念珠菌病(例如，酵母菌性阴道炎)、疟疾、锥虫病、曲霉菌(Aspergillus)感染、弓形虫病和贾第虫病。可以在不成功的化疗或抗微生物治疗之后施用所述方案，或者可与所述治疗并行施用所述方案以增加成功治疗的速度，在一些实施方案中包括消除感染因子或其症状。
[0044]在另外其他的实施方案中，施用所述糖苷酶方案用于预防疾病，特别是当感染性疾病是例如在流感、SARS或其他疾病发作期间的特殊风险时。按照这个方面，患者接受了本文所述的组合物的非急性方案，其在一段足以跨越疾病发作周期的时间提供了有效的糖苷酶疗法。例如，可以对处于对抗流感的风险中的患者施用所述方案，而且所述方案在整个流感季节(例如，至少两个月、至少三个月、至少四个月或至少六个月)提供了持续的免疫刺激。本发明的这一方面可用于其他流行病或疾病发作，包括保护经常暴露于高度传染性试剂的医护工作人员。
[0045]在具体实施方案中，本发明用于免疫受损的患者，包括老年人、年轻人、住院治疗者以及具有免疫缺陷病况(如由AIDS、遗传性疾病或药物治疗引起)的患者以增强免疫功能。在某些实施方案中，所述糖苷酶组合物和/或方案用作疫苗增强剂，提供更有效的疫苗接种和/或更长的保护作用的持续时间，而且在一些实施方案中允许疫苗剂量节省。在一些实施方案中，疫苗是不含佐剂的疫苗，其中所述糖苷酶组合物充当佐剂。例如，所述糖苷酶组合物和方案可在约接受流感疫苗或其他疫苗时被启动(例如，在接受疫苗的一周或三天或一天内启动)，而且持续所述糖苷酶方案以延长所述疫苗的保护作用的持续时间和/或保护性抗体滴度的水平或持续时间。
[0046]所述糖苷酶方案提供了一种或多种对去除哺乳动物细胞(例如，免疫细胞和/或受病毒感染的细胞)上的一个或多个末端和/或倒数第二的糖基为活性的糖苷酶。这种末端和倒数第二的糖基包括，例如唾液酸基、半乳糖基、N-乙酰半乳糖氨基、岩藻糖基、葡糖基、N-乙酰葡糖氨基和甘露糖基残基。因此，在各个实施方案中所述糖苷酶方案可以包括神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶(例如，β -半乳糖苷酶)、N-乙酰氨基半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的一种或多种。
[0047]在一些实施方案中，所述糖苷酶方案包括神经氨酸苷酶疗法。所述神经氨酸苷酶疗法可以采用神经氨酸苷酶或具有神经氨酸苷酶(唾液酸酶)活性的纯化级分(fract1n)或其活性部分或活性衍生物。在一些实施方案中，所述神经氨酸苷酶是微生物(例如，细菌、病毒、寄生虫或真菌源)。在另外其他的实施方案中，所述神经氨酸苷酶是哺乳动物或植物来源的。所述神经氨酸苷酶可纯化自食物材料，包括发现在食物中的微生物，包括面包酵母和乳球菌属某种(Lactococcus sp.)和乳酸杆菌属某种(Lactobacillus sp.)。在某些实施方案中，所述神经氨酸苷酶是细菌来源的。所述神经氨酸苷酶可被纯化自或分离自其天然来源，或者可以是重组的或合成的(例如，化学合成的)。在一些实施方案中，所述神经氨酸苷酶是γ -B组神经氨酸苷酶，也称为外切-α -唾液酸酶、α -B组或乙酰基B组，其从宿主细胞和病毒的表面上的碳水化合物部分裂解出末端唾液酸残基。在一些实施方案中，所述神经氨酸苷酶催化寡糖、糖脂和多聚乙酰神经氨酸中的末端唾液酸残基的α -2，3、α -2，6和/或α -2，8糖苷键的水解。
[0048]例如，在各个实施方案中，所述神经氨酸苷酶是内切或外切唾液酸酶，例如催化末端唾液酸残基的α - (2 — 3)、α - (2 — 6)和/或α - (2 — 8)糖苷键的外切水解，或催化低聚唾液酸或聚(唾液酸)中的(2 —8)-α -唾液酸基键的内切水解。示例性的神经氨酸苷酶试剂包括远超过100种已知的神经氨酸苷酶中的任一种或其活性部分或衍生物。在一些实施方案中，所述神经氨酸苷酶是来自一种或多种产气荚膜梭菌(Clostridium perfringes)、产脈节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)、霍乱弧菌(Vibr1 cholerae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或其他活性被清楚表征的酶。此类神经氨酸苷酶可被纯化自或分离自其微生物源，或通过重组或合成产生。参见 Cassidy JT, The Sialic Acids-V1.Purificat1n and properties of sialidasefrom Clostridium perfringes.T B1l.Chem.240:9:3501-3506 (1965) ；Crenne11 S.等人，Crystal structure of Vibr1 cholerae neuraminidase reveals dual lectin-likedomains in addit1n to the catalytic domain.Structure 2:535-544(1994) ；Uchida等人，Enzymatic properties of neuraminidases from Arthrobacter ureafaciens.1B1chem.106:1086-1089 (1979)，并且这些文献通过引用在此并入。当处于纯化的形式时，所述神经氨酸苷酶是所述组合物的蛋白质组分的至少10%、所述组合物的蛋白质组分的至少25%、所述组合物的蛋白质组分的50%、或总蛋白质组分的至少75%、或总蛋白质组分的至少90%、或总蛋白质组分的至少95%、或总蛋白质组分的至少99%。
[0049]针对神经氨酸苷酶蛋白质的示例性氨基酸序列包括由GenBank登录号:EIA17609.1、EIA17977.1、NP_561469.1、CAA50436.1、(产气荚膜梭菌)、AAX22758.1、BAD66680.2(产脲节杆菌)、AAW31751.2、ΑΑΑ27546.1、ΑΕΑ78761.I (霍乱弧菌)、2VW0_A (肺炎链球菌)和AAL19864(鼠伤寒沙门氏菌)界定的那些，其各自通过引用在此并入。所述神经氨酸苷酶可包含与由 EIA17609.UEIA17977.UNP_561469.K CAA50436.UAAX22758.1、BAD66680.2、AAW31751.2、AAA27546.1、AEA78761.1、2VW0_A 和 AAL19864 界定的氨基酸序列中的一个或多个具有至少70 %、80 %、90 %、95 %或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。另外的神经氨酸苷酶被描述于美国专利8，012，733、美国专利6，916，916、美国专利5，985，859、美国专利5，830, 748和美国专利4，071, 408中，所述描述通过引用在此整体并入。
[0050]合适的神经氨酸苷酶可以从商业来源获得。示例性的神经氨酸苷酶包括SigmaAldrich 产品编号 N2876、N3001、N5631、N2133 (产气荚膜梭菌)、N7885、N6514 (霍乱弧菌)、N3786和N8271 (产脲节杆菌)。
[0051]这些或其他神经氨酸苷酶的衍生物或突变体的制备可以通过任何已知的结构或石开究教导，包括通过:Kim S等人，Features and applicat1ns of bacterial sialidases，Appl Microb1l B1technol.2011，91 (I): 1-15 ;Crenne11 SJ 等人，Crystal structureof a bacterial sialidase (from Salmonella typhimurium LT2)shows the same foldas an influenza virus neuraminidase，Proc Natl Acad Sci USA 1993 90(21):9852-6 ；Chavas LM,Cryst al structure of the human cytosolic sialidase Neu2:Evidence forthe dynamic nature of substrate recognit1n,J B1l Chem.2005 280 (I):469-75 ;XuG 等人，Crystal structure of the NanB sialidase from Streptococcus pneumoniae,J Mol B1l.2008 384(2):436-49 ；Newstead SL 等人，The structure of Clostridiumperfringens NanI sialidase and its catalytic intermediates, J B1l Chem.2008283(14):9080-8 ；Chan J 等人，Bacterial and viral sialidases:contribut1n of theconserved active site glutamate to catalysis, B1chemistry 2012 51 (I):433-41 ；Chien CH等人，Site-directed mutat1ns of the catalytic and conserved amino acidsof the neuraminidase gene, nanH， of Clostridium perfringes ATCC 10543， EnzymeMicrob.Technol.19(4):267-276(1996) ；Christensen 和 Egebjerg，Cloning，express1nand characterizat1n of a sialidase gene from Arthrobacter ureafaciens，B1technol.Appl.B1chem.41:225-231 (2005)描述的那些。这些参考文献各自通过引用在此整体并入。
[0052]—般可按照单位(U)描述神经氨酸苷酶活性，通过在确定条件下(例如，pH值5.0和37°C)确定从合适的底物释放出的唾液酸的量。示例性的底物是NAN-乳糖或牛颌下腺粘蛋白。参见 Warren L，J B1l.Chem.234 1971 (1959)。
[0053]在这些和其他的独立实施方案中，所述糖苷酶方案包括施用半乳糖苷酶，其在一些实施方案中是半乳糖苷酶。在涉及两种或更多种糖苷酶的实施方案中，半乳糖苷酶可以与神经氨酸苷酶或其他酶共同配制。α-或β-半乳糖基残基(包括I —3连接的、I —4连接的)充当哺乳动物细胞(包括免疫细胞)上的末端糖苷类，和/或可以是倒数第二的糖基残基，并且在某些情况下可以被连接到末端唾液酸。Hakomori，AberantGlycosylat1n in Cancer Cell Membranes as Focused on Glycolipids:Overviewand Perspectives, Cancer Research 45? 2405-2414(1985) ;Dwek 和 Brooks，HarnesingChanges in Cellular Glycosylat1n in New Cancer Treatment Strategies, CurrentCancer Drug Targets 4:425-442(2004)。因此，半乳糖苷酶(例如，β-半乳糖苷酶)可以根据本文描述的方法单独地使用，或者可以与神经氨酸苷酶或其他糖苷酶结合使用，其在一些实施方案中防止或减缓糖基结构的再唾液酸化或再加帽，从而使所述方案更加有效，并支持不太频繁的施用和/或更低的剂量。
[0054]示例性的半乳糖苷酶是众所周知的且可商购的。例如，半乳糖苷酶可以获自大肠杆菌(Escherichia coli)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)和肺炎链球菌以及其他微生物(例如，细菌或真菌)和生物来源，包括哺乳动物来源。例如，合适的半乳糖苷酶可获自Sigma-Aldrich目录编号G5635。
[0055]在这些和其他独立实施方案中，所述糖苷酶方案包括施用N-乙酰氨基半乳糖苷酶。在涉及两种或更多种糖苷酶的实施方案中，N-乙酰氨基半乳糖苷酶可以与神经氨酸苷酶或其他酶共同配制。Hakomori, Aberant Glycosylat1n in Cancer Cell Membranesas Focused on Glycol ipids: Overview and Perspectives, Cancer Research 45，2405-2414(1985) ;Dwek 和 Brooks， Harnesing Changes in Cellular Glycosylat1n inNew Cancer Treatment Strategies, Current Cancer Drug Targets 4:425-442(2004)o因此，N-乙酰氨基半乳糖苷酶可以根据本文描述的方法单独地使用，或者可以与神经氨酸苷酶或其他糖苷酶结合使用，其在一些实施方案中防止或减缓糖基链的再唾液酸化或再加帽。
[0056]示例性的N-乙酰氨基半乳糖苷酶是众所周知的且可商购的。例如，β -N-乙酰氨基半乳糖苷酶可以获自芽孢杆菌属某种(Bacillus sp.)以及其他微生物(例如，细菌或真菌)和生物来源，包括哺乳动物来源。例如，合适的β-N-乙酰氨基半乳糖苷酶可获自Sigma-Aldrich 目录编号 Α2464。
[0057]在这些和其他独立实施方案中，所述糖苷酶方案包括施用岩藻糖苷酶，其在一些实施方案中是α-岩藻糖苷酶。在涉及两种或更多种糖苷酶的实施方案中，岩藻糖苷酶可以与神经氨酸苷酶或其他酶共同配制(例如，与半乳糖苷酶或N-乙酰氨基半乳糖苷酶共同配制)。岩藻糖基残基(包括α I — 2连接的、α I — 3连接的和α I — 4连接的)充当哺乳动物细胞(包括免疫细胞)上的末端糖苷类，和/或可以是倒数第二的糖基残基，并且在某些情况下可以被连接到末端唾液酸。Hakomori，Aberant Glycosylat1n inCancer Cell Membranes as Focused on Glycol ipids: Overview and Perspectives,Cancer Research 45，2405-2414(1985):Dwek矛口Brooks,Harnesing Changes in CellularGlycosylat1n in New Cancer Treatment Strategies, Current Cancer Drug Targets4:425-442(2004)。因此，岩藻糖苷酶(例如，α -岩藻糖苷酶)可以根据本文描述的方法单独地使用，或者可以与神经氨酸苷酶结合使用，其在一些实施方案中防止或减缓糖基链的再唾液酸化或再加帽，从而使所述方案更加有效，并支持不太频繁的施用和/或更低的剂量。
[0058]示例性的岩藻糖苷酶是众所周知的且可商购的。例如，α-岩藻糖苷酶可以获自黄单胞菌属某种(Xanthomonas sp.)(例如，木薯萎蔫病黄单胞菌(manihotis))以及其他微生物(例如，细菌或真菌)和生物来源，包括哺乳动物来源。例如，合适的α-岩藻糖苷酶可获自Sigma-Aldrich目录编号F3023和F1924。
[0059]在这些和其他独立实施方案中，所述糖苷酶方案包括施用葡糖苷酶，其在一些实施方案中是α-葡糖苷酶。在涉及两种或更多种糖苷酶的实施方案中，葡糖苷酶可与神经氨酸苷酶或其他酶共同配制(例如，与神经氨酸苷酶、甘露糖苷酶或N-乙酰氨基半乳糖苷酶共同配制)。糖基残基(包括α I — 2连接的、α I — 3连接的和α I — 4连接的)充当哺乳动物细胞(包括免疫细胞)上的末端糖苷类，和/或在某些情况下可以是内部的糖基歹戈基。Hakomori, Aberant Glycosylat1n in Cancer Cell Membranes as Focused onGlycolipids:Overview and Perspectives, Cancer Research 45，2405-2414(1985) ；Dwek和 Brooks， Harnesing Changes in Cellular Glycosylat1n in New Cancer TreatmentStrategies, Current Cancer Drug Targets 4:425-442(2004)。因此，葡糖苷酶(例如，
葡糖苷酶)可以根据本文描述的方法单独地使用，或者可以与神经氨酸苷酶、甘露糖苷酶或其他糖苷酶结合使用，其在一些实施方案中防止或减缓糖基链的再唾液酸化或再加帽，从而使所述方案更加有效，并支持不太频繁的施用和/或更低的剂量。
[0060]示例性的葡糖苷酶是众所周知的且可商购的。例如，α-葡糖苷酶可以获自酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)、黑曲霉(Aspergillus niger)或嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophilus)以及其他微生物(例如，细菌或真菌)和生物来源(包括食物来源，如大米)，并且包括哺乳动物来源。例如，合适的α-葡糖苷酶可获自Sigma-Aldrich 目录编号 G5003、G0660、70797、49291、G9259 和 G3651。
[0061]在这些和其他独立实施方案中，所述糖苷酶方案包括施用N-乙酰氨基葡糖苷酶，其在一些实施方案中是β-N-乙酰氨基匍糖苷酶。在涉及两种或更多种糖苷酶的实施方案中，N-乙酰氨基葡糖苷酶可以与神经氨酸苷酶或其他酶共同配制(例如，与神经氨酸苷酶、甘露糖苷酶和/或葡糖苷酶共同配制)。N-乙酰葡糖胺残基(包括β? —4连接的、βI — 6连接的等)充当哺乳动物细胞(包括免疫细胞)上的末端糖苷类，和/或在某些情况下可以是倒数第二的或内部的糖基残基。Hakomori，Aberant Glycosylat1nin Cancer Cell Membranes as Focused on Glycolipids:Overview and Perspectives,Cancer Research 45，2405-2414(1985):Dwek矛口Brooks,Harnesing Changes in CellularGlycosylat1n in New Cancer Treatment Strategies, Current Cancer Drug Targets4:425-442(2004)。因此，N-乙酰氨基葡糖苷酶(例如，β-N-乙酰氨基葡糖苷酶)可以根据本文描述的方法单独地使用或者可以与神经氨酸苷酶、甘露糖苷酶或葡糖苷酶结合使用，其在一些实施方案中防止或减缓糖基链的再唾液酸化或再加帽，从而使所述方案更加有效，并支持不太频繁的施用和/或更低的剂量。
[0062]示例性的N-乙酰氨基葡糖苷酶是众所周知的且可商购的。 例如，β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶可以获自肺炎链球菌和直生刀豆(Canavalia ensiformis)以及其他微生物(例如，细菌或真菌)和生物来源(包括食物来源)，并包括哺乳动物来源。例如，合适的β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶可获自Sigma-Aldrich目录编号Α2264和Α6803。
[0063]在这些和其他独立实施方案中，所述糖苷酶方案包括施用甘露糖苷酶，其在一些实施方案中为α-甘露糖苷酶。在涉及两种或更多种糖苷酶的实施方案中，甘露糖苷酶可以与神经氨酸苷酶或其他酶共同配制(例如，与神经氨酸苷酶、葡糖苷酶和/或N-乙酰氨基葡糖苷酶共同配制)。甘露糖基残基(包括α I — 2连接的、α I — 3连接的、α I — 6连接的、β I — 4连接的等)充当哺乳动物细胞(包括免疫细胞)上的末端糖苷类，和/或在某些情况下可以是倒数第二的或内部的糖基残基。Hakomori，Aberant Glycosylat1nin Cancer Cell Membranes as Focused on Glycolipids:Overview and Perspectives,Cancer Research 45，2405-2414(1985):Dwek矛口Brooks,Harnesing Changes in CellularGlycosylat1n in New Cancer Treatment Strategies, Current Cancer Drug Targets4:425-442 (2004) o因此，甘露糖苷酶(例如，α -甘露糖苷酶)可以根据本文描述的方法单独地使用或者可以与神经氨酸苷酶、葡萄糖苷酶或N-乙酰氨基葡糖苷酶结合使用，其在一些实施方案中防止或减缓糖基链的再唾液酸化或再加帽，从而使所述方案更加有效，并支持不太频繁的施用和/或更低的剂量。
[0064]示例性的甘露糖苷酶是众所周知的且可商购的。例如，甘露糖苷酶可以获自直生刀豆(α)或法国大蜗牛(Helix pomatia) ( β )以及其他微生物(例如，细菌或真菌)和生物来源(包括食物来源)，并包括哺乳动物来源。例如，合适的甘露糖苷酶可以获自Sigma-Aldrich 目录编号 M7257 或 M9400。
[0065]对人或动物施用有效量的经配制的糖苷酶有助于通过免疫功能的调节和/或直接作用于受感染的细胞或其他参与病理的组织或细胞来预防或消除感染性疾病症状。在不影响正常的细胞功能下，以表现出症状或病理的减少的剂量和频率施用所述糖苷酶。在一些实施方案中，施用的剂量和/或频率是不会引起延长的关节不舒服或不适(例如，全身的不舒服感觉)的剂量和/或频率。当患者经历关节或全身不舒服时，所述患者可调节施用的剂量或频率，直到不舒服消退或正常化。例如，当患者经历不舒服时，所述患者可以跳过一天、两天或三天的用药，和/或从所述方案中减去一个或两个每日剂量，和/或增加剂量之间的时间安排，直到不舒服消退或正常化。因此，患者发现不会诱发延长的关节不舒服或使不舒服最小化的最高施用剂量和/或频率。在一些实施方案中，当剂量的量为可控时，例如，使用带计量的剂量施用器，可以减少所述剂量但时间表被保持。因此，当给定了患者的独特生物学的状态、疾病或免疫系统状况时，每个患者可通过发现不会诱发延长的关节不舒服或不适的最高剂量和/或频率来根据需要定制剂量。在实践中，可以按每剂量单位小于约10_2mg或小于约10_3mg对人或动物施用所述糖苷酶制剂。在某些实施方案中，按约10_3mg至10_8mg之间施用所述糖苷酶。在另外其他的实施方案中，糖苷酶的剂量在约10_3mg和lCr7mg之间、lCr3mg和lCT6mg之间、lCT3mg和lCT5mg之间或约lCT4mg。在一些实施方案中，每个受试者的总的每日剂量不超过约10_3mg，或在一些实施方案中，不超过约5X10_3mg至l(T4mg。通常，表现出免疫抑制的患者(如接受ARV的那些)可能需要l(T2mg或l(T3mg范围内的更高剂量。
[0066]尽管某些糖苷酶(包括神经氨酸苷酶)可以具有形成同源二聚体(例如，三聚体、四聚体)的倾向，但是在各个实施方案中，将所述糖苷酶配制(例如，稀释)成作为单体和/或二聚体存在，其中如可通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定的基本无更高的聚集体。
[0067]可以将所述糖苷酶配制成含水制剂，包括用于舌下、鼻或颊部递送。在一些实施方案中，所述含水制剂包括盐水。在一些实施方案中，所述制剂具有约0.5至约2%盐水的离子强度，例如约0.9%盐水的离子强度。在一些实施方案中，在生理盐水(例如，约0.9%盐水)中配制所述糖苷酶。也可使用用于舌下、鼻或颊部递送的其他常规载体。所述糖苷酶还可进一步与防腐剂一起配制，所述防腐剂可以是芳族或酚类防腐剂。例如，在一些实施方案中，所述防腐剂是苯酚。例如，在一些实施方案中，神经氨酸苷酶任选地与其他的糖苷酶在0.05至0.5%的苯酚或相当量的类似起作用的防腐剂(例如)中配制。在一些实施方案中，通过苯酚(例如至少0.2%、0.3%或0.4%苯酚)的存在提高了神经氨酸苷酶和可能其他糖苷酶的活性。在一些实施方案中，在含有约0.2%至约1%苯酚(例如，0.2至0.6%苯酸或约0.4%苯酸)的溶液中孵育所述神经氨酸苷酶(例如，Sigma Aldrich目录编号N2876、N3001、N5631、N2133、N7885、N6514、N3786、N8271)，然后被稀释成或形成最终的制剂，其可含有0.05%至约0.2%的苯酚。在一些实施方案中，所述神经氨酸苷酶的这种“活化”允许以较低的剂量施用活性剂，以避免免疫靶向，同时保持活性的适当水平。
[0068]为了说明，神经氨酸苷酶以及任选与其他糖苷酶可以与0.9%盐水混合，经过过滤灭菌，并在室温下静置10分钟至五小时(例如，约30分钟至约三小时)。在室温孵育之后，加入苯酚盐水以得到在0.9%盐水中的最终苯酚浓度为约0.1%的溶液。将所述溶液贮藏在 4。。。
[0069]或者，神经氨酸苷酶以及任选的其他糖苷酶与约0.4%苯酚盐水混合。所述溶液经过过滤灭菌，并在室温下静置5分钟至5小时(例如，约30分钟、约一小时或约三小时)。在室温孵育之后，最终浓度变为约0.1 %苯酚、0.9%盐水。将所述溶液贮藏在4°C。
[0070]可通过多种途径施用所述糖苷酶制剂，包括舌下、鼻、口(port)、真皮下、灌胃、目艮内、静脉内、肌内、皮下、经真皮和颊部。在各个实施方案中，通过舌下施用所述糖苷酶。在一些通过舌下施用所述糖苷酶的实施方案中，所述神经氨酸苷酶在舌下保持约I至约5分钟，并且优选为约3、约4或约5分钟。在此期间患者应避免讲话。在施用的15分钟内患者应不吃或不喝。
[0071]根据本发明的各方面，按平均每天2至6次施用糖苷酶的方案至少两周或至少一个月，特别是针对免疫受损或晚期病例。每天的施用应基本上均匀地间隔开，但在各个实施方案中间隔约15分钟至5小时。例如，剂量可以间隔约15分钟、约30分钟、约I小时、约2小时或约3小时。例如，可以按平均每天2至8次施用所述糖苷酶制剂至少约两个月、至少约四个月或至少约五个月或至少约六个月。在一些实施方案中，按每天约2、约3或约4次施用所述糖苷酶制剂至少一个月、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月。通常，在不会表现出显著延长的关节不舒服或不适下，按有效地减少感染性疾病的病理或刺激免疫系统的剂量和频率施用所述糖苷酶制剂。当患者确实经历关节或全身不舒服时，所述患者调节剂量和/或频率(例如，跳过一天、两天或三天的神经氨酸苷酶给药，或将每日剂量减少一次或两次施用)，直到不舒服消退或正常化。因此，在一些实施方案中所述施用方案在关节不舒服时暂停。
[0072]例如，治疗的第一天可以约八个剂量开始，在首先的一个或两个小时内服用首先的三至五个剂量，其余在全天大致均匀间隔地服用。然后可以通过每天约四个剂量对患者进行治疗，定期监测恶性肿瘤。即使当恶性肿瘤为检测不到时，患者仍可以保持每天2至7个剂量的方案，如基于关节不舒服或不适的表现时不时地调节。
[0073]可以如上所述地启动疗法。然而，在一些实施方案中，所述糖苷酶方案是这些常规疗法的替代。在一些实施方案中，随后通过每天约一剂量对患者长期治疗至少约六个月、或至少约一年、或至少约两年、或至少约五年或更长，或者被选择或被规定用于此类长期治疗。在一些实施方案中，在不存在化疗或其他疗法下这种后续的长期治疗用以减少复发或疾病进展的可能性。长期糖苷酶治疗，例如，为了防止疾病复发或再发，可以每天施用I或2次。
[0074]在一些实施方案中，患者被指导监测关节僵硬或不适。这样的状况表明应对糖苷酶治疗进行调节。所述调节可以包括跳过一天或两天或多至一周的用药，或可选地通过每天一次或两次施用降低剂量，直到症状消除。其他分子测定可用于同样的效果，但是关节僵硬或不适提供了患者顺应性的缓解。因此，在所述方案的过程中，可容易地针对患者对所述糖苷酶剂量进行调节，从而保持长期的最佳护理。
[0075]在本发明的另外其他方面，提供了一种药物组合物，其包含用于根据需要施用单一的糖苷酶剂量的递送媒介物，且其中所述媒介物含有至少50个剂量、或至少100个剂量、至少150个剂量、或至少200个剂量的全糖苷酶方案。施用的每个糖苷酶剂量的量为至多约10_2mg糖苷酶和如已经描述的药学上的惰性成分。所述药物组合物可包含神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶、N-乙酰氨基半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的至少两种以及药学上可接受的赋形剂。例如，所述组合物可以包含神经氨酸苷酶和β -半乳糖苷酶。所述糖苷酶可以按约10_3mg至10_8mg之间存在(全体地)，或根据上文所公开的剂量存在。所述组合物可以被配制用于多种如本文所公开的施用途径，包括舌下递送。
[0076]在各个实施方案中，所述治疗方案包括不超过约10_3mg的糖苷酶的量的分割式施用(partit1nal administrat1n)，但是，在某些情况下，在任何一天中施用的糖苷酶的总量可以超过此限度。
[0077]可以各种途径和形式施用所述糖苷酶制剂。例如，所述糖苷酶可以作为固体施用，其中所述酶被包埋或混合在生物可降解或生物可蚀性基质中。所述基质可以是延时释放基质(time release matrix) ο这些基质是那些本领域普通技术人员所熟知的。可以通过注射或通过舌下途径施用所述糖苷酶。在一个实施方案中，所述媒介物是被包含在惰性容器中的水溶液。在另一个变型中，所述组合物是栓剂的形式。所述组合物的液体形式可以经皮下、肌内或静脉内注射。此外，可通过粘膜(如鼻膜)施用所述组合物。
[0078]在某些实施方案中，通过药物施用器施用所述糖苷酶组合物，所述施用器包括至少100个剂量、或至少150个剂量或至少200个剂量的组合物。在各个实施方案中，所述施用器用于舌下、鼻、经真皮、真皮下延时释放、眼内、灌胃、口、皮下、口服或颊部递送。例如，所述施用器用于舌下递送。
[0079]在一些实施方案中，所述施用器递送可以由患者根据需要进行调节的带计量的剂量。
[0080]所述施用器优选以维持剩余剂量的无菌条件的方式分配剂量。通过非限制性实例的方式，所述施用器可以是被描述在美国 专利4，830，284 ;4，565，302 ;5，011，046 ；5，147，087 ;5，893，484 ;6，877，672 ;6，886，556 和 7，201，296 中的那些中的任一种，所述美国专利各自通过引用在此整体并入。例如，所述施用器可以是雾化或给药泵，其可以确保存在于泵缸和排放口之间的区域中的介质不会干涸或不以其他方式受环境影响而改变。参见美国专利4，830，284，其通过引用在此并入。在一些实施方案中，所述施用器采用了 0.2 μ m的过滤器，以维持无菌内容物。此外，所述施用器可以在单一冲程排放中分配剂量。此类施用器被描述在美国专利5，893，484中，其通过引用在此并入。所述施用器可被构造用于经鼻递送、真皮递送、咽喉递送或舌下递送。在一些实施方案中，所述施用器实现了可致动的给药机构，其允许监测精确的剂量，因此在很大程度上消除了在剂量的数目和/或持续给药方面不正确的给药。参见美国专利4，565，302，其通过引用在此并入。在一些实施方案中，所述施用器递送50至100 μ I的剂量，如在例如美国专利6，886，556中描述的施用器，其通过引用在此并入。
实施例
[0081]实施例1 J^HSV-1感染件的影晌
[0082]使用HSV-1作为模型病毒，启动体外研宄以确定神经氨酸苷酶和补体对自Vero细胞的病毒感染性和病毒释放的影响。对于感染性研宄而言，将补体、病毒和神经氨酸苷酶的组合一起孵育，然后加入到Ve1细胞，并进一步孵育。然后进行细胞固定和染色后，对细胞中形成病毒的斑块进行计数。结果表明，相对于对照，将病毒与神经氨酸苷酶和补体一起孵育显著地(70-80% )降低了 Vero细胞的病毒感染性(图1)。
[0083]对于病毒释放研宄而言，使Vero细胞首先用HSV-1感染。然后将这些细胞与不同浓度的补体和神经氨酸苷酶孵育。对来自细胞培养物的上清液测试形成斑块的能力，所述斑块表明自细胞释放出的病毒。结果表明，相对于对照，在神经氨酸苷酶和补体两者的存在下，游离病毒的释放被大大降低(70-80% )(图2)。这些结果表明，神经氨酸苷酶和补体的组合既显著地降低了受HSV-1感染的Ve1细胞的感染性又显著地减少了游离病毒自预感染的细胞的释放。
[0084]实施例2:对细胞因子释放的影响
[0085]研宄了神经氨酸苷酶对某些体外细胞因子的产生的影响。细胞因子是由活化的淋巴细胞分泌的应答于感染的化学信使。任何给定的细胞因子(单独的或与其他细胞因子组合)可对免疫功能产生多重作用。白细胞介素_2(IL-2)、干扰素α (IFN-α)、干扰素γ (IFN-γ)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)是参与宿主抵抗病毒的防御的重要细胞因子。IL-2、TNF-a和IFN-γ由T细胞的T辅助(THl)子集产生，并且因此与炎症过程相关。IL-2和IFN-γ —起活化巨噬细胞，所述巨噬细胞是吞噬并消化病原体(吞噬作用)的重要的免疫细胞，并且还可以用作对T淋巴细胞的抗原提呈细胞。IL-2和IFN-γ还提高了自然杀伤(NK)细胞在清除受病毒感染的细胞中的细胞毒性。IFN-γ还增强了抗原提呈细胞上的主要组织相容性复合体(MHC) I类和II类分子的表达，从而诱导参与病毒清除的CD4+和CD8+溶细胞性细胞。IFN-γ还与TNF-α组合以刺激NK细胞。IFN-α通过阻断早期病毒蛋白的转录来抑制病毒复制。
[0086]使用细胞系统、孵育条件和其他适合于生产和测定各分子的程序对这些细胞因子进行了体外研宄。将含神经氨酸苷酶的试验样品与盐水对照进行了比较。图3总结了当对用神经氨酸苷酶处理的细胞测试IL-2、IFN-a ,IFN-γ和TNF-α的产生时获得的结果。相对于各自的对照，使用治疗剂量的神经氨酸苷酶刺激了所有四种细胞因子的产生。预期上面讨论的这些细胞因子的功能可以通过体内系统中的神经氨酸苷酶得到加强并会在患者中具有抗病毒效果是合理的。
【主权项】
1.一种用于治疗具有慢性病毒感染的患者的方法，其包括: 对所述患者施用免疫耐受的和免疫信号传导的糖苷酶组合物的非急性方案，以治疗、改善和/或控制所述感染。2.如权利要求1所述的方法，其中所述患者是HIV阳性。3.如权利要求2所述的方法，其中所述患者具有AIDS。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述患者未经受抗病毒化疗，和/或所述HIV对抗病毒疗法有抗性。5.如权利要求3所述的方法，其中在抗病毒疗法之后启动所述方案以控制慢性AIDS。6.如权利要求3所述的方法，其中所述组合物与抗病毒疗法一起施用以逆转疾病轨迹，以及任选地持续至少六个月、或至少一年、或至少两年、或至少五年来任选地在无ARV治疗的情况下控制所述感染。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在所述方案开始时所述患者的CD4计数小于500。8.如权利要求7所述的方法，其中在所述方案开始时所述患者的CD4计数在200和400之间。9.如权利要求7所述的方法，其中在所述方案开始时所述患者的CD4计数小于400、小于350、小于300、小于200、小于100或小于50。10.如权利要求2至9中任一项所述的方法，其中在所述方案开始时病毒载量为大于10，000/ml ο11.如权利要求10所述的方法，其中在所述方案开始时所述病毒载量为至少25，000/ml、至少 40，000/ml、至少 50，000/ml、至少 75，000/ml、至少 100，000/ml、至少 500，000/ml、至少I百万/ml或至少5百万/ml。12.如权利要求1所述的方法，其中所述患者具有选自单纯疱瘆病毒感染、水痘带状疱瘆病毒感染、甲型、乙型或丙型肝炎、腺病毒感染或者人乳头状瘤病毒感染的慢性病毒感染。13.如权利要求12所述的方法，其中所述患者具有带状疱瘆。14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶方案包括施用神经氨酸苷酶。15.如权利要求14所述的方法，其进一步包括施用半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的一种或多种。16.一种用于治疗具有持续性或复发性细菌感染的患者的方法，其包括对所述患者施用糖苷酶的方案。17.如权利要求16所述的方法，其中所述细菌感染与肺炎、支气管炎、鼻窦炎、肠炎、结肠炎、败血症或尿路感染相关。18.如权利要求16所述的方法，其中所述细菌感染是持续性或复发性耳、眼、鼻和/或咽喉感染。19.如权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述细菌是分枝杆菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、衣原体属、奈瑟氏菌属、链球菌属、葡萄球菌属、博德特氏菌属或耶尔森氏菌属的种。20.如权利要求19所述的方法，其中所述细菌是结核分枝杆菌。21.如权利要求16至20中任一项所述的方法，其中在至少一轮的抗生素疗法未能改善或消除所述感染之后施用所述糖苷酶方案。22.如权利要求14至18中任一项所述的方法，其中与抗生素疗法并行施用所述糖苷酶方案。23.如权利要求20所述的方法，其中所述抗生素疗法采用氨基糖苷、碳青霉烯、头孢菌素、大环内酯、β内酰胺、喹诺酮、磺酰胺或四环素中的一种或多种。24.如权利要求16至23中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶方案包括施用神经氨酸苷酶。25.如权利要求24所述的方法，其进一步包括施用半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的一种或多种。26.一种用于治疗真菌或寄生虫感染的方法，其包括对需要其的患者施用糖苷酶方案。27.如权利要求26所述的方法，其中所述感染是念珠菌病。28.如权利要求26所述的方法，其中所述感染是疟疾或锥虫病。29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶方案包括施用神经氨酸苷酶。30.如权利要求29所述的方法，其进一步包括施用半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的一种或多种。31.—种用于增强疫苗接种的方法，其包括对所述患者施用免疫信号传导的糖苷酶的方案，所述方案在疫苗接种之前、期间或之后开始。32.如权利要求31所述的方法，其中所述疫苗是不含佐剂的疫苗。33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中通过选自舌下、鼻、口、真皮下、灌胃、眼内、静脉内、肌内、皮下、经真皮和颊部的途径施用所述糖苷酶。34.如权利要求33所述的方法，其中通过舌下施用所述糖苷酶。35.如权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶方案包括施用神经氨酸苷酶。36.如权利要求35所述的方法，其进一步包括施用半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶和甘露糖苷酶中的一种或多种。37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶是生物来源的糖苷酶或保持了免疫调节活性的其衍生物或活性部分。38.如权利要求35或36所述的方法，其中所述糖苷酶来自于生物来源或是合成的。39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中按照平均每天2至6次施用所述糖苷酶至少一个月。40.如权利要求39所述的方法，其中按照平均每天2至6次施用所述糖苷酶至少两个月、至少四个月或至少六个月。41.如权利要求39所述的方法，其中随后每天用约一个剂量对所述患者长期地治疗，持续至少六个月、或至少一年、或至少两年、或至少五年或更长。42.一种用于施用糖苷酶组合物的药物施用器，所述施用器包括至少100个剂量的所述神经氨酸苷酶组合物。43.如权利要求42所述的药物施用器，其中所述施用器用于舌下、鼻、经真皮、真皮下延时释放、眼内、灌胃、口、皮下、口服或颊部递送。44.如权利要求42所述的药物施用器，其中所述施用器是用于舌下递送。45.如权利要求42至44中任一项所述的药物施用器，其中所述施用器以维持剩余剂量的无菌条件的方式分配剂量。46.如权利要求45所述的药物施用器，其中所述施用器递送50至100μ I的剂量。47.如权利要求42至46中任一项所述的药物施用器，其中所述糖苷酶包括神经氨酸苷酶。48.如权利要求42至46中任一项所述的药物施用器，其中所述糖苷酶包括神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶以及甘露糖苷酶中的至少两种。
【专利摘要】在各个方面，本发明涉及免疫耐受的糖苷酶疗法。本发明提供了用于治疗或预防包括慢性病毒感染在内的感染性疾病、以及对免疫系统呈现持续挑战的高度传染性的感染因子的方法。所述组合物和治疗方案可与其他抗病毒或抗微生物疗法一起使用，以及与疫苗接种结合使用以增强效力和/或延长保护作用的持续时间。在某些实施方案中，本文描述的方案减少或消除了对施用其他传统的抗病毒或抗微生物疗法的需求。在各个实施方案中，本发明可用于免疫受损的患者中以增强免疫功能。
【IPC分类】A61P31/04, A01N25/00, A61K39/21
【公开号】CN104902926
【申请号】CN201380053622
【发明人】艾里斯.克莱恩
【申请人】艾里斯.克莱恩
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年9月26日
【公告号】CA2886474A1, EP2900259A1, US20150238580, WO2014052621A1
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