用于治疗用途的抗-bag3抗体的制作方法
用于治疗用途的抗-bag3抗体的制作方法
【专利说明】用于治疗用途的抗-BAG3抗体
[0001] 描述
[0002] 本发明涉及抗-BAG3抗体作为药物，特别是用于在治疗胰腺肿瘤或免疫、炎性、赘 生性（neoplastic)和/或退行性质的其他病理学中使用的药物的用途。 现有技术
[0003] BAG3蛋白是74kDa胞质蛋白，其属于共伴侣蛋白家族，所述共伴侣蛋白家族与蛋 白HSP70(热休克蛋白）的ATP酶域通过称为BAG域（氨基酸110-124)的结构域相互作 用。此外，BAG3蛋白包含Wff结构域（Trp-Trp)、富含脯氨酸区域（PXXP)、和两个保守的基 序IPV(Ile-Pro-Val)，其可介导与其他蛋白的结合。由于BAG3蛋白作为适配体（adapter) 的性质，可归因于许多功能域的存在，因此此类蛋白可与不同的蛋白相互作用。
[0004] 在人类中，bag3基因表达对于包括肌细胞的数种正常细胞而言是组成型的，然而 其突变与骨骼肌和心肌的疾病相关。此外，BAG3蛋白表达于许多类型的原发性肿瘤或肿瘤 细胞系（淋巴或骨髓性白血病、神经母细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌和前列腺癌、黑素 瘤、骨肉瘤、成胶质细胞瘤和肾肿瘤、结肠肿瘤、和卵巢肿瘤）。
[0005] 在正常的细胞类型，诸如白细胞、上皮细胞和神经胶质细胞和视网膜的细胞中， bag3基因表达可通过应激物，诸如氧化剂、高温、缺乏血清、重金属、HIV-I感染等来诱导。 这些发现表明，bag3基因表达调控是细胞应激反应中的重要组成部分，并与响应转录因子 HSFl (热休克转录因子）的元件的存在相关，所述元件在bag3基因启动子中以各种形式的 细胞应激被激活（Franceschelli S.，等人 J Cell Physiol 215(2008)575-577)。
[0006] 此外，由于许多蛋白-蛋白相互作用域在其结构中的存在，BAG3蛋白在不同类型 的细胞中与不同的分子伴侣相互作用，影响细胞存活。（A. Rosati等人Cell Death Dis. (2011)2:el41)。在骨肉瘤和黑色素瘤细胞中鉴定了报道的与BAG3抗细胞凋亡活性有关的 第一机制，其中观察到BAG3蛋白调节转录因子NF-kB的活化和细胞存活（Ammirante M.等 人，Proc Natl Acad Sci USA 107(2010)7497-7502)。已在成胶质细胞瘤细胞中描述了不 同的分子机制，其中BAG3蛋白以积极的方式与HSP70蛋白合作，以维持细胞溶质中的BAX 蛋白并阻止其易位进入线粒体（Festa M.等人，AmJ Patholl78 (2011) 2504-25)。最后，已 示出了，BAG3在某些肿瘤中调控调节细胞粘附的蛋白。
[0007] 细胞质BAG3蛋白的存在已在许多不同的细胞系统中被描述，并且不但与各种肿 瘤关联，而且与细胞存活通常有关的病理学关联。
[0008] 此外，专利申请号W02011/067377描述了外分泌至细胞作为血清中的生化标志物 的可溶性BAG3蛋白，其对于某些病理学状况，诸如心脏的病理学和胰腺肿瘤的诊断是高度 特异性的。特别是，已经证实了，在患有胰腺癌的患者中（细胞外）可溶性BAG3的浓度通 常大于l〇ng/ml。
[0009] 此外，最近已报道了 BAG3蛋白表达于患有胰腺导管腺癌（PDAC)的346/346患者 中，并由胰腺肿瘤的细胞所释放，但此蛋白不表达于周围的非赘生性组织或正常胰腺中；同 样地，已报道了 BAG3表达的水平与患者存活相关。研宄的结果证明了，应用BAG3mRNA的特 异性siRNA分子可沉默bag3基因表达并诱导细胞死亡，证实了 BAG3蛋白对于胰腺肿瘤细 胞而言是重要的存活因子，且证实了当与庆大霉素结合时，其下调，可有助于根除肿瘤细胞 (Rosati 等人，Am J Pathol. 2012Nov ; 181 (5) : 1524-9) 〇
[0010] 如已知的，用于肿瘤病理学的常规化疗治疗，以及用皮质类固醇或NSAID(非甾体 抗炎药）对炎性和免疫疾病的治疗，带来与副作用相关的许多缺点，并且目前，不是治疗此 类病理学的决定性方法。
[0011] 因此，存在对新的及改进的治疗处理的明显需要，与用于治疗本发明中描述的炎 性、免疫、和赘生性性质的疾病的常规、公知的疗法比较，其具有高度特异性及具有很少或 无副作用的优势。
[0012] 发明描述
[0013] 令人惊讶地，已首次证实了，通过使用抗BAG3单克隆抗体抑制可溶性（即细胞外） BAG3蛋白，损害胰腺肿瘤细胞的发展。抗BAG3抗体代表用于治疗胰腺肿瘤的新的和改进的 治疗工具。此外，还已令人惊讶地发现了，上述的BAG3蛋白参与巨噬细胞的活化。
[0014] 因此，用专利申请号W003/055908中描述的能特异性抑制可溶性BAG3蛋白（即细 胞外）对认为是靶细胞的巨噬细胞的活性的抗BAG3抗体的任一种的治疗，证明了在特征为 巨噬细胞的活化的这些病理学，诸如赘生性疾病和炎性、免疫、或退行性性质的疾病的治疗 中特别有效。事实上，当由细胞分泌时，针对BAG3的这些特异性抗体可以以高度选择性和 靶向的方式结合并阻断与BAG3蛋白相关的病理学效应。
[0015] 特别是，抗BAG3抗体在这个进程中的应用具有对特征为过表达和释放BAG3蛋白 的选择的病理学状态是更特异的，及还在副作用方面更少的损害的令人惊奇的优势。
[0016] 术语"可溶性BAG3蛋白"应理解为细胞外BAG3蛋白，即外部分泌至细胞的蛋白。
[0017] 因此，本发明的目的之一是抗BAG3抗体作为药物的用途。
[0018] 根据本发明可用的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选地是单克隆抗 体。
[0019] 仍然更优选地，所述单克隆抗体可选自以下：鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组 抗体、缀合的抗体、ScFv片段（双链抗体、三链抗体和四链抗体（tetrabody))、Fab片段、和 片段 F(ab'）2。
[0020] 术语"多克隆抗体"是指由于由不同的浆细胞产生而是遗传上不同的并识别相同 抗原的不同表位的抗体的混合物。
[0021] 术语"单克隆抗体"是指由于由仅来自一种类型的免疫细胞（即细胞克隆）的细 胞系产生的而全部是相同的一组抗体。
[0022] 术语"人源化抗体"是指其高变区已替换为非人单克隆抗体的同源区的人类起源 的抗体。
[0023] 术语"嵌合抗体"是指包含源自不同抗体的部分的抗体。
[0024] 术语"重组抗体"是指使用重组DNA方法获得的抗体。
[0025] 术语"缀合的抗体"是指缀合了药物、毒素、放射性物质或其他剂的抗体。
[0026] 术语"scFv片段"（单链可变片段）是指仅能够与相关的抗原结合的免疫球蛋白 片段。ScFv片段还可使用肽接头合成为二聚体（双链抗体），三聚体（三链抗体）和四聚 体（四链抗体）。
[0027] 术语"Fab片段"（抗原结合片段）和"Fab2片段"是指由连接至相邻重链的Fe片 段的轻链组成的免疫球蛋白片段，且此类片段是单价抗体。当Fab部分成对时，片段称为 Fab2〇
[0028] 术语"杂交瘤"是指产生单克隆抗体的细胞。
[0029] 在实施例中使用的单克隆抗体通过使用本领域技术人员已知的任何方法针对四 种不同的BAG3蛋白肽免疫接种小鼠来获得。由于其是BAG3蛋白特异的并且不与任何其他 蛋白包括BAG蛋白共享，因此选择此类肽。
[0030] 四种肽的序列包括在BAG3氨基酸序列中（RefSeq:NP_004272 ;基因ID 9531)并 选自以下：
[0031] SEQ ID NO 1:DRDPLPPGWEIKIDPQ ;(包括 BAG3 蛋白氨基酸 18-33);
[0032] SEQ ID NO 2:SSPKSVATEERAAPS ;(包括 BAG3 蛋白氨基酸 385-399);
[0033] SEQ ID NO 3:DKGKKNAGNAEDPHT ;(包括 BAG3 蛋白氨基酸 533-547);
[0034] SEQ ID NO 4:NPSSMTDTPGNPAAP ;(包括 BAG3 蛋白氨基酸 561-575)。
[0035] 优选地，使用以下图谱构建体，所述抗体可通过多重抗原肽的方法（MAP) 来获得（Keah HH 等人，J P印t Res(1988) ;51:2.Tam JP;Proc Natl acad Sci USA (1988) ,85:5409。Ota S,等人，Cancer Res (2002) ,62:1471):
[0036] -MAP-BAG3-l:nh2-DRDPLPPGWEIKIDPQ-MAP (其包含序列 SEQ ID N0:1);
[0037] -MAP-BAG3-2:nh2-SSPKSVATEERAAPS-MAP (其包含序列 SEQ ID N0:2);
[0038] -MAP-BAG3-3:nh2-DKGKKNAGNAEDPHT-MAP (其包含序列 SEQ ID N0:3);
[0039] -MAP-BAG3-4:nh2-NPSSMTDTPGNPAAP-MAP (其包含序列 SEQ ID N0:4);
[0040] 根据本发明的优选的实施方案，所述多克隆抗-BAG3抗体通过针对上述序列SEQ ID NO. 1-4的四种肽之一免疫接种动物来获得。
[0041] 根据优选的实施方案，本发明的单克隆抗BAG3抗体使用上述四种MAP-BAG3肽通 过标准程序（Tassone P.,等人，Tissue Antigens 51:671(1998))获得并通过选自以下的 九种母克隆的至少一种来产生：AC-1、AC-2、AC-3、AC-4、AC-5、AC-6、AC-7、AC-8、或 AC-9 (描 述于W003/055908中），其包含对使用的四种MAP-BAG3构建体的每种的特异性杂交瘤。
[0042] 根据另外的实施方案，所用的抗体是从上述母克隆中的至少一种，且优选地从选 自以下的至少一种获得的单克隆抗BAG3抗体：401、八(：-2、4(：-3、4(：-4、或4(：-5。更优选地， 所述单克隆抗体从选自以下的至少一种母克隆获得：AC-I、AC-2、和AC-3。
[0043] 根据另外的优选实施方案，以标准程序（Ceran C, Cokol M, Cillgdz S, Tasan I, Ozturk M, Ya gci T. Novel anti-HER2monoclonal antibodies: synergy and antagonism with tumor necrosis factor-a. BMC Cancer. 20120ct 4 ;12:450)和以 BAG3 重组蛋白 免疫接种小鼠，在本发明中设想的单克隆抗BAG 3抗体从以下克隆的至少一个：A C -r b I、 AC-rb2、AC-rb3和AC. rb4,和/或以下亚克隆中的至少一个来获得：AC-rbla、AC-rblb、 八〇1^23、4〇1^213、4(：-1^33、4(：-1^313、4(：-1^43、和4(：-1^413。由所有这些克隆和亚克隆产生 的单克隆抗体在ELISA测试中识别BAG3重组蛋白。（实施例2)。
[0044] 优选地，所述单克隆抗BAG3抗体是识别BAG3蛋白氨基酸序列中的表位的那些，所 述BAG3蛋白氨基酸序列中的表位包括以下片段中的至少一个：18-33、385-399、533-547或 562-575。
[0045] 本发明的另外的目的是上述的抗BAG3抗体在治疗涉及巨噬细胞的活化的特定病 理学状态中的用途。此类病理学状态可选自：赘生性疾病、炎性疾病、免疫疾病、和/或退行 性疾病。
[0046] 优选地，此类赘生性疾病可以是胰腺肿瘤或膀胱肿瘤，更优选地胰腺肿瘤。
[0047] 优选地，所述炎性疾病可选自与以下相关的疾病：皮肤、神经、骨骼、血管、和结缔 组织的炎症，且更优选地，银肩病、关节炎、神经炎、结缔组织炎症（connectivitis)。
[0048] 优选地，所述免疫疾病可选自自身免疫性疾病诸如风湿病、结缔组织疾病、神经肌 肉疾病、内分泌疾病、胃肠疾病、血液病（haematologic diseases)、皮肤病、和脉管炎，并且 更优选地，类风湿关节炎、多发性硬化症、结缔组织炎症、红斑狼疮、子宫内膜异位症、和溃 疡性结肠炎。优选地，所述退行性疾病可选自神经变性疾病和肌肉退行性疾病，且更优选地 阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、和肌肉萎缩症。
[0049] 根据本发明的一个更优选的实施方案，抗BAG3抗体用于治疗赘生性疾病、炎性疾 病、免疫疾病、和退行性疾病。
[0050] 本发明的另外目的是药物组合物，所述药物组合物包含与至少一种药学上可接受 的赋形剂联合的前述的抗BAG3抗体。
[0051] 本发明的另外的目的是所述组合物作为药物的用途。
[0052] 本发明的优选的实施方案是该组合物在赘生性疾病和炎性、免疫和/或退行性性 质的疾病的治疗中的用途。
[0053] 本发明的组合物可以配制为适合于口服施用的形式或适合于肠胃外或局部施用 的形式。
[0054] 在本发明的一个优选的实施方案中，所述口服形式可选自以下：片剂、胶囊、溶液、 悬浮液、颗粒、和油性胶囊。
[0055] 在本发明的一个另外的优选实施方案中，所述局部形式可选自以下：乳膏、软膏、 软膏、溶液、悬浮液、滴眼剂、阴道栓、雾化溶液、喷雾、粉末或凝胶。
[0056] 在本发明的一个另外的优选实施方案中，所述肠胃外形式可以是缓冲水溶液或油 性悬浮液。
[0057] 所述肠胃外施用包括通过肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、结内（intranodal)、 或脾内方法的施用。
【附图说明】
[0058] 图1图像显示了用AC_rb2处理的小鼠中肿瘤生长的减少。
[0059] 图2原位肿瘤生长减少的结果。
[0060] 图3周围区域中肿瘤生长减少的结果。 实施例
[0061] 实施例1?用抗BAG3抗体（AC-rb2)处理BALB/c小鼠。
[0062] 将 6 周龄雌性 BALB/c 裸鼠（nu/nu) (Charles Rivers Wilmington, MA, USA)用食 物和水随意笼养（3只/笼）并保持在12h光照/黑暗周期的标准、无病原体条件中。研宄 方案根据意大利卫生部（Italian Ministry of Health)官方指南（official guidelines) 经伦理委员会（Ethics Committee)批准。适应一周后，小鼠经受癌细胞接种。总计使用10 只小鼠，每一只单独鉴定。整个实验在层流净化罩（laminar flow hood)中进行，且全部手 术程序都严格遵守无菌技术来进行。将小鼠用腹膜内注射的lOOmg/ml盐酸氯胺酮和20mg/ ml赛拉嗪麻醉；然后其经受剖腹手术且将胰腺的尾部温和地由腹取出。在Iml注射器中将 MIA-PaCa 2RFP细胞（2. 5 X IO6)重悬于40微升的PBSlX中；使用25G针头将细胞注射进入 胰腺的尾部，且注入位置用无菌棉擦拭。确定体内平衡后，使胰腺的尾部在腹腔复位并闭合 伤口。两周后，将小鼠随机分为两组：第一组接受腹膜内注射l〇〇mg/kg小鼠IgG，且第二组 接受l〇〇mg/kg鼠单克隆抗BAG3抗体（AC-rb2)。总计一周进行两次该处理，并且然后将小 鼠再次麻醉以使用Leica Mycrosystems Ltd.的Macro Fluo和LAS V3. 7软件检查肿瘤区 域。在每次成像中，肿瘤团块通过定量荧光区域来确定。
[0063] 结果
[0064] 图1-3所示的结果表明，用抗BAG3AC-rb2抗体的处理使肿瘤团块的原位生长减少 了 75%以上且就肿瘤周围的区域，即肿瘤的扩散而论减少了 45%以上。
[0065] 用鼠单克隆抗体AC_rb3获得了相似的结果。
[0066] 实施例2.对从以下亚克隆获得的抗体的ELISA测试：AC-rbla、AC-rblb、AC-rb2a、 AC_rb2b、AC_rb3a、AC_rb3b、AC_rb4a 和 AC_rb4b。
[0067] 将NUNC Maxisorp 96孔微量滴定板用PBS IX pH 7中BAG3重组蛋白I yg/ ml (50 y 1/孔）功能化，并在4°C下温育18小时。然后将板用缓冲洗液（PBS 1X+0. 05%吐 温-20)洗涤两次，并且然后在室温下用PBS IX中0. 5%鱼明胶（150 y 1/孔）保持一小 时。随后，将板用缓冲液洗涤两次，并以PBS IX中0. 5%鱼明胶将八个亚克隆的上清液进行 1/10、1/100、和1/1000稀释，且然后以一式三份温育（50 y 1/孔），并在室温下温育2小时。 然后将板用缓冲液洗涤六次。为了使信号显影，使用鼠抗IgG抗体（H+L) (Sigma Aldrich)， 以相同缓冲液1/20, 000稀释，然后添加至板（50yl/孔）中并在4°C下温育30分钟。温育 后，将板洗涤六次，然后用TMB (50 y 1/孔）（eBioscience)显影，并用硫酸4. 5M(25 y 1/孔） 停止反应。然后将板在分光光度计中在450nm的波长下进行分析。该结果表示为O.D.(光 密度测定法）。
[0068] 所获得的结果表明，由测试的亚克隆获得的所有抗体能够识别BAG3蛋白。
[0069]
【主权项】
1. 抗-BAG3抗体，所述抗-BAG3抗体用于作为药物使用。2. 根据权利要求1所述的用于使用的抗-BAG3抗体，所述抗-BAG3抗体用于治疗赘生 性疾病、炎性疾病、免疫疾病和/或退行性疾病。3. 根据权利要求2所述的用于使用的抗-BAG3抗体，其特征在于所述赘生性疾病是胰 腺肿瘤。4. 根据权利要求2所述的用于使用的抗-BAG3抗体，其特征在于所述赘生性疾病是膀 胱肿瘤。5. 根据前述权利要求中任一项所述的用于使用的抗-BAG3抗体，其特征在于此类抗体 是多克隆抗体。6. 根据前述权利要求中任一项所述的用于使用的抗-BAG3抗体，其特征在于此类抗体 是单克隆抗体。7. 根据权利要求6所述的用于使用的抗-BAG3抗体，其特征在于所述单克隆抗体是鼠 抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、缀合的抗体、scFv片段（双链抗体、三链抗体和四 链抗体）、Fab片段或F(ab'）2片段。8. 根据权利要求7所述的用于使用的单克隆抗-BAG3抗体，其特征在于所述单克隆抗 体由选自以下的九个母克隆中的至少一个产生：AC-1、AC-2、AC-3、AC-4、AC-5、AC-6、AC-7、 AC-8和AC-9 ;优选地所述单克隆抗体从选自以下的五个母克隆中的至少一个获得：AC-1、 AC-2、AC-3、AC-4、或AC-5。9. 根据权利要求7所述的用于使用的单克隆抗-BAG3抗体，其特征在于所述单克隆 抗-BAG3抗体由以下选自AC-rbl、AC-rb2、AC-rb3或AC-rb4的克隆的至少一个，以及由以 下亚克隆：△〇1'1313、六〇1'13113、六0；^323、六0；^3213、六0；^333、六0；^3313、六0；^343、或六0；^3413的 至少一个产生。10. 根据前述权利要求中任一项所述的用于使用的抗-BAG3抗体，其特征在于所述 BAG3蛋白是可溶的。11. 药物组合物，所述药物组合物包含至少一种根据前述权利要求的任一项的抗BAG3 抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。12. 根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于所述组合物可以配制为适合于口 服施用的形式或适合于肠胃外或局部施用的形式。13. 根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于口服施用的所述形式可选自片 剂、胶囊、溶液、悬浮液、颗粒、和油性胶囊。14. 根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于肠胃外施用的所述形式可选自肌 内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、结内、或脾内施用。15. 根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于局部施用的所述形式可选自乳 膏、药膏、软膏或凝胶。16. 根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于所述肠胃外形式可以是缓冲水溶 液或油性悬浮液。
【专利摘要】本发明涉及BAG3抗体作为药物，特别是用于在治疗胰腺肿瘤或免疫、炎性、赘生性(neoplastic)和/或退行性质的其他病理学中使用的药物的用途。
【IPC分类】C07K16/18, A61K39/395, A61P35/00, C07K16/30
【公开号】CN104902927
【申请号】CN201480003897
【发明人】玛丽亚·卡特里纳·图尔科
【申请人】比奥尤尼沃萨有限责任公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月4日
【公告号】CA2895472A1, US20150329622, WO2014147503A2, WO2014147503A3
【专利说明】用于治疗用途的抗-BAG3抗体
[0001] 描述
[0002] 本发明涉及抗-BAG3抗体作为药物，特别是用于在治疗胰腺肿瘤或免疫、炎性、赘 生性（neoplastic)和/或退行性质的其他病理学中使用的药物的用途。 现有技术
[0003] BAG3蛋白是74kDa胞质蛋白，其属于共伴侣蛋白家族，所述共伴侣蛋白家族与蛋 白HSP70(热休克蛋白）的ATP酶域通过称为BAG域（氨基酸110-124)的结构域相互作 用。此外，BAG3蛋白包含Wff结构域（Trp-Trp)、富含脯氨酸区域（PXXP)、和两个保守的基 序IPV(Ile-Pro-Val)，其可介导与其他蛋白的结合。由于BAG3蛋白作为适配体（adapter) 的性质，可归因于许多功能域的存在，因此此类蛋白可与不同的蛋白相互作用。
[0004] 在人类中，bag3基因表达对于包括肌细胞的数种正常细胞而言是组成型的，然而 其突变与骨骼肌和心肌的疾病相关。此外，BAG3蛋白表达于许多类型的原发性肿瘤或肿瘤 细胞系（淋巴或骨髓性白血病、神经母细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌和前列腺癌、黑素 瘤、骨肉瘤、成胶质细胞瘤和肾肿瘤、结肠肿瘤、和卵巢肿瘤）。
[0005] 在正常的细胞类型，诸如白细胞、上皮细胞和神经胶质细胞和视网膜的细胞中， bag3基因表达可通过应激物，诸如氧化剂、高温、缺乏血清、重金属、HIV-I感染等来诱导。 这些发现表明，bag3基因表达调控是细胞应激反应中的重要组成部分，并与响应转录因子 HSFl (热休克转录因子）的元件的存在相关，所述元件在bag3基因启动子中以各种形式的 细胞应激被激活（Franceschelli S.，等人 J Cell Physiol 215(2008)575-577)。
[0006] 此外，由于许多蛋白-蛋白相互作用域在其结构中的存在，BAG3蛋白在不同类型 的细胞中与不同的分子伴侣相互作用，影响细胞存活。（A. Rosati等人Cell Death Dis. (2011)2:el41)。在骨肉瘤和黑色素瘤细胞中鉴定了报道的与BAG3抗细胞凋亡活性有关的 第一机制，其中观察到BAG3蛋白调节转录因子NF-kB的活化和细胞存活（Ammirante M.等 人，Proc Natl Acad Sci USA 107(2010)7497-7502)。已在成胶质细胞瘤细胞中描述了不 同的分子机制，其中BAG3蛋白以积极的方式与HSP70蛋白合作，以维持细胞溶质中的BAX 蛋白并阻止其易位进入线粒体（Festa M.等人，AmJ Patholl78 (2011) 2504-25)。最后，已 示出了，BAG3在某些肿瘤中调控调节细胞粘附的蛋白。
[0007] 细胞质BAG3蛋白的存在已在许多不同的细胞系统中被描述，并且不但与各种肿 瘤关联，而且与细胞存活通常有关的病理学关联。
[0008] 此外，专利申请号W02011/067377描述了外分泌至细胞作为血清中的生化标志物 的可溶性BAG3蛋白，其对于某些病理学状况，诸如心脏的病理学和胰腺肿瘤的诊断是高度 特异性的。特别是，已经证实了，在患有胰腺癌的患者中（细胞外）可溶性BAG3的浓度通 常大于l〇ng/ml。
[0009] 此外，最近已报道了 BAG3蛋白表达于患有胰腺导管腺癌（PDAC)的346/346患者 中，并由胰腺肿瘤的细胞所释放，但此蛋白不表达于周围的非赘生性组织或正常胰腺中；同 样地，已报道了 BAG3表达的水平与患者存活相关。研宄的结果证明了，应用BAG3mRNA的特 异性siRNA分子可沉默bag3基因表达并诱导细胞死亡，证实了 BAG3蛋白对于胰腺肿瘤细 胞而言是重要的存活因子，且证实了当与庆大霉素结合时，其下调，可有助于根除肿瘤细胞 (Rosati 等人，Am J Pathol. 2012Nov ; 181 (5) : 1524-9) 〇
[0010] 如已知的，用于肿瘤病理学的常规化疗治疗，以及用皮质类固醇或NSAID(非甾体 抗炎药）对炎性和免疫疾病的治疗，带来与副作用相关的许多缺点，并且目前，不是治疗此 类病理学的决定性方法。
[0011] 因此，存在对新的及改进的治疗处理的明显需要，与用于治疗本发明中描述的炎 性、免疫、和赘生性性质的疾病的常规、公知的疗法比较，其具有高度特异性及具有很少或 无副作用的优势。
[0012] 发明描述
[0013] 令人惊讶地，已首次证实了，通过使用抗BAG3单克隆抗体抑制可溶性（即细胞外） BAG3蛋白，损害胰腺肿瘤细胞的发展。抗BAG3抗体代表用于治疗胰腺肿瘤的新的和改进的 治疗工具。此外，还已令人惊讶地发现了，上述的BAG3蛋白参与巨噬细胞的活化。
[0014] 因此，用专利申请号W003/055908中描述的能特异性抑制可溶性BAG3蛋白（即细 胞外）对认为是靶细胞的巨噬细胞的活性的抗BAG3抗体的任一种的治疗，证明了在特征为 巨噬细胞的活化的这些病理学，诸如赘生性疾病和炎性、免疫、或退行性性质的疾病的治疗 中特别有效。事实上，当由细胞分泌时，针对BAG3的这些特异性抗体可以以高度选择性和 靶向的方式结合并阻断与BAG3蛋白相关的病理学效应。
[0015] 特别是，抗BAG3抗体在这个进程中的应用具有对特征为过表达和释放BAG3蛋白 的选择的病理学状态是更特异的，及还在副作用方面更少的损害的令人惊奇的优势。
[0016] 术语"可溶性BAG3蛋白"应理解为细胞外BAG3蛋白，即外部分泌至细胞的蛋白。
[0017] 因此，本发明的目的之一是抗BAG3抗体作为药物的用途。
[0018] 根据本发明可用的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选地是单克隆抗 体。
[0019] 仍然更优选地，所述单克隆抗体可选自以下：鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组 抗体、缀合的抗体、ScFv片段（双链抗体、三链抗体和四链抗体（tetrabody))、Fab片段、和 片段 F(ab'）2。
[0020] 术语"多克隆抗体"是指由于由不同的浆细胞产生而是遗传上不同的并识别相同 抗原的不同表位的抗体的混合物。
[0021] 术语"单克隆抗体"是指由于由仅来自一种类型的免疫细胞（即细胞克隆）的细 胞系产生的而全部是相同的一组抗体。
[0022] 术语"人源化抗体"是指其高变区已替换为非人单克隆抗体的同源区的人类起源 的抗体。
[0023] 术语"嵌合抗体"是指包含源自不同抗体的部分的抗体。
[0024] 术语"重组抗体"是指使用重组DNA方法获得的抗体。
[0025] 术语"缀合的抗体"是指缀合了药物、毒素、放射性物质或其他剂的抗体。
[0026] 术语"scFv片段"（单链可变片段）是指仅能够与相关的抗原结合的免疫球蛋白 片段。ScFv片段还可使用肽接头合成为二聚体（双链抗体），三聚体（三链抗体）和四聚 体（四链抗体）。
[0027] 术语"Fab片段"（抗原结合片段）和"Fab2片段"是指由连接至相邻重链的Fe片 段的轻链组成的免疫球蛋白片段，且此类片段是单价抗体。当Fab部分成对时，片段称为 Fab2〇
[0028] 术语"杂交瘤"是指产生单克隆抗体的细胞。
[0029] 在实施例中使用的单克隆抗体通过使用本领域技术人员已知的任何方法针对四 种不同的BAG3蛋白肽免疫接种小鼠来获得。由于其是BAG3蛋白特异的并且不与任何其他 蛋白包括BAG蛋白共享，因此选择此类肽。
[0030] 四种肽的序列包括在BAG3氨基酸序列中（RefSeq:NP_004272 ;基因ID 9531)并 选自以下：
[0031] SEQ ID NO 1:DRDPLPPGWEIKIDPQ ;(包括 BAG3 蛋白氨基酸 18-33);
[0032] SEQ ID NO 2:SSPKSVATEERAAPS ;(包括 BAG3 蛋白氨基酸 385-399);
[0033] SEQ ID NO 3:DKGKKNAGNAEDPHT ;(包括 BAG3 蛋白氨基酸 533-547);
[0034] SEQ ID NO 4:NPSSMTDTPGNPAAP ;(包括 BAG3 蛋白氨基酸 561-575)。
[0035] 优选地，使用以下图谱构建体，所述抗体可通过多重抗原肽的方法（MAP) 来获得（Keah HH 等人，J P印t Res(1988) ;51:2.Tam JP;Proc Natl acad Sci USA (1988) ,85:5409。Ota S,等人，Cancer Res (2002) ,62:1471):
[0036] -MAP-BAG3-l:nh2-DRDPLPPGWEIKIDPQ-MAP (其包含序列 SEQ ID N0:1);
[0037] -MAP-BAG3-2:nh2-SSPKSVATEERAAPS-MAP (其包含序列 SEQ ID N0:2);
[0038] -MAP-BAG3-3:nh2-DKGKKNAGNAEDPHT-MAP (其包含序列 SEQ ID N0:3);
[0039] -MAP-BAG3-4:nh2-NPSSMTDTPGNPAAP-MAP (其包含序列 SEQ ID N0:4);
[0040] 根据本发明的优选的实施方案，所述多克隆抗-BAG3抗体通过针对上述序列SEQ ID NO. 1-4的四种肽之一免疫接种动物来获得。
[0041] 根据优选的实施方案，本发明的单克隆抗BAG3抗体使用上述四种MAP-BAG3肽通 过标准程序（Tassone P.,等人，Tissue Antigens 51:671(1998))获得并通过选自以下的 九种母克隆的至少一种来产生：AC-1、AC-2、AC-3、AC-4、AC-5、AC-6、AC-7、AC-8、或 AC-9 (描 述于W003/055908中），其包含对使用的四种MAP-BAG3构建体的每种的特异性杂交瘤。
[0042] 根据另外的实施方案，所用的抗体是从上述母克隆中的至少一种，且优选地从选 自以下的至少一种获得的单克隆抗BAG3抗体：401、八(：-2、4(：-3、4(：-4、或4(：-5。更优选地， 所述单克隆抗体从选自以下的至少一种母克隆获得：AC-I、AC-2、和AC-3。
[0043] 根据另外的优选实施方案，以标准程序（Ceran C, Cokol M, Cillgdz S, Tasan I, Ozturk M, Ya gci T. Novel anti-HER2monoclonal antibodies: synergy and antagonism with tumor necrosis factor-a. BMC Cancer. 20120ct 4 ;12:450)和以 BAG3 重组蛋白 免疫接种小鼠，在本发明中设想的单克隆抗BAG 3抗体从以下克隆的至少一个：A C -r b I、 AC-rb2、AC-rb3和AC. rb4,和/或以下亚克隆中的至少一个来获得：AC-rbla、AC-rblb、 八〇1^23、4〇1^213、4(：-1^33、4(：-1^313、4(：-1^43、和4(：-1^413。由所有这些克隆和亚克隆产生 的单克隆抗体在ELISA测试中识别BAG3重组蛋白。（实施例2)。
[0044] 优选地，所述单克隆抗BAG3抗体是识别BAG3蛋白氨基酸序列中的表位的那些，所 述BAG3蛋白氨基酸序列中的表位包括以下片段中的至少一个：18-33、385-399、533-547或 562-575。
[0045] 本发明的另外的目的是上述的抗BAG3抗体在治疗涉及巨噬细胞的活化的特定病 理学状态中的用途。此类病理学状态可选自：赘生性疾病、炎性疾病、免疫疾病、和/或退行 性疾病。
[0046] 优选地，此类赘生性疾病可以是胰腺肿瘤或膀胱肿瘤，更优选地胰腺肿瘤。
[0047] 优选地，所述炎性疾病可选自与以下相关的疾病：皮肤、神经、骨骼、血管、和结缔 组织的炎症，且更优选地，银肩病、关节炎、神经炎、结缔组织炎症（connectivitis)。
[0048] 优选地，所述免疫疾病可选自自身免疫性疾病诸如风湿病、结缔组织疾病、神经肌 肉疾病、内分泌疾病、胃肠疾病、血液病（haematologic diseases)、皮肤病、和脉管炎，并且 更优选地，类风湿关节炎、多发性硬化症、结缔组织炎症、红斑狼疮、子宫内膜异位症、和溃 疡性结肠炎。优选地，所述退行性疾病可选自神经变性疾病和肌肉退行性疾病，且更优选地 阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、和肌肉萎缩症。
[0049] 根据本发明的一个更优选的实施方案，抗BAG3抗体用于治疗赘生性疾病、炎性疾 病、免疫疾病、和退行性疾病。
[0050] 本发明的另外目的是药物组合物，所述药物组合物包含与至少一种药学上可接受 的赋形剂联合的前述的抗BAG3抗体。
[0051] 本发明的另外的目的是所述组合物作为药物的用途。
[0052] 本发明的优选的实施方案是该组合物在赘生性疾病和炎性、免疫和/或退行性性 质的疾病的治疗中的用途。
[0053] 本发明的组合物可以配制为适合于口服施用的形式或适合于肠胃外或局部施用 的形式。
[0054] 在本发明的一个优选的实施方案中，所述口服形式可选自以下：片剂、胶囊、溶液、 悬浮液、颗粒、和油性胶囊。
[0055] 在本发明的一个另外的优选实施方案中，所述局部形式可选自以下：乳膏、软膏、 软膏、溶液、悬浮液、滴眼剂、阴道栓、雾化溶液、喷雾、粉末或凝胶。
[0056] 在本发明的一个另外的优选实施方案中，所述肠胃外形式可以是缓冲水溶液或油 性悬浮液。
[0057] 所述肠胃外施用包括通过肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、结内（intranodal)、 或脾内方法的施用。
【附图说明】
[0058] 图1图像显示了用AC_rb2处理的小鼠中肿瘤生长的减少。
[0059] 图2原位肿瘤生长减少的结果。
[0060] 图3周围区域中肿瘤生长减少的结果。 实施例
[0061] 实施例1?用抗BAG3抗体（AC-rb2)处理BALB/c小鼠。
[0062] 将 6 周龄雌性 BALB/c 裸鼠（nu/nu) (Charles Rivers Wilmington, MA, USA)用食 物和水随意笼养（3只/笼）并保持在12h光照/黑暗周期的标准、无病原体条件中。研宄 方案根据意大利卫生部（Italian Ministry of Health)官方指南（official guidelines) 经伦理委员会（Ethics Committee)批准。适应一周后，小鼠经受癌细胞接种。总计使用10 只小鼠，每一只单独鉴定。整个实验在层流净化罩（laminar flow hood)中进行，且全部手 术程序都严格遵守无菌技术来进行。将小鼠用腹膜内注射的lOOmg/ml盐酸氯胺酮和20mg/ ml赛拉嗪麻醉；然后其经受剖腹手术且将胰腺的尾部温和地由腹取出。在Iml注射器中将 MIA-PaCa 2RFP细胞（2. 5 X IO6)重悬于40微升的PBSlX中；使用25G针头将细胞注射进入 胰腺的尾部，且注入位置用无菌棉擦拭。确定体内平衡后，使胰腺的尾部在腹腔复位并闭合 伤口。两周后，将小鼠随机分为两组：第一组接受腹膜内注射l〇〇mg/kg小鼠IgG，且第二组 接受l〇〇mg/kg鼠单克隆抗BAG3抗体（AC-rb2)。总计一周进行两次该处理，并且然后将小 鼠再次麻醉以使用Leica Mycrosystems Ltd.的Macro Fluo和LAS V3. 7软件检查肿瘤区 域。在每次成像中，肿瘤团块通过定量荧光区域来确定。
[0063] 结果
[0064] 图1-3所示的结果表明，用抗BAG3AC-rb2抗体的处理使肿瘤团块的原位生长减少 了 75%以上且就肿瘤周围的区域，即肿瘤的扩散而论减少了 45%以上。
[0065] 用鼠单克隆抗体AC_rb3获得了相似的结果。
[0066] 实施例2.对从以下亚克隆获得的抗体的ELISA测试：AC-rbla、AC-rblb、AC-rb2a、 AC_rb2b、AC_rb3a、AC_rb3b、AC_rb4a 和 AC_rb4b。
[0067] 将NUNC Maxisorp 96孔微量滴定板用PBS IX pH 7中BAG3重组蛋白I yg/ ml (50 y 1/孔）功能化，并在4°C下温育18小时。然后将板用缓冲洗液（PBS 1X+0. 05%吐 温-20)洗涤两次，并且然后在室温下用PBS IX中0. 5%鱼明胶（150 y 1/孔）保持一小 时。随后，将板用缓冲液洗涤两次，并以PBS IX中0. 5%鱼明胶将八个亚克隆的上清液进行 1/10、1/100、和1/1000稀释，且然后以一式三份温育（50 y 1/孔），并在室温下温育2小时。 然后将板用缓冲液洗涤六次。为了使信号显影，使用鼠抗IgG抗体（H+L) (Sigma Aldrich)， 以相同缓冲液1/20, 000稀释，然后添加至板（50yl/孔）中并在4°C下温育30分钟。温育 后，将板洗涤六次，然后用TMB (50 y 1/孔）（eBioscience)显影，并用硫酸4. 5M(25 y 1/孔） 停止反应。然后将板在分光光度计中在450nm的波长下进行分析。该结果表示为O.D.(光 密度测定法）。
[0068] 所获得的结果表明，由测试的亚克隆获得的所有抗体能够识别BAG3蛋白。
[0069]
【主权项】
1. 抗-BAG3抗体，所述抗-BAG3抗体用于作为药物使用。2. 根据权利要求1所述的用于使用的抗-BAG3抗体，所述抗-BAG3抗体用于治疗赘生 性疾病、炎性疾病、免疫疾病和/或退行性疾病。3. 根据权利要求2所述的用于使用的抗-BAG3抗体，其特征在于所述赘生性疾病是胰 腺肿瘤。4. 根据权利要求2所述的用于使用的抗-BAG3抗体，其特征在于所述赘生性疾病是膀 胱肿瘤。5. 根据前述权利要求中任一项所述的用于使用的抗-BAG3抗体，其特征在于此类抗体 是多克隆抗体。6. 根据前述权利要求中任一项所述的用于使用的抗-BAG3抗体，其特征在于此类抗体 是单克隆抗体。7. 根据权利要求6所述的用于使用的抗-BAG3抗体，其特征在于所述单克隆抗体是鼠 抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、缀合的抗体、scFv片段（双链抗体、三链抗体和四 链抗体）、Fab片段或F(ab'）2片段。8. 根据权利要求7所述的用于使用的单克隆抗-BAG3抗体，其特征在于所述单克隆抗 体由选自以下的九个母克隆中的至少一个产生：AC-1、AC-2、AC-3、AC-4、AC-5、AC-6、AC-7、 AC-8和AC-9 ;优选地所述单克隆抗体从选自以下的五个母克隆中的至少一个获得：AC-1、 AC-2、AC-3、AC-4、或AC-5。9. 根据权利要求7所述的用于使用的单克隆抗-BAG3抗体，其特征在于所述单克隆 抗-BAG3抗体由以下选自AC-rbl、AC-rb2、AC-rb3或AC-rb4的克隆的至少一个，以及由以 下亚克隆：△〇1'1313、六〇1'13113、六0；^323、六0；^3213、六0；^333、六0；^3313、六0；^343、或六0；^3413的 至少一个产生。10. 根据前述权利要求中任一项所述的用于使用的抗-BAG3抗体，其特征在于所述 BAG3蛋白是可溶的。11. 药物组合物，所述药物组合物包含至少一种根据前述权利要求的任一项的抗BAG3 抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。12. 根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于所述组合物可以配制为适合于口 服施用的形式或适合于肠胃外或局部施用的形式。13. 根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于口服施用的所述形式可选自片 剂、胶囊、溶液、悬浮液、颗粒、和油性胶囊。14. 根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于肠胃外施用的所述形式可选自肌 内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、结内、或脾内施用。15. 根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于局部施用的所述形式可选自乳 膏、药膏、软膏或凝胶。16. 根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于所述肠胃外形式可以是缓冲水溶 液或油性悬浮液。
【专利摘要】本发明涉及BAG3抗体作为药物，特别是用于在治疗胰腺肿瘤或免疫、炎性、赘生性(neoplastic)和/或退行性质的其他病理学中使用的药物的用途。
【IPC分类】C07K16/18, A61K39/395, A61P35/00, C07K16/30
【公开号】CN104902927
【申请号】CN201480003897
【发明人】玛丽亚·卡特里纳·图尔科
【申请人】比奥尤尼沃萨有限责任公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月4日
【公告号】CA2895472A1, US20150329622, WO2014147503A2, WO2014147503A3
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