使用蛋白质前体作为前药的方法
使用蛋白质前体作为前药的方法
【专利说明】
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是于2011年6月30日递交的美国专利申请13/174,520的部分继续申请， 其享有于2010年7月2日递交的美国临时申请61/361，248的权益，因此将这些申请的所 有内容都通过援引并入本文中。
[0003] 关于受联邦资助的研发的声明
[0004] 本发明依NIH和HIGMS授予的合同GM 063647在政府支持下完成。政府享有本发 明的一定权利。
技术领域
[0005] 本发明属于药物递送和蛋白质工程领域。更具体而言，本发明涉及用于递送基于 蛋白的治疗剂（例如激素原或因子原（profactor))的方法和组合物，其无需体外化学加工 或蛋白水解加工就能产生治疗有效的药物。
【背景技术】
[0006] 许多具有生物活性的肽或蛋白，包括激素、细胞因子、神经肽和生长因子，最初是 以更大的无活性前体肽的形式产生。这些前体肽或前肽（包括激素原或因子原）通常需要 特定的细胞内蛋白水解加工来使其转变成其活性形式以发挥生物学功能[1，2]。对于蛋白 制造而言，经常先合成肽的前体形式而不是成熟形式。这是因为肽的成熟形式往往具有复 杂的构象、收率低或结构不稳定。对于蛋白药物递送而言，将前肽（而非成熟的肽）通过化 学缀合或重组融合与另一蛋白部分连接，从而实现特定的递送目标并增强蛋白的整体稳定 性[3]。因此，为了展现出生物学活性，需要对前肽进行加工并激活，这是制造重组治疗肽时 的重要而具有挑战性的一步。
[0007] 递送前药的常规方法通常涉及将前肽与递送蛋白连接在一起的化学缀合。但是， 将两个结构域化学缀合在一起的主要障碍在于，最终产物的组成和尺寸可以是异源的，这 对于治疗用途而言是不能接受的。因此，仍需要一种更好的方法来形成将递送结构域与前 药结构域连接在一起的融合蛋白。
【发明内容】
[0008] 本发明基于以下出人意料的发现：在转铁蛋白受体介导的胞吞作用中，肝细胞和 上皮细胞的细胞内区室具有将胰岛素原转化为胰岛素的能力。受此发现的启发，本发明人 设想并实践了一种通过将蛋白因子的前肽与转铁蛋白结构域缀合来配制基于蛋白的药物 的方法。例如，可以通过将胰岛素的前肽（即胰岛素原）与转铁蛋白缀合来形成基于胰岛 素的蛋白药物。在与肝细胞温育时，该胰岛素原-转铁蛋白缀合物或融合蛋白将转化为完 全活性的胰岛素-转铁蛋白。除了充当活化元件外，转铁蛋白部分还能够提高胰岛素或其 他治疗性肽的稳定性和持久活性（与其未缀合的对应物相比）。
[0009] 本领域技术人员知晓，许多蛋白因子的前肽，例如胰岛素原和高血糖素原，不能用 作药物，除非已通过化学处理或蛋白水解处理切断了特定肽键而将它们转化成活性肽，例 如，从胰岛素原上移除C-肽。或者，可以用两肽重组法合成胰岛素，该方法包括进行CNBr处 理来分别产生A链和B链，而后进行氧化还原反应来形成链间二硫键[4]。此类在前肽产生 后进行的修饰加工对于产生治疗性肽而言不但在技术上有挑战性，而且成本效益很低。本 发明使得能够在不进行额外的化学加工或酶促加工的情况下使用前肽作为药物。
[0010] 减少肝葡萄糖生成已是糖尿病治疗策略的靶点。胰岛素（INS)的生物活性能够 影响肝葡萄糖生成和外周葡萄糖移除（glucose disposal)。通常，胰脏将INS直接递送 至肝门静脉，因此肝暴露在高浓度的INS下，由此对肝葡萄糖生成（HGP)造成更大的影 响。在常规的INS疗法中，皮下施用INS和/或INS类似物，从而使肝脏得到胰岛素治疗 (under-insulinized liver)。之后对外周葡萄糖移除的效果变大，导致代谢异常，包括过 大的血糖波动、血脂异常、血浆IGF-I减少以及生长激素血浆水平升高[9]。因此，对HGP的 效果大于对外周葡萄糖移除的效果的INS疗法将比现有的治疗方案具有优势。本发明的出 乎意料的发现是，本发明的融合蛋白能够在体内向肝脏靶向递送，具体而言，本文所述的胰 岛素原_转铁蛋白融合蛋白能够在体内向肝脏靶向递送。
[0011] 因此，在一方面，本发明提供一种用作前药的融合蛋白。本发明的该方面的实施方 式的融合蛋白通常具有通过连接序列与第二蛋白前体结构域连接的第一递送结构域。该递 送结构域是能够促进通过胞吞途径而进入靶细胞的蛋白。第二蛋白前体结构域优选是激素 原或因子原。
[0012] 在另一方面，本发明还提供一种将蛋白前体结构域递送至需要该前体结构域的受 试对象中的方法。本发明的该方面的实施方式的方法通常包括如下步骤：形成具有与蛋白 前体结构域连接的递送结构域的融合蛋白，和将该融合蛋白施用给患者。
[0013] 在又一方面，本发明还提供一种形成用作前药的融合蛋白的方法。本发明的该方 面的实施方式的方法通常包括：为蛋白前体选择用作递送结构域的蛋白；构建载体，所述 载体编码通过适合的连接序列与所述蛋白前体连接的所述递送结构域；和在适合的表达宿 主中表达所述融合蛋白。
[0014] 在又一方面，本发明还提供一种延长蛋白前体结构域的血浆半衰期的方法。本发 明的该方面的实施方式的方法通常包括如下步骤：将该蛋白前体结构域导入血浆中之前， 将蛋白前体结构域缀合至转铁蛋白结构域。此处，转铁蛋白结构域充当半衰期延长元件，用 来延长蛋白前体在血浆中的血浆半衰期。
[0015] 在又一方面，本发明还提供一种延长蛋白前体在受试对象中的治疗效果的方法。 本发明的该方面的实施方式的方法通常包括如下步骤：将蛋白前体缀合至转铁蛋白结构 域，以形成通过连接序列与转铁蛋白结构域连接的蛋白前体结构域。此处，转铁蛋白结构域 充当治疗有效性稳定化元件，其延长蛋白前体的治疗有效期。
[0016] 在又一方面，本发明还提供一种将蛋白前体前药靶向至受试对象的肝脏的方法。 本发明的该方面的方法通常包括如下步骤：向受试对象施用前药，其中，所述前药是融合蛋 白，所述融合蛋白包含通过连接序列与第二蛋白前体结构域连接的第一递送结构域。该肝 脏递送结构域是能够在体内靶向递送至肝脏的蛋白，更优选的是，其还促进通过胞吞途径 进入肝细胞。优选的是，肝脏递送结构域是转铁蛋白。第二蛋白前体结构域优选是激素原 或因子原。在一个优选实施方式中，所述融合蛋白是胰岛素原-转铁蛋白融合蛋白。
[0017] 本发明的其他方面和优点将从以下说明和所附权利要求中变得明显。
【附图说明】
[0018] 图1图示了在pcDNA 3. 1(+)载体中的前胰岛素原-Tf?融合蛋白基因构建体。
[0019] 图2示出了使用抗Tf抗体和抗胰岛素（原）抗体对胰岛素原（PI)-转铁蛋白 (Tf)融合蛋白进行蛋白质印迹的结果，该结果证明了融合蛋白中的Tf和胰岛素原均表达。 第1至第5道是抗Tf印迹，第7道是抗胰岛素（原）印迹。第1道：5ng脱铁Tf (apo-Tf)。 第2道：20ng脱铁Tf。第3道：PI-Tf。第4道：5ng脱铁Tf+PI-Tf。第5道：20ng脱铁 Tf+PI-Tf。第 6 道：标记。第 7 道：PI-Tf。
[0020] 图3示出了肝癌H4IIE细胞的葡萄糖生成的图。其证明了 PI-Tf融合蛋白的抑制 肝葡萄糖生成的活性高于胰岛素和胰岛素原。此外，图3B示出了在存在极大过量的Tf时 可以破坏PI-Tf的活性，表明该活性受到TfR结合的介导。（A)胰岛素原、胰岛素和PI-Tf 融合蛋白的抑制曲线。（B)增加的肝葡萄糖生成被1000倍Tf共温育所阻断。
[0021] 图4示出了溶液中的胰岛素的测量结果的图。其证明了在肝癌H4IIE细胞的存在 下PI-Tf转化成胰岛素-Tf。
[0022] 图5示出了阐明了对胰岛素受体结合的竞争的柱状图。其证明了在37°C下在 H4IIE细胞中预先温育的PI-Tf融合蛋白的胰岛素受体结合亲和力提高。
[0023] 图6示出了脂肪细胞的葡萄糖摄取的柱状图，其证明了培养的脂肪细胞对2-脱 氧-D-[2, 6- 3H]葡萄糖的摄入受到了经H4IIE预处理的PI-Tf融合蛋白的刺激。（A)胰岛 素和胰岛素原所致的葡萄糖摄取刺激的剂量依赖性曲线。（B) IOOnM胰岛素、胰岛素原、等摩 尔比的胰岛素原和Tf、以及PI-Tf融合蛋白所致的葡萄糖摄取的比较。（C)经H4IIE预处 理的PI-Tf融合蛋白展现出了与未经细胞处理的融合蛋白相比增加的活性。星号表示在t 检验评估中P〈〇. 01。
[0024] 图7示出了对示例性胰岛素原-Tf融合蛋白和胰岛素原的体内药代动力学特征的 比较。
[0025] 图8示出了对示例性胰岛素原-Tf融合蛋白与PBS、胰岛素和胰岛素原（ProINS) 的降血糖功效的比较。
[0026] 图9示出了肝葡萄糖生成途径的重要性和延长的对血液葡萄糖水平的抑制。 (A)在喂食状态和禁食状态下的血液葡萄糖来源。（B)向STZ小鼠单次皮下注射PBS或 22. 5nmol/kg的胰岛素（INS)、胰岛素原（ProINS)或胰岛素原-Tf(ProINS-Tf)。在注射前 2小时和实验过程中使小鼠禁食。使用OneTouch血糖计测量血液葡萄糖水平。数据表示平 均值土标准偏差（n = 3~5)。
【具体实施方式】
[0027] 本文所用的术语"蛋白前体"是指能够通过翻译后修饰而转化为活性形式的无活 性蛋白或肽。示例性的"蛋白前体"可以包括胰岛素原、高血糖素原和阿黑皮素原，但不限 于此。
[0028] 本文所用的术语"前药"是指以无活性形式或活性明显更低的形式施用的药理学 物质，但其在体内通过代谢活性在细胞内或细胞外活化。示例性前药可以包括激素原或其 他因子原。
[0029] "蛋白"是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白还可以包含非肽组分，例如糖 基。糖和其他非肽取代基可以被产生蛋白的细胞添加到蛋白上，而且根据细胞类型而有所 不同。在本文中蛋白以其氨基酸骨架结构来定义；诸如糖基等取代基通常不具体指明，但可 能存在。
[0030] 除非另有说明，本文所用的所有术语都具有下文给出的定义，并且通常都与本发 明所属领域的技术人员所知的这些术语的含义一致。对于本领域的定义和术语，从业者可 特别参考：Sambrook 等（1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第二版），Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.;和 Ausubel F M等（1993)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, N.Y.。应理解的是，本发明不限于所描述 的特定方法、操作规程和试剂，因为这些可以发生变化。
[0031] 术语"载体"是指设计用来在不同的宿主细胞之间进行转移的核酸构建体。"表达 载体"是指能够并入外源细胞并在其中表达异源DNA片段的载体。许多原核表达载体和真 核表达载体都可商购获得。选择合适的表达载体在本领域技术人员的知识范围内。因此， "表达盒"或"表达载体"是重组产生或合成的核酸构建体，其具有一系列特定的核酸元件以 允许特定的核酸在靶细胞中转录。可以将重组表达盒整合到质粒、染色体、线粒体DNA、质体 DNA、病毒或核酸片段中。通常，除其他序列之外，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的 核酸序列和启动子。
[0032] 可以按照制药工业中公知的常规技术来制备本发明的药物制剂，其可以方便地以 单位剂型存在。此类技术包括使活性成分与一种或多种药物载剂或赋形剂结合的步骤。通 常，通过使活性成分与液体载剂和/或细密分割的固体载剂均匀紧密地结合，并必要时使 产品成形，来制备制剂。
[0033] 为了描述和公开在本发明背景下可能使用的组合物和方法，本文引用的所有出版 物都明确地以援引方式并入本文中。
[0034] 适合作为递送结构域的蛋白将取决于靶细胞。优选的是，该蛋白是能够促进通过 胞吞途径而进入靶细胞的蛋白。
[0035] 连接序列优选较短且稳定。在一些实施方式中，连接序列可抵抗蛋白水解性切割， 从而使融合蛋白在体内保持完整。在其他实施方式中，连接序列被设计成在适当的环境下 得到切割，例如胞吞小泡的酸性环境或蛋白水解环境。
[0036] 作为演示，本发明人获得了胰岛素原_转铁蛋白融合蛋白，并证明了该融合蛋白 可在肝细胞培养物中转化为胰岛素-转铁蛋白。与无活性的胰岛素原不同，胰岛素原-转 铁蛋白融合蛋白在与肝细胞温育后，与有活性的胰岛素相比具有更高的糖原异生活性和相 等的葡萄糖转运活性。因此，本发明的实施方式的融合蛋白可用作前药。
[0037] 现将参照以下实施例和附图中所示的【具体实施方式】来进一步说明本发明。应理解 的是，提供以下实施例是为了展示和进一步说明本发明的某些实施方式和方面，而不应理 解为限制本发明的范围。虽然就具体的示例性实施方式和实施例描述了本发明，应理解的 是，本文公开的实施方式仅出于说明性目的，本领域技术人员可以在不背离由所附权利要 求阐明的本发明的主旨和范围的情况下做出各种修改和变化。
[0038] 实施例
[0039] 实施例I
[0040] PI-Tf重组融合蛋白的表汰和表征
[0041] 利用分子克隆法，将与Tf序列（NM_001063)框内融合的前胰岛素原序列 (NM_000207)工程化到pcDNA3. 1 (+)表达载体（Invitrogen，CA)中（图1)。通过聚乙烯亚 胺介导的DNA转染，将包含前胰岛素原-Tf融合基因的质粒瞬时转染至HEK 293细胞中。 收集无血清的条件培养基，使用实验室规模的正切流动过滤系统（Millipore, MA)将其浓 缩，而后用Centricon (Millipore, MA)进行超滤。使用抗Tf抗体（Sigma, MO)和抗胰岛素 (原）抗体（Abeam, MA)，通过蛋白质印迹来对PI-Tf融合蛋白进行表征和定量。抗Tf和 抗胰岛素（原）蛋白质印迹显示出存在分子量为约89kD的主条带，这表明PI-Tf融合蛋 白成功地表达并分泌到培养基中。利用Xhol限制性酶切割位点，将亮氨酸-谷氨酸二肽 序列导入胰岛素原和Tf之间。图2的第3道所示的Tf来自原始的无血清细胞培养基CD 293 (Invitrogen)，而不是由转染的HEK293细胞产生，二肽连接物在产生过程中保持稳定。
[0042] 实施例2
[0043] H4IIE肝癌细朐中的PI-Tf融合蛋白对肝葡萄糖牛成的抑制作用增强
[0044] 在包含10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM中培养大鼠肝癌H4IIE细胞。汇合后，在 37°C下用不同的药物处理细胞24小时。用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞2次。将由补充有 2mM丙酮酸钠和40mM LD-乳酸钠的无血清、无葡萄糖、无酷红的DMEM构成的葡萄糖生成 培养基加入细胞中，再温育3小时。收获上清液，并用Amplex Red葡萄糖/葡萄糖氧化酶 试剂盒（Invitrogen，CA)来测量葡萄糖浓度[5]。在IM NaOH中裂解细胞，用BCA(Thermo Scientific, IL)来确定蛋白量。
[0045] 在葡萄糖生成方面，胰岛素原和胰岛素展示出了相当的抑制效果，其IC5tl值分别 为1441. 3 ±641. 6pM和1093. 9 ±105. 6pM (图3A)。胰岛素原与胰岛素受体结合，但其结合 亲和力明显低于胰岛素[6]。然而，胰岛素原的更高的稳定性使其降解速率更低，这在24小 时温育测定中可以导致与胰岛素相似的活性。PI-Tf融合蛋白的IC 5tl值为4. 60±5. 78pM， 其与胰岛素原和胰岛素相比产生了约300倍的更强的活性。但是，胰岛素原/胰岛素和Tf 的等摩尔混合物并未象融合蛋白那样显著提高抑制活性。由此表明，增强的抑制作用归因 于这两部分的融合。融合蛋白与过量Tf(K)OO倍）的共温育能够阻断已增强的抑制作用， 从而使活性降至胰岛素和胰岛素原的水平。然而，与过量的白蛋白温育时，未观察到阻断效 应（图3B)。因此，将Tf部分与胰岛素原合并成一个单一的融合蛋白，能够显著增强胰岛素 原的肝葡萄糖抑制能力。
[0046] 实施例3
[0047] 肝癌细朐将PI-Tf转化为腠岛素-Tf融合蛋白
[0048] 在DMEM培养基中用PI-Tf融合蛋白处理大鼠肝癌H4IIE细胞（ATCC，VA)，并于 37°C下温育。在不同时刻收集培养基，并对其进行胰岛素特异性放射免疫测定和胰岛素原 特异性放射免疫测定（Millip 〇re，MA)。基于来自放射免疫测定的标准曲线，获得胰岛素原 和胰岛素的浓度。在H4IIE细胞中处理至多24小时后，在经PI-Tf融合蛋白处理的样品中 持续产生了含有胰岛素的物质，但在经胰岛素原处理的样品中却非如此（图4)。显示所产 生的含有胰岛素的物质为胰岛素-Tf而非释放出的胰岛素，这是因为这两部分由稳定的肽 键连接。经估算，PI-Tf至胰岛素-Tf的转化效率在PI-Tf剂量为IOnM时为8. 8 %，在PI-Tf 剂量为InM时为21. 6%。这些结果证明，激素原融合蛋白PI-Tf能够在肝癌细胞中转化为 胰岛素-Tf。还表明，该肝转化过程受到Tf的介导，推断其在TfR介导的胞吞和再循环期间 出现在胞内再循环区室内。
[0049] 实施例4
[0050] 在H4IIE肝癌细朐中对PI-Tf融合蛋白的预处理导致#体结合亲和力增加和对葡 萄糖转运的刺激作用增强
[0051] 使用H4IIE肝癌细胞进行了胰岛素受体结合测定[7]。在4°C下用[125I]-TyrA14 胰岛素（Perkin Elmer, MA)和不同浓度的未标记融合蛋白处理细胞2小时。用磷酸盐缓冲 盐水洗涤细胞2次，并于室温下用0.1 N NaOH裂解细胞。用伽马计数器测量总细胞裂解物 的放射性。用BCA测定来确定蛋白量。
[0052] 与胰岛素相比，胰岛素原表现出了约100倍低的与H4IIE肝癌细胞上的胰岛素受 体的结合亲和力。为了证实PI-Tf?至胰岛素-Tf?的肝转化，测量了经H4IIE预处理的PI-TF 融合细胞的结合亲和力。简言之，在37°C或4°C下先用PI-Tf处理细胞1小时，随后在4°C 下平衡15分钟，而后添加[I25I]-TyrA14胰岛素。随后在4°C下温育细胞2小时以使结合 充分。与未处理的融合蛋白相比，在37°C下预处理的PI-Tf融合蛋白溶液展现出了显著提 高的结合能力（图5)。这表明，这种增加的结合可能是因为在肝癌细胞中进行预处理的过 程中所产生的胰岛素-Tf。此外，对于在4°C下预处理的PI-Tf，未观察到显著变化。这些数 据表明，肝转化至胰岛素-Tf并不是由细胞膜上的蛋白酶来进行，而是需要细胞内化作用 来使PI-Tf融合蛋白进行胞内酶促加工。认为内化过程通过Tf-TfR介导的胞吞和再循环 来促进。
[0053] 已知胰岛素能够促进葡萄糖在肌肉和脂肪组织中的摄取。为了测试PI-Tf和经 H4IIE预处理的PI-Tf在葡萄糖摄取刺激中是否具有活性，如先前所述使用分化的脂肪细 胞建立了葡萄糖摄取测定[8]。简言之，用由牛胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄 嘌呤组成的激素混合剂诱导前成脂肪细胞（鼠3T3-L1成纤维细胞）分化。10~14天 后，细胞达到完全分化。在实验前使脂肪细胞血清饥饿。在补充有0.1%牛血清白蛋白的 Krebs-Ringer磷酸盐（KRP)缓冲液中，将细胞与不同的药物温育30分钟。通过添加2-脱 氧-D-[2,6-3H]葡萄糖（Perkin Elmer，MA)来测量葡萄糖摄取。10分钟后通过抽吸来使反 应停止，用冰冷的KRP缓冲液洗涤细胞4次。用含0.1 M Na0H/0. 1 % SDS的KRP使细胞裂 解。通过闪烁记数来定量放射性。针对用BCA测定测量的蛋白量对结果进行归一化。对于 H4IIE细胞中的PI-Tf处理，将剂量为IOnM的融合蛋白的溶液给药至H4IIE细胞。温育24 小时后，离心蛋白溶液，收集上清液以评估其在脂肪细胞中的葡萄糖摄取刺激活性。
[0054] 在葡萄糖摄取方面，胰岛素展现出了强刺激，其EC50值为2nM，而胰岛素原的活性 则低得多（图6A)。这是因为胰岛素原与胰岛素受体的结合亲和力低得多。与胰岛素原相 似，在30分钟的葡萄糖摄取中PI-Tf融合蛋白也表现出了低刺激活性（图6B)。然而，当使 用在H4IIE细胞中预处理过的PI-Tf融合蛋白来处理脂肪细胞时，显示出了与在相同实验 条件下在空白孔中预处理的PI-Tf相比显著增加的葡萄糖摄取（图6C)。该结果证明，肝癌 细胞转化的胰岛素-Tf在刺激葡萄糖摄取方面具有生物学活性。因此，肝预处理能够充分 地转化并激活PI-Tf融合蛋白。这些数据表明，可应用PI-Tf融合蛋白作为通过侵入性或 非侵入性递送途径来治疗糖尿病的前药。
[0055] 实施例5
[0056] 腠岛素原-Tf融合蛋白的体内血浆半衰期的延长
[0057] 将单剂量的0. 5mg/kg胰岛素原-Tf或0. 053mg/kg胰岛素原静脉内注射至CF-I小 鼠中。用胰岛素原特异性RIA(Millipore，MA)测量胰岛素原-Tf和胰岛素原的血浆浓度。 数据获自4只小鼠并示于图7中。
[0058] 体内药代动力学。在施用药物前，使雄性CF-I小鼠（6~7周龄）禁食6小时。静 脉内注射单剂量的胰岛素原-Tf或胰岛素原。在不同时刻通过隐静脉采取血样。将全血与 肝素混合，并离心收集血浆。分别使用胰岛素原-Tf和胰岛素原作为标准曲线，通过胰岛素 原特异性RIA来确定胰岛素原-Tf和胰岛素原的血浆浓度。
[0059] 实施例6
[0060] 腠岛素原-Tf融合蛋白的持续的、增强的体内降血糖功效
[0061] 向经STZ诱导的糖尿病小鼠单次皮下注射相同摩尔剂量的PBS、胰岛素、胰岛素 原、或胰岛素原-Tf融合蛋白。在实验过程中使小鼠禁食。使用OneTouch血糖计测量血液 葡萄糖水平。所有时刻都表示注射后的小时数。将数据表示为相对于〇小时（注射前的初 始血液葡萄糖水平）的血液葡萄糖百分数。图8和下表总结了实验结果。数据表示平均值 土标准偏差（N = 3~5)。
[0062]
[0063] 体内降血糖功效。向雄性C57BL/6J小鼠（6~7周龄）单次腹膜内注射175mg/ kg链脲霉素。注射后6天，小鼠变为糖尿病性，禁食血液葡萄糖水平为约500mg/dl。使糖 尿病小鼠禁食2小时，而后单次皮下注射蛋白。在不同时刻从尾静脉采血。使用OneTouch 血糖计测量血液葡萄糖水平。
[0064] 实施例7
[0065] 在用腠岛素原-转铁蛋白（ProINS-Tf)处理后对禁畲备件下的血液葡萄糖水平的 抑制作用延长
[0066] 通过糖原分解途径和糖原异生途径的肝葡萄糖生成（HGP)是使葡萄糖体内稳态 保持正常血液葡萄糖水平的至关重要的途径。在禁食和饥饿条件下，血液中葡萄糖的主要 来源是通过HGP (图9A)。因此，为了评估胰岛素原-Tf对HGP的影响，评估了注射后长时间 内的血液葡萄糖水平。用单次腹膜内注射150mg/kg链脲霉素（STZ)处理雄性C57B1/6小 鼠（6~7周龄），将禁食血液葡萄糖水平为约500mg/dl的小鼠认为是糖尿病性的。向小鼠 单次皮下注射缓冲液对照（PBS)、胰岛素（INS)、胰岛素原（ProINS)、或胰岛素原-Tf，在施 用后的不同时刻在禁食条件下测量血液葡萄糖水平。如图9B所示，胰岛素原-Tf的降血糖 效果逐渐升高，最大效果出现在注射后4小时，其保持在血糖正常水平（即，与未经STZ诱 导的小鼠相似），并持续到所测试的最后12小时时刻（与PBS相比，下降了 72%~77% )。 胰岛素原和胰岛素的血液葡萄糖水平分别从施用后8小时起和10小时起与PBS组相比无 显著差异。因此，图9B所示的数据证明，如对禁食条件下的血液葡萄糖水平的抑制作用延 长所表明的，胰岛素原-Tf特异性地抑制HGP。
[0067] 实施例8
[0068]胰岛素原-Tf对HGP酶水平的影响 [0069] 为了评估胰岛素原-Tf对HGP的影响，确定了经胰岛素原-Tf处理的STZ小鼠中 的葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase)的mRNA水平。G6Pase是催化HGP途径的最终步骤的关键 酶。用胰岛素原-Tf或缓冲液对照处理STZ小鼠12小时，并使用RT-PCR确定了肝匀浆中 的G6Pase表达水平。结果显示，经胰岛素原-Tf处理的小鼠中的G6Pase表达仅为对照小 鼠中的约10%，表明对HGP产生了抑制。
[0070] 参考文献
[0071] 将以下各引用文献通过援引并入本文。
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[0083] [12]AgouniA，OwenC，CzopekA，ModyN，DelibegovicM.Invivodifferential effectsoffasting,re-feeding,insulinandinsulinstimulationtimecourseon insulinsignalingpathwaycomponentsinperipheraltissues.Biochemicaland BiophysicalResearchCommunications. 2010 ；401 (I):104-11.
【主权项】
1. 一种将前药靶向递送至受试对象的肝脏的方法，所述方法包括： 施用形成所述前药的融合蛋白，所述融合蛋白具有通过连接序列与第二蛋白前体结构 域连接的第一递送结构域， 其中，所述第一递送结构域是能够在体内靶向递送至肝脏的蛋白，并且促进通过胞吞 途径进入肝细胞。2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述第一递送结构域是转铁蛋白。3. 如权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述第二蛋白前体结构域是胰岛素原。4. 一种减少受试对象的肝葡萄糖生成的方法，所述方法包括： 对所述受试对象施用有效量的融合蛋白， 其中，所述融合蛋白包含与转铁蛋白结构域连接的胰岛素原。5. 如权利要求4所述的方法，其中，所述连接序列是亮氨酸-谷氨酸二肽。6. -种形成用作前药的融合蛋白的方法，所述方法包括： 为蛋白前体选择用作递送结构域的蛋白； 构建载体，所述载体编码通过适合的连接序列与所述蛋白前体连接的所述递送结构 域；和 在合适的表达宿主中表达所述融合蛋白。7. 如权利要求9所述的方法，其中，所述递送结构域是转铁蛋白。8. 如权利要求9所述的方法，其中，所述蛋白前体是胰岛素原。9. 如权利要求9所述的方法，其中，所述连接序列是亮氨酸-谷氨酸二肽。10. -种将蛋白前体前药递送至受试对象的肝脏的方法，所述方法包括： 在将所述蛋白前体施用至所述受试对象中之前，将所述蛋白前体缀合至转铁蛋白结构 域， 其中，所述转铁蛋白结构域充当递送结构域，所述蛋白前体是在肝脏中转化为活性蛋 白后具有治疗活性的蛋白前体。11. 如权利要求10所述的方法，其中，所述蛋白前体是激素原或因子原。12. 如权利要求11所述的方法，其中，所述蛋白前体是胰岛素原。
【专利摘要】本发明提供了可用作前药的组合物和制造该组合物的方法。所述组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白具有通过连接序列连接在一起的第一递送结构域和第二蛋白前体结构域。所述递送结构域是能够促进通过胞吞途径而进入靶细胞的蛋白，例如转铁蛋白。所述蛋白前体是激素原或因子原，例如胰岛素原。本发明的方法包括以下步骤：选择适合作为递送结构域的蛋白，构建编码融合蛋白的载体，并在适合的表达宿主中表达所述融合蛋白。还公开了一种将前药靶向递送至肝脏中的方法和一种减少肝葡萄糖生成的方法。
【IPC分类】A61K47/48, A61K38/28
【公开号】CN104902929
【申请号】CN201380038582
【发明人】沈维强, 王燕, J·克兰克尔
【申请人】沈维强
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年5月20日
【公告号】WO2013177063A1
【专利说明】
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是于2011年6月30日递交的美国专利申请13/174,520的部分继续申请， 其享有于2010年7月2日递交的美国临时申请61/361，248的权益，因此将这些申请的所 有内容都通过援引并入本文中。
[0003] 关于受联邦资助的研发的声明
[0004] 本发明依NIH和HIGMS授予的合同GM 063647在政府支持下完成。政府享有本发 明的一定权利。
技术领域
[0005] 本发明属于药物递送和蛋白质工程领域。更具体而言，本发明涉及用于递送基于 蛋白的治疗剂（例如激素原或因子原（profactor))的方法和组合物，其无需体外化学加工 或蛋白水解加工就能产生治疗有效的药物。
【背景技术】
[0006] 许多具有生物活性的肽或蛋白，包括激素、细胞因子、神经肽和生长因子，最初是 以更大的无活性前体肽的形式产生。这些前体肽或前肽（包括激素原或因子原）通常需要 特定的细胞内蛋白水解加工来使其转变成其活性形式以发挥生物学功能[1，2]。对于蛋白 制造而言，经常先合成肽的前体形式而不是成熟形式。这是因为肽的成熟形式往往具有复 杂的构象、收率低或结构不稳定。对于蛋白药物递送而言，将前肽（而非成熟的肽）通过化 学缀合或重组融合与另一蛋白部分连接，从而实现特定的递送目标并增强蛋白的整体稳定 性[3]。因此，为了展现出生物学活性，需要对前肽进行加工并激活，这是制造重组治疗肽时 的重要而具有挑战性的一步。
[0007] 递送前药的常规方法通常涉及将前肽与递送蛋白连接在一起的化学缀合。但是， 将两个结构域化学缀合在一起的主要障碍在于，最终产物的组成和尺寸可以是异源的，这 对于治疗用途而言是不能接受的。因此，仍需要一种更好的方法来形成将递送结构域与前 药结构域连接在一起的融合蛋白。
【发明内容】
[0008] 本发明基于以下出人意料的发现：在转铁蛋白受体介导的胞吞作用中，肝细胞和 上皮细胞的细胞内区室具有将胰岛素原转化为胰岛素的能力。受此发现的启发，本发明人 设想并实践了一种通过将蛋白因子的前肽与转铁蛋白结构域缀合来配制基于蛋白的药物 的方法。例如，可以通过将胰岛素的前肽（即胰岛素原）与转铁蛋白缀合来形成基于胰岛 素的蛋白药物。在与肝细胞温育时，该胰岛素原-转铁蛋白缀合物或融合蛋白将转化为完 全活性的胰岛素-转铁蛋白。除了充当活化元件外，转铁蛋白部分还能够提高胰岛素或其 他治疗性肽的稳定性和持久活性（与其未缀合的对应物相比）。
[0009] 本领域技术人员知晓，许多蛋白因子的前肽，例如胰岛素原和高血糖素原，不能用 作药物，除非已通过化学处理或蛋白水解处理切断了特定肽键而将它们转化成活性肽，例 如，从胰岛素原上移除C-肽。或者，可以用两肽重组法合成胰岛素，该方法包括进行CNBr处 理来分别产生A链和B链，而后进行氧化还原反应来形成链间二硫键[4]。此类在前肽产生 后进行的修饰加工对于产生治疗性肽而言不但在技术上有挑战性，而且成本效益很低。本 发明使得能够在不进行额外的化学加工或酶促加工的情况下使用前肽作为药物。
[0010] 减少肝葡萄糖生成已是糖尿病治疗策略的靶点。胰岛素（INS)的生物活性能够 影响肝葡萄糖生成和外周葡萄糖移除（glucose disposal)。通常，胰脏将INS直接递送 至肝门静脉，因此肝暴露在高浓度的INS下，由此对肝葡萄糖生成（HGP)造成更大的影 响。在常规的INS疗法中，皮下施用INS和/或INS类似物，从而使肝脏得到胰岛素治疗 (under-insulinized liver)。之后对外周葡萄糖移除的效果变大，导致代谢异常，包括过 大的血糖波动、血脂异常、血浆IGF-I减少以及生长激素血浆水平升高[9]。因此，对HGP的 效果大于对外周葡萄糖移除的效果的INS疗法将比现有的治疗方案具有优势。本发明的出 乎意料的发现是，本发明的融合蛋白能够在体内向肝脏靶向递送，具体而言，本文所述的胰 岛素原_转铁蛋白融合蛋白能够在体内向肝脏靶向递送。
[0011] 因此，在一方面，本发明提供一种用作前药的融合蛋白。本发明的该方面的实施方 式的融合蛋白通常具有通过连接序列与第二蛋白前体结构域连接的第一递送结构域。该递 送结构域是能够促进通过胞吞途径而进入靶细胞的蛋白。第二蛋白前体结构域优选是激素 原或因子原。
[0012] 在另一方面，本发明还提供一种将蛋白前体结构域递送至需要该前体结构域的受 试对象中的方法。本发明的该方面的实施方式的方法通常包括如下步骤：形成具有与蛋白 前体结构域连接的递送结构域的融合蛋白，和将该融合蛋白施用给患者。
[0013] 在又一方面，本发明还提供一种形成用作前药的融合蛋白的方法。本发明的该方 面的实施方式的方法通常包括：为蛋白前体选择用作递送结构域的蛋白；构建载体，所述 载体编码通过适合的连接序列与所述蛋白前体连接的所述递送结构域；和在适合的表达宿 主中表达所述融合蛋白。
[0014] 在又一方面，本发明还提供一种延长蛋白前体结构域的血浆半衰期的方法。本发 明的该方面的实施方式的方法通常包括如下步骤：将该蛋白前体结构域导入血浆中之前， 将蛋白前体结构域缀合至转铁蛋白结构域。此处，转铁蛋白结构域充当半衰期延长元件，用 来延长蛋白前体在血浆中的血浆半衰期。
[0015] 在又一方面，本发明还提供一种延长蛋白前体在受试对象中的治疗效果的方法。 本发明的该方面的实施方式的方法通常包括如下步骤：将蛋白前体缀合至转铁蛋白结构 域，以形成通过连接序列与转铁蛋白结构域连接的蛋白前体结构域。此处，转铁蛋白结构域 充当治疗有效性稳定化元件，其延长蛋白前体的治疗有效期。
[0016] 在又一方面，本发明还提供一种将蛋白前体前药靶向至受试对象的肝脏的方法。 本发明的该方面的方法通常包括如下步骤：向受试对象施用前药，其中，所述前药是融合蛋 白，所述融合蛋白包含通过连接序列与第二蛋白前体结构域连接的第一递送结构域。该肝 脏递送结构域是能够在体内靶向递送至肝脏的蛋白，更优选的是，其还促进通过胞吞途径 进入肝细胞。优选的是，肝脏递送结构域是转铁蛋白。第二蛋白前体结构域优选是激素原 或因子原。在一个优选实施方式中，所述融合蛋白是胰岛素原-转铁蛋白融合蛋白。
[0017] 本发明的其他方面和优点将从以下说明和所附权利要求中变得明显。
【附图说明】
[0018] 图1图示了在pcDNA 3. 1(+)载体中的前胰岛素原-Tf?融合蛋白基因构建体。
[0019] 图2示出了使用抗Tf抗体和抗胰岛素（原）抗体对胰岛素原（PI)-转铁蛋白 (Tf)融合蛋白进行蛋白质印迹的结果，该结果证明了融合蛋白中的Tf和胰岛素原均表达。 第1至第5道是抗Tf印迹，第7道是抗胰岛素（原）印迹。第1道：5ng脱铁Tf (apo-Tf)。 第2道：20ng脱铁Tf。第3道：PI-Tf。第4道：5ng脱铁Tf+PI-Tf。第5道：20ng脱铁 Tf+PI-Tf。第 6 道：标记。第 7 道：PI-Tf。
[0020] 图3示出了肝癌H4IIE细胞的葡萄糖生成的图。其证明了 PI-Tf融合蛋白的抑制 肝葡萄糖生成的活性高于胰岛素和胰岛素原。此外，图3B示出了在存在极大过量的Tf时 可以破坏PI-Tf的活性，表明该活性受到TfR结合的介导。（A)胰岛素原、胰岛素和PI-Tf 融合蛋白的抑制曲线。（B)增加的肝葡萄糖生成被1000倍Tf共温育所阻断。
[0021] 图4示出了溶液中的胰岛素的测量结果的图。其证明了在肝癌H4IIE细胞的存在 下PI-Tf转化成胰岛素-Tf。
[0022] 图5示出了阐明了对胰岛素受体结合的竞争的柱状图。其证明了在37°C下在 H4IIE细胞中预先温育的PI-Tf融合蛋白的胰岛素受体结合亲和力提高。
[0023] 图6示出了脂肪细胞的葡萄糖摄取的柱状图，其证明了培养的脂肪细胞对2-脱 氧-D-[2, 6- 3H]葡萄糖的摄入受到了经H4IIE预处理的PI-Tf融合蛋白的刺激。（A)胰岛 素和胰岛素原所致的葡萄糖摄取刺激的剂量依赖性曲线。（B) IOOnM胰岛素、胰岛素原、等摩 尔比的胰岛素原和Tf、以及PI-Tf融合蛋白所致的葡萄糖摄取的比较。（C)经H4IIE预处 理的PI-Tf融合蛋白展现出了与未经细胞处理的融合蛋白相比增加的活性。星号表示在t 检验评估中P〈〇. 01。
[0024] 图7示出了对示例性胰岛素原-Tf融合蛋白和胰岛素原的体内药代动力学特征的 比较。
[0025] 图8示出了对示例性胰岛素原-Tf融合蛋白与PBS、胰岛素和胰岛素原（ProINS) 的降血糖功效的比较。
[0026] 图9示出了肝葡萄糖生成途径的重要性和延长的对血液葡萄糖水平的抑制。 (A)在喂食状态和禁食状态下的血液葡萄糖来源。（B)向STZ小鼠单次皮下注射PBS或 22. 5nmol/kg的胰岛素（INS)、胰岛素原（ProINS)或胰岛素原-Tf(ProINS-Tf)。在注射前 2小时和实验过程中使小鼠禁食。使用OneTouch血糖计测量血液葡萄糖水平。数据表示平 均值土标准偏差（n = 3~5)。
【具体实施方式】
[0027] 本文所用的术语"蛋白前体"是指能够通过翻译后修饰而转化为活性形式的无活 性蛋白或肽。示例性的"蛋白前体"可以包括胰岛素原、高血糖素原和阿黑皮素原，但不限 于此。
[0028] 本文所用的术语"前药"是指以无活性形式或活性明显更低的形式施用的药理学 物质，但其在体内通过代谢活性在细胞内或细胞外活化。示例性前药可以包括激素原或其 他因子原。
[0029] "蛋白"是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白还可以包含非肽组分，例如糖 基。糖和其他非肽取代基可以被产生蛋白的细胞添加到蛋白上，而且根据细胞类型而有所 不同。在本文中蛋白以其氨基酸骨架结构来定义；诸如糖基等取代基通常不具体指明，但可 能存在。
[0030] 除非另有说明，本文所用的所有术语都具有下文给出的定义，并且通常都与本发 明所属领域的技术人员所知的这些术语的含义一致。对于本领域的定义和术语，从业者可 特别参考：Sambrook 等（1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第二版），Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.;和 Ausubel F M等（1993)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, N.Y.。应理解的是，本发明不限于所描述 的特定方法、操作规程和试剂，因为这些可以发生变化。
[0031] 术语"载体"是指设计用来在不同的宿主细胞之间进行转移的核酸构建体。"表达 载体"是指能够并入外源细胞并在其中表达异源DNA片段的载体。许多原核表达载体和真 核表达载体都可商购获得。选择合适的表达载体在本领域技术人员的知识范围内。因此， "表达盒"或"表达载体"是重组产生或合成的核酸构建体，其具有一系列特定的核酸元件以 允许特定的核酸在靶细胞中转录。可以将重组表达盒整合到质粒、染色体、线粒体DNA、质体 DNA、病毒或核酸片段中。通常，除其他序列之外，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的 核酸序列和启动子。
[0032] 可以按照制药工业中公知的常规技术来制备本发明的药物制剂，其可以方便地以 单位剂型存在。此类技术包括使活性成分与一种或多种药物载剂或赋形剂结合的步骤。通 常，通过使活性成分与液体载剂和/或细密分割的固体载剂均匀紧密地结合，并必要时使 产品成形，来制备制剂。
[0033] 为了描述和公开在本发明背景下可能使用的组合物和方法，本文引用的所有出版 物都明确地以援引方式并入本文中。
[0034] 适合作为递送结构域的蛋白将取决于靶细胞。优选的是，该蛋白是能够促进通过 胞吞途径而进入靶细胞的蛋白。
[0035] 连接序列优选较短且稳定。在一些实施方式中，连接序列可抵抗蛋白水解性切割， 从而使融合蛋白在体内保持完整。在其他实施方式中，连接序列被设计成在适当的环境下 得到切割，例如胞吞小泡的酸性环境或蛋白水解环境。
[0036] 作为演示，本发明人获得了胰岛素原_转铁蛋白融合蛋白，并证明了该融合蛋白 可在肝细胞培养物中转化为胰岛素-转铁蛋白。与无活性的胰岛素原不同，胰岛素原-转 铁蛋白融合蛋白在与肝细胞温育后，与有活性的胰岛素相比具有更高的糖原异生活性和相 等的葡萄糖转运活性。因此，本发明的实施方式的融合蛋白可用作前药。
[0037] 现将参照以下实施例和附图中所示的【具体实施方式】来进一步说明本发明。应理解 的是，提供以下实施例是为了展示和进一步说明本发明的某些实施方式和方面，而不应理 解为限制本发明的范围。虽然就具体的示例性实施方式和实施例描述了本发明，应理解的 是，本文公开的实施方式仅出于说明性目的，本领域技术人员可以在不背离由所附权利要 求阐明的本发明的主旨和范围的情况下做出各种修改和变化。
[0038] 实施例
[0039] 实施例I
[0040] PI-Tf重组融合蛋白的表汰和表征
[0041] 利用分子克隆法，将与Tf序列（NM_001063)框内融合的前胰岛素原序列 (NM_000207)工程化到pcDNA3. 1 (+)表达载体（Invitrogen，CA)中（图1)。通过聚乙烯亚 胺介导的DNA转染，将包含前胰岛素原-Tf融合基因的质粒瞬时转染至HEK 293细胞中。 收集无血清的条件培养基，使用实验室规模的正切流动过滤系统（Millipore, MA)将其浓 缩，而后用Centricon (Millipore, MA)进行超滤。使用抗Tf抗体（Sigma, MO)和抗胰岛素 (原）抗体（Abeam, MA)，通过蛋白质印迹来对PI-Tf融合蛋白进行表征和定量。抗Tf和 抗胰岛素（原）蛋白质印迹显示出存在分子量为约89kD的主条带，这表明PI-Tf融合蛋 白成功地表达并分泌到培养基中。利用Xhol限制性酶切割位点，将亮氨酸-谷氨酸二肽 序列导入胰岛素原和Tf之间。图2的第3道所示的Tf来自原始的无血清细胞培养基CD 293 (Invitrogen)，而不是由转染的HEK293细胞产生，二肽连接物在产生过程中保持稳定。
[0042] 实施例2
[0043] H4IIE肝癌细朐中的PI-Tf融合蛋白对肝葡萄糖牛成的抑制作用增强
[0044] 在包含10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM中培养大鼠肝癌H4IIE细胞。汇合后，在 37°C下用不同的药物处理细胞24小时。用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞2次。将由补充有 2mM丙酮酸钠和40mM LD-乳酸钠的无血清、无葡萄糖、无酷红的DMEM构成的葡萄糖生成 培养基加入细胞中，再温育3小时。收获上清液，并用Amplex Red葡萄糖/葡萄糖氧化酶 试剂盒（Invitrogen，CA)来测量葡萄糖浓度[5]。在IM NaOH中裂解细胞，用BCA(Thermo Scientific, IL)来确定蛋白量。
[0045] 在葡萄糖生成方面，胰岛素原和胰岛素展示出了相当的抑制效果，其IC5tl值分别 为1441. 3 ±641. 6pM和1093. 9 ±105. 6pM (图3A)。胰岛素原与胰岛素受体结合，但其结合 亲和力明显低于胰岛素[6]。然而，胰岛素原的更高的稳定性使其降解速率更低，这在24小 时温育测定中可以导致与胰岛素相似的活性。PI-Tf融合蛋白的IC 5tl值为4. 60±5. 78pM， 其与胰岛素原和胰岛素相比产生了约300倍的更强的活性。但是，胰岛素原/胰岛素和Tf 的等摩尔混合物并未象融合蛋白那样显著提高抑制活性。由此表明，增强的抑制作用归因 于这两部分的融合。融合蛋白与过量Tf(K)OO倍）的共温育能够阻断已增强的抑制作用， 从而使活性降至胰岛素和胰岛素原的水平。然而，与过量的白蛋白温育时，未观察到阻断效 应（图3B)。因此，将Tf部分与胰岛素原合并成一个单一的融合蛋白，能够显著增强胰岛素 原的肝葡萄糖抑制能力。
[0046] 实施例3
[0047] 肝癌细朐将PI-Tf转化为腠岛素-Tf融合蛋白
[0048] 在DMEM培养基中用PI-Tf融合蛋白处理大鼠肝癌H4IIE细胞（ATCC，VA)，并于 37°C下温育。在不同时刻收集培养基，并对其进行胰岛素特异性放射免疫测定和胰岛素原 特异性放射免疫测定（Millip 〇re，MA)。基于来自放射免疫测定的标准曲线，获得胰岛素原 和胰岛素的浓度。在H4IIE细胞中处理至多24小时后，在经PI-Tf融合蛋白处理的样品中 持续产生了含有胰岛素的物质，但在经胰岛素原处理的样品中却非如此（图4)。显示所产 生的含有胰岛素的物质为胰岛素-Tf而非释放出的胰岛素，这是因为这两部分由稳定的肽 键连接。经估算，PI-Tf至胰岛素-Tf的转化效率在PI-Tf剂量为IOnM时为8. 8 %，在PI-Tf 剂量为InM时为21. 6%。这些结果证明，激素原融合蛋白PI-Tf能够在肝癌细胞中转化为 胰岛素-Tf。还表明，该肝转化过程受到Tf的介导，推断其在TfR介导的胞吞和再循环期间 出现在胞内再循环区室内。
[0049] 实施例4
[0050] 在H4IIE肝癌细朐中对PI-Tf融合蛋白的预处理导致#体结合亲和力增加和对葡 萄糖转运的刺激作用增强
[0051] 使用H4IIE肝癌细胞进行了胰岛素受体结合测定[7]。在4°C下用[125I]-TyrA14 胰岛素（Perkin Elmer, MA)和不同浓度的未标记融合蛋白处理细胞2小时。用磷酸盐缓冲 盐水洗涤细胞2次，并于室温下用0.1 N NaOH裂解细胞。用伽马计数器测量总细胞裂解物 的放射性。用BCA测定来确定蛋白量。
[0052] 与胰岛素相比，胰岛素原表现出了约100倍低的与H4IIE肝癌细胞上的胰岛素受 体的结合亲和力。为了证实PI-Tf?至胰岛素-Tf?的肝转化，测量了经H4IIE预处理的PI-TF 融合细胞的结合亲和力。简言之，在37°C或4°C下先用PI-Tf处理细胞1小时，随后在4°C 下平衡15分钟，而后添加[I25I]-TyrA14胰岛素。随后在4°C下温育细胞2小时以使结合 充分。与未处理的融合蛋白相比，在37°C下预处理的PI-Tf融合蛋白溶液展现出了显著提 高的结合能力（图5)。这表明，这种增加的结合可能是因为在肝癌细胞中进行预处理的过 程中所产生的胰岛素-Tf。此外，对于在4°C下预处理的PI-Tf，未观察到显著变化。这些数 据表明，肝转化至胰岛素-Tf并不是由细胞膜上的蛋白酶来进行，而是需要细胞内化作用 来使PI-Tf融合蛋白进行胞内酶促加工。认为内化过程通过Tf-TfR介导的胞吞和再循环 来促进。
[0053] 已知胰岛素能够促进葡萄糖在肌肉和脂肪组织中的摄取。为了测试PI-Tf和经 H4IIE预处理的PI-Tf在葡萄糖摄取刺激中是否具有活性，如先前所述使用分化的脂肪细 胞建立了葡萄糖摄取测定[8]。简言之，用由牛胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄 嘌呤组成的激素混合剂诱导前成脂肪细胞（鼠3T3-L1成纤维细胞）分化。10~14天 后，细胞达到完全分化。在实验前使脂肪细胞血清饥饿。在补充有0.1%牛血清白蛋白的 Krebs-Ringer磷酸盐（KRP)缓冲液中，将细胞与不同的药物温育30分钟。通过添加2-脱 氧-D-[2,6-3H]葡萄糖（Perkin Elmer，MA)来测量葡萄糖摄取。10分钟后通过抽吸来使反 应停止，用冰冷的KRP缓冲液洗涤细胞4次。用含0.1 M Na0H/0. 1 % SDS的KRP使细胞裂 解。通过闪烁记数来定量放射性。针对用BCA测定测量的蛋白量对结果进行归一化。对于 H4IIE细胞中的PI-Tf处理，将剂量为IOnM的融合蛋白的溶液给药至H4IIE细胞。温育24 小时后，离心蛋白溶液，收集上清液以评估其在脂肪细胞中的葡萄糖摄取刺激活性。
[0054] 在葡萄糖摄取方面，胰岛素展现出了强刺激，其EC50值为2nM，而胰岛素原的活性 则低得多（图6A)。这是因为胰岛素原与胰岛素受体的结合亲和力低得多。与胰岛素原相 似，在30分钟的葡萄糖摄取中PI-Tf融合蛋白也表现出了低刺激活性（图6B)。然而，当使 用在H4IIE细胞中预处理过的PI-Tf融合蛋白来处理脂肪细胞时，显示出了与在相同实验 条件下在空白孔中预处理的PI-Tf相比显著增加的葡萄糖摄取（图6C)。该结果证明，肝癌 细胞转化的胰岛素-Tf在刺激葡萄糖摄取方面具有生物学活性。因此，肝预处理能够充分 地转化并激活PI-Tf融合蛋白。这些数据表明，可应用PI-Tf融合蛋白作为通过侵入性或 非侵入性递送途径来治疗糖尿病的前药。
[0055] 实施例5
[0056] 腠岛素原-Tf融合蛋白的体内血浆半衰期的延长
[0057] 将单剂量的0. 5mg/kg胰岛素原-Tf或0. 053mg/kg胰岛素原静脉内注射至CF-I小 鼠中。用胰岛素原特异性RIA(Millipore，MA)测量胰岛素原-Tf和胰岛素原的血浆浓度。 数据获自4只小鼠并示于图7中。
[0058] 体内药代动力学。在施用药物前，使雄性CF-I小鼠（6~7周龄）禁食6小时。静 脉内注射单剂量的胰岛素原-Tf或胰岛素原。在不同时刻通过隐静脉采取血样。将全血与 肝素混合，并离心收集血浆。分别使用胰岛素原-Tf和胰岛素原作为标准曲线，通过胰岛素 原特异性RIA来确定胰岛素原-Tf和胰岛素原的血浆浓度。
[0059] 实施例6
[0060] 腠岛素原-Tf融合蛋白的持续的、增强的体内降血糖功效
[0061] 向经STZ诱导的糖尿病小鼠单次皮下注射相同摩尔剂量的PBS、胰岛素、胰岛素 原、或胰岛素原-Tf融合蛋白。在实验过程中使小鼠禁食。使用OneTouch血糖计测量血液 葡萄糖水平。所有时刻都表示注射后的小时数。将数据表示为相对于〇小时（注射前的初 始血液葡萄糖水平）的血液葡萄糖百分数。图8和下表总结了实验结果。数据表示平均值 土标准偏差（N = 3~5)。
[0062]
[0063] 体内降血糖功效。向雄性C57BL/6J小鼠（6~7周龄）单次腹膜内注射175mg/ kg链脲霉素。注射后6天，小鼠变为糖尿病性，禁食血液葡萄糖水平为约500mg/dl。使糖 尿病小鼠禁食2小时，而后单次皮下注射蛋白。在不同时刻从尾静脉采血。使用OneTouch 血糖计测量血液葡萄糖水平。
[0064] 实施例7
[0065] 在用腠岛素原-转铁蛋白（ProINS-Tf)处理后对禁畲备件下的血液葡萄糖水平的 抑制作用延长
[0066] 通过糖原分解途径和糖原异生途径的肝葡萄糖生成（HGP)是使葡萄糖体内稳态 保持正常血液葡萄糖水平的至关重要的途径。在禁食和饥饿条件下，血液中葡萄糖的主要 来源是通过HGP (图9A)。因此，为了评估胰岛素原-Tf对HGP的影响，评估了注射后长时间 内的血液葡萄糖水平。用单次腹膜内注射150mg/kg链脲霉素（STZ)处理雄性C57B1/6小 鼠（6~7周龄），将禁食血液葡萄糖水平为约500mg/dl的小鼠认为是糖尿病性的。向小鼠 单次皮下注射缓冲液对照（PBS)、胰岛素（INS)、胰岛素原（ProINS)、或胰岛素原-Tf，在施 用后的不同时刻在禁食条件下测量血液葡萄糖水平。如图9B所示，胰岛素原-Tf的降血糖 效果逐渐升高，最大效果出现在注射后4小时，其保持在血糖正常水平（即，与未经STZ诱 导的小鼠相似），并持续到所测试的最后12小时时刻（与PBS相比，下降了 72%~77% )。 胰岛素原和胰岛素的血液葡萄糖水平分别从施用后8小时起和10小时起与PBS组相比无 显著差异。因此，图9B所示的数据证明，如对禁食条件下的血液葡萄糖水平的抑制作用延 长所表明的，胰岛素原-Tf特异性地抑制HGP。
[0067] 实施例8
[0068]胰岛素原-Tf对HGP酶水平的影响 [0069] 为了评估胰岛素原-Tf对HGP的影响，确定了经胰岛素原-Tf处理的STZ小鼠中 的葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase)的mRNA水平。G6Pase是催化HGP途径的最终步骤的关键 酶。用胰岛素原-Tf或缓冲液对照处理STZ小鼠12小时，并使用RT-PCR确定了肝匀浆中 的G6Pase表达水平。结果显示，经胰岛素原-Tf处理的小鼠中的G6Pase表达仅为对照小 鼠中的约10%，表明对HGP产生了抑制。
[0070] 参考文献
[0071] 将以下各引用文献通过援引并入本文。
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【主权项】
1. 一种将前药靶向递送至受试对象的肝脏的方法，所述方法包括： 施用形成所述前药的融合蛋白，所述融合蛋白具有通过连接序列与第二蛋白前体结构 域连接的第一递送结构域， 其中，所述第一递送结构域是能够在体内靶向递送至肝脏的蛋白，并且促进通过胞吞 途径进入肝细胞。2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述第一递送结构域是转铁蛋白。3. 如权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述第二蛋白前体结构域是胰岛素原。4. 一种减少受试对象的肝葡萄糖生成的方法，所述方法包括： 对所述受试对象施用有效量的融合蛋白， 其中，所述融合蛋白包含与转铁蛋白结构域连接的胰岛素原。5. 如权利要求4所述的方法，其中，所述连接序列是亮氨酸-谷氨酸二肽。6. -种形成用作前药的融合蛋白的方法，所述方法包括： 为蛋白前体选择用作递送结构域的蛋白； 构建载体，所述载体编码通过适合的连接序列与所述蛋白前体连接的所述递送结构 域；和 在合适的表达宿主中表达所述融合蛋白。7. 如权利要求9所述的方法，其中，所述递送结构域是转铁蛋白。8. 如权利要求9所述的方法，其中，所述蛋白前体是胰岛素原。9. 如权利要求9所述的方法，其中，所述连接序列是亮氨酸-谷氨酸二肽。10. -种将蛋白前体前药递送至受试对象的肝脏的方法，所述方法包括： 在将所述蛋白前体施用至所述受试对象中之前，将所述蛋白前体缀合至转铁蛋白结构 域， 其中，所述转铁蛋白结构域充当递送结构域，所述蛋白前体是在肝脏中转化为活性蛋 白后具有治疗活性的蛋白前体。11. 如权利要求10所述的方法，其中，所述蛋白前体是激素原或因子原。12. 如权利要求11所述的方法，其中，所述蛋白前体是胰岛素原。
【专利摘要】本发明提供了可用作前药的组合物和制造该组合物的方法。所述组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白具有通过连接序列连接在一起的第一递送结构域和第二蛋白前体结构域。所述递送结构域是能够促进通过胞吞途径而进入靶细胞的蛋白，例如转铁蛋白。所述蛋白前体是激素原或因子原，例如胰岛素原。本发明的方法包括以下步骤：选择适合作为递送结构域的蛋白，构建编码融合蛋白的载体，并在适合的表达宿主中表达所述融合蛋白。还公开了一种将前药靶向递送至肝脏中的方法和一种减少肝葡萄糖生成的方法。
【IPC分类】A61K47/48, A61K38/28
【公开号】CN104902929
【申请号】CN201380038582
【发明人】沈维强, 王燕, J·克兰克尔
【申请人】沈维强
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年5月20日
【公告号】WO2013177063A1
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