包含修饰的抗原的生物缀合物及其用图
包含修饰的抗原的生物缀合物及其用图
【专利说明】包含修饰的抗原的生物缀合物及其用途
[0001] 本申请要求于2012年9月10日提交的美国临时专利申请号61/698,843的优先 权，将其公开内容以其整体通过引用结合于此。
[0002] 1?引言
[0003] 本文提供了一种大肠杆菌（Escherichia coli)的修饰的抗原，来自大肠杆菌 (E. coli)血清型0121的0抗原。本文还提供了所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的用途， 如所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原在治疗和/或预防疾病中的用途，例如，治疗和/或预 防由肠道沙门氏菌（Salmonella enterica)引起的疾病，包括由伤寒沙门氏菌（S.typhi) 引起的疾病。 2.【背景技术】
[0004] 伤寒症仍然是一种严重的公众健康问题，其每年发生2200-3300万病例，包括约 216, 000-500, 000 例死亡[Crump, J. A.，Luby，S. P.，Mintz，E. D. : The global burden of typhoid fever (伤寒热的全球负担）? Bull World Health 0rgan82 (5) ,346-353 (2004)]。 这种人类全身感染的病原体伤寒沙门氏菌（S.typhi)是通过污染的水和食物经口 (feco-orally)传播的。因此，伤寒症是卫生条件仍然较差的较不发达地区中的地方 性疾病。包括亚洲、非洲和南美洲在内的许多国家的学生和年轻人最经常受到影响 [Bhan，M.K.，Bahl，R.，Bhatnagar，S.:Typhoid and paratyphoid fever(伤寒症和副伤 寒）.Lancet366 (9487)，749-762 (2005)]。伤寒热的抗微生物治疗通过出现伤寒沙门氏菌 的多药抗性菌株而日渐变得复杂[Mirza, S. H.，Beeching, N. J.，Hart, C. A. :Multi_drug resistant typhoid:a global problem(多药抗性伤寒：全球问题）? J Med Microbiol 44(5)，317-319(1996)]。
[0005] 高危险人群的疫苗接种被认为是用于控制和预防伤寒症的最有前景策略。目 前，有两种被许可的伤寒疫苗：经口施用的、全细胞减毒活疫苗Ty21a和纯化的Vi多 糖肠胃外疫苗。Ty21a疫苗具有多种缺点：（i)有助于这种伤寒沙门氏菌菌株的减毒 表型的突变未被充分定义[Hone, D. M.，Attridge, S. R.，Forrest, B.，Morona, R.，Dan iels, D. , LaBrooy, J. T. , Bartholomeusz, R. C. , Shearman, D. J. , Hackett, J. :A galE via (Vi antigen-negative)mutant of Salmonella typhi Ty2retains virulence in humans (伤寒沙门氏菌Ty2的galE via(Vi抗原阴性）突变体在人中保持病毒性）.Infect Immun 56(5)，1326-1333(1988)]，（ii)减毒菌株理论上可以恢复为病毒性，和（iii) Ty21a是仅适度免疫原性的并且每5年需要三至四个初始剂量和加强剂量[Levine，M. M. , Ferreccio, C. , Black, R. E. , Germanier, R. :Large-scale field trial of Ty21a live oral typhoid vaccine in enteric-coated capsule formulation (肠包衣的胶囊制齐Ij中 的Ty21a活性伤寒疫苗的大规模现场试验）.Lancet 1 (8541)，1049-1052 (1987) ;Black, R. E. , Levine, M. M. , Ferreccio, C. , Clements, M. L. , Lanata, C. , Rooney, J. , Germanier, R. :Ef ficacy of one or two doses of Ty21a Salmonella typhi vaccine in enteric-coated capsules in a controlled field trial (肠包衣胶囊中一个或两个剂量的Ty21a伤 寒沙门氏菌疫苗在受控现场试验中的效力）? Chilean Typhoid Committee. Vaccine 8(1), 81-84 (1990) ；Murphy, J. R. , Grez, L. , Schlesinger, L. , Ferreccio, C. , Baqar, S. , M unoz, C. , ffasserman, S. S. , Losonsky, G. , Olson, J. G. , Levine, M. M. : Immunogenicity of Salmonella typhi Ty21a vaccine for young children (伤寒沙门氏菌疫苗对于年轻幼 儿的免疫原性）? Infect Immun 59 (11), 4291-4293 (1991) ；Levine, M. M. , Ferreccio, C. , Cr yz, S. , Ortiz, E. !Comparison of enteric-coated capsules and liquid formulation of Ty21a typhoid vaccine in randomised controlled field trial (Ty21a伤寒疫苗的肠包 衣胶囊和液体制剂在随机化受控现场试验中的比较）.Lancet 336(8720)，891-894(1990); Levine, M. M. , Ferreccio, C. , Abrego, P. , Martin, 0. S. , Ortiz, E. , Cryz, S. !Duration of efficacy of Ty21a, attenuated Salmonella typhi live oral vaccine(Ty21a 减毒 的伤寒沙门氏菌活口服疫苗的效力的持续时间）.Vaccine 17Suppl 2, S22-27(1999)]。 Vi多糖疫苗的有用性受其年龄相关的免疫原性和针对多糖的免疫应答是T细胞无关 这一事实所限制。因此，不能建立免疫记忆并且再接种疫苗不会引起任何加强应答 [ffeintraub, A. : Immunology of bacterial polysaccharide antigens (细菌多糖抗原的 免疫学）? Carbohydr Res 338 (23) ,2539-2547 (2003)，Landy，M. : Studies on Vi antigen. VI. Immunization of human beings with purified Vi antigen(人类用纯化的Vi 抗原免 疫）.Am J Hyg 60 (I) ,52-62 (1954)]。由于这些缺陷，所以期望用良好定义的、良好耐受的 且高度免疫原性的疫苗替代当前的伤寒疫苗。
[0006] 多糖疫苗的缺点可以通过将糖缀合至蛋白质载体（缀合物疫苗）而克服。在 缀合后，多糖的行为类似于T细胞依赖性抗原。已证实，共价连接至重组绿脓假单胞 菌（Pseudomonas aeruginosa)外毒素A (EPA)的纯化的Vi多糖在幼儿中诱发针对 伤寒沙门氏菌的保护性免疫应答[3211，3.(1，1&7101'，0.11，1'1'0€&，六.(1，01611161^8，]\ D. , Shiloach, J. , Sadoff, J. C. , Bryla, D. A. , Robbins, J. B. !Laboratory and preliminary clinical characterization of Vi capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines (Vi荚膜多糖-蛋白质缀合物疫苗的实验室和初步临床表征）.Infect Immun 62 (10), 4440-4444 (1994) ；Lin, F. Y. , Ho, V. A. , Khiem, H. B. , Trach, D. D. , Bay, P. V. , Thanh, T. C. , Kossaczka, Z. , Bryla, D. A. , Shiloach, J. , Robbins, J. B. , Schneerson, R. , Szu, S. C. :The efficacy of a Salmonella typhi Vi conjugate vaccine in tw〇-t〇-five_year-〇ld children (伤寒沙门氏菌Vi缀合物疫苗在二至五岁儿 童中的效力）.N Engl J Med 344(17)，1263-1269(2001)]。然而，缀合物疫苗的生产是一 个复杂的多步骤过程。首先，必须培育产生重组蛋白质载体和多糖抗原的分离的细菌菌株。 多糖和蛋白质载体在该两种组分进行化学偶合之前必须通过不同的程序纯化。最后的步骤 涉及用于获得最终产物的额外纯化步骤。该费力的生产过程具有以下缺点：（i)需要多个 纯化步骤，其中可能出现相当大的损失和（ii)由于化学偶合的随机性，所以产物不是均一 结构而是不同糖缀合物的混合物，具有潜在的不同效力分布曲线。
[0007] 因此，仍然需要对感染了肠道沙门氏菌，包括伤寒沙门氏菌的受试者进行治疗和 预防的改进方法。
[0008] 3?概述
[0009] 在一个方面，本文提供了包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀 合物。
[0010] 在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原共价 结合至载体蛋白的糖基化位点内的天冬酰胺残基（Asn)，其中所述糖基化位点包含氨基酸 序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸。在某些实施 方式中，本文提供的生物缀合物的载体蛋白不是天然地（例如，在其正常/天然的或"野生 型"状态）包含糖基化位点。在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物的载体蛋白被改造 成包含一个或多个糖基化位点，例如，所述载体蛋白被改造成包含一个或多个糖基化位点， 该糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的 任何氨基酸。例如，根据本文描述的方法使用的载体蛋白可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 个或更多个糖基化位点，每一个糖基化位点具有氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其 中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸；并且其中一些（例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9个） 或全部糖基化位点已被重组地引入到所述载体蛋白中。
[0011] 适合用于本文描述的方法（例如，治疗和/或预防伤寒沙门氏菌感染）中的任何 载体蛋白可以在本文描述的生物缀合物的生产中使用。示例性载体蛋白包括，但不限于，铜 绿假单胞菌（P. aeruginosa)的外毒素 A (EPA)、CRM197、白喉类毒素（Diphtheria toxoid)、 破伤风类毒素（tetanus toxoid)、金黄色葡萄球菌（S. aureus)的解毒溶血素A、聚集因子 (clumping factor)A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素 (E.coli heat labile enterotoxin)、大肠杆菌不耐热肠毒素的解毒变体、霍乱毒素B亚基 (Cholera toxin B subunit) (CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的解毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大 肠杆菌sat蛋白的效应结构域、空肠弯曲杆菌AcrA(C. jejuni AcrA)和空肠弯曲杆菌天然 糖蛋白。
[0012] 在一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0013] - 4)- a -D-GalNAcA-(1 - 4)- a -D-GalNAcA-(1 -
[0014] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0015]
[0016] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0017]
[0018] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0019]
[0020]在另一个方面，本文提供了能够生产本文描述的生物缀合物的原核宿主细胞。在 一种【具体实施方式】中，本文提供了一种可用于产生生物缀合物的原核宿主细胞，其中所述 原核宿主细胞包含：（i)编码载体蛋白的异源核苷酸序列，所述载体蛋白包含至少一个糖 基化位点，该糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu - X - Asn - Z - Ser/Thr，其中X和Z可以 是除Pro之外的任何天然氨基酸；和（ii)编码寡糖基转移酶的异源核苷酸序列；其中所述 原核宿主细胞被重组地改造成生产Und-PP-修饰的大肠杆菌0121 0-抗原（即，本文描述 的任一个修饰的大肠杆菌0121 0-抗原），其中所述寡糖基转移酶将修饰的大肠杆菌0121 〇-抗原转移至所述糖基化位点的Asn。在一种【具体实施方式】中，本文描述的原核宿主细胞 是大肠杆菌宿主细胞。在另一种【具体实施方式】中，本文描述的原核宿主细胞是大肠杆菌菌 株K12宿主细胞。在另一种【具体实施方式】中，重组地引入到本文描述的宿主细胞，例如，大 肠杆菌宿主细胞中的寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌的PglB。
[0021] 在某些实施方式中，除了异源寡糖基转移酶之外，本文描述的宿主细胞包含异源 核酸序列（即，不是与宿主细胞在其自然/天然状态，例如，在其"野生型"状态正常相关联 的核酸序列，例如，基因）。这样的额外的异源核酸序列可以包含编码已知是属于糖基化操 纵子，例如，原核糖基化操纵子的基因的核酸。在具体的实施方式中，这样的额外异源核酸 序列包含属于空肠弯曲杆菌的Pgl簇的基因，或包含空肠弯曲杆菌的全部Pgl簇。
[0022] 在某些实施方式中，本文描述的宿主细胞包含一个或多个基因缺失和/或一个或 多个基因失活，即，宿主细胞的遗传背景已经以使得与宿主细胞正常相关的基因（例如，一 个或多个"野生型"基因）失活或功能失常，或者将该基因全部去除的方式进行修饰。在一 种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细 胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因中的突变或该wbqG基因的缺失。在另一 种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细 胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqC基因中的突变或该wbqC基因的缺失。在另一 种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细 胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqE基因中的突变或该wbqE基因的缺失。在另一 种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细 胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因和wbqC基因中的突变或该wbqG基因和 wbqC基因的缺失。在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿 主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因和wbqE基因中 的突变或该wbqG基因和wbqE基因的缺失。在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物 缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在 wbqG基因、wbqC基因和wbqE基因中的突变或该wbqG基因、wbqC基因和wbqE基因的缺失。
[0023] 在某些实施方式中，大肠杆菌的0121基因簇（例如，大肠杆菌0121参照菌株CCUG 11422 的 0121 基因簇；在 Fratamico 等，2003, J. Clin. Microbiol. 41 (7) :3379-3383 中描 述的0121基因簇）被引入（例如，重组地引入）到本文描述的宿主细胞中。在某些实施方 式中，0121基因簇被引入到不产生任何O抗原的宿主细胞中，例如，所述宿主细胞已以使其 不产生任何0抗原的方式 被修饰。在某些实施方式中，0121基因簇的一个或多个基因被功 能性失活（例如，缺失，以使该基因失活的方式突变等）。在一种【具体实施方式】中，引入到本 文描述的宿主细胞中的0121基因簇的WbqG基因被功能性失活（例如，缺失）。在另一种具 体实施方式中，引入到本文描述的宿主细胞中的0121基因簇的WbqG基因和/或WbqE基因 被功能性失活（例如，缺失）。在具体的实施方式中，这样的宿主细胞被用来生产修饰的大 肠杆菌0121 0-抗原（即，本文描述的任一修饰的大肠杆菌0121 0-抗原）。
[0024] 在某些实施方式中，除了或代替上述的一个或多个基因缺失，在本文描述的生物 缀合物的生产中使用的宿主细胞包含一个或多个以下基因的缺失/失活：waaL(参见，例 如，Feldman等，2005，PNASUSA 102:3016-3021)、脂质A核心生物合成簇、半乳糖簇、阿 拉伯糖簇、可拉酸（colonic acid)簇、荚膜多糖簇、^^一癸稀醇_p生物合成基因、und_P再 循环基因、在核苷酸激活的糖生物合成中涉及的代谢酶、肠道细菌共同抗原簇、和原噬菌体 〇抗原修饰簇如gtrABS簇。
[0025] 在另一个方面，本文提供了产生本文提供的生物缀合物的方法。在某些实施方式 中，用于产生本文提供的生物缀合物的方法包括在适合生产蛋白质的条件下培养本文描述 的宿主细胞，和分离生物缀合物。本领域技术人员将了解适用于维持宿主细胞生长的条件 以使本文描述的生物缀合物可以通过所述宿主细胞生产并随后分离。这样的方法额外地通 过本文提供的工作实施例涵盖（参见第6部分）。
[0026] 在又一个方面，本文提供了包含本文描述的生物缀合物的组合物，例如，免疫原性 组合物。在某些实施方式中，本文描述的免疫原性组合物包含本文描述的生物缀合物和一 种或多种额外的组分，例如，佐剂。
[0027] 在另外的一个方面，本文提供了治疗或预防肠道沙门氏菌的感染的方法，包括向 被肠道沙门氏菌感染的或处于被肠道沙门氏菌感染风险中的受试者施用本文描述的生物 缀合物、或其组合物（例如，免疫原性组合物）。在具体的实施方式中，所述肠道沙门氏菌是 伤寒沙门氏菌（S. typhi)。
[0028] 3. 1惯例和缩写
[0029] 大肠杆菌0121 大肠杆菌血清型0121
[0030] PglB 细菌寡糖基转移酶PglB
[0031] Und-PP 十一异戊二稀焦磷酸盐（undecaprenyl pyrophosphate)
[0032] ELISA 酶联免疫吸附测定
[0033] EPA 绿脓假单胞菌外毒素A
[0034] Vi a -1，4-连接的N-乙酰基半乳糖胺糖醛酸（D-GalNAcA)残基 的荚膜
[0035] 多糖线性的、酸性均聚物
[0036] viaB Vi生物合成基因簇
[0037] ABC转运蛋白 ATP结合盒
[0038] wzy 聚合酶基因
[0039] 大肠杆菌0121 含有2-乙酰胺基-2-脱氧-d-半乳糖醛酸（d-GalNAcA)而不 是
[0040] wbqG d-GalNAcAN 的大肠杆菌 0121 wbqG 0 抗原突变体（d-GalNAcA)
[0041] CPS 荚膜多糖
[0042] D-GalNAcAN N-乙酰基半乳糖胺糖酸酰胺（N-acetylgalactosaminuronami de)
[0043] 残基 a (1 - 3) - a -D-GlcNAc
[0044] 残基 b (1 - 4) - a -D-GalNAcA
[0045] 残基 c (1 - 4) - a -D-GalNAcAN (60 %在 C-3 处 0-乙酰化的）
[0046] 残基 c' （1 - 4)-a -D-GalNAcA(30-40%在 C-3 处 0-乙酰化的）
[0047] 残基 d (1 - 3) - 0 _D_Qui4NAcGly
[0048] LPS 脂多糖
[0049] 2AB 2-氨基苯甲酰胺
[0050] MS 质谱法
[0051] m/z 质荷比
[0052] (CID) MS-MS 碰撞诱导解离质谱-质谱法
[0053] Da 道尔顿，质量的单位
[0054] kDa 千道尔顿
[0055] waaL 〇抗原连接酶基因
[0056] Und-PP ^^一异戊二烯焦磷酸
[0057] Dol-PP 焦磷酸长醇（dolichyl pyrophosphate)
[0058] wzz 〇抗原链长度调苄基因
[0059] ECA 肠道细菌共同抗原
[0060] CffP 细胞壁多糖
[0061] ELISA 酶联免疫吸附测定
[0062] A_ 在600 nm的光密度
[0063] MES 2-(N-吗啉代）乙磺酸，用于MES运行缓冲液
[0064] TBAP 磷酸四丁铵
[0065] TFA 三氟乙酸
[0066] PEG 聚乙二醇
[0067] CHCA a -氰基-4-羟基肉桂酸
[0068] IPTG 异丙基0 -D-I-硫代半乳糖吡喃糖苷
[0069] CTAB 十六烷基三甲基溴化铵
[0070] rpm 每分钟的转数
[0071] BCA 二金鸡宁酸测定
[0072] Vi-Tyr 酪氨酸化的Vi多糖
[0073] HRP 辣根过氧化物酶
[0074] TMB 3, 3 '，5, 5 ' -四甲基联苯胺
[0075] 4?附图描述
[0076] 图1 :伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi) Vi多糖的结构和大肠杆菌01210抗原的 重复单元。0121 0抗原簇编码的基因wbqG的突变导致修饰的0多糖结构的表达。GalNAcA : 2-乙酰胺基-2-脱氧-D-半乳糖醛酸；GalNAcAN :2-乙酰胺基-2-脱氧-D-半乳糖糖醛酰 胺；Qui4N :4_氨基-4, 6-二脱氧-D-葡萄糖。
[0077] 图2 :大肠杆菌0121及其wbqG突变衍生物的0多糖分析。（A)来自表达0121野 生型〇抗原基因簇或其WbqG突变衍生物的W3110细胞的LPS通过SDS-PAGE分离并用银染 色或在转移至硝基纤维素后用抗-0121和抗-Vi抗体检测。WbqG的突变导致与抗-Vi血 清是反应性的修饰的0抗原的装配。（B)Und-PP-连接的聚糖从表达0121野生型0抗原基 因簇或其突变WbqG衍生物的大肠杆菌SCM6细胞提取，接着2AB标记并使用GlycoS印N柱 通过正常相HPLC分离。单个峰馏分通过质谱法分析并表明所鉴别的聚糖结构。:N-乙 酰基己糖胺；?:二脱氧己糖胺；?:己糖醛酸；葡糖醛酰胺（hexuronamide) ;Ac :乙酰 基；NAc :N-乙酰基。
[0078] 图3 :通过正常相HPLC分离的聚糖物种的CID MS-MS谱图。该CID MS-MS谱图对 应于在图2B中看到的在单个峰馏分中鉴别的聚糖物种，具有以下保留时间：(A) 58. 8分钟， (B) 65. 1 分钟，（C) 67. 2 分钟和（D) 73. 5 分钟。
[0079] 图4 :利用细菌N-糖基化系统生产糖缀合物。糖缀合物通过共表达细菌寡糖基转 移酶PglB、改造的载体蛋白EPA和推动抗原性多糖的合成的基因（大肠杆菌0121，大肠杆 菌0121wbqG突变体，痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae)01)在大肠杆菌CLM24中生 产。在使用抗-EPA、抗-0121和抗-Vi抗体转移至硝基纤维素膜后，纯化的糖缀合物通过 SDS-PAGE，接着通过考马斯蓝染色（Coomassie blue staining)或糖苷蛋白质印迹分析。
[0080] 图5 :利用糖缀合物的免疫化研宄。使多组小鼠在氢氧化铝存在下用纯化的糖缀 合物免疫。对照组用纯化的Vi多糖免疫。（A)在第67天收集的血清的抗-0121总免疫球 蛋白效价。（B)在第67天收集的血清的抗-Vi抗体效价。数据表示为单个效价（鲁）和平 均效价（_)。用〇121 wbq(；-EPA缀合物免疫的一个动物不发展0121-LPS特异性抗体应答，但 是同一动物显示抗-Vi抗体效价的显著升高。
[0081] 5?详细描述
[0082] 在一个方面，本文提供了包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀 合物。
[0083] 在另一个方面，本文提供了能够生产本文描述的生物缀合物的原核宿主细胞。在 一种【具体实施方式】中，本文提供了一种可用于产生生物缀合物的原核宿主细胞，其中所述 原核宿主细胞包含：（i)编码载体蛋白的异源核苷酸序列，该载体蛋白包含至少一个糖基 化位点，该糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除 Pro之外的任何天然氨基酸；和（ii)编码寡糖基转移酶的异源核苷酸序列；其中所述原核 宿主细胞被重组地改造以生产Und-PP-修饰的大肠杆菌0121 0-抗原（即，本文描述的任一 修饰的大肠杆菌0121 0-抗原），其中所述寡糖基转移酶将所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗 原转移至糖基化位点的Asn。
[0084] 在另一个方面，本文提供了产生本文提供的生物缀合物的方法。在某些实施方式 中，用于产生本文提供的生物缀合物的方法包括在适合生产蛋白质的条件下培养本文描述 的宿主细胞，和分离所述生物缀合物。
[0085] 在又一个方面，本文提供了包含本文描述的生物缀合物的组合物，例如，免疫原性 组合物。在一个进一步的方面，本文提供了治疗或预防肠道沙门氏菌的感染的方法，包括向 被肠道沙门氏菌感染的或处于被肠道沙门氏菌感染的风险的受试者施用本文描述的生物 缀合物或其组合物（例如，免疫原性组合物）。在具体的实施方式中，所述肠道沙门氏菌是 伤寒沙门氏菌（s. typhi)。
[0086] 5. 1宿主细胞
[0087] 任何宿主细胞可以用来生产本文描述的生物缀合物。在具体的实施方式中，用来 生产本文描述的生物缀合物的宿主细胞是原核宿主细胞。示例性的原核宿主细胞包括， 但不限于，埃希氏菌属（Escherichia)物种、志贺氏菌属（Shigella)物种、克雷伯氏菌属 (Klebsiella)物种、黄单胞菌属（Xhantomonas)物种、沙门氏菌属（Salmonella)物种、耶 尔森氏菌属（Yersinia)物种、乳球菌属（Lactococcus)物种，乳杆菌属（Lactobacillus) 物种、假单胞菌属（Pseudomonas)物种、棒状杆菌属（Corynebacterium)物种、链霉菌属 (Streptomyces)物种、链球菌属（Streptococcus)物种、葡萄球菌属（Staphylococcus)物 种、芽胞杆菌属（Bacillus)物种和芽胞杆菌属（Clostridium)物种。在一种【具体实施方式】 中，用来生产本文描述的生物缀合物的宿主细胞是大肠杆菌（E.coli)宿主细胞（例如，大 肠杆菌菌株K12或CLM 24及其衍生物）。
[0088] 在某些实施方式中，用来生产本文描述的生物缀合物的宿主细胞被改造成包含异 源核酸，例如，编码一种或多种载体蛋白的异源核酸（参见，例如，第5. 2部分）和/或编码 一种或多种蛋白质的异源核酸，例如，编码一种或多种蛋白质的基因（参见，例如，第5. I. 1 部分）。在一种【具体实施方式】中，涉及糖基化途径（例如，原核和/或真核糖基化途径）的 编码蛋白质的异源核酸可以被引入到本文描述的宿主细胞中。这样的核酸可以编码蛋白 质，包括但不限于寡糖基转移酶和/或羰基转移酶。异源核酸（例如，编码载体蛋白的核酸 和/或编码其他蛋白质，例如在糖基化中涉及的蛋白质的核酸）可以使用本领域技术人员 已知的任何方法，例如，电穿孔、通过热冲击的化学转化、自然转化、噬菌体转导和缀合，弓丨 入到本文描述的宿主细胞中。在具体的实施方式中，异源核酸使用质粒引入到宿主细胞中， 例如，异源核酸通过质粒（例如，表达载体）在宿主细胞中表达。
[0089] 在某些实施方式中，可以向本文描述的宿主细胞中引入（例如，使用重组技术）额 外的修饰。例如，编码蛋白质（其形成可能与糖基化途径竞争或干扰糖基化途径（例如与被 重组地引入到宿主细胞中的在糖基化中所涉及的一种或多种异源基因竞争或干扰糖基化） 的一部分）的宿主细胞核酸（例如，基因）可以被缺失或者以使它们失活/失去功能的方 式在宿主细胞背景（基因组）中修饰（即缺失/修饰的宿主细胞核酸不编码功能性蛋白质 或者不编码任何蛋白质）。在某些实施方式中，当核酸从本文提供的宿主细胞的基因组缺 失时，它们被所需序列，例如，可用于糖蛋白生产的序列替代。控制宿主细胞中可以被缺失 (并且，在一些情况下，被其他所需核酸序列替代）的示例性基因包括在糖脂生物合成中涉 及的宿主细胞的基因，如waaL(参见，例如，Feldman等，2005, PNAS USA 102:3016-3021)、 脂质A核心生物合成簇、半乳糖簇、阿拉伯糖簇、结肠酸簇、荚膜多糖簇、十一癸烯醇-P生物 合成基因、und-P再循环基因、在核苷酸激活的糖生物合成中涉及的代谢酶、肠道细菌共同 抗原簇、和原噬菌体〇抗原修饰簇如gtrABS簇。在一种【具体实施方式】中，本文描述的宿主 细胞被修饰以使它们不产生不同于本文描述的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的任何0抗原 (例如，用于生产不同本文描述的修饰的大肠杆菌〇 121 0-抗原的0抗原的宿主细胞机制被 缺失/失活）。
[0090] 在具体的实施方式中，本文描述的宿主细胞的基因组可以以在生产变得与本文描 述的生物缀合物相关联的抗原中涉及的一个或多个基因不再由所述宿主生产的方式被修 饰。例如，在生产在正常情况下将与本文描述的生物缀合物相关联的抗原侧链中涉及的一 个或多个基因可以被缺失。不意图受限于任何特定的操作理论，认为编码在生产变得与本 文描述的生物缀合物相关联的抗原（不同于本文描述的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原（例 如，抗原侧链））中涉及的基因的失活/缺失核酸，增加/增强针对本文描述的修饰的大肠 杆菌0121 0-抗原的特异性免疫应答，由此增加本文描述的生物缀合物的抗原性。在一种
【具体实施方式】中，本文描述的宿主细胞具有突变的/缺失的/失活的wbqC基因，导致AcGly 侧链（即，图1中的残基d)的失活/缺失。在另一种【具体实施方式】中，本文描述的宿主细 胞具有突变的/缺失的/失活的WbqE基因。
[0091] 在一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大 肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在WbqG基因中的突变或WbqG基因的缺 失。在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠 杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在WbqC基因中的突变或WbqC基因的缺失。 在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌 宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在WbqE基因中的突变或WbqE基因的缺失。在 另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿 主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在WbqG基因和WbqC基因中的突变或WbqG基因和 wbqC基因的缺失。在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿 主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在WbqG基因和WbqE基因中 的突变或WbqG基因和WbqE基因的缺失。在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合 物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在WbqG 基因、wbqC基因和WbqE基因中的突变或WbqG基因、wbqC基因和WbqE基因的缺失。这样的 宿主细胞可以还包含本文描述的任何修饰，例如，宿主细胞包含编码载体蛋白和/或编码 在蛋白质糖基化中涉及的一个或多个基因（例如，寡糖基转移酶）的异源核酸和/或宿主 细胞可以还包含基因缺失/失活（例如，waaL的缺失）。
[0092] 在某些实施方式中，大肠杆菌的0121基因簇（例如，大肠杆菌0121参照菌株CCUG 11422 的 0121 基因簇；描述于 Fratamico 等，2003, J. Clin. Microbiol. 41 (7) : 3379-3383 中 的0121基因簇）被引入（例如，重组地引入）到本文描述的宿主细胞中。在某些实施方式 中，0121基因簇被引入到不产生任何0抗原的宿主细胞中，例如，宿主细胞已以使其不生产 任何0抗原的方式被修饰。在某些实施方式中，0121基因簇的一个或多个基因在功能上失 活（例如，缺失 ，以使基因失活的方式突变等）。在一种【具体实施方式】中，引入到本文描述的 宿主细胞中的0121基因簇的WbqG基因在功能上失活（例如，缺失）。在另一种具体实施方 式中，引入到本文描述的宿主细胞中的0121基因簇的WbqG基因和/或WbqE基因在功能上 失活（例如，缺失）。在具体的实施方式中，这样的宿主细胞用来生产修饰的大肠杆菌0121 〇-抗原（即，本文描述的任何修饰的大肠杆菌0121 0-抗原）。
[0093] 5. I. 1糖基化机构
[0094] 在某些实施方式中，本文提供的宿主细胞被修饰以表达糖基化机构（machinery) 以使该宿主能够生产本文描述的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原。在甚至更具体的实施方式 中，宿主细胞的糖基化机构被改造以生产UndPP-连接的修饰的大肠杆菌0121 O-抗原。
[0095] 不受理论限制，UndPP-连接的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原然后从宿主细胞的细 胞溶质快速翻转（flip)到宿主细胞的壁膜间隙中。而且，不受理论限制，修饰的大肠杆菌 0121 0-抗原然后在载体蛋白的糖基化位点的Asn上从UndPP转移到载体蛋白上。
[0096] 在某些实施方式中，编码糖基化转移的异源核酸引入（例如，使用重组方法引入） 到宿主细胞中以使修饰的大肠杆菌0121 0-抗原在UndPP上产生。本领域技术人员将容易 地认识到，任何合适的异源糖基化转移酶可以根据本文描述的方法使用。在一种具体实施 方式中，编码来自空肠弯曲杆菌的糖基化转移酶的异源核酸被引入到宿主细胞中。
[0097] 在某些实施方式中，编码寡糖基转移酶的异源核酸被引入到本文描述的宿主细胞 中。本领域技术人员将容易认识到，任何合适的异源寡糖基转移酶可以根据本文描述的方 法使用。在一种【具体实施方式】中，编码来自空肠弯曲杆菌的寡糖基转移酶的异源核酸被引 入到宿主细胞中。在另一种【具体实施方式】中，来自空肠弯曲杆菌的寡糖基转移酶Pglb被引 入到本文描述的宿主细胞中。
[0098] 在某些更具体的实施方式中，异源糖基化操纵子被引入到本文描述的宿主细胞 中。在某些实施方式中，异源糖基化操纵子具有一个或多个突变，即操纵子中的一个或多个 基因发生突变以使该基因失活/缺失。在一种【具体实施方式】中，编码来自空肠弯曲杆菌的 糖基化操纵子的异源核酸被引入到宿主中。
[0099] 5. 2载体蛋白
[0100] 适合用于生产生物缀合物的任何载体蛋白可以在本文中使用。示例性载体蛋白 包括，但不限于，铜绿假单胞菌（EPA)的外毒素A、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄 色葡萄球菌的解毒溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠 杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的解毒变体、霍乱毒素B亚基（CTB)、霍乱毒素、 霍乱毒素的解毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的效应结构域、空肠弯曲杆菌 AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。
[0101] 在某些实施方式中，在产生本文描述的生物缀合物中使用的载体蛋白被修饰，例 如，以使蛋白质毒性更低和或更易于糖基化等的方式修饰。在一种【具体实施方式】中，在产生 本文描述的生物缀合物中使用的载体蛋白被修饰以使载体蛋白中的糖基化位点的数量以 允许更低浓度的蛋白质可以被施用的方式最大化，例如，以免疫原性组合物、以其生物缀合 物形式。因此，在某些实施方式中，本文描述的载体蛋白被修饰以包括将通常与载体蛋白相 关联的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个糖基化位点（例如，相对于与在其天然/自然，例 如，"野生型"状态的载体蛋白相关联的糖基化位点的数量）。在具体的实施方式中，糖基化 位点的引入伴随蛋白质的初级结构中的糖基化共有序列的插入。这样的糖基化位点的引入 可以伴随，例如，将新的氨基酸添加至蛋白质的初级结构（即，糖基化位点被添加，全部或 部分），或伴随使蛋白质中的现有氨基酸突变以产生糖基化位点（即，氨基酸没有添加至蛋 白质，但所选的蛋白质的氨基酸发生突变以形成糖基化位点）。本领域技术人员将认识到， 蛋白质的氨基酸序列可以使用本领域已知的方法，例如，重组方法（包括编码蛋白质的核 酸序列的修饰）容易地修饰。在具体的实施方式中，糖基化共有序列被引入到载体蛋白的 特定区域中，例如，蛋白质的表面结构，在蛋白质的N或C末端，和/或在通过在蛋白质的基 部处通过二硫键稳定化的环中。在某些实施方式中，经典的5个氨基酸糖基化共有序列可 以通过赖氨酸残基延展用于更有效的糖基化，并且因此所插入的共有序列可以编码应被插 入或代替受体蛋白氨基酸的5、6或7个氨基酸。
[0102] 在某些实施方式中，用于产生本文描述的生物缀合物的载体蛋白包含"标签"，即， 允许分离和/或鉴别载体蛋白的氨基酸的序列。例如，将标签添加至本文描述的载体蛋白 可以可用于纯化该蛋白质，并且因此，可用于纯化包含标签的载体蛋白的生物缀合物。可以 在本文使用的示例性标签包括，但不限于，组氨酸（HIS)标签（例如，六组氨酸-标签，或 6XHis-Tag)、FLAG-TAG和HA标签。在某些实施方式中，一旦不再需要它们，例如在所述蛋白 已被纯化之后，本文中使用的标签是可去除的，例如，通过化学试剂或通过酶促手段去除。
[0103] 5. 3修饰的大肠杆菌0121 0-抗原
[0104] 本文描述的生物缀合物包含修饰的大肠杆菌0121 0-抗原，其中，作为使用本文描 述的方法修饰所述抗原（例如，缺失wbqG基因）的结果，所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗 原含有与肠道沙门氏菌Vi多糖，特别是伤寒沙门氏菌（S. typhi) Vi多糖的结构相似性。不 期望受理论限制，由于本文提供的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原与肠道沙门氏菌Vi多糖的 相似性所致，这样的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原适合用于治疗和/或预防受试者（例如， 人类受试者）由肠道沙门氏菌引起的感染，特别是当所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原作 为生物缀合物施用时。本领域技术人员将认识到，基于发明人的发现，只要所述修饰的大肠 杆菌0121 0-抗原保持与肠道沙门氏菌Vi多糖，例如，伤寒沙门氏菌（S. typhi)Vi多糖的 相似性，任何修饰的大肠杆菌0121 0-抗原都适合根据本文描述的方法使用，并且可以用于 产生本文描述的生物缀合物。
[0105] 在一种【具体实施方式】中，本文提供了一种修饰的大肠杆菌0121 0-抗原，其中所 述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含以下结构：
[0106] - 4)-a -D-GalNAcA-(1 - 4)-a -D-GalNAcA-(1 ―。
[0107] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种修饰的大肠杆菌0121 0-抗原，其中所 述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含以下结构：
[0108]
[0109] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种修饰的大肠杆菌0121 0-抗原，其中所 述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含以下结构：
[0110]
[0111] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种修饰的大肠杆菌0121 0-抗原，其中所 述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含以下结构：
[0112]
[0113] 5. 4生物缀合物
[0114] 本文提供了通过本文描述的宿主细胞生产的生物缀合物，其中所述生物缀合物包 含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原。如本文提及的，生物缀合物包含载体蛋白和 修饰的大肠杆菌0121 0-抗原，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原共价连接至载体蛋 白的天冬酰胺（ASN))残基（例如，连接在载体蛋白的糖基化位点）。
[0115] 在一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0116] - 4) - a -D-GalNAcA- (1 - 4) - a -D-GalNAcA- (1 -。
[0117] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0118]
[0119] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0120]
[0121] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0122]
[0123] 在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物被分离，即，使用本领域已知的和/或 本文描述的生产生物缀合物的方法通过本文描述的宿主细胞生产所述生物缀合物，并且分 离和/或纯化所生产的生物缀合物。在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物为至少 75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%纯的，例如没有其他污染物等。
[0124] 在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物相对于连接至载体蛋白的糖基化位点 的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原是同源的，例如，所述生物缀合物在载体蛋白的所有糖基化 位点处表达相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原。
[0125] 在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物相对于连接至载体蛋白的糖基化位点 的修饰的大肠杆菌0121 O-抗原不是同源的，例如，所述生物缀合物在载体蛋白的糖基化位 点处表达不同的修饰的大肠杆菌。
[0126] 在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物具有多于一个的糖基化位点，其中载 体蛋白的每个糖基化位点被糖基化（即，载体蛋白的100%的糖基化位点被糖基化），即，修 饰的大肠杆菌0121 0-抗原连接至每个糖基化位点。在某些实施方式中，本文提供的生物 缀合物具有多于一个的糖基化位点，其中不是载体蛋白的所有糖基化位点都被糖基化，例 如，约或至少 10 %，20 %，25 %，30 %，35 %，40 %，45 %，50 %，55 %，60 %，65 %，70 %，75 %， 80 %，85 %，90 %，或95 %的载体蛋白的糖基化位点被糖基化，但不是载体蛋白的所有糖基 化位点被糖基化（即，修饰的大肠杆菌0121 0-抗原不是连接至每个糖基化位点）。在某 些实施方式中，被糖基化的载体蛋白的所有糖基化位点包含相同的修饰的大肠杆菌0121 〇-抗原（即，被其糖基化）。
[0127] 在某些实施方式中，本文提供了生物缀合物的群。在一种实施方式中，本文提供 了一群生物缀合物，其中至少 50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90 %或 95%， 或其中100%的在所述群中的生物缀合物的载体蛋白中的第一糖基化位点被糖基化。在一 种【具体实施方式】中，至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，或95%或 100%的每个生物缀合物的第一糖基化位点被相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原糖基化， 如同该群中的其他生物缀合物（即，所有生物缀合物在载体蛋白的第一糖基化位点处具有 相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原）。在某些实施方式中，至少50%，55%，60%，65%， 70%，75%，80%，85%，90%，或95%，或100%的在所述群中的生物缀合物的载体蛋白中 的第二糖基化位点被糖基化。在一种【具体实施方式】中，至少50 %，55 %，60 %，65 %，70 %， 75 %，80 %，85 %，90 %，或95 %，或100 %的每个生物缀合物的第二糖基化位点被相同的修 饰的大肠杆菌0121 0-抗原糖基化，如同该群中的其他生物缀合物（即，所有的生物缀合物 在载体蛋白的第二糖基化位点处具有相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原）。在某些实施 方式中，至少 50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，或 95%，或 100% 的在所 述群中的生物缀合物的载体蛋白中的第三糖基化位点被糖基化。在一种【具体实施方式】中， 至少 50 %，55 %，60 %，65 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，或 95 %，或 100 % 的每个生物缀 合物的第三糖基化位点被相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原糖基化，如同该群中的其他 生物缀合物（即，所有生物缀合物在载体蛋白的第三糖基化位点处具有相同的修饰的大肠 杆菌0121 0-抗原）。在某些实施方式中，至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%， 85 %，90 %，或95 %，或100 %的所述群中的生物缀合物的载体蛋白中的第四糖基化位点被 糖基化。在一种【具体实施方式】中，至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%， 或95%，或100%的每个生物缀合物的第四糖基化位点被相同的修饰的大肠杆菌0121 〇-抗原糖基化，如同该群中的其他生物缀合物（即，所有生物缀合物在载体蛋白的第四糖 基化位点处具有相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原）。在某些实施方式中，至少50%， 55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，或 95%，或 100% 的所述群中的生物缀合物 的载体蛋白中的第五糖基化位点被糖基化。在一种【具体实施方式】中，至少50 %，55 %，60 %， 65 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，或95 %，或100 %的每个生物缀合物的第五糖基化位点 被相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原糖基化，如同该群中的其他生物缀合物（即，所有生 物缀合物在载体蛋白的第五糖基化位点处具有相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原）。
[0128] 5. 5组合物
[0129] 5. 5. 1包含宿主细胞的组合物
[0130] 在一种实施方式中，本文提供了包含了本文描述的宿主细胞的组合物。这样的组 合物可以在用于产生本文描述的生物缀合物的方法中使用，例如，该组合物可以在适合生 产蛋白质的条件下培养。随后，将生物缀合物与所述组合物分离。
[0131] 本文提供的包含宿主细胞的组合物包含适用于本文描述的宿主细胞的维持和存 活的额外组分，并且可以额外地包含通过宿主细胞生产蛋白质所需的或有益的额外组分， 例如用于诱导型启动子的诱导物，如阿拉伯糖，IPTG。
[0132] 5. 5. 2包含生物缀合物的组合物
[0133] 在另一种实施方式中，本文提供了包含本文描述的生物缀合物的组合物。这样的 组合物可以在治疗和预防疾病的方法中使用。在一种【具体实施方式】中，本文描述的组合物 用于治疗被肠道沙门氏菌感染的受试者（例如，人类受试者）。在另一种【具体实施方式】中， 本文描述的免疫原性组合物用于预防治疗被伤寒沙门氏菌（S.typhi)感染的受试者（例 如，人类受试者）。
[0134] 在一种【具体实施方式】中，本文提供了包含本文描述的一种或多种生物缀合物的免 疫原性组合物。本文提供的免疫原性组合物可以用于在施用了该组合物的宿主中引发免疫 应答。因此，本文描述的免疫原性组合物可以用作疫苗并且因此可以被配制为药物组合物。 在一种【具体实施方式】中，本文描述的免疫原性组合物可以用于预防受试者（例如，人类受 试者）受到肠道沙门氏菌的感染。在另一种【具体实施方式】中，本文描述的免疫原性组合物 可以用于受试者（例如，人类受试者）受到伤寒沙门氏菌（S.typhi)的感染。
[0135] 包含本文描述的生物缀合物的组合物可以包含适用于药物施用的额外组分。在具 体的实施方式中，本文描述的免疫原性组合物是单价制剂。在其他实施方式中，本文描述的 免疫原性组合物是多价制剂。例如，多价制剂包含多于一种的本文描述的生物缀合物。
[0136] 在某些实施方式中，本文描述的组合物额外地包含防腐剂，例如，汞衍生物硫柳汞 (thimerosal)。在一种【具体实施方式】中，本文描述的药物组合物包含0. 001 %至0. 01 %硫 柳汞。在其他实施方式中，本文描述的药物组合物不包含防腐剂。
[0137] 在某些实施方式中，本文描述的组合物（例如，免疫原性组合物）包含佐剂或与 其联合施用。用于与本文描述的组合物联合施用的佐剂可以在施用所述组合物之前、同 时地或之后施用。在一些实施方式中，术语"佐剂"是指当与本文描述的组合配合或作为 该组合物的一部分施用时，增加、增强和/或加强对生物缀合物的免疫应答的化合物，但 当该化合物单独施用时不会对生物缀合物产生免疫应答。在一些实施方式中，佐剂对多 生物缀合物肽产生免疫应答而不产生变态反应或其他不利反应。佐剂可以通过多种机制 增强免疫应答，所述机制包括例如淋巴细胞募集、刺激B和/或T细胞、以及刺激巨噬细 胞。佐剂的具体实例包括但不限于铝盐（明矾（alum))(如氢氧化铝，磷酸铝和硫酸铝）， 3 脱乙酰化的单磷酰脂质 A(3De -〇_acylated monophosphoryl lipid A) (MPL)(参 见 GB 2220211)，MF59 (Novartis)，AS03 (GlaxoSmithKline)，AS04 (GlaxoSmithKline)，聚 山梨醇酯80(Tween80 ;ICL Americas, Inc.)，咪唑并吡啶化合物（参见国际申请号PCT/ US2007/064857,公布为国际公开号W02007/109812)，咪唑并喹喔啉化合物（参见国际申 请号PCT/US2007/064858,公布为国际公开号W02007/109813)和皂角苷，如QS21 (参见 Kensil 等，in Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(在疫苗设计中：亚 基和佐剂方法）（eds. Powell&Newman, Plenum Press, NY, 1995);美国专利号 5, 057, 540)。 在一些实施方式中，佐剂是弗氏佐剂（完全或不完全的）。其他佐剂是水包油乳液（如 藍稀或花生油），任选地联合免疫刺激剂，如单磷酰脂质A (参见Stoute等，N. Engl. J. Med. 336,86-91(1997))。另一种佐剂是 CpG (Bioworld Today, 1998 年 11 月 15 日）。
[0138] 5. 6 用途
[0139] 在一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中的感染的方法，包括向所述受试者 施用本文描述的生物缀合物或其组合物。在一种【具体实施方式】中，本文描述了一种用于治 疗感染的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本文描述的生物缀合物或其组合物。
[0140] 在另一种实施方式中，本文提供了用于在受试者中诱发免疫应答的方法，包括向 所述受试者施用本文描述的生物缀合物或其组合物。在一种【具体实施方式】中，本文提供了 一种对本文描述的生物缀合物诱发免疫应答的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的 本文描述的生物缀合物或其组合物。
[0141] 在一种【具体实施方式】中，对其施用生物缀合物或其组合物的受试者受到感染或易 感感染，例如细菌感染。在另一种【具体实施方式】中，对其施用生物缀合物或其组合物的受试 者受到肠道沙门氏菌感染或者易感肠道沙门氏菌的感染。在另一种【具体实施方式】中，对其 施用生物缀合物或其组合物的受试者受到伤寒沙门氏菌感染或易感伤寒沙门氏菌的感染。
[0142] 在另一种实施方式中，本文描述的生物缀合物可以用于产生抗体，该抗体用于例 如诊断和研宄目的，例如，这样的抗体可用于确定施用包含本文描述的生物缀合物的免疫 原性组合物、或用于治疗肠道沙门氏菌感染的任何其他组合物是否导致足以杀灭肠道沙门 氏菌或使其无效的宿主免疫应答（例如，这样的抗体可以用于血清杀菌测定）。
[0143] 5. 7 测定
[0144] 5. 7. 1用于评估生物缀合物诱导免疫应答的能力的测定
[0145] 可以使用本领域技术人员已知的或本文描述的任何方法来评估本文描述的生物 缀合物在能够与肠道沙门氏菌（S.enterica)的Vi多糖交叉反应的受试者中产生免疫应答 的能力。在一些实施方式中，本文描述的生物缀合物在能够与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉 反应的受试者中产生免疫应答的能力可以通过用本文描述的生物缀合物使受试者（例如， 小鼠）或受试者组免疫并且用对照（PBS)使额外的受试者（例如，小鼠）或受试者组免疫 进行评估。这样的受试者可以代表疾病的动物模型，例如，伤寒症的动物模型（参见，例如， Libby等，2010, PNAS USA 107 (35): 15589-15594)。可以随后用毒性的肠道沙门氏菌攻击 所述受试者或受试者组并且可以确定该毒性的肠道沙门氏菌在所述受试者或受试者组中 引起疾病（例如，伤寒症）的能力。本领域技术人员将认识到，如果用对照免疫的受试者或 受试者组在用肠道沙门氏菌攻击后患病（例如，伤寒症）而用本文描述的生物缀合物免疫 的受试者或受试者组没有患病，则该生物缀合物能够在能够与肠道沙门氏菌的Vi多糖交 叉反应的受试者中产生免疫应答。可以通过例如免疫测定（如ELISA)来测试本文描述的 生物缀合物诱导与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉反应的抗血清的能力。
[0146] 5. 7. 2血清杀菌测定
[0147] 可以使用血清杀菌测定（SBA)来评估本文描述的生物缀合物在能够与肠道沙门 氏菌的Vi多糖交叉反应的受试者中产生免疫应答的能力。这样的测定是本领域熟知的并 且简单地包括产生和分离针对关注的靶标（例如，肠道沙门氏菌的Vi多糖）的抗体的步 骤，其中通过向受试者（例如，小鼠）施用激发出这样的抗体的化合物。随后，可以例如通 过以下来评估抗体的杀菌能力：在所述抗体和补充物存在下培养所讨论的细菌（例如，肠 道沙门氏菌），并例如使用标准的微生物学方法测定所述抗体杀灭该细菌和/或使其无效 的能力。
[0148] 6.实施例
[0149] 本实施例证实，能够成功地形成修饰的大肠杆菌0121 0-抗原并且施用包含这样 的抗原的生物缀合物能够在与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉反应的小鼠中产生抗体。
[0150] 6.1材料和方法
[0151] (a)菌株、质粒和培养条件。
[0152] 本实施例中描述的菌株和质粒列于表1中。质粒的构建在下文中描述。将大肠 杆菌株在37°C在LB培养基（每升IOg胰蛋白胨、5g酵母膏和5g NaCl)或LB琼脂（每升 添加了 15g琼脂的LB培养基）中培养。使伤寒沙门氏菌BRD948在37°C在补充了 l%v/ V Aro-mix (在IOml ddH20中的40mg L-苯丙氛酸、40mg L-色氛酸、IOmg 4_氛基苯甲酸和 1〇11^2,3-二羟基苯甲酸）和1%￥八171'-11111(在1〇1111(1(11120中的4〇11^1^-酪氨酸二钠） 的LB培养基中生长。如果适当，该培养基含有四环素（20yg mr1)、壮观霉素（80yg mr1) 或氨苄西林（100 y g mr1)。
[0153] 表1.本研宄中使用的菌株和质粒。
[0156] * 哥德堡大学微生物保藏中心（CultureCollectionUniversityofGStcborg)， 保藏人：瑞典哥德堡E. R. B. Moore教授
[0157] **Coligenetic Stock Center，耶鲁大学，美国康奈提格州纽黑文
[0158] (b) DNA 操作
[0159] 使用 NucleoSpin Plasmid 或 NucleoBond Xtra Maxi Plus 试剂盒 (Macherey-Nagel)分离质粒 DNA。使用 NucleoSpin Tissue 试剂盒（Macherey-Nagel)分 离总染色体DNA。根据制造商说明使用限制酶（Fermentas)、奸碱性磷酸酶（Fermentas)、 T4DNA 连接酶（Fermentas)和 Phusion 高保真 DNA 聚合酶（Finnzyme)。使用 NucleoSpin Extract II试剂盒（Macherey-Nagel)，纯化PCR和限制片段用于克隆。所有DNA测序通过 Synergene Biotech GmbH (瑞士）完成并且合成的寡核苷酸在Microsynth AG (瑞士）订 购。
[0160] (C)质粒构建
[0161] 质粒1含有合成的寡核苷酸盒，其形成自退火连接入EcoRI-消化的PLAFRl中的 5' -AATTGGCGCGCCCGGGACTAGTCTTGGG(SEQ ID NO. :1)和 5' -AATTCCCAAGACTAGTCCCGGGCGC GCC (SEQ ID NO. : 2) [Friedman, A. M. , Long, S. R. , Brown, S. E. , Buikema, ff. J. , Ausubel, F. M. : Construction of a broad host range cosmid cloning vector and its use in the genetic analysis of Rhizobium mutants (宽宿主范围粘粒克隆载体的构建及其在根瘤菌 突变体的遗传分析中的用途）.Gene 18 (3)，289-296 (1982)]，由此引入独特的AscI和SpeI 单个限制位点。使用引物 5'-AAAGGCGCGCCGCGAAGGTAAAGTCAGCCG(SEQ ID NO. :3)和 5'-AA AACTAGTCAGGAGTGAATTAAGTCAITG(SEQ ID NO. :4)，将大肠杆菌0121 0抗原簇由制备自大肠 杆菌0121 (CCUG 11422)的基因组DNA扩增。将该消化的PCR片段连接到Ascl/Spel消化 的质粒1中，产生质粒2。质粒3通过如下构建：将形成自退火5' -TGAATGAATGAACTAGTTCA ATCACTCA(SEQ ID NO. :5)和 5' -TGAGTGAITGAACTAGITCAITCAITCA(SEQ ID NO. :6)的合成 寡核苷酸盒插入到单个限制位点PmlI中，中断wbqG的开放阅读框。
[0162] (d) LPS 分析
[0163] 收集相当于A_为1的过夜培养物的细胞，再悬浮在100 y 1的根据Laemmli的 Ix 样品缓冲液[Laemmli, U. K.，Favre, M. :Maturation of the head of bacteriophage T4. I. DNA packaging events( 菌体 T4. I. DNA 包装事件的头部的突变）.J Mol Biol 80 (4)，575-599 (1973)]并在 95 °C 煮 10 分钟。加入蛋白酶 K (Fermentas)至 200 y g/ ml的最终浓度，并将样品在60°C温育1小时。根据制造商说明，使用来自Invitrogen 的12 % BisTris NuPAGE凝胶和MES运行缓冲液，通过SDS-PAGE分离来自蛋白酶 K-消化的全细胞溶解产物的LPS分子物质。通过用银染色使LPS可视化[Tsai, C. M. ,Frasch, C. E. :A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels(用于检测聚酰胺凝胶中的脂多糖的灵敏银染色）.Anal Biochem 119(1)，115-119(1982)]。0抗原的免疫学性质使用标准方法通过蛋白质印迹分析。大肠 杆菌0121 0抗原的结构与痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae)类型70抗原相同，因此 抗-痢疾志贺氏菌类型7血清购自Reagensia AB (瑞典）并以1:100稀释液使用。抗-Vi 多克隆抗体购自Murex Biotech Ltd(英格兰）并以1:100稀释液使用。
[0164] (e) ^^一异戊二烯焦磷酸（Und-PP)-连接的0抗原聚糖的分析
[0165] 0抗原聚糖在大肠杆菌菌株SCM6中分析，该菌株在多个多糖基因簇中含有染色体 缺失。〇多糖通过用编码〇抗原簇的质粒和WecA表达质粒（质粒4)转化SCM6细胞而表 达。用空质粒转化的SCM6用作阴性对照以鉴别0抗原特异信号。菌株在摇瓶中培养过夜。 收获相当于A_为400的细胞，用0. 9% NaCl洗涤一次，并冻干。通过重复的多轮涡旋和冰 上温育10分钟，用95%甲醇（MeOH)从干燥的细胞中提取脂质。通过添加CldH 2O将该悬浮液 转换成85% MeOH并在规则涡旋的同时再温育10分钟。在离心后，收集上清并且提取物在 N2下干燥。将干燥的脂质溶解在含有IOmM磷酸四丁铵（TBAP)的1:1甲醇/水（M/W)中并 经过 C18SepPak柱（Waters Corp.，Milford, MA)。该柱用 10ml MeOH调节，接着用以 1:1M/W 的IOmllOmM TBAP调节。在上样后，用1:1M/W的IOml IOmM TBAP洗涤该柱并用5ml MeOH 接着用5ml 10:10:3氯仿/甲醇/水（C/M/W)洗脱。合并的洗脱流分在队下干燥。
[0166]根据 Glover 等[Glover, K. J.，Weerapana，E.，Imperiali，B. : In vitro assembly of the undecaprenyIpyrophosphate-1 inked heptasaccharide for prokaryotic N-Iinked glycosylation (用于原核N-连接的糖基化的^^一异戊二稀焦磷酸-连接的七 糖的体外组装）.proc Natl Acad Sci U S A 102(40)，14255-14259(2005)]，通过将在2ml IM三氟乙酸（TFA)中的干燥样品溶解在50%正丙醇中并加热至50°C达15分钟来水解脂质 样品。水解的样品在N 2下干燥，溶解在4ml 3:48:47C/M/W中并经过C 18S印Pak柱（Waters Corp. ,Milford, MA)以从水解的聚糖分离脂质。该柱用10ml MeOH调节，接着用IOml 3:48:47C/M/W平衡。将样品上样至柱并收集流出物（flow-through)。用4ml 3:48:47C/M/ W洗涤柱并且利用SpeedVac干燥合并的流出流分。
[0167]根据 Bigge 等[131886，]\〇.，？&七61，1'.?.，131'11。6，]\六.，6〇111(1;[叫，？. N. , Charles, S. M. , Parekh, R. B. :Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid(聚糖使用 2_ 氨基 苯甲酰胺和邻氨基苯甲酸的非选择性和有效焚光标记）.Analytical biochemistry 230 (2)，229-238 (1995)]，用2-氨基苯甲酰胺（2AB)标记干燥的样品。使用如在 Merry 等[Merry, A. H.，Neville, D. C.，Royle，L.，Matthews, B.，Harvey, D. J.，Dwek，R. A. , Rudd, P. M. : Recovery of intact 2-aminobenzamide-labeled 0-glycans released from glycoproteins by hydrazinolysis (通过肼解释放自糖蛋白的完整2-氨基苯甲 酰胺-标记的 0_ 聚糖的回收）?Analytical biochemistry304 (1),91-99 (2002)]中描 述的纸片法（paper disk method)，进行聚糖清理。根据 Royle 等[1?0716，]^.，]\&11:1：11，1'. S. , Hart, E. , Langridge, J. I. , Merry, A. H. , Murphy, N. , Harvey, D. J. , Dwek, R. A. , Rudd, P. M. :An analytical and structural database provides a strategy for sequencing 〇-glycans from microgram quantities of glycoproteins (分析和结构数据库提 供用于对来自微克量的糖蛋白的〇-聚糖测序的策略）.Analytical biochemistry 304 (I)，70-90 (2002)]，但改变为三溶剂系统，使用GlycoS印N正相柱，通过HPLC进行2-AB 标记的聚糖的分离。溶剂A:在80%乙腈中的IOmM甲酸铵pH 4.4。溶剂B :在40%乙腈中 的30mM甲酸铵pH 4.4。溶剂(：：0.5%甲酸。柱温度为30°〇并且248-标记的聚糖通过荧 光检测（人ex = 330nm,人em = 420nm)。梯度条件：在160分钟内100 % A至100 % B的线 性梯度，流速为0. 4ml HiirT1，接着2分钟100% B至100% C，在2分钟内恢复至100% A并 以100% A在Iml HiirT1流速运行15分钟，然后恢复至0. 4ml min 4达5分钟。将样品注入 到 CldH2O 中。
[0168] 为了鉴别0抗原特异性聚糖，从获自含有0抗原簇的细胞的痕迹减去来自带有空 白质粒对照的细胞的2AB聚糖分布图。收集0抗原特异性峰并且2AB聚糖在MALDI SYNAPT HDMS Q-TOF系统（Waters Corp.，Milford, MA)上进行分 析。将样品溶解在5:95乙腈/水中 并用在80:20甲醇/水中的20mgHir1DHB1:1形成斑点。用PEG(准备好的混合溶液，Waters Corp.，Milford, MA)进行校准，用在60:40:0. 1乙腈/水/三氟乙酸中的5mg mr1 a -氰 基-4-羟基肉桂酸（CHCA，Sigma-Aldrich，瑞士）1:3形成斑点。仪器装配有200Hz固态UV 激光器。以正离子模式记录质谱。对于MSMS :激光能量在燃烧速率为200Hz下固定在240， 碰撞气体为氩气。碰撞能量分布图用来根据m/z渐变碰撞能。合并的、减去背景的和平滑化 的（Savitzsky Golay)谱图使用 MassLynx v4.0 软件（Waters Corp. ,Milford, MA)集中。
[0169] (f)糖缀合物的生产和纯化
[0170] 通过在大肠杆菌中表达寡糖基转移酶PglB、改造的受体蛋白EPA (绿脓假单胞菌 的外毒素A)和生产十一异戊二烯焦磷酸（Und-PP)-连接的聚糖的基因簇来实现糖缀合 物的生产。将PGVXN114(表达PglB)、PGVXN150(表达C-末端His 6-标记的EPA)和质粒 2(0121抗原簇）或质粒3(0121￥696突变抗原）共转化入大肠杆菌菌株<：111124〇 :^1(11]^11，]\1 F. , ffacker, M. , Hernandez, M. , Hitchen, P. G. , Marolda, C. L. , Kowarik, M. , Morris, H. R., Dell,A. , Valvano, M. A. , Aebi, M. !Engineering N-Iinked protein glycosylation with diverse 0 antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli?(在大 肠杆菌中利用不同〇抗原脂多糖结构改造N-连接的蛋白质糖基化）Proc Natl Acad Sci U S A 102(8)，3016-3021 (2005)]。在37°C将细胞在振荡培养箱（180rpm)中在补充有抗生素 的LB培养基中进行培养。从未诱导的过夜培养物接种摇瓶表达培养物至八_为0. 05。PglB 和载体蛋白EPA的表达通过IPTG(ImM)和L-阿拉伯糖（0. 02% w/v)在A_为0. 4-0. 6进 行诱导。在第一次诱导后四小时，添加第二批L-阿拉伯糖（0.02% w/v)。在过夜温育后收 获细胞（总诱导时间为19-22小时）。团粒用0. 9% NaCl洗涤并以相当于A_为50的浓 度悬浮在再悬浮缓冲液（25%蔗糖，IOmM EDTA，200mM Tris HCl pH 8.0)中。该细胞悬浮 液在4°C在摇床上温育20分钟。在离心后，将细胞团粒再悬浮在相同体积的渗透冲击缓冲 液（osmotic shock buffer)(IOmMTris HCl pH 8.0)中。该悬浮液在 4°C在摇床上温育 30分钟并以10, OOOg离心20分钟以除去球芽。收集含有周质蛋白的上清并且含有C-末端 六组氨酸标签的重组EPA使用HisTrap粗制FF Iml柱（GE Healthcare,瑞士）纯化。提 取物用5x HT结合缓冲液（2.5MNaCl,150mMTris HCl pH 8.0, 50mM咪唑）稀释以优化结 合条件并添加]\%(：12至50mM的终浓度。过滤提取物并施加至用lx HT结合缓冲液平衡的 HisTrap粗制FF柱。在加载后，柱用含有20mM咪唑的相同缓冲液洗涤以除去未结合的蛋白 质。用HT洗脱缓冲液（含有0. 5M咪唑的HT结合缓冲液）将蛋白质从柱洗脱。
[0171] 随后，使用Resource Q Iml柱（GE Healthcare,瑞士）将糖蛋白从未糖基化的EPA 分离。汇合含有EPA的HisTrap洗脱馏分并用RQ结合缓冲液（20mM L-组氨酸，pH 6. 0)稀 释10x。将稀释的EPA样品施加至用RQ结合缓冲液平衡的阴离子交换柱。该柱用以25柱 体积的0%至32. 5%的RQ洗脱缓冲液（（含有IM NaCl的RQ结合缓冲液）的线性梯度洗 脱并且使用 Akta FPLC(Amersham Biosciences)收集 0.5ml 馈分。馈分通过 SDS-PAGE 分 析并且蛋白质用考马斯蓝（Coomassie blue)染色。汇合含有糖蛋白的馏分，并且根据制造 商说明，通过多个浓缩和稀释步骤，使用具有30kDa膜（Millipore)的Amicon Ultra-4离 心滤器，将缓冲液交换为PBS。将最终纯化的蛋白质样品的浓度调节至Imgml'
[0172] (g)大肠杆菌0121LPS的纯化
[0173] 大肠杆菌0121(CCGU11422)培养物的LPS如在其他地方描述的通过酚提取纯化 [Apicella, M. A. : Isolation and characterization of lipopolysaccharides (月旨多糖的 分离和表征）.Methods Mol Biol431,3-13(2008)]。
[0174] (h)Vi多糖的纯化和用酪胺的修饰
[0175] Vi多糖通过如之前描述的改进的程序纯化自伤寒沙门氏菌BRD948[Demil，P.， D' Hondt, E. , Hoecke, C. V. : Salmonella typhi vaccine compositions (伤寒沙门氏菌疫 苗组合物）.European Patent EP1107787 (2003)]。简言之，将伤寒沙门氏菌BRD948在 补充了 Aro-和Tyrnix的LB培养基中培养。在振荡培养箱（180rpm)中在37°C过夜 温育后，将培养物加热至60°C达1小时并离心。Vi从具有0. 1 %溴化十六烷基三甲铵 (CTAB，Sigma，H6269)的上清中沉淀。加入 20g r1 硅藻土（celite)545(Sigma，20199-U)并 将混合物在室温（RT)搅拌1小时以允许形成多糖-CTAB复合物，其吸附在硅藻土上。将该 娃藻土倒入装配有玻璃料（frit) (Socochim S.A.)的适当尺寸的储罐（Extract-clean EV SPE Reservoir, Socochim S. A.)。通过具有 10 柱体积（CV)的 0? 05 % CTAB、IOCV 的 20 % 乙 醇、50mM磷酸钠缓冲液pH 6. 0和14CV的45%乙醇的梯度流连续地洗涤柱以去除吸附的杂 质。Vi多糖最后用1.5CV的50%乙醇、0.4M NaCl洗脱。在洗脱后，通过添加乙醇至80% 的终浓度并在室温温育20分钟使所述多糖沉淀。最后，通过在15000g离心20分钟收集沉 淀的多糖，用80%乙醇洗涤两次，并冻干。
[0176] 纯化的Vi多糖的蛋白质和核酸含量分别通过二辛可宁酸法（BCA)和UV光谱法 确定。〇-乙酰基含量利用乙酰胆碱作为标准进行测量[Hestrin，S.:The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxylamine, and its analytical application(乙酰胆碱和其他羧酸衍生物与轻胺的反应，及其分析应用）.J Biol Chem 180 (1),249-261 (1949)]。
[0177] 为了增大Vi与微滴定板的结合效率，将多糖酪胺化（Vi-Tyr)。将酪胺盐酸盐 (30mg mr1，Sigma)添加至IOmg纯化的Vi中。加入100 y 1的0. 5M N-(3_二甲基氨基丙 基）-N' -乙基碳二亚胺HCl (Sigma)并将混合物在pH4. 9-5. 1温育3小时。将反应混合物 对于ddH20进行透析。
[0178] (i)免疫研宄
[0179] 多组7只CB6F1雌性小鼠（6-8周龄）用于免疫实验。小鼠用20yg的具有 Alum(Rehydragel LV-Aluminium Hydroxide, General Chemical)作为佐剂的糖缀合物或 5 Ug的Vi多糖（Typhim Vi，Sanofi Pasteur MSD)免疫。在刚要免疫之前进行糖缀合物的 辅佐。简言之，将纯化的糖缀合物用PBS稀释至200 ygmr1的终浓度，加入Alum(最终量 为Al3+对应于0. 6mg ml 并将该溶液在室温温和地混合1小时。在第1、22和57天进行 免疫。多组小鼠正常接受100 U 1剂量的疫苗，对应于20 y g的缀合物（蛋白质）。在第二 次免疫后10天和在最后一次免疫后10天收集血液样品。
[0180] (j)酶联免疫吸附测定（ELISA)
[0181] 平底96孔微滴定板（Nunc immuno PolySorb)用50 y 1的5 y g ml 1大肠杆菌 01211^5或51^1111_1的酪胺化￥1(￥卜171〇涂覆，在？83中稀释，在41：过夜。倒掉涂覆溶 液并将板在4000ml的洗涤缓冲液（lx PBS，具有0.05% Triton X 100)浸泡并剧烈搅拌。 该清洗步骤进行至少4次。随后，该板通过颠倒放置在微板转子中并旋转进行干燥。此洗 涤程序总是在另外的洗涤步骤中施加。每个孔完全用300 Ul的封闭缓冲液（lx PBS，具有 2. 5% BSA (无球蛋白的BSA，Sigma，A7030))填充并在板摇床上在室温温育2小时。在洗涤 和干燥所述板后，将在稀释缓冲液（lx PBS，具有0.5% BSA)中的小鼠血清的稀释液加入到 板（IOOul)中并在板摇床上在室温温育1小时。为了检测总免疫球蛋白（Ig)，向每个孔 中加入100 y 1的在稀释缓冲液中1:2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP)标记的羊抗-小鼠 Ig(Sigma)并将该板在板摇床上在室温温育1小时。在洗涤和干燥板之后，反应用IOOy 1 的Ultra TMB底物（3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺液体底物，Pierce)显影15分钟并利用添 加100 y 1的2M硫酸终止。在450nm测量光密度（OD)。
[0182] 为了 确定终点效价，根据[Frey, A.，Di Canzio, J.，Zurakowski, D. :A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays (用于免疫测定的统计学定义终点效价确定方法）.J Immunol Methods 221(1-2),35-41(1998]定义95%的置信度。作为阴性样品，使用一池免疫前血清。
[0183] 6. 2 结果
[0184] (a)大肠杆菌0121wbqG突变体0多糖的分析
[0185] 首先考察通过大肠杆菌0121wbqG突变体生产的0多糖是否将被对于伤寒沙门氏 菌Vi荚膜多糖特异性的抗体识别。大肠杆菌0121 0抗原基因簇被克隆，并且WbqG的开放 阅读框通过插入含有寡盒（oligocassette)的终止密码子中断。将克隆的质粒转化到大肠 杆菌K-12菌株W3110中并且脂多糖（LPS)通过SDS-PAGE分析并用银染色，或在转移至硝 基纤维素膜转化通过蛋白质印迹分析（图2A)。如之前报道的，WbqG基因的突变不会消除 0 抗原表达[King, J. D.，Vinogradov, E.，Tran, V.，Lam, J. S. :Biosynthesis of uronamide sugars in Pseudomonas aeruginosa 06and Escherichia coli 0121 0 antigens (绿胺 假单胞菌06和大肠杆菌0121 0抗原中的糖醛酰胺糖的生物合成）.Environ Microbiol 12(6)，1531-1544(2010)]。然而，在银染色的聚丙烯酰胺凝胶中可视化的wbqG突变体的 LPS分布图在以下方面与野生型不同：（i)含有聚合的O抗原的条带的染色相对于野生型 LPS较弱，（ii)由连接至脂质A-核心的一个O抗原重复单元（核心+1RU)构成的条带更密 实地染色和（iii)含有O抗原的带比野生型LPS的等同带更快速地移动。据估计，通过分析 过曝光的银染色的SDS-PAGE凝胶，两个LPS分布图含有连接至脂质A-核心的平均12个O 抗原重复单元。LPS的蛋白质印迹分析揭示，抗-0121血清与wbqG突变体O抗原反应。该 WbqG突变体0多糖被抗-Vi血清识别。
[0186] 为了确认表达的0抗原重复单元的结构和确定0-乙酰化的程度，从表达0121野 生型或wbqG突变体0抗原的大肠杆菌SCM6提取糖脂。脂质连接的寡糖使用C 18 S印Pak柱 纯化并用特异地释放Und-PP-连接的聚糖的弱酸处理。在同样使用C18 SepPak柱的额外纯 化步骤之后，聚糖用2-氨基苯甲酰胺（2AB)标记，随后使用GlycoS印N柱通过正相HPLC 拆分。图2B示出了色谱图的一部分，其中预期洗脱单个重复单元和短的聚合的0抗原。含 有公认2AB-标记的聚糖物质的流分通过质谱法（MS)分析（图3)，并且通过MS鉴别的聚糖 结构示于图2B。
[0187] 由表达0121野生型0抗原的SCM6细胞制备的2AB-标记的聚糖的色谱图的特征 在于在58. 8分钟具有洗脱的峰。在该峰流分中，鉴别出质荷比（m/z)为1083的分子。保 留时间为65. 1分钟的峰流分主要含有m/z为1041的物质。该检测的m/z对应于2AB-标 记的、非乙酰化的0121野生型亚基的单电荷钠加合物。两个检测的质量之间的差异对应于 42 Da，其是0-乙酰基和羟基之间的质量差。这两种物质经过碰撞诱导解离（CID)MS-MS。 获自m/z为1083的前体的系列单电荷片段离子（图3A)与来自2AB-标记的0121野生型 〇抗原重复单元的糖苷裂解产物一致（在残基c处含有0-乙酰基）。而m/z为1041的分 子物质的CID MS-MS谱图对应于非乙酰化的2AB-标记的0121亚基（图3B)。
[0188] 由表达wbqG突变体多糖的SCM6细胞制备的2AB-标记的聚糖的色谱图显示两个 突出的峰。在保留时间为67.2分钟的峰流分中，检测到m/z为1084的分子。该检测到的质 量与在58. 8分钟洗脱的0121野生型痕迹的相应峰中测得的质量相差IDa。同样地，对于保 留时间为73. 5分钟的2AB-标记的分子测得m/z为1042。这些前体离子的CID MS-MS (图 3C和图3D)导致类似于获自0121野生型2AB-标记的聚糖的谱图的碎片图。测得的IDa 的质量差分配给聚糖结构的残基c。IDa的质量差对应于酸和酰胺基之间的计算的质量 差，与 wbqG 突变体 0 抗原的公开结构一致[King, J. D.，Vinogradov, E.，Tran, V.，Lam, J. S. !Biosynthesis of uronamide sugars in Pseudomonas aeruginosa 06and Escherichia coli 0121 0 antigens (绿脓假单胞菌06和大肠杆菌0121 0抗原中的糖醛酰胺糖的生物 合成）.Environ Microbiol 12(6)，1531-1544(2010)]。
[0189] 聚合的2AB-标记的0抗原亚基在0121野生型痕迹中鉴别。分别在保留时间为 83. 1分钟、86. 9分钟和90. 6分钟的峰流分中鉴别出可变地0-乙酰化的两个亚基。双倍乙 酰化的物质首先洗脱，接着单次乙酰化和非乙酰化形式。由于乙酰化和非乙酰化形式的分 离，所以可以确定〇-乙酰化的程度。在两个菌株中，大约50%的单个重复单元被0-乙酰 化。
[0190] 也在0121野生型痕迹（图2B)的一些峰中鉴别出肽聚糖单体的前体。肽聚糖前 体也在十一异戊二烯焦磷酸上类似并且预期被纯化并用用于0抗原亚基的方法进行标记。
[0191] (b)糖缀合物的生产
[0192] 确认了 0121wbqG突变体的结构，并且显示与对于Vi抗原产生的抗体是交叉反应 的。接着，确定wbqG突变体0多糖是否可以引出结合至Vi的抗体。制备糖缀合物用于免 疫研宄。通过在大肠杆菌K12衍生物CLM24表达细菌寡糖基转移酶PglB、改造的周质载 体蛋白EPA (类毒素重组绿脓假单胞菌外毒素A)、和大肠杆菌0121野生型或WbqG突变体 抗原来生产糖蛋白[Feldman, M. F.，Wacker, M.，Hernandez, M.，Hitchen, P. G.，Marolda, C. L. , Kowarik, M. , Morris, H. R. , Dell, A. , Valvano, M. A. , Aebi, M. !Engineering N-Iinked protein glycosylation with diverse 0 0 anti gen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli.(在大肠杆菌中利用不同00抗原脂多糖结构改造N-连接的蛋 白质糖基化）.Proc Natl Acad Sci U S A102 (8) ,3016-3021 (2005)]。菌株 CLM24 缺 乏0抗原连接酶（WaaL)。因此，0抗原转移至脂质A-核心被阻断并且Und-PP-连接的 〇抗原底物在内膜的周质面处聚集，提供〇抗原供体用于PglB-催化的转移至蛋白质受 体内的特异天冬酰胺残基。另外，大肠杆菌K12衍生物缺乏功能性内源性0抗原基因簇 [Liu, D. , Reeves, P. R. :Escherichia coli K12regains its 0 antigen (大肠杆菌 K12 复得其 0抗原）.Microbiology 140(Pt 1),49-57(1994) ;Feldman,M.F. , Marolda, C. L. , Monteiro, M. A. , Perry, M. B. , Parodi, A. J. , Valvano, M. A. : The activity of a putative polyisoprenol-1inked sugar translocase(Wzx) involved in Escherichia coli 0 antigen assembly is independent of the chemical structure of the 0 repeat (大肠杆菌0抗原组装中涉及的公认多猫醇-连接的糖转位酶（Wzx)的活性）.J Biol Chem 274 (49) ,35129-35138 (1999)]。因此，质粒编码的0抗原基因簇可以在没有产 生混合的0抗原群的情况下被表达。如其他地方所述的，EPA用作蛋白质受体，具有用于II 型依赖性分泌至周质的N-末端信号序列，和用于通过亲和性色谱法纯化的C-末端六组氨 酸标签[Ihssen, J.，Kowarik, M.，Dilettoso, S.，Tanner, C.，Wacker, M.，Thony-Meyer, L. : P roduction of glycoprotein vaccines in Escherichia coli (大肠杆菌中糖蛋白疫苗的 生产）.Microb Cell Fact 9,61(2010)]。EPA含有两个改造的N-糖基化位点。低拷贝质 粒PGVXNl 14用于在IPTG诱导型tac启动子控制下的PglB的表达。
[0193] 在诱导PglB和EPA后，新合成的糖蛋白通过镍亲和色谱法从周质提取物纯化。由 于在糖缀合物中存在带负电荷的多糖，所以使用阴离子交换色谱法来分离糖基化形式与非 糖基化形式。基于两种物质的分离，发现在表达0121野生型0多糖基因簇的培养物中，大 约70 %的总EPA被糖基化。糖基化效率在表达wbqG突变体0抗原的培养物中较低，而35 % 的总载体蛋白含有聚糖修饰。
[0194] 纯化的糖缀合物通过SDS-PAGE分离并在转移至硝基纤维素膜后使用抗-EPA、 抗-0121和抗-Vi抗体通过考马斯蓝染色或通过蛋白质印迹可视化（图4)。通过考马斯蓝 染色，在纯化的0121多糖-EPA缀合物（0121-EPA))中检测到与未糖基化的EPA(70kDa)相 同质量的带，其也被抗-EPA血清识别但不被抗-0121血清识别。因此，未糖基化的EPA在糖 缀合物制备中被很大程度地去除。主要地，在100和130kDa之间成簇的一系列带通过考马 斯蓝染色进行检测。这些带与抗-EPA血清反应，表明EPA的修饰形式。这些较大的多肽，但 不是用痢疾志贺氏菌01抗原修饰的EPA(Ol-EPA)(描述于[Ihssen, J.，Kowarik, M.，Dilet toso, S. , Tanner, C. , Wacker, M. , Thony-Meyerj L. !Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli (大肠杆菌中糖蛋白疫苗的生产）.Microb Cell Fact 9,61(2010)]) 也利用抗-0121特异性抗体检测，表明该载体被共表达的多糖修饰。用wbqG突变体0多糖 羰基的EPA(Omwbqe-EPA)额外地用抗-Vi抗体染色。
[0195] 如通过SDS-PAGE分析确定的，主要是单糖基化的EPA被纯化，即在两个改造的 糖基化位点之一上用相应的0-多糖修饰的EPA。二糖基化的EPA的痕迹可以在纯化的 Om wbtf-EPA样品中通过蛋白质印迹进行检测（图4)。EPA的二糖基化形式作为比130kDa 稍大的第二微弱系列带运行。如在图2A中看到的，表达的0-抗原显示具有平均12个重复 单元的模式链长度分布。假定纯化的糖缀合物由单糖基化的EPA构成，含有平均长度为12 个重复单元的单个多糖链，则糖与蛋白质的重量比估计为0. 15:1。
[0196] (C)糖缀合物在小鼠中的免疫原性和多糖特异性抗体应答的评价
[0197] 接下来，评估在用缀合物疫苗免疫后的小鼠中引发的免疫应答。在小组的CB6F1 小鼠中进行中间实验以确定纯化的糖缀合物的剂量范围和辅佐。这些建立了 20 yg的蛋 白质（大约3yg的多糖），结合Alum，是可再现地免疫原性的。随后，多组CB6F1小鼠（7 只/组）在第1、22和57天用0121-EPA、0121 wb(1(；-EPA或用5 y g的纯化的Vi多糖（Typhim Vi，Sanofi Pasteur MSD)皮下地免疫。在第32和67天对小鼠进行采血并且测试血清是否 存在抗-0121LPS和抗-Vi总免疫球蛋白（Ig)。到第67天，观察到在用任一缀合物免疫的 14只动物中的13只中的血清Ig抗-0121LPS效价的显著升高（图5A)。在用Om wbqe-EPA 免疫的一组小鼠中的一只动物未显示血清转化。感兴趣的是，同一动物在血清Ig抗-Vi效 价方面显示出显著的升高（图5B)。如所预期的，用纯化的Vi多糖免疫的对照组未显示出 可检测的抗-0121LPS应答，但在血清Ig抗-Vi效价方面有显著升高。
[0198] 6. 3 讨论
[0199] 本实施例描述了用于分析十一异戊二烯焦磷酸（Und-PP)-连接的聚糖的新方法。 所描述的程序基于用来分析真核细胞的焦磷酸长醇Dol-PP)-连接的寡糖的方法。主要改 进包括用于细菌糖脂的优化提取程序和在聚糖释放之前通过弱酸水解的纯化步骤。细菌 Und-PP-连接的聚糖的纯化策略通过大量各种各样的在该脂质载体上组装的不同糖结构而 进一步复杂化。用来分析Und-PP-连接的聚糖的具体亚类的恰当表达菌株的选择是关键。 在本实施例中，分析了 Und-PP-连接的0多糖。由于Und-PP-连接的0抗原代表LPS生物 合成的中间物质，所以使用大肠杆菌菌株，缺乏〇抗原连接酶（AwaaL)。因此，Und-PP-连 接的〇多糖不被转移至脂质A-核心，导致这种脂质中间体的积累。如果0抗原在waaL阳 性菌株中表达，则不能鉴别出2AB-标记的0聚糖，这最可能是由于这种糖脂物质的快速周 转（turnover)。此外，0抗原是具有高分子量的聚合的结构，使其对于通过质谱法的分析日 渐困难。因此，选择含有在0抗原亚基的有效聚合中涉及的0抗原链长度调节子（wzz)基 因中的突变的菌株背景。这导致主要产生单一重复单元和短聚合的〇抗原，由此简化MS分 析。多个其他多糖结构也在Und-PP上组装，如同肽聚糖前体、荚膜多糖和肠道细菌共同抗 原（ECA)，这会使0聚糖物质的鉴别和表征复杂化。含有在所有主要多糖基因簇中的缺失的 大肠杆菌菌株SCM6恰恰适合用于0抗原表达。
[0200] 利用这种改进的方法，分析0121wbqG突变体0多糖。本实施例证实了由King 等[King, J. D.，Vinogradov, E.，Tran, V.，Lam, J. S. :Biosynthesis of uronamide sugars in Pseudomonas aeruginosa 06and Escherichia coli 0121 0 antigens (绿胺假单 胞菌06和大肠杆菌0121 O抗原中的糖醛酰胺糖的生物合成）.Environ Microbiol 12(6)，1531-1544(2010)]公开的结构。此外，确定了重组表达的wbqG突变体0抗原结构含 有0-乙酰化的N-乙酰基半乳糖胺糖醛酸，最可能地在C-3处修饰。因此，这种突变体0多 糖含有在Vi多糖中也存在的结构基序。Vi多糖的0-乙酰基形成免疫优势表位并且Vi的 免疫原性与 O-乙酰化程度密切相关[Szu, S. C.，Bystricky, S. :Physical, chemical, antig enic，and immunologic characterization of polygalacturonan, its derivatives, and Vi antigen from Salmonella typhi(来自伤寒沙门氏菌的多聚半乳糖醛酸聚糖、其衍生物 和 Vi 抗原的物理、化学、抗原和免疫表征）.]\^七11〇(18￡1^7111〇1363,552-567(2003);5211，5. C. , Li, X. R. , Stone, A. L. , Robbins, J. B. : Relation between structure and immunologic properties of the Vi capsular polysaccharide(Vi荚膜多糖的结构和免疫性质之间的 相关性）? Infect Immun 59 (12) ,4555-4561 (1991)]。
[0201] 本实施例首次显示出，wbqG突变体0多糖与抗Vi抗原产生的抗体是交叉反应性 的。
[0202] 类似地，在本实施例中制备了由大肠杆菌0121野生型或WbqG突变体0多糖和 铜绿假单胞菌外毒素A构成的糖缀合物（0121-EPA/0121 wb(1(；-EPA)。EPA已经被成功地用 作伤寒缀合物疫苗中的免疫原性载体[Szu, S. C.，Taylor, D. N.，Trofa, A. C.，Clements, J. D. , Shiloach, J. , Sadoff, J. C. , Bryla, D. A. , Robbins, J. B. !Laboratory and preliminary clinical characterization of Vi capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines (Vi荚膜多糖-蛋白质缀合物疫苗的实验室和初步临床表征）.Infect Immun 62(10)，4440-4444(1994)]。用糖缀合物免疫的两组小鼠形成聚糖特异性抗体应答。用 Om wbtf-EPA缀合物免疫的7只小鼠中的6只显示在血清免疫球蛋白（Ig)抗-0121LPS效 价方面的显著升高，这表明不同于糖醛酰胺基团（uronamide group)的抗原决定簇对于诱 导抗-0121LPS特异性免疫应答是重要的。用0121wbq(rEPA缀合物免疫的一只动物的抗体 与大肠杆菌0121LPS不是反应性的，而与Vi多糖是反应性的。这表明这种动物形成了针对 由残基b和c'构成的表位（其类似于Vi结构）的抗体应答。然而，该组的其他动物产生 针对0121-LPS特异性表位的抗体，该表位最可能地是残基d，其含有突出的表面暴露侧基。 0121聚糖结构的其他优化将在免疫后提高Vi特异性免疫应答。
[0203] 表2.序列表
[0204]
[0205] 本文描述的实施方式意图仅是示例性的，并且本领域技术人员将认识到或者仅仅 利用常规实验将能够确定本文描述的具体程序的大量等同替换。所有这样的等同替换认为 是在本发明的范围内并且由所附权利要求所涵盖。
[0206] 本文引述的所有参考文献（包括专利申请、专利和出版物）以其整体通过引用结 合于此并且用于所有目的，其程度与每个单个出版物或专利或专利申请被具体且单个地指 明以其整体通过引用结合于此用于所有目的的程度相同。
【主权项】
1. 一种生物缀合物，包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 O-抗原。2. 根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原共价 结合至所述载体蛋白的糖基化位点内的Asn，其中所述糖基化位点包含氨基酸序列Asp/ Glu - X - Asn - Z - Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸。3. 根据权利要求2所述的生物缀合物，其中，所述糖基化位点已被重组改造并且在天 然载体蛋白中不存在。4. 根据权利要求2所述的生物缀合物，其中，所述载体蛋白包含2、3、4、5、6、7、8、9或 10个糖基化位点，每个所述糖基化位点具有所述氨基酸序列Asp/Glu - X - Asn - Z - Ser/ Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸。5. 根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述载体蛋白选自由以下物质组成的组： 铜绿假单胞菌的外毒素 A、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄色葡萄球菌的解毒溶血 素 A、聚集因子A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠 杆菌不耐热肠毒素的解毒变体、霍乱毒素 B亚基、霍乱毒素、霍乱毒素的解毒变体、大肠杆 菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、空肠弯曲杆菌AcrA、和空肠弯曲杆菌天然糖 蛋白、脑膜炎奈瑟氏菌菌毛蛋白、NMB0088、亚硝酸还原酶（AniA)、肝素结合性抗原（NHBA)、 因子H结合蛋白（fHBP)、粘附素 NadA、Ag473、表面蛋白A (NapA)、肠道沙门氏菌的抗原。6. 根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含： -4) - a -D-GalNAcA- (1 - 4) - a -D-GalNAcA- (1 -。7. 根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含8. 根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：9. 根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：10. -种免疫原性组合物，包含根据权利要求1至9中任一项所述的生物缀合物。11. 根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防肠道沙门氏菌感染。12. 根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防伤寒沙门氏菌感染。13. -种治疗或预防受试者中肠道沙门氏菌感染的方法，其中，所述方法包括向有需要 的受试者施用有效量的权利要求10所述的免疫原性组合物。14. 一种治疗或治疗受试者中伤寒沙门氏菌感染的方法，其中，所述方法包括向有需要 的受试者施用有效量的权利要求10所述的免疫原性组合物。15. -种用于产生生物缀合物的原核宿主生物，其中，所述原核宿主生物包含： a. 编码载体蛋白的异源核苷酸序列，所述载体蛋白包含至少一个糖基化位点，所述糖 基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu - X - Asn - Z - Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的 任何天然氨基酸；和 b. 编码寡糖基转移酶的异源核苷酸序列； 其中，所述原核宿主生物被重组改造以产生修饰的大肠杆菌0121 0抗原，并且其中所 述寡糖基转移酶将所述修饰的大肠杆菌0121 0抗原转移至所述糖基化位点的Asn。16. 根据权利要求15所述的原核宿主生物，其中，所述原核宿主生物是大肠杆菌。17. 根据权利要求15所述的原核宿主生物，其中，所述原核宿主生物是大肠杆菌菌株 K12〇18. 根据权利要求15所述的原核宿主生物，其中，所述寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌 的 PglB。19. 一种产生权利要求1的生物缀合物的方法，其中，所述方法包括： a. 培养权利要求15至18中任一项所述的原核宿主生物；和 b. 分离所述生物缀合物。
【专利摘要】本文提供了大肠杆菌的修饰的抗原，即O抗原O121。本文还提供了修饰的O121抗原的用途，如所述修饰的O121抗原在治疗和/或预防疾病中的用途，例如，治疗和/或预防由肠道沙门氏菌引起的疾病，包括由伤寒沙门氏菌(S.typhi)引起的疾病。
【IPC分类】A61K39/385, A61K47/48, A61P31/04, A61K39/108
【公开号】CN104902931
【申请号】CN201380058695
【发明人】M·瓦克, 迈克尔·科瓦里克, 迈克尔·韦特
【申请人】格林考瓦因有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年9月10日
【公告号】CA2883000A1, EP2892566A1, US20150238596, WO2014037585A1
【专利说明】包含修饰的抗原的生物缀合物及其用途
[0001] 本申请要求于2012年9月10日提交的美国临时专利申请号61/698,843的优先 权，将其公开内容以其整体通过引用结合于此。
[0002] 1?引言
[0003] 本文提供了一种大肠杆菌（Escherichia coli)的修饰的抗原，来自大肠杆菌 (E. coli)血清型0121的0抗原。本文还提供了所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的用途， 如所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原在治疗和/或预防疾病中的用途，例如，治疗和/或预 防由肠道沙门氏菌（Salmonella enterica)引起的疾病，包括由伤寒沙门氏菌（S.typhi) 引起的疾病。 2.【背景技术】
[0004] 伤寒症仍然是一种严重的公众健康问题，其每年发生2200-3300万病例，包括约 216, 000-500, 000 例死亡[Crump, J. A.，Luby，S. P.，Mintz，E. D. : The global burden of typhoid fever (伤寒热的全球负担）? Bull World Health 0rgan82 (5) ,346-353 (2004)]。 这种人类全身感染的病原体伤寒沙门氏菌（S.typhi)是通过污染的水和食物经口 (feco-orally)传播的。因此，伤寒症是卫生条件仍然较差的较不发达地区中的地方 性疾病。包括亚洲、非洲和南美洲在内的许多国家的学生和年轻人最经常受到影响 [Bhan，M.K.，Bahl，R.，Bhatnagar，S.:Typhoid and paratyphoid fever(伤寒症和副伤 寒）.Lancet366 (9487)，749-762 (2005)]。伤寒热的抗微生物治疗通过出现伤寒沙门氏菌 的多药抗性菌株而日渐变得复杂[Mirza, S. H.，Beeching, N. J.，Hart, C. A. :Multi_drug resistant typhoid:a global problem(多药抗性伤寒：全球问题）? J Med Microbiol 44(5)，317-319(1996)]。
[0005] 高危险人群的疫苗接种被认为是用于控制和预防伤寒症的最有前景策略。目 前，有两种被许可的伤寒疫苗：经口施用的、全细胞减毒活疫苗Ty21a和纯化的Vi多 糖肠胃外疫苗。Ty21a疫苗具有多种缺点：（i)有助于这种伤寒沙门氏菌菌株的减毒 表型的突变未被充分定义[Hone, D. M.，Attridge, S. R.，Forrest, B.，Morona, R.，Dan iels, D. , LaBrooy, J. T. , Bartholomeusz, R. C. , Shearman, D. J. , Hackett, J. :A galE via (Vi antigen-negative)mutant of Salmonella typhi Ty2retains virulence in humans (伤寒沙门氏菌Ty2的galE via(Vi抗原阴性）突变体在人中保持病毒性）.Infect Immun 56(5)，1326-1333(1988)]，（ii)减毒菌株理论上可以恢复为病毒性，和（iii) Ty21a是仅适度免疫原性的并且每5年需要三至四个初始剂量和加强剂量[Levine，M. M. , Ferreccio, C. , Black, R. E. , Germanier, R. :Large-scale field trial of Ty21a live oral typhoid vaccine in enteric-coated capsule formulation (肠包衣的胶囊制齐Ij中 的Ty21a活性伤寒疫苗的大规模现场试验）.Lancet 1 (8541)，1049-1052 (1987) ;Black, R. E. , Levine, M. M. , Ferreccio, C. , Clements, M. L. , Lanata, C. , Rooney, J. , Germanier, R. :Ef ficacy of one or two doses of Ty21a Salmonella typhi vaccine in enteric-coated capsules in a controlled field trial (肠包衣胶囊中一个或两个剂量的Ty21a伤 寒沙门氏菌疫苗在受控现场试验中的效力）? Chilean Typhoid Committee. Vaccine 8(1), 81-84 (1990) ；Murphy, J. R. , Grez, L. , Schlesinger, L. , Ferreccio, C. , Baqar, S. , M unoz, C. , ffasserman, S. S. , Losonsky, G. , Olson, J. G. , Levine, M. M. : Immunogenicity of Salmonella typhi Ty21a vaccine for young children (伤寒沙门氏菌疫苗对于年轻幼 儿的免疫原性）? Infect Immun 59 (11), 4291-4293 (1991) ；Levine, M. M. , Ferreccio, C. , Cr yz, S. , Ortiz, E. !Comparison of enteric-coated capsules and liquid formulation of Ty21a typhoid vaccine in randomised controlled field trial (Ty21a伤寒疫苗的肠包 衣胶囊和液体制剂在随机化受控现场试验中的比较）.Lancet 336(8720)，891-894(1990); Levine, M. M. , Ferreccio, C. , Abrego, P. , Martin, 0. S. , Ortiz, E. , Cryz, S. !Duration of efficacy of Ty21a, attenuated Salmonella typhi live oral vaccine(Ty21a 减毒 的伤寒沙门氏菌活口服疫苗的效力的持续时间）.Vaccine 17Suppl 2, S22-27(1999)]。 Vi多糖疫苗的有用性受其年龄相关的免疫原性和针对多糖的免疫应答是T细胞无关 这一事实所限制。因此，不能建立免疫记忆并且再接种疫苗不会引起任何加强应答 [ffeintraub, A. : Immunology of bacterial polysaccharide antigens (细菌多糖抗原的 免疫学）? Carbohydr Res 338 (23) ,2539-2547 (2003)，Landy，M. : Studies on Vi antigen. VI. Immunization of human beings with purified Vi antigen(人类用纯化的Vi 抗原免 疫）.Am J Hyg 60 (I) ,52-62 (1954)]。由于这些缺陷，所以期望用良好定义的、良好耐受的 且高度免疫原性的疫苗替代当前的伤寒疫苗。
[0006] 多糖疫苗的缺点可以通过将糖缀合至蛋白质载体（缀合物疫苗）而克服。在 缀合后，多糖的行为类似于T细胞依赖性抗原。已证实，共价连接至重组绿脓假单胞 菌（Pseudomonas aeruginosa)外毒素A (EPA)的纯化的Vi多糖在幼儿中诱发针对 伤寒沙门氏菌的保护性免疫应答[3211，3.(1，1&7101'，0.11，1'1'0€&，六.(1，01611161^8，]\ D. , Shiloach, J. , Sadoff, J. C. , Bryla, D. A. , Robbins, J. B. !Laboratory and preliminary clinical characterization of Vi capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines (Vi荚膜多糖-蛋白质缀合物疫苗的实验室和初步临床表征）.Infect Immun 62 (10), 4440-4444 (1994) ；Lin, F. Y. , Ho, V. A. , Khiem, H. B. , Trach, D. D. , Bay, P. V. , Thanh, T. C. , Kossaczka, Z. , Bryla, D. A. , Shiloach, J. , Robbins, J. B. , Schneerson, R. , Szu, S. C. :The efficacy of a Salmonella typhi Vi conjugate vaccine in tw〇-t〇-five_year-〇ld children (伤寒沙门氏菌Vi缀合物疫苗在二至五岁儿 童中的效力）.N Engl J Med 344(17)，1263-1269(2001)]。然而，缀合物疫苗的生产是一 个复杂的多步骤过程。首先，必须培育产生重组蛋白质载体和多糖抗原的分离的细菌菌株。 多糖和蛋白质载体在该两种组分进行化学偶合之前必须通过不同的程序纯化。最后的步骤 涉及用于获得最终产物的额外纯化步骤。该费力的生产过程具有以下缺点：（i)需要多个 纯化步骤，其中可能出现相当大的损失和（ii)由于化学偶合的随机性，所以产物不是均一 结构而是不同糖缀合物的混合物，具有潜在的不同效力分布曲线。
[0007] 因此，仍然需要对感染了肠道沙门氏菌，包括伤寒沙门氏菌的受试者进行治疗和 预防的改进方法。
[0008] 3?概述
[0009] 在一个方面，本文提供了包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀 合物。
[0010] 在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原共价 结合至载体蛋白的糖基化位点内的天冬酰胺残基（Asn)，其中所述糖基化位点包含氨基酸 序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸。在某些实施 方式中，本文提供的生物缀合物的载体蛋白不是天然地（例如，在其正常/天然的或"野生 型"状态）包含糖基化位点。在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物的载体蛋白被改造 成包含一个或多个糖基化位点，例如，所述载体蛋白被改造成包含一个或多个糖基化位点， 该糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的 任何氨基酸。例如，根据本文描述的方法使用的载体蛋白可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 个或更多个糖基化位点，每一个糖基化位点具有氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其 中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸；并且其中一些（例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9个） 或全部糖基化位点已被重组地引入到所述载体蛋白中。
[0011] 适合用于本文描述的方法（例如，治疗和/或预防伤寒沙门氏菌感染）中的任何 载体蛋白可以在本文描述的生物缀合物的生产中使用。示例性载体蛋白包括，但不限于，铜 绿假单胞菌（P. aeruginosa)的外毒素 A (EPA)、CRM197、白喉类毒素（Diphtheria toxoid)、 破伤风类毒素（tetanus toxoid)、金黄色葡萄球菌（S. aureus)的解毒溶血素A、聚集因子 (clumping factor)A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素 (E.coli heat labile enterotoxin)、大肠杆菌不耐热肠毒素的解毒变体、霍乱毒素B亚基 (Cholera toxin B subunit) (CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的解毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大 肠杆菌sat蛋白的效应结构域、空肠弯曲杆菌AcrA(C. jejuni AcrA)和空肠弯曲杆菌天然 糖蛋白。
[0012] 在一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0013] - 4)- a -D-GalNAcA-(1 - 4)- a -D-GalNAcA-(1 -
[0014] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0015]
[0016] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0017]
[0018] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0019]
[0020]在另一个方面，本文提供了能够生产本文描述的生物缀合物的原核宿主细胞。在 一种【具体实施方式】中，本文提供了一种可用于产生生物缀合物的原核宿主细胞，其中所述 原核宿主细胞包含：（i)编码载体蛋白的异源核苷酸序列，所述载体蛋白包含至少一个糖 基化位点，该糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu - X - Asn - Z - Ser/Thr，其中X和Z可以 是除Pro之外的任何天然氨基酸；和（ii)编码寡糖基转移酶的异源核苷酸序列；其中所述 原核宿主细胞被重组地改造成生产Und-PP-修饰的大肠杆菌0121 0-抗原（即，本文描述 的任一个修饰的大肠杆菌0121 0-抗原），其中所述寡糖基转移酶将修饰的大肠杆菌0121 〇-抗原转移至所述糖基化位点的Asn。在一种【具体实施方式】中，本文描述的原核宿主细胞 是大肠杆菌宿主细胞。在另一种【具体实施方式】中，本文描述的原核宿主细胞是大肠杆菌菌 株K12宿主细胞。在另一种【具体实施方式】中，重组地引入到本文描述的宿主细胞，例如，大 肠杆菌宿主细胞中的寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌的PglB。
[0021] 在某些实施方式中，除了异源寡糖基转移酶之外，本文描述的宿主细胞包含异源 核酸序列（即，不是与宿主细胞在其自然/天然状态，例如，在其"野生型"状态正常相关联 的核酸序列，例如，基因）。这样的额外的异源核酸序列可以包含编码已知是属于糖基化操 纵子，例如，原核糖基化操纵子的基因的核酸。在具体的实施方式中，这样的额外异源核酸 序列包含属于空肠弯曲杆菌的Pgl簇的基因，或包含空肠弯曲杆菌的全部Pgl簇。
[0022] 在某些实施方式中，本文描述的宿主细胞包含一个或多个基因缺失和/或一个或 多个基因失活，即，宿主细胞的遗传背景已经以使得与宿主细胞正常相关的基因（例如，一 个或多个"野生型"基因）失活或功能失常，或者将该基因全部去除的方式进行修饰。在一 种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细 胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因中的突变或该wbqG基因的缺失。在另一 种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细 胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqC基因中的突变或该wbqC基因的缺失。在另一 种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细 胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqE基因中的突变或该wbqE基因的缺失。在另一 种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细 胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因和wbqC基因中的突变或该wbqG基因和 wbqC基因的缺失。在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿 主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因和wbqE基因中 的突变或该wbqG基因和wbqE基因的缺失。在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物 缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在 wbqG基因、wbqC基因和wbqE基因中的突变或该wbqG基因、wbqC基因和wbqE基因的缺失。
[0023] 在某些实施方式中，大肠杆菌的0121基因簇（例如，大肠杆菌0121参照菌株CCUG 11422 的 0121 基因簇；在 Fratamico 等，2003, J. Clin. Microbiol. 41 (7) :3379-3383 中描 述的0121基因簇）被引入（例如，重组地引入）到本文描述的宿主细胞中。在某些实施方 式中，0121基因簇被引入到不产生任何O抗原的宿主细胞中，例如，所述宿主细胞已以使其 不产生任何0抗原的方式 被修饰。在某些实施方式中，0121基因簇的一个或多个基因被功 能性失活（例如，缺失，以使该基因失活的方式突变等）。在一种【具体实施方式】中，引入到本 文描述的宿主细胞中的0121基因簇的WbqG基因被功能性失活（例如，缺失）。在另一种具 体实施方式中，引入到本文描述的宿主细胞中的0121基因簇的WbqG基因和/或WbqE基因 被功能性失活（例如，缺失）。在具体的实施方式中，这样的宿主细胞被用来生产修饰的大 肠杆菌0121 0-抗原（即，本文描述的任一修饰的大肠杆菌0121 0-抗原）。
[0024] 在某些实施方式中，除了或代替上述的一个或多个基因缺失，在本文描述的生物 缀合物的生产中使用的宿主细胞包含一个或多个以下基因的缺失/失活：waaL(参见，例 如，Feldman等，2005，PNASUSA 102:3016-3021)、脂质A核心生物合成簇、半乳糖簇、阿 拉伯糖簇、可拉酸（colonic acid)簇、荚膜多糖簇、^^一癸稀醇_p生物合成基因、und_P再 循环基因、在核苷酸激活的糖生物合成中涉及的代谢酶、肠道细菌共同抗原簇、和原噬菌体 〇抗原修饰簇如gtrABS簇。
[0025] 在另一个方面，本文提供了产生本文提供的生物缀合物的方法。在某些实施方式 中，用于产生本文提供的生物缀合物的方法包括在适合生产蛋白质的条件下培养本文描述 的宿主细胞，和分离生物缀合物。本领域技术人员将了解适用于维持宿主细胞生长的条件 以使本文描述的生物缀合物可以通过所述宿主细胞生产并随后分离。这样的方法额外地通 过本文提供的工作实施例涵盖（参见第6部分）。
[0026] 在又一个方面，本文提供了包含本文描述的生物缀合物的组合物，例如，免疫原性 组合物。在某些实施方式中，本文描述的免疫原性组合物包含本文描述的生物缀合物和一 种或多种额外的组分，例如，佐剂。
[0027] 在另外的一个方面，本文提供了治疗或预防肠道沙门氏菌的感染的方法，包括向 被肠道沙门氏菌感染的或处于被肠道沙门氏菌感染风险中的受试者施用本文描述的生物 缀合物、或其组合物（例如，免疫原性组合物）。在具体的实施方式中，所述肠道沙门氏菌是 伤寒沙门氏菌（S. typhi)。
[0028] 3. 1惯例和缩写
[0029] 大肠杆菌0121 大肠杆菌血清型0121
[0030] PglB 细菌寡糖基转移酶PglB
[0031] Und-PP 十一异戊二稀焦磷酸盐（undecaprenyl pyrophosphate)
[0032] ELISA 酶联免疫吸附测定
[0033] EPA 绿脓假单胞菌外毒素A
[0034] Vi a -1，4-连接的N-乙酰基半乳糖胺糖醛酸（D-GalNAcA)残基 的荚膜
[0035] 多糖线性的、酸性均聚物
[0036] viaB Vi生物合成基因簇
[0037] ABC转运蛋白 ATP结合盒
[0038] wzy 聚合酶基因
[0039] 大肠杆菌0121 含有2-乙酰胺基-2-脱氧-d-半乳糖醛酸（d-GalNAcA)而不 是
[0040] wbqG d-GalNAcAN 的大肠杆菌 0121 wbqG 0 抗原突变体（d-GalNAcA)
[0041] CPS 荚膜多糖
[0042] D-GalNAcAN N-乙酰基半乳糖胺糖酸酰胺（N-acetylgalactosaminuronami de)
[0043] 残基 a (1 - 3) - a -D-GlcNAc
[0044] 残基 b (1 - 4) - a -D-GalNAcA
[0045] 残基 c (1 - 4) - a -D-GalNAcAN (60 %在 C-3 处 0-乙酰化的）
[0046] 残基 c' （1 - 4)-a -D-GalNAcA(30-40%在 C-3 处 0-乙酰化的）
[0047] 残基 d (1 - 3) - 0 _D_Qui4NAcGly
[0048] LPS 脂多糖
[0049] 2AB 2-氨基苯甲酰胺
[0050] MS 质谱法
[0051] m/z 质荷比
[0052] (CID) MS-MS 碰撞诱导解离质谱-质谱法
[0053] Da 道尔顿，质量的单位
[0054] kDa 千道尔顿
[0055] waaL 〇抗原连接酶基因
[0056] Und-PP ^^一异戊二烯焦磷酸
[0057] Dol-PP 焦磷酸长醇（dolichyl pyrophosphate)
[0058] wzz 〇抗原链长度调苄基因
[0059] ECA 肠道细菌共同抗原
[0060] CffP 细胞壁多糖
[0061] ELISA 酶联免疫吸附测定
[0062] A_ 在600 nm的光密度
[0063] MES 2-(N-吗啉代）乙磺酸，用于MES运行缓冲液
[0064] TBAP 磷酸四丁铵
[0065] TFA 三氟乙酸
[0066] PEG 聚乙二醇
[0067] CHCA a -氰基-4-羟基肉桂酸
[0068] IPTG 异丙基0 -D-I-硫代半乳糖吡喃糖苷
[0069] CTAB 十六烷基三甲基溴化铵
[0070] rpm 每分钟的转数
[0071] BCA 二金鸡宁酸测定
[0072] Vi-Tyr 酪氨酸化的Vi多糖
[0073] HRP 辣根过氧化物酶
[0074] TMB 3, 3 '，5, 5 ' -四甲基联苯胺
[0075] 4?附图描述
[0076] 图1 :伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi) Vi多糖的结构和大肠杆菌01210抗原的 重复单元。0121 0抗原簇编码的基因wbqG的突变导致修饰的0多糖结构的表达。GalNAcA : 2-乙酰胺基-2-脱氧-D-半乳糖醛酸；GalNAcAN :2-乙酰胺基-2-脱氧-D-半乳糖糖醛酰 胺；Qui4N :4_氨基-4, 6-二脱氧-D-葡萄糖。
[0077] 图2 :大肠杆菌0121及其wbqG突变衍生物的0多糖分析。（A)来自表达0121野 生型〇抗原基因簇或其WbqG突变衍生物的W3110细胞的LPS通过SDS-PAGE分离并用银染 色或在转移至硝基纤维素后用抗-0121和抗-Vi抗体检测。WbqG的突变导致与抗-Vi血 清是反应性的修饰的0抗原的装配。（B)Und-PP-连接的聚糖从表达0121野生型0抗原基 因簇或其突变WbqG衍生物的大肠杆菌SCM6细胞提取，接着2AB标记并使用GlycoS印N柱 通过正常相HPLC分离。单个峰馏分通过质谱法分析并表明所鉴别的聚糖结构。:N-乙 酰基己糖胺；?:二脱氧己糖胺；?:己糖醛酸；葡糖醛酰胺（hexuronamide) ;Ac :乙酰 基；NAc :N-乙酰基。
[0078] 图3 :通过正常相HPLC分离的聚糖物种的CID MS-MS谱图。该CID MS-MS谱图对 应于在图2B中看到的在单个峰馏分中鉴别的聚糖物种，具有以下保留时间：(A) 58. 8分钟， (B) 65. 1 分钟，（C) 67. 2 分钟和（D) 73. 5 分钟。
[0079] 图4 :利用细菌N-糖基化系统生产糖缀合物。糖缀合物通过共表达细菌寡糖基转 移酶PglB、改造的载体蛋白EPA和推动抗原性多糖的合成的基因（大肠杆菌0121，大肠杆 菌0121wbqG突变体，痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae)01)在大肠杆菌CLM24中生 产。在使用抗-EPA、抗-0121和抗-Vi抗体转移至硝基纤维素膜后，纯化的糖缀合物通过 SDS-PAGE，接着通过考马斯蓝染色（Coomassie blue staining)或糖苷蛋白质印迹分析。
[0080] 图5 :利用糖缀合物的免疫化研宄。使多组小鼠在氢氧化铝存在下用纯化的糖缀 合物免疫。对照组用纯化的Vi多糖免疫。（A)在第67天收集的血清的抗-0121总免疫球 蛋白效价。（B)在第67天收集的血清的抗-Vi抗体效价。数据表示为单个效价（鲁）和平 均效价（_)。用〇121 wbq(；-EPA缀合物免疫的一个动物不发展0121-LPS特异性抗体应答，但 是同一动物显示抗-Vi抗体效价的显著升高。
[0081] 5?详细描述
[0082] 在一个方面，本文提供了包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀 合物。
[0083] 在另一个方面，本文提供了能够生产本文描述的生物缀合物的原核宿主细胞。在 一种【具体实施方式】中，本文提供了一种可用于产生生物缀合物的原核宿主细胞，其中所述 原核宿主细胞包含：（i)编码载体蛋白的异源核苷酸序列，该载体蛋白包含至少一个糖基 化位点，该糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除 Pro之外的任何天然氨基酸；和（ii)编码寡糖基转移酶的异源核苷酸序列；其中所述原核 宿主细胞被重组地改造以生产Und-PP-修饰的大肠杆菌0121 0-抗原（即，本文描述的任一 修饰的大肠杆菌0121 0-抗原），其中所述寡糖基转移酶将所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗 原转移至糖基化位点的Asn。
[0084] 在另一个方面，本文提供了产生本文提供的生物缀合物的方法。在某些实施方式 中，用于产生本文提供的生物缀合物的方法包括在适合生产蛋白质的条件下培养本文描述 的宿主细胞，和分离所述生物缀合物。
[0085] 在又一个方面，本文提供了包含本文描述的生物缀合物的组合物，例如，免疫原性 组合物。在一个进一步的方面，本文提供了治疗或预防肠道沙门氏菌的感染的方法，包括向 被肠道沙门氏菌感染的或处于被肠道沙门氏菌感染的风险的受试者施用本文描述的生物 缀合物或其组合物（例如，免疫原性组合物）。在具体的实施方式中，所述肠道沙门氏菌是 伤寒沙门氏菌（s. typhi)。
[0086] 5. 1宿主细胞
[0087] 任何宿主细胞可以用来生产本文描述的生物缀合物。在具体的实施方式中，用来 生产本文描述的生物缀合物的宿主细胞是原核宿主细胞。示例性的原核宿主细胞包括， 但不限于，埃希氏菌属（Escherichia)物种、志贺氏菌属（Shigella)物种、克雷伯氏菌属 (Klebsiella)物种、黄单胞菌属（Xhantomonas)物种、沙门氏菌属（Salmonella)物种、耶 尔森氏菌属（Yersinia)物种、乳球菌属（Lactococcus)物种，乳杆菌属（Lactobacillus) 物种、假单胞菌属（Pseudomonas)物种、棒状杆菌属（Corynebacterium)物种、链霉菌属 (Streptomyces)物种、链球菌属（Streptococcus)物种、葡萄球菌属（Staphylococcus)物 种、芽胞杆菌属（Bacillus)物种和芽胞杆菌属（Clostridium)物种。在一种【具体实施方式】 中，用来生产本文描述的生物缀合物的宿主细胞是大肠杆菌（E.coli)宿主细胞（例如，大 肠杆菌菌株K12或CLM 24及其衍生物）。
[0088] 在某些实施方式中，用来生产本文描述的生物缀合物的宿主细胞被改造成包含异 源核酸，例如，编码一种或多种载体蛋白的异源核酸（参见，例如，第5. 2部分）和/或编码 一种或多种蛋白质的异源核酸，例如，编码一种或多种蛋白质的基因（参见，例如，第5. I. 1 部分）。在一种【具体实施方式】中，涉及糖基化途径（例如，原核和/或真核糖基化途径）的 编码蛋白质的异源核酸可以被引入到本文描述的宿主细胞中。这样的核酸可以编码蛋白 质，包括但不限于寡糖基转移酶和/或羰基转移酶。异源核酸（例如，编码载体蛋白的核酸 和/或编码其他蛋白质，例如在糖基化中涉及的蛋白质的核酸）可以使用本领域技术人员 已知的任何方法，例如，电穿孔、通过热冲击的化学转化、自然转化、噬菌体转导和缀合，弓丨 入到本文描述的宿主细胞中。在具体的实施方式中，异源核酸使用质粒引入到宿主细胞中， 例如，异源核酸通过质粒（例如，表达载体）在宿主细胞中表达。
[0089] 在某些实施方式中，可以向本文描述的宿主细胞中引入（例如，使用重组技术）额 外的修饰。例如，编码蛋白质（其形成可能与糖基化途径竞争或干扰糖基化途径（例如与被 重组地引入到宿主细胞中的在糖基化中所涉及的一种或多种异源基因竞争或干扰糖基化） 的一部分）的宿主细胞核酸（例如，基因）可以被缺失或者以使它们失活/失去功能的方 式在宿主细胞背景（基因组）中修饰（即缺失/修饰的宿主细胞核酸不编码功能性蛋白质 或者不编码任何蛋白质）。在某些实施方式中，当核酸从本文提供的宿主细胞的基因组缺 失时，它们被所需序列，例如，可用于糖蛋白生产的序列替代。控制宿主细胞中可以被缺失 (并且，在一些情况下，被其他所需核酸序列替代）的示例性基因包括在糖脂生物合成中涉 及的宿主细胞的基因，如waaL(参见，例如，Feldman等，2005, PNAS USA 102:3016-3021)、 脂质A核心生物合成簇、半乳糖簇、阿拉伯糖簇、结肠酸簇、荚膜多糖簇、十一癸烯醇-P生物 合成基因、und-P再循环基因、在核苷酸激活的糖生物合成中涉及的代谢酶、肠道细菌共同 抗原簇、和原噬菌体〇抗原修饰簇如gtrABS簇。在一种【具体实施方式】中，本文描述的宿主 细胞被修饰以使它们不产生不同于本文描述的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的任何0抗原 (例如，用于生产不同本文描述的修饰的大肠杆菌〇 121 0-抗原的0抗原的宿主细胞机制被 缺失/失活）。
[0090] 在具体的实施方式中，本文描述的宿主细胞的基因组可以以在生产变得与本文描 述的生物缀合物相关联的抗原中涉及的一个或多个基因不再由所述宿主生产的方式被修 饰。例如，在生产在正常情况下将与本文描述的生物缀合物相关联的抗原侧链中涉及的一 个或多个基因可以被缺失。不意图受限于任何特定的操作理论，认为编码在生产变得与本 文描述的生物缀合物相关联的抗原（不同于本文描述的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原（例 如，抗原侧链））中涉及的基因的失活/缺失核酸，增加/增强针对本文描述的修饰的大肠 杆菌0121 0-抗原的特异性免疫应答，由此增加本文描述的生物缀合物的抗原性。在一种
【具体实施方式】中，本文描述的宿主细胞具有突变的/缺失的/失活的wbqC基因，导致AcGly 侧链（即，图1中的残基d)的失活/缺失。在另一种【具体实施方式】中，本文描述的宿主细 胞具有突变的/缺失的/失活的WbqE基因。
[0091] 在一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大 肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在WbqG基因中的突变或WbqG基因的缺 失。在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠 杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在WbqC基因中的突变或WbqC基因的缺失。 在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌 宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在WbqE基因中的突变或WbqE基因的缺失。在 另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿 主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在WbqG基因和WbqC基因中的突变或WbqG基因和 wbqC基因的缺失。在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿 主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在WbqG基因和WbqE基因中 的突变或WbqG基因和WbqE基因的缺失。在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合 物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在WbqG 基因、wbqC基因和WbqE基因中的突变或WbqG基因、wbqC基因和WbqE基因的缺失。这样的 宿主细胞可以还包含本文描述的任何修饰，例如，宿主细胞包含编码载体蛋白和/或编码 在蛋白质糖基化中涉及的一个或多个基因（例如，寡糖基转移酶）的异源核酸和/或宿主 细胞可以还包含基因缺失/失活（例如，waaL的缺失）。
[0092] 在某些实施方式中，大肠杆菌的0121基因簇（例如，大肠杆菌0121参照菌株CCUG 11422 的 0121 基因簇；描述于 Fratamico 等，2003, J. Clin. Microbiol. 41 (7) : 3379-3383 中 的0121基因簇）被引入（例如，重组地引入）到本文描述的宿主细胞中。在某些实施方式 中，0121基因簇被引入到不产生任何0抗原的宿主细胞中，例如，宿主细胞已以使其不生产 任何0抗原的方式被修饰。在某些实施方式中，0121基因簇的一个或多个基因在功能上失 活（例如，缺失 ，以使基因失活的方式突变等）。在一种【具体实施方式】中，引入到本文描述的 宿主细胞中的0121基因簇的WbqG基因在功能上失活（例如，缺失）。在另一种具体实施方 式中，引入到本文描述的宿主细胞中的0121基因簇的WbqG基因和/或WbqE基因在功能上 失活（例如，缺失）。在具体的实施方式中，这样的宿主细胞用来生产修饰的大肠杆菌0121 〇-抗原（即，本文描述的任何修饰的大肠杆菌0121 0-抗原）。
[0093] 5. I. 1糖基化机构
[0094] 在某些实施方式中，本文提供的宿主细胞被修饰以表达糖基化机构（machinery) 以使该宿主能够生产本文描述的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原。在甚至更具体的实施方式 中，宿主细胞的糖基化机构被改造以生产UndPP-连接的修饰的大肠杆菌0121 O-抗原。
[0095] 不受理论限制，UndPP-连接的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原然后从宿主细胞的细 胞溶质快速翻转（flip)到宿主细胞的壁膜间隙中。而且，不受理论限制，修饰的大肠杆菌 0121 0-抗原然后在载体蛋白的糖基化位点的Asn上从UndPP转移到载体蛋白上。
[0096] 在某些实施方式中，编码糖基化转移的异源核酸引入（例如，使用重组方法引入） 到宿主细胞中以使修饰的大肠杆菌0121 0-抗原在UndPP上产生。本领域技术人员将容易 地认识到，任何合适的异源糖基化转移酶可以根据本文描述的方法使用。在一种具体实施 方式中，编码来自空肠弯曲杆菌的糖基化转移酶的异源核酸被引入到宿主细胞中。
[0097] 在某些实施方式中，编码寡糖基转移酶的异源核酸被引入到本文描述的宿主细胞 中。本领域技术人员将容易认识到，任何合适的异源寡糖基转移酶可以根据本文描述的方 法使用。在一种【具体实施方式】中，编码来自空肠弯曲杆菌的寡糖基转移酶的异源核酸被引 入到宿主细胞中。在另一种【具体实施方式】中，来自空肠弯曲杆菌的寡糖基转移酶Pglb被引 入到本文描述的宿主细胞中。
[0098] 在某些更具体的实施方式中，异源糖基化操纵子被引入到本文描述的宿主细胞 中。在某些实施方式中，异源糖基化操纵子具有一个或多个突变，即操纵子中的一个或多个 基因发生突变以使该基因失活/缺失。在一种【具体实施方式】中，编码来自空肠弯曲杆菌的 糖基化操纵子的异源核酸被引入到宿主中。
[0099] 5. 2载体蛋白
[0100] 适合用于生产生物缀合物的任何载体蛋白可以在本文中使用。示例性载体蛋白 包括，但不限于，铜绿假单胞菌（EPA)的外毒素A、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄 色葡萄球菌的解毒溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠 杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的解毒变体、霍乱毒素B亚基（CTB)、霍乱毒素、 霍乱毒素的解毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的效应结构域、空肠弯曲杆菌 AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。
[0101] 在某些实施方式中，在产生本文描述的生物缀合物中使用的载体蛋白被修饰，例 如，以使蛋白质毒性更低和或更易于糖基化等的方式修饰。在一种【具体实施方式】中，在产生 本文描述的生物缀合物中使用的载体蛋白被修饰以使载体蛋白中的糖基化位点的数量以 允许更低浓度的蛋白质可以被施用的方式最大化，例如，以免疫原性组合物、以其生物缀合 物形式。因此，在某些实施方式中，本文描述的载体蛋白被修饰以包括将通常与载体蛋白相 关联的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个糖基化位点（例如，相对于与在其天然/自然，例 如，"野生型"状态的载体蛋白相关联的糖基化位点的数量）。在具体的实施方式中，糖基化 位点的引入伴随蛋白质的初级结构中的糖基化共有序列的插入。这样的糖基化位点的引入 可以伴随，例如，将新的氨基酸添加至蛋白质的初级结构（即，糖基化位点被添加，全部或 部分），或伴随使蛋白质中的现有氨基酸突变以产生糖基化位点（即，氨基酸没有添加至蛋 白质，但所选的蛋白质的氨基酸发生突变以形成糖基化位点）。本领域技术人员将认识到， 蛋白质的氨基酸序列可以使用本领域已知的方法，例如，重组方法（包括编码蛋白质的核 酸序列的修饰）容易地修饰。在具体的实施方式中，糖基化共有序列被引入到载体蛋白的 特定区域中，例如，蛋白质的表面结构，在蛋白质的N或C末端，和/或在通过在蛋白质的基 部处通过二硫键稳定化的环中。在某些实施方式中，经典的5个氨基酸糖基化共有序列可 以通过赖氨酸残基延展用于更有效的糖基化，并且因此所插入的共有序列可以编码应被插 入或代替受体蛋白氨基酸的5、6或7个氨基酸。
[0102] 在某些实施方式中，用于产生本文描述的生物缀合物的载体蛋白包含"标签"，即， 允许分离和/或鉴别载体蛋白的氨基酸的序列。例如，将标签添加至本文描述的载体蛋白 可以可用于纯化该蛋白质，并且因此，可用于纯化包含标签的载体蛋白的生物缀合物。可以 在本文使用的示例性标签包括，但不限于，组氨酸（HIS)标签（例如，六组氨酸-标签，或 6XHis-Tag)、FLAG-TAG和HA标签。在某些实施方式中，一旦不再需要它们，例如在所述蛋白 已被纯化之后，本文中使用的标签是可去除的，例如，通过化学试剂或通过酶促手段去除。
[0103] 5. 3修饰的大肠杆菌0121 0-抗原
[0104] 本文描述的生物缀合物包含修饰的大肠杆菌0121 0-抗原，其中，作为使用本文描 述的方法修饰所述抗原（例如，缺失wbqG基因）的结果，所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗 原含有与肠道沙门氏菌Vi多糖，特别是伤寒沙门氏菌（S. typhi) Vi多糖的结构相似性。不 期望受理论限制，由于本文提供的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原与肠道沙门氏菌Vi多糖的 相似性所致，这样的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原适合用于治疗和/或预防受试者（例如， 人类受试者）由肠道沙门氏菌引起的感染，特别是当所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原作 为生物缀合物施用时。本领域技术人员将认识到，基于发明人的发现，只要所述修饰的大肠 杆菌0121 0-抗原保持与肠道沙门氏菌Vi多糖，例如，伤寒沙门氏菌（S. typhi)Vi多糖的 相似性，任何修饰的大肠杆菌0121 0-抗原都适合根据本文描述的方法使用，并且可以用于 产生本文描述的生物缀合物。
[0105] 在一种【具体实施方式】中，本文提供了一种修饰的大肠杆菌0121 0-抗原，其中所 述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含以下结构：
[0106] - 4)-a -D-GalNAcA-(1 - 4)-a -D-GalNAcA-(1 ―。
[0107] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种修饰的大肠杆菌0121 0-抗原，其中所 述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含以下结构：
[0108]
[0109] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种修饰的大肠杆菌0121 0-抗原，其中所 述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含以下结构：
[0110]
[0111] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种修饰的大肠杆菌0121 0-抗原，其中所 述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含以下结构：
[0112]
[0113] 5. 4生物缀合物
[0114] 本文提供了通过本文描述的宿主细胞生产的生物缀合物，其中所述生物缀合物包 含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原。如本文提及的，生物缀合物包含载体蛋白和 修饰的大肠杆菌0121 0-抗原，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原共价连接至载体蛋 白的天冬酰胺（ASN))残基（例如，连接在载体蛋白的糖基化位点）。
[0115] 在一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0116] - 4) - a -D-GalNAcA- (1 - 4) - a -D-GalNAcA- (1 -。
[0117] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0118]
[0119] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0120]
[0121] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0122]
[0123] 在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物被分离，即，使用本领域已知的和/或 本文描述的生产生物缀合物的方法通过本文描述的宿主细胞生产所述生物缀合物，并且分 离和/或纯化所生产的生物缀合物。在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物为至少 75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%纯的，例如没有其他污染物等。
[0124] 在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物相对于连接至载体蛋白的糖基化位点 的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原是同源的，例如，所述生物缀合物在载体蛋白的所有糖基化 位点处表达相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原。
[0125] 在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物相对于连接至载体蛋白的糖基化位点 的修饰的大肠杆菌0121 O-抗原不是同源的，例如，所述生物缀合物在载体蛋白的糖基化位 点处表达不同的修饰的大肠杆菌。
[0126] 在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物具有多于一个的糖基化位点，其中载 体蛋白的每个糖基化位点被糖基化（即，载体蛋白的100%的糖基化位点被糖基化），即，修 饰的大肠杆菌0121 0-抗原连接至每个糖基化位点。在某些实施方式中，本文提供的生物 缀合物具有多于一个的糖基化位点，其中不是载体蛋白的所有糖基化位点都被糖基化，例 如，约或至少 10 %，20 %，25 %，30 %，35 %，40 %，45 %，50 %，55 %，60 %，65 %，70 %，75 %， 80 %，85 %，90 %，或95 %的载体蛋白的糖基化位点被糖基化，但不是载体蛋白的所有糖基 化位点被糖基化（即，修饰的大肠杆菌0121 0-抗原不是连接至每个糖基化位点）。在某 些实施方式中，被糖基化的载体蛋白的所有糖基化位点包含相同的修饰的大肠杆菌0121 〇-抗原（即，被其糖基化）。
[0127] 在某些实施方式中，本文提供了生物缀合物的群。在一种实施方式中，本文提供 了一群生物缀合物，其中至少 50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90 %或 95%， 或其中100%的在所述群中的生物缀合物的载体蛋白中的第一糖基化位点被糖基化。在一 种【具体实施方式】中，至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，或95%或 100%的每个生物缀合物的第一糖基化位点被相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原糖基化， 如同该群中的其他生物缀合物（即，所有生物缀合物在载体蛋白的第一糖基化位点处具有 相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原）。在某些实施方式中，至少50%，55%，60%，65%， 70%，75%，80%，85%，90%，或95%，或100%的在所述群中的生物缀合物的载体蛋白中 的第二糖基化位点被糖基化。在一种【具体实施方式】中，至少50 %，55 %，60 %，65 %，70 %， 75 %，80 %，85 %，90 %，或95 %，或100 %的每个生物缀合物的第二糖基化位点被相同的修 饰的大肠杆菌0121 0-抗原糖基化，如同该群中的其他生物缀合物（即，所有的生物缀合物 在载体蛋白的第二糖基化位点处具有相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原）。在某些实施 方式中，至少 50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，或 95%，或 100% 的在所 述群中的生物缀合物的载体蛋白中的第三糖基化位点被糖基化。在一种【具体实施方式】中， 至少 50 %，55 %，60 %，65 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，或 95 %，或 100 % 的每个生物缀 合物的第三糖基化位点被相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原糖基化，如同该群中的其他 生物缀合物（即，所有生物缀合物在载体蛋白的第三糖基化位点处具有相同的修饰的大肠 杆菌0121 0-抗原）。在某些实施方式中，至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%， 85 %，90 %，或95 %，或100 %的所述群中的生物缀合物的载体蛋白中的第四糖基化位点被 糖基化。在一种【具体实施方式】中，至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%， 或95%，或100%的每个生物缀合物的第四糖基化位点被相同的修饰的大肠杆菌0121 〇-抗原糖基化，如同该群中的其他生物缀合物（即，所有生物缀合物在载体蛋白的第四糖 基化位点处具有相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原）。在某些实施方式中，至少50%， 55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，或 95%，或 100% 的所述群中的生物缀合物 的载体蛋白中的第五糖基化位点被糖基化。在一种【具体实施方式】中，至少50 %，55 %，60 %， 65 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，或95 %，或100 %的每个生物缀合物的第五糖基化位点 被相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原糖基化，如同该群中的其他生物缀合物（即，所有生 物缀合物在载体蛋白的第五糖基化位点处具有相同的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原）。
[0128] 5. 5组合物
[0129] 5. 5. 1包含宿主细胞的组合物
[0130] 在一种实施方式中，本文提供了包含了本文描述的宿主细胞的组合物。这样的组 合物可以在用于产生本文描述的生物缀合物的方法中使用，例如，该组合物可以在适合生 产蛋白质的条件下培养。随后，将生物缀合物与所述组合物分离。
[0131] 本文提供的包含宿主细胞的组合物包含适用于本文描述的宿主细胞的维持和存 活的额外组分，并且可以额外地包含通过宿主细胞生产蛋白质所需的或有益的额外组分， 例如用于诱导型启动子的诱导物，如阿拉伯糖，IPTG。
[0132] 5. 5. 2包含生物缀合物的组合物
[0133] 在另一种实施方式中，本文提供了包含本文描述的生物缀合物的组合物。这样的 组合物可以在治疗和预防疾病的方法中使用。在一种【具体实施方式】中，本文描述的组合物 用于治疗被肠道沙门氏菌感染的受试者（例如，人类受试者）。在另一种【具体实施方式】中， 本文描述的免疫原性组合物用于预防治疗被伤寒沙门氏菌（S.typhi)感染的受试者（例 如，人类受试者）。
[0134] 在一种【具体实施方式】中，本文提供了包含本文描述的一种或多种生物缀合物的免 疫原性组合物。本文提供的免疫原性组合物可以用于在施用了该组合物的宿主中引发免疫 应答。因此，本文描述的免疫原性组合物可以用作疫苗并且因此可以被配制为药物组合物。 在一种【具体实施方式】中，本文描述的免疫原性组合物可以用于预防受试者（例如，人类受 试者）受到肠道沙门氏菌的感染。在另一种【具体实施方式】中，本文描述的免疫原性组合物 可以用于受试者（例如，人类受试者）受到伤寒沙门氏菌（S.typhi)的感染。
[0135] 包含本文描述的生物缀合物的组合物可以包含适用于药物施用的额外组分。在具 体的实施方式中，本文描述的免疫原性组合物是单价制剂。在其他实施方式中，本文描述的 免疫原性组合物是多价制剂。例如，多价制剂包含多于一种的本文描述的生物缀合物。
[0136] 在某些实施方式中，本文描述的组合物额外地包含防腐剂，例如，汞衍生物硫柳汞 (thimerosal)。在一种【具体实施方式】中，本文描述的药物组合物包含0. 001 %至0. 01 %硫 柳汞。在其他实施方式中，本文描述的药物组合物不包含防腐剂。
[0137] 在某些实施方式中，本文描述的组合物（例如，免疫原性组合物）包含佐剂或与 其联合施用。用于与本文描述的组合物联合施用的佐剂可以在施用所述组合物之前、同 时地或之后施用。在一些实施方式中，术语"佐剂"是指当与本文描述的组合配合或作为 该组合物的一部分施用时，增加、增强和/或加强对生物缀合物的免疫应答的化合物，但 当该化合物单独施用时不会对生物缀合物产生免疫应答。在一些实施方式中，佐剂对多 生物缀合物肽产生免疫应答而不产生变态反应或其他不利反应。佐剂可以通过多种机制 增强免疫应答，所述机制包括例如淋巴细胞募集、刺激B和/或T细胞、以及刺激巨噬细 胞。佐剂的具体实例包括但不限于铝盐（明矾（alum))(如氢氧化铝，磷酸铝和硫酸铝）， 3 脱乙酰化的单磷酰脂质 A(3De -〇_acylated monophosphoryl lipid A) (MPL)(参 见 GB 2220211)，MF59 (Novartis)，AS03 (GlaxoSmithKline)，AS04 (GlaxoSmithKline)，聚 山梨醇酯80(Tween80 ;ICL Americas, Inc.)，咪唑并吡啶化合物（参见国际申请号PCT/ US2007/064857,公布为国际公开号W02007/109812)，咪唑并喹喔啉化合物（参见国际申 请号PCT/US2007/064858,公布为国际公开号W02007/109813)和皂角苷，如QS21 (参见 Kensil 等，in Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(在疫苗设计中：亚 基和佐剂方法）（eds. Powell&Newman, Plenum Press, NY, 1995);美国专利号 5, 057, 540)。 在一些实施方式中，佐剂是弗氏佐剂（完全或不完全的）。其他佐剂是水包油乳液（如 藍稀或花生油），任选地联合免疫刺激剂，如单磷酰脂质A (参见Stoute等，N. Engl. J. Med. 336,86-91(1997))。另一种佐剂是 CpG (Bioworld Today, 1998 年 11 月 15 日）。
[0138] 5. 6 用途
[0139] 在一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中的感染的方法，包括向所述受试者 施用本文描述的生物缀合物或其组合物。在一种【具体实施方式】中，本文描述了一种用于治 疗感染的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本文描述的生物缀合物或其组合物。
[0140] 在另一种实施方式中，本文提供了用于在受试者中诱发免疫应答的方法，包括向 所述受试者施用本文描述的生物缀合物或其组合物。在一种【具体实施方式】中，本文提供了 一种对本文描述的生物缀合物诱发免疫应答的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的 本文描述的生物缀合物或其组合物。
[0141] 在一种【具体实施方式】中，对其施用生物缀合物或其组合物的受试者受到感染或易 感感染，例如细菌感染。在另一种【具体实施方式】中，对其施用生物缀合物或其组合物的受试 者受到肠道沙门氏菌感染或者易感肠道沙门氏菌的感染。在另一种【具体实施方式】中，对其 施用生物缀合物或其组合物的受试者受到伤寒沙门氏菌感染或易感伤寒沙门氏菌的感染。
[0142] 在另一种实施方式中，本文描述的生物缀合物可以用于产生抗体，该抗体用于例 如诊断和研宄目的，例如，这样的抗体可用于确定施用包含本文描述的生物缀合物的免疫 原性组合物、或用于治疗肠道沙门氏菌感染的任何其他组合物是否导致足以杀灭肠道沙门 氏菌或使其无效的宿主免疫应答（例如，这样的抗体可以用于血清杀菌测定）。
[0143] 5. 7 测定
[0144] 5. 7. 1用于评估生物缀合物诱导免疫应答的能力的测定
[0145] 可以使用本领域技术人员已知的或本文描述的任何方法来评估本文描述的生物 缀合物在能够与肠道沙门氏菌（S.enterica)的Vi多糖交叉反应的受试者中产生免疫应答 的能力。在一些实施方式中，本文描述的生物缀合物在能够与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉 反应的受试者中产生免疫应答的能力可以通过用本文描述的生物缀合物使受试者（例如， 小鼠）或受试者组免疫并且用对照（PBS)使额外的受试者（例如，小鼠）或受试者组免疫 进行评估。这样的受试者可以代表疾病的动物模型，例如，伤寒症的动物模型（参见，例如， Libby等，2010, PNAS USA 107 (35): 15589-15594)。可以随后用毒性的肠道沙门氏菌攻击 所述受试者或受试者组并且可以确定该毒性的肠道沙门氏菌在所述受试者或受试者组中 引起疾病（例如，伤寒症）的能力。本领域技术人员将认识到，如果用对照免疫的受试者或 受试者组在用肠道沙门氏菌攻击后患病（例如，伤寒症）而用本文描述的生物缀合物免疫 的受试者或受试者组没有患病，则该生物缀合物能够在能够与肠道沙门氏菌的Vi多糖交 叉反应的受试者中产生免疫应答。可以通过例如免疫测定（如ELISA)来测试本文描述的 生物缀合物诱导与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉反应的抗血清的能力。
[0146] 5. 7. 2血清杀菌测定
[0147] 可以使用血清杀菌测定（SBA)来评估本文描述的生物缀合物在能够与肠道沙门 氏菌的Vi多糖交叉反应的受试者中产生免疫应答的能力。这样的测定是本领域熟知的并 且简单地包括产生和分离针对关注的靶标（例如，肠道沙门氏菌的Vi多糖）的抗体的步 骤，其中通过向受试者（例如，小鼠）施用激发出这样的抗体的化合物。随后，可以例如通 过以下来评估抗体的杀菌能力：在所述抗体和补充物存在下培养所讨论的细菌（例如，肠 道沙门氏菌），并例如使用标准的微生物学方法测定所述抗体杀灭该细菌和/或使其无效 的能力。
[0148] 6.实施例
[0149] 本实施例证实，能够成功地形成修饰的大肠杆菌0121 0-抗原并且施用包含这样 的抗原的生物缀合物能够在与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉反应的小鼠中产生抗体。
[0150] 6.1材料和方法
[0151] (a)菌株、质粒和培养条件。
[0152] 本实施例中描述的菌株和质粒列于表1中。质粒的构建在下文中描述。将大肠 杆菌株在37°C在LB培养基（每升IOg胰蛋白胨、5g酵母膏和5g NaCl)或LB琼脂（每升 添加了 15g琼脂的LB培养基）中培养。使伤寒沙门氏菌BRD948在37°C在补充了 l%v/ V Aro-mix (在IOml ddH20中的40mg L-苯丙氛酸、40mg L-色氛酸、IOmg 4_氛基苯甲酸和 1〇11^2,3-二羟基苯甲酸）和1%￥八171'-11111(在1〇1111(1(11120中的4〇11^1^-酪氨酸二钠） 的LB培养基中生长。如果适当，该培养基含有四环素（20yg mr1)、壮观霉素（80yg mr1) 或氨苄西林（100 y g mr1)。
[0153] 表1.本研宄中使用的菌株和质粒。
[0156] * 哥德堡大学微生物保藏中心（CultureCollectionUniversityofGStcborg)， 保藏人：瑞典哥德堡E. R. B. Moore教授
[0157] **Coligenetic Stock Center，耶鲁大学，美国康奈提格州纽黑文
[0158] (b) DNA 操作
[0159] 使用 NucleoSpin Plasmid 或 NucleoBond Xtra Maxi Plus 试剂盒 (Macherey-Nagel)分离质粒 DNA。使用 NucleoSpin Tissue 试剂盒（Macherey-Nagel)分 离总染色体DNA。根据制造商说明使用限制酶（Fermentas)、奸碱性磷酸酶（Fermentas)、 T4DNA 连接酶（Fermentas)和 Phusion 高保真 DNA 聚合酶（Finnzyme)。使用 NucleoSpin Extract II试剂盒（Macherey-Nagel)，纯化PCR和限制片段用于克隆。所有DNA测序通过 Synergene Biotech GmbH (瑞士）完成并且合成的寡核苷酸在Microsynth AG (瑞士）订 购。
[0160] (C)质粒构建
[0161] 质粒1含有合成的寡核苷酸盒，其形成自退火连接入EcoRI-消化的PLAFRl中的 5' -AATTGGCGCGCCCGGGACTAGTCTTGGG(SEQ ID NO. :1)和 5' -AATTCCCAAGACTAGTCCCGGGCGC GCC (SEQ ID NO. : 2) [Friedman, A. M. , Long, S. R. , Brown, S. E. , Buikema, ff. J. , Ausubel, F. M. : Construction of a broad host range cosmid cloning vector and its use in the genetic analysis of Rhizobium mutants (宽宿主范围粘粒克隆载体的构建及其在根瘤菌 突变体的遗传分析中的用途）.Gene 18 (3)，289-296 (1982)]，由此引入独特的AscI和SpeI 单个限制位点。使用引物 5'-AAAGGCGCGCCGCGAAGGTAAAGTCAGCCG(SEQ ID NO. :3)和 5'-AA AACTAGTCAGGAGTGAATTAAGTCAITG(SEQ ID NO. :4)，将大肠杆菌0121 0抗原簇由制备自大肠 杆菌0121 (CCUG 11422)的基因组DNA扩增。将该消化的PCR片段连接到Ascl/Spel消化 的质粒1中，产生质粒2。质粒3通过如下构建：将形成自退火5' -TGAATGAATGAACTAGTTCA ATCACTCA(SEQ ID NO. :5)和 5' -TGAGTGAITGAACTAGITCAITCAITCA(SEQ ID NO. :6)的合成 寡核苷酸盒插入到单个限制位点PmlI中，中断wbqG的开放阅读框。
[0162] (d) LPS 分析
[0163] 收集相当于A_为1的过夜培养物的细胞，再悬浮在100 y 1的根据Laemmli的 Ix 样品缓冲液[Laemmli, U. K.，Favre, M. :Maturation of the head of bacteriophage T4. I. DNA packaging events( 菌体 T4. I. DNA 包装事件的头部的突变）.J Mol Biol 80 (4)，575-599 (1973)]并在 95 °C 煮 10 分钟。加入蛋白酶 K (Fermentas)至 200 y g/ ml的最终浓度，并将样品在60°C温育1小时。根据制造商说明，使用来自Invitrogen 的12 % BisTris NuPAGE凝胶和MES运行缓冲液，通过SDS-PAGE分离来自蛋白酶 K-消化的全细胞溶解产物的LPS分子物质。通过用银染色使LPS可视化[Tsai, C. M. ,Frasch, C. E. :A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels(用于检测聚酰胺凝胶中的脂多糖的灵敏银染色）.Anal Biochem 119(1)，115-119(1982)]。0抗原的免疫学性质使用标准方法通过蛋白质印迹分析。大肠 杆菌0121 0抗原的结构与痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae)类型70抗原相同，因此 抗-痢疾志贺氏菌类型7血清购自Reagensia AB (瑞典）并以1:100稀释液使用。抗-Vi 多克隆抗体购自Murex Biotech Ltd(英格兰）并以1:100稀释液使用。
[0164] (e) ^^一异戊二烯焦磷酸（Und-PP)-连接的0抗原聚糖的分析
[0165] 0抗原聚糖在大肠杆菌菌株SCM6中分析，该菌株在多个多糖基因簇中含有染色体 缺失。〇多糖通过用编码〇抗原簇的质粒和WecA表达质粒（质粒4)转化SCM6细胞而表 达。用空质粒转化的SCM6用作阴性对照以鉴别0抗原特异信号。菌株在摇瓶中培养过夜。 收获相当于A_为400的细胞，用0. 9% NaCl洗涤一次，并冻干。通过重复的多轮涡旋和冰 上温育10分钟，用95%甲醇（MeOH)从干燥的细胞中提取脂质。通过添加CldH 2O将该悬浮液 转换成85% MeOH并在规则涡旋的同时再温育10分钟。在离心后，收集上清并且提取物在 N2下干燥。将干燥的脂质溶解在含有IOmM磷酸四丁铵（TBAP)的1:1甲醇/水（M/W)中并 经过 C18SepPak柱（Waters Corp.，Milford, MA)。该柱用 10ml MeOH调节，接着用以 1:1M/W 的IOmllOmM TBAP调节。在上样后，用1:1M/W的IOml IOmM TBAP洗涤该柱并用5ml MeOH 接着用5ml 10:10:3氯仿/甲醇/水（C/M/W)洗脱。合并的洗脱流分在队下干燥。
[0166]根据 Glover 等[Glover, K. J.，Weerapana，E.，Imperiali，B. : In vitro assembly of the undecaprenyIpyrophosphate-1 inked heptasaccharide for prokaryotic N-Iinked glycosylation (用于原核N-连接的糖基化的^^一异戊二稀焦磷酸-连接的七 糖的体外组装）.proc Natl Acad Sci U S A 102(40)，14255-14259(2005)]，通过将在2ml IM三氟乙酸（TFA)中的干燥样品溶解在50%正丙醇中并加热至50°C达15分钟来水解脂质 样品。水解的样品在N 2下干燥，溶解在4ml 3:48:47C/M/W中并经过C 18S印Pak柱（Waters Corp. ,Milford, MA)以从水解的聚糖分离脂质。该柱用10ml MeOH调节，接着用IOml 3:48:47C/M/W平衡。将样品上样至柱并收集流出物（flow-through)。用4ml 3:48:47C/M/ W洗涤柱并且利用SpeedVac干燥合并的流出流分。
[0167]根据 Bigge 等[131886，]\〇.，？&七61，1'.?.，131'11。6，]\六.，6〇111(1;[叫，？. N. , Charles, S. M. , Parekh, R. B. :Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid(聚糖使用 2_ 氨基 苯甲酰胺和邻氨基苯甲酸的非选择性和有效焚光标记）.Analytical biochemistry 230 (2)，229-238 (1995)]，用2-氨基苯甲酰胺（2AB)标记干燥的样品。使用如在 Merry 等[Merry, A. H.，Neville, D. C.，Royle，L.，Matthews, B.，Harvey, D. J.，Dwek，R. A. , Rudd, P. M. : Recovery of intact 2-aminobenzamide-labeled 0-glycans released from glycoproteins by hydrazinolysis (通过肼解释放自糖蛋白的完整2-氨基苯甲 酰胺-标记的 0_ 聚糖的回收）?Analytical biochemistry304 (1),91-99 (2002)]中描 述的纸片法（paper disk method)，进行聚糖清理。根据 Royle 等[1?0716，]^.，]\&11:1：11，1'. S. , Hart, E. , Langridge, J. I. , Merry, A. H. , Murphy, N. , Harvey, D. J. , Dwek, R. A. , Rudd, P. M. :An analytical and structural database provides a strategy for sequencing 〇-glycans from microgram quantities of glycoproteins (分析和结构数据库提 供用于对来自微克量的糖蛋白的〇-聚糖测序的策略）.Analytical biochemistry 304 (I)，70-90 (2002)]，但改变为三溶剂系统，使用GlycoS印N正相柱，通过HPLC进行2-AB 标记的聚糖的分离。溶剂A:在80%乙腈中的IOmM甲酸铵pH 4.4。溶剂B :在40%乙腈中 的30mM甲酸铵pH 4.4。溶剂(：：0.5%甲酸。柱温度为30°〇并且248-标记的聚糖通过荧 光检测（人ex = 330nm,人em = 420nm)。梯度条件：在160分钟内100 % A至100 % B的线 性梯度，流速为0. 4ml HiirT1，接着2分钟100% B至100% C，在2分钟内恢复至100% A并 以100% A在Iml HiirT1流速运行15分钟，然后恢复至0. 4ml min 4达5分钟。将样品注入 到 CldH2O 中。
[0168] 为了鉴别0抗原特异性聚糖，从获自含有0抗原簇的细胞的痕迹减去来自带有空 白质粒对照的细胞的2AB聚糖分布图。收集0抗原特异性峰并且2AB聚糖在MALDI SYNAPT HDMS Q-TOF系统（Waters Corp.，Milford, MA)上进行分 析。将样品溶解在5:95乙腈/水中 并用在80:20甲醇/水中的20mgHir1DHB1:1形成斑点。用PEG(准备好的混合溶液，Waters Corp.，Milford, MA)进行校准，用在60:40:0. 1乙腈/水/三氟乙酸中的5mg mr1 a -氰 基-4-羟基肉桂酸（CHCA，Sigma-Aldrich，瑞士）1:3形成斑点。仪器装配有200Hz固态UV 激光器。以正离子模式记录质谱。对于MSMS :激光能量在燃烧速率为200Hz下固定在240， 碰撞气体为氩气。碰撞能量分布图用来根据m/z渐变碰撞能。合并的、减去背景的和平滑化 的（Savitzsky Golay)谱图使用 MassLynx v4.0 软件（Waters Corp. ,Milford, MA)集中。
[0169] (f)糖缀合物的生产和纯化
[0170] 通过在大肠杆菌中表达寡糖基转移酶PglB、改造的受体蛋白EPA (绿脓假单胞菌 的外毒素A)和生产十一异戊二烯焦磷酸（Und-PP)-连接的聚糖的基因簇来实现糖缀合 物的生产。将PGVXN114(表达PglB)、PGVXN150(表达C-末端His 6-标记的EPA)和质粒 2(0121抗原簇）或质粒3(0121￥696突变抗原）共转化入大肠杆菌菌株<：111124〇 :^1(11]^11，]\1 F. , ffacker, M. , Hernandez, M. , Hitchen, P. G. , Marolda, C. L. , Kowarik, M. , Morris, H. R., Dell,A. , Valvano, M. A. , Aebi, M. !Engineering N-Iinked protein glycosylation with diverse 0 antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli?(在大 肠杆菌中利用不同〇抗原脂多糖结构改造N-连接的蛋白质糖基化）Proc Natl Acad Sci U S A 102(8)，3016-3021 (2005)]。在37°C将细胞在振荡培养箱（180rpm)中在补充有抗生素 的LB培养基中进行培养。从未诱导的过夜培养物接种摇瓶表达培养物至八_为0. 05。PglB 和载体蛋白EPA的表达通过IPTG(ImM)和L-阿拉伯糖（0. 02% w/v)在A_为0. 4-0. 6进 行诱导。在第一次诱导后四小时，添加第二批L-阿拉伯糖（0.02% w/v)。在过夜温育后收 获细胞（总诱导时间为19-22小时）。团粒用0. 9% NaCl洗涤并以相当于A_为50的浓 度悬浮在再悬浮缓冲液（25%蔗糖，IOmM EDTA，200mM Tris HCl pH 8.0)中。该细胞悬浮 液在4°C在摇床上温育20分钟。在离心后，将细胞团粒再悬浮在相同体积的渗透冲击缓冲 液（osmotic shock buffer)(IOmMTris HCl pH 8.0)中。该悬浮液在 4°C在摇床上温育 30分钟并以10, OOOg离心20分钟以除去球芽。收集含有周质蛋白的上清并且含有C-末端 六组氨酸标签的重组EPA使用HisTrap粗制FF Iml柱（GE Healthcare,瑞士）纯化。提 取物用5x HT结合缓冲液（2.5MNaCl,150mMTris HCl pH 8.0, 50mM咪唑）稀释以优化结 合条件并添加]\%(：12至50mM的终浓度。过滤提取物并施加至用lx HT结合缓冲液平衡的 HisTrap粗制FF柱。在加载后，柱用含有20mM咪唑的相同缓冲液洗涤以除去未结合的蛋白 质。用HT洗脱缓冲液（含有0. 5M咪唑的HT结合缓冲液）将蛋白质从柱洗脱。
[0171] 随后，使用Resource Q Iml柱（GE Healthcare,瑞士）将糖蛋白从未糖基化的EPA 分离。汇合含有EPA的HisTrap洗脱馏分并用RQ结合缓冲液（20mM L-组氨酸，pH 6. 0)稀 释10x。将稀释的EPA样品施加至用RQ结合缓冲液平衡的阴离子交换柱。该柱用以25柱 体积的0%至32. 5%的RQ洗脱缓冲液（（含有IM NaCl的RQ结合缓冲液）的线性梯度洗 脱并且使用 Akta FPLC(Amersham Biosciences)收集 0.5ml 馈分。馈分通过 SDS-PAGE 分 析并且蛋白质用考马斯蓝（Coomassie blue)染色。汇合含有糖蛋白的馏分，并且根据制造 商说明，通过多个浓缩和稀释步骤，使用具有30kDa膜（Millipore)的Amicon Ultra-4离 心滤器，将缓冲液交换为PBS。将最终纯化的蛋白质样品的浓度调节至Imgml'
[0172] (g)大肠杆菌0121LPS的纯化
[0173] 大肠杆菌0121(CCGU11422)培养物的LPS如在其他地方描述的通过酚提取纯化 [Apicella, M. A. : Isolation and characterization of lipopolysaccharides (月旨多糖的 分离和表征）.Methods Mol Biol431,3-13(2008)]。
[0174] (h)Vi多糖的纯化和用酪胺的修饰
[0175] Vi多糖通过如之前描述的改进的程序纯化自伤寒沙门氏菌BRD948[Demil，P.， D' Hondt, E. , Hoecke, C. V. : Salmonella typhi vaccine compositions (伤寒沙门氏菌疫 苗组合物）.European Patent EP1107787 (2003)]。简言之，将伤寒沙门氏菌BRD948在 补充了 Aro-和Tyrnix的LB培养基中培养。在振荡培养箱（180rpm)中在37°C过夜 温育后，将培养物加热至60°C达1小时并离心。Vi从具有0. 1 %溴化十六烷基三甲铵 (CTAB，Sigma，H6269)的上清中沉淀。加入 20g r1 硅藻土（celite)545(Sigma，20199-U)并 将混合物在室温（RT)搅拌1小时以允许形成多糖-CTAB复合物，其吸附在硅藻土上。将该 娃藻土倒入装配有玻璃料（frit) (Socochim S.A.)的适当尺寸的储罐（Extract-clean EV SPE Reservoir, Socochim S. A.)。通过具有 10 柱体积（CV)的 0? 05 % CTAB、IOCV 的 20 % 乙 醇、50mM磷酸钠缓冲液pH 6. 0和14CV的45%乙醇的梯度流连续地洗涤柱以去除吸附的杂 质。Vi多糖最后用1.5CV的50%乙醇、0.4M NaCl洗脱。在洗脱后，通过添加乙醇至80% 的终浓度并在室温温育20分钟使所述多糖沉淀。最后，通过在15000g离心20分钟收集沉 淀的多糖，用80%乙醇洗涤两次，并冻干。
[0176] 纯化的Vi多糖的蛋白质和核酸含量分别通过二辛可宁酸法（BCA)和UV光谱法 确定。〇-乙酰基含量利用乙酰胆碱作为标准进行测量[Hestrin，S.:The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxylamine, and its analytical application(乙酰胆碱和其他羧酸衍生物与轻胺的反应，及其分析应用）.J Biol Chem 180 (1),249-261 (1949)]。
[0177] 为了增大Vi与微滴定板的结合效率，将多糖酪胺化（Vi-Tyr)。将酪胺盐酸盐 (30mg mr1，Sigma)添加至IOmg纯化的Vi中。加入100 y 1的0. 5M N-(3_二甲基氨基丙 基）-N' -乙基碳二亚胺HCl (Sigma)并将混合物在pH4. 9-5. 1温育3小时。将反应混合物 对于ddH20进行透析。
[0178] (i)免疫研宄
[0179] 多组7只CB6F1雌性小鼠（6-8周龄）用于免疫实验。小鼠用20yg的具有 Alum(Rehydragel LV-Aluminium Hydroxide, General Chemical)作为佐剂的糖缀合物或 5 Ug的Vi多糖（Typhim Vi，Sanofi Pasteur MSD)免疫。在刚要免疫之前进行糖缀合物的 辅佐。简言之，将纯化的糖缀合物用PBS稀释至200 ygmr1的终浓度，加入Alum(最终量 为Al3+对应于0. 6mg ml 并将该溶液在室温温和地混合1小时。在第1、22和57天进行 免疫。多组小鼠正常接受100 U 1剂量的疫苗，对应于20 y g的缀合物（蛋白质）。在第二 次免疫后10天和在最后一次免疫后10天收集血液样品。
[0180] (j)酶联免疫吸附测定（ELISA)
[0181] 平底96孔微滴定板（Nunc immuno PolySorb)用50 y 1的5 y g ml 1大肠杆菌 01211^5或51^1111_1的酪胺化￥1(￥卜171〇涂覆，在？83中稀释，在41：过夜。倒掉涂覆溶 液并将板在4000ml的洗涤缓冲液（lx PBS，具有0.05% Triton X 100)浸泡并剧烈搅拌。 该清洗步骤进行至少4次。随后，该板通过颠倒放置在微板转子中并旋转进行干燥。此洗 涤程序总是在另外的洗涤步骤中施加。每个孔完全用300 Ul的封闭缓冲液（lx PBS，具有 2. 5% BSA (无球蛋白的BSA，Sigma，A7030))填充并在板摇床上在室温温育2小时。在洗涤 和干燥所述板后，将在稀释缓冲液（lx PBS，具有0.5% BSA)中的小鼠血清的稀释液加入到 板（IOOul)中并在板摇床上在室温温育1小时。为了检测总免疫球蛋白（Ig)，向每个孔 中加入100 y 1的在稀释缓冲液中1:2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP)标记的羊抗-小鼠 Ig(Sigma)并将该板在板摇床上在室温温育1小时。在洗涤和干燥板之后，反应用IOOy 1 的Ultra TMB底物（3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺液体底物，Pierce)显影15分钟并利用添 加100 y 1的2M硫酸终止。在450nm测量光密度（OD)。
[0182] 为了 确定终点效价，根据[Frey, A.，Di Canzio, J.，Zurakowski, D. :A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays (用于免疫测定的统计学定义终点效价确定方法）.J Immunol Methods 221(1-2),35-41(1998]定义95%的置信度。作为阴性样品，使用一池免疫前血清。
[0183] 6. 2 结果
[0184] (a)大肠杆菌0121wbqG突变体0多糖的分析
[0185] 首先考察通过大肠杆菌0121wbqG突变体生产的0多糖是否将被对于伤寒沙门氏 菌Vi荚膜多糖特异性的抗体识别。大肠杆菌0121 0抗原基因簇被克隆，并且WbqG的开放 阅读框通过插入含有寡盒（oligocassette)的终止密码子中断。将克隆的质粒转化到大肠 杆菌K-12菌株W3110中并且脂多糖（LPS)通过SDS-PAGE分析并用银染色，或在转移至硝 基纤维素膜转化通过蛋白质印迹分析（图2A)。如之前报道的，WbqG基因的突变不会消除 0 抗原表达[King, J. D.，Vinogradov, E.，Tran, V.，Lam, J. S. :Biosynthesis of uronamide sugars in Pseudomonas aeruginosa 06and Escherichia coli 0121 0 antigens (绿胺 假单胞菌06和大肠杆菌0121 0抗原中的糖醛酰胺糖的生物合成）.Environ Microbiol 12(6)，1531-1544(2010)]。然而，在银染色的聚丙烯酰胺凝胶中可视化的wbqG突变体的 LPS分布图在以下方面与野生型不同：（i)含有聚合的O抗原的条带的染色相对于野生型 LPS较弱，（ii)由连接至脂质A-核心的一个O抗原重复单元（核心+1RU)构成的条带更密 实地染色和（iii)含有O抗原的带比野生型LPS的等同带更快速地移动。据估计，通过分析 过曝光的银染色的SDS-PAGE凝胶，两个LPS分布图含有连接至脂质A-核心的平均12个O 抗原重复单元。LPS的蛋白质印迹分析揭示，抗-0121血清与wbqG突变体O抗原反应。该 WbqG突变体0多糖被抗-Vi血清识别。
[0186] 为了确认表达的0抗原重复单元的结构和确定0-乙酰化的程度，从表达0121野 生型或wbqG突变体0抗原的大肠杆菌SCM6提取糖脂。脂质连接的寡糖使用C 18 S印Pak柱 纯化并用特异地释放Und-PP-连接的聚糖的弱酸处理。在同样使用C18 SepPak柱的额外纯 化步骤之后，聚糖用2-氨基苯甲酰胺（2AB)标记，随后使用GlycoS印N柱通过正相HPLC 拆分。图2B示出了色谱图的一部分，其中预期洗脱单个重复单元和短的聚合的0抗原。含 有公认2AB-标记的聚糖物质的流分通过质谱法（MS)分析（图3)，并且通过MS鉴别的聚糖 结构示于图2B。
[0187] 由表达0121野生型0抗原的SCM6细胞制备的2AB-标记的聚糖的色谱图的特征 在于在58. 8分钟具有洗脱的峰。在该峰流分中，鉴别出质荷比（m/z)为1083的分子。保 留时间为65. 1分钟的峰流分主要含有m/z为1041的物质。该检测的m/z对应于2AB-标 记的、非乙酰化的0121野生型亚基的单电荷钠加合物。两个检测的质量之间的差异对应于 42 Da，其是0-乙酰基和羟基之间的质量差。这两种物质经过碰撞诱导解离（CID)MS-MS。 获自m/z为1083的前体的系列单电荷片段离子（图3A)与来自2AB-标记的0121野生型 〇抗原重复单元的糖苷裂解产物一致（在残基c处含有0-乙酰基）。而m/z为1041的分 子物质的CID MS-MS谱图对应于非乙酰化的2AB-标记的0121亚基（图3B)。
[0188] 由表达wbqG突变体多糖的SCM6细胞制备的2AB-标记的聚糖的色谱图显示两个 突出的峰。在保留时间为67.2分钟的峰流分中，检测到m/z为1084的分子。该检测到的质 量与在58. 8分钟洗脱的0121野生型痕迹的相应峰中测得的质量相差IDa。同样地，对于保 留时间为73. 5分钟的2AB-标记的分子测得m/z为1042。这些前体离子的CID MS-MS (图 3C和图3D)导致类似于获自0121野生型2AB-标记的聚糖的谱图的碎片图。测得的IDa 的质量差分配给聚糖结构的残基c。IDa的质量差对应于酸和酰胺基之间的计算的质量 差，与 wbqG 突变体 0 抗原的公开结构一致[King, J. D.，Vinogradov, E.，Tran, V.，Lam, J. S. !Biosynthesis of uronamide sugars in Pseudomonas aeruginosa 06and Escherichia coli 0121 0 antigens (绿脓假单胞菌06和大肠杆菌0121 0抗原中的糖醛酰胺糖的生物 合成）.Environ Microbiol 12(6)，1531-1544(2010)]。
[0189] 聚合的2AB-标记的0抗原亚基在0121野生型痕迹中鉴别。分别在保留时间为 83. 1分钟、86. 9分钟和90. 6分钟的峰流分中鉴别出可变地0-乙酰化的两个亚基。双倍乙 酰化的物质首先洗脱，接着单次乙酰化和非乙酰化形式。由于乙酰化和非乙酰化形式的分 离，所以可以确定〇-乙酰化的程度。在两个菌株中，大约50%的单个重复单元被0-乙酰 化。
[0190] 也在0121野生型痕迹（图2B)的一些峰中鉴别出肽聚糖单体的前体。肽聚糖前 体也在十一异戊二烯焦磷酸上类似并且预期被纯化并用用于0抗原亚基的方法进行标记。
[0191] (b)糖缀合物的生产
[0192] 确认了 0121wbqG突变体的结构，并且显示与对于Vi抗原产生的抗体是交叉反应 的。接着，确定wbqG突变体0多糖是否可以引出结合至Vi的抗体。制备糖缀合物用于免 疫研宄。通过在大肠杆菌K12衍生物CLM24表达细菌寡糖基转移酶PglB、改造的周质载 体蛋白EPA (类毒素重组绿脓假单胞菌外毒素A)、和大肠杆菌0121野生型或WbqG突变体 抗原来生产糖蛋白[Feldman, M. F.，Wacker, M.，Hernandez, M.，Hitchen, P. G.，Marolda, C. L. , Kowarik, M. , Morris, H. R. , Dell, A. , Valvano, M. A. , Aebi, M. !Engineering N-Iinked protein glycosylation with diverse 0 0 anti gen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli.(在大肠杆菌中利用不同00抗原脂多糖结构改造N-连接的蛋 白质糖基化）.Proc Natl Acad Sci U S A102 (8) ,3016-3021 (2005)]。菌株 CLM24 缺 乏0抗原连接酶（WaaL)。因此，0抗原转移至脂质A-核心被阻断并且Und-PP-连接的 〇抗原底物在内膜的周质面处聚集，提供〇抗原供体用于PglB-催化的转移至蛋白质受 体内的特异天冬酰胺残基。另外，大肠杆菌K12衍生物缺乏功能性内源性0抗原基因簇 [Liu, D. , Reeves, P. R. :Escherichia coli K12regains its 0 antigen (大肠杆菌 K12 复得其 0抗原）.Microbiology 140(Pt 1),49-57(1994) ;Feldman,M.F. , Marolda, C. L. , Monteiro, M. A. , Perry, M. B. , Parodi, A. J. , Valvano, M. A. : The activity of a putative polyisoprenol-1inked sugar translocase(Wzx) involved in Escherichia coli 0 antigen assembly is independent of the chemical structure of the 0 repeat (大肠杆菌0抗原组装中涉及的公认多猫醇-连接的糖转位酶（Wzx)的活性）.J Biol Chem 274 (49) ,35129-35138 (1999)]。因此，质粒编码的0抗原基因簇可以在没有产 生混合的0抗原群的情况下被表达。如其他地方所述的，EPA用作蛋白质受体，具有用于II 型依赖性分泌至周质的N-末端信号序列，和用于通过亲和性色谱法纯化的C-末端六组氨 酸标签[Ihssen, J.，Kowarik, M.，Dilettoso, S.，Tanner, C.，Wacker, M.，Thony-Meyer, L. : P roduction of glycoprotein vaccines in Escherichia coli (大肠杆菌中糖蛋白疫苗的 生产）.Microb Cell Fact 9,61(2010)]。EPA含有两个改造的N-糖基化位点。低拷贝质 粒PGVXNl 14用于在IPTG诱导型tac启动子控制下的PglB的表达。
[0193] 在诱导PglB和EPA后，新合成的糖蛋白通过镍亲和色谱法从周质提取物纯化。由 于在糖缀合物中存在带负电荷的多糖，所以使用阴离子交换色谱法来分离糖基化形式与非 糖基化形式。基于两种物质的分离，发现在表达0121野生型0多糖基因簇的培养物中，大 约70 %的总EPA被糖基化。糖基化效率在表达wbqG突变体0抗原的培养物中较低，而35 % 的总载体蛋白含有聚糖修饰。
[0194] 纯化的糖缀合物通过SDS-PAGE分离并在转移至硝基纤维素膜后使用抗-EPA、 抗-0121和抗-Vi抗体通过考马斯蓝染色或通过蛋白质印迹可视化（图4)。通过考马斯蓝 染色，在纯化的0121多糖-EPA缀合物（0121-EPA))中检测到与未糖基化的EPA(70kDa)相 同质量的带，其也被抗-EPA血清识别但不被抗-0121血清识别。因此，未糖基化的EPA在糖 缀合物制备中被很大程度地去除。主要地，在100和130kDa之间成簇的一系列带通过考马 斯蓝染色进行检测。这些带与抗-EPA血清反应，表明EPA的修饰形式。这些较大的多肽，但 不是用痢疾志贺氏菌01抗原修饰的EPA(Ol-EPA)(描述于[Ihssen, J.，Kowarik, M.，Dilet toso, S. , Tanner, C. , Wacker, M. , Thony-Meyerj L. !Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli (大肠杆菌中糖蛋白疫苗的生产）.Microb Cell Fact 9,61(2010)]) 也利用抗-0121特异性抗体检测，表明该载体被共表达的多糖修饰。用wbqG突变体0多糖 羰基的EPA(Omwbqe-EPA)额外地用抗-Vi抗体染色。
[0195] 如通过SDS-PAGE分析确定的，主要是单糖基化的EPA被纯化，即在两个改造的 糖基化位点之一上用相应的0-多糖修饰的EPA。二糖基化的EPA的痕迹可以在纯化的 Om wbtf-EPA样品中通过蛋白质印迹进行检测（图4)。EPA的二糖基化形式作为比130kDa 稍大的第二微弱系列带运行。如在图2A中看到的，表达的0-抗原显示具有平均12个重复 单元的模式链长度分布。假定纯化的糖缀合物由单糖基化的EPA构成，含有平均长度为12 个重复单元的单个多糖链，则糖与蛋白质的重量比估计为0. 15:1。
[0196] (C)糖缀合物在小鼠中的免疫原性和多糖特异性抗体应答的评价
[0197] 接下来，评估在用缀合物疫苗免疫后的小鼠中引发的免疫应答。在小组的CB6F1 小鼠中进行中间实验以确定纯化的糖缀合物的剂量范围和辅佐。这些建立了 20 yg的蛋 白质（大约3yg的多糖），结合Alum，是可再现地免疫原性的。随后，多组CB6F1小鼠（7 只/组）在第1、22和57天用0121-EPA、0121 wb(1(；-EPA或用5 y g的纯化的Vi多糖（Typhim Vi，Sanofi Pasteur MSD)皮下地免疫。在第32和67天对小鼠进行采血并且测试血清是否 存在抗-0121LPS和抗-Vi总免疫球蛋白（Ig)。到第67天，观察到在用任一缀合物免疫的 14只动物中的13只中的血清Ig抗-0121LPS效价的显著升高（图5A)。在用Om wbqe-EPA 免疫的一组小鼠中的一只动物未显示血清转化。感兴趣的是，同一动物在血清Ig抗-Vi效 价方面显示出显著的升高（图5B)。如所预期的，用纯化的Vi多糖免疫的对照组未显示出 可检测的抗-0121LPS应答，但在血清Ig抗-Vi效价方面有显著升高。
[0198] 6. 3 讨论
[0199] 本实施例描述了用于分析十一异戊二烯焦磷酸（Und-PP)-连接的聚糖的新方法。 所描述的程序基于用来分析真核细胞的焦磷酸长醇Dol-PP)-连接的寡糖的方法。主要改 进包括用于细菌糖脂的优化提取程序和在聚糖释放之前通过弱酸水解的纯化步骤。细菌 Und-PP-连接的聚糖的纯化策略通过大量各种各样的在该脂质载体上组装的不同糖结构而 进一步复杂化。用来分析Und-PP-连接的聚糖的具体亚类的恰当表达菌株的选择是关键。 在本实施例中，分析了 Und-PP-连接的0多糖。由于Und-PP-连接的0抗原代表LPS生物 合成的中间物质，所以使用大肠杆菌菌株，缺乏〇抗原连接酶（AwaaL)。因此，Und-PP-连 接的〇多糖不被转移至脂质A-核心，导致这种脂质中间体的积累。如果0抗原在waaL阳 性菌株中表达，则不能鉴别出2AB-标记的0聚糖，这最可能是由于这种糖脂物质的快速周 转（turnover)。此外，0抗原是具有高分子量的聚合的结构，使其对于通过质谱法的分析日 渐困难。因此，选择含有在0抗原亚基的有效聚合中涉及的0抗原链长度调节子（wzz)基 因中的突变的菌株背景。这导致主要产生单一重复单元和短聚合的〇抗原，由此简化MS分 析。多个其他多糖结构也在Und-PP上组装，如同肽聚糖前体、荚膜多糖和肠道细菌共同抗 原（ECA)，这会使0聚糖物质的鉴别和表征复杂化。含有在所有主要多糖基因簇中的缺失的 大肠杆菌菌株SCM6恰恰适合用于0抗原表达。
[0200] 利用这种改进的方法，分析0121wbqG突变体0多糖。本实施例证实了由King 等[King, J. D.，Vinogradov, E.，Tran, V.，Lam, J. S. :Biosynthesis of uronamide sugars in Pseudomonas aeruginosa 06and Escherichia coli 0121 0 antigens (绿胺假单 胞菌06和大肠杆菌0121 O抗原中的糖醛酰胺糖的生物合成）.Environ Microbiol 12(6)，1531-1544(2010)]公开的结构。此外，确定了重组表达的wbqG突变体0抗原结构含 有0-乙酰化的N-乙酰基半乳糖胺糖醛酸，最可能地在C-3处修饰。因此，这种突变体0多 糖含有在Vi多糖中也存在的结构基序。Vi多糖的0-乙酰基形成免疫优势表位并且Vi的 免疫原性与 O-乙酰化程度密切相关[Szu, S. C.，Bystricky, S. :Physical, chemical, antig enic，and immunologic characterization of polygalacturonan, its derivatives, and Vi antigen from Salmonella typhi(来自伤寒沙门氏菌的多聚半乳糖醛酸聚糖、其衍生物 和 Vi 抗原的物理、化学、抗原和免疫表征）.]\^七11〇(18￡1^7111〇1363,552-567(2003);5211，5. C. , Li, X. R. , Stone, A. L. , Robbins, J. B. : Relation between structure and immunologic properties of the Vi capsular polysaccharide(Vi荚膜多糖的结构和免疫性质之间的 相关性）? Infect Immun 59 (12) ,4555-4561 (1991)]。
[0201] 本实施例首次显示出，wbqG突变体0多糖与抗Vi抗原产生的抗体是交叉反应性 的。
[0202] 类似地，在本实施例中制备了由大肠杆菌0121野生型或WbqG突变体0多糖和 铜绿假单胞菌外毒素A构成的糖缀合物（0121-EPA/0121 wb(1(；-EPA)。EPA已经被成功地用 作伤寒缀合物疫苗中的免疫原性载体[Szu, S. C.，Taylor, D. N.，Trofa, A. C.，Clements, J. D. , Shiloach, J. , Sadoff, J. C. , Bryla, D. A. , Robbins, J. B. !Laboratory and preliminary clinical characterization of Vi capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines (Vi荚膜多糖-蛋白质缀合物疫苗的实验室和初步临床表征）.Infect Immun 62(10)，4440-4444(1994)]。用糖缀合物免疫的两组小鼠形成聚糖特异性抗体应答。用 Om wbtf-EPA缀合物免疫的7只小鼠中的6只显示在血清免疫球蛋白（Ig)抗-0121LPS效 价方面的显著升高，这表明不同于糖醛酰胺基团（uronamide group)的抗原决定簇对于诱 导抗-0121LPS特异性免疫应答是重要的。用0121wbq(rEPA缀合物免疫的一只动物的抗体 与大肠杆菌0121LPS不是反应性的，而与Vi多糖是反应性的。这表明这种动物形成了针对 由残基b和c'构成的表位（其类似于Vi结构）的抗体应答。然而，该组的其他动物产生 针对0121-LPS特异性表位的抗体，该表位最可能地是残基d，其含有突出的表面暴露侧基。 0121聚糖结构的其他优化将在免疫后提高Vi特异性免疫应答。
[0203] 表2.序列表
[0204]
[0205] 本文描述的实施方式意图仅是示例性的，并且本领域技术人员将认识到或者仅仅 利用常规实验将能够确定本文描述的具体程序的大量等同替换。所有这样的等同替换认为 是在本发明的范围内并且由所附权利要求所涵盖。
[0206] 本文引述的所有参考文献（包括专利申请、专利和出版物）以其整体通过引用结 合于此并且用于所有目的，其程度与每个单个出版物或专利或专利申请被具体且单个地指 明以其整体通过引用结合于此用于所有目的的程度相同。
【主权项】
1. 一种生物缀合物，包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 O-抗原。2. 根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原共价 结合至所述载体蛋白的糖基化位点内的Asn，其中所述糖基化位点包含氨基酸序列Asp/ Glu - X - Asn - Z - Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸。3. 根据权利要求2所述的生物缀合物，其中，所述糖基化位点已被重组改造并且在天 然载体蛋白中不存在。4. 根据权利要求2所述的生物缀合物，其中，所述载体蛋白包含2、3、4、5、6、7、8、9或 10个糖基化位点，每个所述糖基化位点具有所述氨基酸序列Asp/Glu - X - Asn - Z - Ser/ Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸。5. 根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述载体蛋白选自由以下物质组成的组： 铜绿假单胞菌的外毒素 A、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄色葡萄球菌的解毒溶血 素 A、聚集因子A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠 杆菌不耐热肠毒素的解毒变体、霍乱毒素 B亚基、霍乱毒素、霍乱毒素的解毒变体、大肠杆 菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、空肠弯曲杆菌AcrA、和空肠弯曲杆菌天然糖 蛋白、脑膜炎奈瑟氏菌菌毛蛋白、NMB0088、亚硝酸还原酶（AniA)、肝素结合性抗原（NHBA)、 因子H结合蛋白（fHBP)、粘附素 NadA、Ag473、表面蛋白A (NapA)、肠道沙门氏菌的抗原。6. 根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含： -4) - a -D-GalNAcA- (1 - 4) - a -D-GalNAcA- (1 -。7. 根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含8. 根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：9. 根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：10. -种免疫原性组合物，包含根据权利要求1至9中任一项所述的生物缀合物。11. 根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防肠道沙门氏菌感染。12. 根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防伤寒沙门氏菌感染。13. -种治疗或预防受试者中肠道沙门氏菌感染的方法，其中，所述方法包括向有需要 的受试者施用有效量的权利要求10所述的免疫原性组合物。14. 一种治疗或治疗受试者中伤寒沙门氏菌感染的方法，其中，所述方法包括向有需要 的受试者施用有效量的权利要求10所述的免疫原性组合物。15. -种用于产生生物缀合物的原核宿主生物，其中，所述原核宿主生物包含： a. 编码载体蛋白的异源核苷酸序列，所述载体蛋白包含至少一个糖基化位点，所述糖 基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu - X - Asn - Z - Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的 任何天然氨基酸；和 b. 编码寡糖基转移酶的异源核苷酸序列； 其中，所述原核宿主生物被重组改造以产生修饰的大肠杆菌0121 0抗原，并且其中所 述寡糖基转移酶将所述修饰的大肠杆菌0121 0抗原转移至所述糖基化位点的Asn。16. 根据权利要求15所述的原核宿主生物，其中，所述原核宿主生物是大肠杆菌。17. 根据权利要求15所述的原核宿主生物，其中，所述原核宿主生物是大肠杆菌菌株 K12〇18. 根据权利要求15所述的原核宿主生物，其中，所述寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌 的 PglB。19. 一种产生权利要求1的生物缀合物的方法，其中，所述方法包括： a. 培养权利要求15至18中任一项所述的原核宿主生物；和 b. 分离所述生物缀合物。
【专利摘要】本文提供了大肠杆菌的修饰的抗原，即O抗原O121。本文还提供了修饰的O121抗原的用途，如所述修饰的O121抗原在治疗和/或预防疾病中的用途，例如，治疗和/或预防由肠道沙门氏菌引起的疾病，包括由伤寒沙门氏菌(S.typhi)引起的疾病。
【IPC分类】A61K39/385, A61K47/48, A61P31/04, A61K39/108
【公开号】CN104902931
【申请号】CN201380058695
【发明人】M·瓦克, 迈克尔·科瓦里克, 迈克尔·韦特
【申请人】格林考瓦因有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年9月10日
【公告号】CA2883000A1, EP2892566A1, US20150238596, WO2014037585A1
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