一种将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂及其制备方法
一种将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂，以及制备该组织封闭剂的 方法，更具体地，本发明在于补充强度和降解性，而这被指出是市场中的血纤蛋白黏合剂的 弱点。即，本发明涉及一种组织封闭剂，当该组织封闭剂与细胞有亲和性时，将活化包含于 血液中的血小板以诱导组织再生，因此可以显著改善产品的质量和可靠性以满足作为使用 者的消费者的各种需求。
【背景技术】
[0002] 如所周知，医疗封闭剂已被应用到范围从手术黏着（surgical adhension)和附着 到止血的各种领域，且有很长历史。由于医疗封闭剂材料被直接施用于人类组织，需要使用 生物相容性材料。由于医疗封闭剂材料可以基本上流入体液或血液中，需要医疗封闭剂材 料是严格生物相容的和生物可降解的，能够是无菌的，并且不应表现出毒性和损害。另外， 对于选择封闭剂材料重要的是与生物组织具有高亲和性，甚至在施用进组织中之后，从而 不干扰再生至原组织中。
[0003] 目前，氰基丙烯酸酯、聚氨酯、明胶、纤维蛋白等作为医疗封闭剂材料被应用于产 品。医疗封闭剂已普遍被用于多个领域，例如皮肤、血管、消化器官、脑神经、整形外科、骨科 等。考虑到伤口，需要这样的封闭剂以具有在潮湿环境中迅速的粘合强度，是可灭菌和无毒 的，并且不干扰足够机械性质、生物降解性、有效止血和身体愈合。
[0004] 氰基丙烯酸酯主要用于工业目的，且不超过5%用于医疗目的。然而，由于氰基丙 烯酸酯有替代缝合的可能性，因此研宄正在积极进行中，尤其是在发达国家。然而，氰基丙 烯酸酯容易受到影响，施用后在耐热性和耐水性上有恶化，并对一些组织保留了毒性和易 损性，因此，目前氰基丙烯酸酯是被限制性地使用。
[0005] 聚氨酯为保持附着区域的弹性的材料，且优点在于由于与水的良好反应性而快速 变硬，且变硬的材料保持了它的弹性。另一方面，聚氨酯的缺点在芳香二异氰酸酯是合成的 原料，是生物有毒的。
[0006] 使用明胶的胶为生物衍生的封闭剂，其实例为产品中明胶和间苯二酚经福尔马林 交联的产品，以及使用明胶、聚谷氨酸和碳化二亚胺的产品。这些产品使用福尔马林和碳化 二亚胺的化学交联剂可以显示出毒性。使用福尔马林为交联剂的产品已在一些国家中使 用，但其许可正在进行中并且其效用正被日本等国测试。
[0007] 纤维蛋白胶为一种产品，该产品通过使用纤维蛋白原、凝血酶、氯化钙等为材料应 用纤维蛋白形成的原理而获得。纤维蛋白胶具有快速黏着性，无需加热和加压，不受胶合区 域的环境的显著影响，并且保持生物相容性和可生物降解的生物优点。然而，当与使用合成 材料的封闭剂相比时，纤维蛋白胶的缺点在于其缺乏物理性质且具有相对较高的生物降解 速率。为了克服这些缺点，关于通过加入抑肽酶对纤维蛋白溶酶抑制以减缓纤维蛋白聚合 物的降解速率，并保留形状的研宄正在进行。使用胶原作为弥补这些缺点的添加剂将对补 充纤维蛋白胶配方做出显著贡献。
[0008] 用于纤维蛋白胶的纤维蛋白作为天然粘合剂或止血剂被应用和商业化，并且具有 生物相容性和生物降解性。已知纤维蛋白通常在伤口愈合的过程中于几周内被吸收而且没 有例如炎症、免疫应答、组织坏死或纤维肥大的副作用。此外，纤维蛋白是对成纤母细胞的 天然支撑物（natural support)，并对伤口愈合起到非常重要的作用。纤维蛋白产品的概念 建立于20世纪70年代。最早的产品于1982年已在欧洲商业化，然后使用到现在。最近，许 多研宄中已证实纤维蛋白作为生物组织工程的支撑物，且已被应用于各种领域，例如骨科、 牙科和神经外科。
[0009] 可以用作添加剂以弥补纤维蛋白胶缺点的胶原为结构蛋白成分。胶原构成例如 真皮、肌腱/韧带和血管的软组织，以及例如骨骼和软骨的硬组织，并且占到哺乳动物中全 身蛋白含量的约1/3。已知超过二十种类型的胶原，并且构成皮肤、肌腱/韧带、骨骼等的 I型胶原占到体内胶原的约90%。胶原是由三股（strands)螺旋构成的蛋白且分子量为 300, 000道尔顿（每股约100, 000道尔顿）。在胶原（collage)中，为最小氨基酸单元（具 有最小的分子量）的甘氨酸被反复连接（-G X Y-;甘氨酸被连续重复，X和Y变化）。因此， 甘氨酸占到构成胶原的氨基酸的约1/3。目前胶原已被用于在止血剂、伤口覆盖剂、人造血 管、皱纹改善等领域的医疗目的。在用于止血剂时，从小牛皮肤提取的胶原粉末产品Aviten 于1974年首次被开发并使用到现在。
[0010] 最重要的是，胶原在医疗再生领域使用的最重要的特征在于胶原是在人体组织中 生物兼容的材料，显示出与细胞的亲和性，因此对细胞的黏着和生长以及维持活力是重要 的。另外，胶原刺激包含在血液中的血小板以诱导包含在血小板中的生长因子，因此使损坏 的组织再生。而且，胶原具有三股螺旋结构，而且与蛋白的单个结构相比胶原可以相对保持 降解性，因此胶原可以在体内用作支架（scaffold)。
[0011] 这样的材料粘合可以基本保持组织封闭剂所需要具有的生物降解特性，并维持不 干扰再生的特性。而且，这样的材料粘合可以补充纤维蛋白胶缺少的物理性质，并减缓降解 速率，从而提供可降解再生骨骼。因此，除了作为简单的封闭剂，该组织封闭剂会促进组织 生成并加速再生程序以缩短治疗过程。另外，为了立即使用该组织封闭剂，该组织封闭剂可 以是以预填充型和冷冻储存安装的制剂。
[0012] 组织封闭剂是一种产品，该产品可以减少病人在外科手术上的负担，并最大化伤 口缝合和涂覆情况中的满意度，例如与传统方法相比疼痛和感染的风险更低并缩短手术时 间。所以，组织封闭剂在这种领域会受到高度青睐，且市场规模会逐渐扩大。进一步地，这 样的产品有助于组织生成，并被用于药物释放体系和用于再生的支架，从而有助于再生医 疗领域。
【发明内容】
[0013] 技术问题
[0014] (专利文件1)已提交了韩国专利公开号为2012-0125465 (专利申请号为 2012-7018109,名称：干粉纤维蛋白封闭剂）。
[0015] 因此，本发明已经考虑到上述问题，本发明提供了一种将胶原和纤维蛋白混合的 组织封闭剂及其制备方法，其中，本发明的第一个目的是包括以下步骤：使用纤维蛋白原和 抑肽酶（aprotinin)混合第一材料；使用凝血酶、氯化钙和胶原混合第二材料；以及将第一 材料和第二材料互相混合以制备第三材料；根据本发明的第二个目的，作为物理强度比较 的结果，可以确认含有胶原的封闭剂显示了高强度；根据本发明的第三个目的，作为长期/ 短期降解性测试的结果，可以确认含有胶原的封闭剂显示了低降解性；根据本发明的第四 个目的，通过电子显微镜观察，可以确认将胶原和纤维蛋白原结合以显示稳定的结构；根 据本发明的第五个目的，作为使用软骨细胞、造骨细胞和脂肪来源细胞（adipose-derived cells)的生长和活力的比较结果，可以确认含有胶原的结构显示了良好的生长速率和高生 存力；根据本发明的第六个目的，可以确认胶原的内含物维持了高强度和稳定的结构并提 供了与细胞/血液具有亲和性的材料，因此大大帮助了删除/损坏区域的再生；本发明的第 七个目的是活化包含在血液中的血小板以诱导组织再生；以及本发明的第八个目的是显著 改善产品的质量和可靠性，从而满足作为用户的消费者的各种需求，从而给予好印象。
[0016] 技术方案
[0017] 根据本发明的第一个方面，提供了制备将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂的方 法，该方法包括：使用纤维蛋白原和抑肽酶混合第一材料；使用凝血酶、氯化钙和胶原混合 第二材料；以及将第一材料和第二材料互相混合以制备第三材料。
[0018] 根据本发明的另一个方面，提供了一种将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂，该 组织封闭剂通过以下步骤制备：使用纤维蛋白原和抑肽酶混合第一材料；使用凝血酶、氯 化钙和胶原混合第二材料；以及将第一材料和第二材料互相混合以制备第三材料。
[0019] 有益效果
[0020] 如上所述，本发明包括以下步骤：使用纤维蛋白原和抑肽酶混合第一材料；使用 凝血酶、氯化钙和胶原混合第二材料；以及将第一材料和第二材料互相混合以制备第三材 料。
[0021] 根据具有前述技术特征的本发明，作为物理强度比较的结果，可以确认含有胶原 的封闭剂显示了高强度。
[0022] 另外，根据本发明，作为长期/短期降解性测试的结果，可以确认含有胶原的封闭 剂显示了低降解性。
[0023] 另外，根据本发明，通过电子显微镜观察，可以确认将胶原和纤维蛋白原结合以显 示稳定的结构。
[0024] 另外，根据本发明，作为使用软骨细胞、造骨细胞和脂肪来源细胞的生长和活力的 比较结果，可以确认含有胶原的结构显示了良好的生长速率和高生存力。
[0025] 另外，根据本发明，可以确认胶原的内含物维持了高强度和稳定的结构并提供了 与细胞/血液具有亲和性的材料，因此大大帮组了删除/损坏区域的再生。
[0026] 另外，本发明是活化包含在血液中的血小板以诱导组织再生。
[0027] 本发明通过前述效果能显著改善产品的质量和可靠性，从而满足作为其用户的消 费者的各种需求，因此给予好印象，所以本发明非常有用的。
[0028] 下文中，结合附图将详细描述用于获得以上效果的本发明的优选实施方式。
【附图说明】
[0029] 图1为根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂的电子显微镜图像 (20, 000X，临界点干燥法）。
[0030] 图2为显示胶原与细胞粘合的概念图。
[0031] 图3为显示胶原中血小板活化的概念图。
[0032] 图4为显示了根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂的降解速率的 比较曲线。
[0033] 图5显示了在根据 本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂中的软骨细胞 的增殖速率曲线。
[0034] 图6说明证实在根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂中的软骨细 胞的增殖和生存力的图像。
[0035] 图7为显示了在根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂中的造骨细 胞的增殖速率的曲线。
[0036] 图8说明证实在根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂中的造骨细 胞的增殖和生存力的图像。
[0037] 图9说明证实在根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂中的脂肪来 源细胞的增殖和生存力的图像。
[0038] 图10为将根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂装载在双向注射器 中的状态图。
【具体实施方式】
[0039] 根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂及其制备方法如图1-10所 不O
[0040] 在以下说明中，当确定与本发明有关的已知功能或构成的详细描述使本发明的主 旨模糊时，省略该详细描述。
[0041] 另外，考虑到本发明中的功能，限定稍后描述的术语，因此由于所述术语可以由生 产者的意图或习惯进行解释，所以术语的定义纵观本说明书加以解释。
[0042] 首先，本发明包括使用纤维蛋白原和抑肽酶混合第一材料的步骤。
[0043] 另外，本发明包括使用凝血酶、氯化钙和胶原混合第二材料的步骤。
[0044] 另外，本发明包括将所述第一材料和所述第二材料互相混合以制备第三材料的步 骤，从而制备将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂。
[0045] 特别地，根据本发明，优选地，所述纤维蛋白原的浓度为65-130mg/mL，所述抑肽酶 的浓度为 1，000-3, 000KIU/mL。
[0046] 另外，优选地，所述凝血酶的浓度为40_600U/ml，所述氯化钙的浓度为 4-140mmol/mL，且所述胶原的浓度不超过60mg/mL。
[0047] 在本发明中，所述纤维蛋白原的浓度优选为65-130mg/mL。低于65mg/mL的纤维蛋 白原减弱物理强度，且超过130mg/mL的纤维蛋白原导致物理结构的密实化，致使孔尺寸降 低，从而抑制细胞活性，因此所述纤维蛋白原的浓度优选为65-130mg/mL。
[0048] 另外，所述抑肽酶的浓度优选为1，000-3, 000KIU/mL。低于1，000KIU/mL的抑肽酶 加速组合物的降解，且超过3, 000KIU/mL的抑肽酶增加引起过敏的风险，因此抑肽酶的浓 度优选为 1，000-3, 000KIU/mL。
[0049] 另外，所述凝血酶的浓度优选为40-600U/ml。低于40U/ml的凝血酶减弱组合物的 物理强度，且超过600U/ml的凝血酶导致组合物结构的密实化，因此与细胞无亲和性并迅 速增加凝胶化速率，不能在施用区域充当封闭剂，因此，所述凝血酶的浓度优选为40-600U/ ml 〇
[0050] 另外，所述氯化妈的浓度优选为4-140mmol/mL。低于4mmol/mL的氯化妈也减缓了 凝胶速率，且超过140mmol/mL的氯化钙由于高渗透压可能对细胞有不良影响，因此氯化钙 的浓度优选为4-140mmol/mL。
[0051] 最后，所述胶原的浓度优选不超过60mg/mL。特别地，所述胶原的优选浓度为 10_30mg/mL〇
[0052] 即，低于lOmg/mL的胶原减弱物理强度，且超过30mg/mL对降解性和稳定的结构有 不良影响，并且与细胞和血液无亲和性，因此所述胶原的浓度优选为10_30mg/mL。
[0053] 同时，制备根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂的方法具体描述如 下。
[0054] 首先，进行制备包括纤维蛋白原和抑肽酶的第一材料的步骤。
[0055] 之后，进行制备包括凝血酶、氯化钙和胶原的第二材料的步骤。
[0056] 然后，进行将所述第一材料放到双向注射器的一侧，并将所述第二材料放到所述 双向注射器的另一侧，随后将所述第一材料和所述第二材料互相混合的步骤，从而制备将 胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂。
[0057] 根据本发明，抑肽酶和钙溶液分别注入到纤维蛋白原和凝血酶中，且凝血酶与胶 原溶液混合，然后将所得溶液载入双向注射器中，从而制备将胶原和纤维蛋白混合的组织 封闭剂。
[0058] 根据本发明，可以通过经历用于制备将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂的各个 步骤来制备将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂。
[0059] 根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂及其制备方法，将通过给出的 实施例描述。
[0060] 实施例1
[0061 ] 比较本发明和现有技术之间的物理性质
[0062] 为了验证本发明的物理性质，使用物性仪（physical property meter)检测最大 应力、凝胶强度和抗张强度（tensile strength)。
[0063]I、样品制备
[0064] 1)在现有技术中，使用Greenplast产品。
[0065] 2)对于本发明的组分，将Greenplast的干燥的纤维蛋白原和凝血酶分别溶解在 抑肽酶溶液和外加的钙溶液中。在此，将凝血酶溶液与3%的胶原溶液混合。将所得溶液载 入双向注射器中。
[0066] 3)为物理性质的测量，将每个样品放入圆柱形模具（?12X 15mm)中制成一种形 状。
[0067] 2、物理性质的测量
[0068] 1)物性仪：流变仪（Rheometer) (CR-500DX，Sunscienctific流变仪）
[0069]2)测试项目：最大应力（N)，凝胶强度（g-cm)，抗张强度（g/cm2)
[0070]3)测试条件：入□距离（7. 5mm)，工作台速度（50mm/min)，最大应力（IOkg)，适配 器（No. I C> 20mm)
[0071] 3、测试结果
[0072] 表I
[0073]
[0074] 实施例2
[0075] 比较本发明和现有技术产品之间的降解性（长期/短期）
[0076] 为了验证本发明的组合物的降解性，检测纤维蛋白胶产品和材料对于预定期间的 降解性。
[0077] 1、降解性（短期）
[0078] 1)样品制备
[0079] _在现有技术中，使用Greenplast产品。
[0080] -对于本发明的组分，将Greenplast的干燥的纤维蛋白原和凝血酶分别溶解在抑 肽酶和外加的钙溶液中。在此，将凝血酶溶液与3%的胶原溶液混合。将所得溶液载入双向 注射器中。
[0081] _为物理性质的测量，将每个样品放入圆柱形模具（?8X 5mm)中制成一种形状。
[0082] 2)降解性验证的处理条件
[0083]-对于溶剂确认两种条件。确认仅使用DEME培养基的条件和使用含有Liberase TM的DMEM培养基的条件（Liberase TM的浓度设置为lOug/mL)。
[0084] -将样品放入12孔板中，降解方面以2小时为单位检查12小时内组合物的残留物 重量。
[0085] 3)测试结果
[0086] -可以确认，在通过酶处理的降解条件中，现有技术的制剂超过90%在12小时内 降解，本发明的组合物约80%保留了 12小时。在DMED条件下，在12小时未验证降解。
[0087]2、降解性（长期）
[0088] 1)样品制备
[0089] -在现有技术中，使用Greenplast产品。
[0090] -对于本发明的组分，将Greenplast的干燥的纤维蛋白原和凝血酶分别溶解在抑 肽酶溶液和外加的钙溶液中。在此，将凝血酶溶液与3%的胶原溶液混合。将所得溶液载入 双向注射器中。
[0091] -为物理性质的测量，将每个样品放入圆柱形模具（?12X 15mm)中制成一种形 状。
[0092] 2)降解性验证的处理条件
[0093] -DMEM用于溶剂，并在37。。下进行裸眼观察1个月。
[0094] 3)测试结果
[0095] -观察到本发明的组合物一个月或更长，而现有技术的制剂在三周内降解。可以确 认，本发明的组合物的降解周期长于现有技术的制剂。
[0096] 实施例3
[0097] 本发明的电子显微镜分析
[0098] 通过电子显微镜观察本发明的组合物的结构
[0099] 1、样品制备
[0100] -为制备组合物，制备Greenplast的纤维蛋白原溶液和含有胶原的凝血酶溶液/ 钙溶液。胶原溶液的浓度为3% (重量/体积）。
[0101] _为了电子显微镜观察，将每个制备的溶液施加到双向注射器，以在托盘上分配。
[0102] 2、方法
[0103] -将本发明的组合物在临界点干燥，然后用电子显微镜观察。
[0104] _通过将临界点干燥仪（Hitachi，HCP-2)中的乙醇处理进行组合物的临界点干 燥。
[0105] -将用于电子显微镜观察的样品切割并镀金，随后用SEM(Hitachi，S3500)观察。
[0106] -电子显微镜分析在20, 000倍放大率下进行。
[0107] 3、测试结果
[0108] 作为在20, 000倍放大率下电子显微镜的观察结果，可以确认，胶原和纤维蛋白互 相交联。还观察到胶原的纤维结构。可以预测到该材料的交联增强了物理性质。
[0109] 实施例4
[0110] 测试本发明的细胞相容性和生长（软骨细胞）
[0111] 为了验证在本发明的组合物 中软骨细胞的增殖和活力，使用CCK-8检测和 Calcein-AM&EthD-l染色。
[0112] 1、细胞和组合物
[0113] -使用排除人类的动物软骨细胞。在组合物混合液体中的细胞数量为 12, 000, 000〇
[0114] -对于组合物，将Greenplast (为纤维蛋白胶产品）分别与3 %和6 %的胶原混合。
[0115] -通过将Greenplast的干燥的纤维蛋白原溶解在ImL的含有软骨细胞的溶液中， 并将凝血酶/钙溶液与每种浓度的ImL的胶原溶液混合制备组合物。
[0116] -使用含有软骨细胞的纤维蛋白原溶液和含有胶原的凝血酶溶液制备总量2mL的 胶原-纤维蛋白溶液。
[0117] -对于培养，将制备的胶原-纤维蛋白组分分配在24孔板中，每孔0. 2mL，并且进 行观察20天，同时每2-3天更换DMEM培养基。
[0118] 2、CCK_8 检测
[0119] -从含有培养材料的每个孔（24孔板）中去除培养基。
[0120] -将ImL新培养基放入每个孔中。
[0121] -在每个孔中加入IOOuL CCK-8(Dojindo，CK04-ll)试剂，相当于培养基体积的 10%，随后在5% CO2的培养箱中于37°C下反应3小时。
[0122] --旦该反应完成，使用酶标仪（microplate reader)读取反应液体的吸光度 (450nm)〇
[0123] -使用测量的OD值确认每个培养周期的细胞增殖。
[0124] 3、Calcein-AM&EthD-l 染色
[0125] -通过将缓冲溶液分别与2yM和4yM的Calcein AM&EthD-l的VE/ DEADViability/CytotoxiciLIty 试剂盒（Assay Kit) (Invitrogen，L3224)混合制备工作 溶液。
[0126] -将该培养的材料转移到新的24孔板中，然后在其中放入ImL的所述工作溶液，随 后在光被阻断20分钟的条件下反应。之后，利用荧光显微镜观察活细胞和死细胞。观察到 活细胞为绿色，且观察到死细胞为红色。
[0127] 4、测试结果
[0128] A、CCK-8 检测（图 5)
[0129] B、Calcein-AM&EthD-l 染色（图 6)
[0130] 实施例5
[0131] 测试本发明的细胞生物相容性（造骨细胞）
[0132] 为了验证在本发明的组合物中造骨细胞的增殖和生存力，使用CCK-8检测和 Calcein-AM&EthD-l 染色。
[0133] 1、细胞和组合物
[0134] -使用排除人类的动物造骨细胞。在组合物混合液体中的细胞数目为 12, 000, 000〇
[0135] -通过将Greenplast (为纤维蛋白胶产品）分别与3%和6%的胶原混合配备组合 物。
[0136] -通过将Greenplast的干燥的纤维蛋白原溶解在ImL的含有软骨细胞的溶液中， 并将凝血酶/钙溶液与每种浓度的ImL的胶原溶液混合来制备组合物。
[0137] -使用含有造骨细胞的纤维蛋白原溶液和含有胶原的凝血酶溶液制备总量2mL的 胶原-纤维蛋白溶液。
[0138] -对于培养，将制备的胶原-纤维蛋白组分分配在24孔板中，每孔0. 2mL，并进行 观察20天，同时每2-3天更换a -DMEM培养基。
[0139] 2、CCK_8 检测
[0140] -从每个孔（24孔板）中去除含有培养材料的培养基。
[0141] -将ImL新培养基放入每个孔中。
[0142] 在每个孔中加入IOOuL CCK-8(Dojindo，CK04-ll)试剂，相当于培养基体积的 10%，随后在5% CO2的培养箱中于37°C反应3小时。
[0143] --旦该反应完成，使用酶标仪读取反应液体的吸光度（450nm)。
[0144] -使用测量的OD值确认每个培养周期的细胞增殖。
[0145] 3、Calcein-AM&EthD-l 染色
[0146] -通过将缓冲溶液分别与2 yM和4 yM的Calcein AM&EthD-l的VE/ DEADViability/CytotoxiciLIty 试剂盒（Invitrogen, L3224)混合制备工作溶液。
[0147] -将该培养的材料转移到新的24孔板中，然后在其中放入ImL的所述工作溶液，随 后在光被阻断20分钟的条件下反应。之后，利用荧光显微镜观察活细胞和死细胞。观察到 活细胞为绿色，观察到死细胞为红色。
[0148] 4、测试结果
[0149] A、CCK-8 检测（图 7)
[0150] B、Calcein-AM&EthD-l染色（图 8)
[0151] 实施例6
[0152] 测试本发明的细胞生物相容性（脂肪来源细胞）
[0153] 为了验证在本发明的组合物中脂肪来源细胞的增殖和生存力，使用CCK-8检测和 Calcein-AM&EthD-l染色。
[0154] 1、细胞和组合物
[0155] _使用脂肪来源细胞。在组合物混合液体中的细胞数目为12, 000, 000。
[0156] _通过将Greenplast (为纤维蛋白胶产品）与3%的胶原混合配备组合物。
[0157] _通过将Greenplast的干燥的纤维蛋白原溶解在ImL的含有脂肪来源细胞的溶液 中，并将凝血酶/钙溶液与每种浓度的ImL的胶原溶液混合来制备组合物。
[0158] _使用含有脂肪来源细胞的纤维蛋白原溶液和含有胶原的凝血酶溶液制备总量 2mL的胶原-纤维蛋白溶液。
[0159] -对于培养，将制备的胶粒-纤维蛋白组分分配在24孔板中，每孔0. 2mL，并进行 观察20天，同时每2-3天更换DMEM培养基。
[0160]2、Calcein-AM&EthD-l染色
[0161] -通过将 PBS 分别与 2yM和 4yM 的 Calcein AM&EthD-l 的 VE/DEADViability/ CytotoxiciLIty试剂盒（Invitrogen，L3224)混合制备工作溶液。
[0162] -将该培养的材料转移到新的24孔板中，然后在其中放入ImL的所述工作溶液，随 后在光被阻断20分钟的条件下反应。之后，利用荧光显微镜观察活细胞和死细胞。
[0163] 3、测试结果
[0164] -Calcein-AM&EthD-l染色（图 9)
[0165] 同时，对于本申请的前述特征，本发明可以以各种方式修改和以多种不同的形式 体现。
[0166] 然而，需要注意的是，并非旨在将本发明限制于在详细的说明中所描述的具体实 施方式，而旨在包括所有由附带的权利要求书限定的属于本发明的技术思想和技术范围的 修改、等同或替换。
[0167] 工业实用性
[0168] 由于实际上可以重复相同的结果，本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂 及其制备方法的技术精神足以值得保护，并且尤其是实施本发明可以促进技术发展并有助 于工业发展。
【主权项】
1. 一种制备将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂的方法，该方法包括： 使用纤维蛋白原和抑肽酶混合第一材料； 使用凝血酶、氯化钙和胶原混合第二材料；以及 将所述第一材料和所述第二材料互相混合以制备第三材料。2. 根据权利要求1的方法，其中，所述纤维蛋白原的浓度为65-130mg/mL，所述抑肽 酶的浓度为1，000-3,OOOKIU/mL，所述凝血酶的浓度为40-600U/ml，所述氯化钙的浓度为 4-140mmol/mL，所述胶原的浓度不高于60mg/mL。3. 权利要求2所述的方法，其中，所述胶原的浓度为10-30mg/mL。4. 权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，该方法包括： 制备包括纤维蛋白原和抑肽酶的第一材料； 制备包括凝血酶、氯化钙和胶原的第二材料；以及 将所述第一材料放入双向注射器的一侧，并将第二材料放入所述双向注射器的另一 侦牝随后将所述第一材料和第二材料互相混合。5. 权利要求4所述的方法，其中，分别将抑肽酶和氯化钙注入到纤维蛋白原和凝血酶 中，并将所述凝血酶与胶原溶液混合，随后将所得溶液载入双向注射器中。6. 通过权利要求1-5中任意一项所述方法制备的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭 剂。
【专利摘要】本发明涉及一种将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂及其制备方法。为此，本发明的方法包括以下步骤：使用纤维蛋白原和抑肽酶混合第一材料；使用凝血酶、氯化钙和胶粒混合第二材料；通过将所述第一材料和所述第二材料混合制备第三材料。由该方法制备的组织封闭剂可以弥补缺点，即商业市场上目前可获得的纤维封闭剂的强度和降解性。而且，本发明的组织封闭剂为亲细胞的并能活化包含在血液中的血小板以诱导组织再生。因此，产品的质量和可靠性能显著改善以满足作为用户的消费者的各种需求，从而呈现好形象。
【IPC分类】A61K38/36, A61L33/12
【公开号】CN104902937
【申请号】CN201380064818
【发明人】柳志喆, 吕世根, 金壮勋, 李准根, 徐东三, 张晶皓
【申请人】世元世龙技术株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年1月9日
【公告号】CA2894815A1, EP2932989A1, US20150320904, WO2014092239A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂，以及制备该组织封闭剂的 方法，更具体地，本发明在于补充强度和降解性，而这被指出是市场中的血纤蛋白黏合剂的 弱点。即，本发明涉及一种组织封闭剂，当该组织封闭剂与细胞有亲和性时，将活化包含于 血液中的血小板以诱导组织再生，因此可以显著改善产品的质量和可靠性以满足作为使用 者的消费者的各种需求。
【背景技术】
[0002] 如所周知，医疗封闭剂已被应用到范围从手术黏着（surgical adhension)和附着 到止血的各种领域，且有很长历史。由于医疗封闭剂材料被直接施用于人类组织，需要使用 生物相容性材料。由于医疗封闭剂材料可以基本上流入体液或血液中，需要医疗封闭剂材 料是严格生物相容的和生物可降解的，能够是无菌的，并且不应表现出毒性和损害。另外， 对于选择封闭剂材料重要的是与生物组织具有高亲和性，甚至在施用进组织中之后，从而 不干扰再生至原组织中。
[0003] 目前，氰基丙烯酸酯、聚氨酯、明胶、纤维蛋白等作为医疗封闭剂材料被应用于产 品。医疗封闭剂已普遍被用于多个领域，例如皮肤、血管、消化器官、脑神经、整形外科、骨科 等。考虑到伤口，需要这样的封闭剂以具有在潮湿环境中迅速的粘合强度，是可灭菌和无毒 的，并且不干扰足够机械性质、生物降解性、有效止血和身体愈合。
[0004] 氰基丙烯酸酯主要用于工业目的，且不超过5%用于医疗目的。然而，由于氰基丙 烯酸酯有替代缝合的可能性，因此研宄正在积极进行中，尤其是在发达国家。然而，氰基丙 烯酸酯容易受到影响，施用后在耐热性和耐水性上有恶化，并对一些组织保留了毒性和易 损性，因此，目前氰基丙烯酸酯是被限制性地使用。
[0005] 聚氨酯为保持附着区域的弹性的材料，且优点在于由于与水的良好反应性而快速 变硬，且变硬的材料保持了它的弹性。另一方面，聚氨酯的缺点在芳香二异氰酸酯是合成的 原料，是生物有毒的。
[0006] 使用明胶的胶为生物衍生的封闭剂，其实例为产品中明胶和间苯二酚经福尔马林 交联的产品，以及使用明胶、聚谷氨酸和碳化二亚胺的产品。这些产品使用福尔马林和碳化 二亚胺的化学交联剂可以显示出毒性。使用福尔马林为交联剂的产品已在一些国家中使 用，但其许可正在进行中并且其效用正被日本等国测试。
[0007] 纤维蛋白胶为一种产品，该产品通过使用纤维蛋白原、凝血酶、氯化钙等为材料应 用纤维蛋白形成的原理而获得。纤维蛋白胶具有快速黏着性，无需加热和加压，不受胶合区 域的环境的显著影响，并且保持生物相容性和可生物降解的生物优点。然而，当与使用合成 材料的封闭剂相比时，纤维蛋白胶的缺点在于其缺乏物理性质且具有相对较高的生物降解 速率。为了克服这些缺点，关于通过加入抑肽酶对纤维蛋白溶酶抑制以减缓纤维蛋白聚合 物的降解速率，并保留形状的研宄正在进行。使用胶原作为弥补这些缺点的添加剂将对补 充纤维蛋白胶配方做出显著贡献。
[0008] 用于纤维蛋白胶的纤维蛋白作为天然粘合剂或止血剂被应用和商业化，并且具有 生物相容性和生物降解性。已知纤维蛋白通常在伤口愈合的过程中于几周内被吸收而且没 有例如炎症、免疫应答、组织坏死或纤维肥大的副作用。此外，纤维蛋白是对成纤母细胞的 天然支撑物（natural support)，并对伤口愈合起到非常重要的作用。纤维蛋白产品的概念 建立于20世纪70年代。最早的产品于1982年已在欧洲商业化，然后使用到现在。最近，许 多研宄中已证实纤维蛋白作为生物组织工程的支撑物，且已被应用于各种领域，例如骨科、 牙科和神经外科。
[0009] 可以用作添加剂以弥补纤维蛋白胶缺点的胶原为结构蛋白成分。胶原构成例如 真皮、肌腱/韧带和血管的软组织，以及例如骨骼和软骨的硬组织，并且占到哺乳动物中全 身蛋白含量的约1/3。已知超过二十种类型的胶原，并且构成皮肤、肌腱/韧带、骨骼等的 I型胶原占到体内胶原的约90%。胶原是由三股（strands)螺旋构成的蛋白且分子量为 300, 000道尔顿（每股约100, 000道尔顿）。在胶原（collage)中，为最小氨基酸单元（具 有最小的分子量）的甘氨酸被反复连接（-G X Y-;甘氨酸被连续重复，X和Y变化）。因此， 甘氨酸占到构成胶原的氨基酸的约1/3。目前胶原已被用于在止血剂、伤口覆盖剂、人造血 管、皱纹改善等领域的医疗目的。在用于止血剂时，从小牛皮肤提取的胶原粉末产品Aviten 于1974年首次被开发并使用到现在。
[0010] 最重要的是，胶原在医疗再生领域使用的最重要的特征在于胶原是在人体组织中 生物兼容的材料，显示出与细胞的亲和性，因此对细胞的黏着和生长以及维持活力是重要 的。另外，胶原刺激包含在血液中的血小板以诱导包含在血小板中的生长因子，因此使损坏 的组织再生。而且，胶原具有三股螺旋结构，而且与蛋白的单个结构相比胶原可以相对保持 降解性，因此胶原可以在体内用作支架（scaffold)。
[0011] 这样的材料粘合可以基本保持组织封闭剂所需要具有的生物降解特性，并维持不 干扰再生的特性。而且，这样的材料粘合可以补充纤维蛋白胶缺少的物理性质，并减缓降解 速率，从而提供可降解再生骨骼。因此，除了作为简单的封闭剂，该组织封闭剂会促进组织 生成并加速再生程序以缩短治疗过程。另外，为了立即使用该组织封闭剂，该组织封闭剂可 以是以预填充型和冷冻储存安装的制剂。
[0012] 组织封闭剂是一种产品，该产品可以减少病人在外科手术上的负担，并最大化伤 口缝合和涂覆情况中的满意度，例如与传统方法相比疼痛和感染的风险更低并缩短手术时 间。所以，组织封闭剂在这种领域会受到高度青睐，且市场规模会逐渐扩大。进一步地，这 样的产品有助于组织生成，并被用于药物释放体系和用于再生的支架，从而有助于再生医 疗领域。
【发明内容】
[0013] 技术问题
[0014] (专利文件1)已提交了韩国专利公开号为2012-0125465 (专利申请号为 2012-7018109,名称：干粉纤维蛋白封闭剂）。
[0015] 因此，本发明已经考虑到上述问题，本发明提供了一种将胶原和纤维蛋白混合的 组织封闭剂及其制备方法，其中，本发明的第一个目的是包括以下步骤：使用纤维蛋白原和 抑肽酶（aprotinin)混合第一材料；使用凝血酶、氯化钙和胶原混合第二材料；以及将第一 材料和第二材料互相混合以制备第三材料；根据本发明的第二个目的，作为物理强度比较 的结果，可以确认含有胶原的封闭剂显示了高强度；根据本发明的第三个目的，作为长期/ 短期降解性测试的结果，可以确认含有胶原的封闭剂显示了低降解性；根据本发明的第四 个目的，通过电子显微镜观察，可以确认将胶原和纤维蛋白原结合以显示稳定的结构；根 据本发明的第五个目的，作为使用软骨细胞、造骨细胞和脂肪来源细胞（adipose-derived cells)的生长和活力的比较结果，可以确认含有胶原的结构显示了良好的生长速率和高生 存力；根据本发明的第六个目的，可以确认胶原的内含物维持了高强度和稳定的结构并提 供了与细胞/血液具有亲和性的材料，因此大大帮助了删除/损坏区域的再生；本发明的第 七个目的是活化包含在血液中的血小板以诱导组织再生；以及本发明的第八个目的是显著 改善产品的质量和可靠性，从而满足作为用户的消费者的各种需求，从而给予好印象。
[0016] 技术方案
[0017] 根据本发明的第一个方面，提供了制备将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂的方 法，该方法包括：使用纤维蛋白原和抑肽酶混合第一材料；使用凝血酶、氯化钙和胶原混合 第二材料；以及将第一材料和第二材料互相混合以制备第三材料。
[0018] 根据本发明的另一个方面，提供了一种将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂，该 组织封闭剂通过以下步骤制备：使用纤维蛋白原和抑肽酶混合第一材料；使用凝血酶、氯 化钙和胶原混合第二材料；以及将第一材料和第二材料互相混合以制备第三材料。
[0019] 有益效果
[0020] 如上所述，本发明包括以下步骤：使用纤维蛋白原和抑肽酶混合第一材料；使用 凝血酶、氯化钙和胶原混合第二材料；以及将第一材料和第二材料互相混合以制备第三材 料。
[0021] 根据具有前述技术特征的本发明，作为物理强度比较的结果，可以确认含有胶原 的封闭剂显示了高强度。
[0022] 另外，根据本发明，作为长期/短期降解性测试的结果，可以确认含有胶原的封闭 剂显示了低降解性。
[0023] 另外，根据本发明，通过电子显微镜观察，可以确认将胶原和纤维蛋白原结合以显 示稳定的结构。
[0024] 另外，根据本发明，作为使用软骨细胞、造骨细胞和脂肪来源细胞的生长和活力的 比较结果，可以确认含有胶原的结构显示了良好的生长速率和高生存力。
[0025] 另外，根据本发明，可以确认胶原的内含物维持了高强度和稳定的结构并提供了 与细胞/血液具有亲和性的材料，因此大大帮组了删除/损坏区域的再生。
[0026] 另外，本发明是活化包含在血液中的血小板以诱导组织再生。
[0027] 本发明通过前述效果能显著改善产品的质量和可靠性，从而满足作为其用户的消 费者的各种需求，因此给予好印象，所以本发明非常有用的。
[0028] 下文中，结合附图将详细描述用于获得以上效果的本发明的优选实施方式。
【附图说明】
[0029] 图1为根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂的电子显微镜图像 (20, 000X，临界点干燥法）。
[0030] 图2为显示胶原与细胞粘合的概念图。
[0031] 图3为显示胶原中血小板活化的概念图。
[0032] 图4为显示了根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂的降解速率的 比较曲线。
[0033] 图5显示了在根据 本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂中的软骨细胞 的增殖速率曲线。
[0034] 图6说明证实在根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂中的软骨细 胞的增殖和生存力的图像。
[0035] 图7为显示了在根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂中的造骨细 胞的增殖速率的曲线。
[0036] 图8说明证实在根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂中的造骨细 胞的增殖和生存力的图像。
[0037] 图9说明证实在根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂中的脂肪来 源细胞的增殖和生存力的图像。
[0038] 图10为将根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂装载在双向注射器 中的状态图。
【具体实施方式】
[0039] 根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂及其制备方法如图1-10所 不O
[0040] 在以下说明中，当确定与本发明有关的已知功能或构成的详细描述使本发明的主 旨模糊时，省略该详细描述。
[0041] 另外，考虑到本发明中的功能，限定稍后描述的术语，因此由于所述术语可以由生 产者的意图或习惯进行解释，所以术语的定义纵观本说明书加以解释。
[0042] 首先，本发明包括使用纤维蛋白原和抑肽酶混合第一材料的步骤。
[0043] 另外，本发明包括使用凝血酶、氯化钙和胶原混合第二材料的步骤。
[0044] 另外，本发明包括将所述第一材料和所述第二材料互相混合以制备第三材料的步 骤，从而制备将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂。
[0045] 特别地，根据本发明，优选地，所述纤维蛋白原的浓度为65-130mg/mL，所述抑肽酶 的浓度为 1，000-3, 000KIU/mL。
[0046] 另外，优选地，所述凝血酶的浓度为40_600U/ml，所述氯化钙的浓度为 4-140mmol/mL，且所述胶原的浓度不超过60mg/mL。
[0047] 在本发明中，所述纤维蛋白原的浓度优选为65-130mg/mL。低于65mg/mL的纤维蛋 白原减弱物理强度，且超过130mg/mL的纤维蛋白原导致物理结构的密实化，致使孔尺寸降 低，从而抑制细胞活性，因此所述纤维蛋白原的浓度优选为65-130mg/mL。
[0048] 另外，所述抑肽酶的浓度优选为1，000-3, 000KIU/mL。低于1，000KIU/mL的抑肽酶 加速组合物的降解，且超过3, 000KIU/mL的抑肽酶增加引起过敏的风险，因此抑肽酶的浓 度优选为 1，000-3, 000KIU/mL。
[0049] 另外，所述凝血酶的浓度优选为40-600U/ml。低于40U/ml的凝血酶减弱组合物的 物理强度，且超过600U/ml的凝血酶导致组合物结构的密实化，因此与细胞无亲和性并迅 速增加凝胶化速率，不能在施用区域充当封闭剂，因此，所述凝血酶的浓度优选为40-600U/ ml 〇
[0050] 另外，所述氯化妈的浓度优选为4-140mmol/mL。低于4mmol/mL的氯化妈也减缓了 凝胶速率，且超过140mmol/mL的氯化钙由于高渗透压可能对细胞有不良影响，因此氯化钙 的浓度优选为4-140mmol/mL。
[0051] 最后，所述胶原的浓度优选不超过60mg/mL。特别地，所述胶原的优选浓度为 10_30mg/mL〇
[0052] 即，低于lOmg/mL的胶原减弱物理强度，且超过30mg/mL对降解性和稳定的结构有 不良影响，并且与细胞和血液无亲和性，因此所述胶原的浓度优选为10_30mg/mL。
[0053] 同时，制备根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂的方法具体描述如 下。
[0054] 首先，进行制备包括纤维蛋白原和抑肽酶的第一材料的步骤。
[0055] 之后，进行制备包括凝血酶、氯化钙和胶原的第二材料的步骤。
[0056] 然后，进行将所述第一材料放到双向注射器的一侧，并将所述第二材料放到所述 双向注射器的另一侧，随后将所述第一材料和所述第二材料互相混合的步骤，从而制备将 胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂。
[0057] 根据本发明，抑肽酶和钙溶液分别注入到纤维蛋白原和凝血酶中，且凝血酶与胶 原溶液混合，然后将所得溶液载入双向注射器中，从而制备将胶原和纤维蛋白混合的组织 封闭剂。
[0058] 根据本发明，可以通过经历用于制备将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂的各个 步骤来制备将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂。
[0059] 根据本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂及其制备方法，将通过给出的 实施例描述。
[0060] 实施例1
[0061 ] 比较本发明和现有技术之间的物理性质
[0062] 为了验证本发明的物理性质，使用物性仪（physical property meter)检测最大 应力、凝胶强度和抗张强度（tensile strength)。
[0063]I、样品制备
[0064] 1)在现有技术中，使用Greenplast产品。
[0065] 2)对于本发明的组分，将Greenplast的干燥的纤维蛋白原和凝血酶分别溶解在 抑肽酶溶液和外加的钙溶液中。在此，将凝血酶溶液与3%的胶原溶液混合。将所得溶液载 入双向注射器中。
[0066] 3)为物理性质的测量，将每个样品放入圆柱形模具（?12X 15mm)中制成一种形 状。
[0067] 2、物理性质的测量
[0068] 1)物性仪：流变仪（Rheometer) (CR-500DX，Sunscienctific流变仪）
[0069]2)测试项目：最大应力（N)，凝胶强度（g-cm)，抗张强度（g/cm2)
[0070]3)测试条件：入□距离（7. 5mm)，工作台速度（50mm/min)，最大应力（IOkg)，适配 器（No. I C> 20mm)
[0071] 3、测试结果
[0072] 表I
[0073]
[0074] 实施例2
[0075] 比较本发明和现有技术产品之间的降解性（长期/短期）
[0076] 为了验证本发明的组合物的降解性，检测纤维蛋白胶产品和材料对于预定期间的 降解性。
[0077] 1、降解性（短期）
[0078] 1)样品制备
[0079] _在现有技术中，使用Greenplast产品。
[0080] -对于本发明的组分，将Greenplast的干燥的纤维蛋白原和凝血酶分别溶解在抑 肽酶和外加的钙溶液中。在此，将凝血酶溶液与3%的胶原溶液混合。将所得溶液载入双向 注射器中。
[0081] _为物理性质的测量，将每个样品放入圆柱形模具（?8X 5mm)中制成一种形状。
[0082] 2)降解性验证的处理条件
[0083]-对于溶剂确认两种条件。确认仅使用DEME培养基的条件和使用含有Liberase TM的DMEM培养基的条件（Liberase TM的浓度设置为lOug/mL)。
[0084] -将样品放入12孔板中，降解方面以2小时为单位检查12小时内组合物的残留物 重量。
[0085] 3)测试结果
[0086] -可以确认，在通过酶处理的降解条件中，现有技术的制剂超过90%在12小时内 降解，本发明的组合物约80%保留了 12小时。在DMED条件下，在12小时未验证降解。
[0087]2、降解性（长期）
[0088] 1)样品制备
[0089] -在现有技术中，使用Greenplast产品。
[0090] -对于本发明的组分，将Greenplast的干燥的纤维蛋白原和凝血酶分别溶解在抑 肽酶溶液和外加的钙溶液中。在此，将凝血酶溶液与3%的胶原溶液混合。将所得溶液载入 双向注射器中。
[0091] -为物理性质的测量，将每个样品放入圆柱形模具（?12X 15mm)中制成一种形 状。
[0092] 2)降解性验证的处理条件
[0093] -DMEM用于溶剂，并在37。。下进行裸眼观察1个月。
[0094] 3)测试结果
[0095] -观察到本发明的组合物一个月或更长，而现有技术的制剂在三周内降解。可以确 认，本发明的组合物的降解周期长于现有技术的制剂。
[0096] 实施例3
[0097] 本发明的电子显微镜分析
[0098] 通过电子显微镜观察本发明的组合物的结构
[0099] 1、样品制备
[0100] -为制备组合物，制备Greenplast的纤维蛋白原溶液和含有胶原的凝血酶溶液/ 钙溶液。胶原溶液的浓度为3% (重量/体积）。
[0101] _为了电子显微镜观察，将每个制备的溶液施加到双向注射器，以在托盘上分配。
[0102] 2、方法
[0103] -将本发明的组合物在临界点干燥，然后用电子显微镜观察。
[0104] _通过将临界点干燥仪（Hitachi，HCP-2)中的乙醇处理进行组合物的临界点干 燥。
[0105] -将用于电子显微镜观察的样品切割并镀金，随后用SEM(Hitachi，S3500)观察。
[0106] -电子显微镜分析在20, 000倍放大率下进行。
[0107] 3、测试结果
[0108] 作为在20, 000倍放大率下电子显微镜的观察结果，可以确认，胶原和纤维蛋白互 相交联。还观察到胶原的纤维结构。可以预测到该材料的交联增强了物理性质。
[0109] 实施例4
[0110] 测试本发明的细胞相容性和生长（软骨细胞）
[0111] 为了验证在本发明的组合物 中软骨细胞的增殖和活力，使用CCK-8检测和 Calcein-AM&EthD-l染色。
[0112] 1、细胞和组合物
[0113] -使用排除人类的动物软骨细胞。在组合物混合液体中的细胞数量为 12, 000, 000〇
[0114] -对于组合物，将Greenplast (为纤维蛋白胶产品）分别与3 %和6 %的胶原混合。
[0115] -通过将Greenplast的干燥的纤维蛋白原溶解在ImL的含有软骨细胞的溶液中， 并将凝血酶/钙溶液与每种浓度的ImL的胶原溶液混合制备组合物。
[0116] -使用含有软骨细胞的纤维蛋白原溶液和含有胶原的凝血酶溶液制备总量2mL的 胶原-纤维蛋白溶液。
[0117] -对于培养，将制备的胶原-纤维蛋白组分分配在24孔板中，每孔0. 2mL，并且进 行观察20天，同时每2-3天更换DMEM培养基。
[0118] 2、CCK_8 检测
[0119] -从含有培养材料的每个孔（24孔板）中去除培养基。
[0120] -将ImL新培养基放入每个孔中。
[0121] -在每个孔中加入IOOuL CCK-8(Dojindo，CK04-ll)试剂，相当于培养基体积的 10%，随后在5% CO2的培养箱中于37°C下反应3小时。
[0122] --旦该反应完成，使用酶标仪（microplate reader)读取反应液体的吸光度 (450nm)〇
[0123] -使用测量的OD值确认每个培养周期的细胞增殖。
[0124] 3、Calcein-AM&EthD-l 染色
[0125] -通过将缓冲溶液分别与2yM和4yM的Calcein AM&EthD-l的VE/ DEADViability/CytotoxiciLIty 试剂盒（Assay Kit) (Invitrogen，L3224)混合制备工作 溶液。
[0126] -将该培养的材料转移到新的24孔板中，然后在其中放入ImL的所述工作溶液，随 后在光被阻断20分钟的条件下反应。之后，利用荧光显微镜观察活细胞和死细胞。观察到 活细胞为绿色，且观察到死细胞为红色。
[0127] 4、测试结果
[0128] A、CCK-8 检测（图 5)
[0129] B、Calcein-AM&EthD-l 染色（图 6)
[0130] 实施例5
[0131] 测试本发明的细胞生物相容性（造骨细胞）
[0132] 为了验证在本发明的组合物中造骨细胞的增殖和生存力，使用CCK-8检测和 Calcein-AM&EthD-l 染色。
[0133] 1、细胞和组合物
[0134] -使用排除人类的动物造骨细胞。在组合物混合液体中的细胞数目为 12, 000, 000〇
[0135] -通过将Greenplast (为纤维蛋白胶产品）分别与3%和6%的胶原混合配备组合 物。
[0136] -通过将Greenplast的干燥的纤维蛋白原溶解在ImL的含有软骨细胞的溶液中， 并将凝血酶/钙溶液与每种浓度的ImL的胶原溶液混合来制备组合物。
[0137] -使用含有造骨细胞的纤维蛋白原溶液和含有胶原的凝血酶溶液制备总量2mL的 胶原-纤维蛋白溶液。
[0138] -对于培养，将制备的胶原-纤维蛋白组分分配在24孔板中，每孔0. 2mL，并进行 观察20天，同时每2-3天更换a -DMEM培养基。
[0139] 2、CCK_8 检测
[0140] -从每个孔（24孔板）中去除含有培养材料的培养基。
[0141] -将ImL新培养基放入每个孔中。
[0142] 在每个孔中加入IOOuL CCK-8(Dojindo，CK04-ll)试剂，相当于培养基体积的 10%，随后在5% CO2的培养箱中于37°C反应3小时。
[0143] --旦该反应完成，使用酶标仪读取反应液体的吸光度（450nm)。
[0144] -使用测量的OD值确认每个培养周期的细胞增殖。
[0145] 3、Calcein-AM&EthD-l 染色
[0146] -通过将缓冲溶液分别与2 yM和4 yM的Calcein AM&EthD-l的VE/ DEADViability/CytotoxiciLIty 试剂盒（Invitrogen, L3224)混合制备工作溶液。
[0147] -将该培养的材料转移到新的24孔板中，然后在其中放入ImL的所述工作溶液，随 后在光被阻断20分钟的条件下反应。之后，利用荧光显微镜观察活细胞和死细胞。观察到 活细胞为绿色，观察到死细胞为红色。
[0148] 4、测试结果
[0149] A、CCK-8 检测（图 7)
[0150] B、Calcein-AM&EthD-l染色（图 8)
[0151] 实施例6
[0152] 测试本发明的细胞生物相容性（脂肪来源细胞）
[0153] 为了验证在本发明的组合物中脂肪来源细胞的增殖和生存力，使用CCK-8检测和 Calcein-AM&EthD-l染色。
[0154] 1、细胞和组合物
[0155] _使用脂肪来源细胞。在组合物混合液体中的细胞数目为12, 000, 000。
[0156] _通过将Greenplast (为纤维蛋白胶产品）与3%的胶原混合配备组合物。
[0157] _通过将Greenplast的干燥的纤维蛋白原溶解在ImL的含有脂肪来源细胞的溶液 中，并将凝血酶/钙溶液与每种浓度的ImL的胶原溶液混合来制备组合物。
[0158] _使用含有脂肪来源细胞的纤维蛋白原溶液和含有胶原的凝血酶溶液制备总量 2mL的胶原-纤维蛋白溶液。
[0159] -对于培养，将制备的胶粒-纤维蛋白组分分配在24孔板中，每孔0. 2mL，并进行 观察20天，同时每2-3天更换DMEM培养基。
[0160]2、Calcein-AM&EthD-l染色
[0161] -通过将 PBS 分别与 2yM和 4yM 的 Calcein AM&EthD-l 的 VE/DEADViability/ CytotoxiciLIty试剂盒（Invitrogen，L3224)混合制备工作溶液。
[0162] -将该培养的材料转移到新的24孔板中，然后在其中放入ImL的所述工作溶液，随 后在光被阻断20分钟的条件下反应。之后，利用荧光显微镜观察活细胞和死细胞。
[0163] 3、测试结果
[0164] -Calcein-AM&EthD-l染色（图 9)
[0165] 同时，对于本申请的前述特征，本发明可以以各种方式修改和以多种不同的形式 体现。
[0166] 然而，需要注意的是，并非旨在将本发明限制于在详细的说明中所描述的具体实 施方式，而旨在包括所有由附带的权利要求书限定的属于本发明的技术思想和技术范围的 修改、等同或替换。
[0167] 工业实用性
[0168] 由于实际上可以重复相同的结果，本发明的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂 及其制备方法的技术精神足以值得保护，并且尤其是实施本发明可以促进技术发展并有助 于工业发展。
【主权项】
1. 一种制备将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂的方法，该方法包括： 使用纤维蛋白原和抑肽酶混合第一材料； 使用凝血酶、氯化钙和胶原混合第二材料；以及 将所述第一材料和所述第二材料互相混合以制备第三材料。2. 根据权利要求1的方法，其中，所述纤维蛋白原的浓度为65-130mg/mL，所述抑肽 酶的浓度为1，000-3,OOOKIU/mL，所述凝血酶的浓度为40-600U/ml，所述氯化钙的浓度为 4-140mmol/mL，所述胶原的浓度不高于60mg/mL。3. 权利要求2所述的方法，其中，所述胶原的浓度为10-30mg/mL。4. 权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，该方法包括： 制备包括纤维蛋白原和抑肽酶的第一材料； 制备包括凝血酶、氯化钙和胶原的第二材料；以及 将所述第一材料放入双向注射器的一侧，并将第二材料放入所述双向注射器的另一 侦牝随后将所述第一材料和第二材料互相混合。5. 权利要求4所述的方法，其中，分别将抑肽酶和氯化钙注入到纤维蛋白原和凝血酶 中，并将所述凝血酶与胶原溶液混合，随后将所得溶液载入双向注射器中。6. 通过权利要求1-5中任意一项所述方法制备的将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭 剂。
【专利摘要】本发明涉及一种将胶原和纤维蛋白混合的组织封闭剂及其制备方法。为此，本发明的方法包括以下步骤：使用纤维蛋白原和抑肽酶混合第一材料；使用凝血酶、氯化钙和胶粒混合第二材料；通过将所述第一材料和所述第二材料混合制备第三材料。由该方法制备的组织封闭剂可以弥补缺点，即商业市场上目前可获得的纤维封闭剂的强度和降解性。而且，本发明的组织封闭剂为亲细胞的并能活化包含在血液中的血小板以诱导组织再生。因此，产品的质量和可靠性能显著改善以满足作为用户的消费者的各种需求，从而呈现好形象。
【IPC分类】A61K38/36, A61L33/12
【公开号】CN104902937
【申请号】CN201380064818
【发明人】柳志喆, 吕世根, 金壮勋, 李准根, 徐东三, 张晶皓
【申请人】世元世龙技术株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年1月9日
【公告号】CA2894815A1, EP2932989A1, US20150320904, WO2014092239A1
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