肽溶液的灌装加工法
肽溶液的灌装加工法
【专利说明】肽溶液的灌装加工法
[0001] 序列表
[0002] 本说明书参考于2013年7月3日作为命名为"2004837-0032_Sequences_ST25" 的ASCII.txt文件以电子形式提交的序列表。该.txt文件于2013年6月10日生成，大小 为 11KB。
[0003] 发明背景
[0004] 可向患者施用纯化的蛋白质和/或肽混合物以用于多种治疗用途。经制备用于向 患者施用的肽溶液在使用前必须是无菌的。肽和生物技术产品的纯化和包装通常可以是异 常困难的。所述产品非常复杂，可能对光、温度、压力、PH、辐射、机械干扰敏感并且另外地 对环境条件敏感。此外，该产品可发生物理改变或容易降解，即使在理想的加工条件下亦如 此。用于一些蛋白质（包括寡肽）的合适的灭菌方法包括肽溶液的过滤。可定制过滤器的 尺寸来保留（即从肽溶液中除去）颗粒、微生物和病毒，同时蛋白质能够通过膜。
[0005] 因此，人们希望开发以大体上不损坏肽的方式过滤和包装肽溶液的方法，然而该 方法仍允许随时间推移的适当高的处理通量（即，过滤速度）。此外，人们希望开发通常适 用于任何蛋白质的过滤法，以便可以以高效率过滤（例如，无菌过滤）一般肽而不发生肽的 重大损坏/损失。
[0006] 发明概述
[0007] 在各种实施方案中，本发明包括制造和纯化肽溶液的方法。在一些实施方案中，该 方法包括以下步骤：第一脱气步骤，其中通过降压来对含肽混合物进行脱气；通过无菌过 滤器过滤所述混合物；和第二脱气步骤，其中通过振动和降压来对滤液进行脱气。
[0008] 在一些实施方案中，制造和纯化本发明的肽溶液的方法不包括将混合物通过无菌 过滤器进行过滤。实际上，在一些实施方案中，本发明的一个方面是认识到，某些特定肽溶 液可具有使得它们顺从于对于其它肽溶液可以是有效的或可以是无效的特定制备方法的 特征。在一些实施方案中，不利用过滤器的方法是想要的。可选地或此外，在一些实施方案 中，提供的制造和纯化本发明的肽溶液的方法包括无需过滤的热灭菌。在一些实施方案中， 本发明涵盖认识：不需要过滤的某些肽溶液顺从于使用包括热灭菌和/或不包括过滤的方 法进行的制造和/或纯化。
[0009] 在一些实施方案中，包括过滤步骤的方法利用具有小于约0. 45 μL?的平均孔径的 无菌过滤器。
[0010] 在一些实施方案中，第一脱气步骤包括以小于约-0.1 MPa/分钟的速率降低混合 物的压力。在一些实施方案中，第一脱气步骤包括使压力降低约至少-〇.〇5MPa。在一些实 施方案中，将更低的压力维持至少约30分钟。
[0011] 在一些实施方案中，第二脱气步骤包括以150转/分钟振动混合物，并且振动运动 的偏心距离在位置编号6与8之间。在一些实施方案中，第二脱气步骤包括使压力降低约 至少-〇. 05MPa。
[0012] 在一些实施方案中，所述方法还包括将肽与溶剂混合，随后进行第一脱气步骤。
[0013] 在一些实施方案中，利用的肽溶液为RADA-16(SEQ ID ΝΟ:1)肽溶液。在一些实施 方案中，利用的肽溶液为IEIK13(SEQ ID N0:39)肽溶液或包含IEIK13(SEQ ID N0:39)肽 溶液。在一些实施方案中，利用的肽溶液为表1中出现的肽的溶液。在一些实施方案中，利 用的肽溶液为表2中出现的肽的溶液。在一些实施方案中，利用的肽溶液为两种或更多种 肽的溶液。
[0014] 在一些特定实施方案中，本发明提供了不存在一个或多个过滤步骤的制造和纯化 IEIK13(SEQ ID NO:39)的方法。在一些实施方案中，本发明提供了不包括任何过滤步骤的 制造和纯化IEIK13(SEQ ID NO: 39)的方法。本发明的一个特征是其认识到，至少对于某些 IEIK13(SEQ ID N0:39)溶液，这样的过滤可能不是灭菌所需的。
[0015] 在一些实施方案中，溶剂为水。在一些实施方案中，所述方法还包括在第二脱气步 骤之后用混合物对制品进行无菌灌装。在一些实施方案中，在第二脱气步骤后至少5小时 灌装所述制品。在一些实施方案中，以至少约2个制品/分钟、约3个制品/分钟、约4个制 品/分钟、约5个制品/分钟、约6个制品/分钟、约7个制品/分钟、约8个制品/分钟、 约9个制品/分钟、约10个制品/分钟、约11个制品/分钟、约12个制品/分钟、约13个 制品/分钟、约14个制品/分钟、约15个制品/分钟、约16个制品/分钟、约17个制品/ 分钟、约18个制品/分钟、约19个制品/分钟或约20个制品分钟或其倍数的速率灌装制 品；在一些实施方案中，以约100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000或更多个 制品/小时的速率灌装制品。
[0016] 在一些实施方案中，高速灌装机（例如，诸如FLS 3000，Bosch ;1I/1F/1I1VI0CY， 8I/8F/8IS-CY 或 10I/10FF/10I(KT Manufacturing Co. Ltd.)用于灌装制品；在一些实施 方案中，高速灌装机为灌装嘴或包含多个灌装嘴（例如，2、3、4、5等）。在一些实施方案中， 这样排列和构造所述机器以便每一个喷嘴具有以至少约2个制品/分钟、约3个制品/分 钟、约4个制品/分钟、约5个制品/分钟、约6个制品/分钟、约7个制品/分钟、约8个 制品/分钟、约9个制品/分钟、约10个制品/分钟、约11个制品/分钟、约12个制品/ 分钟、约13个制品/分钟、约14个制品/分钟、约15个制品/分钟、约16个制品/分钟、 约17个制品/分钟、约18个制品/分钟、约19个制品/分钟或约20个制品/分钟的速率 或以约100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000或更多个制品/小时的速率灌 装制品的能力；和/或排列和构造所述机器（例如，在一些实施方案中，由于多个喷嘴的存 在）以以至少约 1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、 13000U4000或至少约15000个制品/小时的速率灌装制品。在一些实施方案中，所提供 的方法将此类高速灌装机的能力利用至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%或至少100%。
[0017] 在一些实施方案中，所述制品为注射器、小袋、小瓶、管。在一些实施方案中，所述 方法还包括用气体可渗透材料包装灌装的制品和所述灌装步骤后的灭菌步骤。
[0018] 在一些实施方案中，气体灭菌通过环氧乙烷气体来进行。在一些实施方案中，气体 灭菌通过过氧化氢气体来进行。
[0019] 在一些实施方案中，制品利用单包装来进行。
[0020] 在一些实施方案中，制品利用双包装来进行。
[0021] 在一些实施方案中，在约0. 1 -0.6兆帕（MPa)的压力下进行过滤。在一些特定实 施方案中，在约〇· IMPa、约0· 2MPa、约0· 3MPa、约0· 4MPa、约0· 5MPa或约0· 6MPa的压力下 进行过滤。
[0022] 在一些实施方案中，在约室温下进行过滤。
[0023] 在一些实施方案中，所述过滤器由选自以下的材料构造：硝酸纤维素、醋酸纤维 素、乙烯基聚合物、氟碳化合物、聚乙烯、超高分子量聚乙烯、聚丙烯、EVA共聚物和α-烯 烃、茂金属烯烃聚合物、PFA、MFA、PTFE、聚碳酸醋、乙烯共聚物、聚酰胺、尼龙、聚醋、纤维素、 醋酸纤维素、再生纤维素、纤维素复合材料、聚砜、聚醚砜、聚芳砜、聚苯砜、聚丙烯腈、聚偏 二氟乙烯（PVDF)及其混物物。
[0024] 在一些实施方案中，过滤器由聚醚砜构造。
[0025] 在一些实施方案中，过滤步骤包括在第一压力下灌装过滤器，随后升高压力以进 行过滤的步骤。在一些实施方案中，将附加罐置于压力源与过滤进料罐之间以保持压力作 为进行过滤的压力源。在一些特定实施方案，用于灌装过滤器的第一压力相对较弱。在一 些实施方案中，第一压力低于约〇· OIMPa。在一些实施方案中，第一压力为约0· 05MPa。
[0026] 在一些实施方案中，测试过滤器的完整性。在一些实施方案中，使用完整性测 试仪（例如，诸如 INTEGRITEST?' 4 系统，Millipore ; PALLTRONIC? AquaWIT Series过滤器完整性测试系统或PALLTRONIC? Flowstar Series完整性测试仪；Pall Corp. ;Meissner's ACCUFLUX? 自动化过滤器完整性测试仪，Meissner Filtration Products)测试过滤器的完整性。
[0027] 在一些实施方案中，洗涤过滤器，随后进行完整性测试。在一些特定实施方案中， 用水洗涤过滤器，随后进行完整性测试。在一些特定实施方案中，用热水和/或通过高压水 洗涤过滤器，随后进行完整性测试。在一些特定实施方案中，利用蒸汽和/或高压灭菌洗涤 过滤器，随后进行完整性测试。
[0028] 在一些实施方案中，使用刮刀将几乎所有溶液从过滤进料罐送入过滤器。在一些 实施方案中，过滤步骤包括使用清管器（pig)来帮助过滤。在一些实施方案中，在平行操作 的两个过滤器中进行过滤步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括清除步骤，该步骤包括 将蒸汽添加至过滤和脱气设备。
[0029] 定义
[0030] "互补的"意指能够在来自支架中的相邻肽的亲水性残基之间形成离子或氢键合 相互作用，肽中的每一个亲水性残基与相邻肽上的亲水性残基氢键或离子配对，或暴露于 溶剂。
[0031] "结构上相容的"意指能够维持足够恒定的肽内距离以允许支架形成。在本发明的 某些实施方案中，肽内距离的变化小于4、3、2或1埃。如果足够稳定的力存在，还可预期肽 内距离的更大变化可以不阻止支架形成。该距离可基于分子建模或基于先前已报道的简化 程序（美国专利号5, 670, 483)来计算。在该方法中，肽内距离通过获取对中每一个氨基酸 的侧链上的无支链原子的数目之和来计算。例如，赖氨酸-谷氨酸离子对的肽内之和为5+4 =9个原子，谷氨酰胺-谷氨酰胺氢键合对的距离为4+4 = 8个原子。使用每原子3埃的 换算因子，具有赖氨酸-谷氨酸对和谷氨酰胺-谷氨酰胺对（例如，9个对8个原子）的肽 的肽内距离的变化为3埃。
[0032] 术语"纯的"用于指示本文中所述的肽不含其它化学药品种类（包括所述肽的缺 失加合物和具有不同长度的肽）所达到的程度。
[0033] 如本文中所用，当经 历机械搅拌时，如果水凝胶诸如肽水凝胶大体上保持在物理 搅拌之前表征水凝胶的物理性质（诸如弹性、粘度等），则其是"相对于机械或物理搅拌稳 定的"。水凝胶不必保持其形状或尺寸，并且当经历机械搅拌时可被片段化成更小的碎片， 同时在机械或物理搅拌方面仍然被称为是稳定的。术语"稳定的"，除与该短语一起使用时 外，不具有该含义。
[0034] 如本文中所用，术语"纳米纤维"是指具有纳米级尺寸的纤维。通常地纳米级纤维 具有500nm或更小的直径。根据本发明的某些实施方案，纳米纤维具有小于IOOnm的直径。 根据本发明的某些其它实施方案，纳米纤维具有小于50nm的直径。根据本发明的某些其它 实施方案，纳米纤维具有小于20nm的直径。根据本发明的某些其它实施方案，纳米纤维具 有10至20nm的直径。根据本发明的某些其它实施方案，纳米纤维具有5至10纳米的直径。 根据本发明的某些其它实施方案，纳米纤维具有小于5nm的直径。
[0035] 本发明的某些实施方案的详述
[0036] 肽和生物技术产品的纯化和包装通常可以是异常困难的。所述产品非常复杂，可 能对光、温度、压力、pH、辐射、机械干扰敏感并且另外地对环境条件敏感。此外，该产品可发 生物理改变或容易降解，即使在理想的加工条件下亦如此。
[0037] 我们已发现一系列使得能够对肽混合物（包括自组装肽混合物）进行灭菌和包装 的方法。提供的方法不利用热、化学药品和辐射法来进行灭菌，因为它们可降解肽。根据本 发明，过滤是用于肽混合物的灭菌的特别有用的方法。
[0038] 在一个方面，本发明涵盖这样的认识，即依赖于物理灭菌法提出基于肽混合物的 流变学的问题。例如，肽混合物的粘度可随着时间推移而改变，或只是非常高，这样看起来 像凝胶。提供的技术在自组装肽的纯化中是特别有用的，所述纯化可造成特殊困难。本发明 涵盖一系列操作和操作条件的发现，所述操作和操作条件可（a)产生已灭菌的肽混合物， (b)给包装（例如，注射器）灌装肽混合物并对其进行灭菌，和/或（c)根据现代优良生产 实践（cGMP)清洁处理设备。在一些实施方案中，本发明的过滤设备利用微米尺寸的过滤器 (例如，0. 2微米聚醚砜过滤器，但也可使用其它尺寸和构造材料）。在一些实施方案中，提 供的过滤法包括"预涂覆"过滤器（即，在升高压力以进行主动过滤之前用介质灌装过滤器 以通过在低压下除去过滤器壳体中的空气来完全覆盖过滤器表面）。在一些实施方案中，提 供的过滤法牵涉使用管道辅助装置（例如，"清管器"）或一些其它机械方式（例如，刮擦） 来确保最大量的肽混合物通过过滤器。在一些实施方案中，在脱气步骤（例如，通过减压脱 气）之后进行提供的过滤法。在一些实施方案中，在提供的过滤法之后进行脱气步骤（例 如，通过振动脱气）。在一些实施方案中，提供的过滤法包括在过滤后进行灭菌过滤器的完 整性测试程序。在一些实施方案中，用肽混合物灌装的注射器的表面的灭菌包括使用杀菌 气体（例如，环氧乙烷、过氧化氢）来避免注射器中肽溶液的降解。
[0039] 自组装肽
[0040] 适合与本发明一起使用的肽序列包括美国专利No. 5, 670, 483和5, 955, 343以及 美国专利申请No. 09/778, 200 (所有所述专利或专利申请的内容通过引用整体并入本文） 中报道的那些序列。这些肽链由交替的亲水性和疏水性氨基酸组成，所述多肽能够自组装 以在电解质，诸如单价阳离子存在的情况下形成极度稳定的β折叠宏观结构。肽链是互 补的和结构上相容的。结构中的肽链的侧链分成两面，具有带电离子侧链的极性面和具有 丙氨酸或其它疏水基团的非极性面。这些离子侧链彼此自身互补，因为带正电荷和带负电 荷的氨基酸残基可形成互补离子对。这些肽链因而被称为离子型自身互补肽或I型自组 装肽。如果离子残基通过一个带正电荷的残基与一个带负电荷的残基交替（-+-+-+-+)，则 肽链被描述为"模量Γ;如果离子残基通过两个带电荷的残基与两个带负电荷的残基交替 (--++--++)，则肽链被描述为〃模量II"。与本发明一起使用的示例性肽序列包括表1中所 列的那些肽序列。在一些实施方案中，与本发明一起使用的肽序列具有至少12或16个氨 基酸残基。D-氨基酸和L-氨基酸可用于产生肽链。将它们在相同链中混合，或可制备具有 其本身仅包括D-氨基酸和L-氨基酸的单个肽链的肽组合物。
[0041] 表1.代表性自组装肽
[0042]
[0043] N/A指示不适用
[0044] *当在含有NaCl的溶液中温育时，这些肽形成β折叠，然而一直未观察到它们自 组装以形成宏观支架。
[0045] 许多模量I和II自身互补肽序列，诸如ΕΑΚ16、ΚΑΕ16、RAD16、RAE16和KAD16先 前已进行了分析（表1)。还已研宄了含有16个氨基酸的模量IV离子自身互补肽序列诸如 EAK16-IV、KAE16-IV、DAR16-IV和RAD16-IV。如果这些自组装肽链中的带电荷的残基被取 代（即，带正电荷的赖氨酸被带正电荷的精氨酸替代和带负电荷的谷氨酸被带负电荷的天 冬氨酸替代），则对自组装过程基本上没有显著影响。然而，如果带正电荷的残基赖氨酸和 精氨酸被带负电荷的残基天冬氨酸和谷氨酸替代，则肽链可不再进行自组装以形成宏观支 架；然而，它们仍然可在盐存在的情况下形成β折叠结构。替代带电荷的残基或除了带电 荷的残基以外，还可将形成氢键的其它亲水性残基诸如天冬酰胺和谷氨酰胺掺入肽链。如 果将肽链中的丙氨酸变成更加疏水的残基诸如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸，则这 些肽链具有更大的自组装倾向性和以增强的强度形成肽基质。一些具有与前述肽链相似的 组成和长度的肽形成α螺旋和随机卷曲而非β折叠，并且不形成宏观结构。因此，除了自 身互补以外，其它因素对于宏观支架的形成也可能是非常重要的，诸如链长度、分子间相互 作用的程度和形成交错阵列的能力。
[0046] 其它自组装肽链可通过使任何自装肽链的氨基酸序列改变单个氨基酸残基或多 个氨基酸残基来产生。此外，特定细胞识别配体诸如RGD或RAD至肽支架中的整合可促进封 装细胞的增殖。在体内，这些配体还可将细胞从支架外部吸引至支架，其中它们可侵入支架 或另外地与封装细胞相互作用。为了增强所得支架的机械强度，可将半胱氨酸掺入肽链以 允许二硫键形成，或可掺入具有芳环的残基，随后通过暴露于紫外光将其交联。支架的体内 半衰期还可通过将蛋白酶切割位点整合进支架，从而允许支架被酶促降解来进行调节。还 可对相同的肽支架进行任何上述改变的组合。
[0047] 可形成具有不同程度的刚度或弹性的自组装纳米级结构。然而不希望受任何理论 束缚，低弹性在允许细胞迀移进入支架和在驻留在支架中后彼此通讯的方面可以是重要因 素。本文中所述的肽支架通常具有在I-IOkPa的范围内的低弹性模量，如在标准锥板流变 仪中测量的。这样的低值允许支架作为细胞收缩的结果而变形，该变形可为细胞间通讯提 供工具。此外，这样的模量允许支架将生理应激传递给在其中迀移的细胞，刺激所述细胞产 生在显微结构上比疤痕更接近天然组织的组织。支架刚度可受通过多种手段控制，包括肽 序列的改变、肽浓度的改变和肽长度的改变。还可使用用于增加刚度的方法，诸如通过将生 物素分子附接于肽链的氨基或羧基末端，或附接于氨基末端与羧基末端之间，随后可将所 述生物素分子交联。
[0048] 连接的肽链可使用标准f-moc化学来合成以及使用高压液相色谱来纯化。在初始 合成后，可通过冷冻干燥保存肽链来进行贮存。肽支架的形成可通过添加本文中所述的电 解质来起始。具有芳族侧链的疏水性残基可通过暴露于紫外辐射来交联。交联的程度可通 过暴露于紫外光的预定长度和预定肽链浓度来精确地控制。交联的程度可使用标准方法， 通过光散射、凝胶过滤或扫描电子显微镜来测定。此外，交联的程度还可通过在利用蛋白酶 诸如基质金属蛋白酶消化后支架的HPLC或质谱分析来检查。如本文中所述的，可在交联之 前和之后测定支架的材料强度。
[0049] 表2用于交联的代表性肽序列
[0050]
[0051] 必要时，还可形成具有预定形状或体积的肽支架。为了形成具有所需几何形状或 尺寸的支架，将肽水溶液添加至预成型的铸模，如本文中所述，通过添加电解质诱导肽链自 组装成支架。所得的肽支架的几何形状和宏观尺寸由施用的肽溶液的浓度和量、用于诱导 支架组装的电解质的浓度和铸造装置的尺寸控制。
[0052] 必要时，肽支架可使用各种生物物理和光学仪器诸如圆二色性（⑶）、动态光散射、 傅立叶变换红外（FTIR)、原子力显微镜（ATM)、扫描电子显微镜（SEM)和透射电子显微镜 (TEM)来表征。例如，生物物理方法可用于测定肽支架中β折叠二级结构的程度。此外，纤 丝和孔径、纤维直径、长度、弹性和体积分数可使用扫描和透射电子显微镜术的定量图像分 析来测定。支架还可使用几种标准机械测试技术测量肿胀的程度、PH值和电解质浓度对支 架形成的影响、各种条件下的水合水平以及拉伸强度来检查。
[0053] 如下文中所述，自组装肽的水溶液是粘稠至凝胶样的，其粘度随时间而变化。当未 对溶液施加力（例如，剪切）时，肽溶液的粘度变得越来越高。其需要持续的力来保持自组 装肽溶液的低粘度。自组装肽的性质使配制比大多数液体配制更加困难。制造方法应当被 设计来使自组装肽满足医疗用的管理要求，并在商业规模制造中减少产品的损失，如下文 中描述的。
[0054] 溶解
[0055] 合成肽由制造商制备（例如，合成的），并且在合成后以干燥形式（例如，冻干的） 贮存。为了最终的纯化/灭菌和/或包装，应当将干燥的肽以适合用于最终用途/施用的 浓度溶解于溶剂（例如，水）中。
[0056] 灌装加工法以溶解步骤开始。在最广泛的实施方案中，通过将粉末状肽（例如，冷 冻干燥或冻干的肽）与水混合开始溶解。在一些实施方案中，水是抑菌性注射用水。在一些 实施方案中，水是无菌、去离子和/或蒸馏水。将肽溶解，以使肽的浓度为约〇. 1重量％至 约5重量％ (例如，约0. 2重量％、约0. 3重量％、约0. 4重量％、约0. 5重量％、约0. 75重 量％、约1.0重量％、约1.25重量％、约1.5%重量、约1.75重量％、约2.0重量％、约2. 25 重量％、约2. 5重量％、约2. 75重量％和其间的范围）。在一些实施方案中，该浓度是用于 最终应用和/或最终用途的溶液中的肽的浓度。肽溶液的最终应用或最终用途可影响所述 肽在溶液中溶解的浓度或确定所述浓度。在一些实施方案中，肽溶液具有约1重量％至约3 重量％的肽浓度。在重量百分比的计算中，所述肽粉末的水分含量可考虑在内。在一些实 施方案中，肽粉末的水分含量为肽粉末的约1重量％至约10重量％ (例如，约5重量％ )。 [0057] 在一些实施方案中，将肽粉末添加至预定量的水中。在一些实施方案中，缓慢地或 逐步地添加肽粉末以便在添加随后量的肽粉末之前，肽的一个添加完全溶解。因为本文中 所描述的灌装加工的一个目标是对肽溶液的灭菌，应采取适当地小心，以防止细菌污染。如 果可能的话，应对用于溶解的设备进行高压或蒸汽灭菌，或如果高压灭菌不适合于设备的 特定部分，通过照射（例如，紫外辐射）消毒。
[0058] 在溶解过程中，搅拌溶液。再次地由于粘度和溶解速率的原因，控制搅拌速度和时 间。在一些实施方案中，所使用的混合器包括轴向或径向流动叶轮和/或推进器、桨或涡轮 形叶轮。在一些实施方案中，混合器以不小于约500rpm的速度运行，但缓慢地从停止速度 升至该速度。例如，当添加肽粉末时，混合器始于约200rpm的速度。一旦所有粉末溶解，则 将混合器速度增加至约500rpm。混合器（用于初始粉末添加或用于混合溶解的粉末）的旋 转速度可在约30rpm至约1000 rpm (例如约50rpm、约60rpm、约75rpm、约lOOrpm、约120rpm、 约 180rpm、约 240rpm、约 360rpm、约 480rpm、约 600rpm、约 720rpm、约 840rpm、约 960rpm 以 及其间的范围）的范围内。本领域普通技术人员将理解，所述混合器的速度在很大程度上 取决于混合容器的容积和根据叶轮的速度，这又取决于所述叶轮的直径。其中V =叶轮的 速度，d =叶轮的直径，r =旋转速度，该速度可以通过V = π *d*r计算，并且随着容器尺寸 按比例扩大，应保持成比例。
[0059] -旦达到该速度，继续混合约30分钟（例如，约30分钟、约40分钟、约45分钟、 约60分钟和其间的值）。维持混合器速度的速率，以使溶液不偏离至这样的程度：溶液的 液滴从本体溶液产生并被抛向混合容器的壁。溶液的表面应该是连续的，虽然它并不需要 是水平或平面的（例如，涡流可在混合期间发生，然而，其表面应是连续的表面）。
[0060] 在搅拌和溶解过程中，从混合罐获取样品，并检查其以监测溶解。将样品离心以除 去任何夹带的气体。随后目视检查样品，以确保该肽的溶解，还可通过光度计检查所述样品 的溶解肽的含量。如果检查表明存在未溶解的粉末，则可延伸搅拌时间。如果检查表明肽 粉末溶解，则可将该溶液通过灌装加工法的下一阶段。
[0061] 如果所述溶液大体上完全溶解，则灌装加工法的下一步将是对溶液进行脱气（例 如，除气）。我们的工作表明，大体上脱气或脱气的溶液以更高效的方式继续通过过滤，在过 滤器中产生更少的废物和/或不太频繁的堵塞。
[0062] 第一脱气
[0063] 如本文中所用，脱气相当于除去气体，这是其中从液体移除溶解或夹带的气体 (例如，空气），或减少其在液体中的量的过程。第一脱气步骤通过任何可接受的脱气方法 来进行。例如，通过真空、离心、振动、液体-气体膜分离或使溶液自然脱气。在一些实施方 案中，脱气步骤通过真空（例如，通过改变对溶液的压力）来进行。在一些实施方案中，施 加的真空为至少-〇· OIMPa、-0· 015MPa、-0· 02MPa、-0· 025MPa、-0· 03、MPa、-0· 035MPa、-0· 04MPa、_0. 045MPa、_0. 05MPa、_0. 055MPa、_0. 06MPa、_0. 065MPa、_0. 07MPa、_0. 075MPa、_0. 08MP a、-0. 085MPa、-0. 09MPa、-0. 095MPa、-0. 098MPa、-0. 099MPa、-0.1 MPa 或以上。在一些实施 方案中，施加的真空为约-O.IMPa。本发明尤其涵盖这样的认识，即压力的下降速率（或真 空的升高）影响脱气方法的功效和效率，以及最终的过滤法。在一些实施方案中，压力下降 的速率是不超过约-〇. OlMPa/分钟（例如，约-0. 005MPa/分钟，大约-0. 0025MPa/分钟， 约-0.0 OlMPa/分钟，以及其间的范围）。在一些实施方案中，压力降低的速率取决于待脱气 的溶液的总体积。
[0064] 在一些实施方案中，脱气装置配备有脱气室（用于暂时保持所述肽溶液）和抽吸 装置（用于降低在脱气室中的压力）。抽吸装置可以是产生真空的任何设计或操作。在一 些实施方案中，所述装置可使用水射流的动态压力，或可以是任何类型的真空泵，或类似物 可以用作抽吸装置。
[0065] 优选的是，脱气室内部的肽溶液的巨大表面积与空气接触。因此，脱气室的形状和 尺寸可以是这样的，以使所述肽溶液与空气的接触表面积最大化。另外，至脱气室内的流入 可以是这样的，以便所述肽溶液沿着室的内壁循环，从而使接触表面积最大化。在一些实施 方案中，肽溶液至室内的流动可以是如沿着脱气室的内壁的薄膜。再次地，所述高表面积 (和肽溶液的表面积对体积的比率）可有助于脱气效率。然而，在一些实施方案中，只使肽 溶液流入脱气室可能就足够了。在一些具体实施方案中，允许高粘度（例如，具有大于约 15. 0帕斯卡-秒[Pa · s]的粘度）溶液流入脱气室。
[0066] 在一些实施方案中，在通气过程中搅拌溶液。在一些实施方案中，以约50rpm、 lOOrpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、400rpm 或 500rpm 的速度揽拌溶液。在一 些实施方案中，优选的是当将肽引入脱气室时，其已被加热。这种加热可降低溶液的粘度， 提高脱气效率。加热时应当小心，因为一些肽因热而发生降解，因而加热可能不适合所有情 况。
[0067] 可将搅拌与减压组合，以高效地从粘稠肽混合物脱气，但快速搅拌可能将气泡带 入混合物。为了从肽混合物脱气，以不低于约300rpm的速率操作混合器。如果不同时进行 搅拌的话，自组装肽混合物在脱气过程中变为凝胶状溶液。混合自组装肽溶液保持低粘度， 以使得溶液被有效地脱气。
[0068] 脱气步骤持续（即，维持真空的时间）至少约30分钟（例如，约15分钟、约20分 钟、约40分钟、约45分钟、约60分钟）。用于脱气的最终时间长度取决于结果，例如，所述 混合物大体上不含溶解的气体或气泡。在脱气过程中，获取溶液的样品，检查其溶解的气体 或气泡。如果溶解的气体或气泡仍然存在，则继续脱气过程。如果溶液充分不含溶解的气 体或气泡，则可继续灌装加工法。
[0069] 过滤
[0070] 适于根据公开的方法使用的过滤器无特别限制，可以包括表面过滤器，例如死端 过滤器（即，其中待过滤的流体垂直地接近过滤表面）和交叉流过滤器（即，其中待过滤 的流体平行于过滤器表面行进）。参见，例如，Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，第 10 卷，第 788-853 页（"Filtration")(第 4 版，1993 年）。所述过滤器在它 们的分类尺寸（即，高于其的分散材料保留在过滤器上的尺寸，和低于其分散材料通过进 入滤液的尺寸）方面也无特别限制。一旦过滤器的分类尺寸被选择用于特定应用（即，待 保留的分散材料对通过进入过滤器的分散材料），过滤器的操作应当考虑相对于被过滤的 特定蛋白质的剪切敏感性，由流过过滤器的载液产生的剪切力的量。
[0071] 在将混合物充分脱气后，进行过滤步骤。如上所述，我们已经发现一系列方法，所 述方法使得能够进行灭菌，所述灭菌不利用用于灭菌的热、化学和辐射方法，因为它们可以 降解肽。根据本发明，过滤是特别有用的用于肽混合物灭菌的方法。过滤在去除残留的碎 片和其它小颗粒以及以不会导致肽的降解的方式对肽溶液灭菌中是有效的。过滤器使用过 滤器与污染颗粒之间的两个主要类型的相互作用保留污染物。颗粒因其尺寸而被保留，并 且还可因至过滤器材料的吸附而被保留。颗粒与过滤材料之间的分子和/或电动力吸引这 些实体并将其保留在过滤器内。
[0072] -般而言，可定制过滤器的孔的尺寸来去除至少一部分包含在所述肽溶液中的污 染物，从而将去除的分散污染物保留在过滤器的上游侧（例如，入口侧），产生大体上不含 污染物的滤液。具体来讲，滤液不应当以可不利地影响纯化的肽溶液的使用的量含有污染 物。例如，当分散污染物包括微生物时，过滤器应当能够去除至少99. 9999%的最初存在于 溶液中的微生物，即用于医疗用途的无菌保证水平（SAL :KT6)。
[0073] 过滤器通常具有各种尺寸（即，过滤器表面积，例如从约0.0 Olm2至约IOm2)和构 型（例如，滤盘、过滤筒）。用于过滤器构造的材料被选择来与所述肽混合物相容（例如，防 止与溶液的粘附或过度摩擦）。可从材料形成多孔膜，所述材料是诸如磷酸纤维素、醋酸纤 维素、乙烯基聚合物、氟碳化合物、烯烃诸如聚乙烯（包括超高分子量聚乙烯）、聚丙烯、EVA 共聚物和α -烯烃、茂金属烯烃聚合物、PFA、MFA、PTFE、聚碳酸酯、乙烯共聚物诸如PVC、聚 酰胺诸如尼龙、聚酯、纤维素、醋酸纤维素、再生纤维素、纤维素复合材料、聚砜、聚醚砜、聚 芳砜、聚苯砜、聚丙烯腈、聚偏二氟乙烯（PVDF)及其混物物。取决于混合物，过滤器可以是 亲水或疏水的。优选的过滤器是亲水的，具有低的蛋白质/肽结合。
[0074] 在一些实施方案中，过滤步骤通过经过具有特定孔尺寸（例如，约0.2微米）的过 滤器过滤来进行。多孔膜包括通常具有取决于待从液体混合物中除去的分散污染物的尺寸 而选择的高度均匀的尺寸的孔。例如，在意欲用于除去微生物（同时允许蛋白质穿过滤膜 进入滤液）的无菌过滤操作中，孔优选地具有在约〇. 1微米至约〇. 5微米的范围内的尺寸。 在一些实施方案中，孔径尺寸为约〇. 15微米，约0. 1微米。合适的过滤系统还可以包括具有 例如0. 2微米的孔径的初级过滤器，以及较粗的预过滤器，以改善通量和限制在较细的过 滤器内的积累。较粗的预过滤器可具有在约〇. 4微米至约10微米的范围内的孔径。（例如， 约0. 4微米，约0. 45微米，约0. 5微米，约0. 6微米，约0. 7微米，约0. 8微米，约I. 0微米， 约1. 5微米，约100. 0微米）。预过滤器系统需要两个或更多个过滤器，以便肽混合物可在 预过滤器多丢失。此外，串联预过滤系统导致降低灭菌过滤器中的压力，其中初始高压力由 预过滤器降低。高度粘稠的肽混合物诸如自组装肽，需要高压（0. 5或更多兆帕斯卡（MPa)) 来进行过滤，因此，预过滤器和灭菌过滤器的串联不适合于粘性自组装肽的制造方法。
[0075] 在各种实施方案中，在如下范围内的压力下进行根据本发明的过滤：约 0· 3-0. 7(包括 0· 3 和 0· 7)，例如约 0· 30MPa、0. 31MPa、0. 32MPa、0. 33MPa、0. 34MPa、0. 35MPa、 0. 36MPa、 0. 37MPa、0. 38MPa、0. 39MPa、0. 40MPa、0. 41MPa、0. 42MPa、0. 43MPa、0. 44MPa、 0.45MPa、0. 46MPa、0. 47MPa、0.48MPa、0. 49MPa、0.50MPa、0. 51MPa、0. 52MPa、0.53MPa、 0. 54MPa、0. 55MPa. ;0. 56MPa、0. 57MPa、0. 58MPa、0. 59MPa、0. 60MPa、0. 61MPa、0. 62MPa、 0· 63MPa、0. 64MPa、0. 65MPa、0. 66MPa、0. 67MPa、0. 68MPa、0. 69MPa、0. 70MPa。在一些实施 方案中，在约0.4-0. 6MPa(包括0.4和0.6MPa)的范围内进行过滤。在一些实施方案中， 在约0.5-0. 6MPa(包括0.5和0.6MPa)的范围内进行过滤。在一些实施方案中，在约 0. 5-0. 55MPa (包括0. 5和0. 55MPa)的范围内进行过滤。
[0076] 在一些实施方案中，在约0. 40MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施 方案中，在约〇. 41MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约0. 42MPa 的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约〇.43MPa的压力下进行根据 本发明的过滤；在一些实施方案中，在约0. 44MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一 些实施方案中，在约〇.45MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约 0· 46MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约0· 47MPa的压力下进行 根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约〇. 48MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在 一些实施方案中，在约0. 49MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约 0· 50MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约0· 51MPa的压力下进行 根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约〇. 52MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在 一些实施方案中，在约0. 53MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约 0· 54MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约0· 55MPa的压力下进行 根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约〇. 56MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在 一些实施方案中，在约0. 57MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约 0· 58MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约0· 59MPa的压力下进行 根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约〇. 60MPa的压力下进行根据本发明的过滤。
[0077] 在一些实施方案中，在过滤过程中监测压力；在一些此类实施方案中，可进行调整 以将压力保持在所需范围内。在一些实施方案中，偶尔地监测压力。在一些实施方案中，定 期监测压力。在一些实施方案中，连续监测压力。
[0078] 在一些实施方案中，通过对真空装置的控制选择压力。在一些此类实施方案中，连 续监测实际施用的压力。在一些此类实施方案中，离散地监测实际施用的压力。
[0079] 为了开始过滤，缓慢地充注过滤器，以便溶液不夹带气体，（例如，预涂覆），和迫 使所有气体从过滤器容器释放出来。在一些实施方案中，通过将肽混合物自动和/或人工 地添加至过滤器外壳，用所述混合物预灌注滤器。可在〇. 〇5MPa或更低压力下进行肽混合 物至过滤器外壳的自动添加。在一些实施方案中，将与初级过滤泵分离的泵用于充注过滤 器容器。另外的方法可用于产生压力，包括但不限于重力、压缩气体（例如，空气）。
[0080] 过滤器、膜或另外的方式可以以死端或法线流（NF)形式或切向流（TFF)形式运 行。通常地，法线流可优选地确保适当的灭菌和最大化过滤步骤的效力。选择取决于许多 因素，主要是用户的偏好或已安装的过滤。当大量的肽将被回收时，TFF法和设备可以是优 选的，因为TFF相较于NF法较少经历堵塞或结垢。
[0081] 还可任选地控制过滤过程中的温度。肽溶液的粘度基于温度而变化，并且粘度反 过来影响过滤效率和功效。在一些实施方案中，过滤过程中的温度在约〇°C至约40°C。（例 如，约10°C、20°C、30°C )。还可任选地控制过滤过程中的温度以防止肽的降解（例如，温度 应当不超过l〇〇°C )。
[0082] 过滤器和相关设备均可进行高压灭菌和/或蒸汽灭菌。为了保持无菌过滤的溶 液，将溶液从纤维捕获至无菌袋（例如，Millipore Mobius)或连接至过滤器的出口的无菌 不锈钢罐中。可使用另外的一次性设备（即，轮廓介质（figure media)、外壳等）来确保无 菌。
[0083] 在一些实施方案中，为了确保基本上所有的肽混合物被送入过滤器，在过滤进料 罐中使用刮刀，以除去粘附在罐表面上的任何肽混合物。如果刮刀不用于自组装肽混合物， 则将混合物放置在研磨钵状的罐中，因为压缩的肽混合物变得像凝胶。或者，可使用管道辅 助装置（例如，清管器）。将肽混合物在约〇· 1至约IMPa的压力（例如，约0· 5MPa)下通过 过滤器过滤。过滤的流速为约0.5至约5升/分钟。我们的工作表明，在过滤过程中可随 流速变化的压力似乎对过滤运行的功效具有更大的影响。
[0084] 可以以反压模式操作过滤器，这导致过滤器出口处的压力大于大气压。为了有效 地对过滤器施加反压并避免压力被降低，压力源与过滤进料罐之间的附加罐可以是可用 的，因为压缩气体的压力将因过滤进料罐的空域的膨胀而降低。反压可以通过任何合适的 来源例如常规阀门、流动缢缩（例如，孔板）、压力调节器来施加。正压（例如，入口压〉出 口压）驱动肽溶液通过过滤器。在一些实施方案中，压力差可以是低的，合适的最大压力差 取决于多种因素，包括待过滤的肽的浓度和类型。在一些实施方案中，压力差为约〇. OlMPa 至约IMPa (例如，约0. 5MPa)。
[0085] 在这样的压力差下，通过过滤器的流速足够低，以产生大体上不损害溶液中的肽 的低剪切环境。此外，低剪切环境不限制在过滤过程（例如，因粘度作用、阻塞而限制过滤 效率或功效，或在过滤器中产生气袋）。
[0086] 过滤后，过滤器可能被高压损坏；在许多实施方案中，适当地或期望地通过完整性 测试检查过滤器，以评估损坏是否可能已经削弱了灭菌的质量。在许多实施方案中，将在完 整性测试之前洗涤（例如，通过水，特别是例如，通过热水和/或通过高压水）过滤器。在 一些实施方案中，这样洗涤除去或可以除去可能一直保持在过滤器中的溶液，应理解，这样 的残留溶液有时会影响测试数据。在一些实施方案中，用蒸汽和/或通过高压灭菌来洗涤 过滤器。在一些实施方案中，用于洗涤过滤器的方法可降解残留在过滤器中的肽。例如，在 一些实施方案中，在一定条件下进行方法（例如，包括水洗[例如，高压和/或热水]，蒸汽 洗涤，高压灭菌等）并进行足以降解这样的肽的时间。在一些实施方案中，用具有在约70°C 至80°C的范围内（包括70°C和80°C)的温度的水洗涤过滤器，随后进行完整性测试。在一 些特定实施方案中，用具有约70°C的温度的水洗涤过滤器，随后进行完整性测试。
[0087] 第二脱气
[0088] 过滤后，肽溶液经历脱气步骤。在该第二脱气步骤中，应当保护现有无菌混合物免 受任何污染，诸如来自驱动部件的金属微粒。因此，可进行第二脱气而无进一步的设备（例 如，旋转式叶轮）与肽溶液接触。在一些实施方案中，溶液通过上述脱气法（如，减压/抽 真空、振动、沉降）来进行脱气。
[0089] 在一些实施方案中，所述混合物通过振动脱气来降低肽混合物的粘度。在一些实 施方案中，振动可通过轨道摇床来诱导。在一些实施方案中，脱气振动运动存在于一个以上 的维度中。例如，含有已灭菌的肽溶液的容器在X轴和y轴（和/或任选的Z轴）方向上 运动。这与简单的一维（或单一轴）振动（即，摇动）成对比。在一些实施方案中，可将压 力降低与振动组合以进行有效脱气。
[0090] 为所述装置的振动运动提供工具以用于改变所述装置在任何特定方向上移动的 旋转速度和距离。在一些实施方案中，振动频率为约50转/分钟和任何特定的方向。在一 些实施方案中，振动频率在约20转/分钟至约360转/分钟的范围内，例如约30、40、50、 60、90、100、120、150、180、210、240、300、360转）。振动的圆形方向是顺时针或逆时针或两 者的组合。在一些实施方案中，所述振动运动的距离约为-20cm至约20cm。
[0091] 在一些实施方案中，通过真空中进行所述脱气步骤。使溶液的压力下降至少 约-0· 05MPa(例如，-0· OIMpa、-0· 015MPa、-0· 02MPa、-0· 025MPa)。我们已认识到压力 的下降速率（或在真空的升高）影响脱气方法的功效和效率。在一些实施方案中，压力 的下降速率不超过约-o. OlMPa/分钟（例如，约-o. 005MPa/分钟、约-o. 0025MPa/分钟、 约-0.0 OlMPa/分钟以及其间的范围）。在一些实施方案中，压力的下降速率取决于待脱气 的溶液的总体积。
[0092] 第二脱气步骤还导致均匀混合的溶液。
[0093] 示例性振动脱气设备包括来自Medical&Food System Co. ,Ltd.的装置模型（JP0 专利申请号2010-161052 ;公布号2012-11364)。
[0094] 灌装
[0095] 在第二脱气步骤后，肽混合物适用于灌装至注射器中。注射器可以是任意尺寸，例 如，11^、21^、31^、511^、1〇111匕此外，注射器可以是任何构造材料（例如，玻璃、聚乙烯等）。 基于目视检查、称重来确定适当的灌装。每一个注射器的目标容积取决于溶液的粘度。
[0096] 将注射器放置在灌装站，将已灭菌的肽溶液以所需数量泵入注射器。在一些实施 方案中，随后在引入肽溶液之后，但在添加柱塞之前，将真空施加于注射器。真空的速率部 分取决于肽溶液的粘度和沸点。可选择施真空的加速率，以便其应用不向肽溶液中引入气 泡。灌装注射器的其它方面包括将所述柱塞置于注射器中。应当这样放置柱塞，以便其与 肽混合物接触，但不封住肽混合物与柱塞之间的空气，以及未扰动肽混合物至这样的程度， 即溶液在注射器内飞溅或将空气掺入肽混合物中。
[0097] 在注射器被灌装后，目视检查其的（a)任何异物或可见污染物（b)针对注射器本 身的任何瑕疵、损坏或缺陷；和（c)任何泄漏。在过程中，检查包括但不限于利用紫外光分 光镜法和/或整体氮含量、HPLC 、质谱图、pH值、胶凝化和/或粘度、细菌污染和内毒素、重 金属判定、残留溶剂的测量来测量的肽浓度。可在整个过程中重复进行和在灌装加工法完 成后（作为最终质量控制）进行这些检查参数。注射器随后经历最终装配，这可包括柱塞、 把手的添加和粘贴标签。可将注射器包装进多单元包（例如，1、2、3、4、5个等，单元枕头或 泡罩包装）以用于运输和贮存。双包装也可用于在用于手术室之前避免注射器表面的细菌 污染。
[0098] 包装后，通过环氧乙烷气体（"E0G"）或过氧化氢气体灭菌对包装进行灭菌。在每 一个步骤后，或在一批肽溶液已被处理后，可按照cGMP标准清洁处理设备。可原位清洁所 述设备，或将其拆卸并逐片清洁。此外，处理设备可通过常用灭菌技术（例如，高压灭菌、辐 射、EOG等）进行灭菌。
[0099] 清洁设备
[0100] 高粘度肽混合物常常粘附于罐和管道的表面。遵照CGMP清洁所有设备对于粘肽 混合物是如此之难，以至制造商寻求有效的清洗方法。因为通常通过暴露于高温（例如， 121°C)来降解肽，因此蒸汽或热水可用于从罐和管道的表面上除去肽混合物。原位清洗 (CIP)中对蒸汽的暴露和分离的设备的高压灭菌对于清洁设备都是有效的。由于自组装肽 也可通过蒸汽或高压灭菌器降解，因此在暴露于水蒸汽或高压灭菌器后，肽可通过用水漂 洗除去。遵照cGMP，在设备上剩余的肽可以通过总有机碳（TOC)测量来检查，清洁效率可通 过TOC进行验证。 实施例
[0101] 自组装肽溶液的示例性生产验证
[0102] 本实施例举例说明了使用方法生产自组装肽溶液，所述方法包括：第一脱气步骤， 其中通过降压来对含肽混合物进行脱气；通过无菌过滤器过滤所述混合物；和第二脱气步 骤，其中通过振动和降压来对滤液进行脱气。
[0103] 简而言之，使用原始肽Ac-(RADA)4-NH2 (批号12103001)在IOL批次规模上生产 2. 5%的肽溶液。示例性生产条件如下：
[0104] 溶解（60分钟）：10kg注射用水，256. 7克的肽和300至500rpm的叶轮转速。
[0105] 第一脱气步骤（60分钟）：-0. 099MPa至-0.1 OOMPa的空气真空和250rpm的叶轮 转速。
[0106] 过滤步骤：20"药筒、0· 2 μm无菌过滤网（Millipore Express SHF)、0· 05Mpa 的预 灌注压、0. 5MPa的反过滤压、35cm(与溶解罐的刮刀直径相似）的刮刀直径、具有40L容量 的压力源罐和用于使用完整性测试仪（INTEGRITESP-MSystem，Millipore)的完整性 测试（纯蒸汽于100°C -130°C持续30分钟）的洗涤过虑器。洗涤过滤器上的肽溶液，随 后进行完整性测试（例如，通过水，特别是例如，通过热水和/或通过高压水）。
[0107] 第二脱气步骤（60分钟）：0· 099MPa至-0· IOOMPa的空气真空、IOOrpm的圆形转 速和IOcm的振动模式距离。
[0108] 使用高速灌装机将所得的肽溶液用于以灌装制品。例如使用10I/10FF/10I机（KT Manufacturing Co. Ltd.)，利用两个灌装嘴以1000个制品/小时的速度灌装注射器。将 ImL (574个制品）、3mL (1164个制品）和5mL (250个制品）变化的产品经历环氧乙烷气体以 进行最终的灭菌。
[0109] 综上所述，本实施例表明本文中所述的制造和纯化肽溶液的方法有效地为各种科 学和医学应用提供适当包装的肽溶液而无对肽混合物的任何降解或物理变化。
[0110] 至此已经描述了本发明的至少一个实施方案的若干方面，应理解，各种变化、变动 和改进对本领域普通技术人员来说将是容易进行的。这样的改变、变动和改进旨在是本公 开内容的部分，并且意欲在本发明的精神和范围内。因此，上述描述和附图仅仅是举例说明 性的，本发明通过下列权利要求详述地描述。
[0111] 在权利要求中使用序数术语诸如"第一"、"第二"、"第三"等来修饰声称元素本身 并不意味着任何优先权、优先级或一个声称元素优于另一个的顺序或其中执行方法的时间 顺序，而仅用作区分一个具有特定名称的声称元素与另一个具有相同名称（若非使用序数 术语的话）以区分所述声称元素的标记。
[0112] 如本文中的说明书和权利要求中所用，除非明确地相反地指出，否则冠词"一个/ 种"应理解为包括复数个指示物。除非指示相反或另外地根据上下文很明显，否则如果一 个、超过一个或所有组成员存在于给定的产品或方法中，用于所述产品或方法，或以其它方 式与其相关，则包括组的一个或多个成员之间的"或"的权利要求或描述被认为是满意的。 本发明还包括实施方案，其中组的正好一个成员存在于给定的产品或方法中，用于所述产 品或方法中，或以其它方式与所述产品或方法相关。本发明还包括实施方案，其中超过一个 组成员或整个组成员存在于给定的产品或方法中，用于所述产品或方法中，或以其它方式 与所述产品或方法相关。此外，应理解，本发明涵盖所有变化、组合和变换，其中除非另有 说明或除非对于本领域普通技术人员来说显而易见的是可产生矛盾或不一致，否则取决于 相同的基础权利要求（或者，如相关，任何其它权利要求），来自所列权利要求的一项或多 项的一个或多个限制、元素、条款、说明性术语等被引入另一个权利要求。当元素被表示为 列表，（例如，在Markush组或类似格式中）时，应理解，本发明还公开了元素的每个亚组， 并且任何元素可从该组中删除。应理解，在一般情况下，当本发明，或本发明的方面被称为 包含特定元素、特征等时，本发明的某些实施方案或本发明的方面由这样的元素、特征等组 成，或基本上由所述元素、特征等组成。为简单起见，这些实施方案在每一种情况下在用本 文中未用这么多的词汇进行描述。还应理解，本发明的任何实施方案和方面可被明确地排 除在权利要求中，无论具体排除是否在权利要求中被引述。本文中参考以描述本发明的背 景和提供关于其实施的额外细节的出版物、网站及本文参考材料通过引用并入本文。
【主权项】
1. 一种方法，其包括以下步骤： 第一脱气步骤，其中通过降压来对含肽混合物进行脱气， 通过无菌过滤器过滤所述混合物；和 第二脱气步骤，其中通过振动和降压来对滤液进行脱气。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述灭菌过滤器具有小于约0. 22ym的平均孔径。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述肽是自组装肽。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述肽包含RADA16-I(SEQIDNO: 1)。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述肽包含IEIK13(SEQIDN0:39)。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一脱气步骤包括以低于约-0.OlMPa/分钟 的速率降低所述混合物的压力。7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一脱气步骤包括使压力降低约至 少-〇? 095MPa。8. 根据权利要求7所述的方法，其中将所述低压维持至少约30分钟。9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第二脱气步骤包括以150转/分钟振动所述 混合物并且振动运动的偏心距离为-IOcm至10cm。10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第二脱气步骤包括使压力降低约至 少-〇? 095MPa。11. 根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述肽与溶剂混合，随后进行所述第一脱 气步骤。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述溶剂为水。13. 根据权利要求1所述的方法，其还包括在所述第二脱气步骤之后用所述混合物对 制品进行无菌灌装。14. 根据权利要求13所述的方法，其中在所述第二脱气步骤后至少5小时灌装所述制 品。15. 根据权利要求13所述的方法，其中所述制品为注射器、小袋、小瓶、管。16. 根据权利要求13所述的方法，其还包括用气体可渗透材料包装灌装的制品和所述 灌装步骤后的灭菌步骤。17. 根据权利要求16所述的方法，其中气体灭菌通过环氧乙烷气体来进行。18. 根据权利要求16所述的方法，其中气体灭菌通过过氧化氢气体来进行。19. 根据权利要求16所述的方法，其中包装所述制品利用单包装来进行。20. 根据权利要求16所述的方法，其中包装所述制品利用双包装来进行。21. 根据权利要求1所述的方法，其中在约0. 5MPa的压力下进行所述过滤。22. 根据权利要求21所述的方法，其中在约环境温度下进行所述过滤。23. 根据权利要求1所述的方法，其中所述过滤器由选自以下的材料构造：硝酸纤维 素、醋酸纤维素、乙烯基聚合物、氟碳化合物、聚乙烯、超高分子量聚乙烯、聚丙烯、EVA共聚 物和a-烯烃、茂金属烯烃聚合物、？?八、10^、？1?￡、聚碳酸酯、乙烯共聚物、聚酰胺、尼龙、聚 酯、纤维素、醋酸纤维素、再生纤维素、纤维素复合材料、聚砜、聚醚砜、聚芳砜、聚苯砜、聚丙 烯腈、聚偏二氟乙烯（PVDF)及其混物物。24. 根据权利要求1所述的方法，其中所述过滤器由聚醚砜构造。25. 根据权利要求1所述的方法，其中所述过滤步骤包括在第一压力下灌装所述过滤 器，随后升高压力以进行所述过滤的步骤。26. 根据权利要求1所述的方法，其中洗涤所述过滤器，随后进行完整性测试。27. 根据权利要求26所述的方法，其中用水洗涤所述过滤器，随后进行完整性测试，任 选地用热水和/或高压水洗涤所述滤器。28. 根据权利要求26所述的方法，其中利用蒸汽和/或高压灭菌洗涤所述过滤器，随后 进行完整性测试。29. 根据权利要求1所述的方法，其中将附加罐置于压力源与过滤进料罐之间以保持 压力作为进行所述过滤的压力源。30. 根据权利要求1所述的方法，其中使用刮刀将几乎所有所述溶液从过滤进料罐送 入过滤器。31. 根据权利要求1所述的方法，其中所述过滤步骤包括使用清管器帮助过滤。32. 根据权利要求1所述的方法，其中在平行操作的两个过滤器中进行所述过滤步骤。33. 根据权利要求1所述的方法，其还包括清洁步骤，所述步骤包括将蒸汽添加至过滤 和脱气设备。
【专利摘要】所附公开尤其描述了一种方法，所述方法包括以下步骤：第一脱气步骤，其中通过降压来对含肽混合物进行脱气；通过无菌过滤器过滤所述混合物；和第二脱气步骤，其中通过振动和降压来对滤液进行脱气。
【IPC分类】C07K1/34, B01D27/14
【公开号】CN104902974
【申请号】CN201380046268
【发明人】野原正弘, 长谷川佑也
【申请人】三维矩阵有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年7月3日
【公告号】EP2869903A2, US20150197359, WO2014008400A2, WO2014008400A3
【专利说明】肽溶液的灌装加工法
[0001] 序列表
[0002] 本说明书参考于2013年7月3日作为命名为"2004837-0032_Sequences_ST25" 的ASCII.txt文件以电子形式提交的序列表。该.txt文件于2013年6月10日生成，大小 为 11KB。
[0003] 发明背景
[0004] 可向患者施用纯化的蛋白质和/或肽混合物以用于多种治疗用途。经制备用于向 患者施用的肽溶液在使用前必须是无菌的。肽和生物技术产品的纯化和包装通常可以是异 常困难的。所述产品非常复杂，可能对光、温度、压力、PH、辐射、机械干扰敏感并且另外地 对环境条件敏感。此外，该产品可发生物理改变或容易降解，即使在理想的加工条件下亦如 此。用于一些蛋白质（包括寡肽）的合适的灭菌方法包括肽溶液的过滤。可定制过滤器的 尺寸来保留（即从肽溶液中除去）颗粒、微生物和病毒，同时蛋白质能够通过膜。
[0005] 因此，人们希望开发以大体上不损坏肽的方式过滤和包装肽溶液的方法，然而该 方法仍允许随时间推移的适当高的处理通量（即，过滤速度）。此外，人们希望开发通常适 用于任何蛋白质的过滤法，以便可以以高效率过滤（例如，无菌过滤）一般肽而不发生肽的 重大损坏/损失。
[0006] 发明概述
[0007] 在各种实施方案中，本发明包括制造和纯化肽溶液的方法。在一些实施方案中，该 方法包括以下步骤：第一脱气步骤，其中通过降压来对含肽混合物进行脱气；通过无菌过 滤器过滤所述混合物；和第二脱气步骤，其中通过振动和降压来对滤液进行脱气。
[0008] 在一些实施方案中，制造和纯化本发明的肽溶液的方法不包括将混合物通过无菌 过滤器进行过滤。实际上，在一些实施方案中，本发明的一个方面是认识到，某些特定肽溶 液可具有使得它们顺从于对于其它肽溶液可以是有效的或可以是无效的特定制备方法的 特征。在一些实施方案中，不利用过滤器的方法是想要的。可选地或此外，在一些实施方案 中，提供的制造和纯化本发明的肽溶液的方法包括无需过滤的热灭菌。在一些实施方案中， 本发明涵盖认识：不需要过滤的某些肽溶液顺从于使用包括热灭菌和/或不包括过滤的方 法进行的制造和/或纯化。
[0009] 在一些实施方案中，包括过滤步骤的方法利用具有小于约0. 45 μL?的平均孔径的 无菌过滤器。
[0010] 在一些实施方案中，第一脱气步骤包括以小于约-0.1 MPa/分钟的速率降低混合 物的压力。在一些实施方案中，第一脱气步骤包括使压力降低约至少-〇.〇5MPa。在一些实 施方案中，将更低的压力维持至少约30分钟。
[0011] 在一些实施方案中，第二脱气步骤包括以150转/分钟振动混合物，并且振动运动 的偏心距离在位置编号6与8之间。在一些实施方案中，第二脱气步骤包括使压力降低约 至少-〇. 05MPa。
[0012] 在一些实施方案中，所述方法还包括将肽与溶剂混合，随后进行第一脱气步骤。
[0013] 在一些实施方案中，利用的肽溶液为RADA-16(SEQ ID ΝΟ:1)肽溶液。在一些实施 方案中，利用的肽溶液为IEIK13(SEQ ID N0:39)肽溶液或包含IEIK13(SEQ ID N0:39)肽 溶液。在一些实施方案中，利用的肽溶液为表1中出现的肽的溶液。在一些实施方案中，利 用的肽溶液为表2中出现的肽的溶液。在一些实施方案中，利用的肽溶液为两种或更多种 肽的溶液。
[0014] 在一些特定实施方案中，本发明提供了不存在一个或多个过滤步骤的制造和纯化 IEIK13(SEQ ID NO:39)的方法。在一些实施方案中，本发明提供了不包括任何过滤步骤的 制造和纯化IEIK13(SEQ ID NO: 39)的方法。本发明的一个特征是其认识到，至少对于某些 IEIK13(SEQ ID N0:39)溶液，这样的过滤可能不是灭菌所需的。
[0015] 在一些实施方案中，溶剂为水。在一些实施方案中，所述方法还包括在第二脱气步 骤之后用混合物对制品进行无菌灌装。在一些实施方案中，在第二脱气步骤后至少5小时 灌装所述制品。在一些实施方案中，以至少约2个制品/分钟、约3个制品/分钟、约4个制 品/分钟、约5个制品/分钟、约6个制品/分钟、约7个制品/分钟、约8个制品/分钟、 约9个制品/分钟、约10个制品/分钟、约11个制品/分钟、约12个制品/分钟、约13个 制品/分钟、约14个制品/分钟、约15个制品/分钟、约16个制品/分钟、约17个制品/ 分钟、约18个制品/分钟、约19个制品/分钟或约20个制品分钟或其倍数的速率灌装制 品；在一些实施方案中，以约100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000或更多个 制品/小时的速率灌装制品。
[0016] 在一些实施方案中，高速灌装机（例如，诸如FLS 3000，Bosch ;1I/1F/1I1VI0CY， 8I/8F/8IS-CY 或 10I/10FF/10I(KT Manufacturing Co. Ltd.)用于灌装制品；在一些实施 方案中，高速灌装机为灌装嘴或包含多个灌装嘴（例如，2、3、4、5等）。在一些实施方案中， 这样排列和构造所述机器以便每一个喷嘴具有以至少约2个制品/分钟、约3个制品/分 钟、约4个制品/分钟、约5个制品/分钟、约6个制品/分钟、约7个制品/分钟、约8个 制品/分钟、约9个制品/分钟、约10个制品/分钟、约11个制品/分钟、约12个制品/ 分钟、约13个制品/分钟、约14个制品/分钟、约15个制品/分钟、约16个制品/分钟、 约17个制品/分钟、约18个制品/分钟、约19个制品/分钟或约20个制品/分钟的速率 或以约100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000或更多个制品/小时的速率灌 装制品的能力；和/或排列和构造所述机器（例如，在一些实施方案中，由于多个喷嘴的存 在）以以至少约 1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、 13000U4000或至少约15000个制品/小时的速率灌装制品。在一些实施方案中，所提供 的方法将此类高速灌装机的能力利用至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%或至少100%。
[0017] 在一些实施方案中，所述制品为注射器、小袋、小瓶、管。在一些实施方案中，所述 方法还包括用气体可渗透材料包装灌装的制品和所述灌装步骤后的灭菌步骤。
[0018] 在一些实施方案中，气体灭菌通过环氧乙烷气体来进行。在一些实施方案中，气体 灭菌通过过氧化氢气体来进行。
[0019] 在一些实施方案中，制品利用单包装来进行。
[0020] 在一些实施方案中，制品利用双包装来进行。
[0021] 在一些实施方案中，在约0. 1 -0.6兆帕（MPa)的压力下进行过滤。在一些特定实 施方案中，在约〇· IMPa、约0· 2MPa、约0· 3MPa、约0· 4MPa、约0· 5MPa或约0· 6MPa的压力下 进行过滤。
[0022] 在一些实施方案中，在约室温下进行过滤。
[0023] 在一些实施方案中，所述过滤器由选自以下的材料构造：硝酸纤维素、醋酸纤维 素、乙烯基聚合物、氟碳化合物、聚乙烯、超高分子量聚乙烯、聚丙烯、EVA共聚物和α-烯 烃、茂金属烯烃聚合物、PFA、MFA、PTFE、聚碳酸醋、乙烯共聚物、聚酰胺、尼龙、聚醋、纤维素、 醋酸纤维素、再生纤维素、纤维素复合材料、聚砜、聚醚砜、聚芳砜、聚苯砜、聚丙烯腈、聚偏 二氟乙烯（PVDF)及其混物物。
[0024] 在一些实施方案中，过滤器由聚醚砜构造。
[0025] 在一些实施方案中，过滤步骤包括在第一压力下灌装过滤器，随后升高压力以进 行过滤的步骤。在一些实施方案中，将附加罐置于压力源与过滤进料罐之间以保持压力作 为进行过滤的压力源。在一些特定实施方案，用于灌装过滤器的第一压力相对较弱。在一 些实施方案中，第一压力低于约〇· OIMPa。在一些实施方案中，第一压力为约0· 05MPa。
[0026] 在一些实施方案中，测试过滤器的完整性。在一些实施方案中，使用完整性测 试仪（例如，诸如 INTEGRITEST?' 4 系统，Millipore ; PALLTRONIC? AquaWIT Series过滤器完整性测试系统或PALLTRONIC? Flowstar Series完整性测试仪；Pall Corp. ;Meissner's ACCUFLUX? 自动化过滤器完整性测试仪，Meissner Filtration Products)测试过滤器的完整性。
[0027] 在一些实施方案中，洗涤过滤器，随后进行完整性测试。在一些特定实施方案中， 用水洗涤过滤器，随后进行完整性测试。在一些特定实施方案中，用热水和/或通过高压水 洗涤过滤器，随后进行完整性测试。在一些特定实施方案中，利用蒸汽和/或高压灭菌洗涤 过滤器，随后进行完整性测试。
[0028] 在一些实施方案中，使用刮刀将几乎所有溶液从过滤进料罐送入过滤器。在一些 实施方案中，过滤步骤包括使用清管器（pig)来帮助过滤。在一些实施方案中，在平行操作 的两个过滤器中进行过滤步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括清除步骤，该步骤包括 将蒸汽添加至过滤和脱气设备。
[0029] 定义
[0030] "互补的"意指能够在来自支架中的相邻肽的亲水性残基之间形成离子或氢键合 相互作用，肽中的每一个亲水性残基与相邻肽上的亲水性残基氢键或离子配对，或暴露于 溶剂。
[0031] "结构上相容的"意指能够维持足够恒定的肽内距离以允许支架形成。在本发明的 某些实施方案中，肽内距离的变化小于4、3、2或1埃。如果足够稳定的力存在，还可预期肽 内距离的更大变化可以不阻止支架形成。该距离可基于分子建模或基于先前已报道的简化 程序（美国专利号5, 670, 483)来计算。在该方法中，肽内距离通过获取对中每一个氨基酸 的侧链上的无支链原子的数目之和来计算。例如，赖氨酸-谷氨酸离子对的肽内之和为5+4 =9个原子，谷氨酰胺-谷氨酰胺氢键合对的距离为4+4 = 8个原子。使用每原子3埃的 换算因子，具有赖氨酸-谷氨酸对和谷氨酰胺-谷氨酰胺对（例如，9个对8个原子）的肽 的肽内距离的变化为3埃。
[0032] 术语"纯的"用于指示本文中所述的肽不含其它化学药品种类（包括所述肽的缺 失加合物和具有不同长度的肽）所达到的程度。
[0033] 如本文中所用，当经 历机械搅拌时，如果水凝胶诸如肽水凝胶大体上保持在物理 搅拌之前表征水凝胶的物理性质（诸如弹性、粘度等），则其是"相对于机械或物理搅拌稳 定的"。水凝胶不必保持其形状或尺寸，并且当经历机械搅拌时可被片段化成更小的碎片， 同时在机械或物理搅拌方面仍然被称为是稳定的。术语"稳定的"，除与该短语一起使用时 外，不具有该含义。
[0034] 如本文中所用，术语"纳米纤维"是指具有纳米级尺寸的纤维。通常地纳米级纤维 具有500nm或更小的直径。根据本发明的某些实施方案，纳米纤维具有小于IOOnm的直径。 根据本发明的某些其它实施方案，纳米纤维具有小于50nm的直径。根据本发明的某些其它 实施方案，纳米纤维具有小于20nm的直径。根据本发明的某些其它实施方案，纳米纤维具 有10至20nm的直径。根据本发明的某些其它实施方案，纳米纤维具有5至10纳米的直径。 根据本发明的某些其它实施方案，纳米纤维具有小于5nm的直径。
[0035] 本发明的某些实施方案的详述
[0036] 肽和生物技术产品的纯化和包装通常可以是异常困难的。所述产品非常复杂，可 能对光、温度、压力、pH、辐射、机械干扰敏感并且另外地对环境条件敏感。此外，该产品可发 生物理改变或容易降解，即使在理想的加工条件下亦如此。
[0037] 我们已发现一系列使得能够对肽混合物（包括自组装肽混合物）进行灭菌和包装 的方法。提供的方法不利用热、化学药品和辐射法来进行灭菌，因为它们可降解肽。根据本 发明，过滤是用于肽混合物的灭菌的特别有用的方法。
[0038] 在一个方面，本发明涵盖这样的认识，即依赖于物理灭菌法提出基于肽混合物的 流变学的问题。例如，肽混合物的粘度可随着时间推移而改变，或只是非常高，这样看起来 像凝胶。提供的技术在自组装肽的纯化中是特别有用的，所述纯化可造成特殊困难。本发明 涵盖一系列操作和操作条件的发现，所述操作和操作条件可（a)产生已灭菌的肽混合物， (b)给包装（例如，注射器）灌装肽混合物并对其进行灭菌，和/或（c)根据现代优良生产 实践（cGMP)清洁处理设备。在一些实施方案中，本发明的过滤设备利用微米尺寸的过滤器 (例如，0. 2微米聚醚砜过滤器，但也可使用其它尺寸和构造材料）。在一些实施方案中，提 供的过滤法包括"预涂覆"过滤器（即，在升高压力以进行主动过滤之前用介质灌装过滤器 以通过在低压下除去过滤器壳体中的空气来完全覆盖过滤器表面）。在一些实施方案中，提 供的过滤法牵涉使用管道辅助装置（例如，"清管器"）或一些其它机械方式（例如，刮擦） 来确保最大量的肽混合物通过过滤器。在一些实施方案中，在脱气步骤（例如，通过减压脱 气）之后进行提供的过滤法。在一些实施方案中，在提供的过滤法之后进行脱气步骤（例 如，通过振动脱气）。在一些实施方案中，提供的过滤法包括在过滤后进行灭菌过滤器的完 整性测试程序。在一些实施方案中，用肽混合物灌装的注射器的表面的灭菌包括使用杀菌 气体（例如，环氧乙烷、过氧化氢）来避免注射器中肽溶液的降解。
[0039] 自组装肽
[0040] 适合与本发明一起使用的肽序列包括美国专利No. 5, 670, 483和5, 955, 343以及 美国专利申请No. 09/778, 200 (所有所述专利或专利申请的内容通过引用整体并入本文） 中报道的那些序列。这些肽链由交替的亲水性和疏水性氨基酸组成，所述多肽能够自组装 以在电解质，诸如单价阳离子存在的情况下形成极度稳定的β折叠宏观结构。肽链是互 补的和结构上相容的。结构中的肽链的侧链分成两面，具有带电离子侧链的极性面和具有 丙氨酸或其它疏水基团的非极性面。这些离子侧链彼此自身互补，因为带正电荷和带负电 荷的氨基酸残基可形成互补离子对。这些肽链因而被称为离子型自身互补肽或I型自组 装肽。如果离子残基通过一个带正电荷的残基与一个带负电荷的残基交替（-+-+-+-+)，则 肽链被描述为"模量Γ;如果离子残基通过两个带电荷的残基与两个带负电荷的残基交替 (--++--++)，则肽链被描述为〃模量II"。与本发明一起使用的示例性肽序列包括表1中所 列的那些肽序列。在一些实施方案中，与本发明一起使用的肽序列具有至少12或16个氨 基酸残基。D-氨基酸和L-氨基酸可用于产生肽链。将它们在相同链中混合，或可制备具有 其本身仅包括D-氨基酸和L-氨基酸的单个肽链的肽组合物。
[0041] 表1.代表性自组装肽
[0042]
[0043] N/A指示不适用
[0044] *当在含有NaCl的溶液中温育时，这些肽形成β折叠，然而一直未观察到它们自 组装以形成宏观支架。
[0045] 许多模量I和II自身互补肽序列，诸如ΕΑΚ16、ΚΑΕ16、RAD16、RAE16和KAD16先 前已进行了分析（表1)。还已研宄了含有16个氨基酸的模量IV离子自身互补肽序列诸如 EAK16-IV、KAE16-IV、DAR16-IV和RAD16-IV。如果这些自组装肽链中的带电荷的残基被取 代（即，带正电荷的赖氨酸被带正电荷的精氨酸替代和带负电荷的谷氨酸被带负电荷的天 冬氨酸替代），则对自组装过程基本上没有显著影响。然而，如果带正电荷的残基赖氨酸和 精氨酸被带负电荷的残基天冬氨酸和谷氨酸替代，则肽链可不再进行自组装以形成宏观支 架；然而，它们仍然可在盐存在的情况下形成β折叠结构。替代带电荷的残基或除了带电 荷的残基以外，还可将形成氢键的其它亲水性残基诸如天冬酰胺和谷氨酰胺掺入肽链。如 果将肽链中的丙氨酸变成更加疏水的残基诸如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸，则这 些肽链具有更大的自组装倾向性和以增强的强度形成肽基质。一些具有与前述肽链相似的 组成和长度的肽形成α螺旋和随机卷曲而非β折叠，并且不形成宏观结构。因此，除了自 身互补以外，其它因素对于宏观支架的形成也可能是非常重要的，诸如链长度、分子间相互 作用的程度和形成交错阵列的能力。
[0046] 其它自组装肽链可通过使任何自装肽链的氨基酸序列改变单个氨基酸残基或多 个氨基酸残基来产生。此外，特定细胞识别配体诸如RGD或RAD至肽支架中的整合可促进封 装细胞的增殖。在体内，这些配体还可将细胞从支架外部吸引至支架，其中它们可侵入支架 或另外地与封装细胞相互作用。为了增强所得支架的机械强度，可将半胱氨酸掺入肽链以 允许二硫键形成，或可掺入具有芳环的残基，随后通过暴露于紫外光将其交联。支架的体内 半衰期还可通过将蛋白酶切割位点整合进支架，从而允许支架被酶促降解来进行调节。还 可对相同的肽支架进行任何上述改变的组合。
[0047] 可形成具有不同程度的刚度或弹性的自组装纳米级结构。然而不希望受任何理论 束缚，低弹性在允许细胞迀移进入支架和在驻留在支架中后彼此通讯的方面可以是重要因 素。本文中所述的肽支架通常具有在I-IOkPa的范围内的低弹性模量，如在标准锥板流变 仪中测量的。这样的低值允许支架作为细胞收缩的结果而变形，该变形可为细胞间通讯提 供工具。此外，这样的模量允许支架将生理应激传递给在其中迀移的细胞，刺激所述细胞产 生在显微结构上比疤痕更接近天然组织的组织。支架刚度可受通过多种手段控制，包括肽 序列的改变、肽浓度的改变和肽长度的改变。还可使用用于增加刚度的方法，诸如通过将生 物素分子附接于肽链的氨基或羧基末端，或附接于氨基末端与羧基末端之间，随后可将所 述生物素分子交联。
[0048] 连接的肽链可使用标准f-moc化学来合成以及使用高压液相色谱来纯化。在初始 合成后，可通过冷冻干燥保存肽链来进行贮存。肽支架的形成可通过添加本文中所述的电 解质来起始。具有芳族侧链的疏水性残基可通过暴露于紫外辐射来交联。交联的程度可通 过暴露于紫外光的预定长度和预定肽链浓度来精确地控制。交联的程度可使用标准方法， 通过光散射、凝胶过滤或扫描电子显微镜来测定。此外，交联的程度还可通过在利用蛋白酶 诸如基质金属蛋白酶消化后支架的HPLC或质谱分析来检查。如本文中所述的，可在交联之 前和之后测定支架的材料强度。
[0049] 表2用于交联的代表性肽序列
[0050]
[0051] 必要时，还可形成具有预定形状或体积的肽支架。为了形成具有所需几何形状或 尺寸的支架，将肽水溶液添加至预成型的铸模，如本文中所述，通过添加电解质诱导肽链自 组装成支架。所得的肽支架的几何形状和宏观尺寸由施用的肽溶液的浓度和量、用于诱导 支架组装的电解质的浓度和铸造装置的尺寸控制。
[0052] 必要时，肽支架可使用各种生物物理和光学仪器诸如圆二色性（⑶）、动态光散射、 傅立叶变换红外（FTIR)、原子力显微镜（ATM)、扫描电子显微镜（SEM)和透射电子显微镜 (TEM)来表征。例如，生物物理方法可用于测定肽支架中β折叠二级结构的程度。此外，纤 丝和孔径、纤维直径、长度、弹性和体积分数可使用扫描和透射电子显微镜术的定量图像分 析来测定。支架还可使用几种标准机械测试技术测量肿胀的程度、PH值和电解质浓度对支 架形成的影响、各种条件下的水合水平以及拉伸强度来检查。
[0053] 如下文中所述，自组装肽的水溶液是粘稠至凝胶样的，其粘度随时间而变化。当未 对溶液施加力（例如，剪切）时，肽溶液的粘度变得越来越高。其需要持续的力来保持自组 装肽溶液的低粘度。自组装肽的性质使配制比大多数液体配制更加困难。制造方法应当被 设计来使自组装肽满足医疗用的管理要求，并在商业规模制造中减少产品的损失，如下文 中描述的。
[0054] 溶解
[0055] 合成肽由制造商制备（例如，合成的），并且在合成后以干燥形式（例如，冻干的） 贮存。为了最终的纯化/灭菌和/或包装，应当将干燥的肽以适合用于最终用途/施用的 浓度溶解于溶剂（例如，水）中。
[0056] 灌装加工法以溶解步骤开始。在最广泛的实施方案中，通过将粉末状肽（例如，冷 冻干燥或冻干的肽）与水混合开始溶解。在一些实施方案中，水是抑菌性注射用水。在一些 实施方案中，水是无菌、去离子和/或蒸馏水。将肽溶解，以使肽的浓度为约〇. 1重量％至 约5重量％ (例如，约0. 2重量％、约0. 3重量％、约0. 4重量％、约0. 5重量％、约0. 75重 量％、约1.0重量％、约1.25重量％、约1.5%重量、约1.75重量％、约2.0重量％、约2. 25 重量％、约2. 5重量％、约2. 75重量％和其间的范围）。在一些实施方案中，该浓度是用于 最终应用和/或最终用途的溶液中的肽的浓度。肽溶液的最终应用或最终用途可影响所述 肽在溶液中溶解的浓度或确定所述浓度。在一些实施方案中，肽溶液具有约1重量％至约3 重量％的肽浓度。在重量百分比的计算中，所述肽粉末的水分含量可考虑在内。在一些实 施方案中，肽粉末的水分含量为肽粉末的约1重量％至约10重量％ (例如，约5重量％ )。 [0057] 在一些实施方案中，将肽粉末添加至预定量的水中。在一些实施方案中，缓慢地或 逐步地添加肽粉末以便在添加随后量的肽粉末之前，肽的一个添加完全溶解。因为本文中 所描述的灌装加工的一个目标是对肽溶液的灭菌，应采取适当地小心，以防止细菌污染。如 果可能的话，应对用于溶解的设备进行高压或蒸汽灭菌，或如果高压灭菌不适合于设备的 特定部分，通过照射（例如，紫外辐射）消毒。
[0058] 在溶解过程中，搅拌溶液。再次地由于粘度和溶解速率的原因，控制搅拌速度和时 间。在一些实施方案中，所使用的混合器包括轴向或径向流动叶轮和/或推进器、桨或涡轮 形叶轮。在一些实施方案中，混合器以不小于约500rpm的速度运行，但缓慢地从停止速度 升至该速度。例如，当添加肽粉末时，混合器始于约200rpm的速度。一旦所有粉末溶解，则 将混合器速度增加至约500rpm。混合器（用于初始粉末添加或用于混合溶解的粉末）的旋 转速度可在约30rpm至约1000 rpm (例如约50rpm、约60rpm、约75rpm、约lOOrpm、约120rpm、 约 180rpm、约 240rpm、约 360rpm、约 480rpm、约 600rpm、约 720rpm、约 840rpm、约 960rpm 以 及其间的范围）的范围内。本领域普通技术人员将理解，所述混合器的速度在很大程度上 取决于混合容器的容积和根据叶轮的速度，这又取决于所述叶轮的直径。其中V =叶轮的 速度，d =叶轮的直径，r =旋转速度，该速度可以通过V = π *d*r计算，并且随着容器尺寸 按比例扩大，应保持成比例。
[0059] -旦达到该速度，继续混合约30分钟（例如，约30分钟、约40分钟、约45分钟、 约60分钟和其间的值）。维持混合器速度的速率，以使溶液不偏离至这样的程度：溶液的 液滴从本体溶液产生并被抛向混合容器的壁。溶液的表面应该是连续的，虽然它并不需要 是水平或平面的（例如，涡流可在混合期间发生，然而，其表面应是连续的表面）。
[0060] 在搅拌和溶解过程中，从混合罐获取样品，并检查其以监测溶解。将样品离心以除 去任何夹带的气体。随后目视检查样品，以确保该肽的溶解，还可通过光度计检查所述样品 的溶解肽的含量。如果检查表明存在未溶解的粉末，则可延伸搅拌时间。如果检查表明肽 粉末溶解，则可将该溶液通过灌装加工法的下一阶段。
[0061] 如果所述溶液大体上完全溶解，则灌装加工法的下一步将是对溶液进行脱气（例 如，除气）。我们的工作表明，大体上脱气或脱气的溶液以更高效的方式继续通过过滤，在过 滤器中产生更少的废物和/或不太频繁的堵塞。
[0062] 第一脱气
[0063] 如本文中所用，脱气相当于除去气体，这是其中从液体移除溶解或夹带的气体 (例如，空气），或减少其在液体中的量的过程。第一脱气步骤通过任何可接受的脱气方法 来进行。例如，通过真空、离心、振动、液体-气体膜分离或使溶液自然脱气。在一些实施方 案中，脱气步骤通过真空（例如，通过改变对溶液的压力）来进行。在一些实施方案中，施 加的真空为至少-〇· OIMPa、-0· 015MPa、-0· 02MPa、-0· 025MPa、-0· 03、MPa、-0· 035MPa、-0· 04MPa、_0. 045MPa、_0. 05MPa、_0. 055MPa、_0. 06MPa、_0. 065MPa、_0. 07MPa、_0. 075MPa、_0. 08MP a、-0. 085MPa、-0. 09MPa、-0. 095MPa、-0. 098MPa、-0. 099MPa、-0.1 MPa 或以上。在一些实施 方案中，施加的真空为约-O.IMPa。本发明尤其涵盖这样的认识，即压力的下降速率（或真 空的升高）影响脱气方法的功效和效率，以及最终的过滤法。在一些实施方案中，压力下降 的速率是不超过约-〇. OlMPa/分钟（例如，约-0. 005MPa/分钟，大约-0. 0025MPa/分钟， 约-0.0 OlMPa/分钟，以及其间的范围）。在一些实施方案中，压力降低的速率取决于待脱气 的溶液的总体积。
[0064] 在一些实施方案中，脱气装置配备有脱气室（用于暂时保持所述肽溶液）和抽吸 装置（用于降低在脱气室中的压力）。抽吸装置可以是产生真空的任何设计或操作。在一 些实施方案中，所述装置可使用水射流的动态压力，或可以是任何类型的真空泵，或类似物 可以用作抽吸装置。
[0065] 优选的是，脱气室内部的肽溶液的巨大表面积与空气接触。因此，脱气室的形状和 尺寸可以是这样的，以使所述肽溶液与空气的接触表面积最大化。另外，至脱气室内的流入 可以是这样的，以便所述肽溶液沿着室的内壁循环，从而使接触表面积最大化。在一些实施 方案中，肽溶液至室内的流动可以是如沿着脱气室的内壁的薄膜。再次地，所述高表面积 (和肽溶液的表面积对体积的比率）可有助于脱气效率。然而，在一些实施方案中，只使肽 溶液流入脱气室可能就足够了。在一些具体实施方案中，允许高粘度（例如，具有大于约 15. 0帕斯卡-秒[Pa · s]的粘度）溶液流入脱气室。
[0066] 在一些实施方案中，在通气过程中搅拌溶液。在一些实施方案中，以约50rpm、 lOOrpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、400rpm 或 500rpm 的速度揽拌溶液。在一 些实施方案中，优选的是当将肽引入脱气室时，其已被加热。这种加热可降低溶液的粘度， 提高脱气效率。加热时应当小心，因为一些肽因热而发生降解，因而加热可能不适合所有情 况。
[0067] 可将搅拌与减压组合，以高效地从粘稠肽混合物脱气，但快速搅拌可能将气泡带 入混合物。为了从肽混合物脱气，以不低于约300rpm的速率操作混合器。如果不同时进行 搅拌的话，自组装肽混合物在脱气过程中变为凝胶状溶液。混合自组装肽溶液保持低粘度， 以使得溶液被有效地脱气。
[0068] 脱气步骤持续（即，维持真空的时间）至少约30分钟（例如，约15分钟、约20分 钟、约40分钟、约45分钟、约60分钟）。用于脱气的最终时间长度取决于结果，例如，所述 混合物大体上不含溶解的气体或气泡。在脱气过程中，获取溶液的样品，检查其溶解的气体 或气泡。如果溶解的气体或气泡仍然存在，则继续脱气过程。如果溶液充分不含溶解的气 体或气泡，则可继续灌装加工法。
[0069] 过滤
[0070] 适于根据公开的方法使用的过滤器无特别限制，可以包括表面过滤器，例如死端 过滤器（即，其中待过滤的流体垂直地接近过滤表面）和交叉流过滤器（即，其中待过滤 的流体平行于过滤器表面行进）。参见，例如，Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，第 10 卷，第 788-853 页（"Filtration")(第 4 版，1993 年）。所述过滤器在它 们的分类尺寸（即，高于其的分散材料保留在过滤器上的尺寸，和低于其分散材料通过进 入滤液的尺寸）方面也无特别限制。一旦过滤器的分类尺寸被选择用于特定应用（即，待 保留的分散材料对通过进入过滤器的分散材料），过滤器的操作应当考虑相对于被过滤的 特定蛋白质的剪切敏感性，由流过过滤器的载液产生的剪切力的量。
[0071] 在将混合物充分脱气后，进行过滤步骤。如上所述，我们已经发现一系列方法，所 述方法使得能够进行灭菌，所述灭菌不利用用于灭菌的热、化学和辐射方法，因为它们可以 降解肽。根据本发明，过滤是特别有用的用于肽混合物灭菌的方法。过滤在去除残留的碎 片和其它小颗粒以及以不会导致肽的降解的方式对肽溶液灭菌中是有效的。过滤器使用过 滤器与污染颗粒之间的两个主要类型的相互作用保留污染物。颗粒因其尺寸而被保留，并 且还可因至过滤器材料的吸附而被保留。颗粒与过滤材料之间的分子和/或电动力吸引这 些实体并将其保留在过滤器内。
[0072] -般而言，可定制过滤器的孔的尺寸来去除至少一部分包含在所述肽溶液中的污 染物，从而将去除的分散污染物保留在过滤器的上游侧（例如，入口侧），产生大体上不含 污染物的滤液。具体来讲，滤液不应当以可不利地影响纯化的肽溶液的使用的量含有污染 物。例如，当分散污染物包括微生物时，过滤器应当能够去除至少99. 9999%的最初存在于 溶液中的微生物，即用于医疗用途的无菌保证水平（SAL :KT6)。
[0073] 过滤器通常具有各种尺寸（即，过滤器表面积，例如从约0.0 Olm2至约IOm2)和构 型（例如，滤盘、过滤筒）。用于过滤器构造的材料被选择来与所述肽混合物相容（例如，防 止与溶液的粘附或过度摩擦）。可从材料形成多孔膜，所述材料是诸如磷酸纤维素、醋酸纤 维素、乙烯基聚合物、氟碳化合物、烯烃诸如聚乙烯（包括超高分子量聚乙烯）、聚丙烯、EVA 共聚物和α -烯烃、茂金属烯烃聚合物、PFA、MFA、PTFE、聚碳酸酯、乙烯共聚物诸如PVC、聚 酰胺诸如尼龙、聚酯、纤维素、醋酸纤维素、再生纤维素、纤维素复合材料、聚砜、聚醚砜、聚 芳砜、聚苯砜、聚丙烯腈、聚偏二氟乙烯（PVDF)及其混物物。取决于混合物，过滤器可以是 亲水或疏水的。优选的过滤器是亲水的，具有低的蛋白质/肽结合。
[0074] 在一些实施方案中，过滤步骤通过经过具有特定孔尺寸（例如，约0.2微米）的过 滤器过滤来进行。多孔膜包括通常具有取决于待从液体混合物中除去的分散污染物的尺寸 而选择的高度均匀的尺寸的孔。例如，在意欲用于除去微生物（同时允许蛋白质穿过滤膜 进入滤液）的无菌过滤操作中，孔优选地具有在约〇. 1微米至约〇. 5微米的范围内的尺寸。 在一些实施方案中，孔径尺寸为约〇. 15微米，约0. 1微米。合适的过滤系统还可以包括具有 例如0. 2微米的孔径的初级过滤器，以及较粗的预过滤器，以改善通量和限制在较细的过 滤器内的积累。较粗的预过滤器可具有在约〇. 4微米至约10微米的范围内的孔径。（例如， 约0. 4微米，约0. 45微米，约0. 5微米，约0. 6微米，约0. 7微米，约0. 8微米，约I. 0微米， 约1. 5微米，约100. 0微米）。预过滤器系统需要两个或更多个过滤器，以便肽混合物可在 预过滤器多丢失。此外，串联预过滤系统导致降低灭菌过滤器中的压力，其中初始高压力由 预过滤器降低。高度粘稠的肽混合物诸如自组装肽，需要高压（0. 5或更多兆帕斯卡（MPa)) 来进行过滤，因此，预过滤器和灭菌过滤器的串联不适合于粘性自组装肽的制造方法。
[0075] 在各种实施方案中，在如下范围内的压力下进行根据本发明的过滤：约 0· 3-0. 7(包括 0· 3 和 0· 7)，例如约 0· 30MPa、0. 31MPa、0. 32MPa、0. 33MPa、0. 34MPa、0. 35MPa、 0. 36MPa、 0. 37MPa、0. 38MPa、0. 39MPa、0. 40MPa、0. 41MPa、0. 42MPa、0. 43MPa、0. 44MPa、 0.45MPa、0. 46MPa、0. 47MPa、0.48MPa、0. 49MPa、0.50MPa、0. 51MPa、0. 52MPa、0.53MPa、 0. 54MPa、0. 55MPa. ;0. 56MPa、0. 57MPa、0. 58MPa、0. 59MPa、0. 60MPa、0. 61MPa、0. 62MPa、 0· 63MPa、0. 64MPa、0. 65MPa、0. 66MPa、0. 67MPa、0. 68MPa、0. 69MPa、0. 70MPa。在一些实施 方案中，在约0.4-0. 6MPa(包括0.4和0.6MPa)的范围内进行过滤。在一些实施方案中， 在约0.5-0. 6MPa(包括0.5和0.6MPa)的范围内进行过滤。在一些实施方案中，在约 0. 5-0. 55MPa (包括0. 5和0. 55MPa)的范围内进行过滤。
[0076] 在一些实施方案中，在约0. 40MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施 方案中，在约〇. 41MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约0. 42MPa 的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约〇.43MPa的压力下进行根据 本发明的过滤；在一些实施方案中，在约0. 44MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一 些实施方案中，在约〇.45MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约 0· 46MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约0· 47MPa的压力下进行 根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约〇. 48MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在 一些实施方案中，在约0. 49MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约 0· 50MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约0· 51MPa的压力下进行 根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约〇. 52MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在 一些实施方案中，在约0. 53MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约 0· 54MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约0· 55MPa的压力下进行 根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约〇. 56MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在 一些实施方案中，在约0. 57MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约 0· 58MPa的压力下进行根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约0· 59MPa的压力下进行 根据本发明的过滤；在一些实施方案中，在约〇. 60MPa的压力下进行根据本发明的过滤。
[0077] 在一些实施方案中，在过滤过程中监测压力；在一些此类实施方案中，可进行调整 以将压力保持在所需范围内。在一些实施方案中，偶尔地监测压力。在一些实施方案中，定 期监测压力。在一些实施方案中，连续监测压力。
[0078] 在一些实施方案中，通过对真空装置的控制选择压力。在一些此类实施方案中，连 续监测实际施用的压力。在一些此类实施方案中，离散地监测实际施用的压力。
[0079] 为了开始过滤，缓慢地充注过滤器，以便溶液不夹带气体，（例如，预涂覆），和迫 使所有气体从过滤器容器释放出来。在一些实施方案中，通过将肽混合物自动和/或人工 地添加至过滤器外壳，用所述混合物预灌注滤器。可在〇. 〇5MPa或更低压力下进行肽混合 物至过滤器外壳的自动添加。在一些实施方案中，将与初级过滤泵分离的泵用于充注过滤 器容器。另外的方法可用于产生压力，包括但不限于重力、压缩气体（例如，空气）。
[0080] 过滤器、膜或另外的方式可以以死端或法线流（NF)形式或切向流（TFF)形式运 行。通常地，法线流可优选地确保适当的灭菌和最大化过滤步骤的效力。选择取决于许多 因素，主要是用户的偏好或已安装的过滤。当大量的肽将被回收时，TFF法和设备可以是优 选的，因为TFF相较于NF法较少经历堵塞或结垢。
[0081] 还可任选地控制过滤过程中的温度。肽溶液的粘度基于温度而变化，并且粘度反 过来影响过滤效率和功效。在一些实施方案中，过滤过程中的温度在约〇°C至约40°C。（例 如，约10°C、20°C、30°C )。还可任选地控制过滤过程中的温度以防止肽的降解（例如，温度 应当不超过l〇〇°C )。
[0082] 过滤器和相关设备均可进行高压灭菌和/或蒸汽灭菌。为了保持无菌过滤的溶 液，将溶液从纤维捕获至无菌袋（例如，Millipore Mobius)或连接至过滤器的出口的无菌 不锈钢罐中。可使用另外的一次性设备（即，轮廓介质（figure media)、外壳等）来确保无 菌。
[0083] 在一些实施方案中，为了确保基本上所有的肽混合物被送入过滤器，在过滤进料 罐中使用刮刀，以除去粘附在罐表面上的任何肽混合物。如果刮刀不用于自组装肽混合物， 则将混合物放置在研磨钵状的罐中，因为压缩的肽混合物变得像凝胶。或者，可使用管道辅 助装置（例如，清管器）。将肽混合物在约〇· 1至约IMPa的压力（例如，约0· 5MPa)下通过 过滤器过滤。过滤的流速为约0.5至约5升/分钟。我们的工作表明，在过滤过程中可随 流速变化的压力似乎对过滤运行的功效具有更大的影响。
[0084] 可以以反压模式操作过滤器，这导致过滤器出口处的压力大于大气压。为了有效 地对过滤器施加反压并避免压力被降低，压力源与过滤进料罐之间的附加罐可以是可用 的，因为压缩气体的压力将因过滤进料罐的空域的膨胀而降低。反压可以通过任何合适的 来源例如常规阀门、流动缢缩（例如，孔板）、压力调节器来施加。正压（例如，入口压〉出 口压）驱动肽溶液通过过滤器。在一些实施方案中，压力差可以是低的，合适的最大压力差 取决于多种因素，包括待过滤的肽的浓度和类型。在一些实施方案中，压力差为约〇. OlMPa 至约IMPa (例如，约0. 5MPa)。
[0085] 在这样的压力差下，通过过滤器的流速足够低，以产生大体上不损害溶液中的肽 的低剪切环境。此外，低剪切环境不限制在过滤过程（例如，因粘度作用、阻塞而限制过滤 效率或功效，或在过滤器中产生气袋）。
[0086] 过滤后，过滤器可能被高压损坏；在许多实施方案中，适当地或期望地通过完整性 测试检查过滤器，以评估损坏是否可能已经削弱了灭菌的质量。在许多实施方案中，将在完 整性测试之前洗涤（例如，通过水，特别是例如，通过热水和/或通过高压水）过滤器。在 一些实施方案中，这样洗涤除去或可以除去可能一直保持在过滤器中的溶液，应理解，这样 的残留溶液有时会影响测试数据。在一些实施方案中，用蒸汽和/或通过高压灭菌来洗涤 过滤器。在一些实施方案中，用于洗涤过滤器的方法可降解残留在过滤器中的肽。例如，在 一些实施方案中，在一定条件下进行方法（例如，包括水洗[例如，高压和/或热水]，蒸汽 洗涤，高压灭菌等）并进行足以降解这样的肽的时间。在一些实施方案中，用具有在约70°C 至80°C的范围内（包括70°C和80°C)的温度的水洗涤过滤器，随后进行完整性测试。在一 些特定实施方案中，用具有约70°C的温度的水洗涤过滤器，随后进行完整性测试。
[0087] 第二脱气
[0088] 过滤后，肽溶液经历脱气步骤。在该第二脱气步骤中，应当保护现有无菌混合物免 受任何污染，诸如来自驱动部件的金属微粒。因此，可进行第二脱气而无进一步的设备（例 如，旋转式叶轮）与肽溶液接触。在一些实施方案中，溶液通过上述脱气法（如，减压/抽 真空、振动、沉降）来进行脱气。
[0089] 在一些实施方案中，所述混合物通过振动脱气来降低肽混合物的粘度。在一些实 施方案中，振动可通过轨道摇床来诱导。在一些实施方案中，脱气振动运动存在于一个以上 的维度中。例如，含有已灭菌的肽溶液的容器在X轴和y轴（和/或任选的Z轴）方向上 运动。这与简单的一维（或单一轴）振动（即，摇动）成对比。在一些实施方案中，可将压 力降低与振动组合以进行有效脱气。
[0090] 为所述装置的振动运动提供工具以用于改变所述装置在任何特定方向上移动的 旋转速度和距离。在一些实施方案中，振动频率为约50转/分钟和任何特定的方向。在一 些实施方案中，振动频率在约20转/分钟至约360转/分钟的范围内，例如约30、40、50、 60、90、100、120、150、180、210、240、300、360转）。振动的圆形方向是顺时针或逆时针或两 者的组合。在一些实施方案中，所述振动运动的距离约为-20cm至约20cm。
[0091] 在一些实施方案中，通过真空中进行所述脱气步骤。使溶液的压力下降至少 约-0· 05MPa(例如，-0· OIMpa、-0· 015MPa、-0· 02MPa、-0· 025MPa)。我们已认识到压力 的下降速率（或在真空的升高）影响脱气方法的功效和效率。在一些实施方案中，压力 的下降速率不超过约-o. OlMPa/分钟（例如，约-o. 005MPa/分钟、约-o. 0025MPa/分钟、 约-0.0 OlMPa/分钟以及其间的范围）。在一些实施方案中，压力的下降速率取决于待脱气 的溶液的总体积。
[0092] 第二脱气步骤还导致均匀混合的溶液。
[0093] 示例性振动脱气设备包括来自Medical&Food System Co. ,Ltd.的装置模型（JP0 专利申请号2010-161052 ;公布号2012-11364)。
[0094] 灌装
[0095] 在第二脱气步骤后，肽混合物适用于灌装至注射器中。注射器可以是任意尺寸，例 如，11^、21^、31^、511^、1〇111匕此外，注射器可以是任何构造材料（例如，玻璃、聚乙烯等）。 基于目视检查、称重来确定适当的灌装。每一个注射器的目标容积取决于溶液的粘度。
[0096] 将注射器放置在灌装站，将已灭菌的肽溶液以所需数量泵入注射器。在一些实施 方案中，随后在引入肽溶液之后，但在添加柱塞之前，将真空施加于注射器。真空的速率部 分取决于肽溶液的粘度和沸点。可选择施真空的加速率，以便其应用不向肽溶液中引入气 泡。灌装注射器的其它方面包括将所述柱塞置于注射器中。应当这样放置柱塞，以便其与 肽混合物接触，但不封住肽混合物与柱塞之间的空气，以及未扰动肽混合物至这样的程度， 即溶液在注射器内飞溅或将空气掺入肽混合物中。
[0097] 在注射器被灌装后，目视检查其的（a)任何异物或可见污染物（b)针对注射器本 身的任何瑕疵、损坏或缺陷；和（c)任何泄漏。在过程中，检查包括但不限于利用紫外光分 光镜法和/或整体氮含量、HPLC 、质谱图、pH值、胶凝化和/或粘度、细菌污染和内毒素、重 金属判定、残留溶剂的测量来测量的肽浓度。可在整个过程中重复进行和在灌装加工法完 成后（作为最终质量控制）进行这些检查参数。注射器随后经历最终装配，这可包括柱塞、 把手的添加和粘贴标签。可将注射器包装进多单元包（例如，1、2、3、4、5个等，单元枕头或 泡罩包装）以用于运输和贮存。双包装也可用于在用于手术室之前避免注射器表面的细菌 污染。
[0098] 包装后，通过环氧乙烷气体（"E0G"）或过氧化氢气体灭菌对包装进行灭菌。在每 一个步骤后，或在一批肽溶液已被处理后，可按照cGMP标准清洁处理设备。可原位清洁所 述设备，或将其拆卸并逐片清洁。此外，处理设备可通过常用灭菌技术（例如，高压灭菌、辐 射、EOG等）进行灭菌。
[0099] 清洁设备
[0100] 高粘度肽混合物常常粘附于罐和管道的表面。遵照CGMP清洁所有设备对于粘肽 混合物是如此之难，以至制造商寻求有效的清洗方法。因为通常通过暴露于高温（例如， 121°C)来降解肽，因此蒸汽或热水可用于从罐和管道的表面上除去肽混合物。原位清洗 (CIP)中对蒸汽的暴露和分离的设备的高压灭菌对于清洁设备都是有效的。由于自组装肽 也可通过蒸汽或高压灭菌器降解，因此在暴露于水蒸汽或高压灭菌器后，肽可通过用水漂 洗除去。遵照cGMP，在设备上剩余的肽可以通过总有机碳（TOC)测量来检查，清洁效率可通 过TOC进行验证。 实施例
[0101] 自组装肽溶液的示例性生产验证
[0102] 本实施例举例说明了使用方法生产自组装肽溶液，所述方法包括：第一脱气步骤， 其中通过降压来对含肽混合物进行脱气；通过无菌过滤器过滤所述混合物；和第二脱气步 骤，其中通过振动和降压来对滤液进行脱气。
[0103] 简而言之，使用原始肽Ac-(RADA)4-NH2 (批号12103001)在IOL批次规模上生产 2. 5%的肽溶液。示例性生产条件如下：
[0104] 溶解（60分钟）：10kg注射用水，256. 7克的肽和300至500rpm的叶轮转速。
[0105] 第一脱气步骤（60分钟）：-0. 099MPa至-0.1 OOMPa的空气真空和250rpm的叶轮 转速。
[0106] 过滤步骤：20"药筒、0· 2 μm无菌过滤网（Millipore Express SHF)、0· 05Mpa 的预 灌注压、0. 5MPa的反过滤压、35cm(与溶解罐的刮刀直径相似）的刮刀直径、具有40L容量 的压力源罐和用于使用完整性测试仪（INTEGRITESP-MSystem，Millipore)的完整性 测试（纯蒸汽于100°C -130°C持续30分钟）的洗涤过虑器。洗涤过滤器上的肽溶液，随 后进行完整性测试（例如，通过水，特别是例如，通过热水和/或通过高压水）。
[0107] 第二脱气步骤（60分钟）：0· 099MPa至-0· IOOMPa的空气真空、IOOrpm的圆形转 速和IOcm的振动模式距离。
[0108] 使用高速灌装机将所得的肽溶液用于以灌装制品。例如使用10I/10FF/10I机（KT Manufacturing Co. Ltd.)，利用两个灌装嘴以1000个制品/小时的速度灌装注射器。将 ImL (574个制品）、3mL (1164个制品）和5mL (250个制品）变化的产品经历环氧乙烷气体以 进行最终的灭菌。
[0109] 综上所述，本实施例表明本文中所述的制造和纯化肽溶液的方法有效地为各种科 学和医学应用提供适当包装的肽溶液而无对肽混合物的任何降解或物理变化。
[0110] 至此已经描述了本发明的至少一个实施方案的若干方面，应理解，各种变化、变动 和改进对本领域普通技术人员来说将是容易进行的。这样的改变、变动和改进旨在是本公 开内容的部分，并且意欲在本发明的精神和范围内。因此，上述描述和附图仅仅是举例说明 性的，本发明通过下列权利要求详述地描述。
[0111] 在权利要求中使用序数术语诸如"第一"、"第二"、"第三"等来修饰声称元素本身 并不意味着任何优先权、优先级或一个声称元素优于另一个的顺序或其中执行方法的时间 顺序，而仅用作区分一个具有特定名称的声称元素与另一个具有相同名称（若非使用序数 术语的话）以区分所述声称元素的标记。
[0112] 如本文中的说明书和权利要求中所用，除非明确地相反地指出，否则冠词"一个/ 种"应理解为包括复数个指示物。除非指示相反或另外地根据上下文很明显，否则如果一 个、超过一个或所有组成员存在于给定的产品或方法中，用于所述产品或方法，或以其它方 式与其相关，则包括组的一个或多个成员之间的"或"的权利要求或描述被认为是满意的。 本发明还包括实施方案，其中组的正好一个成员存在于给定的产品或方法中，用于所述产 品或方法中，或以其它方式与所述产品或方法相关。本发明还包括实施方案，其中超过一个 组成员或整个组成员存在于给定的产品或方法中，用于所述产品或方法中，或以其它方式 与所述产品或方法相关。此外，应理解，本发明涵盖所有变化、组合和变换，其中除非另有 说明或除非对于本领域普通技术人员来说显而易见的是可产生矛盾或不一致，否则取决于 相同的基础权利要求（或者，如相关，任何其它权利要求），来自所列权利要求的一项或多 项的一个或多个限制、元素、条款、说明性术语等被引入另一个权利要求。当元素被表示为 列表，（例如，在Markush组或类似格式中）时，应理解，本发明还公开了元素的每个亚组， 并且任何元素可从该组中删除。应理解，在一般情况下，当本发明，或本发明的方面被称为 包含特定元素、特征等时，本发明的某些实施方案或本发明的方面由这样的元素、特征等组 成，或基本上由所述元素、特征等组成。为简单起见，这些实施方案在每一种情况下在用本 文中未用这么多的词汇进行描述。还应理解，本发明的任何实施方案和方面可被明确地排 除在权利要求中，无论具体排除是否在权利要求中被引述。本文中参考以描述本发明的背 景和提供关于其实施的额外细节的出版物、网站及本文参考材料通过引用并入本文。
【主权项】
1. 一种方法，其包括以下步骤： 第一脱气步骤，其中通过降压来对含肽混合物进行脱气， 通过无菌过滤器过滤所述混合物；和 第二脱气步骤，其中通过振动和降压来对滤液进行脱气。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述灭菌过滤器具有小于约0. 22ym的平均孔径。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述肽是自组装肽。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述肽包含RADA16-I(SEQIDNO: 1)。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述肽包含IEIK13(SEQIDN0:39)。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一脱气步骤包括以低于约-0.OlMPa/分钟 的速率降低所述混合物的压力。7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一脱气步骤包括使压力降低约至 少-〇? 095MPa。8. 根据权利要求7所述的方法，其中将所述低压维持至少约30分钟。9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第二脱气步骤包括以150转/分钟振动所述 混合物并且振动运动的偏心距离为-IOcm至10cm。10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第二脱气步骤包括使压力降低约至 少-〇? 095MPa。11. 根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述肽与溶剂混合，随后进行所述第一脱 气步骤。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述溶剂为水。13. 根据权利要求1所述的方法，其还包括在所述第二脱气步骤之后用所述混合物对 制品进行无菌灌装。14. 根据权利要求13所述的方法，其中在所述第二脱气步骤后至少5小时灌装所述制 品。15. 根据权利要求13所述的方法，其中所述制品为注射器、小袋、小瓶、管。16. 根据权利要求13所述的方法，其还包括用气体可渗透材料包装灌装的制品和所述 灌装步骤后的灭菌步骤。17. 根据权利要求16所述的方法，其中气体灭菌通过环氧乙烷气体来进行。18. 根据权利要求16所述的方法，其中气体灭菌通过过氧化氢气体来进行。19. 根据权利要求16所述的方法，其中包装所述制品利用单包装来进行。20. 根据权利要求16所述的方法，其中包装所述制品利用双包装来进行。21. 根据权利要求1所述的方法，其中在约0. 5MPa的压力下进行所述过滤。22. 根据权利要求21所述的方法，其中在约环境温度下进行所述过滤。23. 根据权利要求1所述的方法，其中所述过滤器由选自以下的材料构造：硝酸纤维 素、醋酸纤维素、乙烯基聚合物、氟碳化合物、聚乙烯、超高分子量聚乙烯、聚丙烯、EVA共聚 物和a-烯烃、茂金属烯烃聚合物、？?八、10^、？1?￡、聚碳酸酯、乙烯共聚物、聚酰胺、尼龙、聚 酯、纤维素、醋酸纤维素、再生纤维素、纤维素复合材料、聚砜、聚醚砜、聚芳砜、聚苯砜、聚丙 烯腈、聚偏二氟乙烯（PVDF)及其混物物。24. 根据权利要求1所述的方法，其中所述过滤器由聚醚砜构造。25. 根据权利要求1所述的方法，其中所述过滤步骤包括在第一压力下灌装所述过滤 器，随后升高压力以进行所述过滤的步骤。26. 根据权利要求1所述的方法，其中洗涤所述过滤器，随后进行完整性测试。27. 根据权利要求26所述的方法，其中用水洗涤所述过滤器，随后进行完整性测试，任 选地用热水和/或高压水洗涤所述滤器。28. 根据权利要求26所述的方法，其中利用蒸汽和/或高压灭菌洗涤所述过滤器，随后 进行完整性测试。29. 根据权利要求1所述的方法，其中将附加罐置于压力源与过滤进料罐之间以保持 压力作为进行所述过滤的压力源。30. 根据权利要求1所述的方法，其中使用刮刀将几乎所有所述溶液从过滤进料罐送 入过滤器。31. 根据权利要求1所述的方法，其中所述过滤步骤包括使用清管器帮助过滤。32. 根据权利要求1所述的方法，其中在平行操作的两个过滤器中进行所述过滤步骤。33. 根据权利要求1所述的方法，其还包括清洁步骤，所述步骤包括将蒸汽添加至过滤 和脱气设备。
【专利摘要】所附公开尤其描述了一种方法，所述方法包括以下步骤：第一脱气步骤，其中通过降压来对含肽混合物进行脱气；通过无菌过滤器过滤所述混合物；和第二脱气步骤，其中通过振动和降压来对滤液进行脱气。
【IPC分类】C07K1/34, B01D27/14
【公开号】CN104902974
【申请号】CN201380046268
【发明人】野原正弘, 长谷川佑也
【申请人】三维矩阵有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年7月3日
【公告号】EP2869903A2, US20150197359, WO2014008400A2, WO2014008400A3
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