1-[1-(苯甲酰基)-吡咯烷-2-羰基]-吡咯烷-2-甲腈衍生物的制作方法
1-[1-(苯甲酰基)-吡咯烷-2-羰基]-吡咯烷-2-甲腈衍生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有药理活性的化合物，并且更特别地，涉及一些1-[1-(苯甲酰 基）-吡咯烷-2-羰基]-吡咯烷-2-甲腈衍生物、制备这类化合物的方法、包含其的药物组 合物及其在治疗和/或预防认知障碍中的用途。
【背景技术】
[0002]脯氨酰寡肽酶（EC 3. 4. 21. 26) (POP)，也称为脯氨酰内肽酶（PREP)，是催化肽在 L-脯氨酸残基的C端侧水解的丝氨酸蛋白酶。其广泛分布在哺乳动物中并且可从多种器官 (包括脑）中纯化。
[0003] 该酶在与学习和记忆功能有关的含脯氨酸神经肽的断裂中发挥着重要作用（Wilk S 等，Life Sci. 1983 ;33 :2149-57 ;0' Leary RM，0，Connor B，J. Neurochem. 1995 ;65 : 953-63)〇
[0004] 在治疗与神经退行性进程有关的认知缺陷时测试了脯氨酰寡肽酶抑制的作用。通 过用1-甲基-4-苯基-1，2,3,6-四氢吡啶（MPTP)处理，在猴中产生了帕金森病，MPTP是 导致P物质耗尽的神经毒素。随后用S-17092(强力的POP抑制剂）治疗增加了认知任务 的成绩（Schneider JS 等，Neuropsychopharmacology 2002 ;26(2) :176_82)。还发现，POP 抑制防止了 a -突触核蛋白在体外的寡聚化[My8h錢！ien TT等，Br. J. Pharmacol. 2012 ; 166(3) :1097-113]。在阿尔茨海默病（AD)的情况下，在动物模型中进行的数个体内实验 表明，POP抑制引起了神经保护和认知增强作用（Kato A等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997 ; 283(1):328-35和1'〇丨(16 1(等，1^￥.他111'〇8(^.1998;9(1):17-29)。最初，1^七8油6小组在 通过用POP抑制剂0N0-1603处理来使皮层和小脑颗粒细胞免于年老诱导的凋亡时，观察到 了神经保护作用（Katsube N 等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999 ;288(1) :6_13) 〇
[0005] 仅在少数情况下，进行了用POP抑制剂治疗认知缺陷的临床试验。在I期临床研 宄中，Morain 小组（Morain P 等，Br. J. Clin. Pharmacol. 2000 ;50 (4) :350_9)发现，一种新 的口服活性脯氨酰内肽酶抑制剂S 17092在健康的老年对象中显示出认知增强特性和清 晰的剂量依赖性；而且，没有检测到副作用。稍后的研宄表明了该化合物另外的微小的情绪 稳定特性（Morain P 等，Neuropsychobiology 2007 ;55 (3-4) : 176-83)。
[0006] 据报道，在多种神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病（AD)、帕金森病、亨廷顿病和 多发性硬化（MS))中，脯氨酰寡肽酶活性发生改变（死后）（Mantle D等，Clin. Chim. Acta 1996 ;249 (1-2) :129-39)。
[0007]还存在大量的证据指明了神经炎症在神经退行性疾病（如AD、MS和帕金森 病）的发病机理中的作用（Hirsch EC 等，Lancet Neurol. 2〇〇9;8(4) :382-97，Philips T等，Lancet Neurol. 2011 ;10(3) :253-63)。POP被认为是由脑中的T0 4释放抗炎性 四肽 Ac-SDKP 的主要酶（Yang F 等，Hypertension 2004 ;43 (2) :229-36，Nolte WM 等， Biochemistry ;2009 ;48 (50) : 11971-81)。这表明POP的抑制可帮助减少神经炎症，并因此 POP抑制剂可用于治疗具有炎症组分的神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病，并且 特别地，帮助改善与这些疾病相关的认知障碍。
[0008] 皮质脑区中遍布的老年斑是AD的典型神经病理学标志。这些斑的主要蛋白质组 分是淀粉样肽（Af3)。A0沉积引起脑中的神经元功能障碍和死亡。该肽来源于淀 粉样前体蛋白（APP)。在正常情况下，APP被a-分泌酶切割产生可溶的APP a，从而阻止 了 A0生成。
[0009] 有趣的是，POP抑制提高了细胞内IP3水平，其可有助于刺激APP a产生，进而减 少A0生成。
[0010]另外，Rossner (Rossner S 等，Neurochem. Res. 2005 ;30 (6-7) :695_702)发现，受 A|3斑影响的AD患者的脑结构中具有较少的POP免疫反应性神经元。
[0011] 另外，P物质似乎可抑制0 -淀粉样蛋白的神经毒作用（Kowall NW等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1991 ;88(16) :7247-51)。脯氨酰寡肽酶抑制剂抑制P物质的代谢，从而帮助 维持可抑制0 _淀粉样蛋白神经毒作用的P物质的水平。
[0012] 鉴于上述作用，认为脯氨酰寡肽酶抑制剂可能是用于治疗阿尔茨海默病以帮助改 善与该疾病相关的认知障碍的有用药物。
[0013] 脯氨酰寡肽酶也与可能与多发性硬化（MS)有关的多种因素有关。例如，POP参与 小胶质细胞毒性的调节（Klegeris A等，Glia 2008;56(6) :675-85)。实际上，最近的报道 确定了 POP与MS之间的直接关系；RR-MS患者的血衆POP活性显著降低（Tenorio-Laranga J等，JNeuroinflammation 2010 ;7 :23)。有趣的是，该降低与疾病症状的严重程度相关，而 不与患者年龄相关。相反地，在健康对照中观察到POP活性与年龄之间的负相关（inverse correlation)，并且在老年对照中，其水平与MS患者中发现的水平相当。
[0014] 帕金森病的神经病理学标志是黑质部中黑化的多巴胺能神经元以及细胞内包涵 体（称为卢伊体（Lewy body))的进行性退化。卢伊体的主要组分是140个氨基酸的蛋白 质一一a-突触核蛋白。在某些情况下，a-突触核蛋白单体相互作用形成纤维前体聚集 体（prefibrillar aggregate)或初原纤维，其可产生细胞毒性的可溶原纤维。这些原纤 维不能被蛋白酶体降解，并且其损害该细胞内蛋白水解系统的功能。这导致了 a-突触 核蛋白初原纤维（和另一些被蛋白酶体降解的蛋白质）在细胞溶胶中积累（Bennett MC， Pharmacol. Ther. 2005 ;105(3) :311-31)，并因此使帕金森病患者脑中的a-突触核蛋白 初原纤维增加。在a-突触核蛋白过表达细胞和小鼠模型中，这些原纤维与神经毒性有 关（Masliah E 等，Science 2000 ;287(5456) :1265-9;Gosavi N 等，J.Biol.Chem. 2002; 277(50) :48984-92)。错误折叠的a-突触核蛋白的异常积累可引起线粒体变化，这可促 进氧化应激并引起细胞死亡（Hsu LJ等，Am.J.Pathol.2000;157(2):401-10)。此外，已 知a-突触核蛋白基因的三个点突变（A53T、A30P或E46K)涉及到帕金森病家族形式的发 病机理（Polymeropoulos MH 等，Science 1997 ;276 (5321) :2045_7;Zarranz JJ 等，Ann. Neurol. 2004 ;55(2) :164-73)。
[0015] 在体外已显示出，当将a-突触核蛋白与野生型猪POP的克隆一起孵育时，a-突 触核蛋白的聚集速率增加，并且该增加依赖于POP浓度（Brandt I等，P印tides 2008; 29(9) : 1472-8)。而且，不具有POP活性的突变变体（S544A)不使聚集速率加快。
[0016] 添加POP抑制剂也可防止增加的聚集，表明该作用依赖于POP酶活性。最近的证据 表明，POP抑制剂在人a -突触核蛋白过表达的成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞中可阻断由氧化 应激诱导的a -突触核蛋白聚集增加My6h3neilTT等，Br. J. Pharmacol. 2012 ;166(3): 1097-113。POP与a-突触核蛋白共同定位在SH-SY5Y细胞中，并且这种共同定位在与POP 抑制剂一起孵育后消失，指明了 POP与a-突触核蛋白之间的相互作用。用POP抑制剂处 理5天降低了 A30P a-突触核蛋白转基因小鼠的脑中可溶a-突触核蛋白的量。
[0017] 因此，抑制脑POP活性可防止a -突触核蛋白聚集，并因此防止卢伊体中细胞毒性 初原纤维的形成。因此，POP抑制剂在治疗已描述有加速的a-突触核蛋白聚集的神经退 行性疾病中可潜在地具有治疗价值。
[0018] 能够抑制POP的化合物可有效用于防止大鼠中由莨菪胺诱导的实验性遗忘，推测 POP抑制剂具有减缓记忆功能障碍的功能（Yoshimoto T等，J.Pharmacobiodyn. 1987 ;10 : 730-5)〇
[0019] 在Morris水迷宫中对大鼠测试了亚长期（subchronic)施用迷迭香酸（非竞争 性POP抑制剂）的作用（具有63. 7 y M的相对高的IC50值），并且报道了空间记忆的增强 (Park DH 等，Fitoterapia 2010;81(6) :644_8)〇
[0020] 已发现双相障碍患者在血清中具有POP的高水平活性。近年来，POP作为用于治 疗这种疾病的靶标是重要的，这尤其是因为其参与肌醇-1，4,5-P3(IP3)的代谢。IP3是在 神经肽级联中转导信号的关键分子。通过与特定受体结合，神经肽诱导IP3增加，IP3与其 在内质网膜上的受体结合并诱导认为在学习和记忆中发挥至关重要作用的Ca2+释放。最 近的发现表明 POP 调控 IP3 的浓度（Komatsu Y J. Neurosci. 1996 ; 16 :6342-52)。因此，知 道了在真核生物盘基网柄菌<X*ictyostelium discoideum)中破坏POP基因通过使IP3升 高诱导了锂抗性（Schulz I 等，Eur. J. Biochem. 2002 ;269 :5813-20)，并且还降低了 POP 的 蛋白水解活性，这是神经胶质瘤细胞中的高浓度IP3的原因（抵抗人P0P(antisense human for POP))。当用特异性POP抑制剂处理这些细胞时，也观察到这种作用（Williams RS等， EMB0 J. 1999;18 :2734-45)。
[0021] IP3信号传导途径涉及多种药物治疗性情绪稳定剂（锂、卡马西平和丙戊酸） 的作用，并且其在调节IP3信号传导的机制中缺陷可造成双相障碍。而且，常用于治疗 双相障碍的情绪稳定剂药物丙戊酸直接抑制重组POP的活性（Cheng L等，Mol. Cell. Neurosci. 2005 ;29 :155-61)。总之，存在有力的证据证明POP抑制剂可用于在哺乳动物中 预防和/或治疗双相情感障碍。因此，提供POP的新型抑制剂在治疗这种障碍或疾病中是 令人感兴趣的。
[0022] 总之，已对数种POP抑制剂在各种认知任务中的作用进行了表征，并且达成了一 些共识：P0P抑制剂对学习与记忆具有积极作用（Morain P等，CNS Drug. Rev. 2002 ;8(1): 31-52 ;Shinoda M 等，Eur. J. Pharmacol. 1996 ;305 (1-3) :31_8 ;Marighetto A 等，Learn. Mem. 2000 ;7 (3) : 159-69 ;Toide K 等，Pharmacol. Biochem. Behav. 1997 ;56 (3) :427_34 ; Schneider JS 等，Neuropsychopharmacology 2002 ;26 (2) :176_82)。
[0023] 数个专利和专利申请公开了 POP抑制剂：W0 2008/077978 Al、W0 2005/027934 A1、JP 2011-037874 A2、W0 2005/002624 AUTO 2004/060862 A2、W0 03/04468 A1、DE 196 03 510 Al、US 2006/0100253 A1和US 6,159,938 A，但是仅几种化合物进行了体内研宄 (JTP-4819、S17092、Z-321、0N0-1603、Y-29794、ZTTA、Z-Pro-Prolinal 和 KYP-2047)，该列 表中仅前三种进入了临床试验并且没有一个实现市场交易。
[0024] 尽管存在POP抑制剂，但是本领域中仍然需要提供对POP具有高亲和力并且具有 穿过血脑屏障到达脑部（当用于治疗认知障碍时抑制剂发生作用的地方）的良好能力的替 代化合物。这是化合物成为用于治疗认知障碍的良好候选物的重要特征。
[0025] 发明简述
[0026] 本发明现在已成功地发现，一系列的1-[1_(苯甲酰基）_吡咯烷-2-羰基]-吡咯 烷-2-甲腈衍生物不仅能够以高效力抑制P0P，而且能够穿过平行的人工膜，所述穿过平行 人工膜是普遍接受的用于预测穿过血脑屏障之能力的方法。这两种特性使得本发明化合物 成为用于治疗认知障碍的理想候选物。
[0027]因此，本发明的一个方面涉及具有式（I)化合物或其可药用盐、异构体、前药或溶 剂合物：
[0028]
[0029] 其中
[0030] R1、R2、R3和R 4独立地选自C i_4烷氧基、C i_4烷基幾基氧基、苄基氧基、苯基幾基氧 基、奈基幾基氧基、卩奎琳基幾基氧基、异卩奎琳基幾基氧基、二氣甲基、卤素和氣；
[0031] R5选自卤素、臆、Ci_4烷氧基、Ci_4烷基硫基、Ci_4烷基、Ci_4烷基幾基氧基、苯基、苯 氧基、苯硫基和二氣甲基；
[0032] R6选自氢、氟和甲基。
[0033] 本发明的另一个方面涉及用于制备如上所限定的式（I)化合物或其可药用盐、异 构体、前药或溶剂合物的方法。
[0034] 本发明的另一个方面涉及药物或药物组合物，其包含至少一种如上所限定的式 (I)化合物或其可药用盐、异构体、前药或溶剂合物，以及可药用载体、辅药或载剂。
[0035] 本发明的又一个方面涉及如上所限定的式（I)化合物或其可药用盐、异构体、前 药或溶剂合物，其用作药物，特别地用于预防和/或治疗认知障碍。
[0036] 本发明的再一个方面涉及用于在哺乳动物中治疗或预防认知障碍的方法，其中向 有所述治疗之需要的患者施用治疗量的如上所限定的式（I)化合物或其可药用盐、异构 体、前药或溶剂合物。在一个特别的实施方案中，所述障碍是与选自以下的疾病相关的认知 障碍：精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病和帕金森病。
[0037] 本发明的另一个方面涉及如上所限定的式（I)化合物或其可药用盐、异构体、前 药或溶剂合物用于制备药物的用途，所述药物特别地用于预防和/或治疗认知障碍，并且 更特别地，用于预防和/或治疗与选自以下的疾病相关的认知障碍：精神分裂症、双相情感 障碍、阿尔茨海默病和帕金森病。权利要求书中也对这些方面及其优选实施方案进行了限 定。
【附图说明】
[0038] 图1是对于PBS+载剂、MK-801+载剂以及MK-801+实施例4的化合物，比较在新 物体识别（novel object recognition，N0R)测试中获得的结果的图。
[0039] 图2是对于PBS+载剂、MK-801+载剂以及MK-801+实施例4的化合物，比较在被 动逃避任务测试中获得的结果的图。
[0040] 发明详述
[0041] 在本发明的上下文中，以下术语具有以下详细说明的含义。
[0042] 如本文所使用的，作为基团或基团一部分的q_4烷基定义为具有1至4个碳原子 的直链或支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁 基。烷基可任选地被一个或更多个取代基取代，所述取代基例如芳基、卤代、羟基、烷氧基、 幾基、氛基、幾基、醜基、烧氧幾基、氣基、硝基、疏基、烷基硫基等。如果被芳基取代，则为"芳 烷基"，例如苄基和苯乙基。
[0043] 术语Ci_4烷氧基意指Ci_4烷氧基或C烷基酿基，其中术语C烷基如上所定乂。 合适的烷基醚基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基 和叔丁氧基.
[0044]术语Q_4烷基羰基氧基意指Ch烷基与-C ( = 0) -0-基团连接，其中术语Ch烷基 如上所定义。
[0045] "卤素"或"卤代"是指溴、氯、碘或氟。
[0046] "腈"、"氰基"或"甲腈"是指基团-C= N。
[0047]术语Ch烷基羰基是指Ch烷基与羰基-C ( = 0)-基团连接。
[0048] 术语苯氧基意指苯氧基或苯基醚基。
[0049] 术语苯硫基意指苯基与硫醚基团-S-连接。
[0050] 应注意，所述定义中使用的任何分子部分上的基团位置可以是该部分上的任意位 置，只要其是化学稳定的即可。
[0051] 除非另有指示，否则本文中任何变量的定义中使用的基团包括所有可能的异构 体。
[0052] 术语"盐"必须理解为根据本发明使用的活性化合物的任何形式，其中所述化合物 是离子形式或者是带电的或者与相反离子（阳离子或阴离子）结合或者是在溶液中。该定 义还包括季铵盐以及活性分子与另一些分子和离子的络合物，特别是通过离子相互作用形 成的络合物。该定义特别地包括可生理接受的盐；该术语必须理解为等同于"药理学上可 接受的盐"或"可药用盐"。
[0053] 在本发明的上下文中，术语"可药用盐"意指，当以适当方式用于治疗，施用于或用 于特别是人和/或哺乳动物时是生理学耐受的任何盐（通常意指其是无毒的，特别是作为 相反离子的结果）。这些生理学上可接受的盐可用阳离子或碱形成，并且在本发明的上下 文中，理解为是通过至少一种根据 本发明使用的化合物一一通常是酸（去质子化的）一一例如阴离子形成的盐，特别是用于人和/或哺乳动物时。这些生理学上可接受的盐也可用 阴离子或酸形成，并且在本发明的上下文中，理解为是通过至少一种根据本发明使用的化 合物一一通常是质子化的（例如氮是质子化的）一一例如阳离子与至少一种生理学上耐受 阴离子形成的盐，特别是用于人和/或哺乳动物时。在本发明的上下文中，该定义具体地包 括：通过生理学上耐受的酸形成的盐，即，特定活性化合物与生理学上耐受的有机酸或无机 酸的盐一一特别是用于人和/或哺乳动物时。该类型盐的实例是用以下酸形成的那些盐： 盐酸、氢溴酸、硫酸、甲磺酸、甲酸、乙酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、扁桃酸、富马酸、乳 酸或柠檬酸。
[0054] 根据本发明的术语"溶剂合物"应理解为意指其中根据本发明的活性化合物通过 非共价键与另一种分子（通常为极性溶剂）结合的所述活性化合物的任意形式，尤其包括 水合物和醇合物，如例如甲醇化物（methanolate)。优选的溶剂合物是水合物。
[0055] 作为式（I)化合物之前药的任意化合物也在本发明的范围中。术语"前药"以其最 广泛的意义使用并且涵盖在体内转化为本发明化合物的那些衍生物。前药的实例包括但不 限于式I的化合物的衍生物和代谢物，其包括生物可水解部分，如生物可水解的酰胺、生物 可水解的酯、生物可水解的氨基甲酸酯、生物可水解的碳酸酯、生物可水解的酰脲和生物可 水解的磷酸酯类似物。优选地，具有羧基官能团的化合物的前药是羧酸的低级烷基酯。羧酸 酯常规地通过使分子上存在的任意羧酸部分酯化形成。前药通常可使用公知方法来制备， 例如，Burger "Medicinal Chemistry and Drug Discovery，第 6 版"（Donald J. Abraham 编著，2〇01，Wiley)、"Design and Applications of Prodrugs"（H.Bundgaard 编著，I985， Harwood Academic Publishers)以及 Krogsgaard-Larsen 等 "Textbook of Drug design and Discovery"Taylor&Francis(2002 年 4 月）所描述的那些方法。
[0056] 由上述式⑴表示的本发明化合物可包括对映体（取决于手性中心的存在）或异 构体（取决于多重键的存在）（例如，Z、E)。单一异构体、对映体或非对映体及其混合物在 本发明的范围中。
[0057] 此外，本文提及的任意化合物可作为互变异构体存在。具体地，术语互变异构体是 指化合物的两种或更多种结构异构体之一，所述结构异构体平衡存在并且容易由一种异构 体形式转化为另一种异构体形式。常见的互变异构体对是胺-亚胺、酰胺_亚氨酸、酮-烯 醇、内酰胺-内酰亚胺等。
[0058] 除非另有规定，否则本发明化合物还意指包括同位素标记形式，即，不同仅在于存 在一个或更多个富含同位素的原子的化合物。例如，除了至少一个氢原子被氘或氚替代，或 者至少一个碳被富含 13C或14C的碳替代，或者至少一个氮被富含15N的氮替代之外的具有本 发明结构的化合物也在本发明的范围中。
[0059] 式（I)化合物或其盐或溶剂合物优选地是可药用形式或基本纯的形式。尤其，可 药用形式意指除正常药物添加剂如稀释剂和载体之外具有可药用水平的纯度，并且不包括 正常剂量水平下认为有毒的物质。药物物质的纯度水平优选高于50%，更优选高于70%， 最优选高于90%。在一个优选实施方案中，式（I)化合物或其盐、溶剂合物或前药的纯度水 平高于95%。
[0060] 如之前所述的，术语"可药用盐、溶剂合物、前药"是指在施用于接受者后能够提供 (直接或间接）本文所述化合物的任何盐、溶剂合物或任何其他化合物。然而，应理解，非可 药用盐、溶剂合物和前药也在本发明的范围中，因为这些物质可用于制备可药用盐、溶剂合 物和前药。可通过本领域已知方法来进行盐、溶剂合物和前药的制备。
[0061] 本文所使用的术语"治疗"包括根除、移除、逆转、减轻、改变或控制疾病或病症，例 如认知障碍。
[0062] 本文所使用的术语"预防"和"预防性"是指式⑴化合物能够在疾病或病症（如 认知障碍）发病前避免其发病或形成，使其发病或形成最小化或者使其发病或形成变得困 难。
[0063]因此，"治疗"和/或"预防"作为整体意指至少抑制或减轻与折磨对象的病症有关 的症状，其中抑制和减轻在广义上用于指至少参数的幅度减小，例如，与待治疗病症如认知 障碍有关的症状。因此，本发明方法还包括其中完全抑制所述病症（例如，防止发生或停止 如终止）使得对象不再经受所述病症的情况。因此，本发明方法包括预防和管理认知障碍 二者。
[0064]本文所使用的术语"认知障碍"意指以与思考、学习或记忆有关的精神活动不足为 特征的任何病症。这样的障碍的实例包括失认症、遗忘症、失语症、失用症、谵妄、痴呆和学 习障碍。
[0065]认知障碍可（并且经常）与以神经元或参与神经元之间信号传递的其他结构 损伤或损失为特征的其他病症有关（即，由其造成或在其存在下发生）。因此，认知障 碍可与神经退行性疾病有关，所述神经退行性疾病例如阿尔茨海默病、皮质基底节变性 (corticobasal degeneration)、克-雅病、额颞叶变性、亨廷顿病、多发性硬化、正常压力脑 积水、有机慢性脑病综合征（organic chronic brain syndrome)、帕金森病、皮克病、进行 性核上性麻痹或老年性痴呆（阿尔茨海默型）。
[0066] 认知障碍也可与损害中枢神经系统的另一些病症有关，所述另一些病症包括精神 障碍如焦虑性障碍、分离型障碍，心境障碍如双相情感障碍、精神分裂症，以及躯体型障碍 和做作性障碍。
[0067]本文所述化合物可用于治疗失认症、遗忘症、失语症、失用症、谵妄、痴呆、学习障 碍和另一些认知障碍。
[0068]可用本发明方法进行治疗的痴呆的实例包括AIDS痴呆复合症、宾斯旺格病、具有 卢伊体的痴呆、额颞痴呆、多发性梗死痴呆、皮克病、语义性痴呆、老年性痴呆和血管性痴 呆。
[0069]可用本发明方法治疗的学习障碍的实例包括阿斯波哥尔综合征、注意缺陷障碍、 注意缺陷多动障碍、自闭症、童年期分裂症和Rett综合征。
[0070] 可用本发明方法治疗的失语症的实例包括进行性非流畅性失语症。
[0071] 本文所述的化合物也可用于治疗患有轻度的或者不显著干扰日常生活的精神活 动不足的患者。轻度认知损害是这样的病症的实例：患有轻度认知损害的患者表现出痴呆 症状（例如，语言或记忆困难），但是这些症状的严重程度使得诊断为痴呆可能不合适。本 文所述化合物可用于治疗轻度认知损害，并且类似地，治疗另一些较不严重形式的认知障 碍。
[0072] 因此，本发明的另一个方面是用于在哺乳动物中治疗或预防认知障碍的方法，其 中向有所述治疗之需要的患者施用治疗量的本发明化合物。
[0073] 在本发明的一个具体实施方案中，本文所述化合物可用于治疗患有与以下疾病相 关的认知障碍的患者：精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病或帕金森病。
[0074] 在本发明的一个具体实施方案中，在式（I)化合物或其可药用盐、异构体、前药或 溶剂合物中，R1是氢；R2、R3和R 4独立地选自Ci_4烷氧基、Ci_4烷基羰基氧基、苄基氧基、苯基 幾基氧基、奈基_幾基氧基、陸琳基幾基氧基和异陸琳基幾基氧基；R5选自卤素、臆、C i_4烧 氧基、(V4烷基硫基、C i_4烷基、苯基、苯氧基、苯硫基和二氣甲基；并且R6选自氣、氣和甲基。
[0075] 在一个具体实施方案中，R2和R4独立地选自氢、卤素、三氟甲基和Ch烷氧基。
[0076] 在另一个具体实施方案中，R2选自氢和甲氧基；并且R4选自氟、三氟甲基和甲氧 基。
[0077] 在另一个具体实施方案中，R5是氟。
[0078] 在一个具体实施方案中，R2和R 4独立地选自Ch烷氧基、Ch烷基羰基氧基和苄基 氧基。
[0079] 在一个具体实施方案中，R2和R 4是甲氧基。
[0080] 在另一个实施方案中，R3是苄基氧基。
[0081] 在另一个实施方案中，R1是氢。
[0082] 在另一个实施方案中，R5选自氟、甲氧基、甲基硫基和苯基，优选氟。
[0083] 在另一个实施方案中，R6是氢或氟。
[0084] 在另一些优选实施方案中，将以上所述不同取代基所述的优选组合起来。本发明 还涉及上式中优选取代基的这类组合。
[0085] 属于式⑴的具体独立的本发明化合物包括以下所列化合物：
[0086] ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_甲氧基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0087] ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0088] ? (S)-1-((2S，4S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_苯基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0089] ?⑶-l_((2S)-1-(4-(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0090] ? (S)-1-((2S，4S)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4-(甲基硫基） 吡咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲腈
[0091] ? (S)-1-((2S，4S)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_甲基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0092] ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_氰基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0093] ?⑶-1-((2S，4S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_(三氟甲 基） _ R比略烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0094] ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_(叔丁氧基） 吡咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲腈
[0095] ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_乙酰氧基吡 咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲腈
[0096] ?⑶-1-((2S)-1_(4-乙酰氧基-3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0097] ?⑶-1-((2S)-1_(4-苯甲酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0098] ? (S)-1-((2S)-1_(3,4-二苄基氧基-5-甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0099] ? (S)-1-((2S)-1_(3,4-二苯甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0100] ?⑶-1-((2S)-1-(3-乙酰氧基_4,5_二甲氧基苯甲酰基）-4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0101] ?⑶-l_((2S)-1-(3-特戊酰氧基-4,5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0102] ? (S)-1-((S)-1-(4-(苄基氧基）苯甲酰基）-4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烧_2_甲腈
[0103] ? (S)-1-((S)-1-(3-(苄基氧基）苯甲酰基）-4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烧_2_甲腈
[0104] ? (S)-1-((S)-1-(2-(苄基氧基）苯甲酰基）-4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烧_2_甲腈
[0105] ?⑶-l_((S)-1-(4-(苄基氧基）-3_(三氟甲基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0106] ?(幻-1-((幻-1-(4-(苄基氧基）-3-氟苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基） 吨匕略烧 _2_甲腈
[0107] 或其可药用盐、异构体、前药或溶剂合物。
[0108] 如上所限定的式（I)化合物可通过以下通用方案所阐明的可用合成工序获得。
[0109]
[0112]在第一步中，将式（II)的酯溶解或悬于极性有机溶剂（优选质子性极性有机溶 剂）如乙醇（EtOH)或甲醇或者极性有机溶剂的混合物中。添加水性碱溶液并通过以下过 程进行水解反应：将混合物（通常在回流下）维持在室温与溶剂混合物回流温度之间的温 度下直至水解完成，通常维持0. 5至4小时，优选1至2小时的时间段。碱溶液优选为无机 性质，例如稀碱，如NaOH。然后，放置反应混合物到达室温，并优选浓缩至反应体积的约五 分之一。然后将反应混合物缓慢添加到酸溶液如1M HC1溶液中以实现中和，同时在冰浴中 冷却。如果酸化导致沉淀，则过滤固体并用水洗涤，提供式（VII)的产物。如果没有得到沉 淀，则用适当的有机溶剂如乙酸乙酯将所得溶液萃取几次，干燥并蒸发有机相。通过快速色 谱法纯化式（VII)的粗产物。
[0113] 式（III)的胺的脱保护在温和酸性条件下例如添加到氯化氢在有机溶剂如二嗝 烷中的溶液中或者用TFA/DCM混合物，在0°C至室温的低温下实现。将反应在室温下搅拌1 至3小时。然后将溶剂蒸发至干，以得到式（VI)的胺的盐酸盐或三氟乙酸盐（取决于所使 用的酸）。
[0114] 式（IX)化合物由式（VII)的羧酸和式（VI)的胺在Schotten-Baumann条件下制 备。因此，向式（VII)的羧酸在有机溶剂如甲苯中的溶液中添加氯化剂如草酰氯。将反应 在50°C至80°C的温度下搅拌1至2小时，以允许形成式（VIII)的羧酸氯化物。在蒸发溶剂 之后，在低温如〇°C下将所得粗制物溶解在有机溶剂如THF中并添加到式（VI)的胺的碱性 水溶液（通常为式（VI)的胺的NaOH水溶液）中。将反应混合物在低温下搅拌1至2小时 并在室温下搅拌2至4小时。然后，蒸发溶剂，通过添加HC1溶液将剩余的水性级分调节为 酸性pH(3至4)并用乙酸乙酯进行萃取。有机相用盐水洗涤，干燥，过滤并蒸发。需要时， 通过快速色谱法纯化粗产物。
[0115] 然后，在碱如N，N-二异丙基乙胺（DIEA)存在下，并且在偶联剂如碳化二亚胺帮 助下，使式（IX)的产物与式（IV)的（S)-吡咯烷-2-甲腈偶联。具体地，将式（IX)化合物 溶解在非质子有机溶剂如二氯甲烷中并与DIEA -起添加到碳化二亚胺，例如固载的碳化 二亚胺，如N-环己基碳二亚胺、N'-甲基聚苯乙烯中。5分钟后，添加式（IV)的（S)-吡咯 烷-2-甲腈和额外的DIEA。将反应在室温下搅拌8至16小时。然后，过滤反应混合物并 用非质子有机溶剂洗涤剩余的固体。使滤液蒸发至干。然后通过制备型RP-HPLC纯化粗产 物。
[0116] 或者，可如方案E所阐述地制备式（I)化合物并且在以下描述：
[0117] 将经胺官能化的树脂如式（X)的Sieber酰胺树脂放置在装配有聚乙烯多孔圆盘 的注射器中。通过用适当的有机溶剂如二氯甲烷OCM)和二甲基甲酰胺（DMF)洗涤使树脂 溶胀。在树脂的胺基被保护后（即，在Sieber酰胺树脂的情况下），通过用胺碱溶液如哌啶 的DMF溶液处理实现保护基（如，芴基甲氧基羰基（Fmoc)保护基）的移除。
[0118]
[0119] 在从树脂中移除保护基之后，使用在适当的有机溶剂如DMF中的活化剂如三唑 (即，TBTU)和胺碱（如DIEA)使式（V)的经Fmoc保护的L-脯氨酸与树脂连接。将混合物 搅拌1至2小时。过滤并洗涤后，可使用Kaiser测试监测偶联程度，在需要时进行再偶联。 通过用胺碱溶液如哌啶的DMF溶液和/或哌啶/DBU/甲苯/DMF的混合物处理移除Fmoc以 产生式（XI)的产物。Fmoc移除可使用对硝基苯基酯NF31测试进行评价。
[0120]
[0121] 在适当的有机溶剂如DMF中，在添加剂如HOAt存在或不存在下，使用活化剂PyBOP 和胺碱如DIEA使式（XI)的产物与式（IX)的产物偶联，以产生式（XII)的产物。将混合物 手动搅拌1至2小时的总反应时间。使用相同的量和时间完成系统的再偶联。偶联程度可 使用对硝基苯基酯NF31测试进行监测。
[0122]
[0123]或者，式（XII)的产物也可通过以下过程逐步获得：首先使式产物（XI)与（XIII) 化合物偶联，然后移除Fmoc保护基团，然后与式（VII)化合物偶联。
[0124] 将用适当有机溶剂如DCM彻底洗涤并干燥的式（XII)的产物转移至烧瓶中，向其 中添加少量有机溶剂中的三氟乙酸酐和吡啶。将混合物维持在20°C至40°C的温度下8至 16小时。然后，过滤反应混合物并用相同有机溶剂洗涤树脂。收集滤液并使溶剂蒸发至干。 将所得粗制物溶解在适当溶剂如乙酸乙酯中，并用饱和NaHC0 3溶液和5% KHSOjK溶液洗 涤。将有机相干燥，过滤并蒸发。将粗制物溶解在H20 : CH3CN中并冻干以产生式（I)的肽 腈。
[0125] 或者，可用TFA/H20/TIS的混合物处理式（XII)的肽基-树脂（peptidyl-resin) 1 至2小时。然后，过滤树脂并用TFA洗涤，收集滤液并使溶剂蒸发至干。将粗制物重悬于 H20 : CH3CN的混合物中并冻干。将所得粗制物肽酰胺溶解在适当有机溶剂如DCM中，并例 如在五氧化二磷、四氯化钛、亚硫酰氯、三氟乙酸酐/吡啶或三苯基膦/四氯化碳存在下转 化为腈。将混合物维持在室温下8至16小时，使溶剂蒸发并将残余物溶解在乙酸乙酯中。 随后用KHSCVK溶液和NaHC0 3水溶液洗涤有机溶液。干燥并蒸发有机相，产生式（I)的肽 腈。
[0126] 粗产物通过RP-HPLC进行纯化。
[0127] 在用于制备本发明化合物的上述方法产生立体异 构体的混合物的情况下，可通过 常规技术例如制备型色谱法来分离这些异构体。如果存在手性中心，则所述化合物可制备 成外消旋形式，或者可通过对映体特异性合成或者通过拆分来制备单独的对映体。
[0128] 用作起始产物的式（II)、（III)、（IV)和（V)化合物以及一些式（VII)化合物是市 售可得的，并且也可使用本领域专家公知的方法来制备。
[0129] 因此，在本发明的一个方面中，提供了用于制备式（I)化合物或其可药用盐、异构 体、前药或溶剂合物的方法。
[0130] 在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0131] a)使式（IX)化合物与式（XI)化合物反应：
[0132]
[0133] 其中R1、!?2、!? 3、!?4、R5和R6如上式（I)中所限定；
[0134]
18
[0135] 其中聚合物代表在本文所公开的合成方法的反应条件下为惰性并且在本文所采 用溶剂中不溶但是可溶胀的聚合物，例如，低交联聚苯乙烯和聚乙二醇接枝的聚苯乙烯聚 合物，
[0136] 以产生式（XII)化合物：
[0137]
[0138] b)使式（XII)化合物水解以产生式（XIV)化合物
[0139]
[0140] 以及
[0141] c)使式（XIV)化合物处于能够使甲酰胺基团转化为腈基团的条件，以产生式（I) 化合物；
[0142] 其中步骤b)和c)可分开进行或以一釜式反应进行。
[0143] 在本发明的另一个实施方案中，用于制备式（I)化合物或其可药用盐、异构体、前 药或溶剂合物的方法包括以下步骤：
[0144] a)使式（IX)化合物与式（IV)化合物反应：
[0145]
[0146] 其中R1、!?2、!? 3、!?4、R5和R6如上式（I)中所限定，
[0147]
[0148] 在又一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0149] a)使式（XI)化合物与式（XIII)化合物反应：
[0150]
[0151] 其中聚合物代表在本文所公开合成方法的反应条件下为惰性并且在本文所采用 溶剂中不溶但是可溶胀的聚合物，例如，低交联聚苯乙烯和聚乙二醇接枝的聚苯乙烯聚合 物，
[0152]
[0153] 其中R5和R 6如上式⑴中所限定；
[0154] b)移除Fmoc保护基团；
[0155] c)与式（VII)化合物反应；
[0156]
[0157] 其中Ri、R2、R3和R 4如上式（I)中所限定；
[0158] d)使得到的产物从支撑聚合物水解以产生式（I)化合物：
[0159]
[0160]其中 R1、!?2、!?3、!?4、R5和 R6如上所限定。
[0161] 已发现，通式（I)化合物可用于治疗认知障碍，特别是与中枢神经系统的另一些 疾病或病症相关的认知障碍。
[0162] 在本发明的一个具体实施方案中，认知障碍是与选自以下的疾病相关的认知障 碍：精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病和帕金森病。
[0163] 本发明还提供了用于向患者施用的药物或药物组合物，其包含本发明化合物或其 可药用盐、衍生物、前药或立体异构体，以及可药用载体、辅药或载剂。
[0164] 根据本发明的药物组合物的辅助材料或添加剂可选自载体、赋形剂、支撑材料、 润滑剂、填料、溶剂、稀释剂、着色剂、风味调节剂如糖、抗氧化剂、粘合剂（binder)、粘结剂 (adhesives)、崩解剂、防粘剂（anti-adherent)、助流剂和/或凝集剂。在栓剂的情况下， 其可隐含蜡或脂肪酸酯或防腐剂、乳化剂和/或用于肠胃外施用的载体。这些辅助材料和 /或添加剂及待使用量的选择将取决于药物组合物的施用形式。
[0165] 根据本发明的药物或药物组合物可以是适于施用于人和/或动物，优选人（包括 婴儿、儿童和成年人）的任何形式，并且可通过本领域技术人员已知的标准程序来产生。 因此，根据本发明的制剂可适于局部施用或全身施用，特别是真皮、透皮、皮下、肌内、关节 内、腹膜内、静脉内、动脉内、膀胱内、骨内、海绵体内、鼻内、肺部、经颊、舌下、眼睛、玻璃体 内、经皮、经直肠、经阴道、经口、硬膜外、鞘内、心室内、脑内、脑室内、脑池内、脊柱内、髓周 (perispinal)、颅内、通过具有或没有泵装置的针或导管递送或者另一些施用途径。
[0166] 在一个实施方案中，药物组合物是经口形式，固体或液体。适用于口服施用的剂型 可以是片剂、丸剂、胶囊片（caplet)、胶囊（gel cap)、口香糖、胶囊剂、颗粒剂、滴剂、糖衆 剂或溶液剂，并且可包含本领域已知的常规赋形剂，例如粘合剂，如糖浆、阿拉伯胶、明胶、 山梨糖醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮；填料，如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨 酸；压片润滑剂，如硬脂酸镁；崩解剂，如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、乙醇酸淀粉钠或微晶纤维 素；或者可药用润湿剂，如月桂醇硫酸钠。
[0167] 在另一个实施方案中，药物组合物是用于非肠胃外的鼻内施用的产品形式，优选 用于鼻内施用的产品形式。通常，鼻内施用通过使用鼻喷雾器、挤压瓶和液体点滴器作为递 送装置来进行。为了与这些装置一起使用，药物组合物有利地为本发明化合物的液体溶液 或悬液。
[0168] 组合物可通过混合、填充或压片的常规方法来制备。采用大量填料进行反复混合 操作可用于使活性剂遍布在这些组合物中。这样的操作在本领域是常规的。片剂可例如通 过湿式造粒或干式造粒并且任选地根据正常制药实践中公知的方法（特别是用肠溶包衣） 进行包衣来制备。
[0169] 药物组合物也可适用于肠胃外施用，例如适当单位剂型的无菌溶液、悬液或可重 构干制备物、气雾剂或喷雾剂。可使用适当的赋形剂，例如填充剂、缓冲剂或表面活性剂。[0170] 本发明组合物可配制为溶解形式或贴剂中的沉积物，用于经皮施用。
[0171] 皮肤施用包括软膏、凝胶、霜剂、洗液、悬液或乳液。
[0172] 直肠施用的合适形式是通过栓剂。
[0173] 所述制剂使用标准方法来制备，例如西班牙和美国药典及类似参考文本中描述或 提及的那些方法。
[0174] 在本发明的一个实施方案中，优选的是，以治疗有效量使用使（I)化合物。医师将 决定最适合的本发明治疗剂的剂量，并且其随所选择的施用形式和特定化合物而改变，并 且此外，其随所治疗患者、患者年龄、待治疗疾病或病症类型而改变。当组合物口服施用时， 将需要大量的活性剂以与肠胃外较少量给药产生相同的作用。所述化合物可以以与之相当 的治疗剂相同的方式使用，并且剂量水平与这些其他治疗剂一般采用的数量级相同。活性 化合物通常每天施用一次或更多次，例如每日1、2、3或4次，并且典型的总日剂量在0. lmg/ kg/天至1000mg/kg/天的范围中。
[0175] 本发明的化合物和组合物可以与另一些药物一起使用，以提供联合疗法。另一些 药物可构成同一组合物的一部分，或者作为单独组合物提供用于同时或在不同时间施用。
[0176] 特别地，可配制至少一种式（I)化合物和至少另一种药物的组合用于与至少可药 用载体、添加剂、辅药或载剂同时施用、分开施用或顺序施用。这暗示式（I)化合物和另一 种药物的组合可这样施用：
[0177] a)作为同一药物制剂的部分的组合，然后二者总是同时施用；
[0178] b)作为两个单元的组合，其每一个产生同时、顺序或分开施用的可能性。在一个具 体实施方案中，式（I)化合物与另一种药物独立地（即，在两个单元中）但是同时施用。在 另一个具体实施方案中，首先施用式（I)化合物，然后分开或顺序地施用另一种药物。在又 一个具体实施方案中，首先施用另一种药物，然后分开或顺序施用式（I)化合物，如所限定 的。
[0179] 在本发明的上下文中，使用以下首字母缩略词和缩写，以下对其意思进行详细说 明：
[0180] AcOEt 乙酸乙酯
[0181] AcSDKP N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸
[0182] AD 阿尔茨海默病
[0183]BBB 血脑屏障
[0184]Boc 叔丁氧羰基
[0185] BSA 牛血清白蛋白
[0186]DBU 1，8-二氮杂二环[5. 4. 0] ^^一碳 _7_ 烯
[0187] DCM 二氯甲烷
[0188] DIEA N，N'_ 二异丙基乙胺
[0189] DMF 二甲基甲酰胺
[0190] DMS0 二甲亚砜
[0191] DPPIV 二肽基肽酶 IV
[0192] EtOH 乙醇
[0193] Fmoc 9_荷基甲氧基羰基
[0194] FPLC 快速蛋白质液相色谱法
[0195] HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
[0196] IP3 三磷酸肌醇
[0197] IPTG 异丙基_0 -D-1-硫代半乳糖苷
[0198] LB 溶菌肉汤（Lysogeny broth)
[0199] MALDI-T0F基质辅助激光解吸/电离-飞行时间
[0200] MK-801 双素西平（1NN)
[0201] MS 多发性硬化
[0202] 0D 光学密度
[0203] PAMPA 平行人工膜渗透性测定
[0204] PBS 磷酸盐缓冲盐水
[0205] PC 磷脂酰胆碱
[0206] PE 磷脂酰乙醇胺
[0207] pETMlO 质粒 pETMlO
[0208] PI 磷脂酰肌醇
[0209]POP 脯氨酰寡肽酶
[0210]hPOP 人脯氨酰寡肽酶
[0211] PREP 脯氨酰内肽酶（请注意，POP和PREP是同义词）
[0212] PS 磷酯酰丝氨酸
[0213] PyBOP 六氟磷酸（苯并三唑-1-基氧基）三吡咯烷基磷
[0214] RP-HPLC反相高效液相色谱法
[0215] SD 标准偏差
[0216] SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0217] TBTU 0_(苯并三唑-1-基）_N，N，f-四甲基脲四氟硼酸酯
[0218] TFA 三氟乙酸
[0219] THF 四氢呋喃
[0220] TIS 三异丙基硅烷
[0221] Tris 三（羟甲基）氨基甲烷
[0222] T 0 4 胸腺素0 _4蛋白
[0223] Z-G-P-AMC (N-苄氧羰基-Gly_Pr〇-甲基香豆素基_7_酰胺）
[0224] 以下实施例仅举例说明了本发明的某些实施方案，并且不能认为是以任何方式限 制本发明。 实施例
[0225] 用于实施例所述制剂的具体合成条件
[0226]工序A:将式(II)的酯水解为式（VII)的羧酸
[0227] 将式（II)的酯（lmmol)溶解于95% EtOH中。添加Na0H(3. 7mmol)并在回流下维 持反应约2小时。然后放置其至达到室温。将反应混合物浓缩至约15mL至20mL，然后在冰 浴中冷却的同时将该溶液缓慢添加到1M HC1溶液中。用水洗涤通过过滤回收的白色固体沉 淀并在下一个合成步骤之前对其进行充分干燥。在未出现沉淀物的情况下，用Ac0Et(3X) 萃取所得溶液，干燥并蒸发有机相。如果需要，通过快速色谱法纯化粗制产物。
[0228]工序B:对式(III)的Boc保护的胺进行脱保护以获得式（VI)的胺
[0229] 在0°C下将式（III)的Boc保护的胺（lmmol)缓慢添加到含4M HC1的二喝烷 (20ml)中。将反应在室温下搅拌2小时。然后将溶剂蒸干以产出式（VI)的胺的盐酸盐。
[0230]工序C:通过式(VIII)的甲酰氯（carboxylic acid chloride)的形成来偶联式 (VI)的胺与式（VII)的羧酸
[0231] 将草酰氯（1. 5mmol)添加至含式（VII)之羧酸（lmmol)的甲苯（5ml)溶液中。在 50°C下搅拌反应物1.5小时以使得能够形成式（VIII)的甲酰氯。在蒸发溶剂后，将所得粗 制物溶解于THF中并且在0°C下添加至式（VI)的胺（1. lmmol)的NaOH水溶液中。在0°C 下搅拌反应混合物1. 5小时并且在室温下搅拌3小时。然后，蒸发THF并通过添加1M HC1 溶液将残留含水部分调节至酸性pH(3至4)并用AcOEt对其进行萃取。有机相用盐水洗涤、 干燥、过滤并蒸发。根据需要，通过快速色谱法纯化式（IX)的粗制产物。
[0232] 工序D:在溶液中使式(IX)的产物与式（IV)的（S)-吡咯烷-2-甲腈偶联
[0233] 将式（IX)的产物（1. 2mmol)溶解于DCM并添加至N-环已基碳二亚胺、N'-甲 基聚苯乙烯（3mmol)和DIEA(lmmol)中。5分钟后，添加式（IV)的（S)-吡咯烷-2-甲腈 (lmmol)和DIEA(lmmol)。在室温下搅拌反应物过夜。然后，将反应混合物过滤并用DCM洗 涤残留固体。将滤液蒸干。然后通过制备型RP-HPLC对粗制产物进行纯化。
[0234]工序E:用于在固相上进行合成的一般步骤
[0235] 树脂的溶胀/老化（conditioning):将式（X)的Sieber酰胺树脂（1当量）放置 于装配有聚乙烯多孔圆盘的注射器中。通过用DCM和DMF洗涤使树脂溶胀。通过用DMF的 20%哌啶溶液处理来实现移除芴基甲氧基羰基（Fmoc)保护基。
[0236]
[0237] 然后，使用含TBTU(4当量）和DIEA(8当量）的DMF将式（V)的Fmoc保护的L-脯 氨酸（4当量）连接到树脂上。将混合物手动间歇地搅拌90分钟。在过滤和洗涤后，使用 开氏测试（Kaiser test)来监测偶联的程度，根据需要进行再偶联。通过用含20%哌啶的 DMF溶液处理，然后用哌啶/DBU/甲苯/DMF(20 : 5 : 5 : 70)溶液处理来移除Fmoc以获 得式（XI)的产物。采用对硝基苯醋NF31测试来评价Fmoc移除（Madder，A等，Eur. J. Org. Chem. 1999 ; (11) :2787-91 中所描述的）。
[0238]
[0239] 使用含PyB0P(2当量）、H0At(6当量）和DIEA(6当量）的DMF使式（IX)的产物 (2当量）与式（XI)的产物相偶联以获得式（XII)的产物。在90分钟的总反应时间内手动 地间歇性搅拌混合物。使用相同的量和时间来进行系统的再偶联。使用对硝基苯酯NF31 测试来监测偶联的程度。
[0240] 或者，使用含PyB0P(4当量）、H0At(12当量）和DIEA(12当量）的DMF将式（XIII) 的产物（4当量）与式（XI)的产物相偶联。在90min的总反应时间内手动地间歇性搅拌混 合物。使用对硝基苯酯NF31测试来监测偶联的程度，并且根据需要进行再偶联。通过采用 含20%哌啶的01^溶液处理并采用哌啶/1?"甲苯/1)1^(20:5:5:70)溶液处理来移 除Fmoc基团。随后，使用含PyB0P(4当量）、H0At(12当量）和DIEA(12当量）的DMF，并 入式（VII)的产物（4当量）以获得式（XII)的产物。在90分钟的总反应时间内手动地间 歇性搅拌混合物。使用对硝基苯酯NF31测试来监测偶联的程度，根据需要进行再偶联。
[0241]
[0242] 将用DCM充分洗涤并干燥的式（XII)的产物转移至圆底烧瓶中，并且添加含三氟 乙酸酐（5当量）和吡啶（10当量）的DCM(约2mL/100mg)。将混合物在室温下放置过夜。 然后，过滤反应混合物并且用DCM洗涤树脂。收集滤液并将溶剂蒸干。将所得粗制物溶解 于AcOEt中并用饱和NaHC0 3溶液和5%的KHS0 4水溶液洗涤。使有机相干燥、过滤并蒸发。 将粗制物溶于H20 : CH3CN(1 : 1)中并且冻干以获得式（I)的肽腈。
[0243]或者，可在 1 至 2 小时内用 TFA/H20/TIS(95 : 2. 5 : 2. 5,约 2mL/100mg 至 5mL/100mg)的混合物处理式（XII)的肽基-树脂。然后，对树脂进行过滤并用TFA洗涤，收 集滤液并将溶剂蒸干。将粗制物重悬于H20 : CH3CN(1 : 1)的混合物中并冻干。将所得粗 制肽酰胺溶于DCM并添加三氟乙酸酐（5当量）和吡啶（10当量）。将混合物在室温下放置 过夜，蒸发溶剂并使残留物溶于AcOEt中。随后用5% KHS04水溶和10% NaHCO 3水溶液洗 涤有机溶液。干燥并蒸发有机相以获得式（I)的肽腈。
[0244] 通过RP-HPLC来纯化粗制产物。
[0245] 中间化合物的合成：
[0246] 中间体1 :4_苄基氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酸
[0247]
[0248]将 3, 5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲醋（2. 0g，9. 4mmol)、碳酸钾（3. 2g，22. 6mmol) 和碘化钾（500mg，3. Ommol)引入圆底烧瓶中。添加丙酮（200mL)。在室温下将反应物搅拌 30分钟。然后，将苄基氯（4.3mL，37. 7_〇1)添加至反应混合物中并在回流下维持搅拌8小 时。接着，放置反应物至冷却到室温。添加水并采用二乙醚进行三次萃取，用盐水洗涤有机 萃取物，干燥并蒸发。通过快速色谱法来纯化粗制产物，得到1.7g(5. 7_〇1)。然后，根据上 述步骤A对甲酯进行水解以产出4-苄基氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酸（2.4g，7. 9mmol)。
[0249] 中间体2 : (2S，4R)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸
[0250]
[0251] 起始于市售（2S，4R)-1-(叔丁氧基羰基）-4_甲氧基吡咯烷-2-羧酸（221mg， 1. 5mmol)，根据上述步骤B以定量收率获得作为盐酸盐的产物 并且使用时无需进一步纯 化。
[0252] 中间体3:(S) -4,4-二氟吡咯烷-2-羧酸
[0253]
[0254] 起始于市售⑶-1-(叔丁氧基羰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羧酸（150mg， 1. Ommol)，根据上述步骤B以定量收率获得作为盐酸盐的产物并且使用时无需进一步纯 化。
[0255] 中间体4:(2S，4S) -4-(甲基硫基）吡咯烷-2-羧酸
[0256]
[0257] 起始于市售（2S，4S)-1_(叔丁氧基羰基）-4_甲基硫基-吡咯烷-2-羧酸（310mg， 1. 93mmol)，根据上述步骤B以定量收率获得作为盐酸盐的产物并且使用时无需进一步纯 化。
[0258] 中间体5 : (2S，4S)-4-甲基吡咯烷-2-羧酸
[0259]
[0260] 起始于市售（2S，4S) -1-(叔丁氧基羰基）-4-甲基吡咯烷-2-羧酸（500mg， 2. 18mmol)，根据上述步骤B以定量收率获得作为盐酸盐的产物并且使用时无需进一步纯 化。
[0261] 中间体6 : (2S，4R)-4-乙酰氧基吡咯烷-2-羧酸
[0262]
[0263] 将市售的反式-L-羟脯氨酸（500mg，3. 81mmol)溶解于6N盐酸（lmL)中。添加冰 乙酸（lmL)，并且在冰浴中将溶液冷却至0°C。然后缓慢添加乙酰氯（10mL)。几分钟之后， 通过沉淀获得产物，这得益于醚的添加。盐酸盐形式的化合物（626mg，2. 98mmol)通过过滤 来分离，用醚洗涤、干燥并直接用于下一步骤。
[0264] 中间体7 :(2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_甲氧基-吡 咯烷-2-羧酸
[0265]
[0266] 根据上述步骤C由中间体1(4-苄基氧基_3,5_二甲氧基苯甲酸）（425mg， 1. 5mmol)和中间体2((2S，4R)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸）（1. 5mmol)制备。通过快速色谱 法纯化获得期望的产物（428mg，1. Ommol)。
[0267] 中间体8 : (2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_氟吡咯 烷-2-羧酸
[0268]
[0269] 根据上述步骤C由中间体1(4-苄基氧基_3,5_二甲氧基苯甲酸）（714mg， 2. 5mmol)和市售（2S，4R)-4-氟吡咯烷-2-羧酸（363mg，2. 7mmol)制备。通过快速色谱法 纯化获得期望的产物（670mg，1. 7mmol)。
[0270] 中间体9 :(2S，4S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_苯基吡咯 烷-2-羧酸
[0271]
[0272] 根据上述步骤C由中间体1 (4-苄基氧基-3，5-二甲氧基苯甲酸）（700mg， 2. 4mmol)和市售（2S，4S)-4-苯基吡咯烷-2-羧酸（608mg，2. 7mmol)制备。通过快速色谱 法纯化获得期望的产物（700mg，1. 5mmol)。
[0273] 中间体10 :(S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烷-2-羧酸
[0274]
[0275] 根据上述步骤C由中间体1 (4-苄基氧基-3，5-二甲氧基苯甲酸）（260mg， 0. 9mmol)和中间体3(⑶-4,4-二氟吡咯烷-2-羧酸）（l.Ommol)制备。通过快速色谱法纯 化获得期望的产物（366mg，0. 9mmol)。
[0276] 中间体11:(25,45)-1-(4-(苄基氧基）-3,5-二甲氧基苯甲酰基）-4-(甲基硫 基）_吡咯烷-2-羧酸
[0277]
[0278] 根据上述步骤C由中间体1(4-苄基氧基_3,5_二甲氧基苯甲酸）（505mg， 1.75mmol)和中间体4((2S，4S)-4-(甲基硫基）吡咯烷-2-羧酸）（1.93mmol)制备。通过 快速色谱法纯化获得期望的产物（537mg，1. 24mmol)。
[0279] 中间体12 :(2S，4S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_甲基吡咯 烷-2-羧酸
[0280]
[0281] 根据上述步骤C由中间体1(4-苄基氧基_3,5_二甲氧基苯甲酸）（384mg， 1.33mmol)和中间体5((2S，4S)-4-甲基吡咯烷-2-羧酸）（1.47mmol)制备。通过快速色谱 法纯化获得期望的产物（342mg，0. 85mmol)。
[0282] 中间体13 : (2S，4R) -1- (4-(苄基氧基）-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4-乙酰氧基吡 咯烷-2-羧酸
[0283]
[0284] 根据上述步骤C由中间体1 (4-苄基氧基-3，5-二甲氧基苯甲酸）（400mg， 1.39mmol)和中间体6((2S，4R)-4-乙酰氧基吡咯烷-2-羧酸）（1.53mmol)制备。通过快速 色谱法纯化获得期望的产物（342mg，0. 85mmol)。
[0285] 中间体14 :4_乙酰氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酸
[0286]
[0287] 在0 °C下将4-羟基-3, 5-二甲氧基苯甲酸（300mg，1. 51mmol)溶解于吡啶 (732 yL，9.08mmol)中。在搅拌混合物的同时逐滴添加乙酸酐（214yL，2.27mmol)。保持 冰浴2小时，然后将混合物注入冰水中。混合物用DCM萃取（3 X)，有机相用IN HC1溶液洗 涤（3X)、用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发以产出4-乙酰氧基_3,5_二甲氧基 苯甲酸（266mg，1. lOmmol)。
[0288] 中间体15 :4_苯甲酰氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酸
[0289]
[0290] 将4-羟基_3,5_二甲氧基苯甲酸（300mg，1. 51mmol)溶解于水（6mL)中，然后添 加异丙醇（2.5mL)，接着添加碳酸钾（523mg，3.78mm〇l)。将混合物保持于氩气下并冷却至 〇°C。然后，向剧烈搅拌的反应混合物中逐滴添加苯甲酰氯（185yL，1.59mm 〇l)。添加期间 形成粘稠的白色沉淀。将混合物再搅拌20min后用6M HC1淬灭，同时使反应混合物保持冷 却。固体通过过滤收集，经冷水洗涤并干燥以产出作为白色固体的4-苯甲酰氧基_3,5_二 甲氧基苯甲酸（401mg，1. 33mmol)。
[0291] 中间体16 :3,4-二苄基氧基-5-甲氧基苯甲酸
[0292]
[0293] 将3,4-二羟基-5-甲氧基苯甲酸甲醋（300mg，1. 51mmol)、碳酸钾（1. Og， 7. 3mmol)和碘化钾（161mg，0. 97mmol)引入圆底烧瓶中。添加丙酮（60mL)。在室温下将反 应物搅拌30分钟。然后，将苄基氯（1. 39mL，12. lmmol)添加至反应混合物中并在回流下 维持搅拌8小时。接着，将反应物放置至冷却到室温。添加水并用二乙醚进行三次萃取， 有机相用盐水洗绦，干燥并蒸发。通过快速色谱法来纯化粗制产物，得到377mg(l. Ommol)。 然后，根据上述步骤A对甲酯进行水解以产出3,4_二苄基氧基-5-甲氧基苯甲酸（144mg， 0. 4mmo1)。
[0294] 中间体17 :3,4-二苯甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酸
[0295]
[0296] 将3,4_二羟基-5-甲氧基苯甲酸（300mg，1. 63mmol)溶解于水（6mL)中并然后 添加异丙醇（2. 5mL)，再添加碳酸钾（1. 13g，8. 15mmol)。将混合物保持在氩气下并冷却至 〇°C。然后，向剧烈搅拌的反应混合物中逐滴添加苯甲酰氯（388 y L，3. 34_〇1)。将混合物 再搅拌20min后用6MHC1淬灭，同时使反应混合物保持冷。接着，用AcOEt对其进行稀释并 且进行相分离。有机相依次用1M HC1溶液和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。通过快 速色谱法纯化粗制物来产出作为白色固体的3,4_二苯甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酸（548mg， 1. 40mmo1)〇
[0297] 中间体18 :3-乙酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酸
[0298]
[0299] 在0 °C下将3-羟基-4, 5-二甲氧基苯甲酸（300mg，1. 51mmol)溶解于R比啶 (732 yL，9.08mmol)中。在搅拌混合物的同时逐滴添加乙酸酐（214yL，2.27mmol)。保持 冰浴2小时，然后将混合物注入冰水中。混合物用DCM萃取（3X)，有机相用IN HC1溶液 (3X)、水（2X)和盐水（2X)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发以产出3-乙酰氧基_4,5_二 甲氧基苯甲酸（277mg，1. 15mmol)。
[0300] 中间体19 :3_特戊酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酸
[0301]
[0302]将3-羟基-4,5-二甲氧基苯甲酸（30011^，1.51臟〇1)和吡啶（2441^，3.02臟〇1) 的氯仿（2mL)溶液搅拌30分钟。根据TLC，在室温下向该反应混合物中逐滴添加氯仿（2mL) 的特戊酰氯（196 y L，1. 59mmol)溶液，并且搅拌反应直至反应完成（约3h)。然后，用DCM 稀释反应混合物，添加1M HC1溶液并进行相分离。有机相依次用1M HC1溶液1MHC1 (2X)、 水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。通过快速色谱法纯化获得4-特戊酰氧基-3， 5_ 二甲氧基苯甲酸（321mg，1. 14mmo 1)。
[0303] 中间体20 :4_苄基氧基-3-三氟甲基苯甲酸
[0304]
[0305] 将4-羟基-3-三氟甲基苯甲酸（1. 0g，4. 9mmol)和碳酸钾（1. 6g，11. 6mmol)引入 圆底烧瓶中。添加DMF(lOmL)并在室温下将反应物搅拌5分钟。然后，将苄基氯（2. 2mL， 19. 4mmol)添加至反应混合物中，在回流下维持4小时。接着，放置反应物至冷却到室温。 添加水并用乙酸乙酯（3X50mL)进行三次萃取，有机萃取物经盐水洗涤，干燥并蒸发。通过 快速色谱法来纯化粗制产物，获得1. 3g (3. 4mmol)。然后，根据上述的步骤A对苄基酯进行 水解以产出4-苄基氧基-3-三氟甲基苯甲酸（320mg，1. lmmol)。
[0306] 中间体21 :4_苄基氧基-3-氟苯甲酸
[0307]
[0308] 将4-羟基-3-氟苯甲酸（1. 0g，6. 4mmol)、碳酸钾（2. 7g，19. 2mmol)和碘化钾 (532mg，3. 2mmol)引入圆底烧瓶中。添加丙酮（140mL)并在室温下将反应搅拌30分钟。然 后，将苄基溴（3. 8mL，32. Ommol)添加至反应混合物中，在回流下维持12小时。接着，放置 反应物至冷却到室温。添加水并用乙酸乙酯（3X50mL)进行三次萃取，有机萃取物经盐水 洗涤，干燥并蒸发。通过快速色谱法来纯化粗制产物，获得1. 2g(3. 5mmol)。然后，根据上述 的步骤A对苄基酯进行水解以产出4-苄基氧基-3-氟甲基苯甲酸（612mg，2. 5_〇1)。
[0309] 实施例1:
[0310] (S)-1-((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_甲氧基吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0311]
[0312] 根据上述步骤D使市售（S)_吡咯烷-2-甲腈（58mg，0. 4mmol)与中间体7((2S， 4R) -1- (4-(苄基氧基）-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸）（220mg， 0. 5mmol)偶联。通过RP-HPLC纯化来获得10mg(0. 02mmol)的最终产物。
[0313] 实施例2:
[0314] (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0315]
[0316] 起始于市售Sieber酰胺树脂（500mg，0. 30mmol，1当量）、市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (400mg，1. 2mmol)和中间体 8((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_ 二甲 氧基苯甲酰基）-4-氟吡咯烷-2-羧酸）（239mg，0. 60mmol)，根据上述步骤E制备产物。通 过RP-HPLC纯化获得80mg(0. 17mmol)的最终产物。
[0317] 实施例3 :
[0318] (S)-1-((2S，4S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_苯基吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0319]
[0320] 起始于市售Sieber酰胺树脂（500mg，0. 38mmol，1当量）、市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (516mg，1.53mmol)和中间体 9((25,45)-1-(4-(苄基氧基）-3,5-二甲 氧基苯甲酰基）-4-苯基吡咯烷-2-羧酸）（351mg，0. 76mmol)，根据上述步骤E制备产物。 通过RP-HPLC纯化获得16mg(0. 03mmol)的最终产物。
[0321] 实施例4:
[0322] (S) -1-((2S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0323]
[0324] 起始于市售Sieber酰胺树脂（250mg，0. 19mmol，1当量）、市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (258mg，0? 77mmol)和中间体 10 ((S) -1- (4-(苄基氧基）-3, 5-二甲氧 基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羧酸）（161mg，0. 38mmol)，根据上述步骤E制备产物。 通过RP-HPLC纯化获得18mg(0. 036mmol)的最终产物。
[0325] 实施例5:
[0326] (S)-1-((2S，4S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_(甲基硫基）吡 咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲腈
[0327]
[0328]起始于市售Sieber酰胺树脂（500mg，0. 38mmol，1当量）、市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (516mg，1.53mmol)和中间体 ll((2S，4S)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_ 二 甲氧基苯甲酰基）-4-(甲基硫基）吡略烧-2-羧酸）（330mg，0. 76mmol)，根据上述步骤E制 备产物。通过RP-HPLC纯化获得22mg(0.043mmol)的最终产物。
[0329] 实施例6 :
[0330] (S) -1-((2S，4S) -1- (4-(苄基氧基）-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4-甲基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0331]
[0332] 起始于市售Sieber酰胺树脂（300mg，0. 18mmol，1当量）、市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (247mg，0. 73mmol)和中间体 12((2S，4S)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_ 二 甲氧基苯甲酰基）-4-甲基吡咯烷-2-羧酸）（146mg，0. 37mmol)，根据上述步骤E制备产物。 通过RP-HPLC纯化获得10mg(0. 02mmol)的最终产物。
[0333] 实施例7 :
[0334] (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_氰基吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0335]
[0336] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (516mg，1. 53mmol)和Boc-反式-4-氰基-L-脯氨酸（368mg，1. 53mmol)依次偶联到市售 Sieber酰胺树脂（500mg，0. 38mmol，l当量）上。在二肽从树脂上裂解掉（cleavage)之后， 根据步骤C通过形成羧酸酰氯使中间体1 (4-苄基氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酸）（145mg， 0. 5mmol)与所得二肽腈偶联。通过RP-HPLC纯化粗制物获得llmg(0. 03mmol)的最终产物。
[0337] 实施例8 :
[0338] (S) -1-((2S，4S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-(三氟甲 基）_ R比略烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0339]
[0340] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 40mmol)、（2S，4S)-Fmoc-4-三氟甲基-吡咯烷-2-羧酸（162mg，0. 40mmol)和中 间体1 (4-苄基氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酸）（115mg，0. 40mmol)依次偶联到市售Sieber酰 胺树脂（165mg，0. 10mmol，l当量）上。通过RP-HPLC纯化获得13mg(0. 045mmol)的最终产 物。
[0341] 实施例9:
[0342] (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_(叔丁氧基）吡 咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲腈
[0343]
[0344] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0? 40mmol)、Fmoc-4-叔丁氧基 _L_ 腫氛酸（164mg，0? 40mmol)和中间体 1 (4-苄基 氧基-3,5-二甲氧基苯甲酸）（11511^，0.40_31)依次偶联到市售516匕61'酰胺树脂（16511^， 0? lOmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得22m g(0. 076mmol)的最终产物。
[0345] 实施例10:
[0346] (S) -1-((2S，4R) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-乙酰氧基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0347]
[0348]起始于市售Sieber酰胺树脂（165mg，0. lOmmol，1当量），市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 40mmol)和中间体 13((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_ 二 甲氧基苯甲酰基）-4-乙酰氧基吡咯烷-2-羧酸）（90mg，0. 20mmol)，根据上述步骤E来制备 产物。通过RP-HPLC纯化获得6. 2mg(0. 012mmol)的最终产物。
[0349] 实施例11 :
[0350] (S) -1-((2S) -1- (4-乙酰氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈
[0351]
[0352] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 40mmol)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（149mg，0? 40mmol)和中间体 14(4-乙醜 氧基-3,5-二甲氧基苯甲酸）（96mg，0. 40mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（165mg， 0? lOmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得25mg(0. 054mmol)的最终产物。
[0353] 实施例12 :
[0354] (S)-1-((2S)-1_(4-苯甲酰氧基_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0355]
[0356] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0? 4mmo 1)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（149mg，0? 4mmo 1)和中间体 15 (4-苯甲醜 氧基-3,5-二甲氧基苯甲酸）（12111^，0.4111皿)1)依次偶联到市售516匕61'酰胺树脂（16511^， 0? lmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得26mg(0. 051mmol)的最终产物。
[0357] 实施例13 :
[0358] (S) -1- ((2S) -1- (3,4-二苄基氧基-5-甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈
[0359]
[0360] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0? 4mmo 1)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（149mg，0? 4mmo1)和中间体 16 (3,4-二节 基氧基-5-甲氧基苯甲酸）（146mg，0. 4mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（165mg， 0. lmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得24mg(0. 041mmol)的最终产物。
[0361] 实施例14:
[0362] (S) -1- ((2S) -1- (3,4-二苯甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0363]
[0364] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 4mmo 1)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（149mg，0? 4mmo1)和中间体 17 (3,4-二苯 甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酸）（157mg，0. 4mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（165mg， 0. lmmol，1当量）。通过RP-HPLC纯化获得31mg(0. 052mmol)的最终产物。
[0365] 实施例15 :
[0366] (S) -1-((2S) -1- (3-乙酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈
[0367]
[0368] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0? 4mmol)、Fmoc-4,4-二氟-L-腫氨酸（149mg，0? 4mmol)和中间体 18 (3-乙酰氧 基-4,5-二甲氧基苯甲酸）（96mg，0. 4mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（165mg， 0? lmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得22mg(0. 048mmol)的最终产物。
[0369] 实施例16:
[0370] (S) -1-((2S) -1- (3-特戊酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0371]
[0372] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 4mmol)、Fmoc-4,4_ 二氟-L-脯氨酸（149mg，0. 4mmol)和中间体 19(3-特戊酰 氧基-4,5-二甲氧基苯甲酸）（11311^，0.4_31)依次偶联到市售516匕61'酰胺树脂（16511^， 0? lmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得19mg(0. 040mmol)的最终产物。
[0373] 实施例17 :
[0374] (S)-1-((S)-1-(4_(苄基氧基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烷-2-甲腈
[0375]
[0376] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (15〇11^，0.45_〇1)、卩1]1〇(3-4,4-二氣-1^-腫氛酸（16611^，0.45_〇1)和4-苄基氧基苯甲酸 (101mg，0.45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg，0. 15mmol，l当量）上。通过 RP-HPLC纯化获得17mg(0. 038mmol)的最终产物。
[0377] 实施例18 :
[0378] (S)-1-((S)-1-(3_(苄基氧基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烷-2-甲腈
[0379]
[0380] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (15〇11^，0.45_〇1)、卩1]1〇(3-4,4-二氣-1^-腫氛酸（16611^，0.45_〇1)和3-苄基氧基苯甲酸 (101mg，0.45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg，0. 15mmol，l当量）上。通过 RP-HPLC纯化获得8mg(0. 018mmol)的最终产物。
[0381] 实施例19 :
[0382] (S)-1-((S)-1-(2_(苄基氧基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烷-2-甲腈
[0383]
[0384] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (15〇11^，0.45_〇1)、卩1]1〇(3-4,4-二氣-1^-腫氛酸（16611^，0.45_〇1)和2-苄基氧基苯甲酸 (101mg，0.45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg，0. 15mmol，l当量）上，通过 RP-HPLC纯化获得5mg(0.0 llmmol)的最终产物。
[0385] 实施例20 :
[0386] (S)-1-((S)-1-(4_(苄基氧基）-3_(三氟甲基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0387]
[0388] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (150mg, 0. 45mmol)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（l66mg，0? 45mmol)和中间体 2〇 (4-苄基 氧基-3-三氟甲基苯甲酸）（132mg，0. 45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg， 0? 15mmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得32mg(0. 061mmol)的最终产物。
[0389] 实施例21 :
[0390] (S) -1- ((S) -1- (4-(苄基氧基）-3-氟苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基）吡 咯烷-2-甲腈
[0391]
[0392] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (150mg, 0. 45mmol)、Fmoc_4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（l66mg，0? 45mmol)和中间体 21 (4-苄基氧 基-3-氟苯甲酸）（109mg，0. 45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg，0. 15mmol， 1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得14mg(0. 030mmol)的最终产物。
[0393] 药理学数据
[0394] 新化合物对（人）脯氨酰寡肽酶活性的抑制作用的测定
[0395] 脯氨酰寡肽酶（POP)的表达和纯化
[0396] 根据文献方法（Tarrag6 T等，ChemBioChem 2006 ;7 :827_33)通过在大肠杆菌 (E.coli)中表达并使用His尾融合的亲和纯化来获得P0P，概述如下：
[0397] hPOP表达：用pETMlO hPOP转化E. coli BL21感受态细胞。为了诱导表达，进行 将单菌落接种到含卡那霉素（50yg/mL)的LB培养基（50mL)并37°C下生长过夜的预培 养。次日，用过夜培养物（10mL)接种LB培养基的两个培养物（500mL)。使经接种培养物 在37°C和220rpm下生长直至0D 595为1.2(2. 5至3小时）。然后添加IPTG(最终浓度为 ImM)并且在25°C下进行诱导过夜。收集细胞（3500g，15分钟，4°C )并且使沉淀悬于悬浮 缓冲液（50mL) [Tris-HCl pH 8(50mM)、NaCl (300mM)、咪唑（ImM)]中并在 50%强度和 0? 5 脉冲下进行超声处理，采用四个循环（每一循环由15秒的超声处理和15秒的静止组成）， 将样品放置在冰上。超声处理后，对样品进行离心（40 000g，30分钟，4°C)并立即使用上 清液进行POP纯化。使用又KTAexplorer FPLC系统来进行纯化。在lmL/分钟的流速 下，将上清液施加至先前经5个柱体积的悬浮缓冲液平衡的HiTrapQuelating柱（5mL)中。 用悬浮缓冲液冲洗柱直至280nm处的吸光度回至基线水平。然后用5个体积的洗涤缓冲液 (50mM Tris-HCl，pH 8,300mM NaCl，30mM咪唑）来漂洗柱。用4个体积的洗脱缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 8,300mM NaCl，500mM咪唑）进行洗脱。在整个洗脱期间收集各级分（4mL)。在 所有级分中检测POP活性并且通过SDS-PAGE来分析呈阳性的级分并用Biosafe Comassie Stain G-250染色。收集阳性级分并且通过使用具有作为缓冲液的Tris-HCl(50mM，pH 8) 的HiPr印26/10脱盐柱对其进行脱盐。采用具有BSA作为标准的Bio-Rad蛋白质测定来 定量重组的hPOP。制备重组酶的等分试样并立即用液氮冷冻并储存于-80°C。
[0398] POP抑制测定
[0399]根据 Toide 等所述的方法（Toide K 等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995 ;274 : 1370-8)将Z-G-P-AMC(N-苄基氧基羰基-Gly-Pro-甲基香豆素基-7-酰胺）用作POP底 物来测定POP活性。反应在96孔微量滴定板中进行，这使得能够同时监测多个反应。对各 个反应而言，在37°C下将hPOP (根据hPOP批次的活性，范围为20nM至60nM)和相应新化 合物溶液（3 y 1)与活性缓冲液（134 y 1，100mM Na/K磷酸盐缓冲液，pH 8. 0)预孵育15分 钟。在DMSO(lOOmM)中制备新化合物的储液，并且使用DMS0由该储液制备稀释物。或者， 使用另一种活性缓冲液（141 y L，lOOmM Tris-乙酸盐，10mM BSA，ImM DIT，pH 7. 3)进行反 应，其与hPOP (lOnM)和相应新化合物溶液（3 y 1)(条件B)预孵育。
[0400]在预孵育后，添加 Z-G-P-AMC(40% 1，4_ 二p恶烷中 10yl，3mM) (40% 的 1，4_ 二p恶 烷中3yl，1.5mM，条件B)，并且在37°C下将反应孵育1小时。通过添加醋酸钠（150yl， lM，pH 4)终止反应并且使用焚光计量法（fluorimetrically)测定AMC的形成。激发和发 射波长分别为360/40nm和485/20nm。
[0401] 对每一化合物测定几个浓度点（范围为25pM至400 y M)。根据公式1计算对脯氨 酰寡肽酶的抑制活性。对各个新化合物而言，在存在hPOP (a)和不存在hPOP (b)时测定荧 光。在不存在抑制化合物时由hPOP样品获得最大荧光（0%抑制活性）。为了评价新化合 物的抑制效力，针对化合物的log浓度绘制活性，使用GraphPad Prism软件调节为S形曲 线，并且由所得曲线确定IC5Q值（定义为抑制50%的POP活性所需化合物浓度）。
[0402]
[0403]其中：
[0404] a对应于存在底物+测试的化合物+hP0P时的荧光强度
[0405] b对应于存在底物+测试的化合物时的荧光强度
[0406] c对应于存在底物+hP0P时的荧光强度
[0407] d对应于存在底物时的荧光强度。
[0408] 新化合物表现出针对人脯氨酰寡肽酶的高抑制效力。结果总结于表1中。
[0409] 表1:人脯氨酰寡肽酶的抑制
[0410]
[0411] ( * )条忏B卜所测疋的
[0412] 对相关脯氨酸特异性蛋白酶的抑制活性
[0413] 测试到新化合物对二肽基肽酶IV (DPPIV)活性的抑制作用。按照用于测定对脯氨 酰寡肽酶之抑制活性的上述方法，将G-P-AMC (H-Gly-Pro-甲基香豆素基-7-酰胺）用作底 物。在用活性缓冲液和相应化合物溶液对DPPIV进行预孵育后，添加G-P-AMC (40 % 1，4-二 v恶烷中10 y 1，750 yM)，并且在37°C下将反应孵育20分钟。通过添加醋酸钠（150 y 1，1M， pH 4)终止反应并且使用荧光测定法测定AMC的形成。对每一化合物测量几个浓度点（范 围为100 y M至400 y M)。根据公式1计算对DPPIV的抑制活性。没有一个新化合物示出针 对二肽基肽酶IV(400 yM的IC5(I值）的抑制活性，因此为特异性POP抑制剂。
[0414] 此外，测试新化合物针对成纤维细胞激活蛋白（FAP)的抑制活性。采用的方法与 用于测定对POP之抑制活性的上述方法类似。将Z-G-P-AMC用作底物，最终浓度为100 y M。 测定中使用的缓冲液为50mM Tris、lM NaCl、lmg/ml BSA pH:7. 5。在活性缓冲液中，使用 母液浓度为2 y g/mL的重组人FAP，这导致测定中的最终浓度为0. 1 y g/mL。在DMS0中制 备20mM的各新化合物的储液并且便于稀释。在37°C下将活性缓冲液和相应新化合物溶液 与FAP预孵育15分钟后，添加底物（活性缓冲液中50 y 1，100 y M)，并且在37°C下将反应 孵育1小时。通过添加醋酸钠（150 yl，lM，pH 4)终止反应并且使用荧光测定法测定AMC 的形成。对每一化合物测量几个浓度点（范围为100 至400 yM)。根据公式1计算对 FAP的抑制活性。没有一个新型化合物示出针对FAP的抑制活性（IC5(I值超过400 y M)，因 此为特异性POP抑制剂。
[0415] 化合物渗透特性的测定
[0416] 平行人工膜渗透性测定（PAMPA)
[0417] Kansy M等，J. Med. Chem. 1998 ;41 (7) : 1007-10中所述的平行人工膜渗透性测定 (PAMPA)用于测定化合物通过被动扩散跨越血脑屏障（BBB)的能力（Di L等，Eur. J.Med. Chem. 2003 ;38 (3) :223-32)。在200 y M的初始浓度下测定化合物的有效渗透性（Pe)。根据 制造商的说明书由商业浓缩的缓冲液来制备缓冲液。使用0. 5M NaOH溶液将pH调节至7. 4。 在DMS0中制备新化合物的储液并且用缓冲液稀释至200 yM的最终浓度（0. 5%的DMS0含 量）。将PAMPA夹层分离并且用200 y L的化合物溶液填充各个供体孔。将受体板放置到供体 板中，确保膜的底面与缓冲液相接触。将4yL的十二烷中的磷脂混合物（20mg/mL)添加至 各孔的过滤器中，并且将200 y L的缓冲液添加至各个受体孔中。覆盖平板并且在室温、饱 和湿度气氛和l〇〇rpm的轨道（orbital)搅拌下孵育4小时。4小时后，通过HPLC来分析受 体区室和供体区室的内容物：将来自供体板的每个孔的150yL和来自受体板的每个孔的 150yL转移至HPLC小瓶中，将各个样品注射入反相C 18柱（150mmX4.6mmX5ym，1〇〇 A )(100 y L/来自受体孔的注射物、10 y L/来自供体孔的注射物并且对h进行参照）。转运 还可通过MALDI-T0F光谱测定法加以证实。
[0418] 所用磷脂混合物为由Avanti polar lipids提供的猪脑极性脂质提取物，其具 有如下组成：12.6%卵磷脂（PC)、33. 1%磷脂酰乙醇胺（PE)、18.5%磷脂酰丝氨酸（PS)、 4. 1 %磷脂酰肌醇（PI)、0. 8 %磷脂酸和30. 9% 的其他化合物。
[0419] 4小时后，使用公式2计算有效渗透性（Pe)并且使用公式3计算转运百分比：
[0420]
[0421]
[0422]其中：
[0423] t 为时间（h)
[0424] CA(t)为时间t时受体孔中的化合物浓度
[0425] 并且CD (tj为在h时供体孔中的化合物浓度。
[0426] 基于表2所示的指示值Pe，新化合物示出跨越BBB的良好渗透性（表3)
[0427] 表2:指示值Pe
[0428]
[0429] 表3 :新化合物的有效渗透性（PJ和转运百分比
[0430]
[0431] 新化合物对认知损伤动物模型的学习与记忆的影响
[0432] 在认知损伤的药理学模型中评价新化合物作为认知增强剂的效力。在未治疗和 经MK-801治疗的啮齿动物（小鼠或大鼠）中评价新化合物的效果。MK-801为损害动物 在各种学习与记忆范例中的表现的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA)受体的非竞争性拮抗 剂（Castellano C 等，Curr. Drug Targets 2001;2:273-83. ;Riedel G 等，Behav. Brain Res. 2003 ;140 :l-47)。MK-801也对啮齿动物行为产生多种影响，包括感觉处理的缺陷、运 动过强、刻板症（stereotypy)和共济失调。由MK-801处理诱导的行为表现已广泛用作认 知缺陷的动物模型（Bardgett ME 等，Brain Res. Bull. 2003;60:131-42 ;Van der Staay FJ 等，Behav. Brain Res. 2011 ;220 :215_29 ;Mutlu 0 等，Pharmacol. Biochem. Behav. 2011 ; 99 :557-65)〇
[0433] 为了确定所测试化合物是否可充当认知增强剂，通过广泛使用的如下测试来测试 其恢复正常认知行为的能力：新物体识别测试（X*ere E等，Neurosci.Biobehav. Rev. 2007 ; 31 :673-704 ;Boess FG 等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007 ;321 :716-25);被动或抑制性 逃避任务（Sarter M 等，Psychopharmacology(Berl) 1992 ;107 :144_59) ;Morris 水迷宫 (D'Hooge R 等，fcain Res. Rev. 2001;36:60-90);以及 T 迷宫交替任务（Boess FG 等， Neuropharmacology 2004;47:1081-92 ;Spowart_Manning L 等，Behav. Brain Res. 2004; 151 :37-46)。
[0434] 作为用于评价新POP抑制剂的代表性实施例，描述了各个行为测试遵循的方案和 新物体识别测试以及被动逃避测试所获得的结果。
[0435] 新物体识别任务
[0436] 新物体识别（novel object recognition，N0R)任务基于嗤齿动物探宄新物体的 自然偏好（Ennaceur A等，Behav. Brain Res. 1988 ;31 :47_59)。其为用于研宄视觉学习和 记忆缺陷的相关非奖励测试。简言之，N0R任务过程由三个试验组成：适应、训练和保持。在 不存在物体的情况下，使各个动物适应于40cm直径的圆形台10分钟（适应期）。次日，将 动物在圆形台上放置10分钟进行训练实验，并且将两个相同物体放置在对称位置。该步骤 连续进行两天。在第三天，用不同的物体替代所述物体中的一个。将未用于训练实验的物体 用作保持实验中的新物体。然后允许动物自由探索10分钟，并且记录探索各个物体所花费 时间。期望动物花费更多时间探索新物体，这是完好识别记忆的标志。辨别力指数（index of discrimination)如下计算：探索新物体所花费的时间减去探索旧物体所花费的时间， 再除以探索两个物体所花费的总时间，并且乘以100。认为更高的辨别力指数反映更好的记 忆保持。
[0437] 将新鲜溶解于含5% Tween 80的PBS中的相应测试的POP抑制剂以5mg/Kg的剂量 (0. lmL体积/10g动物体重）皮下（s. c.)给予。十五分钟后，将溶于PBS缓冲液的MK-801 以0. 2mg/kg的剂量（0. lmL体积/10g动物体重）腹膜内（i. p.)注射。对照组i. p.施用 MK-801并s. c.施用相同体积的载剂（具有5% Tween 80的PBS)。另一个对照组i. p.接 受PBS并s.c.接受相同体积的载剂。根据示出药物具有预期效果的行为和神经化学研宄 来选择药物剂量。在训练期期间和测试期之前，每天向动物注射两种药物。
[0438] 在施用作为本发明代表性化合物的实施例4的化合物时，所得结果示出于图1。
[0439] 如实施例4的化合物所示，本发明化合物能够在N0R测试中逆转MK-801诱导的记 忆损伤。
[0440] 被动逃避任务
[0441] 为了评价被动逃避任务，使用具有相同尺寸之亮隔室与暗隔室的两隔室盒。两个 隔室被可提升的闸门隔开。所用设备根据用于该测试的标准方法。给出由24小时的短期间 隔隔开的一段电击期和一段评价期。在电击期，将啮齿动物放置到亮隔室中。在20秒的适 应期后，将通向另一个隔室的闸门打开，并且一旦啮齿动物进入暗隔室便再次下降。然后， 施加短暂而微弱的足电击。在电击终止后60秒，将嗤齿动物从设备移开并且放回其养笼 中。在评价期，测定动物进入暗隔室花费的时间（以秒计），作为先前期期间在暗隔室中所 接受电击的记忆保持的标志。在最初电击期后一周实施第二评价期。在电击期前35分钟 以如物体识别测试所述的相同剂量和体积s. c.注射相应评价的化合物，15分钟后i. p.注 射MK-801 (或者在对照的情况下注射PBS)。仅用MK-801治疗的动物表现出电击期的较小 记忆保持，而另外接受POP抑制剂的动物表现出进入暗隔室的较长等待时间，预示记忆保 持更好。
[0442] 在施用作为本发明代表性化合物的实施例4的化合物时，所得结果示出于图2。
[0443] 如实施例4的化合物所示，本发明化合物能够在被动逃避测试中逆转MK-801诱导 的记忆损伤。
[0444] 水迷宫（Morris逃脱测试）
[0445] 根据用于该测试的标准方法和尺度，在约22°C温度的装有经乳胶染色的自来水 的水箱中评价Morris水逃脱表现。逃脱平台由灰色聚乙烯圆柱体组成，浸没在水面以下 1. 5cm处。在训练和测试期前35分钟以如物体识别测试所述的相同剂量和体积s. c.施用 相应评价的POP抑制剂，然后15分钟后i. p.注射MK-801 (或者在对照的情况下为PBS)。 在训练期以及评价期期间每天对动物注射两种化合物。
[0446] 啮齿动物接受两组连续三天的训练期，两组之间有两天的间隔。每一训练期由两 组三个实验组成，其是紧密连续地进行。实验通过将啮齿动物放入池中，面向水箱的壁开 始。以随机化顺序使用四个起始位置（北、东、南和西）。逃脱台始终处于同一象限中。一 旦动物爬上逃脱台或者在60秒过去后（无论哪个事件首先发生），即终止实验。一旦啮齿 动物达到平台，即允许其停留30秒以使得其能够将逃脱台与水箱上的特定位置相关联。然 后将其从平台移走并开始下一次实验。如果动物未在60秒内找到平台，则实验者将其放在 平台上并使其在那停留30秒。在第一训练期期间，放置视觉线索以标记平台的位置。在下 一个训练期移除该线索。在训练期期间，记录到达平台的等待时间。
[0447] 在第二组训练期结束之后的那天进行评价：移除平台，在60秒内测量啮齿动物在 训练期期间于布置有平台的水池象限（目标象限）中所花费时间。在探测实验中，从与目 标象限相反的相同起始位置释放所有动物。经MK-801治疗的动物不能有效学习与记忆平 台所处的地方，如表现出更长的游泳距离和逃脱等待时间以及这些动物花费在目标象限上 的时间（相比于其他象限约为平均）。经MK-801和相应POP抑制剂处理的动物在测试中表 现出更好的表现一一学习平台的位置（如反映为在目标象限所花费时间的更高百分比）， 因此示出MK-801的作用得以有效逆转。使动物保持休息一周后再训练4天。在第五天，移 除平台并且进行第二评价。
[0448] T迷宫交替任务
[0449] 采用T迷宫交替任务来测试工作记忆。根据一般的尺度和方法在由木材构成并涂 黑的T迷宫中进行实验。侧通道通过可移动的门与主通道隔离。在适应前一周，对所有动 物部分限食并在实验的整个剩余部分保持这样的方式，从而使动物保持其自由进食时体重 的85%。摄像机位于T迷宫上方约lm以对测试期进行录像。在不同动物之间对T迷宫进 行清洁而在不同实验之间不进行清洁。整个实验由三部分组成：适应、训练和测试。在适应 期间，将所有动物放置在T迷宫上直至其进食两块食物或90秒已逃脱。将此每天重复三次， 进行5天。在逝签期间，所有动物每天接受六次实验。每次实验由两种跑动组成：强迫跑动 和自由跑动。在强迫跑动中。强迫啮齿动物从T迷宫的一个目标支路（arm)(其他目标支 路被其门阻挡）获得一块食物。然后将动物放回起始支路，保持10秒的延迟时间。在自由 跑动开始时，允许动物选择任一目标支路。如果动物选择与其在强迫跑动期间被迫进入的 支路相反的支路，则其接收到食物奖励。如果动物选择其被迫进入的同一支路，则其接收不 到食物奖励。实验中间间隔为5分钟。对照动物在连续两天作出>70%的正确选择后，训 练期结束。动物需要7至12天来达到标准。从研宄中排除14天未达到标准的动物。然后 在10秒或40秒的延迟时间，测试啮齿动物的表现。在测试日期间，给予动物三次10秒延 迟实验和三次40秒延迟实验。对药物测试而言，在药物暴露15分钟之后，给予啮齿动物六 次10秒延迟实验。每天随机化延迟次序和强迫活动食物位置（左边或右边），只要没有将 相同的延迟或相同的被迫支路位置用于一组的三次实验。目标进入定义为四个脚爪放在支 路内。
[0450] 在测试期前35分钟，以如物体识别测试所述的相同剂量和体积s. c.注射相应评 价的POP抑制剂，接着15分钟后i.P.注射MK-801抑制剂（或者在对照的情况下为PBS)。
[0451] 对照动物在第1天至第4天的训练之间表现出具有接近偶然水平（chance level) 表现（约50%的正确支路进入）的学习曲线，并且训练的第11天至第14天之间逐步改进 直至达到70%的正确支路进入的平台期。其表现在10秒和40秒延迟实验中保持稳定。经 MK-801处理的动物不能有效学习交替任务并表现低于延迟实验的偶然水平。经MK-801和 相应POP抑制剂处理的动物在测试中表现出更好的性能，具有与对照动物类似的学习曲线 并且在延迟实验中保持记忆，因此示出MK-801的影响得以有效逆转。
【主权项】
1. 式（I)化合物或其可药用盐、异构体、前药或溶剂合物：其中 R1、R2、R3和R 4独立地选自C η烷氧基、C η烷基羰基氧基、苄基氧基、苯基羰基氧基、萘 基幾基氧基、卩奎琳基幾基氧基、异卩奎琳基幾基氧基、二氣甲基、卤素和氣； R5选自卤素、臆、C n烷氧基、C n烷基硫基、C n烷基、苯基、苯氧基、苯硫基和二氣甲基； R6选自氢、氟和甲基。2. 根据权利要求1所述的化合物，其中R2和R4独立地选自氢、卤素、三氟甲基和C η烷 氧基。3. 根据权利要求2所述的化合物，其中R2选自氢和甲氧基，并且R4选自氟、三氟甲基 和甲氧基。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中R 3是苄基氧基。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中R 5是氟。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中R6是氢或氟。7. 根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自： ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4-甲氧基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S，4R) -1- (4-(苄基氧基）-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4-氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S，4S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-苯基吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S，4S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-(甲基硫基）吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S，4S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-甲基吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S，4R) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-氰基吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ?⑶-I- ((2S，4S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-(三氟甲基）-吡 咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S，4R) -I- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-(叔丁氧基）吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈 ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4-乙酰氧基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S) -1- (4-乙酰氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ?(幻-1-((2幻-1-(4-苯甲酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S) -1- (3,4-二苄基氧基-5-甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S) -1- (3,4-二苯甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S) -1- (3-乙酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S) -1- (3-特戊酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S)-I-((S)-1-(4-(苄基氧基）苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲 腈 ? (S)-1-((S)-1-(3-(苄基氧基）苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲 腈 ? (S)-1-((S)-1-(2-(苄基氧基）苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲 腈 ? (S) -I- ((S) -1- (4-(苄基氧基）-3-(三氟甲基）苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S)-1-( (S)-1-(4-(苄基氧基）-3-氟苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烷-2-甲腈 或其可药用盐、异构体、前药或溶剂合物。8.用于制备根据权利要求1至7中任一项所限定的式（I)化合物或其可药用盐、异构 体、前药或溶剂合物的方法，其包括： a)使式（IX)化合物与式（XI)化合物反应：在式（IX)化合物中R1、R2、R3、R4、R 5和R6如上式⑴中所限定，以产生式（XII)化合 物；b) 使所述式（XII)化合物水解以产生式（XIV)化合物 以及c) 使所述式（XIV)化合物处于能够将甲酰胺基团转化为腈基团的条件，以产生所述式 ⑴化合物； 其中步骤b)和c)可分开或以一釜式反应进行。9. 用于制备根据权利要求1至7中任一项所限定的式（I)化合物或其可药用盐、异构 体、前药或溶剂合物的方法，其包括使式（IX)化合物与式（IV)化合物反应：其中H R3、R4、R5和R 6如上式（I)中限定；10. 药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1至7中任一项所述的式（I)化合物或 其可药用盐、异构体、前药或溶剂合物，以及可药用载体、辅药或载剂。11. 如权利要求1至7中任一项所限定的式（I)化合物，其用作药物。12. 如权利要求1至7中任一项所限定的式（I)化合物，其用于治疗和/或预防认知障 碍。13. 如权利要求12中所限定使用的化合物，其中所述认知障碍是与选自以下的疾病相 关的认知障碍：精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病和帕金森病。14. 用于在哺乳动物中治疗或预防认知障碍的方法，其中向有所述治疗之需要的患者 施用治疗量的根据权利要求1至7中任一项所限定的化合物。15. 如权利要求14所限定的方法，其中所述认知障碍是与选自以下的疾病相关的认知 障碍：精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病和帕金森病。16. 如权利要求1至7中任一项所限定的式（I)化合物用于制备药物的用途。17. 如权利要求1至7中任一项所限定的式（I)化合物在制备用于治疗和/或预防认 知障碍的药物中的用途。18. 如权利要求17所限定的用途，其中所述认知障碍是与选自以下的疾病相关的认知 障碍：精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病和帕金森病。
【专利摘要】本发明涉及具有药理活性的式(I)的1-[1-(苯甲酰基)-吡咯烷-2-羰基]-吡咯烷-2-甲腈衍生物，制备这类化合物的方法，包含其的药物组合物及其在治疗和/或预防认知障碍中的用途。
【IPC分类】C07D403/06, A61K31/401, A61P25/00
【公开号】CN104903314
【申请号】CN201380059126
【发明人】埃内斯特·希拉尔特列多, 特里萨·塔拉戈克卢瓦, 罗格·普拉德斯科萨诺, 索莱达·罗约格拉西亚
【申请人】巴塞罗纳大学, 生物医药研究基金会机构(Irb巴塞罗那), 伊普罗透斯有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月11日
【公告号】CA2890042A1, EP2730571A1, EP2917209A1, WO2014072498A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有药理活性的化合物，并且更特别地，涉及一些1-[1-(苯甲酰 基）-吡咯烷-2-羰基]-吡咯烷-2-甲腈衍生物、制备这类化合物的方法、包含其的药物组 合物及其在治疗和/或预防认知障碍中的用途。
【背景技术】
[0002]脯氨酰寡肽酶（EC 3. 4. 21. 26) (POP)，也称为脯氨酰内肽酶（PREP)，是催化肽在 L-脯氨酸残基的C端侧水解的丝氨酸蛋白酶。其广泛分布在哺乳动物中并且可从多种器官 (包括脑）中纯化。
[0003] 该酶在与学习和记忆功能有关的含脯氨酸神经肽的断裂中发挥着重要作用（Wilk S 等，Life Sci. 1983 ;33 :2149-57 ;0' Leary RM，0，Connor B，J. Neurochem. 1995 ;65 : 953-63)〇
[0004] 在治疗与神经退行性进程有关的认知缺陷时测试了脯氨酰寡肽酶抑制的作用。通 过用1-甲基-4-苯基-1，2,3,6-四氢吡啶（MPTP)处理，在猴中产生了帕金森病，MPTP是 导致P物质耗尽的神经毒素。随后用S-17092(强力的POP抑制剂）治疗增加了认知任务 的成绩（Schneider JS 等，Neuropsychopharmacology 2002 ;26(2) :176_82)。还发现，POP 抑制防止了 a -突触核蛋白在体外的寡聚化[My8h錢！ien TT等，Br. J. Pharmacol. 2012 ; 166(3) :1097-113]。在阿尔茨海默病（AD)的情况下，在动物模型中进行的数个体内实验 表明，POP抑制引起了神经保护和认知增强作用（Kato A等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997 ; 283(1):328-35和1'〇丨(16 1(等，1^￥.他111'〇8(^.1998;9(1):17-29)。最初，1^七8油6小组在 通过用POP抑制剂0N0-1603处理来使皮层和小脑颗粒细胞免于年老诱导的凋亡时，观察到 了神经保护作用（Katsube N 等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999 ;288(1) :6_13) 〇
[0005] 仅在少数情况下，进行了用POP抑制剂治疗认知缺陷的临床试验。在I期临床研 宄中，Morain 小组（Morain P 等，Br. J. Clin. Pharmacol. 2000 ;50 (4) :350_9)发现，一种新 的口服活性脯氨酰内肽酶抑制剂S 17092在健康的老年对象中显示出认知增强特性和清 晰的剂量依赖性；而且，没有检测到副作用。稍后的研宄表明了该化合物另外的微小的情绪 稳定特性（Morain P 等，Neuropsychobiology 2007 ;55 (3-4) : 176-83)。
[0006] 据报道，在多种神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病（AD)、帕金森病、亨廷顿病和 多发性硬化（MS))中，脯氨酰寡肽酶活性发生改变（死后）（Mantle D等，Clin. Chim. Acta 1996 ;249 (1-2) :129-39)。
[0007]还存在大量的证据指明了神经炎症在神经退行性疾病（如AD、MS和帕金森 病）的发病机理中的作用（Hirsch EC 等，Lancet Neurol. 2〇〇9;8(4) :382-97，Philips T等，Lancet Neurol. 2011 ;10(3) :253-63)。POP被认为是由脑中的T0 4释放抗炎性 四肽 Ac-SDKP 的主要酶（Yang F 等，Hypertension 2004 ;43 (2) :229-36，Nolte WM 等， Biochemistry ;2009 ;48 (50) : 11971-81)。这表明POP的抑制可帮助减少神经炎症，并因此 POP抑制剂可用于治疗具有炎症组分的神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病，并且 特别地，帮助改善与这些疾病相关的认知障碍。
[0008] 皮质脑区中遍布的老年斑是AD的典型神经病理学标志。这些斑的主要蛋白质组 分是淀粉样肽（Af3)。A0沉积引起脑中的神经元功能障碍和死亡。该肽来源于淀 粉样前体蛋白（APP)。在正常情况下，APP被a-分泌酶切割产生可溶的APP a，从而阻止 了 A0生成。
[0009] 有趣的是，POP抑制提高了细胞内IP3水平，其可有助于刺激APP a产生，进而减 少A0生成。
[0010]另外，Rossner (Rossner S 等，Neurochem. Res. 2005 ;30 (6-7) :695_702)发现，受 A|3斑影响的AD患者的脑结构中具有较少的POP免疫反应性神经元。
[0011] 另外，P物质似乎可抑制0 -淀粉样蛋白的神经毒作用（Kowall NW等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1991 ;88(16) :7247-51)。脯氨酰寡肽酶抑制剂抑制P物质的代谢，从而帮助 维持可抑制0 _淀粉样蛋白神经毒作用的P物质的水平。
[0012] 鉴于上述作用，认为脯氨酰寡肽酶抑制剂可能是用于治疗阿尔茨海默病以帮助改 善与该疾病相关的认知障碍的有用药物。
[0013] 脯氨酰寡肽酶也与可能与多发性硬化（MS)有关的多种因素有关。例如，POP参与 小胶质细胞毒性的调节（Klegeris A等，Glia 2008;56(6) :675-85)。实际上，最近的报道 确定了 POP与MS之间的直接关系；RR-MS患者的血衆POP活性显著降低（Tenorio-Laranga J等，JNeuroinflammation 2010 ;7 :23)。有趣的是，该降低与疾病症状的严重程度相关，而 不与患者年龄相关。相反地，在健康对照中观察到POP活性与年龄之间的负相关（inverse correlation)，并且在老年对照中，其水平与MS患者中发现的水平相当。
[0014] 帕金森病的神经病理学标志是黑质部中黑化的多巴胺能神经元以及细胞内包涵 体（称为卢伊体（Lewy body))的进行性退化。卢伊体的主要组分是140个氨基酸的蛋白 质一一a-突触核蛋白。在某些情况下，a-突触核蛋白单体相互作用形成纤维前体聚集 体（prefibrillar aggregate)或初原纤维，其可产生细胞毒性的可溶原纤维。这些原纤 维不能被蛋白酶体降解，并且其损害该细胞内蛋白水解系统的功能。这导致了 a-突触 核蛋白初原纤维（和另一些被蛋白酶体降解的蛋白质）在细胞溶胶中积累（Bennett MC， Pharmacol. Ther. 2005 ;105(3) :311-31)，并因此使帕金森病患者脑中的a-突触核蛋白 初原纤维增加。在a-突触核蛋白过表达细胞和小鼠模型中，这些原纤维与神经毒性有 关（Masliah E 等，Science 2000 ;287(5456) :1265-9;Gosavi N 等，J.Biol.Chem. 2002; 277(50) :48984-92)。错误折叠的a-突触核蛋白的异常积累可引起线粒体变化，这可促 进氧化应激并引起细胞死亡（Hsu LJ等，Am.J.Pathol.2000;157(2):401-10)。此外，已 知a-突触核蛋白基因的三个点突变（A53T、A30P或E46K)涉及到帕金森病家族形式的发 病机理（Polymeropoulos MH 等，Science 1997 ;276 (5321) :2045_7;Zarranz JJ 等，Ann. Neurol. 2004 ;55(2) :164-73)。
[0015] 在体外已显示出，当将a-突触核蛋白与野生型猪POP的克隆一起孵育时，a-突 触核蛋白的聚集速率增加，并且该增加依赖于POP浓度（Brandt I等，P印tides 2008; 29(9) : 1472-8)。而且，不具有POP活性的突变变体（S544A)不使聚集速率加快。
[0016] 添加POP抑制剂也可防止增加的聚集，表明该作用依赖于POP酶活性。最近的证据 表明，POP抑制剂在人a -突触核蛋白过表达的成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞中可阻断由氧化 应激诱导的a -突触核蛋白聚集增加My6h3neilTT等，Br. J. Pharmacol. 2012 ;166(3): 1097-113。POP与a-突触核蛋白共同定位在SH-SY5Y细胞中，并且这种共同定位在与POP 抑制剂一起孵育后消失，指明了 POP与a-突触核蛋白之间的相互作用。用POP抑制剂处 理5天降低了 A30P a-突触核蛋白转基因小鼠的脑中可溶a-突触核蛋白的量。
[0017] 因此，抑制脑POP活性可防止a -突触核蛋白聚集，并因此防止卢伊体中细胞毒性 初原纤维的形成。因此，POP抑制剂在治疗已描述有加速的a-突触核蛋白聚集的神经退 行性疾病中可潜在地具有治疗价值。
[0018] 能够抑制POP的化合物可有效用于防止大鼠中由莨菪胺诱导的实验性遗忘，推测 POP抑制剂具有减缓记忆功能障碍的功能（Yoshimoto T等，J.Pharmacobiodyn. 1987 ;10 : 730-5)〇
[0019] 在Morris水迷宫中对大鼠测试了亚长期（subchronic)施用迷迭香酸（非竞争 性POP抑制剂）的作用（具有63. 7 y M的相对高的IC50值），并且报道了空间记忆的增强 (Park DH 等，Fitoterapia 2010;81(6) :644_8)〇
[0020] 已发现双相障碍患者在血清中具有POP的高水平活性。近年来，POP作为用于治 疗这种疾病的靶标是重要的，这尤其是因为其参与肌醇-1，4,5-P3(IP3)的代谢。IP3是在 神经肽级联中转导信号的关键分子。通过与特定受体结合，神经肽诱导IP3增加，IP3与其 在内质网膜上的受体结合并诱导认为在学习和记忆中发挥至关重要作用的Ca2+释放。最 近的发现表明 POP 调控 IP3 的浓度（Komatsu Y J. Neurosci. 1996 ; 16 :6342-52)。因此，知 道了在真核生物盘基网柄菌<X*ictyostelium discoideum)中破坏POP基因通过使IP3升 高诱导了锂抗性（Schulz I 等，Eur. J. Biochem. 2002 ;269 :5813-20)，并且还降低了 POP 的 蛋白水解活性，这是神经胶质瘤细胞中的高浓度IP3的原因（抵抗人P0P(antisense human for POP))。当用特异性POP抑制剂处理这些细胞时，也观察到这种作用（Williams RS等， EMB0 J. 1999;18 :2734-45)。
[0021] IP3信号传导途径涉及多种药物治疗性情绪稳定剂（锂、卡马西平和丙戊酸） 的作用，并且其在调节IP3信号传导的机制中缺陷可造成双相障碍。而且，常用于治疗 双相障碍的情绪稳定剂药物丙戊酸直接抑制重组POP的活性（Cheng L等，Mol. Cell. Neurosci. 2005 ;29 :155-61)。总之，存在有力的证据证明POP抑制剂可用于在哺乳动物中 预防和/或治疗双相情感障碍。因此，提供POP的新型抑制剂在治疗这种障碍或疾病中是 令人感兴趣的。
[0022] 总之，已对数种POP抑制剂在各种认知任务中的作用进行了表征，并且达成了一 些共识：P0P抑制剂对学习与记忆具有积极作用（Morain P等，CNS Drug. Rev. 2002 ;8(1): 31-52 ;Shinoda M 等，Eur. J. Pharmacol. 1996 ;305 (1-3) :31_8 ;Marighetto A 等，Learn. Mem. 2000 ;7 (3) : 159-69 ;Toide K 等，Pharmacol. Biochem. Behav. 1997 ;56 (3) :427_34 ; Schneider JS 等，Neuropsychopharmacology 2002 ;26 (2) :176_82)。
[0023] 数个专利和专利申请公开了 POP抑制剂：W0 2008/077978 Al、W0 2005/027934 A1、JP 2011-037874 A2、W0 2005/002624 AUTO 2004/060862 A2、W0 03/04468 A1、DE 196 03 510 Al、US 2006/0100253 A1和US 6,159,938 A，但是仅几种化合物进行了体内研宄 (JTP-4819、S17092、Z-321、0N0-1603、Y-29794、ZTTA、Z-Pro-Prolinal 和 KYP-2047)，该列 表中仅前三种进入了临床试验并且没有一个实现市场交易。
[0024] 尽管存在POP抑制剂，但是本领域中仍然需要提供对POP具有高亲和力并且具有 穿过血脑屏障到达脑部（当用于治疗认知障碍时抑制剂发生作用的地方）的良好能力的替 代化合物。这是化合物成为用于治疗认知障碍的良好候选物的重要特征。
[0025] 发明简述
[0026] 本发明现在已成功地发现，一系列的1-[1_(苯甲酰基）_吡咯烷-2-羰基]-吡咯 烷-2-甲腈衍生物不仅能够以高效力抑制P0P，而且能够穿过平行的人工膜，所述穿过平行 人工膜是普遍接受的用于预测穿过血脑屏障之能力的方法。这两种特性使得本发明化合物 成为用于治疗认知障碍的理想候选物。
[0027]因此，本发明的一个方面涉及具有式（I)化合物或其可药用盐、异构体、前药或溶 剂合物：
[0028]
[0029] 其中
[0030] R1、R2、R3和R 4独立地选自C i_4烷氧基、C i_4烷基幾基氧基、苄基氧基、苯基幾基氧 基、奈基幾基氧基、卩奎琳基幾基氧基、异卩奎琳基幾基氧基、二氣甲基、卤素和氣；
[0031] R5选自卤素、臆、Ci_4烷氧基、Ci_4烷基硫基、Ci_4烷基、Ci_4烷基幾基氧基、苯基、苯 氧基、苯硫基和二氣甲基；
[0032] R6选自氢、氟和甲基。
[0033] 本发明的另一个方面涉及用于制备如上所限定的式（I)化合物或其可药用盐、异 构体、前药或溶剂合物的方法。
[0034] 本发明的另一个方面涉及药物或药物组合物，其包含至少一种如上所限定的式 (I)化合物或其可药用盐、异构体、前药或溶剂合物，以及可药用载体、辅药或载剂。
[0035] 本发明的又一个方面涉及如上所限定的式（I)化合物或其可药用盐、异构体、前 药或溶剂合物，其用作药物，特别地用于预防和/或治疗认知障碍。
[0036] 本发明的再一个方面涉及用于在哺乳动物中治疗或预防认知障碍的方法，其中向 有所述治疗之需要的患者施用治疗量的如上所限定的式（I)化合物或其可药用盐、异构 体、前药或溶剂合物。在一个特别的实施方案中，所述障碍是与选自以下的疾病相关的认知 障碍：精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病和帕金森病。
[0037] 本发明的另一个方面涉及如上所限定的式（I)化合物或其可药用盐、异构体、前 药或溶剂合物用于制备药物的用途，所述药物特别地用于预防和/或治疗认知障碍，并且 更特别地，用于预防和/或治疗与选自以下的疾病相关的认知障碍：精神分裂症、双相情感 障碍、阿尔茨海默病和帕金森病。权利要求书中也对这些方面及其优选实施方案进行了限 定。
【附图说明】
[0038] 图1是对于PBS+载剂、MK-801+载剂以及MK-801+实施例4的化合物，比较在新 物体识别（novel object recognition，N0R)测试中获得的结果的图。
[0039] 图2是对于PBS+载剂、MK-801+载剂以及MK-801+实施例4的化合物，比较在被 动逃避任务测试中获得的结果的图。
[0040] 发明详述
[0041] 在本发明的上下文中，以下术语具有以下详细说明的含义。
[0042] 如本文所使用的，作为基团或基团一部分的q_4烷基定义为具有1至4个碳原子 的直链或支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁 基。烷基可任选地被一个或更多个取代基取代，所述取代基例如芳基、卤代、羟基、烷氧基、 幾基、氛基、幾基、醜基、烧氧幾基、氣基、硝基、疏基、烷基硫基等。如果被芳基取代，则为"芳 烷基"，例如苄基和苯乙基。
[0043] 术语Ci_4烷氧基意指Ci_4烷氧基或C烷基酿基，其中术语C烷基如上所定乂。 合适的烷基醚基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基 和叔丁氧基.
[0044]术语Q_4烷基羰基氧基意指Ch烷基与-C ( = 0) -0-基团连接，其中术语Ch烷基 如上所定义。
[0045] "卤素"或"卤代"是指溴、氯、碘或氟。
[0046] "腈"、"氰基"或"甲腈"是指基团-C= N。
[0047]术语Ch烷基羰基是指Ch烷基与羰基-C ( = 0)-基团连接。
[0048] 术语苯氧基意指苯氧基或苯基醚基。
[0049] 术语苯硫基意指苯基与硫醚基团-S-连接。
[0050] 应注意，所述定义中使用的任何分子部分上的基团位置可以是该部分上的任意位 置，只要其是化学稳定的即可。
[0051] 除非另有指示，否则本文中任何变量的定义中使用的基团包括所有可能的异构 体。
[0052] 术语"盐"必须理解为根据本发明使用的活性化合物的任何形式，其中所述化合物 是离子形式或者是带电的或者与相反离子（阳离子或阴离子）结合或者是在溶液中。该定 义还包括季铵盐以及活性分子与另一些分子和离子的络合物，特别是通过离子相互作用形 成的络合物。该定义特别地包括可生理接受的盐；该术语必须理解为等同于"药理学上可 接受的盐"或"可药用盐"。
[0053] 在本发明的上下文中，术语"可药用盐"意指，当以适当方式用于治疗，施用于或用 于特别是人和/或哺乳动物时是生理学耐受的任何盐（通常意指其是无毒的，特别是作为 相反离子的结果）。这些生理学上可接受的盐可用阳离子或碱形成，并且在本发明的上下 文中，理解为是通过至少一种根据 本发明使用的化合物一一通常是酸（去质子化的）一一例如阴离子形成的盐，特别是用于人和/或哺乳动物时。这些生理学上可接受的盐也可用 阴离子或酸形成，并且在本发明的上下文中，理解为是通过至少一种根据本发明使用的化 合物一一通常是质子化的（例如氮是质子化的）一一例如阳离子与至少一种生理学上耐受 阴离子形成的盐，特别是用于人和/或哺乳动物时。在本发明的上下文中，该定义具体地包 括：通过生理学上耐受的酸形成的盐，即，特定活性化合物与生理学上耐受的有机酸或无机 酸的盐一一特别是用于人和/或哺乳动物时。该类型盐的实例是用以下酸形成的那些盐： 盐酸、氢溴酸、硫酸、甲磺酸、甲酸、乙酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、扁桃酸、富马酸、乳 酸或柠檬酸。
[0054] 根据本发明的术语"溶剂合物"应理解为意指其中根据本发明的活性化合物通过 非共价键与另一种分子（通常为极性溶剂）结合的所述活性化合物的任意形式，尤其包括 水合物和醇合物，如例如甲醇化物（methanolate)。优选的溶剂合物是水合物。
[0055] 作为式（I)化合物之前药的任意化合物也在本发明的范围中。术语"前药"以其最 广泛的意义使用并且涵盖在体内转化为本发明化合物的那些衍生物。前药的实例包括但不 限于式I的化合物的衍生物和代谢物，其包括生物可水解部分，如生物可水解的酰胺、生物 可水解的酯、生物可水解的氨基甲酸酯、生物可水解的碳酸酯、生物可水解的酰脲和生物可 水解的磷酸酯类似物。优选地，具有羧基官能团的化合物的前药是羧酸的低级烷基酯。羧酸 酯常规地通过使分子上存在的任意羧酸部分酯化形成。前药通常可使用公知方法来制备， 例如，Burger "Medicinal Chemistry and Drug Discovery，第 6 版"（Donald J. Abraham 编著，2〇01，Wiley)、"Design and Applications of Prodrugs"（H.Bundgaard 编著，I985， Harwood Academic Publishers)以及 Krogsgaard-Larsen 等 "Textbook of Drug design and Discovery"Taylor&Francis(2002 年 4 月）所描述的那些方法。
[0056] 由上述式⑴表示的本发明化合物可包括对映体（取决于手性中心的存在）或异 构体（取决于多重键的存在）（例如，Z、E)。单一异构体、对映体或非对映体及其混合物在 本发明的范围中。
[0057] 此外，本文提及的任意化合物可作为互变异构体存在。具体地，术语互变异构体是 指化合物的两种或更多种结构异构体之一，所述结构异构体平衡存在并且容易由一种异构 体形式转化为另一种异构体形式。常见的互变异构体对是胺-亚胺、酰胺_亚氨酸、酮-烯 醇、内酰胺-内酰亚胺等。
[0058] 除非另有规定，否则本发明化合物还意指包括同位素标记形式，即，不同仅在于存 在一个或更多个富含同位素的原子的化合物。例如，除了至少一个氢原子被氘或氚替代，或 者至少一个碳被富含 13C或14C的碳替代，或者至少一个氮被富含15N的氮替代之外的具有本 发明结构的化合物也在本发明的范围中。
[0059] 式（I)化合物或其盐或溶剂合物优选地是可药用形式或基本纯的形式。尤其，可 药用形式意指除正常药物添加剂如稀释剂和载体之外具有可药用水平的纯度，并且不包括 正常剂量水平下认为有毒的物质。药物物质的纯度水平优选高于50%，更优选高于70%， 最优选高于90%。在一个优选实施方案中，式（I)化合物或其盐、溶剂合物或前药的纯度水 平高于95%。
[0060] 如之前所述的，术语"可药用盐、溶剂合物、前药"是指在施用于接受者后能够提供 (直接或间接）本文所述化合物的任何盐、溶剂合物或任何其他化合物。然而，应理解，非可 药用盐、溶剂合物和前药也在本发明的范围中，因为这些物质可用于制备可药用盐、溶剂合 物和前药。可通过本领域已知方法来进行盐、溶剂合物和前药的制备。
[0061] 本文所使用的术语"治疗"包括根除、移除、逆转、减轻、改变或控制疾病或病症，例 如认知障碍。
[0062] 本文所使用的术语"预防"和"预防性"是指式⑴化合物能够在疾病或病症（如 认知障碍）发病前避免其发病或形成，使其发病或形成最小化或者使其发病或形成变得困 难。
[0063]因此，"治疗"和/或"预防"作为整体意指至少抑制或减轻与折磨对象的病症有关 的症状，其中抑制和减轻在广义上用于指至少参数的幅度减小，例如，与待治疗病症如认知 障碍有关的症状。因此，本发明方法还包括其中完全抑制所述病症（例如，防止发生或停止 如终止）使得对象不再经受所述病症的情况。因此，本发明方法包括预防和管理认知障碍 二者。
[0064]本文所使用的术语"认知障碍"意指以与思考、学习或记忆有关的精神活动不足为 特征的任何病症。这样的障碍的实例包括失认症、遗忘症、失语症、失用症、谵妄、痴呆和学 习障碍。
[0065]认知障碍可（并且经常）与以神经元或参与神经元之间信号传递的其他结构 损伤或损失为特征的其他病症有关（即，由其造成或在其存在下发生）。因此，认知障 碍可与神经退行性疾病有关，所述神经退行性疾病例如阿尔茨海默病、皮质基底节变性 (corticobasal degeneration)、克-雅病、额颞叶变性、亨廷顿病、多发性硬化、正常压力脑 积水、有机慢性脑病综合征（organic chronic brain syndrome)、帕金森病、皮克病、进行 性核上性麻痹或老年性痴呆（阿尔茨海默型）。
[0066] 认知障碍也可与损害中枢神经系统的另一些病症有关，所述另一些病症包括精神 障碍如焦虑性障碍、分离型障碍，心境障碍如双相情感障碍、精神分裂症，以及躯体型障碍 和做作性障碍。
[0067]本文所述化合物可用于治疗失认症、遗忘症、失语症、失用症、谵妄、痴呆、学习障 碍和另一些认知障碍。
[0068]可用本发明方法进行治疗的痴呆的实例包括AIDS痴呆复合症、宾斯旺格病、具有 卢伊体的痴呆、额颞痴呆、多发性梗死痴呆、皮克病、语义性痴呆、老年性痴呆和血管性痴 呆。
[0069]可用本发明方法治疗的学习障碍的实例包括阿斯波哥尔综合征、注意缺陷障碍、 注意缺陷多动障碍、自闭症、童年期分裂症和Rett综合征。
[0070] 可用本发明方法治疗的失语症的实例包括进行性非流畅性失语症。
[0071] 本文所述的化合物也可用于治疗患有轻度的或者不显著干扰日常生活的精神活 动不足的患者。轻度认知损害是这样的病症的实例：患有轻度认知损害的患者表现出痴呆 症状（例如，语言或记忆困难），但是这些症状的严重程度使得诊断为痴呆可能不合适。本 文所述化合物可用于治疗轻度认知损害，并且类似地，治疗另一些较不严重形式的认知障 碍。
[0072] 因此，本发明的另一个方面是用于在哺乳动物中治疗或预防认知障碍的方法，其 中向有所述治疗之需要的患者施用治疗量的本发明化合物。
[0073] 在本发明的一个具体实施方案中，本文所述化合物可用于治疗患有与以下疾病相 关的认知障碍的患者：精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病或帕金森病。
[0074] 在本发明的一个具体实施方案中，在式（I)化合物或其可药用盐、异构体、前药或 溶剂合物中，R1是氢；R2、R3和R 4独立地选自Ci_4烷氧基、Ci_4烷基羰基氧基、苄基氧基、苯基 幾基氧基、奈基_幾基氧基、陸琳基幾基氧基和异陸琳基幾基氧基；R5选自卤素、臆、C i_4烧 氧基、(V4烷基硫基、C i_4烷基、苯基、苯氧基、苯硫基和二氣甲基；并且R6选自氣、氣和甲基。
[0075] 在一个具体实施方案中，R2和R4独立地选自氢、卤素、三氟甲基和Ch烷氧基。
[0076] 在另一个具体实施方案中，R2选自氢和甲氧基；并且R4选自氟、三氟甲基和甲氧 基。
[0077] 在另一个具体实施方案中，R5是氟。
[0078] 在一个具体实施方案中，R2和R 4独立地选自Ch烷氧基、Ch烷基羰基氧基和苄基 氧基。
[0079] 在一个具体实施方案中，R2和R 4是甲氧基。
[0080] 在另一个实施方案中，R3是苄基氧基。
[0081] 在另一个实施方案中，R1是氢。
[0082] 在另一个实施方案中，R5选自氟、甲氧基、甲基硫基和苯基，优选氟。
[0083] 在另一个实施方案中，R6是氢或氟。
[0084] 在另一些优选实施方案中，将以上所述不同取代基所述的优选组合起来。本发明 还涉及上式中优选取代基的这类组合。
[0085] 属于式⑴的具体独立的本发明化合物包括以下所列化合物：
[0086] ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_甲氧基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0087] ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0088] ? (S)-1-((2S，4S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_苯基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0089] ?⑶-l_((2S)-1-(4-(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0090] ? (S)-1-((2S，4S)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4-(甲基硫基） 吡咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲腈
[0091] ? (S)-1-((2S，4S)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_甲基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0092] ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_氰基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0093] ?⑶-1-((2S，4S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_(三氟甲 基） _ R比略烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0094] ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_(叔丁氧基） 吡咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲腈
[0095] ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_乙酰氧基吡 咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲腈
[0096] ?⑶-1-((2S)-1_(4-乙酰氧基-3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0097] ?⑶-1-((2S)-1_(4-苯甲酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0098] ? (S)-1-((2S)-1_(3,4-二苄基氧基-5-甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0099] ? (S)-1-((2S)-1_(3,4-二苯甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0100] ?⑶-1-((2S)-1-(3-乙酰氧基_4,5_二甲氧基苯甲酰基）-4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0101] ?⑶-l_((2S)-1-(3-特戊酰氧基-4,5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0102] ? (S)-1-((S)-1-(4-(苄基氧基）苯甲酰基）-4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烧_2_甲腈
[0103] ? (S)-1-((S)-1-(3-(苄基氧基）苯甲酰基）-4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烧_2_甲腈
[0104] ? (S)-1-((S)-1-(2-(苄基氧基）苯甲酰基）-4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烧_2_甲腈
[0105] ?⑶-l_((S)-1-(4-(苄基氧基）-3_(三氟甲基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0106] ?(幻-1-((幻-1-(4-(苄基氧基）-3-氟苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基） 吨匕略烧 _2_甲腈
[0107] 或其可药用盐、异构体、前药或溶剂合物。
[0108] 如上所限定的式（I)化合物可通过以下通用方案所阐明的可用合成工序获得。
[0109]
[0112]在第一步中，将式（II)的酯溶解或悬于极性有机溶剂（优选质子性极性有机溶 剂）如乙醇（EtOH)或甲醇或者极性有机溶剂的混合物中。添加水性碱溶液并通过以下过 程进行水解反应：将混合物（通常在回流下）维持在室温与溶剂混合物回流温度之间的温 度下直至水解完成，通常维持0. 5至4小时，优选1至2小时的时间段。碱溶液优选为无机 性质，例如稀碱，如NaOH。然后，放置反应混合物到达室温，并优选浓缩至反应体积的约五 分之一。然后将反应混合物缓慢添加到酸溶液如1M HC1溶液中以实现中和，同时在冰浴中 冷却。如果酸化导致沉淀，则过滤固体并用水洗涤，提供式（VII)的产物。如果没有得到沉 淀，则用适当的有机溶剂如乙酸乙酯将所得溶液萃取几次，干燥并蒸发有机相。通过快速色 谱法纯化式（VII)的粗产物。
[0113] 式（III)的胺的脱保护在温和酸性条件下例如添加到氯化氢在有机溶剂如二嗝 烷中的溶液中或者用TFA/DCM混合物，在0°C至室温的低温下实现。将反应在室温下搅拌1 至3小时。然后将溶剂蒸发至干，以得到式（VI)的胺的盐酸盐或三氟乙酸盐（取决于所使 用的酸）。
[0114] 式（IX)化合物由式（VII)的羧酸和式（VI)的胺在Schotten-Baumann条件下制 备。因此，向式（VII)的羧酸在有机溶剂如甲苯中的溶液中添加氯化剂如草酰氯。将反应 在50°C至80°C的温度下搅拌1至2小时，以允许形成式（VIII)的羧酸氯化物。在蒸发溶剂 之后，在低温如〇°C下将所得粗制物溶解在有机溶剂如THF中并添加到式（VI)的胺的碱性 水溶液（通常为式（VI)的胺的NaOH水溶液）中。将反应混合物在低温下搅拌1至2小时 并在室温下搅拌2至4小时。然后，蒸发溶剂，通过添加HC1溶液将剩余的水性级分调节为 酸性pH(3至4)并用乙酸乙酯进行萃取。有机相用盐水洗涤，干燥，过滤并蒸发。需要时， 通过快速色谱法纯化粗产物。
[0115] 然后，在碱如N，N-二异丙基乙胺（DIEA)存在下，并且在偶联剂如碳化二亚胺帮 助下，使式（IX)的产物与式（IV)的（S)-吡咯烷-2-甲腈偶联。具体地，将式（IX)化合物 溶解在非质子有机溶剂如二氯甲烷中并与DIEA -起添加到碳化二亚胺，例如固载的碳化 二亚胺，如N-环己基碳二亚胺、N'-甲基聚苯乙烯中。5分钟后，添加式（IV)的（S)-吡咯 烷-2-甲腈和额外的DIEA。将反应在室温下搅拌8至16小时。然后，过滤反应混合物并 用非质子有机溶剂洗涤剩余的固体。使滤液蒸发至干。然后通过制备型RP-HPLC纯化粗产 物。
[0116] 或者，可如方案E所阐述地制备式（I)化合物并且在以下描述：
[0117] 将经胺官能化的树脂如式（X)的Sieber酰胺树脂放置在装配有聚乙烯多孔圆盘 的注射器中。通过用适当的有机溶剂如二氯甲烷OCM)和二甲基甲酰胺（DMF)洗涤使树脂 溶胀。在树脂的胺基被保护后（即，在Sieber酰胺树脂的情况下），通过用胺碱溶液如哌啶 的DMF溶液处理实现保护基（如，芴基甲氧基羰基（Fmoc)保护基）的移除。
[0118]
[0119] 在从树脂中移除保护基之后，使用在适当的有机溶剂如DMF中的活化剂如三唑 (即，TBTU)和胺碱（如DIEA)使式（V)的经Fmoc保护的L-脯氨酸与树脂连接。将混合物 搅拌1至2小时。过滤并洗涤后，可使用Kaiser测试监测偶联程度，在需要时进行再偶联。 通过用胺碱溶液如哌啶的DMF溶液和/或哌啶/DBU/甲苯/DMF的混合物处理移除Fmoc以 产生式（XI)的产物。Fmoc移除可使用对硝基苯基酯NF31测试进行评价。
[0120]
[0121] 在适当的有机溶剂如DMF中，在添加剂如HOAt存在或不存在下，使用活化剂PyBOP 和胺碱如DIEA使式（XI)的产物与式（IX)的产物偶联，以产生式（XII)的产物。将混合物 手动搅拌1至2小时的总反应时间。使用相同的量和时间完成系统的再偶联。偶联程度可 使用对硝基苯基酯NF31测试进行监测。
[0122]
[0123]或者，式（XII)的产物也可通过以下过程逐步获得：首先使式产物（XI)与（XIII) 化合物偶联，然后移除Fmoc保护基团，然后与式（VII)化合物偶联。
[0124] 将用适当有机溶剂如DCM彻底洗涤并干燥的式（XII)的产物转移至烧瓶中，向其 中添加少量有机溶剂中的三氟乙酸酐和吡啶。将混合物维持在20°C至40°C的温度下8至 16小时。然后，过滤反应混合物并用相同有机溶剂洗涤树脂。收集滤液并使溶剂蒸发至干。 将所得粗制物溶解在适当溶剂如乙酸乙酯中，并用饱和NaHC0 3溶液和5% KHSOjK溶液洗 涤。将有机相干燥，过滤并蒸发。将粗制物溶解在H20 : CH3CN中并冻干以产生式（I)的肽 腈。
[0125] 或者，可用TFA/H20/TIS的混合物处理式（XII)的肽基-树脂（peptidyl-resin) 1 至2小时。然后，过滤树脂并用TFA洗涤，收集滤液并使溶剂蒸发至干。将粗制物重悬于 H20 : CH3CN的混合物中并冻干。将所得粗制物肽酰胺溶解在适当有机溶剂如DCM中，并例 如在五氧化二磷、四氯化钛、亚硫酰氯、三氟乙酸酐/吡啶或三苯基膦/四氯化碳存在下转 化为腈。将混合物维持在室温下8至16小时，使溶剂蒸发并将残余物溶解在乙酸乙酯中。 随后用KHSCVK溶液和NaHC0 3水溶液洗涤有机溶液。干燥并蒸发有机相，产生式（I)的肽 腈。
[0126] 粗产物通过RP-HPLC进行纯化。
[0127] 在用于制备本发明化合物的上述方法产生立体异 构体的混合物的情况下，可通过 常规技术例如制备型色谱法来分离这些异构体。如果存在手性中心，则所述化合物可制备 成外消旋形式，或者可通过对映体特异性合成或者通过拆分来制备单独的对映体。
[0128] 用作起始产物的式（II)、（III)、（IV)和（V)化合物以及一些式（VII)化合物是市 售可得的，并且也可使用本领域专家公知的方法来制备。
[0129] 因此，在本发明的一个方面中，提供了用于制备式（I)化合物或其可药用盐、异构 体、前药或溶剂合物的方法。
[0130] 在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0131] a)使式（IX)化合物与式（XI)化合物反应：
[0132]
[0133] 其中R1、!?2、!? 3、!?4、R5和R6如上式（I)中所限定；
[0134]
18
[0135] 其中聚合物代表在本文所公开的合成方法的反应条件下为惰性并且在本文所采 用溶剂中不溶但是可溶胀的聚合物，例如，低交联聚苯乙烯和聚乙二醇接枝的聚苯乙烯聚 合物，
[0136] 以产生式（XII)化合物：
[0137]
[0138] b)使式（XII)化合物水解以产生式（XIV)化合物
[0139]
[0140] 以及
[0141] c)使式（XIV)化合物处于能够使甲酰胺基团转化为腈基团的条件，以产生式（I) 化合物；
[0142] 其中步骤b)和c)可分开进行或以一釜式反应进行。
[0143] 在本发明的另一个实施方案中，用于制备式（I)化合物或其可药用盐、异构体、前 药或溶剂合物的方法包括以下步骤：
[0144] a)使式（IX)化合物与式（IV)化合物反应：
[0145]
[0146] 其中R1、!?2、!? 3、!?4、R5和R6如上式（I)中所限定，
[0147]
[0148] 在又一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0149] a)使式（XI)化合物与式（XIII)化合物反应：
[0150]
[0151] 其中聚合物代表在本文所公开合成方法的反应条件下为惰性并且在本文所采用 溶剂中不溶但是可溶胀的聚合物，例如，低交联聚苯乙烯和聚乙二醇接枝的聚苯乙烯聚合 物，
[0152]
[0153] 其中R5和R 6如上式⑴中所限定；
[0154] b)移除Fmoc保护基团；
[0155] c)与式（VII)化合物反应；
[0156]
[0157] 其中Ri、R2、R3和R 4如上式（I)中所限定；
[0158] d)使得到的产物从支撑聚合物水解以产生式（I)化合物：
[0159]
[0160]其中 R1、!?2、!?3、!?4、R5和 R6如上所限定。
[0161] 已发现，通式（I)化合物可用于治疗认知障碍，特别是与中枢神经系统的另一些 疾病或病症相关的认知障碍。
[0162] 在本发明的一个具体实施方案中，认知障碍是与选自以下的疾病相关的认知障 碍：精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病和帕金森病。
[0163] 本发明还提供了用于向患者施用的药物或药物组合物，其包含本发明化合物或其 可药用盐、衍生物、前药或立体异构体，以及可药用载体、辅药或载剂。
[0164] 根据本发明的药物组合物的辅助材料或添加剂可选自载体、赋形剂、支撑材料、 润滑剂、填料、溶剂、稀释剂、着色剂、风味调节剂如糖、抗氧化剂、粘合剂（binder)、粘结剂 (adhesives)、崩解剂、防粘剂（anti-adherent)、助流剂和/或凝集剂。在栓剂的情况下， 其可隐含蜡或脂肪酸酯或防腐剂、乳化剂和/或用于肠胃外施用的载体。这些辅助材料和 /或添加剂及待使用量的选择将取决于药物组合物的施用形式。
[0165] 根据本发明的药物或药物组合物可以是适于施用于人和/或动物，优选人（包括 婴儿、儿童和成年人）的任何形式，并且可通过本领域技术人员已知的标准程序来产生。 因此，根据本发明的制剂可适于局部施用或全身施用，特别是真皮、透皮、皮下、肌内、关节 内、腹膜内、静脉内、动脉内、膀胱内、骨内、海绵体内、鼻内、肺部、经颊、舌下、眼睛、玻璃体 内、经皮、经直肠、经阴道、经口、硬膜外、鞘内、心室内、脑内、脑室内、脑池内、脊柱内、髓周 (perispinal)、颅内、通过具有或没有泵装置的针或导管递送或者另一些施用途径。
[0166] 在一个实施方案中，药物组合物是经口形式，固体或液体。适用于口服施用的剂型 可以是片剂、丸剂、胶囊片（caplet)、胶囊（gel cap)、口香糖、胶囊剂、颗粒剂、滴剂、糖衆 剂或溶液剂，并且可包含本领域已知的常规赋形剂，例如粘合剂，如糖浆、阿拉伯胶、明胶、 山梨糖醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮；填料，如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨 酸；压片润滑剂，如硬脂酸镁；崩解剂，如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、乙醇酸淀粉钠或微晶纤维 素；或者可药用润湿剂，如月桂醇硫酸钠。
[0167] 在另一个实施方案中，药物组合物是用于非肠胃外的鼻内施用的产品形式，优选 用于鼻内施用的产品形式。通常，鼻内施用通过使用鼻喷雾器、挤压瓶和液体点滴器作为递 送装置来进行。为了与这些装置一起使用，药物组合物有利地为本发明化合物的液体溶液 或悬液。
[0168] 组合物可通过混合、填充或压片的常规方法来制备。采用大量填料进行反复混合 操作可用于使活性剂遍布在这些组合物中。这样的操作在本领域是常规的。片剂可例如通 过湿式造粒或干式造粒并且任选地根据正常制药实践中公知的方法（特别是用肠溶包衣） 进行包衣来制备。
[0169] 药物组合物也可适用于肠胃外施用，例如适当单位剂型的无菌溶液、悬液或可重 构干制备物、气雾剂或喷雾剂。可使用适当的赋形剂，例如填充剂、缓冲剂或表面活性剂。[0170] 本发明组合物可配制为溶解形式或贴剂中的沉积物，用于经皮施用。
[0171] 皮肤施用包括软膏、凝胶、霜剂、洗液、悬液或乳液。
[0172] 直肠施用的合适形式是通过栓剂。
[0173] 所述制剂使用标准方法来制备，例如西班牙和美国药典及类似参考文本中描述或 提及的那些方法。
[0174] 在本发明的一个实施方案中，优选的是，以治疗有效量使用使（I)化合物。医师将 决定最适合的本发明治疗剂的剂量，并且其随所选择的施用形式和特定化合物而改变，并 且此外，其随所治疗患者、患者年龄、待治疗疾病或病症类型而改变。当组合物口服施用时， 将需要大量的活性剂以与肠胃外较少量给药产生相同的作用。所述化合物可以以与之相当 的治疗剂相同的方式使用，并且剂量水平与这些其他治疗剂一般采用的数量级相同。活性 化合物通常每天施用一次或更多次，例如每日1、2、3或4次，并且典型的总日剂量在0. lmg/ kg/天至1000mg/kg/天的范围中。
[0175] 本发明的化合物和组合物可以与另一些药物一起使用，以提供联合疗法。另一些 药物可构成同一组合物的一部分，或者作为单独组合物提供用于同时或在不同时间施用。
[0176] 特别地，可配制至少一种式（I)化合物和至少另一种药物的组合用于与至少可药 用载体、添加剂、辅药或载剂同时施用、分开施用或顺序施用。这暗示式（I)化合物和另一 种药物的组合可这样施用：
[0177] a)作为同一药物制剂的部分的组合，然后二者总是同时施用；
[0178] b)作为两个单元的组合，其每一个产生同时、顺序或分开施用的可能性。在一个具 体实施方案中，式（I)化合物与另一种药物独立地（即，在两个单元中）但是同时施用。在 另一个具体实施方案中，首先施用式（I)化合物，然后分开或顺序地施用另一种药物。在又 一个具体实施方案中，首先施用另一种药物，然后分开或顺序施用式（I)化合物，如所限定 的。
[0179] 在本发明的上下文中，使用以下首字母缩略词和缩写，以下对其意思进行详细说 明：
[0180] AcOEt 乙酸乙酯
[0181] AcSDKP N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸
[0182] AD 阿尔茨海默病
[0183]BBB 血脑屏障
[0184]Boc 叔丁氧羰基
[0185] BSA 牛血清白蛋白
[0186]DBU 1，8-二氮杂二环[5. 4. 0] ^^一碳 _7_ 烯
[0187] DCM 二氯甲烷
[0188] DIEA N，N'_ 二异丙基乙胺
[0189] DMF 二甲基甲酰胺
[0190] DMS0 二甲亚砜
[0191] DPPIV 二肽基肽酶 IV
[0192] EtOH 乙醇
[0193] Fmoc 9_荷基甲氧基羰基
[0194] FPLC 快速蛋白质液相色谱法
[0195] HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
[0196] IP3 三磷酸肌醇
[0197] IPTG 异丙基_0 -D-1-硫代半乳糖苷
[0198] LB 溶菌肉汤（Lysogeny broth)
[0199] MALDI-T0F基质辅助激光解吸/电离-飞行时间
[0200] MK-801 双素西平（1NN)
[0201] MS 多发性硬化
[0202] 0D 光学密度
[0203] PAMPA 平行人工膜渗透性测定
[0204] PBS 磷酸盐缓冲盐水
[0205] PC 磷脂酰胆碱
[0206] PE 磷脂酰乙醇胺
[0207] pETMlO 质粒 pETMlO
[0208] PI 磷脂酰肌醇
[0209]POP 脯氨酰寡肽酶
[0210]hPOP 人脯氨酰寡肽酶
[0211] PREP 脯氨酰内肽酶（请注意，POP和PREP是同义词）
[0212] PS 磷酯酰丝氨酸
[0213] PyBOP 六氟磷酸（苯并三唑-1-基氧基）三吡咯烷基磷
[0214] RP-HPLC反相高效液相色谱法
[0215] SD 标准偏差
[0216] SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0217] TBTU 0_(苯并三唑-1-基）_N，N，f-四甲基脲四氟硼酸酯
[0218] TFA 三氟乙酸
[0219] THF 四氢呋喃
[0220] TIS 三异丙基硅烷
[0221] Tris 三（羟甲基）氨基甲烷
[0222] T 0 4 胸腺素0 _4蛋白
[0223] Z-G-P-AMC (N-苄氧羰基-Gly_Pr〇-甲基香豆素基_7_酰胺）
[0224] 以下实施例仅举例说明了本发明的某些实施方案，并且不能认为是以任何方式限 制本发明。 实施例
[0225] 用于实施例所述制剂的具体合成条件
[0226]工序A:将式(II)的酯水解为式（VII)的羧酸
[0227] 将式（II)的酯（lmmol)溶解于95% EtOH中。添加Na0H(3. 7mmol)并在回流下维 持反应约2小时。然后放置其至达到室温。将反应混合物浓缩至约15mL至20mL，然后在冰 浴中冷却的同时将该溶液缓慢添加到1M HC1溶液中。用水洗涤通过过滤回收的白色固体沉 淀并在下一个合成步骤之前对其进行充分干燥。在未出现沉淀物的情况下，用Ac0Et(3X) 萃取所得溶液，干燥并蒸发有机相。如果需要，通过快速色谱法纯化粗制产物。
[0228]工序B:对式(III)的Boc保护的胺进行脱保护以获得式（VI)的胺
[0229] 在0°C下将式（III)的Boc保护的胺（lmmol)缓慢添加到含4M HC1的二喝烷 (20ml)中。将反应在室温下搅拌2小时。然后将溶剂蒸干以产出式（VI)的胺的盐酸盐。
[0230]工序C:通过式(VIII)的甲酰氯（carboxylic acid chloride)的形成来偶联式 (VI)的胺与式（VII)的羧酸
[0231] 将草酰氯（1. 5mmol)添加至含式（VII)之羧酸（lmmol)的甲苯（5ml)溶液中。在 50°C下搅拌反应物1.5小时以使得能够形成式（VIII)的甲酰氯。在蒸发溶剂后，将所得粗 制物溶解于THF中并且在0°C下添加至式（VI)的胺（1. lmmol)的NaOH水溶液中。在0°C 下搅拌反应混合物1. 5小时并且在室温下搅拌3小时。然后，蒸发THF并通过添加1M HC1 溶液将残留含水部分调节至酸性pH(3至4)并用AcOEt对其进行萃取。有机相用盐水洗涤、 干燥、过滤并蒸发。根据需要，通过快速色谱法纯化式（IX)的粗制产物。
[0232] 工序D:在溶液中使式(IX)的产物与式（IV)的（S)-吡咯烷-2-甲腈偶联
[0233] 将式（IX)的产物（1. 2mmol)溶解于DCM并添加至N-环已基碳二亚胺、N'-甲 基聚苯乙烯（3mmol)和DIEA(lmmol)中。5分钟后，添加式（IV)的（S)-吡咯烷-2-甲腈 (lmmol)和DIEA(lmmol)。在室温下搅拌反应物过夜。然后，将反应混合物过滤并用DCM洗 涤残留固体。将滤液蒸干。然后通过制备型RP-HPLC对粗制产物进行纯化。
[0234]工序E:用于在固相上进行合成的一般步骤
[0235] 树脂的溶胀/老化（conditioning):将式（X)的Sieber酰胺树脂（1当量）放置 于装配有聚乙烯多孔圆盘的注射器中。通过用DCM和DMF洗涤使树脂溶胀。通过用DMF的 20%哌啶溶液处理来实现移除芴基甲氧基羰基（Fmoc)保护基。
[0236]
[0237] 然后，使用含TBTU(4当量）和DIEA(8当量）的DMF将式（V)的Fmoc保护的L-脯 氨酸（4当量）连接到树脂上。将混合物手动间歇地搅拌90分钟。在过滤和洗涤后，使用 开氏测试（Kaiser test)来监测偶联的程度，根据需要进行再偶联。通过用含20%哌啶的 DMF溶液处理，然后用哌啶/DBU/甲苯/DMF(20 : 5 : 5 : 70)溶液处理来移除Fmoc以获 得式（XI)的产物。采用对硝基苯醋NF31测试来评价Fmoc移除（Madder，A等，Eur. J. Org. Chem. 1999 ; (11) :2787-91 中所描述的）。
[0238]
[0239] 使用含PyB0P(2当量）、H0At(6当量）和DIEA(6当量）的DMF使式（IX)的产物 (2当量）与式（XI)的产物相偶联以获得式（XII)的产物。在90分钟的总反应时间内手动 地间歇性搅拌混合物。使用相同的量和时间来进行系统的再偶联。使用对硝基苯酯NF31 测试来监测偶联的程度。
[0240] 或者，使用含PyB0P(4当量）、H0At(12当量）和DIEA(12当量）的DMF将式（XIII) 的产物（4当量）与式（XI)的产物相偶联。在90min的总反应时间内手动地间歇性搅拌混 合物。使用对硝基苯酯NF31测试来监测偶联的程度，并且根据需要进行再偶联。通过采用 含20%哌啶的01^溶液处理并采用哌啶/1?"甲苯/1)1^(20:5:5:70)溶液处理来移 除Fmoc基团。随后，使用含PyB0P(4当量）、H0At(12当量）和DIEA(12当量）的DMF，并 入式（VII)的产物（4当量）以获得式（XII)的产物。在90分钟的总反应时间内手动地间 歇性搅拌混合物。使用对硝基苯酯NF31测试来监测偶联的程度，根据需要进行再偶联。
[0241]
[0242] 将用DCM充分洗涤并干燥的式（XII)的产物转移至圆底烧瓶中，并且添加含三氟 乙酸酐（5当量）和吡啶（10当量）的DCM(约2mL/100mg)。将混合物在室温下放置过夜。 然后，过滤反应混合物并且用DCM洗涤树脂。收集滤液并将溶剂蒸干。将所得粗制物溶解 于AcOEt中并用饱和NaHC0 3溶液和5%的KHS0 4水溶液洗涤。使有机相干燥、过滤并蒸发。 将粗制物溶于H20 : CH3CN(1 : 1)中并且冻干以获得式（I)的肽腈。
[0243]或者，可在 1 至 2 小时内用 TFA/H20/TIS(95 : 2. 5 : 2. 5,约 2mL/100mg 至 5mL/100mg)的混合物处理式（XII)的肽基-树脂。然后，对树脂进行过滤并用TFA洗涤，收 集滤液并将溶剂蒸干。将粗制物重悬于H20 : CH3CN(1 : 1)的混合物中并冻干。将所得粗 制肽酰胺溶于DCM并添加三氟乙酸酐（5当量）和吡啶（10当量）。将混合物在室温下放置 过夜，蒸发溶剂并使残留物溶于AcOEt中。随后用5% KHS04水溶和10% NaHCO 3水溶液洗 涤有机溶液。干燥并蒸发有机相以获得式（I)的肽腈。
[0244] 通过RP-HPLC来纯化粗制产物。
[0245] 中间化合物的合成：
[0246] 中间体1 :4_苄基氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酸
[0247]
[0248]将 3, 5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲醋（2. 0g，9. 4mmol)、碳酸钾（3. 2g，22. 6mmol) 和碘化钾（500mg，3. Ommol)引入圆底烧瓶中。添加丙酮（200mL)。在室温下将反应物搅拌 30分钟。然后，将苄基氯（4.3mL，37. 7_〇1)添加至反应混合物中并在回流下维持搅拌8小 时。接着，放置反应物至冷却到室温。添加水并采用二乙醚进行三次萃取，用盐水洗涤有机 萃取物，干燥并蒸发。通过快速色谱法来纯化粗制产物，得到1.7g(5. 7_〇1)。然后，根据上 述步骤A对甲酯进行水解以产出4-苄基氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酸（2.4g，7. 9mmol)。
[0249] 中间体2 : (2S，4R)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸
[0250]
[0251] 起始于市售（2S，4R)-1-(叔丁氧基羰基）-4_甲氧基吡咯烷-2-羧酸（221mg， 1. 5mmol)，根据上述步骤B以定量收率获得作为盐酸盐的产物 并且使用时无需进一步纯 化。
[0252] 中间体3:(S) -4,4-二氟吡咯烷-2-羧酸
[0253]
[0254] 起始于市售⑶-1-(叔丁氧基羰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羧酸（150mg， 1. Ommol)，根据上述步骤B以定量收率获得作为盐酸盐的产物并且使用时无需进一步纯 化。
[0255] 中间体4:(2S，4S) -4-(甲基硫基）吡咯烷-2-羧酸
[0256]
[0257] 起始于市售（2S，4S)-1_(叔丁氧基羰基）-4_甲基硫基-吡咯烷-2-羧酸（310mg， 1. 93mmol)，根据上述步骤B以定量收率获得作为盐酸盐的产物并且使用时无需进一步纯 化。
[0258] 中间体5 : (2S，4S)-4-甲基吡咯烷-2-羧酸
[0259]
[0260] 起始于市售（2S，4S) -1-(叔丁氧基羰基）-4-甲基吡咯烷-2-羧酸（500mg， 2. 18mmol)，根据上述步骤B以定量收率获得作为盐酸盐的产物并且使用时无需进一步纯 化。
[0261] 中间体6 : (2S，4R)-4-乙酰氧基吡咯烷-2-羧酸
[0262]
[0263] 将市售的反式-L-羟脯氨酸（500mg，3. 81mmol)溶解于6N盐酸（lmL)中。添加冰 乙酸（lmL)，并且在冰浴中将溶液冷却至0°C。然后缓慢添加乙酰氯（10mL)。几分钟之后， 通过沉淀获得产物，这得益于醚的添加。盐酸盐形式的化合物（626mg，2. 98mmol)通过过滤 来分离，用醚洗涤、干燥并直接用于下一步骤。
[0264] 中间体7 :(2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_甲氧基-吡 咯烷-2-羧酸
[0265]
[0266] 根据上述步骤C由中间体1(4-苄基氧基_3,5_二甲氧基苯甲酸）（425mg， 1. 5mmol)和中间体2((2S，4R)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸）（1. 5mmol)制备。通过快速色谱 法纯化获得期望的产物（428mg，1. Ommol)。
[0267] 中间体8 : (2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_氟吡咯 烷-2-羧酸
[0268]
[0269] 根据上述步骤C由中间体1(4-苄基氧基_3,5_二甲氧基苯甲酸）（714mg， 2. 5mmol)和市售（2S，4R)-4-氟吡咯烷-2-羧酸（363mg，2. 7mmol)制备。通过快速色谱法 纯化获得期望的产物（670mg，1. 7mmol)。
[0270] 中间体9 :(2S，4S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_苯基吡咯 烷-2-羧酸
[0271]
[0272] 根据上述步骤C由中间体1 (4-苄基氧基-3，5-二甲氧基苯甲酸）（700mg， 2. 4mmol)和市售（2S，4S)-4-苯基吡咯烷-2-羧酸（608mg，2. 7mmol)制备。通过快速色谱 法纯化获得期望的产物（700mg，1. 5mmol)。
[0273] 中间体10 :(S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烷-2-羧酸
[0274]
[0275] 根据上述步骤C由中间体1 (4-苄基氧基-3，5-二甲氧基苯甲酸）（260mg， 0. 9mmol)和中间体3(⑶-4,4-二氟吡咯烷-2-羧酸）（l.Ommol)制备。通过快速色谱法纯 化获得期望的产物（366mg，0. 9mmol)。
[0276] 中间体11:(25,45)-1-(4-(苄基氧基）-3,5-二甲氧基苯甲酰基）-4-(甲基硫 基）_吡咯烷-2-羧酸
[0277]
[0278] 根据上述步骤C由中间体1(4-苄基氧基_3,5_二甲氧基苯甲酸）（505mg， 1.75mmol)和中间体4((2S，4S)-4-(甲基硫基）吡咯烷-2-羧酸）（1.93mmol)制备。通过 快速色谱法纯化获得期望的产物（537mg，1. 24mmol)。
[0279] 中间体12 :(2S，4S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_甲基吡咯 烷-2-羧酸
[0280]
[0281] 根据上述步骤C由中间体1(4-苄基氧基_3,5_二甲氧基苯甲酸）（384mg， 1.33mmol)和中间体5((2S，4S)-4-甲基吡咯烷-2-羧酸）（1.47mmol)制备。通过快速色谱 法纯化获得期望的产物（342mg，0. 85mmol)。
[0282] 中间体13 : (2S，4R) -1- (4-(苄基氧基）-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4-乙酰氧基吡 咯烷-2-羧酸
[0283]
[0284] 根据上述步骤C由中间体1 (4-苄基氧基-3，5-二甲氧基苯甲酸）（400mg， 1.39mmol)和中间体6((2S，4R)-4-乙酰氧基吡咯烷-2-羧酸）（1.53mmol)制备。通过快速 色谱法纯化获得期望的产物（342mg，0. 85mmol)。
[0285] 中间体14 :4_乙酰氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酸
[0286]
[0287] 在0 °C下将4-羟基-3, 5-二甲氧基苯甲酸（300mg，1. 51mmol)溶解于吡啶 (732 yL，9.08mmol)中。在搅拌混合物的同时逐滴添加乙酸酐（214yL，2.27mmol)。保持 冰浴2小时，然后将混合物注入冰水中。混合物用DCM萃取（3 X)，有机相用IN HC1溶液洗 涤（3X)、用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发以产出4-乙酰氧基_3,5_二甲氧基 苯甲酸（266mg，1. lOmmol)。
[0288] 中间体15 :4_苯甲酰氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酸
[0289]
[0290] 将4-羟基_3,5_二甲氧基苯甲酸（300mg，1. 51mmol)溶解于水（6mL)中，然后添 加异丙醇（2.5mL)，接着添加碳酸钾（523mg，3.78mm〇l)。将混合物保持于氩气下并冷却至 〇°C。然后，向剧烈搅拌的反应混合物中逐滴添加苯甲酰氯（185yL，1.59mm 〇l)。添加期间 形成粘稠的白色沉淀。将混合物再搅拌20min后用6M HC1淬灭，同时使反应混合物保持冷 却。固体通过过滤收集，经冷水洗涤并干燥以产出作为白色固体的4-苯甲酰氧基_3,5_二 甲氧基苯甲酸（401mg，1. 33mmol)。
[0291] 中间体16 :3,4-二苄基氧基-5-甲氧基苯甲酸
[0292]
[0293] 将3,4-二羟基-5-甲氧基苯甲酸甲醋（300mg，1. 51mmol)、碳酸钾（1. Og， 7. 3mmol)和碘化钾（161mg，0. 97mmol)引入圆底烧瓶中。添加丙酮（60mL)。在室温下将反 应物搅拌30分钟。然后，将苄基氯（1. 39mL，12. lmmol)添加至反应混合物中并在回流下 维持搅拌8小时。接着，将反应物放置至冷却到室温。添加水并用二乙醚进行三次萃取， 有机相用盐水洗绦，干燥并蒸发。通过快速色谱法来纯化粗制产物，得到377mg(l. Ommol)。 然后，根据上述步骤A对甲酯进行水解以产出3,4_二苄基氧基-5-甲氧基苯甲酸（144mg， 0. 4mmo1)。
[0294] 中间体17 :3,4-二苯甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酸
[0295]
[0296] 将3,4_二羟基-5-甲氧基苯甲酸（300mg，1. 63mmol)溶解于水（6mL)中并然后 添加异丙醇（2. 5mL)，再添加碳酸钾（1. 13g，8. 15mmol)。将混合物保持在氩气下并冷却至 〇°C。然后，向剧烈搅拌的反应混合物中逐滴添加苯甲酰氯（388 y L，3. 34_〇1)。将混合物 再搅拌20min后用6MHC1淬灭，同时使反应混合物保持冷。接着，用AcOEt对其进行稀释并 且进行相分离。有机相依次用1M HC1溶液和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。通过快 速色谱法纯化粗制物来产出作为白色固体的3,4_二苯甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酸（548mg， 1. 40mmo1)〇
[0297] 中间体18 :3-乙酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酸
[0298]
[0299] 在0 °C下将3-羟基-4, 5-二甲氧基苯甲酸（300mg，1. 51mmol)溶解于R比啶 (732 yL，9.08mmol)中。在搅拌混合物的同时逐滴添加乙酸酐（214yL，2.27mmol)。保持 冰浴2小时，然后将混合物注入冰水中。混合物用DCM萃取（3X)，有机相用IN HC1溶液 (3X)、水（2X)和盐水（2X)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发以产出3-乙酰氧基_4,5_二 甲氧基苯甲酸（277mg，1. 15mmol)。
[0300] 中间体19 :3_特戊酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酸
[0301]
[0302]将3-羟基-4,5-二甲氧基苯甲酸（30011^，1.51臟〇1)和吡啶（2441^，3.02臟〇1) 的氯仿（2mL)溶液搅拌30分钟。根据TLC，在室温下向该反应混合物中逐滴添加氯仿（2mL) 的特戊酰氯（196 y L，1. 59mmol)溶液，并且搅拌反应直至反应完成（约3h)。然后，用DCM 稀释反应混合物，添加1M HC1溶液并进行相分离。有机相依次用1M HC1溶液1MHC1 (2X)、 水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。通过快速色谱法纯化获得4-特戊酰氧基-3， 5_ 二甲氧基苯甲酸（321mg，1. 14mmo 1)。
[0303] 中间体20 :4_苄基氧基-3-三氟甲基苯甲酸
[0304]
[0305] 将4-羟基-3-三氟甲基苯甲酸（1. 0g，4. 9mmol)和碳酸钾（1. 6g，11. 6mmol)引入 圆底烧瓶中。添加DMF(lOmL)并在室温下将反应物搅拌5分钟。然后，将苄基氯（2. 2mL， 19. 4mmol)添加至反应混合物中，在回流下维持4小时。接着，放置反应物至冷却到室温。 添加水并用乙酸乙酯（3X50mL)进行三次萃取，有机萃取物经盐水洗涤，干燥并蒸发。通过 快速色谱法来纯化粗制产物，获得1. 3g (3. 4mmol)。然后，根据上述的步骤A对苄基酯进行 水解以产出4-苄基氧基-3-三氟甲基苯甲酸（320mg，1. lmmol)。
[0306] 中间体21 :4_苄基氧基-3-氟苯甲酸
[0307]
[0308] 将4-羟基-3-氟苯甲酸（1. 0g，6. 4mmol)、碳酸钾（2. 7g，19. 2mmol)和碘化钾 (532mg，3. 2mmol)引入圆底烧瓶中。添加丙酮（140mL)并在室温下将反应搅拌30分钟。然 后，将苄基溴（3. 8mL，32. Ommol)添加至反应混合物中，在回流下维持12小时。接着，放置 反应物至冷却到室温。添加水并用乙酸乙酯（3X50mL)进行三次萃取，有机萃取物经盐水 洗涤，干燥并蒸发。通过快速色谱法来纯化粗制产物，获得1. 2g(3. 5mmol)。然后，根据上述 的步骤A对苄基酯进行水解以产出4-苄基氧基-3-氟甲基苯甲酸（612mg，2. 5_〇1)。
[0309] 实施例1:
[0310] (S)-1-((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_甲氧基吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0311]
[0312] 根据上述步骤D使市售（S)_吡咯烷-2-甲腈（58mg，0. 4mmol)与中间体7((2S， 4R) -1- (4-(苄基氧基）-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸）（220mg， 0. 5mmol)偶联。通过RP-HPLC纯化来获得10mg(0. 02mmol)的最终产物。
[0313] 实施例2:
[0314] (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0315]
[0316] 起始于市售Sieber酰胺树脂（500mg，0. 30mmol，1当量）、市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (400mg，1. 2mmol)和中间体 8((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_ 二甲 氧基苯甲酰基）-4-氟吡咯烷-2-羧酸）（239mg，0. 60mmol)，根据上述步骤E制备产物。通 过RP-HPLC纯化获得80mg(0. 17mmol)的最终产物。
[0317] 实施例3 :
[0318] (S)-1-((2S，4S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_苯基吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0319]
[0320] 起始于市售Sieber酰胺树脂（500mg，0. 38mmol，1当量）、市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (516mg，1.53mmol)和中间体 9((25,45)-1-(4-(苄基氧基）-3,5-二甲 氧基苯甲酰基）-4-苯基吡咯烷-2-羧酸）（351mg，0. 76mmol)，根据上述步骤E制备产物。 通过RP-HPLC纯化获得16mg(0. 03mmol)的最终产物。
[0321] 实施例4:
[0322] (S) -1-((2S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0323]
[0324] 起始于市售Sieber酰胺树脂（250mg，0. 19mmol，1当量）、市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (258mg，0? 77mmol)和中间体 10 ((S) -1- (4-(苄基氧基）-3, 5-二甲氧 基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羧酸）（161mg，0. 38mmol)，根据上述步骤E制备产物。 通过RP-HPLC纯化获得18mg(0. 036mmol)的最终产物。
[0325] 实施例5:
[0326] (S)-1-((2S，4S)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_(甲基硫基）吡 咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲腈
[0327]
[0328]起始于市售Sieber酰胺树脂（500mg，0. 38mmol，1当量）、市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (516mg，1.53mmol)和中间体 ll((2S，4S)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_ 二 甲氧基苯甲酰基）-4-(甲基硫基）吡略烧-2-羧酸）（330mg，0. 76mmol)，根据上述步骤E制 备产物。通过RP-HPLC纯化获得22mg(0.043mmol)的最终产物。
[0329] 实施例6 :
[0330] (S) -1-((2S，4S) -1- (4-(苄基氧基）-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4-甲基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0331]
[0332] 起始于市售Sieber酰胺树脂（300mg，0. 18mmol，1当量）、市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (247mg，0. 73mmol)和中间体 12((2S，4S)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_ 二 甲氧基苯甲酰基）-4-甲基吡咯烷-2-羧酸）（146mg，0. 37mmol)，根据上述步骤E制备产物。 通过RP-HPLC纯化获得10mg(0. 02mmol)的最终产物。
[0333] 实施例7 :
[0334] (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4_氰基吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0335]
[0336] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (516mg，1. 53mmol)和Boc-反式-4-氰基-L-脯氨酸（368mg，1. 53mmol)依次偶联到市售 Sieber酰胺树脂（500mg，0. 38mmol，l当量）上。在二肽从树脂上裂解掉（cleavage)之后， 根据步骤C通过形成羧酸酰氯使中间体1 (4-苄基氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酸）（145mg， 0. 5mmol)与所得二肽腈偶联。通过RP-HPLC纯化粗制物获得llmg(0. 03mmol)的最终产物。
[0337] 实施例8 :
[0338] (S) -1-((2S，4S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-(三氟甲 基）_ R比略烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0339]
[0340] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 40mmol)、（2S，4S)-Fmoc-4-三氟甲基-吡咯烷-2-羧酸（162mg，0. 40mmol)和中 间体1 (4-苄基氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酸）（115mg，0. 40mmol)依次偶联到市售Sieber酰 胺树脂（165mg，0. 10mmol，l当量）上。通过RP-HPLC纯化获得13mg(0. 045mmol)的最终产 物。
[0341] 实施例9:
[0342] (S)-1-((2S，4R)-1-(4_(苄基氧基）_3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4_(叔丁氧基）吡 咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲腈
[0343]
[0344] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0? 40mmol)、Fmoc-4-叔丁氧基 _L_ 腫氛酸（164mg，0? 40mmol)和中间体 1 (4-苄基 氧基-3,5-二甲氧基苯甲酸）（11511^，0.40_31)依次偶联到市售516匕61'酰胺树脂（16511^， 0? lOmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得22m g(0. 076mmol)的最终产物。
[0345] 实施例10:
[0346] (S) -1-((2S，4R) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-乙酰氧基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0347]
[0348]起始于市售Sieber酰胺树脂（165mg，0. lOmmol，1当量），市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 40mmol)和中间体 13((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_ 二 甲氧基苯甲酰基）-4-乙酰氧基吡咯烷-2-羧酸）（90mg，0. 20mmol)，根据上述步骤E来制备 产物。通过RP-HPLC纯化获得6. 2mg(0. 012mmol)的最终产物。
[0349] 实施例11 :
[0350] (S) -1-((2S) -1- (4-乙酰氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈
[0351]
[0352] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 40mmol)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（149mg，0? 40mmol)和中间体 14(4-乙醜 氧基-3,5-二甲氧基苯甲酸）（96mg，0. 40mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（165mg， 0? lOmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得25mg(0. 054mmol)的最终产物。
[0353] 实施例12 :
[0354] (S)-1-((2S)-1_(4-苯甲酰氧基_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0355]
[0356] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0? 4mmo 1)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（149mg，0? 4mmo 1)和中间体 15 (4-苯甲醜 氧基-3,5-二甲氧基苯甲酸）（12111^，0.4111皿)1)依次偶联到市售516匕61'酰胺树脂（16511^， 0? lmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得26mg(0. 051mmol)的最终产物。
[0357] 实施例13 :
[0358] (S) -1- ((2S) -1- (3,4-二苄基氧基-5-甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈
[0359]
[0360] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0? 4mmo 1)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（149mg，0? 4mmo1)和中间体 16 (3,4-二节 基氧基-5-甲氧基苯甲酸）（146mg，0. 4mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（165mg， 0. lmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得24mg(0. 041mmol)的最终产物。
[0361] 实施例14:
[0362] (S) -1- ((2S) -1- (3,4-二苯甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0363]
[0364] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 4mmo 1)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（149mg，0? 4mmo1)和中间体 17 (3,4-二苯 甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酸）（157mg，0. 4mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（165mg， 0. lmmol，1当量）。通过RP-HPLC纯化获得31mg(0. 052mmol)的最终产物。
[0365] 实施例15 :
[0366] (S) -1-((2S) -1- (3-乙酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈
[0367]
[0368] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0? 4mmol)、Fmoc-4,4-二氟-L-腫氨酸（149mg，0? 4mmol)和中间体 18 (3-乙酰氧 基-4,5-二甲氧基苯甲酸）（96mg，0. 4mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（165mg， 0? lmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得22mg(0. 048mmol)的最终产物。
[0369] 实施例16:
[0370] (S) -1-((2S) -1- (3-特戊酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0371]
[0372] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 4mmol)、Fmoc-4,4_ 二氟-L-脯氨酸（149mg，0. 4mmol)和中间体 19(3-特戊酰 氧基-4,5-二甲氧基苯甲酸）（11311^，0.4_31)依次偶联到市售516匕61'酰胺树脂（16511^， 0? lmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得19mg(0. 040mmol)的最终产物。
[0373] 实施例17 :
[0374] (S)-1-((S)-1-(4_(苄基氧基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烷-2-甲腈
[0375]
[0376] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (15〇11^，0.45_〇1)、卩1]1〇(3-4,4-二氣-1^-腫氛酸（16611^，0.45_〇1)和4-苄基氧基苯甲酸 (101mg，0.45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg，0. 15mmol，l当量）上。通过 RP-HPLC纯化获得17mg(0. 038mmol)的最终产物。
[0377] 实施例18 :
[0378] (S)-1-((S)-1-(3_(苄基氧基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烷-2-甲腈
[0379]
[0380] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (15〇11^，0.45_〇1)、卩1]1〇(3-4,4-二氣-1^-腫氛酸（16611^，0.45_〇1)和3-苄基氧基苯甲酸 (101mg，0.45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg，0. 15mmol，l当量）上。通过 RP-HPLC纯化获得8mg(0. 018mmol)的最终产物。
[0381] 实施例19 :
[0382] (S)-1-((S)-1-(2_(苄基氧基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烷-2-甲腈
[0383]
[0384] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (15〇11^，0.45_〇1)、卩1]1〇(3-4,4-二氣-1^-腫氛酸（16611^，0.45_〇1)和2-苄基氧基苯甲酸 (101mg，0.45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg，0. 15mmol，l当量）上，通过 RP-HPLC纯化获得5mg(0.0 llmmol)的最终产物。
[0385] 实施例20 :
[0386] (S)-1-((S)-1-(4_(苄基氧基）-3_(三氟甲基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0387]
[0388] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (150mg, 0. 45mmol)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（l66mg，0? 45mmol)和中间体 2〇 (4-苄基 氧基-3-三氟甲基苯甲酸）（132mg，0. 45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg， 0? 15mmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得32mg(0. 061mmol)的最终产物。
[0389] 实施例21 :
[0390] (S) -1- ((S) -1- (4-(苄基氧基）-3-氟苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基）吡 咯烷-2-甲腈
[0391]
[0392] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (150mg, 0. 45mmol)、Fmoc_4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（l66mg，0? 45mmol)和中间体 21 (4-苄基氧 基-3-氟苯甲酸）（109mg，0. 45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg，0. 15mmol， 1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得14mg(0. 030mmol)的最终产物。
[0393] 药理学数据
[0394] 新化合物对（人）脯氨酰寡肽酶活性的抑制作用的测定
[0395] 脯氨酰寡肽酶（POP)的表达和纯化
[0396] 根据文献方法（Tarrag6 T等，ChemBioChem 2006 ;7 :827_33)通过在大肠杆菌 (E.coli)中表达并使用His尾融合的亲和纯化来获得P0P，概述如下：
[0397] hPOP表达：用pETMlO hPOP转化E. coli BL21感受态细胞。为了诱导表达，进行 将单菌落接种到含卡那霉素（50yg/mL)的LB培养基（50mL)并37°C下生长过夜的预培 养。次日，用过夜培养物（10mL)接种LB培养基的两个培养物（500mL)。使经接种培养物 在37°C和220rpm下生长直至0D 595为1.2(2. 5至3小时）。然后添加IPTG(最终浓度为 ImM)并且在25°C下进行诱导过夜。收集细胞（3500g，15分钟，4°C )并且使沉淀悬于悬浮 缓冲液（50mL) [Tris-HCl pH 8(50mM)、NaCl (300mM)、咪唑（ImM)]中并在 50%强度和 0? 5 脉冲下进行超声处理，采用四个循环（每一循环由15秒的超声处理和15秒的静止组成）， 将样品放置在冰上。超声处理后，对样品进行离心（40 000g，30分钟，4°C)并立即使用上 清液进行POP纯化。使用又KTAexplorer FPLC系统来进行纯化。在lmL/分钟的流速 下，将上清液施加至先前经5个柱体积的悬浮缓冲液平衡的HiTrapQuelating柱（5mL)中。 用悬浮缓冲液冲洗柱直至280nm处的吸光度回至基线水平。然后用5个体积的洗涤缓冲液 (50mM Tris-HCl，pH 8,300mM NaCl，30mM咪唑）来漂洗柱。用4个体积的洗脱缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 8,300mM NaCl，500mM咪唑）进行洗脱。在整个洗脱期间收集各级分（4mL)。在 所有级分中检测POP活性并且通过SDS-PAGE来分析呈阳性的级分并用Biosafe Comassie Stain G-250染色。收集阳性级分并且通过使用具有作为缓冲液的Tris-HCl(50mM，pH 8) 的HiPr印26/10脱盐柱对其进行脱盐。采用具有BSA作为标准的Bio-Rad蛋白质测定来 定量重组的hPOP。制备重组酶的等分试样并立即用液氮冷冻并储存于-80°C。
[0398] POP抑制测定
[0399]根据 Toide 等所述的方法（Toide K 等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995 ;274 : 1370-8)将Z-G-P-AMC(N-苄基氧基羰基-Gly-Pro-甲基香豆素基-7-酰胺）用作POP底 物来测定POP活性。反应在96孔微量滴定板中进行，这使得能够同时监测多个反应。对各 个反应而言，在37°C下将hPOP (根据hPOP批次的活性，范围为20nM至60nM)和相应新化 合物溶液（3 y 1)与活性缓冲液（134 y 1，100mM Na/K磷酸盐缓冲液，pH 8. 0)预孵育15分 钟。在DMSO(lOOmM)中制备新化合物的储液，并且使用DMS0由该储液制备稀释物。或者， 使用另一种活性缓冲液（141 y L，lOOmM Tris-乙酸盐，10mM BSA，ImM DIT，pH 7. 3)进行反 应，其与hPOP (lOnM)和相应新化合物溶液（3 y 1)(条件B)预孵育。
[0400]在预孵育后，添加 Z-G-P-AMC(40% 1，4_ 二p恶烷中 10yl，3mM) (40% 的 1，4_ 二p恶 烷中3yl，1.5mM，条件B)，并且在37°C下将反应孵育1小时。通过添加醋酸钠（150yl， lM，pH 4)终止反应并且使用焚光计量法（fluorimetrically)测定AMC的形成。激发和发 射波长分别为360/40nm和485/20nm。
[0401] 对每一化合物测定几个浓度点（范围为25pM至400 y M)。根据公式1计算对脯氨 酰寡肽酶的抑制活性。对各个新化合物而言，在存在hPOP (a)和不存在hPOP (b)时测定荧 光。在不存在抑制化合物时由hPOP样品获得最大荧光（0%抑制活性）。为了评价新化合 物的抑制效力，针对化合物的log浓度绘制活性，使用GraphPad Prism软件调节为S形曲 线，并且由所得曲线确定IC5Q值（定义为抑制50%的POP活性所需化合物浓度）。
[0402]
[0403]其中：
[0404] a对应于存在底物+测试的化合物+hP0P时的荧光强度
[0405] b对应于存在底物+测试的化合物时的荧光强度
[0406] c对应于存在底物+hP0P时的荧光强度
[0407] d对应于存在底物时的荧光强度。
[0408] 新化合物表现出针对人脯氨酰寡肽酶的高抑制效力。结果总结于表1中。
[0409] 表1:人脯氨酰寡肽酶的抑制
[0410]
[0411] ( * )条忏B卜所测疋的
[0412] 对相关脯氨酸特异性蛋白酶的抑制活性
[0413] 测试到新化合物对二肽基肽酶IV (DPPIV)活性的抑制作用。按照用于测定对脯氨 酰寡肽酶之抑制活性的上述方法，将G-P-AMC (H-Gly-Pro-甲基香豆素基-7-酰胺）用作底 物。在用活性缓冲液和相应化合物溶液对DPPIV进行预孵育后，添加G-P-AMC (40 % 1，4-二 v恶烷中10 y 1，750 yM)，并且在37°C下将反应孵育20分钟。通过添加醋酸钠（150 y 1，1M， pH 4)终止反应并且使用荧光测定法测定AMC的形成。对每一化合物测量几个浓度点（范 围为100 y M至400 y M)。根据公式1计算对DPPIV的抑制活性。没有一个新化合物示出针 对二肽基肽酶IV(400 yM的IC5(I值）的抑制活性，因此为特异性POP抑制剂。
[0414] 此外，测试新化合物针对成纤维细胞激活蛋白（FAP)的抑制活性。采用的方法与 用于测定对POP之抑制活性的上述方法类似。将Z-G-P-AMC用作底物，最终浓度为100 y M。 测定中使用的缓冲液为50mM Tris、lM NaCl、lmg/ml BSA pH:7. 5。在活性缓冲液中，使用 母液浓度为2 y g/mL的重组人FAP，这导致测定中的最终浓度为0. 1 y g/mL。在DMS0中制 备20mM的各新化合物的储液并且便于稀释。在37°C下将活性缓冲液和相应新化合物溶液 与FAP预孵育15分钟后，添加底物（活性缓冲液中50 y 1，100 y M)，并且在37°C下将反应 孵育1小时。通过添加醋酸钠（150 yl，lM，pH 4)终止反应并且使用荧光测定法测定AMC 的形成。对每一化合物测量几个浓度点（范围为100 至400 yM)。根据公式1计算对 FAP的抑制活性。没有一个新型化合物示出针对FAP的抑制活性（IC5(I值超过400 y M)，因 此为特异性POP抑制剂。
[0415] 化合物渗透特性的测定
[0416] 平行人工膜渗透性测定（PAMPA)
[0417] Kansy M等，J. Med. Chem. 1998 ;41 (7) : 1007-10中所述的平行人工膜渗透性测定 (PAMPA)用于测定化合物通过被动扩散跨越血脑屏障（BBB)的能力（Di L等，Eur. J.Med. Chem. 2003 ;38 (3) :223-32)。在200 y M的初始浓度下测定化合物的有效渗透性（Pe)。根据 制造商的说明书由商业浓缩的缓冲液来制备缓冲液。使用0. 5M NaOH溶液将pH调节至7. 4。 在DMS0中制备新化合物的储液并且用缓冲液稀释至200 yM的最终浓度（0. 5%的DMS0含 量）。将PAMPA夹层分离并且用200 y L的化合物溶液填充各个供体孔。将受体板放置到供体 板中，确保膜的底面与缓冲液相接触。将4yL的十二烷中的磷脂混合物（20mg/mL)添加至 各孔的过滤器中，并且将200 y L的缓冲液添加至各个受体孔中。覆盖平板并且在室温、饱 和湿度气氛和l〇〇rpm的轨道（orbital)搅拌下孵育4小时。4小时后，通过HPLC来分析受 体区室和供体区室的内容物：将来自供体板的每个孔的150yL和来自受体板的每个孔的 150yL转移至HPLC小瓶中，将各个样品注射入反相C 18柱（150mmX4.6mmX5ym，1〇〇 A )(100 y L/来自受体孔的注射物、10 y L/来自供体孔的注射物并且对h进行参照）。转运 还可通过MALDI-T0F光谱测定法加以证实。
[0418] 所用磷脂混合物为由Avanti polar lipids提供的猪脑极性脂质提取物，其具 有如下组成：12.6%卵磷脂（PC)、33. 1%磷脂酰乙醇胺（PE)、18.5%磷脂酰丝氨酸（PS)、 4. 1 %磷脂酰肌醇（PI)、0. 8 %磷脂酸和30. 9% 的其他化合物。
[0419] 4小时后，使用公式2计算有效渗透性（Pe)并且使用公式3计算转运百分比：
[0420]
[0421]
[0422]其中：
[0423] t 为时间（h)
[0424] CA(t)为时间t时受体孔中的化合物浓度
[0425] 并且CD (tj为在h时供体孔中的化合物浓度。
[0426] 基于表2所示的指示值Pe，新化合物示出跨越BBB的良好渗透性（表3)
[0427] 表2:指示值Pe
[0428]
[0429] 表3 :新化合物的有效渗透性（PJ和转运百分比
[0430]
[0431] 新化合物对认知损伤动物模型的学习与记忆的影响
[0432] 在认知损伤的药理学模型中评价新化合物作为认知增强剂的效力。在未治疗和 经MK-801治疗的啮齿动物（小鼠或大鼠）中评价新化合物的效果。MK-801为损害动物 在各种学习与记忆范例中的表现的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA)受体的非竞争性拮抗 剂（Castellano C 等，Curr. Drug Targets 2001;2:273-83. ;Riedel G 等，Behav. Brain Res. 2003 ;140 :l-47)。MK-801也对啮齿动物行为产生多种影响，包括感觉处理的缺陷、运 动过强、刻板症（stereotypy)和共济失调。由MK-801处理诱导的行为表现已广泛用作认 知缺陷的动物模型（Bardgett ME 等，Brain Res. Bull. 2003;60:131-42 ;Van der Staay FJ 等，Behav. Brain Res. 2011 ;220 :215_29 ;Mutlu 0 等，Pharmacol. Biochem. Behav. 2011 ; 99 :557-65)〇
[0433] 为了确定所测试化合物是否可充当认知增强剂，通过广泛使用的如下测试来测试 其恢复正常认知行为的能力：新物体识别测试（X*ere E等，Neurosci.Biobehav. Rev. 2007 ; 31 :673-704 ;Boess FG 等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007 ;321 :716-25);被动或抑制性 逃避任务（Sarter M 等，Psychopharmacology(Berl) 1992 ;107 :144_59) ;Morris 水迷宫 (D'Hooge R 等，fcain Res. Rev. 2001;36:60-90);以及 T 迷宫交替任务（Boess FG 等， Neuropharmacology 2004;47:1081-92 ;Spowart_Manning L 等，Behav. Brain Res. 2004; 151 :37-46)。
[0434] 作为用于评价新POP抑制剂的代表性实施例，描述了各个行为测试遵循的方案和 新物体识别测试以及被动逃避测试所获得的结果。
[0435] 新物体识别任务
[0436] 新物体识别（novel object recognition，N0R)任务基于嗤齿动物探宄新物体的 自然偏好（Ennaceur A等，Behav. Brain Res. 1988 ;31 :47_59)。其为用于研宄视觉学习和 记忆缺陷的相关非奖励测试。简言之，N0R任务过程由三个试验组成：适应、训练和保持。在 不存在物体的情况下，使各个动物适应于40cm直径的圆形台10分钟（适应期）。次日，将 动物在圆形台上放置10分钟进行训练实验，并且将两个相同物体放置在对称位置。该步骤 连续进行两天。在第三天，用不同的物体替代所述物体中的一个。将未用于训练实验的物体 用作保持实验中的新物体。然后允许动物自由探索10分钟，并且记录探索各个物体所花费 时间。期望动物花费更多时间探索新物体，这是完好识别记忆的标志。辨别力指数（index of discrimination)如下计算：探索新物体所花费的时间减去探索旧物体所花费的时间， 再除以探索两个物体所花费的总时间，并且乘以100。认为更高的辨别力指数反映更好的记 忆保持。
[0437] 将新鲜溶解于含5% Tween 80的PBS中的相应测试的POP抑制剂以5mg/Kg的剂量 (0. lmL体积/10g动物体重）皮下（s. c.)给予。十五分钟后，将溶于PBS缓冲液的MK-801 以0. 2mg/kg的剂量（0. lmL体积/10g动物体重）腹膜内（i. p.)注射。对照组i. p.施用 MK-801并s. c.施用相同体积的载剂（具有5% Tween 80的PBS)。另一个对照组i. p.接 受PBS并s.c.接受相同体积的载剂。根据示出药物具有预期效果的行为和神经化学研宄 来选择药物剂量。在训练期期间和测试期之前，每天向动物注射两种药物。
[0438] 在施用作为本发明代表性化合物的实施例4的化合物时，所得结果示出于图1。
[0439] 如实施例4的化合物所示，本发明化合物能够在N0R测试中逆转MK-801诱导的记 忆损伤。
[0440] 被动逃避任务
[0441] 为了评价被动逃避任务，使用具有相同尺寸之亮隔室与暗隔室的两隔室盒。两个 隔室被可提升的闸门隔开。所用设备根据用于该测试的标准方法。给出由24小时的短期间 隔隔开的一段电击期和一段评价期。在电击期，将啮齿动物放置到亮隔室中。在20秒的适 应期后，将通向另一个隔室的闸门打开，并且一旦啮齿动物进入暗隔室便再次下降。然后， 施加短暂而微弱的足电击。在电击终止后60秒，将嗤齿动物从设备移开并且放回其养笼 中。在评价期，测定动物进入暗隔室花费的时间（以秒计），作为先前期期间在暗隔室中所 接受电击的记忆保持的标志。在最初电击期后一周实施第二评价期。在电击期前35分钟 以如物体识别测试所述的相同剂量和体积s. c.注射相应评价的化合物，15分钟后i. p.注 射MK-801 (或者在对照的情况下注射PBS)。仅用MK-801治疗的动物表现出电击期的较小 记忆保持，而另外接受POP抑制剂的动物表现出进入暗隔室的较长等待时间，预示记忆保 持更好。
[0442] 在施用作为本发明代表性化合物的实施例4的化合物时，所得结果示出于图2。
[0443] 如实施例4的化合物所示，本发明化合物能够在被动逃避测试中逆转MK-801诱导 的记忆损伤。
[0444] 水迷宫（Morris逃脱测试）
[0445] 根据用于该测试的标准方法和尺度，在约22°C温度的装有经乳胶染色的自来水 的水箱中评价Morris水逃脱表现。逃脱平台由灰色聚乙烯圆柱体组成，浸没在水面以下 1. 5cm处。在训练和测试期前35分钟以如物体识别测试所述的相同剂量和体积s. c.施用 相应评价的POP抑制剂，然后15分钟后i. p.注射MK-801 (或者在对照的情况下为PBS)。 在训练期以及评价期期间每天对动物注射两种化合物。
[0446] 啮齿动物接受两组连续三天的训练期，两组之间有两天的间隔。每一训练期由两 组三个实验组成，其是紧密连续地进行。实验通过将啮齿动物放入池中，面向水箱的壁开 始。以随机化顺序使用四个起始位置（北、东、南和西）。逃脱台始终处于同一象限中。一 旦动物爬上逃脱台或者在60秒过去后（无论哪个事件首先发生），即终止实验。一旦啮齿 动物达到平台，即允许其停留30秒以使得其能够将逃脱台与水箱上的特定位置相关联。然 后将其从平台移走并开始下一次实验。如果动物未在60秒内找到平台，则实验者将其放在 平台上并使其在那停留30秒。在第一训练期期间，放置视觉线索以标记平台的位置。在下 一个训练期移除该线索。在训练期期间，记录到达平台的等待时间。
[0447] 在第二组训练期结束之后的那天进行评价：移除平台，在60秒内测量啮齿动物在 训练期期间于布置有平台的水池象限（目标象限）中所花费时间。在探测实验中，从与目 标象限相反的相同起始位置释放所有动物。经MK-801治疗的动物不能有效学习与记忆平 台所处的地方，如表现出更长的游泳距离和逃脱等待时间以及这些动物花费在目标象限上 的时间（相比于其他象限约为平均）。经MK-801和相应POP抑制剂处理的动物在测试中表 现出更好的表现一一学习平台的位置（如反映为在目标象限所花费时间的更高百分比）， 因此示出MK-801的作用得以有效逆转。使动物保持休息一周后再训练4天。在第五天，移 除平台并且进行第二评价。
[0448] T迷宫交替任务
[0449] 采用T迷宫交替任务来测试工作记忆。根据一般的尺度和方法在由木材构成并涂 黑的T迷宫中进行实验。侧通道通过可移动的门与主通道隔离。在适应前一周，对所有动 物部分限食并在实验的整个剩余部分保持这样的方式，从而使动物保持其自由进食时体重 的85%。摄像机位于T迷宫上方约lm以对测试期进行录像。在不同动物之间对T迷宫进 行清洁而在不同实验之间不进行清洁。整个实验由三部分组成：适应、训练和测试。在适应 期间，将所有动物放置在T迷宫上直至其进食两块食物或90秒已逃脱。将此每天重复三次， 进行5天。在逝签期间，所有动物每天接受六次实验。每次实验由两种跑动组成：强迫跑动 和自由跑动。在强迫跑动中。强迫啮齿动物从T迷宫的一个目标支路（arm)(其他目标支 路被其门阻挡）获得一块食物。然后将动物放回起始支路，保持10秒的延迟时间。在自由 跑动开始时，允许动物选择任一目标支路。如果动物选择与其在强迫跑动期间被迫进入的 支路相反的支路，则其接收到食物奖励。如果动物选择其被迫进入的同一支路，则其接收不 到食物奖励。实验中间间隔为5分钟。对照动物在连续两天作出>70%的正确选择后，训 练期结束。动物需要7至12天来达到标准。从研宄中排除14天未达到标准的动物。然后 在10秒或40秒的延迟时间，测试啮齿动物的表现。在测试日期间，给予动物三次10秒延 迟实验和三次40秒延迟实验。对药物测试而言，在药物暴露15分钟之后，给予啮齿动物六 次10秒延迟实验。每天随机化延迟次序和强迫活动食物位置（左边或右边），只要没有将 相同的延迟或相同的被迫支路位置用于一组的三次实验。目标进入定义为四个脚爪放在支 路内。
[0450] 在测试期前35分钟，以如物体识别测试所述的相同剂量和体积s. c.注射相应评 价的POP抑制剂，接着15分钟后i.P.注射MK-801抑制剂（或者在对照的情况下为PBS)。
[0451] 对照动物在第1天至第4天的训练之间表现出具有接近偶然水平（chance level) 表现（约50%的正确支路进入）的学习曲线，并且训练的第11天至第14天之间逐步改进 直至达到70%的正确支路进入的平台期。其表现在10秒和40秒延迟实验中保持稳定。经 MK-801处理的动物不能有效学习交替任务并表现低于延迟实验的偶然水平。经MK-801和 相应POP抑制剂处理的动物在测试中表现出更好的性能，具有与对照动物类似的学习曲线 并且在延迟实验中保持记忆，因此示出MK-801的影响得以有效逆转。
【主权项】
1. 式（I)化合物或其可药用盐、异构体、前药或溶剂合物：其中 R1、R2、R3和R 4独立地选自C η烷氧基、C η烷基羰基氧基、苄基氧基、苯基羰基氧基、萘 基幾基氧基、卩奎琳基幾基氧基、异卩奎琳基幾基氧基、二氣甲基、卤素和氣； R5选自卤素、臆、C n烷氧基、C n烷基硫基、C n烷基、苯基、苯氧基、苯硫基和二氣甲基； R6选自氢、氟和甲基。2. 根据权利要求1所述的化合物，其中R2和R4独立地选自氢、卤素、三氟甲基和C η烷 氧基。3. 根据权利要求2所述的化合物，其中R2选自氢和甲氧基，并且R4选自氟、三氟甲基 和甲氧基。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中R 3是苄基氧基。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中R 5是氟。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中R6是氢或氟。7. 根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自： ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4-甲氧基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S，4R) -1- (4-(苄基氧基）-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4-氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S，4S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-苯基吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S，4S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-(甲基硫基）吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S，4S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-甲基吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S，4R) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-氰基吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ?⑶-I- ((2S，4S) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-(三氟甲基）-吡 咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S，4R) -I- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-(叔丁氧基）吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈 ? (S)-1-((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_二甲氧基苯甲酰基）-4-乙酰氧基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S) -1- (4-乙酰氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ?(幻-1-((2幻-1-(4-苯甲酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S) -1- (3,4-二苄基氧基-5-甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S) -1- (3,4-二苯甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S) -1- (3-乙酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S) -I- ((2S) -1- (3-特戊酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S)-I-((S)-1-(4-(苄基氧基）苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲 腈 ? (S)-1-((S)-1-(3-(苄基氧基）苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲 腈 ? (S)-1-((S)-1-(2-(苄基氧基）苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯烷-2-甲 腈 ? (S) -I- ((S) -1- (4-(苄基氧基）-3-(三氟甲基）苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈 ? (S)-1-( (S)-1-(4-(苄基氧基）-3-氟苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烷-2-甲腈 或其可药用盐、异构体、前药或溶剂合物。8.用于制备根据权利要求1至7中任一项所限定的式（I)化合物或其可药用盐、异构 体、前药或溶剂合物的方法，其包括： a)使式（IX)化合物与式（XI)化合物反应：在式（IX)化合物中R1、R2、R3、R4、R 5和R6如上式⑴中所限定，以产生式（XII)化合 物；b) 使所述式（XII)化合物水解以产生式（XIV)化合物 以及c) 使所述式（XIV)化合物处于能够将甲酰胺基团转化为腈基团的条件，以产生所述式 ⑴化合物； 其中步骤b)和c)可分开或以一釜式反应进行。9. 用于制备根据权利要求1至7中任一项所限定的式（I)化合物或其可药用盐、异构 体、前药或溶剂合物的方法，其包括使式（IX)化合物与式（IV)化合物反应：其中H R3、R4、R5和R 6如上式（I)中限定；10. 药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1至7中任一项所述的式（I)化合物或 其可药用盐、异构体、前药或溶剂合物，以及可药用载体、辅药或载剂。11. 如权利要求1至7中任一项所限定的式（I)化合物，其用作药物。12. 如权利要求1至7中任一项所限定的式（I)化合物，其用于治疗和/或预防认知障 碍。13. 如权利要求12中所限定使用的化合物，其中所述认知障碍是与选自以下的疾病相 关的认知障碍：精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病和帕金森病。14. 用于在哺乳动物中治疗或预防认知障碍的方法，其中向有所述治疗之需要的患者 施用治疗量的根据权利要求1至7中任一项所限定的化合物。15. 如权利要求14所限定的方法，其中所述认知障碍是与选自以下的疾病相关的认知 障碍：精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病和帕金森病。16. 如权利要求1至7中任一项所限定的式（I)化合物用于制备药物的用途。17. 如权利要求1至7中任一项所限定的式（I)化合物在制备用于治疗和/或预防认 知障碍的药物中的用途。18. 如权利要求17所限定的用途，其中所述认知障碍是与选自以下的疾病相关的认知 障碍：精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病和帕金森病。
【专利摘要】本发明涉及具有药理活性的式(I)的1-[1-(苯甲酰基)-吡咯烷-2-羰基]-吡咯烷-2-甲腈衍生物，制备这类化合物的方法，包含其的药物组合物及其在治疗和/或预防认知障碍中的用途。
【IPC分类】C07D403/06, A61K31/401, A61P25/00
【公开号】CN104903314
【申请号】CN201380059126
【发明人】埃内斯特·希拉尔特列多, 特里萨·塔拉戈克卢瓦, 罗格·普拉德斯科萨诺, 索莱达·罗约格拉西亚
【申请人】巴塞罗纳大学, 生物医药研究基金会机构(Irb巴塞罗那), 伊普罗透斯有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月11日
【公告号】CA2890042A1, EP2730571A1, EP2917209A1, WO2014072498A1
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