Pedf衍生的多肽在治疗脱发和/或毛发脱色中的用图
Pedf衍生的多肽在治疗脱发和/或毛发脱色中的用图
【专利说明】PEDF衍生的多肽在治疗脱发和/或毛发脱色中的用途
[0001] 发明背景 1、技术领域
[0002] 本公开涉及脱发和/或毛发脱色的治疗。具体而言，所公开的发明涉及使用衍生 自PEDF的多肽来治疗脱发和/或毛发脱色。
[0003] 2、相关技术的描述
[0004]脱发指毛发自头部或身体脱落。脱发可分为瘢痕性脱发以及非瘢痕性脱发。患瘢 痕性脱发的患者中，毛囊被破坏并被疤痕组织取代，而患非瘢痕性脱发的患者则没有这种 不可逆的损伤。虽然脱发不会影响患者的生命，但却影响个人外表，且因而影响个人的社交 互动、自尊与心理健康。
[0005] 非瘢痕性脱发包含生长期脱发、休止期脱发、雄激素性脱发和斑秃，各自由不同生 物学缺陷引起。取决于患者所患的脱发类型，其对毛囊所造成的影响也不相同。
[0006] 生长期脱发通常指当毛囊仍处于生长期时，毛发基质细胞的有丝分裂突然终止， 因而使得毛囊无法制造毛发或只能制造出易于断裂脱落的狭窄的缺陷毛鞘。生长期脱发常 见于接受化疗或放疗的患者身上。一般来说，一旦引起生长期脱发的因素停止存在后，毛囊 会恢复原本的生长周期，而大多数情况下治疗结束后毛发开始重新生长。但新生头发的颜 色与质地可能会与原来的毛发不同。
[0007] 休止期脱发是指处于循环的毛囊提早进入毛囊周期中的休止期，因而导致毛发过 分脱落的情形。有多种与压力相关的因素可能导致休止期脱发，包括饮食不均衡、药物（如 0肾上腺阻断剂、钙离子通道阻断剂、抗抑郁剂、非留体抗炎药等）、生产、高烧、重大手术、 甲状腺机能失调，严重的感染、严重的慢性疾病与严重的心理压力等。通常，在经历任意这 些因素后3至4个月，对象开始出现落发；而大约在6至12个月内，毛发会渐渐地恢复生 长。
[0008] 雄激素性脱发（又称为雄性秃）是最常见的雄性脱发，会发生于男性与女性身上， 不过女性患者的落发情形通常较男性患者来得轻微。造成雄性秃的真正机制仍未完全明 朗。普遍认为，毛囊对于雄性激素衍生物一二氢睪酮过于敏感与男性雄激素性脱发的发生 相关。这种过于敏感会使得毛囊萎缩、毛囊细胞生长期缩短，进而导致形成最终从毛囊脱落 的杵状毛。
[0009] 目前有两种药物经过美国食品暨卫生管理局FDA)核准用以治疗雄性秃，分别 是局部用药的米诺地尔（minoxidil;商品名为R〇GAINEK )以及口服用药的非那司提 (finasteride;商品名为PROPEC:丨AK )。米诺地尔是一种钾离子通道激动剂，可藉由延长 毛囊的生长期、促使毛囊由休止期转而生长以及促使毛囊增大来影响毛囊。米诺地尔亦可 用于治疗斑秃以及化疗所导致的生长期脱发。非那司提是将睪酮转变为二氢睪酮（DHT)的 II型5a-还原酶的竞争性抑制剂。这两种药物虽然都能刺激部分患者的毛发再生，它们仅 在药物处理期间有效，因此患者被建议持续使用该药物。此外，偶尔发现米诺地尔或非那司 提会产生一些副作用。米诺地尔的可能副作用包括头皮瘙痒或发瘆；性欲降低；心跳速率 提高；呼吸困难；体重增加；和与多毛症。非那司提的可能副作用包括皮瘆、乳房增大或压 痛、睪丸疼痛、性欲降低、精液减少与阳瘘。
[0010] 毛发颜色是毛发着色的结果。当来自黑素细胞的色素（即黑色素）供应量降低时， 新长成的毛发就失去其原有颜色，而呈现较淡的颜色甚至白色；此现象即称为毛发脱色。包 括老化、压力、疾病（如斑驳病）等因素都可能使得毛发脱色。此外，先前接受化疗或放疗 的患者重新长出的毛发也经常会出现脱色。目前并没有有效的医学方法诱导脱色毛发重新 获得其先前的颜色。因此大多数毛发脱色患者只能接受他们的外表，或是藉由染发或使用 假发来遮盖脱色的毛发。
[0011] 有鉴于此，本领域急需有效治疗各种类型的脱发和/或毛发脱色的手段。
【发明内容】
[0012] 下文提供本公开的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明 内容并非本公开的完整概述，且其未指出本发明的重要/关键组件或界定本发明的范围。 本部分内容的目的仅是以简化形式阐明一些概念，更详细的内容将在后文予以呈现。
[0013] 本发明至少是部分基于发现色素上皮衍生因子（PEDF)衍生的合成肽能够保护毛 囊，且因而能够有效预防和/或缓和对象毛发脱落和/或毛发脱色。具体来说，本说明书提 出的实施例显示，有多种PEDF衍生的合成肽能够抑制毛囊萎缩与毛囊细胞凋亡，和/或防 止毛囊中的黑素细胞干细胞（MSC)提早分化。因而，本发明的PEDF衍生合成肽能够用作预 防和/或缓和毛发脱落和/或毛发脱色的制剂或药物。
[0014] 因此，一方面，本公开涉及用于治疗对象脱发和/或毛发脱色的合成肽。
[0015] 根据本公开的多个实施例，所述的合成肽长度为20 - 44个氨基酸残基，且其序列 至少80%与SEQIDNO:10相同。此外，上述氨基酸序列包含至少20个连续氨基酸残基， 其序列至少90%与SEQIDNO:10的氨基酸残基16 - 35相同，而使得此合成肽可用于治疗 对象脱发和/或毛发脱色。
[0016] 在本公开可任选的实施例中，上述合成肽中有至少四个连续的氨基酸与SEQID NO:10的氨基酸残基16 - 19 (即，SLGA残基）相同。此种合成肽的非限制性例子包括具有 SEQIDN0:10(44-聚体）、SEQIDN0:l(39-聚体）、SEQIDN0:2(34-聚体）、SEQIDNO: 3 (29-聚体）、SEQIDNO:5 (24-聚体）、SEQIDNO:6 (20-聚体）、SEQIDNO:8(MO29-聚 体）与SEQIDNO:9(M0 20-聚体）所示的氨基酸序列的合成肽。根据本公开某些实施例， 上述合成肽的氨基酸序列为SEQIDN0:10(44-聚体）、SEQIDN0:3(29-聚体）、SEQID NO:5 (24-聚体）或SEQIDNO:6 (20-聚体）。
[0017] 依据本公开多种实施例，所述的脱发可以为生长期脱发（如，由化疗或放疗所导 致的脱发）、休止期脱发（如由压力、饮食不均衡、药物或感染所导致的脱发）或雄性秃。
[0018] 在一些实施例中，所述的毛发脱色是指由化疗或放疗所导致的毛发脱色。在另一 些实施例中，所述的毛发脱色是指由压力或老化所致的毛发脱色。
[0019] 根据本公开多个实施例，所述的对象可以是任何哺乳动物，包括人类。
[0020] 另一方面，本公开涉及用于治疗对象的脱发和/或毛发脱色的局部施用的药物组 合物。所述的对象可以是任何哺乳动物，包括人类。
[0021] 根据本公开的一实施例，上述局部施用的药物组合物包含上述任一方面/实施例 的合成肽，且该合成肽的含量足以治疗该对象的脱发和/或毛发脱色。该药物组合物亦包 含该合成肽的药学上可接受的赋形剂。
[0022] 依据本公开多种实施例，所述的局部施用的药物组合物可以是以下任一种剂型： 溶液、喷剂、气雾剂、泡沫、霜剂、洗剂、软膏、凝胶或敷料。
[0023] 根据本公开的可任选实施例，此药物组合物中所述合成肽的含量为约0. 1_
[0024] 又一方面，本发明涉及一种治疗对象脱发和/或毛发脱色的方法。所述的对象可 以是任何哺乳动物，包括人类。
[0025] 在一实施例中，所述方法包含给予该对象有效量的根据上述任一方面/实施例的 合成肽。根据本公开多种实施例，上述合成肽可局部给药或全身给药；较佳为局部给药。
[0026] 根据可任选实施例，可将上述合成肽配制为根据本公开上述方面/实施例所述的 局部施用的药物组合物。在一实施例中，可将此局部施用的药物组合物施用于该对象的头 皮上。
[0027] 在参阅下文详细描述，并结合附图后，本公开许多附带的特征和优点将更易于理 解。
[0028] 附图简述
[0029] 本专利或申请文件包含至少一幅彩图。在提出请求并缴纳所需费用后，专利局将 提供带有彩图的此专利或专利申请出版物的副本。
[0030] 结合附图及下文详述，本说明书将更易于理解。
[0031] 图1提供呈现CYP注射后第0、7与36天各实验条件下脱毛小鼠的外观的代表性 照片，还提供了对应于方框标记处的高倍率显微照片。
[0032] 图2显示呈现TUNNEL阳性的凋亡角质形成细胞（绿色）的代表性免疫染色照片， 细胞核经Hoechst33258对比染色（蓝色），原始倍率：X1000。
[0033] 图3显示经酪氨酸酶（绿色）和c-kit(红色）双重免疫荧光染色检测的毛囊样 品的代表性照片，细胞核经Hoechst33258对比染色（蓝色），原始倍率：X1000。
[0034] 图4显示呈现皮下H202注射后第0与22天各实验条件下小鼠的外观的代表性照 片。
[0035] 图5显示经苏木精和曙红（H&E)染色的小鼠触须样品的生长期中期毛囊的代表性 照片；0RS:外根鞘；IRS:内根鞘；DP:皮突；HM:毛基质；；上方照片原始倍率：X100,下方 照片原始倍率：X400。
[0036]图6显示经H&E染色的小鼠背部皮肤的代表性照片，原始倍率：X100。
[0037] 图7显示呈现脱毛后第0与18天各实验条件下毛发再生的代表性照片，以及经苏 木精和曙红（H&E)染色后背部皮肤样品的代表性照片；原始倍率：X100。
[0038] 详述
[0039] 下文结合附图详细描述的内容仅仅是对本实施例的描述，并非是实施或运用本发 明具体实施例的唯一形式。此部分公开了实施例的功能以及用于建构与操作这些具体实施 例的步骤的顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或等同的功能与顺序。
[0040]出于方便，本申请（包括说明书、实施例和权利要求书）所用的某些术语汇集于 此。除非本说明书另有定义，本公开所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域 中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。除非另有说明，应理解的是，所用的单数名词 涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。具体而言，如本文及权 利要求书所用，除非另有说明，单数形式"一"包括其复数形式。
[0041] 虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数界是约略的数值，具体实施例的 相关数值已尽可能精确地呈现。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所 致的标准偏差而导致的误差。同时，本文中，"约"通常指实际数值在一给定数值或范围的正 负10%、5%、1%或0.5%之内。或者是，"约"代表实际数值落在平均值的可接受标准误差 之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实施例之外，或除非另有 明确的说明，当可理解本文所用的所有数值范围、数量、数值与百分比（例如用以描述材料 用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例等）均经过"约"的修饰。因此，除非另有相反的 说明，本公开与权利要求书所涉及的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更改。至少应 将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
[0042] 本文中，术语"肽"指氨基酸残基的多聚物。本文中，术语"合成肽"指未包含存在 于自然界的完整蛋白质分子的肽。此种肽是"合成的"，因为其由人类利用技术手段所得，譬 如化学合成、重组遗传技术或将整个蛋白切段等。于本公开中，任何指定氨基酸残基于一肽 中的位置系由该肽的N端起算。
[0043] 本文所用术语"干细胞"指在某些条件下保有能够增殖而不实质分化，且亦能够在 某些条件下分化成更专一或分化的表型的能力的细胞。
[0044] 本文所用"增殖"指细胞群中细胞数目通过细胞分裂而增加。
[0045] 本文针对合成多肽序列所述的"氨基酸序列相同性百分比（％ )"系指该候选合 成肽的氨基酸残基与参考多肽的氨基酸残基完全相同的百分比。进行上述比对时，可将该 候选合成肽与该参考多肽并排，并于必要时引入间隙（gap)，以使两条序列形成最高的序列 相同性，且在计算相同性时，并未将保守性取代的氨基酸残基纳入考虑。可采用 本领域已 有的多种方法进行上述比对，以确定序列相同性百分比，譬如可使用可公开取得的软件如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)。本领域技术人员可确定比对时的适当参 数，包括需要在对比序列的整个长度上获得最大比对所需的各种算法。为了本文的目的，二 氨基酸序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心（NCBI)所提供的计算机程序 Blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)来进行。给定氨基酸序列A相较于给定氨基酸序列B的 氨基酸序列相同性百分比（亦称为给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B具有特定百分比 (% )的氨基酸序列相同性）的计算方式如下：
[0046]
[0047] 其中X是利用比对程序BLAST对A和B进行比对后所得到的计为完全匹配的氨基 酸残基的数量，而Y是A或B中较短者的氨基酸残基总数。
[0048] 本文所用术语"治疗"指预防性（如，预防用药）、治愈性或缓和性的处理，藉以达 到所需的药学和/或生理学效果。在较佳的情形中，上述的效果是治疗性的，即能够部分或 完全地治愈或预防脱发或毛发脱色。此外，本文所用术语"治疗"指称将本公开合成肽或药 物组合物施用或给予对象，此对象有医学疾患、症状、疾病或与疾患相关的异常或易于罹患 疾患，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻特定疾病、异常和/或病症的一或多种症状 或特征，或延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对并未出现疾 病、异常和/或病症之征兆的对象和/或呈现疾病、异常和/或病症之早期征兆的对象进行 治疗，以期降低发展出与该疾病、异常和/或病症相关之病理变化的风险。本文中，上述症 状、疾病、异常或病症指脱发或毛发脱色。如其在本文中所定义的，当一或更多种症状或临 床指标减少时，通常认为该治疗是"有效"的。
[0049] 本文所用术语"有效量"指一成分的用量足以产生所欲的反应。术语"治疗有效量" 指药物组合物中的治疗药剂的含量能产生上文定义的所需"有效治疗"。具体的治疗有效量 取决于多种因素，诸如欲治疗的特定病症、患者的身体条件（如患者体重、年龄或性别）、接 受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、共同施与的疗法（如果有的话）的本质以 及所用的具体配方。治疗有效量亦指于此用量下，该化合物或组合物的毒性或负面效果不 及于其所带来的正面疗效。
[0050] 术语"施用"或"给药"在本文中可互换使用，指将本发明合成肽或药物组合物提 供给对象，以治疗脱发和/或头发脱色的措施。根据本公开各实施方式，较佳的给药方式为 局部给药。例如，将本发明合成肽或药物组合物局部施用至对象的生物性表面（如，皮肤、 头皮或毛发），并使其到达目标部位（如，毛囊），以预防或缓和脱发和/或头发脱色。
[0051 ] 本文所用术语"赋形剂"指可作为本公开所述PEDF衍生合成肽的媒剂/载体的任 何惰性物质（如粉末或液体）。赋形剂通常是安全、无毒的，且广义上可包括制药产业中用 于制备药物组合物的任何已知物质，如填充剂、稀释剂、凝结剂、黏合剂、润滑剂、助流剂、稳 定剂、着色剂、润湿剂、崩解剂等。
[0052] 在本说明书中，"药学上可接受"的成分指其适用于人类和/或动物，且在合理的效 益/风险比之下不会产生不当的副作用（如毒性、刺激与过敏反应）。此外，每一种赋形剂 必须和药学配方中的其它成分兼容，才是"可接受"的。
[0053] 术语"对象"指可接受本发明的合成肽、组合物和/或方法来进行治疗的哺乳动物 (包括人类）。除非另有指明，术语"对象"包含雄性与雌性。
[0054] 动物的毛发生长有三个周期：退化期、休止期和生长期。生长期是毛发活跃生长 阶段，位于毛球内的细胞会快速分裂并分化成毛干。平均来看，人类头皮毛发在此活跃生长 阶段的时间约为3-5年，而小鼠毛发的生长期约为11天。在生长期之后是退化期。此阶 段中，毛发生长停止，约70%的毛囊细胞经历细胞凋亡与再吸收，因而产生了杵状毛。退化 期是过渡阶段，对于人头皮毛发而言，其持续约1 _ 2周。最后是休止期，人类头皮毛发休止 期持续约3个月。在此时期中，毛囊完全处于休息状态，杵状毛完全形成。相较于生长期毛 发，休止期毛发（即杵状毛）可轻易被拔起，且容易脱落。
[0055] 毛囊发突区域内含有毛囊干细胞（FSC)与黑素细胞干细胞（MSC)，分别负责毛发 再生及毛发着色。已知多种因素危及毛囊干细胞和/或黑素细胞干细胞的干细胞特性。例 如，人体老化、环境氧化剂、毛囊疾病、化疗或对象的遗传组成等因素都可能使这些干细胞 丧失它们的干细胞特性，丧失干细胞特性可影响其后代细胞的正常生长周期，因而导致脱 发或毛发脱色。
[0056] 色素上皮衍生因子（PEDF)是一种多功能的分泌性蛋白质，其具有抗血管新生、抗 肿瘤生成与神经滋养等功能。人PEDF蛋白质（SEQIDNO:ll)是一种大小约50kDa的分泌 性蛋白质，长418个氨基酸。已知PEDF的34-聚体片段（第44 - 77号残基）与44-聚体 片段（第78 - 121号残基；SEQIDNO: 10)分别具有抗血管新生与神经滋养性质。
[0057] 本公开至少部分是基于发现来自PEDF的44-聚体合成肽能够透过多种机制来保 护毛囊。譬如，所述的合成肽能够抑制毛囊萎缩，防止毛囊中的黑素细胞干细胞提早分化成 为成黑素细胞，以及减少黑色素聚集。在不受限于特定理论的前提下，据信这些保护性机制 有助于维持毛囊中干细胞的干细胞特性，且/或可使这些干细胞的后代细胞处于正常的生 长周期，因而使得毛囊能够制造健康、正常的较不易异常掉落和/或保有原本发色的毛发。 本发明的另一创新特征在于所述合成肽仅有20至44个氨基酸残基，比起先前技术所述的 全长PEDF短了许多；因此，本发明克服了传统蛋白质药物在临床使用上经常面临的困境， 诸如制造成本高昂、生物利用率低与药物动力学表现不佳等。因此，这些合成肽可用以治疗 脱发和/或毛发脱色。
[0058] 有鉴于此，一方面，本公开涉及用于治疗对象脱发和/或毛发脱色的合成肽。根 据本公开多个实施例，此合成肽有20 - 44个氨基酸残基，且其氨基酸序列与SEQIDNO: 10 (VLLSPLSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)有至少 80 % 的氨基酸序列相同 性。举例来说，此合成肽与SEQIDNO:10的氨基酸序列相同性可为约80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。另外，此合成肽包含的至少 20 个连续的氨基酸残基与SEQIDNO: 10第16 - 35个残基有至少90%的氨基酸序列相同性。 具体来说，这20个连续氨基酸残基与SEQIDNO: 10第16-35个残基的氨基酸序列相同性 可为约 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。
[0059] 在一实施例中，所述的合成肽为上述44-聚体。本发明人先前所做的实验（如，待 批美国专利申请案第13/428996号与台湾专利申请案第100138168号，在此将该在先申请 的内容以引用的方式一并纳入为本说明书的一部分）与本说明书所提供的实施例显示，还 有其它数种来自此44-聚体的短PEDF合成肽能够用于治疗脱发和/或毛发脱色。具体而 言，台湾专利申请案第100138168号揭示上述PEDF44-聚体能够有效预防和/或缓和由化 疗或压力所导致的脱发与毛发脱色，以及预防和/或缓和雄性秃。
[0060] 譬如，由下文与在先申请的实施例可知，具有SEQIDNO:1(LSVATALSALSLGAEQRTE SIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示序列的39-聚体合成肽能够有效地治疗对象的脱发和/或毛 发脱色。此39-聚体合成肽对应于人PEDF的第83 - 121号氨基酸残基；且为衍生自上述 44-聚体（对应于PEDF的第78-121号残基）的短肽片段。根据上文所述的氨基酸序列相 同性百分比的计算方法，此39-聚体与44-聚体的氨基酸序列相同性为100%，且39-聚体 的第11 - 30号氨基酸残基与44-聚体的第16 - 35号氨基酸残基的氨基酸序列相同性也是 100%〇
[0061] 另一实施例中，由下文与在先申请的实施例可知，具有SEQIDN0:2(ALSALSLGAE QRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示序列的34-聚体合成肽亦能有效地治疗脱发和/或毛发 脱色。此34-聚体合成肽相当于人PEDF的第88 - 121号氨基酸残基；其与44-聚体的氨基 酸序列相同性为100%，且该34-聚体的第6 - 25号氨基酸残基与44-聚体的第16 - 35号 氨基酸残基的氨基酸序列相同性也是100%。
[0062] 此外，下文多个实施例证明，具有SEQIDNO: 3 (SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示序列的29-聚体合成肽能够有效预防和/或缓和 对象的雄性秃。此外，由下文与在先申请的实施例可推知，该29-聚体亦可用以治疗化疗或 压力引起的脱发和/或毛发脱色。此29-聚体合成肽相当于人PEDF的第93 - 121号氨基 酸残基；其与44-聚体的氨基酸序列相同性为100%，且29-聚体的第1 - 20号氨基酸残基 与44-聚体的第16 - 35号氨基酸残基的氨基酸序列相同性亦为100%。
[0063] 某些实施例证实，24-聚体合成肽亦可有效预防和/或缓和对象的雄性秃。此外， 由下文与在先申请的实施例可推知，该24-聚体亦可用以治疗化疗或压力引起的脱发和/ 或毛发脱色。此24-聚体具有SEQIDNO:5(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSP)所示的序列，且 对应于人PEDF第93 - 116号氨基酸残基。此24-聚体序列与44-聚体具有100%的氨基酸 序列相同性，其前20个氨基酸残基与该44-具体的第16 - 35号氨基酸残基具有100%的氨 基酸序列相同性。
[0064] 其它实施例证实，20-聚体可预防和/或缓和对象的雄性秃。而且，由下文与在先 申请的实施例可推知，20-聚体亦可用于治疗化疗或压力引起的脱发和/或毛发脱色。该 20-聚体具有SEQIDNO:6(SLGAEQRTESIIHRALYYDL)所示的序列，对应于人PEDF第93 - 112 号氨基酸残基。此20-聚体肽与44-聚体的第16 - 35号氨基酸残基完全相同（氨基酸序 列相同性：100% )且其与44-聚体的氨基酸序列相同性同样也是100%。
[0065] 本案与在先申请所记载的实验亦显示，两种衍生自小鼠PEDF的合成肽同样也能 够有效地治疗雄性秃或由化疗或压力所致的脱发和/或发色脱色。第一种衍生自小鼠的 肽在本说明书中称为Mo29-聚体，具有SEQIDN0:8(SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST) 所示的序列，此序列与44-聚体的氨基酸序列相同性为83%，且其前20个氨基酸残基与 44-聚体第16 - 35个残基的氨基酸序列相同性为90%。另一种衍生自小鼠的肽称为Mo 20-聚体，具有如SEQIDNO:9 (SLGAEHRTESVIHRALYYDL)所示的序列。Mo20-聚体与 44-聚 体及其第16 - 35号氨基酸残基的氨基酸序列相同性皆为90%。
[0066] 任选地，所述合成肽含有四个连续的氨基酸，其序列与SEQIDNO:10的氨基酸 残基16-19相同。据信，SEQIDNO:10的第16 - 19号氨基酸残基（即SLGA)对于维持 短PEDF肽的生物学功能起重要作用。举例来说，下文提出的多个实施例显示，不具有此 SLGA片段的18-聚体肽（EQRTESIIHRALYYDLIS;SEQIDNO:7)无法对对象的毛囊提供保 护。此外，由本案与在先申请所载的实施例可以发现，不含SLGA序列的25-聚体合成肽 (EQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT;SEQIDN0:4)也无法有效治疗对象的脱发和/或毛发脱 色。
[0067] 可利用常用技术来合成本发明的合成肽，譬如使用t-BOC或FM0C来保护a-氨 基。这两种方法都采用了逐步合成法，由该肽的C端开始，每次加上 一个氨基酸。亦可利用 已知的固态肽合成法来合成本发明的合成肽。
[0068] 本发明的范围亦涵盖了其它相较于39-聚体具有保守性突变的合成肽。本文所用 术语"保守性突变"指利用另一种在生物学上相似的残基来取代某一残基。保守性突变的 例示包括疏水性残基（如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸与甲硫氨酸）彼此间的置换，或极性残 基（如精氨酸与赖氨酸；或谷氨酸与天冬氨酸，或谷氨酰胺与天冬酰胺）彼此间的置换等。 "保守性突变"在此亦指利用取代的氨基酸来取代未取代的原始氨基酸，只要针对该取代的 多肽产生的抗体也能与该未取代的多肽发生免疫反应即可。
[0069] 依据本发明多种实施例，所述的脱发可以是生长期脱发（如，由化疗或放疗所导 致的脱发）、休止期脱发（如，由压力、饮食不均衡、药物或感染所导致的脱发）或雄性秃。
[0070] 在某些实施例中，所述的毛发脱色是指由化疗或放疗所导致的毛发脱色。在另一 些实施例中，所述的毛发脱色是指由压力或老化所致的毛发脱色。
[0071] 根据本公开的一些实施例，所述对象可以是任何归类为哺乳动物的动物，包括人。
[0072] 亦可将上述实施方式所述的各种合成肽调制成局部给药的药物组合物，以治疗对 象脱发和/或毛发脱色；此药物组合物落入本发明其它方面的范围之内。
[0073] 根据本发明一实施方式，上述局部给药的药物组合物包含上述任一方面/实施例 的合成肽，且此合成肽的含量足以有效治疗对象的脱发和/或毛发脱色。此局部给药的药 物组合物还可包含用于该合成肽的药学上可接受的赋形剂。
[0074] 可根据既有的药学程序来制备上述药物组合物，譬如《雷明顿制药科学》 (Remington'sPharmaceuticalSciences)(第 17 版，AlfonosoR.Gennaro编，麦克出版 公司（MackPublishingCompany)，伊斯顿，宾夕法尼亚（1985)) -书中有详细的记载。
[0075] 在选择适用于投递合成肽的药学上可接受的赋形剂时，主要需考虑此局部给药的 药物组合物的给药方式。根据本发明的可任选实施例，可利用涂敷、涂抹、按摩或喷涂或其 它手段，使此局部给药的药学组合施用于对象的生物学表面（如，皮肤、头皮或头发），而使 得所述合成肽能够透过毛囊的主动吸收（即，经附体途径（transappendagealroute))或 通过跨细胞途径或细胞间途径的经皮形式而到达目标部位（如，毛囊）。
[0076] 可使用本领域周知的皮肤学上可接受的各种惰性赋形剂。典型的惰性赋形剂可以 是例如水、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、矿物油、硬脂醇、软膏基质和形成胶状物的材料。
[0077] 可任选地，本发明的药物组合物亦可包含本领域周知的药学上（特别是皮肤 学上）可接受的添加剂。所述添加剂包括但不限于干燥剂、抗痒剂、抗发泡剂、缓冲剂、 中和剂、pH调节剂、着色剂、脱色剂、润肤剂、乳化剂、乳液稳定剂、增黏剂（viscosity builders)、保湿剂、添味剂（odorants)、防腐剂、抗氧化剂、化学稳定剂、增稠剂、硬化剂、或 悬浮剂。
[0078] 依据本发明多种实施例，所述局部给药的药物组合物可调制成各种剂型，如溶液、 喷剂、气雾剂、泡沫、霜剂、洗剂、软膏、凝胶或敷料。
[0079] 根据本发明的可任选实施例，此药物组合物中所述合成肽的含量为约0. 1-100 1^;较佳为约1-25 1^。举例来说，合成肽的浓度可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.3、 0?7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95或100yM。具体而言，下文实施例中针对约20克重的小鼠所用的浓度为约25yM。 本发明所属技术领域具有通常知识者可基于本说明书提出的动物给药剂量计算出本发明 合成肽或药物组合物的人体等效剂量（HE?。譬如，美国食品暨卫生管理局已批准了工业 指南，题为"成年健康志愿者临床治疗实验中最大安全起始剂量的估算"（Estimatingthe MaximumSafeStartingDoseinInitialClinicalTrialsforTherapeuticsinAdult HealthyVolunteers)〇
[0080] 可任选的，亦可将所述合成肽调制于一缓释剂型中，以确保该治疗可提供较长效 的治疗效果。譬如可先将所述的合成肽包裹于一载体中，而后再将其调制成所需的剂型。上 述载体如，脂质体、微球体或纳米体（nanosome)。于某些实施例中，这些可形成微泡的载体 (如，脂质体）亦可促进所述合成肽或药物组合物的投递速率。
[0081] 可任选的，可先将合成肽制成一包覆料，而后将其涂布、浸渍或以其它方式留置于 基材的表面上和/或孔隙中，以得到诸如敷料的制剂。基材可由至少一种天然材料、至少一 种合成材料或两者的组合制成。例如，天然材料可以是胶原蛋白、透明质酸、海藻酸盐或壳 聚糖，或其衍生物；合成材料可以是聚氨酯、聚乙醇酸或聚乙烯氢吡咯酮，或其衍生物。所述 的包覆料和/或基材可具有足够的生物黏着性，以利敷料附着于对象的生物性表面（如，头 皮），且于移除敷料时不至于对毛发生长造成负面影响。
[0082] 又一方面，本发明提出了一种治疗对象脱发和/或毛发脱色的方法。所述对象可 以是任何哺乳动物，包括人类。
[0083] 于一实施例中，上述方法包含给予对象有效量的根据上述方面/实施例的合成 肽。根据本发明多种实施例，所述合成肽可局部或全身给予。优选局部所述合成肽。于更 佳的实施方式中，可将所述合成肽局部给药至该患者的生物性表面（如皮肤、头皮或毛发） 上，而使得合成肽可到达目标部位（如，毛囊）以促进毛发生长和/或毛发染色。
[0084] 于可任选的实施例中，可将所述合成肽调制为上述方面/实施例所述的局部给药 的药物组合物。于一实施例中，可将本发明的药物组合物施用至对象的生物性表面（如皮 肤、头皮或毛发）上。
[0085] 此外，本公开实施例的合成肽或局部给予的药物组合物可在指定条件下给予（如 特定的湿度或温度）。譬如在较为温暖潮湿的条件下给药可促进合成肽在目标位置的吸收。
[0086] 依据本发明多种实施例，对象可能患有脱发，例如生长期脱发、休止期脱发或雄性 秃，其导致异常毛发损失。于某些实施例中，对象可能患有化疗、放疗、氧化压力或老化所致 的毛发脱色。此外，对象亦可能患有因其遗传组成而导致的脱发和/或毛发脱色。
[0087] 下文提出多个实施例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有 通常知识者实施本发明。不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人 员在阅读了本文的描述后，可完整利用本发明。本文所引用的所有公开文献，其全文均以引 用的方式纳入本文。 实施例
[0088] 材料与方法
[0089]〈材料〉
[0090]DMEM培养基、胎牛血清（FBS)与0.25 %胰蛋白酶皆购自英杰生命技术有限公司 (Invitrogen，加利福尼亚，卡尔斯巴德）。二氢睪酮（DHT)、乙醇、1-油酰基单甘油醋、轻质 矿物油、羟丙基甲基纤维素、二甲亚砜DMS0)、胰岛素、皮质醇皮质醇、牛血清白蛋白（BSA)、 5_溴_2' -脱氧尿苷（BrdU)、Hoechst33258染料与Hoechst33342染料皆购自西格玛奥 德里奇（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州）。抗-BrdU抗体购自基泰（GeneTex，台北， 台湾）。抗c-kit抗体（No. 3074)购自细胞信号技术（CellSignalingTechnology)公司 (美国马萨诸塞，韦弗利）。抗酪氨酸酶抗体（No.sc-7833)和所有荧光染料偶联的二级抗体 均购自圣克鲁斯生物技术公司（SantaCruzBiotechnology，加利福尼亚，圣克鲁斯）。苏 木精与曙红（H&E)染料购自默克（美国新泽西州，雷威（Rayway))。
[0091] 合成FITC-结合的29-聚体与其它短合成PEDF肽（包括44-聚体（SEQIDN0:10)、 29-聚体（SEQIDNO:3)、24_ 聚体（SEQIDNO:5)、20_ 聚体（SEQIDNO:6)、18-聚体（SEQ IDNO:7)、与Mo20-聚体（SEQIDNO:9))，并将其N端乙酰化、C端酰胺化而进行修饰。然 后以质谱仪（金斯瑞，新泽西州皮斯卡塔市）表征修饰的肽（纯度>95% )。
[0092]〈动物〉
[0093] 本说明书所载实施例所用的所有动物皆饲育于有温度控制的饲养笼中，饲养温度 约24°C至25°C，光暗循环为12 :12小时。试验过程中提供饮水与标准实验室饲料供任食。 实验计划皆通过马偕纪念医院（新北市，台湾）伦理委员会核准，并遵循国家动物保护相关 规范。
[0094]〈软膏或凝胶配方〉
[0095] 以DMS0为溶剂，将每一PEDF衍生合成肽（以下简称PEDF肽包括FITC-结合的 29-聚体、44-聚体、29-聚体、24-聚体、20-聚体、18-聚体与Mo20-聚体）制成5mM的储 备溶液，并储存于_20°C中以供后续使用。
[0096] 使用前，将含有44-聚体的储备溶液稀释制成工作稀释液，并与抗生素软膏混合， 以得到含有25yM的44-聚体的抗生素软膏。上述抗生素软膏每克含有5毫克硫酸新霉素 以及12. 5毫克枯菌肽。至于其它PEDF肽则是将5y1的上述5mMPEDF肽储备溶液以乙醇 (30%w/w溶于蒸馏水中）逐渐溶解后，缓缓加入1% (w/w)的1-油酰基单甘油酯（一种皮 肤穿透促进剂）与1% (w/w)的轻矿物油；接着加入5% (w/w)的羟丙甲基纤维素（使最终 体积为1毫升，在加入羟丙甲基纤维素后，溶液开始发生胶化反应。另外制备对应于该肽制 剂的DMS0载体，用于体内对照。FITC-29-聚体也溶解在相同制剂中，施加到皮肤上，以观察 FITC-29-聚体于毛囊中的分布。
[0097] 欲进行局部给药时，将350mg含有25yMPEDF肽的软膏或凝胶轻轻地涂敷于每只 小鼠的背部皮肤。
[0098]〈组织学、免疫荧光与定量分析〉
[0099] 收集与脊椎线平行处的小鼠背部皮肤，以取得包含毛囊纵长范围的样本。背部皮 肤经4%甲醛固定后，以固态石蜡包埋，获得纵长切片。将组织切成约5-ym的薄片。于使 用前，于二甲苯中移除固定样品的石蜡，并以一系列浓度梯度的乙醇使样品再水化。利用 H&E染色进行一般组织学观察。利用Zeiss荧光显微镜（德国，耶拿）由样本中的代表性区 域撷取数字显微照片（固定倍率：l〇〇X)。
[0100] 欲分析毛囊的组织形成过程，于脱毛后第15天将动物安乐死。根据本领域所接 受的鼠类毛囊组织形态学分类标准（参见 ：Miiller-R6ver等，皮肤病学杂志（Journalof InvestigativeDermatology) (2001) 117, 3 - 15)来评估在组织形成过程中处于不同阶段 的毛囊的百分比。分析由6-10只经DHT处理的小鼠取得的至少24个纵切毛囊切片。欲证 明经DHT处理的皮肤中PEDF肽依赖性退化期延迟，由单一代表性皮肤切片中选取5至7个 连续显微视野，而后利用计算机辅助的影像分析器（AdobePhotoshopCS310.0)将这些显 微视野合并。
[0101] 进行免疫染色分析前，将脱腊的组织切片以10%山羊血清处理约1小时以进行阻 断。之后以抗C-kit的一级抗体（稀释比1 :100,红色）以及抗酪氨酸酶抗体（稀释比1 : 100)在37°C下培育2小时，进行双重染色，再和与若丹明结合的山羊抗兔IgG抗体（稀释 比1 :500)于室温下培育1小时，之后用苏木精（蓝色）进行约7分钟的对比染色。
[0102] 小鼠触须毛囊的冷冻切片以PBS冲洗三次。经甲醛固定与石蜡包埋的样本于二甲 苯中移除石蜡，并以一系列浓度梯度的乙醇再水化。接着使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶 介导的缺口末端标记（TdT-mediateddUTPni ck-endlabeling，TUNEL)试剂盒（购自罗氏 分子生物化学公司（RocheMolecularBiochemicals)，印第安纳州，印第安纳波利斯）并 根据制造商提供的使用说明进行染色。以Hoechst33258(蓝色）进行对比染色来观察细 胞数目。使用Zeiss荧光显微镜于3个不同的样品室中随机选取10个视野来计算细胞核 (固定倍率：400X;每一样品10个视野）；并利用Zeiss软件撷取影像。
[0103] 在以4%三聚甲醛固定后，将细胞置于冷的甲醇中2分钟，接着在室温下以1N氯化 氢处理约1小时，而后再进行免疫荧光。利用抗BrdU多克隆抗体与若丹明的驴抗兔IgG抗 体来检测经BrdU标记的DNA。
[0104] 进行动物试验时，将BrdU溶于DMS0中，得到浓度为80mM的BrdU储备溶液。将 10y1的BrdU和90y1的PBS溶液混合后经腹膜内注射至小鼠体内，并于16个小时后将小 鼠安乐死。经甲醛固定与石蜡包埋的样品于二甲苯中移除石蜡，并以一系列浓度梯度的乙 醇再水化。以PBS冲洗触须毛囊冷冻切片三次，接着在室温下以1N氯化氢处理约1小时， 而后再进行免疫组织化学分析。
[0105]〈细胞培养〉
[0106] 小鼠触须毛囊的培养方式如下。简言之，由老鼠脸部切下触须垫（whiskerpad)并 放置于含有PBS与1 %抗生素混合物的皮氏培养皿中。由触须垫中分离出每一个处于生长 期的触须毛囊，放置于24孔培养板中（每孔3个触须毛囊），并以DMEM培养基培养；上述 培养基中添加了胰岛素（10yg/ml)、皮质醇（10ng/ml，西格玛奥德里奇）、1 %青霉素/链霉 素抗生素混合物与L-谷酰胺（2mM);培养条件为37°C、5%二氧化碳。每一实验组中分别观 察10-15个毛囊，并重复三次。将DHT与PEDF肽溶于DMS0中并分别加入上述毛囊培养基 内，培养基中添加了胰岛素与皮质醇，且DMS0的最终浓度小于0. 05%。
[0107] 永生化的人类角质形成细胞系HaCaT在37°C下培养于10%FBS-DMEM中，再将细 胞接种到5%FBS-DMEM上，而后以PEDF肽或重组人TGF0 1(安迪生物科技有限公司，R&D Systems)处理细胞。
[0108] 〈统计分析〉
[0109] 将结果表示为平均值土平均值的标准差（SEM)。利用单向AN0VA分析来进行统计 比较。除非另有说明，P〈〇. 05时具有统计上的显著差异。
[0110] 实施例1
[0111] PEDF肽预防/缓和化疗引发之毛发脱落和毛发脱色
[0112] 本实施例采用6周龄雌性C57BL/6小鼠，其具有正常黑色毛发（S卩，末端毛干含有 大量黑色素）。在四次独立的试验中，共使用了80只小鼠。C57BL-6小鼠已被广泛用于化 疗引起的脱发和毛发脱色的研宄中。本试验仅使用毛发生长周期处于休止期的小鼠。由 于小鼠体内色素的制造（又称黑色素生成）仅发生在处于生长期的毛囊中，处于休止期的 C57BL/6小鼠背部皮肤呈现均匀的粉红色。通过脱毛处理诱导处于休止期的背部皮肤进入 生长期。
[0113] 为了得到同属生长期相同阶段的小鼠，利用电动剪毛机小心地刮掉背部的毛发。 在脱毛后第9天，由皮肤颜色由粉红色（休止期皮肤）转变为灰色（生长期VI前期）可判 断毛发进入生长期。
[0114] 在脱毛后第9天，对小鼠腹腔注射舒泰（用量为每公斤体重6毫克）与甲苯噻嗪 (用量为每公斤体重3毫克）混合液，以麻醉小鼠。将小鼠随机分派至不同实验组。CYP/ 载体组的小鼠接受腹腔注射抗癌药物环磷酰胺（CYP，一种抗癌药，每公斤体重150毫克）， 并同时于背部皮肤涂抹350mg抗生素软膏。CYP/44-聚体组的小鼠接受腹腔注射CYP((每 公斤体重150毫克），并同时于背部涂抹350mg含44-聚体的抗生素软膏。载体组与44-聚 体组的小鼠并未接受CYP腹腔注射，仅分别给予350mg的抗生素软膏与350mg含44-聚体 PEDF的抗生素软膏。之后连续七天每天在各组小鼠背部涂抹350mg抗生素软膏（含或不含 44-聚体PEDF)。在空白对照组中，小鼠并未接受CYP注射，也没有涂抹任何抗生素软膏。
[0115] 图1提供了各组小鼠于脱毛后第9天（即，CYP注射后第0天）、脱毛后第16天 (即，CYP注射后第7天）与脱毛后第45天（S卩，CYP注射后第36天）的照片。比较CYP/ 载体组与CYP/44-聚体组的小鼠可以发现，CYP/44-聚体小鼠在CYP注射后第7天与第36 天均具有较好的毛发生长情形。
[0116] 已知给予小鼠每公斤体重150mg的CYP可引发小鼠毛囊角质形成细胞凋亡与毛 囊萎缩。因此，利用TUNEL染色法将凋亡的细胞染色，以评估PEDF肽对角质形成细胞的保 护效果。图2提供了代表性荧光照片，定量分析的结果归纳于表1中。以标记指数来表示 TUNEL-阳性细胞的数量，此一数值是将经标记的细胞数目除以具有核的细胞的总数，并以 百分比（％ )表示。
[0117]表1
[0118]
[0119] *P〈0.0005,相较于CYP/载体组。
[0120] 以上结果显示，相较于仅以软膏处理的小鼠，经含44-聚体的软膏处理的小鼠体 内呈TUNNEL阳性的细胞明显减少。由此可知，给予PEDF肽可以保护角质形成细胞，使其免 于化疗药物（如，CYP)所带来的伤害，且因而可用以预防和/或缓和化疗所致的毛发脱落。
[0121] 黑素细胞干细胞负责供应分化后的后裔细胞（成黑素细胞与黑素细胞）至毛根， 且可调控其后裔细胞的分化周期。近期研宄指出，当小生境（niche)中的MSC异常地分化 为成熟的黑素细胞时，会导致MSC的数量减少和不可逆的毛发变灰色，此现象称为异位性 色素性黑素细胞（ectopicallypigmentedmelanocytes，EPM) 〇
[0122] 只有位于毛球内的黑色素才能将毛干染色。具体而言，毛球内的黑素细胞产生的 黑色素颗粒会被输送到角质形成细胞，以形成经染色的毛发。另外，完全分化的黑素细胞在 退化期中会经历细胞凋亡，而自萎缩的毛囊中移除。当毛囊出现生长期萎缩（dystrophic anagen)时，处于生长期的毛囊内黑色素含量会异常地降低且分布不均，而出现黑色素聚 集。而对于经历退化期萎缩（dystrophiccatagen)的毛发，黑色素将在毛球外聚集。
[0123]再次参照图1，在CYP注射后第36天时，CYP和CYP/载体组的小鼠有较多的灰白 色毛发；而CYP/44-聚体组的小鼠具有较为乌黑的毛发。这些结果意味着在CYP与CYP/载 体组中，MSC可能遭到CYP的破坏，因而无法供应足量的黑素细胞以产生黑色素。
[0124] 可通过黑素细胞系标记（c-kit)和酪氨酸酶来评估MSC的活性。参见图3,免疫 染色分析揭示，在CYP/载体组小鼠的发突内，几乎无法检测到c-kit以及酪氨酸酶表达，表 明其发突内MSC的活性相对低。相较之下，CYP/44-聚体组的小鼠发突中，可观察到c-kit 和酪氨酸酶表达。综而观之，这些数据显示，本发明PEDF肽能够有效地保护MSC，使其免受 CYP的伤害。
[0125] 总结来说，实施例1中的结果显示44-聚体PEDF肽能够有效低降低由CYP所致 的毛囊萎缩、黑色素聚集、毛囊细胞与角质形成细胞凋亡。因而，44-聚体PEDF肽能够预防 和/或缓和化疗引发的毛发脱落和/或毛发脱色。此外，由本发明人先前的研宄结果以及 下文实施例3的结果可以发现，衍生自此44-聚体的39-聚体以及多种衍生自39-聚体的 短肽片段都和44-聚体具有相似的生理活性。由此可以推知，这些短的PEDF合成肽（包括 SEQIDNO: 1 (39-聚体）、SEQIDNO:2 (34-聚体）、SEQIDNO:3 (29-聚体）、SEQIDNO: 5 (24-聚体）、SEQIDNO:6 (20-聚体）、SEQIDNO:8 (M0 29-聚体）与SEQIDNO:9 (M0 20-聚体））亦可有效地治疗化疗所引起的脱发和/或毛发脱色。
[0126] 实施例2
[0127] PEDF肽可预防/缓和压力引发的毛发脱落与毛发脱色
[0128] 已知有多种环境与内因因素可造成氧化压力进而加速老化过程；这些因素如紫外 线辐射、发炎或心理情绪。此外，对象的遗传组成也会影响对象对这些因素的耐受度。先前 的研宄显示，在老龄毛囊中存有浓度以毫摩尔计的过氧化氢。此外，已在动物模型中证实此 种内源性氧化压力可以增加毛囊中黑素细胞的凋亡，而最终会导致毛发变灰色。
[0129] 本实施例探讨了内源性因素（如氧化物）导致的压力和毛发脱落和毛发发灰之间 的关系。根据实施例1所述的方法选择小鼠并将其脱毛。在脱毛后第9天，对小鼠皮下注 射每公斤体重10毫升的过氧化氢。作为比较，在小鼠背部皮肤上分别涂抹350毫克抗生素 软膏（H202/载体组）或含44-聚体的抗生素软膏（H202/44-聚体组）。
[0130] 图4提供了各组小鼠于脱毛后第9天（H202注射当日）以及脱毛后第31天（H202 注射后第22天）的照片。比较H202/载体组和H202/44-聚体组可见，H202注射后第22天 H202/44-聚体组小鼠具有较好的毛发生长活性。此外，用含25yM44-聚体PEDF的抗生素 软膏处理的小鼠具有较黑的毛发颜色。由此可知，所述44-聚体PEDF能够有效预防和/或 缓和因压力（如，氧化压力）所引发的毛发脱落与毛发脱色。
[0131] 此外，由本发明人先前的研宄结果以及下文实施例3的结果可以发现，衍生自此 44-聚体的多种短PEDF肽和44-聚体具有相似的生理活性。因此，这些结果提示，这些短的 卩￡0卩合成肽（包括5￡〇10勵：1(39-聚体）、5￡〇10勵：2(34-聚体）、5￡〇10勵：3(29-聚 体）、SEQIDNO:5 (24-聚体）、SEQIDNO:6 (20-聚体）、SEQIDNO:8 (M0 29-聚体）与 SEQIDN0:9(M0 20-聚体））亦可有效地治疗压力所引起的脱发和/或毛发脱色。
[0132] 实施例3
[0133] PEDF肽可预防/缓和雄性秃
[0134] 本实施例中进行了多项体外与体内分析，以评估本发明PEDF肽对雄性秃的影响。
[0135] 实施例3.1
[0136] PEDF肽可体外拮抗DHT引发的生长停止与角质形成细胞凋亡
[0137] 分别将PEDF肽（29-聚体、24-聚体、20-聚体或Mo20-聚体）加入雄性小鼠触须 毛囊（HF)的组织培养物中培育16小时，之后加入100nM的DHT再进一步培养48小时。在 高倍率下进行组织分析，可以发现相较于未经处理的毛囊，DHT会导致毛基质细胞排列不规 则并出现黑色素聚集（图5)。相较之下，经20-聚体PEDF预处理的HF中，毛基质的大部分 区域中角质形成细胞的排列较为规则，且异常的黑色素粒子较少（图5)。
[0138] 对冷冻切片样品进行免疫分析，以检测TUNEL-与BrdU-阳性细胞，藉以评估HF上 皮细胞的细胞凋亡与细胞增殖能力。定量分析结果如表2所示。将经标记的细胞数目除以 具有核的细胞总数计算得到TUNEL-与BrdU-阳性细胞的标记指数（％ )。
[0139] 表 2
[0140]
[0141] *P〈0.00001，相较于未处理组；#P〈0.00007,相较于DHT/载体组。
[0142]#P〈0. 05,相较于未处理组，P〈0. 002,相较于DHT/载体组。
[0143] 由表2可以看出，于体外，毛基质内角质形成细胞的自发性凋亡比例非常低 (1.7±0. 76%;未处理组）；但在经过100nMDHT处理后，围绕在皮突（dermalpapilla，DP) 附近的角质形成细胞有大量死亡（28. 5±4. 90% ;DHT/载体组）。此外，经过本发明PEDF肽 (如29-聚体、24-聚体、20-聚体或Mo20-聚体）处理的触须毛囊，其TUNEL-阳性角质形 成细胞的数目则远远少于以 载体或18-聚体PEDF肽处理者。这些结果显示本发明PEDF处 理能够有效减少DHT引发的角质形成细胞凋亡。
[0144] 由表2的结果亦可发现，相较于未处理组的毛囊，毛基质中角质形成细胞的细胞 分裂也会受到DHT抑制（未处理组：15. 8±2. 08% ;DHT/载体组：9. 0±1.92%)。另一方 面，经本发明PEDF肽处理的细胞有较高的BrdU标记指数，意味着此处理可改善毛囊角质形 成细胞的增殖活性。
[0145] 已知DHT可诱发皮突细胞（dermalpapillacells，DPC)转型生长因 子-0 1(transforminggrowthfactor-0 1，TGF-0 1)的表达，而TGF-0 1 是一种退化期诱 发剂，会抑制雄性秃患者的毛发生长与毛囊角质形成细胞生长。为了进一步确认PEDF衍生 肽是否能够保护角质形成细胞免于DHT介导的生长抑制，藉由引入BrdU来分析人上皮角质 形成细胞（HaCaT)的细胞分裂对TGF-M和PEDF衍生肽的反应。定量分析的结果摘要整 理于表3,其中BrdU-阳性细胞的标记指数（％ )是将经标记的细胞数目除以具有核的细胞 总数，并以百分比（％)表示。
[0146]表3
[0147]
[0148] *P〈0.002,相较于未处理组；#P〈0.0001，相较于TGF-0 1处理组。
[0149] 如表3所示，与未处理组细胞相比，经TGF-M(4ng/ml，24小时）处理的HaCaT细 胞中BrdU-阳性细胞的比例大幅降低。在TGF-0 1+20-聚体组中，当细胞先以20-聚体处 理16小时时，TGF-M就无法抑制HaCaT细胞的增殖活性。
[0150] 综上所述，PEDF衍生肽可以阻断DHT(与TGFM)对角质形成细胞的抗增殖作用。
[0151] 实施例3. 2
[0152] PEDF肽体内延迟DHT引发的退化期发展
[0153] 采用5a-二氢睪酮（DHT)动物模型来进行体内分析。全身麻醉后，利用融化的蜡 /松脂混合物（1 :1)给毛发生长周期处于休止期的6周龄雄性C57BL/6小鼠（体重15-20 克）脱毛，以诱发生长期。将DHT溶于DMSO中，以得到50mg/ml的储备溶液。在脱毛后第 11天，将DHT溶液（1. 5mg的DHT与200y1的橄榄油混合；用量为每公斤体重30mg)由经剃 毛的背部区域皮下注射到小鼠体内（每种实验条件下6 - 10只小鼠）。在DHT注射后，将 350mg的载体凝胶或350mg含有25yM的PEDF肽（29-聚体、24-聚体、20-聚体或18-聚 体）的凝胶局部施用于小鼠背部皮肤，连续三天，每天给药一次。
[0154] 如图6所示，脱毛后第15天（S卩，DHT注射后第4天）进行的组织分析结果显 示，来自未经DHT处理的小鼠的毛囊由生长期和自发进展的退化期组成；而DHT/载体以及 DHT/18-聚体处理的小鼠则如所预期的那样进入退化期。相反，在经过29-聚体与20-聚体 处理的小鼠中，毛囊主要处于生长期，此一结果显示DHT所致的退化期进程受阻。针对不同 实验组别中，对处于每一生长周期的毛囊百分比进行定量分析，结果摘要整理于表4。
[0155]表 4
[0156]
[0157] *P〈0.001，相较于未处理组；#P〈0.02,相较于DHT/载体组。
[0158]#P〈0. 005,相较于DHT/ 载体组。
[0159] 表4中的数据表明，在DHT/29-聚体、DHT/24-聚体与DHT/20-聚体组中，毛囊有 明显较高的比例处于生长期与退化期早期（退化期I至III期）。另一方面，在载体以及 18-聚体组中，小鼠的毛囊多数处于退化期中期至晚期（S卩，退化期IV至VIII期）。
[0160] 为了确认上述组织形态分析的结果，在脱毛后第15天进行了BrdU与TUNEL染色。 定量分析的结果摘要整理于表5。毛基质（HM)和外根鞘（ORS)内TUNNEL-阳性细胞的数量 表示每个毛囊内的TUNNEL-阳性细胞数。用标记的细胞的数量除以具有核的细胞的总数来 计算毛球（HB)内BrdU-阳性细胞的标记指数（％ )。
[0161]表5
[0162]
[0163] *P〈0. 0002,相较于未处理组；**P〈0. 007,相较于DHT/载体组。
[0164]#P〈0. 002,相较于未处理组，P〈0. 004,相较于DHT/载体组。
[0165] 比较未处理组与DHT/载体组，可以看出后者毛基质和外根鞘（ORS)内TUNEL-阳 性细胞数量急剧增加，且接近生长期毛囊的增殖活性降低，这些结果显示DHT注射会促进 退化期发展。在经过DHT注射以及20-聚体、24-聚体或29-聚体处理的小鼠中，每个毛囊中 几乎都没有TUNEL-阳性的细胞（每一毛囊中平均不到1个），且可观察到密集的BrdU-阳 性角质形成细胞，这证实了本发明PEDF肽能够拮抗DHT引发毛囊退化的效果。
[0166] 综上所述，通过局部给予本发明PEDF衍生肽（如29-聚体、24-聚体与20-聚体） 可阻断细胞增殖停止与毛囊角质形成细胞凋亡所佐证的DHT引发的退化期过渡。这些结果 证实，本发明PEDF衍生肽可延迟DHT诱发的提早生长期向退化期的过渡。
[0167] 实施例3. 3
[0168] PEDF肽体内保持毛囊发展
[0169] 为了评估PEDF肽于重新启动毛发生长方面的功效，根据实施例3. 2所述的方法对 C57BL/6小鼠脱毛。脱毛后第11天，将DHT溶液（1. 5mg的DHT与200y1的橄榄油混合； 用量为每公斤体重30mg)由经剃毛的背部区域皮下注射到小鼠体内（每种实验条件下6 - 10只小鼠）。且在试验过程中，每周对小鼠施注射两次DHT溶液。在第一次DHT注射后，将 350mg的载体凝胶或350mg含有25yM的PEDF肽（29-聚体、24-聚体、20-聚体或18-聚 体）的凝胶局部施用于小鼠背部皮肤，并连续14天，每天给药一次。利用数字相机记录被 毛的改变，计算除毛面积中，呈现黑色部分（即，重新长出毛发之部位）的百分比（图7)， 并根据以下标准来评估在DHT注射后，毛发重新生长的分数：0% (没有毛发生长）者0分； 〈20%者1分；20-39%者2分；40-59%者3分；60-79%者4分；80-100%者5分。另上述 方法来计算深层皮下组织内，每单位长度（1_)中毛球的数目。结果摘要整理于表6。
[0170]表6
[0171]
[0172] *P〈0. 0001，相较于未处理组；**P〈0. 02,相较于DHT/载体组。
[0173]卞尸<0.0005,相较于未处理组；tt尸<0.002,相较于DHT/载体组。
[0174] 图7与表6的结果显示，背部脱毛能够诱使毛囊进入生长期（未处理组）。相反 地，在脱毛后第18天，经DHT/载体与DHT/18-聚体处理的小鼠的毛发再生明显受到延迟； 此现象在众所接受的雄性秃动物模型中是预期的结果。另一方面，经DHT注射的小鼠在每 日接受局部表面涂抹29-聚体、24-聚体或20-聚体之后，上述毛发生长延迟的情形皆有改 善，且可观察到显著的毛发生长。统计分析的结果显示，相较于DHT/载体的对照组，经DHT 注射且接受29-聚体、24-聚体与20-聚体处理的小鼠于脱毛后有较佳的毛发生长分数。
[0175] 继续参照表6,相较于载体与18-聚体组，经29-聚体、24-聚体或20-聚体处理的 小鼠的毛球数量也明显增加（1.6倍）。这些结果显示，本发明PEDF肽能够保护毛囊，使大 多数的毛囊能够躲过DHT的影响，并进入生长期。
[0176] 总结来说，实施例3 (包括实施例3. 1至3. 3)中的各种数据证实本发明PEDF肽能 够有效治疗DHT引发的毛发脱落。因此，以局部给药的形式施用PEDF肽能够预防或缓和雄 性秃所导致的毛发脱落。
[0177] 本公开首度证实以局部给予短PEDF合成肽对于毛囊有治疗效果。相较于传统上 需以静脉内或肌肉内注射来投递表达全长PEDF肽的载体，局部施用短PEDF合成肽不但较 为安全，且成本也相对低廉。
[0178] 应理解，上述实施方式仅仅是以实施例的方式提供，本领域技术人员可作出各种 改动。上述说明书、实施例和数据完整地描述了本发明示例性实施方式的结构和用途。虽 然较详尽地或结合一个或多个实施例描述了本发明的各实施方式，但本领域技术人员在不 悖离本发明原理与精神的情形下可对所公开的各实施方式作出各种改动。
【主权项】
1. 用于治疗对象的脱发和/或毛发脱色的合成肽，由长20 - 44个氨基酸残基并与SEQ IDN0:10具有至少80%氨基酸序列相同性的氨基酸序列组成，其中，所述氨基酸序列含有 的至少20个连续残基与SEQIDNO: 10的残基16 - 35具有至少90%的氨基酸序列相同 性。2. 如权利要求1所述的合成肽，其特征在于，该合成肽的至少4个连续残基与SEQID NO: 10的残基16 - 19相同。3. 如权利要求1所述的合成肽，其特征在于，所述脱发是生长期脱发或雄性秃。4. 如权利要求1所述的合成肽，其特征在于，所述毛发脱色由化疗、放疗、压力、遗传或 老化所致。5. 如权利要求1所述的合成肽，其特征在于，所述对象是人。6. -种用于对象的脱发和/或毛发脱色的局部给药的药物组合物，含有： 有效量的权利要求1所述的合成肽；和 药学上可接受的赋形剂。7. 如权利要求6所述的局部给药的药物组合物，其特征在于，该合成肽的至少4个连续 残基与SEQIDNO: 10的残基16 - 19相同。8. 如权利要求6所述的局部给药的药物组合物，其特征在于，该局部给药的药物组合 物为溶液、喷剂、气雾剂、泡沫、霜剂、洗剂、软膏、凝胶或敷料的形式。9. 如权利要求6所述的局部给药的药物组合物，其特征在于，所述脱发是生长期脱发 或雄性秃。10. 如权利要求6所述的局部给药的药物组合物，其特征在于，所述毛发脱色由化疗、 放疗、压力、遗传或老化所致。11. 如权利要求6所述的局部给药的药物组合物，其特征在于，所述对象是人。12. -种治疗对象的脱发和/或毛发脱色的方法，其特征在于，所述方法包括： 给予该对象有效量的权利要求1所述的合成肽。13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，该合成肽的至少4个连续残基与SEQID NO: 10的残基16 - 19相同。14. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述合成肽被配制成含有该合成肽和药 学上可接受的赋形剂的局部给药的药物组合物。15. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，该局部给药的药物组合物为溶液、喷剂、 气雾剂、泡沫、霜剂、洗剂、软膏、凝胶或敷料的形式。16. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述药物组合物中所述合成肽的浓度为 0. 1-100yMo17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述浓度为1-25yM。18. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述脱发是生长期脱发或雄性秃。19. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述毛发脱色由化疗、放疗、压力、遗传或 老化所致。20. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述对象是人。
【专利摘要】提供了一种衍生自PEDF的合成肽，其具有20–44个氨基酸残基。还提供含有所述合成肽的药物组合物及其用途。所述肽可用于治疗对象的脱发和/或毛发脱色。
【IPC分类】A61K38/17, C12N5/074, C07K14/435, C07K7/08, A61K38/10, A61P17/14
【公开号】CN104903345
【申请号】CN201280077072
【发明人】曹友平, 何宗权
【申请人】财团法人台湾基督长老教会马偕纪念社会事业基金会马偕纪念医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2012年9月17日
【公告号】EP2895502A1, US20150239946, WO2014040302A1
【专利说明】PEDF衍生的多肽在治疗脱发和/或毛发脱色中的用途
[0001] 发明背景 1、技术领域
[0002] 本公开涉及脱发和/或毛发脱色的治疗。具体而言，所公开的发明涉及使用衍生 自PEDF的多肽来治疗脱发和/或毛发脱色。
[0003] 2、相关技术的描述
[0004]脱发指毛发自头部或身体脱落。脱发可分为瘢痕性脱发以及非瘢痕性脱发。患瘢 痕性脱发的患者中，毛囊被破坏并被疤痕组织取代，而患非瘢痕性脱发的患者则没有这种 不可逆的损伤。虽然脱发不会影响患者的生命，但却影响个人外表，且因而影响个人的社交 互动、自尊与心理健康。
[0005] 非瘢痕性脱发包含生长期脱发、休止期脱发、雄激素性脱发和斑秃，各自由不同生 物学缺陷引起。取决于患者所患的脱发类型，其对毛囊所造成的影响也不相同。
[0006] 生长期脱发通常指当毛囊仍处于生长期时，毛发基质细胞的有丝分裂突然终止， 因而使得毛囊无法制造毛发或只能制造出易于断裂脱落的狭窄的缺陷毛鞘。生长期脱发常 见于接受化疗或放疗的患者身上。一般来说，一旦引起生长期脱发的因素停止存在后，毛囊 会恢复原本的生长周期，而大多数情况下治疗结束后毛发开始重新生长。但新生头发的颜 色与质地可能会与原来的毛发不同。
[0007] 休止期脱发是指处于循环的毛囊提早进入毛囊周期中的休止期，因而导致毛发过 分脱落的情形。有多种与压力相关的因素可能导致休止期脱发，包括饮食不均衡、药物（如 0肾上腺阻断剂、钙离子通道阻断剂、抗抑郁剂、非留体抗炎药等）、生产、高烧、重大手术、 甲状腺机能失调，严重的感染、严重的慢性疾病与严重的心理压力等。通常，在经历任意这 些因素后3至4个月，对象开始出现落发；而大约在6至12个月内，毛发会渐渐地恢复生 长。
[0008] 雄激素性脱发（又称为雄性秃）是最常见的雄性脱发，会发生于男性与女性身上， 不过女性患者的落发情形通常较男性患者来得轻微。造成雄性秃的真正机制仍未完全明 朗。普遍认为，毛囊对于雄性激素衍生物一二氢睪酮过于敏感与男性雄激素性脱发的发生 相关。这种过于敏感会使得毛囊萎缩、毛囊细胞生长期缩短，进而导致形成最终从毛囊脱落 的杵状毛。
[0009] 目前有两种药物经过美国食品暨卫生管理局FDA)核准用以治疗雄性秃，分别 是局部用药的米诺地尔（minoxidil;商品名为R〇GAINEK )以及口服用药的非那司提 (finasteride;商品名为PROPEC:丨AK )。米诺地尔是一种钾离子通道激动剂，可藉由延长 毛囊的生长期、促使毛囊由休止期转而生长以及促使毛囊增大来影响毛囊。米诺地尔亦可 用于治疗斑秃以及化疗所导致的生长期脱发。非那司提是将睪酮转变为二氢睪酮（DHT)的 II型5a-还原酶的竞争性抑制剂。这两种药物虽然都能刺激部分患者的毛发再生，它们仅 在药物处理期间有效，因此患者被建议持续使用该药物。此外，偶尔发现米诺地尔或非那司 提会产生一些副作用。米诺地尔的可能副作用包括头皮瘙痒或发瘆；性欲降低；心跳速率 提高；呼吸困难；体重增加；和与多毛症。非那司提的可能副作用包括皮瘆、乳房增大或压 痛、睪丸疼痛、性欲降低、精液减少与阳瘘。
[0010] 毛发颜色是毛发着色的结果。当来自黑素细胞的色素（即黑色素）供应量降低时， 新长成的毛发就失去其原有颜色，而呈现较淡的颜色甚至白色；此现象即称为毛发脱色。包 括老化、压力、疾病（如斑驳病）等因素都可能使得毛发脱色。此外，先前接受化疗或放疗 的患者重新长出的毛发也经常会出现脱色。目前并没有有效的医学方法诱导脱色毛发重新 获得其先前的颜色。因此大多数毛发脱色患者只能接受他们的外表，或是藉由染发或使用 假发来遮盖脱色的毛发。
[0011] 有鉴于此，本领域急需有效治疗各种类型的脱发和/或毛发脱色的手段。
【发明内容】
[0012] 下文提供本公开的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明 内容并非本公开的完整概述，且其未指出本发明的重要/关键组件或界定本发明的范围。 本部分内容的目的仅是以简化形式阐明一些概念，更详细的内容将在后文予以呈现。
[0013] 本发明至少是部分基于发现色素上皮衍生因子（PEDF)衍生的合成肽能够保护毛 囊，且因而能够有效预防和/或缓和对象毛发脱落和/或毛发脱色。具体来说，本说明书提 出的实施例显示，有多种PEDF衍生的合成肽能够抑制毛囊萎缩与毛囊细胞凋亡，和/或防 止毛囊中的黑素细胞干细胞（MSC)提早分化。因而，本发明的PEDF衍生合成肽能够用作预 防和/或缓和毛发脱落和/或毛发脱色的制剂或药物。
[0014] 因此，一方面，本公开涉及用于治疗对象脱发和/或毛发脱色的合成肽。
[0015] 根据本公开的多个实施例，所述的合成肽长度为20 - 44个氨基酸残基，且其序列 至少80%与SEQIDNO:10相同。此外，上述氨基酸序列包含至少20个连续氨基酸残基， 其序列至少90%与SEQIDNO:10的氨基酸残基16 - 35相同，而使得此合成肽可用于治疗 对象脱发和/或毛发脱色。
[0016] 在本公开可任选的实施例中，上述合成肽中有至少四个连续的氨基酸与SEQID NO:10的氨基酸残基16 - 19 (即，SLGA残基）相同。此种合成肽的非限制性例子包括具有 SEQIDN0:10(44-聚体）、SEQIDN0:l(39-聚体）、SEQIDN0:2(34-聚体）、SEQIDNO: 3 (29-聚体）、SEQIDNO:5 (24-聚体）、SEQIDNO:6 (20-聚体）、SEQIDNO:8(MO29-聚 体）与SEQIDNO:9(M0 20-聚体）所示的氨基酸序列的合成肽。根据本公开某些实施例， 上述合成肽的氨基酸序列为SEQIDN0:10(44-聚体）、SEQIDN0:3(29-聚体）、SEQID NO:5 (24-聚体）或SEQIDNO:6 (20-聚体）。
[0017] 依据本公开多种实施例，所述的脱发可以为生长期脱发（如，由化疗或放疗所导 致的脱发）、休止期脱发（如由压力、饮食不均衡、药物或感染所导致的脱发）或雄性秃。
[0018] 在一些实施例中，所述的毛发脱色是指由化疗或放疗所导致的毛发脱色。在另一 些实施例中，所述的毛发脱色是指由压力或老化所致的毛发脱色。
[0019] 根据本公开多个实施例，所述的对象可以是任何哺乳动物，包括人类。
[0020] 另一方面，本公开涉及用于治疗对象的脱发和/或毛发脱色的局部施用的药物组 合物。所述的对象可以是任何哺乳动物，包括人类。
[0021] 根据本公开的一实施例，上述局部施用的药物组合物包含上述任一方面/实施例 的合成肽，且该合成肽的含量足以治疗该对象的脱发和/或毛发脱色。该药物组合物亦包 含该合成肽的药学上可接受的赋形剂。
[0022] 依据本公开多种实施例，所述的局部施用的药物组合物可以是以下任一种剂型： 溶液、喷剂、气雾剂、泡沫、霜剂、洗剂、软膏、凝胶或敷料。
[0023] 根据本公开的可任选实施例，此药物组合物中所述合成肽的含量为约0. 1_
[0024] 又一方面，本发明涉及一种治疗对象脱发和/或毛发脱色的方法。所述的对象可 以是任何哺乳动物，包括人类。
[0025] 在一实施例中，所述方法包含给予该对象有效量的根据上述任一方面/实施例的 合成肽。根据本公开多种实施例，上述合成肽可局部给药或全身给药；较佳为局部给药。
[0026] 根据可任选实施例，可将上述合成肽配制为根据本公开上述方面/实施例所述的 局部施用的药物组合物。在一实施例中，可将此局部施用的药物组合物施用于该对象的头 皮上。
[0027] 在参阅下文详细描述，并结合附图后，本公开许多附带的特征和优点将更易于理 解。
[0028] 附图简述
[0029] 本专利或申请文件包含至少一幅彩图。在提出请求并缴纳所需费用后，专利局将 提供带有彩图的此专利或专利申请出版物的副本。
[0030] 结合附图及下文详述，本说明书将更易于理解。
[0031] 图1提供呈现CYP注射后第0、7与36天各实验条件下脱毛小鼠的外观的代表性 照片，还提供了对应于方框标记处的高倍率显微照片。
[0032] 图2显示呈现TUNNEL阳性的凋亡角质形成细胞（绿色）的代表性免疫染色照片， 细胞核经Hoechst33258对比染色（蓝色），原始倍率：X1000。
[0033] 图3显示经酪氨酸酶（绿色）和c-kit(红色）双重免疫荧光染色检测的毛囊样 品的代表性照片，细胞核经Hoechst33258对比染色（蓝色），原始倍率：X1000。
[0034] 图4显示呈现皮下H202注射后第0与22天各实验条件下小鼠的外观的代表性照 片。
[0035] 图5显示经苏木精和曙红（H&E)染色的小鼠触须样品的生长期中期毛囊的代表性 照片；0RS:外根鞘；IRS:内根鞘；DP:皮突；HM:毛基质；；上方照片原始倍率：X100,下方 照片原始倍率：X400。
[0036]图6显示经H&E染色的小鼠背部皮肤的代表性照片，原始倍率：X100。
[0037] 图7显示呈现脱毛后第0与18天各实验条件下毛发再生的代表性照片，以及经苏 木精和曙红（H&E)染色后背部皮肤样品的代表性照片；原始倍率：X100。
[0038] 详述
[0039] 下文结合附图详细描述的内容仅仅是对本实施例的描述，并非是实施或运用本发 明具体实施例的唯一形式。此部分公开了实施例的功能以及用于建构与操作这些具体实施 例的步骤的顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或等同的功能与顺序。
[0040]出于方便，本申请（包括说明书、实施例和权利要求书）所用的某些术语汇集于 此。除非本说明书另有定义，本公开所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域 中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。除非另有说明，应理解的是，所用的单数名词 涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。具体而言，如本文及权 利要求书所用，除非另有说明，单数形式"一"包括其复数形式。
[0041] 虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数界是约略的数值，具体实施例的 相关数值已尽可能精确地呈现。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所 致的标准偏差而导致的误差。同时，本文中，"约"通常指实际数值在一给定数值或范围的正 负10%、5%、1%或0.5%之内。或者是，"约"代表实际数值落在平均值的可接受标准误差 之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实施例之外，或除非另有 明确的说明，当可理解本文所用的所有数值范围、数量、数值与百分比（例如用以描述材料 用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例等）均经过"约"的修饰。因此，除非另有相反的 说明，本公开与权利要求书所涉及的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更改。至少应 将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
[0042] 本文中，术语"肽"指氨基酸残基的多聚物。本文中，术语"合成肽"指未包含存在 于自然界的完整蛋白质分子的肽。此种肽是"合成的"，因为其由人类利用技术手段所得，譬 如化学合成、重组遗传技术或将整个蛋白切段等。于本公开中，任何指定氨基酸残基于一肽 中的位置系由该肽的N端起算。
[0043] 本文所用术语"干细胞"指在某些条件下保有能够增殖而不实质分化，且亦能够在 某些条件下分化成更专一或分化的表型的能力的细胞。
[0044] 本文所用"增殖"指细胞群中细胞数目通过细胞分裂而增加。
[0045] 本文针对合成多肽序列所述的"氨基酸序列相同性百分比（％ )"系指该候选合 成肽的氨基酸残基与参考多肽的氨基酸残基完全相同的百分比。进行上述比对时，可将该 候选合成肽与该参考多肽并排，并于必要时引入间隙（gap)，以使两条序列形成最高的序列 相同性，且在计算相同性时，并未将保守性取代的氨基酸残基纳入考虑。可采用 本领域已 有的多种方法进行上述比对，以确定序列相同性百分比，譬如可使用可公开取得的软件如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)。本领域技术人员可确定比对时的适当参 数，包括需要在对比序列的整个长度上获得最大比对所需的各种算法。为了本文的目的，二 氨基酸序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心（NCBI)所提供的计算机程序 Blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)来进行。给定氨基酸序列A相较于给定氨基酸序列B的 氨基酸序列相同性百分比（亦称为给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B具有特定百分比 (% )的氨基酸序列相同性）的计算方式如下：
[0046]
[0047] 其中X是利用比对程序BLAST对A和B进行比对后所得到的计为完全匹配的氨基 酸残基的数量，而Y是A或B中较短者的氨基酸残基总数。
[0048] 本文所用术语"治疗"指预防性（如，预防用药）、治愈性或缓和性的处理，藉以达 到所需的药学和/或生理学效果。在较佳的情形中，上述的效果是治疗性的，即能够部分或 完全地治愈或预防脱发或毛发脱色。此外，本文所用术语"治疗"指称将本公开合成肽或药 物组合物施用或给予对象，此对象有医学疾患、症状、疾病或与疾患相关的异常或易于罹患 疾患，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻特定疾病、异常和/或病症的一或多种症状 或特征，或延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对并未出现疾 病、异常和/或病症之征兆的对象和/或呈现疾病、异常和/或病症之早期征兆的对象进行 治疗，以期降低发展出与该疾病、异常和/或病症相关之病理变化的风险。本文中，上述症 状、疾病、异常或病症指脱发或毛发脱色。如其在本文中所定义的，当一或更多种症状或临 床指标减少时，通常认为该治疗是"有效"的。
[0049] 本文所用术语"有效量"指一成分的用量足以产生所欲的反应。术语"治疗有效量" 指药物组合物中的治疗药剂的含量能产生上文定义的所需"有效治疗"。具体的治疗有效量 取决于多种因素，诸如欲治疗的特定病症、患者的身体条件（如患者体重、年龄或性别）、接 受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、共同施与的疗法（如果有的话）的本质以 及所用的具体配方。治疗有效量亦指于此用量下，该化合物或组合物的毒性或负面效果不 及于其所带来的正面疗效。
[0050] 术语"施用"或"给药"在本文中可互换使用，指将本发明合成肽或药物组合物提 供给对象，以治疗脱发和/或头发脱色的措施。根据本公开各实施方式，较佳的给药方式为 局部给药。例如，将本发明合成肽或药物组合物局部施用至对象的生物性表面（如，皮肤、 头皮或毛发），并使其到达目标部位（如，毛囊），以预防或缓和脱发和/或头发脱色。
[0051 ] 本文所用术语"赋形剂"指可作为本公开所述PEDF衍生合成肽的媒剂/载体的任 何惰性物质（如粉末或液体）。赋形剂通常是安全、无毒的，且广义上可包括制药产业中用 于制备药物组合物的任何已知物质，如填充剂、稀释剂、凝结剂、黏合剂、润滑剂、助流剂、稳 定剂、着色剂、润湿剂、崩解剂等。
[0052] 在本说明书中，"药学上可接受"的成分指其适用于人类和/或动物，且在合理的效 益/风险比之下不会产生不当的副作用（如毒性、刺激与过敏反应）。此外，每一种赋形剂 必须和药学配方中的其它成分兼容，才是"可接受"的。
[0053] 术语"对象"指可接受本发明的合成肽、组合物和/或方法来进行治疗的哺乳动物 (包括人类）。除非另有指明，术语"对象"包含雄性与雌性。
[0054] 动物的毛发生长有三个周期：退化期、休止期和生长期。生长期是毛发活跃生长 阶段，位于毛球内的细胞会快速分裂并分化成毛干。平均来看，人类头皮毛发在此活跃生长 阶段的时间约为3-5年，而小鼠毛发的生长期约为11天。在生长期之后是退化期。此阶 段中，毛发生长停止，约70%的毛囊细胞经历细胞凋亡与再吸收，因而产生了杵状毛。退化 期是过渡阶段，对于人头皮毛发而言，其持续约1 _ 2周。最后是休止期，人类头皮毛发休止 期持续约3个月。在此时期中，毛囊完全处于休息状态，杵状毛完全形成。相较于生长期毛 发，休止期毛发（即杵状毛）可轻易被拔起，且容易脱落。
[0055] 毛囊发突区域内含有毛囊干细胞（FSC)与黑素细胞干细胞（MSC)，分别负责毛发 再生及毛发着色。已知多种因素危及毛囊干细胞和/或黑素细胞干细胞的干细胞特性。例 如，人体老化、环境氧化剂、毛囊疾病、化疗或对象的遗传组成等因素都可能使这些干细胞 丧失它们的干细胞特性，丧失干细胞特性可影响其后代细胞的正常生长周期，因而导致脱 发或毛发脱色。
[0056] 色素上皮衍生因子（PEDF)是一种多功能的分泌性蛋白质，其具有抗血管新生、抗 肿瘤生成与神经滋养等功能。人PEDF蛋白质（SEQIDNO:ll)是一种大小约50kDa的分泌 性蛋白质，长418个氨基酸。已知PEDF的34-聚体片段（第44 - 77号残基）与44-聚体 片段（第78 - 121号残基；SEQIDNO: 10)分别具有抗血管新生与神经滋养性质。
[0057] 本公开至少部分是基于发现来自PEDF的44-聚体合成肽能够透过多种机制来保 护毛囊。譬如，所述的合成肽能够抑制毛囊萎缩，防止毛囊中的黑素细胞干细胞提早分化成 为成黑素细胞，以及减少黑色素聚集。在不受限于特定理论的前提下，据信这些保护性机制 有助于维持毛囊中干细胞的干细胞特性，且/或可使这些干细胞的后代细胞处于正常的生 长周期，因而使得毛囊能够制造健康、正常的较不易异常掉落和/或保有原本发色的毛发。 本发明的另一创新特征在于所述合成肽仅有20至44个氨基酸残基，比起先前技术所述的 全长PEDF短了许多；因此，本发明克服了传统蛋白质药物在临床使用上经常面临的困境， 诸如制造成本高昂、生物利用率低与药物动力学表现不佳等。因此，这些合成肽可用以治疗 脱发和/或毛发脱色。
[0058] 有鉴于此，一方面，本公开涉及用于治疗对象脱发和/或毛发脱色的合成肽。根 据本公开多个实施例，此合成肽有20 - 44个氨基酸残基，且其氨基酸序列与SEQIDNO: 10 (VLLSPLSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)有至少 80 % 的氨基酸序列相同 性。举例来说，此合成肽与SEQIDNO:10的氨基酸序列相同性可为约80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。另外，此合成肽包含的至少 20 个连续的氨基酸残基与SEQIDNO: 10第16 - 35个残基有至少90%的氨基酸序列相同性。 具体来说，这20个连续氨基酸残基与SEQIDNO: 10第16-35个残基的氨基酸序列相同性 可为约 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。
[0059] 在一实施例中，所述的合成肽为上述44-聚体。本发明人先前所做的实验（如，待 批美国专利申请案第13/428996号与台湾专利申请案第100138168号，在此将该在先申请 的内容以引用的方式一并纳入为本说明书的一部分）与本说明书所提供的实施例显示，还 有其它数种来自此44-聚体的短PEDF合成肽能够用于治疗脱发和/或毛发脱色。具体而 言，台湾专利申请案第100138168号揭示上述PEDF44-聚体能够有效预防和/或缓和由化 疗或压力所导致的脱发与毛发脱色，以及预防和/或缓和雄性秃。
[0060] 譬如，由下文与在先申请的实施例可知，具有SEQIDNO:1(LSVATALSALSLGAEQRTE SIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示序列的39-聚体合成肽能够有效地治疗对象的脱发和/或毛 发脱色。此39-聚体合成肽对应于人PEDF的第83 - 121号氨基酸残基；且为衍生自上述 44-聚体（对应于PEDF的第78-121号残基）的短肽片段。根据上文所述的氨基酸序列相 同性百分比的计算方法，此39-聚体与44-聚体的氨基酸序列相同性为100%，且39-聚体 的第11 - 30号氨基酸残基与44-聚体的第16 - 35号氨基酸残基的氨基酸序列相同性也是 100%〇
[0061] 另一实施例中，由下文与在先申请的实施例可知，具有SEQIDN0:2(ALSALSLGAE QRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示序列的34-聚体合成肽亦能有效地治疗脱发和/或毛发 脱色。此34-聚体合成肽相当于人PEDF的第88 - 121号氨基酸残基；其与44-聚体的氨基 酸序列相同性为100%，且该34-聚体的第6 - 25号氨基酸残基与44-聚体的第16 - 35号 氨基酸残基的氨基酸序列相同性也是100%。
[0062] 此外，下文多个实施例证明，具有SEQIDNO: 3 (SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示序列的29-聚体合成肽能够有效预防和/或缓和 对象的雄性秃。此外，由下文与在先申请的实施例可推知，该29-聚体亦可用以治疗化疗或 压力引起的脱发和/或毛发脱色。此29-聚体合成肽相当于人PEDF的第93 - 121号氨基 酸残基；其与44-聚体的氨基酸序列相同性为100%，且29-聚体的第1 - 20号氨基酸残基 与44-聚体的第16 - 35号氨基酸残基的氨基酸序列相同性亦为100%。
[0063] 某些实施例证实，24-聚体合成肽亦可有效预防和/或缓和对象的雄性秃。此外， 由下文与在先申请的实施例可推知，该24-聚体亦可用以治疗化疗或压力引起的脱发和/ 或毛发脱色。此24-聚体具有SEQIDNO:5(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSP)所示的序列，且 对应于人PEDF第93 - 116号氨基酸残基。此24-聚体序列与44-聚体具有100%的氨基酸 序列相同性，其前20个氨基酸残基与该44-具体的第16 - 35号氨基酸残基具有100%的氨 基酸序列相同性。
[0064] 其它实施例证实，20-聚体可预防和/或缓和对象的雄性秃。而且，由下文与在先 申请的实施例可推知，20-聚体亦可用于治疗化疗或压力引起的脱发和/或毛发脱色。该 20-聚体具有SEQIDNO:6(SLGAEQRTESIIHRALYYDL)所示的序列，对应于人PEDF第93 - 112 号氨基酸残基。此20-聚体肽与44-聚体的第16 - 35号氨基酸残基完全相同（氨基酸序 列相同性：100% )且其与44-聚体的氨基酸序列相同性同样也是100%。
[0065] 本案与在先申请所记载的实验亦显示，两种衍生自小鼠PEDF的合成肽同样也能 够有效地治疗雄性秃或由化疗或压力所致的脱发和/或发色脱色。第一种衍生自小鼠的 肽在本说明书中称为Mo29-聚体，具有SEQIDN0:8(SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST) 所示的序列，此序列与44-聚体的氨基酸序列相同性为83%，且其前20个氨基酸残基与 44-聚体第16 - 35个残基的氨基酸序列相同性为90%。另一种衍生自小鼠的肽称为Mo 20-聚体，具有如SEQIDNO:9 (SLGAEHRTESVIHRALYYDL)所示的序列。Mo20-聚体与 44-聚 体及其第16 - 35号氨基酸残基的氨基酸序列相同性皆为90%。
[0066] 任选地，所述合成肽含有四个连续的氨基酸，其序列与SEQIDNO:10的氨基酸 残基16-19相同。据信，SEQIDNO:10的第16 - 19号氨基酸残基（即SLGA)对于维持 短PEDF肽的生物学功能起重要作用。举例来说，下文提出的多个实施例显示，不具有此 SLGA片段的18-聚体肽（EQRTESIIHRALYYDLIS;SEQIDNO:7)无法对对象的毛囊提供保 护。此外，由本案与在先申请所载的实施例可以发现，不含SLGA序列的25-聚体合成肽 (EQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT;SEQIDN0:4)也无法有效治疗对象的脱发和/或毛发脱 色。
[0067] 可利用常用技术来合成本发明的合成肽，譬如使用t-BOC或FM0C来保护a-氨 基。这两种方法都采用了逐步合成法，由该肽的C端开始，每次加上 一个氨基酸。亦可利用 已知的固态肽合成法来合成本发明的合成肽。
[0068] 本发明的范围亦涵盖了其它相较于39-聚体具有保守性突变的合成肽。本文所用 术语"保守性突变"指利用另一种在生物学上相似的残基来取代某一残基。保守性突变的 例示包括疏水性残基（如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸与甲硫氨酸）彼此间的置换，或极性残 基（如精氨酸与赖氨酸；或谷氨酸与天冬氨酸，或谷氨酰胺与天冬酰胺）彼此间的置换等。 "保守性突变"在此亦指利用取代的氨基酸来取代未取代的原始氨基酸，只要针对该取代的 多肽产生的抗体也能与该未取代的多肽发生免疫反应即可。
[0069] 依据本发明多种实施例，所述的脱发可以是生长期脱发（如，由化疗或放疗所导 致的脱发）、休止期脱发（如，由压力、饮食不均衡、药物或感染所导致的脱发）或雄性秃。
[0070] 在某些实施例中，所述的毛发脱色是指由化疗或放疗所导致的毛发脱色。在另一 些实施例中，所述的毛发脱色是指由压力或老化所致的毛发脱色。
[0071] 根据本公开的一些实施例，所述对象可以是任何归类为哺乳动物的动物，包括人。
[0072] 亦可将上述实施方式所述的各种合成肽调制成局部给药的药物组合物，以治疗对 象脱发和/或毛发脱色；此药物组合物落入本发明其它方面的范围之内。
[0073] 根据本发明一实施方式，上述局部给药的药物组合物包含上述任一方面/实施例 的合成肽，且此合成肽的含量足以有效治疗对象的脱发和/或毛发脱色。此局部给药的药 物组合物还可包含用于该合成肽的药学上可接受的赋形剂。
[0074] 可根据既有的药学程序来制备上述药物组合物，譬如《雷明顿制药科学》 (Remington'sPharmaceuticalSciences)(第 17 版，AlfonosoR.Gennaro编，麦克出版 公司（MackPublishingCompany)，伊斯顿，宾夕法尼亚（1985)) -书中有详细的记载。
[0075] 在选择适用于投递合成肽的药学上可接受的赋形剂时，主要需考虑此局部给药的 药物组合物的给药方式。根据本发明的可任选实施例，可利用涂敷、涂抹、按摩或喷涂或其 它手段，使此局部给药的药学组合施用于对象的生物学表面（如，皮肤、头皮或头发），而使 得所述合成肽能够透过毛囊的主动吸收（即，经附体途径（transappendagealroute))或 通过跨细胞途径或细胞间途径的经皮形式而到达目标部位（如，毛囊）。
[0076] 可使用本领域周知的皮肤学上可接受的各种惰性赋形剂。典型的惰性赋形剂可以 是例如水、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、矿物油、硬脂醇、软膏基质和形成胶状物的材料。
[0077] 可任选地，本发明的药物组合物亦可包含本领域周知的药学上（特别是皮肤 学上）可接受的添加剂。所述添加剂包括但不限于干燥剂、抗痒剂、抗发泡剂、缓冲剂、 中和剂、pH调节剂、着色剂、脱色剂、润肤剂、乳化剂、乳液稳定剂、增黏剂（viscosity builders)、保湿剂、添味剂（odorants)、防腐剂、抗氧化剂、化学稳定剂、增稠剂、硬化剂、或 悬浮剂。
[0078] 依据本发明多种实施例，所述局部给药的药物组合物可调制成各种剂型，如溶液、 喷剂、气雾剂、泡沫、霜剂、洗剂、软膏、凝胶或敷料。
[0079] 根据本发明的可任选实施例，此药物组合物中所述合成肽的含量为约0. 1-100 1^;较佳为约1-25 1^。举例来说，合成肽的浓度可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.3、 0?7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95或100yM。具体而言，下文实施例中针对约20克重的小鼠所用的浓度为约25yM。 本发明所属技术领域具有通常知识者可基于本说明书提出的动物给药剂量计算出本发明 合成肽或药物组合物的人体等效剂量（HE?。譬如，美国食品暨卫生管理局已批准了工业 指南，题为"成年健康志愿者临床治疗实验中最大安全起始剂量的估算"（Estimatingthe MaximumSafeStartingDoseinInitialClinicalTrialsforTherapeuticsinAdult HealthyVolunteers)〇
[0080] 可任选的，亦可将所述合成肽调制于一缓释剂型中，以确保该治疗可提供较长效 的治疗效果。譬如可先将所述的合成肽包裹于一载体中，而后再将其调制成所需的剂型。上 述载体如，脂质体、微球体或纳米体（nanosome)。于某些实施例中，这些可形成微泡的载体 (如，脂质体）亦可促进所述合成肽或药物组合物的投递速率。
[0081] 可任选的，可先将合成肽制成一包覆料，而后将其涂布、浸渍或以其它方式留置于 基材的表面上和/或孔隙中，以得到诸如敷料的制剂。基材可由至少一种天然材料、至少一 种合成材料或两者的组合制成。例如，天然材料可以是胶原蛋白、透明质酸、海藻酸盐或壳 聚糖，或其衍生物；合成材料可以是聚氨酯、聚乙醇酸或聚乙烯氢吡咯酮，或其衍生物。所述 的包覆料和/或基材可具有足够的生物黏着性，以利敷料附着于对象的生物性表面（如，头 皮），且于移除敷料时不至于对毛发生长造成负面影响。
[0082] 又一方面，本发明提出了一种治疗对象脱发和/或毛发脱色的方法。所述对象可 以是任何哺乳动物，包括人类。
[0083] 于一实施例中，上述方法包含给予对象有效量的根据上述方面/实施例的合成 肽。根据本发明多种实施例，所述合成肽可局部或全身给予。优选局部所述合成肽。于更 佳的实施方式中，可将所述合成肽局部给药至该患者的生物性表面（如皮肤、头皮或毛发） 上，而使得合成肽可到达目标部位（如，毛囊）以促进毛发生长和/或毛发染色。
[0084] 于可任选的实施例中，可将所述合成肽调制为上述方面/实施例所述的局部给药 的药物组合物。于一实施例中，可将本发明的药物组合物施用至对象的生物性表面（如皮 肤、头皮或毛发）上。
[0085] 此外，本公开实施例的合成肽或局部给予的药物组合物可在指定条件下给予（如 特定的湿度或温度）。譬如在较为温暖潮湿的条件下给药可促进合成肽在目标位置的吸收。
[0086] 依据本发明多种实施例，对象可能患有脱发，例如生长期脱发、休止期脱发或雄性 秃，其导致异常毛发损失。于某些实施例中，对象可能患有化疗、放疗、氧化压力或老化所致 的毛发脱色。此外，对象亦可能患有因其遗传组成而导致的脱发和/或毛发脱色。
[0087] 下文提出多个实施例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有 通常知识者实施本发明。不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人 员在阅读了本文的描述后，可完整利用本发明。本文所引用的所有公开文献，其全文均以引 用的方式纳入本文。 实施例
[0088] 材料与方法
[0089]〈材料〉
[0090]DMEM培养基、胎牛血清（FBS)与0.25 %胰蛋白酶皆购自英杰生命技术有限公司 (Invitrogen，加利福尼亚，卡尔斯巴德）。二氢睪酮（DHT)、乙醇、1-油酰基单甘油醋、轻质 矿物油、羟丙基甲基纤维素、二甲亚砜DMS0)、胰岛素、皮质醇皮质醇、牛血清白蛋白（BSA)、 5_溴_2' -脱氧尿苷（BrdU)、Hoechst33258染料与Hoechst33342染料皆购自西格玛奥 德里奇（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州）。抗-BrdU抗体购自基泰（GeneTex，台北， 台湾）。抗c-kit抗体（No. 3074)购自细胞信号技术（CellSignalingTechnology)公司 (美国马萨诸塞，韦弗利）。抗酪氨酸酶抗体（No.sc-7833)和所有荧光染料偶联的二级抗体 均购自圣克鲁斯生物技术公司（SantaCruzBiotechnology，加利福尼亚，圣克鲁斯）。苏 木精与曙红（H&E)染料购自默克（美国新泽西州，雷威（Rayway))。
[0091] 合成FITC-结合的29-聚体与其它短合成PEDF肽（包括44-聚体（SEQIDN0:10)、 29-聚体（SEQIDNO:3)、24_ 聚体（SEQIDNO:5)、20_ 聚体（SEQIDNO:6)、18-聚体（SEQ IDNO:7)、与Mo20-聚体（SEQIDNO:9))，并将其N端乙酰化、C端酰胺化而进行修饰。然 后以质谱仪（金斯瑞，新泽西州皮斯卡塔市）表征修饰的肽（纯度>95% )。
[0092]〈动物〉
[0093] 本说明书所载实施例所用的所有动物皆饲育于有温度控制的饲养笼中，饲养温度 约24°C至25°C，光暗循环为12 :12小时。试验过程中提供饮水与标准实验室饲料供任食。 实验计划皆通过马偕纪念医院（新北市，台湾）伦理委员会核准，并遵循国家动物保护相关 规范。
[0094]〈软膏或凝胶配方〉
[0095] 以DMS0为溶剂，将每一PEDF衍生合成肽（以下简称PEDF肽包括FITC-结合的 29-聚体、44-聚体、29-聚体、24-聚体、20-聚体、18-聚体与Mo20-聚体）制成5mM的储 备溶液，并储存于_20°C中以供后续使用。
[0096] 使用前，将含有44-聚体的储备溶液稀释制成工作稀释液，并与抗生素软膏混合， 以得到含有25yM的44-聚体的抗生素软膏。上述抗生素软膏每克含有5毫克硫酸新霉素 以及12. 5毫克枯菌肽。至于其它PEDF肽则是将5y1的上述5mMPEDF肽储备溶液以乙醇 (30%w/w溶于蒸馏水中）逐渐溶解后，缓缓加入1% (w/w)的1-油酰基单甘油酯（一种皮 肤穿透促进剂）与1% (w/w)的轻矿物油；接着加入5% (w/w)的羟丙甲基纤维素（使最终 体积为1毫升，在加入羟丙甲基纤维素后，溶液开始发生胶化反应。另外制备对应于该肽制 剂的DMS0载体，用于体内对照。FITC-29-聚体也溶解在相同制剂中，施加到皮肤上，以观察 FITC-29-聚体于毛囊中的分布。
[0097] 欲进行局部给药时，将350mg含有25yMPEDF肽的软膏或凝胶轻轻地涂敷于每只 小鼠的背部皮肤。
[0098]〈组织学、免疫荧光与定量分析〉
[0099] 收集与脊椎线平行处的小鼠背部皮肤，以取得包含毛囊纵长范围的样本。背部皮 肤经4%甲醛固定后，以固态石蜡包埋，获得纵长切片。将组织切成约5-ym的薄片。于使 用前，于二甲苯中移除固定样品的石蜡，并以一系列浓度梯度的乙醇使样品再水化。利用 H&E染色进行一般组织学观察。利用Zeiss荧光显微镜（德国，耶拿）由样本中的代表性区 域撷取数字显微照片（固定倍率：l〇〇X)。
[0100] 欲分析毛囊的组织形成过程，于脱毛后第15天将动物安乐死。根据本领域所接 受的鼠类毛囊组织形态学分类标准（参见 ：Miiller-R6ver等，皮肤病学杂志（Journalof InvestigativeDermatology) (2001) 117, 3 - 15)来评估在组织形成过程中处于不同阶段 的毛囊的百分比。分析由6-10只经DHT处理的小鼠取得的至少24个纵切毛囊切片。欲证 明经DHT处理的皮肤中PEDF肽依赖性退化期延迟，由单一代表性皮肤切片中选取5至7个 连续显微视野，而后利用计算机辅助的影像分析器（AdobePhotoshopCS310.0)将这些显 微视野合并。
[0101] 进行免疫染色分析前，将脱腊的组织切片以10%山羊血清处理约1小时以进行阻 断。之后以抗C-kit的一级抗体（稀释比1 :100,红色）以及抗酪氨酸酶抗体（稀释比1 : 100)在37°C下培育2小时，进行双重染色，再和与若丹明结合的山羊抗兔IgG抗体（稀释 比1 :500)于室温下培育1小时，之后用苏木精（蓝色）进行约7分钟的对比染色。
[0102] 小鼠触须毛囊的冷冻切片以PBS冲洗三次。经甲醛固定与石蜡包埋的样本于二甲 苯中移除石蜡，并以一系列浓度梯度的乙醇再水化。接着使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶 介导的缺口末端标记（TdT-mediateddUTPni ck-endlabeling，TUNEL)试剂盒（购自罗氏 分子生物化学公司（RocheMolecularBiochemicals)，印第安纳州，印第安纳波利斯）并 根据制造商提供的使用说明进行染色。以Hoechst33258(蓝色）进行对比染色来观察细 胞数目。使用Zeiss荧光显微镜于3个不同的样品室中随机选取10个视野来计算细胞核 (固定倍率：400X;每一样品10个视野）；并利用Zeiss软件撷取影像。
[0103] 在以4%三聚甲醛固定后，将细胞置于冷的甲醇中2分钟，接着在室温下以1N氯化 氢处理约1小时，而后再进行免疫荧光。利用抗BrdU多克隆抗体与若丹明的驴抗兔IgG抗 体来检测经BrdU标记的DNA。
[0104] 进行动物试验时，将BrdU溶于DMS0中，得到浓度为80mM的BrdU储备溶液。将 10y1的BrdU和90y1的PBS溶液混合后经腹膜内注射至小鼠体内，并于16个小时后将小 鼠安乐死。经甲醛固定与石蜡包埋的样品于二甲苯中移除石蜡，并以一系列浓度梯度的乙 醇再水化。以PBS冲洗触须毛囊冷冻切片三次，接着在室温下以1N氯化氢处理约1小时， 而后再进行免疫组织化学分析。
[0105]〈细胞培养〉
[0106] 小鼠触须毛囊的培养方式如下。简言之，由老鼠脸部切下触须垫（whiskerpad)并 放置于含有PBS与1 %抗生素混合物的皮氏培养皿中。由触须垫中分离出每一个处于生长 期的触须毛囊，放置于24孔培养板中（每孔3个触须毛囊），并以DMEM培养基培养；上述 培养基中添加了胰岛素（10yg/ml)、皮质醇（10ng/ml，西格玛奥德里奇）、1 %青霉素/链霉 素抗生素混合物与L-谷酰胺（2mM);培养条件为37°C、5%二氧化碳。每一实验组中分别观 察10-15个毛囊，并重复三次。将DHT与PEDF肽溶于DMS0中并分别加入上述毛囊培养基 内，培养基中添加了胰岛素与皮质醇，且DMS0的最终浓度小于0. 05%。
[0107] 永生化的人类角质形成细胞系HaCaT在37°C下培养于10%FBS-DMEM中，再将细 胞接种到5%FBS-DMEM上，而后以PEDF肽或重组人TGF0 1(安迪生物科技有限公司，R&D Systems)处理细胞。
[0108] 〈统计分析〉
[0109] 将结果表示为平均值土平均值的标准差（SEM)。利用单向AN0VA分析来进行统计 比较。除非另有说明，P〈〇. 05时具有统计上的显著差异。
[0110] 实施例1
[0111] PEDF肽预防/缓和化疗引发之毛发脱落和毛发脱色
[0112] 本实施例采用6周龄雌性C57BL/6小鼠，其具有正常黑色毛发（S卩，末端毛干含有 大量黑色素）。在四次独立的试验中，共使用了80只小鼠。C57BL-6小鼠已被广泛用于化 疗引起的脱发和毛发脱色的研宄中。本试验仅使用毛发生长周期处于休止期的小鼠。由 于小鼠体内色素的制造（又称黑色素生成）仅发生在处于生长期的毛囊中，处于休止期的 C57BL/6小鼠背部皮肤呈现均匀的粉红色。通过脱毛处理诱导处于休止期的背部皮肤进入 生长期。
[0113] 为了得到同属生长期相同阶段的小鼠，利用电动剪毛机小心地刮掉背部的毛发。 在脱毛后第9天，由皮肤颜色由粉红色（休止期皮肤）转变为灰色（生长期VI前期）可判 断毛发进入生长期。
[0114] 在脱毛后第9天，对小鼠腹腔注射舒泰（用量为每公斤体重6毫克）与甲苯噻嗪 (用量为每公斤体重3毫克）混合液，以麻醉小鼠。将小鼠随机分派至不同实验组。CYP/ 载体组的小鼠接受腹腔注射抗癌药物环磷酰胺（CYP，一种抗癌药，每公斤体重150毫克）， 并同时于背部皮肤涂抹350mg抗生素软膏。CYP/44-聚体组的小鼠接受腹腔注射CYP((每 公斤体重150毫克），并同时于背部涂抹350mg含44-聚体的抗生素软膏。载体组与44-聚 体组的小鼠并未接受CYP腹腔注射，仅分别给予350mg的抗生素软膏与350mg含44-聚体 PEDF的抗生素软膏。之后连续七天每天在各组小鼠背部涂抹350mg抗生素软膏（含或不含 44-聚体PEDF)。在空白对照组中，小鼠并未接受CYP注射，也没有涂抹任何抗生素软膏。
[0115] 图1提供了各组小鼠于脱毛后第9天（即，CYP注射后第0天）、脱毛后第16天 (即，CYP注射后第7天）与脱毛后第45天（S卩，CYP注射后第36天）的照片。比较CYP/ 载体组与CYP/44-聚体组的小鼠可以发现，CYP/44-聚体小鼠在CYP注射后第7天与第36 天均具有较好的毛发生长情形。
[0116] 已知给予小鼠每公斤体重150mg的CYP可引发小鼠毛囊角质形成细胞凋亡与毛 囊萎缩。因此，利用TUNEL染色法将凋亡的细胞染色，以评估PEDF肽对角质形成细胞的保 护效果。图2提供了代表性荧光照片，定量分析的结果归纳于表1中。以标记指数来表示 TUNEL-阳性细胞的数量，此一数值是将经标记的细胞数目除以具有核的细胞的总数，并以 百分比（％ )表示。
[0117]表1
[0118]
[0119] *P〈0.0005,相较于CYP/载体组。
[0120] 以上结果显示，相较于仅以软膏处理的小鼠，经含44-聚体的软膏处理的小鼠体 内呈TUNNEL阳性的细胞明显减少。由此可知，给予PEDF肽可以保护角质形成细胞，使其免 于化疗药物（如，CYP)所带来的伤害，且因而可用以预防和/或缓和化疗所致的毛发脱落。
[0121] 黑素细胞干细胞负责供应分化后的后裔细胞（成黑素细胞与黑素细胞）至毛根， 且可调控其后裔细胞的分化周期。近期研宄指出，当小生境（niche)中的MSC异常地分化 为成熟的黑素细胞时，会导致MSC的数量减少和不可逆的毛发变灰色，此现象称为异位性 色素性黑素细胞（ectopicallypigmentedmelanocytes，EPM) 〇
[0122] 只有位于毛球内的黑色素才能将毛干染色。具体而言，毛球内的黑素细胞产生的 黑色素颗粒会被输送到角质形成细胞，以形成经染色的毛发。另外，完全分化的黑素细胞在 退化期中会经历细胞凋亡，而自萎缩的毛囊中移除。当毛囊出现生长期萎缩（dystrophic anagen)时，处于生长期的毛囊内黑色素含量会异常地降低且分布不均，而出现黑色素聚 集。而对于经历退化期萎缩（dystrophiccatagen)的毛发，黑色素将在毛球外聚集。
[0123]再次参照图1，在CYP注射后第36天时，CYP和CYP/载体组的小鼠有较多的灰白 色毛发；而CYP/44-聚体组的小鼠具有较为乌黑的毛发。这些结果意味着在CYP与CYP/载 体组中，MSC可能遭到CYP的破坏，因而无法供应足量的黑素细胞以产生黑色素。
[0124] 可通过黑素细胞系标记（c-kit)和酪氨酸酶来评估MSC的活性。参见图3,免疫 染色分析揭示，在CYP/载体组小鼠的发突内，几乎无法检测到c-kit以及酪氨酸酶表达，表 明其发突内MSC的活性相对低。相较之下，CYP/44-聚体组的小鼠发突中，可观察到c-kit 和酪氨酸酶表达。综而观之，这些数据显示，本发明PEDF肽能够有效地保护MSC，使其免受 CYP的伤害。
[0125] 总结来说，实施例1中的结果显示44-聚体PEDF肽能够有效低降低由CYP所致 的毛囊萎缩、黑色素聚集、毛囊细胞与角质形成细胞凋亡。因而，44-聚体PEDF肽能够预防 和/或缓和化疗引发的毛发脱落和/或毛发脱色。此外，由本发明人先前的研宄结果以及 下文实施例3的结果可以发现，衍生自此44-聚体的39-聚体以及多种衍生自39-聚体的 短肽片段都和44-聚体具有相似的生理活性。由此可以推知，这些短的PEDF合成肽（包括 SEQIDNO: 1 (39-聚体）、SEQIDNO:2 (34-聚体）、SEQIDNO:3 (29-聚体）、SEQIDNO: 5 (24-聚体）、SEQIDNO:6 (20-聚体）、SEQIDNO:8 (M0 29-聚体）与SEQIDNO:9 (M0 20-聚体））亦可有效地治疗化疗所引起的脱发和/或毛发脱色。
[0126] 实施例2
[0127] PEDF肽可预防/缓和压力引发的毛发脱落与毛发脱色
[0128] 已知有多种环境与内因因素可造成氧化压力进而加速老化过程；这些因素如紫外 线辐射、发炎或心理情绪。此外，对象的遗传组成也会影响对象对这些因素的耐受度。先前 的研宄显示，在老龄毛囊中存有浓度以毫摩尔计的过氧化氢。此外，已在动物模型中证实此 种内源性氧化压力可以增加毛囊中黑素细胞的凋亡，而最终会导致毛发变灰色。
[0129] 本实施例探讨了内源性因素（如氧化物）导致的压力和毛发脱落和毛发发灰之间 的关系。根据实施例1所述的方法选择小鼠并将其脱毛。在脱毛后第9天，对小鼠皮下注 射每公斤体重10毫升的过氧化氢。作为比较，在小鼠背部皮肤上分别涂抹350毫克抗生素 软膏（H202/载体组）或含44-聚体的抗生素软膏（H202/44-聚体组）。
[0130] 图4提供了各组小鼠于脱毛后第9天（H202注射当日）以及脱毛后第31天（H202 注射后第22天）的照片。比较H202/载体组和H202/44-聚体组可见，H202注射后第22天 H202/44-聚体组小鼠具有较好的毛发生长活性。此外，用含25yM44-聚体PEDF的抗生素 软膏处理的小鼠具有较黑的毛发颜色。由此可知，所述44-聚体PEDF能够有效预防和/或 缓和因压力（如，氧化压力）所引发的毛发脱落与毛发脱色。
[0131] 此外，由本发明人先前的研宄结果以及下文实施例3的结果可以发现，衍生自此 44-聚体的多种短PEDF肽和44-聚体具有相似的生理活性。因此，这些结果提示，这些短的 卩￡0卩合成肽（包括5￡〇10勵：1(39-聚体）、5￡〇10勵：2(34-聚体）、5￡〇10勵：3(29-聚 体）、SEQIDNO:5 (24-聚体）、SEQIDNO:6 (20-聚体）、SEQIDNO:8 (M0 29-聚体）与 SEQIDN0:9(M0 20-聚体））亦可有效地治疗压力所引起的脱发和/或毛发脱色。
[0132] 实施例3
[0133] PEDF肽可预防/缓和雄性秃
[0134] 本实施例中进行了多项体外与体内分析，以评估本发明PEDF肽对雄性秃的影响。
[0135] 实施例3.1
[0136] PEDF肽可体外拮抗DHT引发的生长停止与角质形成细胞凋亡
[0137] 分别将PEDF肽（29-聚体、24-聚体、20-聚体或Mo20-聚体）加入雄性小鼠触须 毛囊（HF)的组织培养物中培育16小时，之后加入100nM的DHT再进一步培养48小时。在 高倍率下进行组织分析，可以发现相较于未经处理的毛囊，DHT会导致毛基质细胞排列不规 则并出现黑色素聚集（图5)。相较之下，经20-聚体PEDF预处理的HF中，毛基质的大部分 区域中角质形成细胞的排列较为规则，且异常的黑色素粒子较少（图5)。
[0138] 对冷冻切片样品进行免疫分析，以检测TUNEL-与BrdU-阳性细胞，藉以评估HF上 皮细胞的细胞凋亡与细胞增殖能力。定量分析结果如表2所示。将经标记的细胞数目除以 具有核的细胞总数计算得到TUNEL-与BrdU-阳性细胞的标记指数（％ )。
[0139] 表 2
[0140]
[0141] *P〈0.00001，相较于未处理组；#P〈0.00007,相较于DHT/载体组。
[0142]#P〈0. 05,相较于未处理组，P〈0. 002,相较于DHT/载体组。
[0143] 由表2可以看出，于体外，毛基质内角质形成细胞的自发性凋亡比例非常低 (1.7±0. 76%;未处理组）；但在经过100nMDHT处理后，围绕在皮突（dermalpapilla，DP) 附近的角质形成细胞有大量死亡（28. 5±4. 90% ;DHT/载体组）。此外，经过本发明PEDF肽 (如29-聚体、24-聚体、20-聚体或Mo20-聚体）处理的触须毛囊，其TUNEL-阳性角质形 成细胞的数目则远远少于以 载体或18-聚体PEDF肽处理者。这些结果显示本发明PEDF处 理能够有效减少DHT引发的角质形成细胞凋亡。
[0144] 由表2的结果亦可发现，相较于未处理组的毛囊，毛基质中角质形成细胞的细胞 分裂也会受到DHT抑制（未处理组：15. 8±2. 08% ;DHT/载体组：9. 0±1.92%)。另一方 面，经本发明PEDF肽处理的细胞有较高的BrdU标记指数，意味着此处理可改善毛囊角质形 成细胞的增殖活性。
[0145] 已知DHT可诱发皮突细胞（dermalpapillacells，DPC)转型生长因 子-0 1(transforminggrowthfactor-0 1，TGF-0 1)的表达，而TGF-0 1 是一种退化期诱 发剂，会抑制雄性秃患者的毛发生长与毛囊角质形成细胞生长。为了进一步确认PEDF衍生 肽是否能够保护角质形成细胞免于DHT介导的生长抑制，藉由引入BrdU来分析人上皮角质 形成细胞（HaCaT)的细胞分裂对TGF-M和PEDF衍生肽的反应。定量分析的结果摘要整 理于表3,其中BrdU-阳性细胞的标记指数（％ )是将经标记的细胞数目除以具有核的细胞 总数，并以百分比（％)表示。
[0146]表3
[0147]
[0148] *P〈0.002,相较于未处理组；#P〈0.0001，相较于TGF-0 1处理组。
[0149] 如表3所示，与未处理组细胞相比，经TGF-M(4ng/ml，24小时）处理的HaCaT细 胞中BrdU-阳性细胞的比例大幅降低。在TGF-0 1+20-聚体组中，当细胞先以20-聚体处 理16小时时，TGF-M就无法抑制HaCaT细胞的增殖活性。
[0150] 综上所述，PEDF衍生肽可以阻断DHT(与TGFM)对角质形成细胞的抗增殖作用。
[0151] 实施例3. 2
[0152] PEDF肽体内延迟DHT引发的退化期发展
[0153] 采用5a-二氢睪酮（DHT)动物模型来进行体内分析。全身麻醉后，利用融化的蜡 /松脂混合物（1 :1)给毛发生长周期处于休止期的6周龄雄性C57BL/6小鼠（体重15-20 克）脱毛，以诱发生长期。将DHT溶于DMSO中，以得到50mg/ml的储备溶液。在脱毛后第 11天，将DHT溶液（1. 5mg的DHT与200y1的橄榄油混合；用量为每公斤体重30mg)由经剃 毛的背部区域皮下注射到小鼠体内（每种实验条件下6 - 10只小鼠）。在DHT注射后，将 350mg的载体凝胶或350mg含有25yM的PEDF肽（29-聚体、24-聚体、20-聚体或18-聚 体）的凝胶局部施用于小鼠背部皮肤，连续三天，每天给药一次。
[0154] 如图6所示，脱毛后第15天（S卩，DHT注射后第4天）进行的组织分析结果显 示，来自未经DHT处理的小鼠的毛囊由生长期和自发进展的退化期组成；而DHT/载体以及 DHT/18-聚体处理的小鼠则如所预期的那样进入退化期。相反，在经过29-聚体与20-聚体 处理的小鼠中，毛囊主要处于生长期，此一结果显示DHT所致的退化期进程受阻。针对不同 实验组别中，对处于每一生长周期的毛囊百分比进行定量分析，结果摘要整理于表4。
[0155]表 4
[0156]
[0157] *P〈0.001，相较于未处理组；#P〈0.02,相较于DHT/载体组。
[0158]#P〈0. 005,相较于DHT/ 载体组。
[0159] 表4中的数据表明，在DHT/29-聚体、DHT/24-聚体与DHT/20-聚体组中，毛囊有 明显较高的比例处于生长期与退化期早期（退化期I至III期）。另一方面，在载体以及 18-聚体组中，小鼠的毛囊多数处于退化期中期至晚期（S卩，退化期IV至VIII期）。
[0160] 为了确认上述组织形态分析的结果，在脱毛后第15天进行了BrdU与TUNEL染色。 定量分析的结果摘要整理于表5。毛基质（HM)和外根鞘（ORS)内TUNNEL-阳性细胞的数量 表示每个毛囊内的TUNNEL-阳性细胞数。用标记的细胞的数量除以具有核的细胞的总数来 计算毛球（HB)内BrdU-阳性细胞的标记指数（％ )。
[0161]表5
[0162]
[0163] *P〈0. 0002,相较于未处理组；**P〈0. 007,相较于DHT/载体组。
[0164]#P〈0. 002,相较于未处理组，P〈0. 004,相较于DHT/载体组。
[0165] 比较未处理组与DHT/载体组，可以看出后者毛基质和外根鞘（ORS)内TUNEL-阳 性细胞数量急剧增加，且接近生长期毛囊的增殖活性降低，这些结果显示DHT注射会促进 退化期发展。在经过DHT注射以及20-聚体、24-聚体或29-聚体处理的小鼠中，每个毛囊中 几乎都没有TUNEL-阳性的细胞（每一毛囊中平均不到1个），且可观察到密集的BrdU-阳 性角质形成细胞，这证实了本发明PEDF肽能够拮抗DHT引发毛囊退化的效果。
[0166] 综上所述，通过局部给予本发明PEDF衍生肽（如29-聚体、24-聚体与20-聚体） 可阻断细胞增殖停止与毛囊角质形成细胞凋亡所佐证的DHT引发的退化期过渡。这些结果 证实，本发明PEDF衍生肽可延迟DHT诱发的提早生长期向退化期的过渡。
[0167] 实施例3. 3
[0168] PEDF肽体内保持毛囊发展
[0169] 为了评估PEDF肽于重新启动毛发生长方面的功效，根据实施例3. 2所述的方法对 C57BL/6小鼠脱毛。脱毛后第11天，将DHT溶液（1. 5mg的DHT与200y1的橄榄油混合； 用量为每公斤体重30mg)由经剃毛的背部区域皮下注射到小鼠体内（每种实验条件下6 - 10只小鼠）。且在试验过程中，每周对小鼠施注射两次DHT溶液。在第一次DHT注射后，将 350mg的载体凝胶或350mg含有25yM的PEDF肽（29-聚体、24-聚体、20-聚体或18-聚 体）的凝胶局部施用于小鼠背部皮肤，并连续14天，每天给药一次。利用数字相机记录被 毛的改变，计算除毛面积中，呈现黑色部分（即，重新长出毛发之部位）的百分比（图7)， 并根据以下标准来评估在DHT注射后，毛发重新生长的分数：0% (没有毛发生长）者0分； 〈20%者1分；20-39%者2分；40-59%者3分；60-79%者4分；80-100%者5分。另上述 方法来计算深层皮下组织内，每单位长度（1_)中毛球的数目。结果摘要整理于表6。
[0170]表6
[0171]
[0172] *P〈0. 0001，相较于未处理组；**P〈0. 02,相较于DHT/载体组。
[0173]卞尸<0.0005,相较于未处理组；tt尸<0.002,相较于DHT/载体组。
[0174] 图7与表6的结果显示，背部脱毛能够诱使毛囊进入生长期（未处理组）。相反 地，在脱毛后第18天，经DHT/载体与DHT/18-聚体处理的小鼠的毛发再生明显受到延迟； 此现象在众所接受的雄性秃动物模型中是预期的结果。另一方面，经DHT注射的小鼠在每 日接受局部表面涂抹29-聚体、24-聚体或20-聚体之后，上述毛发生长延迟的情形皆有改 善，且可观察到显著的毛发生长。统计分析的结果显示，相较于DHT/载体的对照组，经DHT 注射且接受29-聚体、24-聚体与20-聚体处理的小鼠于脱毛后有较佳的毛发生长分数。
[0175] 继续参照表6,相较于载体与18-聚体组，经29-聚体、24-聚体或20-聚体处理的 小鼠的毛球数量也明显增加（1.6倍）。这些结果显示，本发明PEDF肽能够保护毛囊，使大 多数的毛囊能够躲过DHT的影响，并进入生长期。
[0176] 总结来说，实施例3 (包括实施例3. 1至3. 3)中的各种数据证实本发明PEDF肽能 够有效治疗DHT引发的毛发脱落。因此，以局部给药的形式施用PEDF肽能够预防或缓和雄 性秃所导致的毛发脱落。
[0177] 本公开首度证实以局部给予短PEDF合成肽对于毛囊有治疗效果。相较于传统上 需以静脉内或肌肉内注射来投递表达全长PEDF肽的载体，局部施用短PEDF合成肽不但较 为安全，且成本也相对低廉。
[0178] 应理解，上述实施方式仅仅是以实施例的方式提供，本领域技术人员可作出各种 改动。上述说明书、实施例和数据完整地描述了本发明示例性实施方式的结构和用途。虽 然较详尽地或结合一个或多个实施例描述了本发明的各实施方式，但本领域技术人员在不 悖离本发明原理与精神的情形下可对所公开的各实施方式作出各种改动。
【主权项】
1. 用于治疗对象的脱发和/或毛发脱色的合成肽，由长20 - 44个氨基酸残基并与SEQ IDN0:10具有至少80%氨基酸序列相同性的氨基酸序列组成，其中，所述氨基酸序列含有 的至少20个连续残基与SEQIDNO: 10的残基16 - 35具有至少90%的氨基酸序列相同 性。2. 如权利要求1所述的合成肽，其特征在于，该合成肽的至少4个连续残基与SEQID NO: 10的残基16 - 19相同。3. 如权利要求1所述的合成肽，其特征在于，所述脱发是生长期脱发或雄性秃。4. 如权利要求1所述的合成肽，其特征在于，所述毛发脱色由化疗、放疗、压力、遗传或 老化所致。5. 如权利要求1所述的合成肽，其特征在于，所述对象是人。6. -种用于对象的脱发和/或毛发脱色的局部给药的药物组合物，含有： 有效量的权利要求1所述的合成肽；和 药学上可接受的赋形剂。7. 如权利要求6所述的局部给药的药物组合物，其特征在于，该合成肽的至少4个连续 残基与SEQIDNO: 10的残基16 - 19相同。8. 如权利要求6所述的局部给药的药物组合物，其特征在于，该局部给药的药物组合 物为溶液、喷剂、气雾剂、泡沫、霜剂、洗剂、软膏、凝胶或敷料的形式。9. 如权利要求6所述的局部给药的药物组合物，其特征在于，所述脱发是生长期脱发 或雄性秃。10. 如权利要求6所述的局部给药的药物组合物，其特征在于，所述毛发脱色由化疗、 放疗、压力、遗传或老化所致。11. 如权利要求6所述的局部给药的药物组合物，其特征在于，所述对象是人。12. -种治疗对象的脱发和/或毛发脱色的方法，其特征在于，所述方法包括： 给予该对象有效量的权利要求1所述的合成肽。13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，该合成肽的至少4个连续残基与SEQID NO: 10的残基16 - 19相同。14. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述合成肽被配制成含有该合成肽和药 学上可接受的赋形剂的局部给药的药物组合物。15. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，该局部给药的药物组合物为溶液、喷剂、 气雾剂、泡沫、霜剂、洗剂、软膏、凝胶或敷料的形式。16. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述药物组合物中所述合成肽的浓度为 0. 1-100yMo17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述浓度为1-25yM。18. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述脱发是生长期脱发或雄性秃。19. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述毛发脱色由化疗、放疗、压力、遗传或 老化所致。20. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述对象是人。
【专利摘要】提供了一种衍生自PEDF的合成肽，其具有20–44个氨基酸残基。还提供含有所述合成肽的药物组合物及其用途。所述肽可用于治疗对象的脱发和/或毛发脱色。
【IPC分类】A61K38/17, C12N5/074, C07K14/435, C07K7/08, A61K38/10, A61P17/14
【公开号】CN104903345
【申请号】CN201280077072
【发明人】曹友平, 何宗权
【申请人】财团法人台湾基督长老教会马偕纪念社会事业基金会马偕纪念医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2012年9月17日
【公告号】EP2895502A1, US20150239946, WO2014040302A1
最新回复(0)