Pedf衍生的多肽在预防和/或缓和皮肤老化中的用图
Pedf衍生的多肽在预防和/或缓和皮肤老化中的用图
【专利说明】PEDF衍生的多肽在预防和/或缓和皮肤老化中的用途
[0001] 发明背景 1、发明领域
[0002] 本公开涉及预防和/或缓和皮肤老化。具体而言，所公开的发明涉及使用PEDF衍 生的合成肽来预防和/或缓和皮肤老化。
[0003] 2、相关技术的描述
[0004] 人类皮肤和其它活体组织一样，会随着时间而老化。皮肤老化导致皱纹与细纹形 成、皮肤变薄、皮肤脱色或色素沉着过多，并且失去紧致与弹性。可根据皮肤老化的成因，将 其分为内因性老化与外因性老化。内因性老化又称为自然老化，此一过程会影响几乎所有 内部器官，主要受到个体遗传组成的调控。外因性老化则是暴露于多种环境因子、尤其是紫 外线（UV)辐射所导致的老化，，故此一过程又称为光老化。暴露于阳光的部分，譬如脸部、 颈部、手背等，会受到内因性老化与光老化的双重影响，因此在这些部分老化的痕迹也特别 明显。
[0005] 胶原蛋白是构成结缔组织的主要成分，其外观呈纤维状，属于细胞外的不可溶蛋 白质。在各种胶原蛋白中，I型与III型胶原蛋白最为重要。I型胶原蛋白是人类皮肤最 主要的结构蛋白质，占皮肤干重中90%以上的重量；而III型胶原蛋白广泛分布于身体各 部位，在胚胎组织内的含量较为丰富。随着皮肤老化，皮肤中总体胶原蛋白的含量减少，且 I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的比例也会下降；再者，细胞外基质（ECM)也会变得较不规 贝1J。举例来说，内因性老化与紫外线B(UVB)暴露会削弱胶原蛋白纤维（尤其是I型胶原蛋 白纤维）的更新。此外，UVB暴露会提高多种降解胶原蛋白的酶的生产，这些酶已知被称为 基质金属蛋白酶（MMP)。在UVB暴露后数小时内，即可诱导人体产生基质金属蛋白酶（特别 是胶原酶与明胶酶）。以上现象都可能导致皮肤细胞外基质组成的改变。
[0006]目前已有多种可对抗皮肤老化的处置方式。举例来说，由于胶原蛋白的在老化中 的重要性，已开发出多种含有胶原蛋白的局部给药产品。许多美妆保养产品也采用了据称 可刺激胶原蛋白合成的成分，如视黄酸、维他命C与透明质酸等。另外还有一些美容手术 (如激光换肤），亦可有效减少脸部皱纹与皮肤不平整。
[0007] 虽然已有许多减少老化痕迹或刺激皮肤再生的解决方案，但现有的方法都无法启 动皮肤的内生修补机制（即，胶原蛋白合成）。因此，本领域亟需一种能够有效治疗皮肤老 化（尤其是光老化）的措施。
【发明内容】
[0008] 下文提供本公开的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明 内容并非本公开的完整概述，且其未指出本发明的重要/关键组件或界定本发明的范围。 本部分内容的目的仅是以简化形式阐明一些概念，更详细的内容将在后文予以呈现。
[0009] 本发明至少部分是基于发现色素上皮衍生因子（PEDF)衍生的合成肽能够刺激胶 原蛋白生成、促进皮肤成纤维细胞增殖，以及降低UVB引发的MMP-1表达；因此这些肽能够 有效预防和/或缓和个体的皮肤老化。因此，本发明PEDF衍生的合成肽能够作为抗皮肤老 化的制剂或药物。
[0010] 有鉴于此，一方面，本发明涉及一种用于预防和/或缓和个体的皮肤老化的合成 肽。
[0011] 根据本公开多个实施例，所述的合成肽长度为20 - 39个氨基酸残基，且具有与 SEQIDNO: 1至少80%相同的氨基酸序列。此外，上述氨基酸序列包含的至少20个连续的 残基与SEQIDNO: 1的残基11-30至少90%相同，而使得此合成肽能用于预防和/或缓和 个体的皮肤老化。
[0012] 在本公开可任选的实施例中，上述合成肽中有至少四个连续的氨基酸与SEQID NO: 1的残基11-14相同。此种合成肽的非限制性例示包括具有SEQIDNO: 1(39-聚 体）、5￡〇10勵：2(34-聚体）、5￡〇10勵：3(29-聚体）、5￡〇10勵：5(24-聚体）、5￡〇10 勵:6(2〇-聚体）、5￡〇1〇勵:8 0\?)29-聚体）与5￡〇1〇勵:9(]\?)2〇-聚体）所示的氨基酸 序列的合成肽。根据本公开某些实施例，上述合成肽的氨基酸序列为SEQIDN0:3(29-聚 体）、SEQIDNO: 5 (24-聚体）或SEQIDNO: 6 (20-聚体）。
[0013] 依据本公开多种实施例，所述的皮肤老化是由紫外线辐射所致。
[0014] 根据本公开多种实施例，所述的个体可以是任何归类为哺乳动物的动物，包括人 类。
[0015] 另一方面，本公开涉及一种用以预防和/或缓和个体皮肤老化的药物组合物。所 述的个体可以是任何哺乳动物，包括人类。
[0016] 根据本公开一实施方式，上述药物组合物包含任一根据本发明上述方面/实施例 的合成肽，且此合成肽以足以治疗该个体的皮肤老化的有效量存在。此药物组合物亦包含 可用以携带该合成肽的药学上可接受的赋形剂。
[0017] 在某些任选实施例中，该药物组合物还含有至少一种用于促进本发明合成肽或药 物组合物流动（flux)的穿透增强剂。
[0018] 依据本公开多种实施例，所述的药物组合物可以是以下任一种剂型：溶液、喷剂、 气雾剂、泡沫、面霜、洗剂、软膏、凝胶或敷料。
[0019] 又一方面，本发明涉及一种用以预防和/或缓和个体皮肤老化的方法。所述的个 体可以是任何哺乳类动物，包括人类。
[0020] 于一实施例中，上述方法包含对该个体给予有效量的根据本发明上述方面/实施 例的合成肽，以使得此合成肽经皮递送至该个体的真皮。
[0021] 于可任选的实施例中，可将合成肽调制为根据上述方面/实施例所述的药物组合 物。于一实施例中，可将此药物组合物局部给予个体的皮肤上。在可任选的实施例中，此方 法还包含于上述局部给予该药物组合物之前、同时或之后，对该个体的皮肤施加外来刺激 (如，机械、电、热、超声波或无线射频刺激），藉以促进所述合成肽或药物组合物的经皮递 送。同样可任选地，此药物组合物还可包含至少一种穿透促进剂，以促进此合成肽或组合物 的流动。
[0022] 依据本发明多种实施例，所述的皮肤老化是由紫外线辐射所致。
[0023] 在参阅下文详细描述，并结合附图后，本公开许多附带的特征和优点将更易于理 解。
[0024] 附图简要说明
[0025] 本专利或申请文件包含至少一幅彩图。在提出请求并缴纳所需费用后，专利局将 提供带有彩图的此专利或专利申请出版物的副本。
[0026] 结合附图及下文详述，本说明书将更易于理解。
[0027] 图1显示本公开一实施例中皮肤样本的经H&E染色的切片照片（左图）以及荧光 照片（中间、右图）；
[0028] 图2显示本公开另一实施例中经麦森（Masson)三色染色以突出胶原蛋白纤维的 皮肤组织切片的代表性照片；
[0029] 图3为原代皮肤成纤维细胞免疫染色（波形蛋白：绿色；BrdU:红色）的代表性照 片以及与Hoechst33258(细胞核：蓝色）染色样本的合并照片；
[0030] 图4的代表性照片呈现各实验条件下小鼠的皱纹形成；以及
[0031] 图5显示本公开又一实施例中经麦森三色染色以突出胶原蛋白纤维的皮肤组织 切片的代表性照片。
[0032] 详述
[0033] 下文结合附图详细描述的内容仅仅是对本实施例的描述，并非是实施或运用本发 明具体实施例的唯一形式。此部分公开了实施例的功能以及用于建构与操作这些具体实施 例的步骤的顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或等同的功能与顺序。
[0034] 出于方便，本申请（包括说明书、实施例和权利要求书）所用的某些术语汇集于 此。除非本说明书另有定义，本公开所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域 中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。此外，除非另有说明，应理解的是，所用的单 数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。具体而言，如本 文及权利要求书所用，除非另有说明，单数形式"一"包括其复数形式。
[0035] 虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数界是约略的数值，具体实施例的 相关数值已尽可能精确地呈现。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所 致的标准偏差而导致的误差。同时，本文中，"约"通常指实际数值在一给定数值或范围的正 负10%、5%、1%或0.5%之内。或者是，"约"代表实际数值落在平均值的可接受标准误差 之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实施例之外，或除非另有 明确的说明，当可理解本文所用的所有数值范围、数量、数值与百分比（例如用以描述材料 用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例等）均经过"约"的修饰。因此，除非另有相反的 说明，本公开与权利要求书所涉及的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更改。至少应 将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
[0036] 本文中，术语"肽"指氨基酸残基的多聚物。本文中，术语"合成肽"指未包含存在 于自然界的完整蛋白质分子的肽。此种肽是"合成的"，因为其由人类利用技术手段所得，譬 如化学合成、重组遗传技术或将整个蛋白切段等。于本公开中，任何指定氨基酸残基于一肽 中的位置系由该肽的N端起算。
[0037] 本文所用"增殖"指族群中的细胞数目通过细胞分裂而增加。
[0038] 本文针对合成多肽序列所述的"氨基酸序列相同性百分比（％ )"系指该候选合 成肽的氨基酸残基与参考多肽的氨基酸残基完全相同的百分比。进行上述比对时，可将该 候选合成肽与该参考多肽并排，并于必要时引入间隙（gap)，以使两条序列形成最高的序列 相同性，且在计算相同性时，并未将保守性取代的氨基酸残基纳入考虑。可采用本领域已 有的多种方法进行上述比对，以确定序列相同性百分比，譬如可使用可公开取得的软件如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)。本领域技术人员可确定比对时的适当参 数，包括需要在对比序列的整个长度上获得最大比对所需的各种算法。为了本文的目的，二 氨基酸序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心（NCBI)所提供的计算机程序 Blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)来进行。给定氨基酸序列A相较于给定氨基酸序列B的 氨基酸序列相同性百分比（亦称为给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B具有特定百分比 (% )的氨基酸序列相同性）的计算方式如下：
[0039]
[0040] 其中X是利用比对程序BLAST对A和B进行比对后所得到的计为完全匹配的氨基 酸残基的数量，而Y是A或B中较短者的氨基酸残基总数。
[0041]本文所用"治疗"指将本公开合成肽或药物组合物给予或施用于一个体，此个体具 有皮肤老化的征兆或易于发生皮肤老化，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻皮肤老化 的一或多种征兆或特征，或延缓其发生、抑制其进展、减轻其严重性和/或减低其发生率。 [0042]本文所用术语"有效量"指一成分的用量足以产生所欲的反应。具体的有效量取 决于多种因素，诸如欲治疗的特定病症、患者的身体条件（如患者体重、年龄或性别）、接受 治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、共同施与的疗法（如果有的话）的本质以及 所用的具体配方。有效量亦指于此用量下，该化合物或组合物的毒 性或负面效果不及于其 所带来的正面疗效。
[0043]术语"施用"或"给药"在本文中可互换使用，指将本发明合成肽或药物组合物提 供给个体，以预防和/或缓和皮肤老化的措施。根据本公开各实施方式，较佳的递送方式为 经皮递送。例如，将本发明合成肽或药物组合物局部施用至个体的皮肤上，并使该合成肽或 本发明的药物组合物到达目标部位（如，真皮），以预防和/或缓和皮肤老化。
[0044]本文所用术语"赋形剂"指可作为本公开所述合成的PEDF肽的媒剂/载体的任何 惰性物质（如粉末或液体）。赋形剂通常是安全、无毒的，且广义上可包括制药产业中用于 制备药物组合物的任何已知物质，如填充剂、稀释剂、凝结剂、黏合剂、润滑剂、助流剂、稳定 剂、着色剂、润湿剂、崩解剂等。
[0045]在本文中，"药学上可接受"的成分指其适用于人类和/或动物，且在合理的效益/ 风险比之下不会产生不当的副作用（如毒性、刺激与过敏反应）。此外，每一种赋形剂必须 和药学配方中的其它成分兼容，才是"可接受"的。载体可以是固体、半固体、液体稀释剂、 霜或胶囊的形式。
[0046]术语"个体"指可接受本发明的合成肽、组合物和/或方法来进行治疗的哺乳动物 (包括人类）。除非另有指明，术语"个体"包含雄性与雌性。
[0047]本文所用术语"经皮"指一活性制剂（如本发明合成肽或药物组合物）通过表皮 到达真皮。
[0048]色素上皮衍生因子（PEDF)是一种多功能的分泌性蛋白质，其具有抗血管新生、抗 肿瘤生成与神经滋养功能。人PEDF蛋白质（SEQIDN0:11)是一种大小约50kDa的分泌性 蛋白质，长418个氨基酸。已知PEDF的34-聚体片段（第44 - 77号残基）与44-聚体片 段（第78 - 121号残基；SEQIDNO: 10)分别具有抗血管新生与神经滋养性质。
[0049] 本公开至少部分是基于发现来自PEDF的44-聚体合成肽能够透过多种机制来保 护皮肤免受皮肤老化所致的损伤。本公开提供的实施例证明，所述合成肽可增加真皮中胶 原蛋白的水平，诱导真皮成纤维细胞增殖，以及降低MMP-1 (可被UVB诱发的胶原酶）的表 达。本发明的另一创新特征在于所述合成肽比全长PEDF短了许多（最多有39个氨基酸残 基）；因此，本发明克服了传统蛋白质药物在临床使用上经常面临的困境，诸如制造成本高 昂、生物利用率低与药物动力学表现不佳等。因此，这些合成肽可用以预防和/或缓和皮肤 老化。
[0050] 因此，一方面，本公开涉及一种用于预防和/或缓和个体皮肤老化的合成肽。
[0051] 根据本公开多个实施例，此合成肽有20 - 39个氨基酸残基，且其氨基酸序列与 SEQIDN0:1(LSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)有至少 80%的氨基酸序列相 同性。举例来说，此合成肽与SEQIDN0:1的氨基酸序列相同性可为约80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。另外，此合成肽包含的至少 20个连续的氨基酸残基与SEQIDNO: 1第11-30个残基有至少90%的相同性。具体来说， 这20个连续氨基酸残基与SEQIDNO: 1第11 - 30个残基的氨基酸序列相同性可为约90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。
[0052] 在一实施例中，所述的合成肽具有SEQIDN0:1所示的序列，其长39个氨基酸。下 文亦将此合成肽称为39-聚体。此种39-聚体肽对应于人PEDF的第83-121位残基，因此 是已知PEDF的44-聚体片段（PEDF第78 - 121号残基）的一种较短的变体。
[0053] 本发明人先前所做的实验（如待批美国专利申请第13/428996号，在此将该在先 申请的内容一并纳入为本说明书的一部分）与本文所提供的实验显示，其它数种来自此 39-聚体的短PEDF合成肽也能够用以预防和/或缓和皮肤老化。
[0054] 譬如，由下文与在先申请的实验可知，SEQIDN0:2(ALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDL ISSPDIHGT)所示的34-聚体合成肽能够有效地预防和/或缓和个体的皮肤老化。此34-聚 体合成肽对应于人PEDF的第88 - 121号残基。根据上文所述的计算两条给定序列之间的 序列相同性百分比的方法，此34-聚体与39-聚体的氨基酸序列相同性为100%，且34-聚 体的第6 - 25号氨基酸残基与39-聚体的第11 - 30号氨基酸残基的氨基酸序列相同性也 是 100%〇
[0055]此外，下文多个实施例证明，SEQIDN0:3(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所 示的29-聚体合成肽能够有效预防和/或缓和个体的皮肤老化。此29-聚体合成肽对应 于人PEDF的第93 - 121号氨基酸残基；其与39-聚体的氨基酸序列相同性为100%。且此 29-聚体的第1 - 20号氨基酸残基与39-聚体的第11 - 30号氨基酸残基的氨基酸序列相同 性亦为100%。
[0056] -些实施例中，已证实24-聚体亦可有效预防和/或缓和个体的皮肤老化。此 24-聚体的序列如SEQ ID N0:5(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSP)所示，且对应于人PEDF第 93 - 116号氨基酸残基。此外，此24-聚体肽与39-聚体具有100%的氨基酸序列相同性， 其中其前20个氨基酸残基与所述39-聚体第11 - 30号氨基酸残基具有100%的氨基酸序 列相同性。
[0057] 在其它实施例中，已证实20-聚体亦可有效预防和/或缓和个体的皮肤老化。该 20-聚体具有SEQIDN0:6所示的序列（SLGAEQRTESIIHRALYYDL)。此20-聚体的序列对应 于人PEDF第93- 112号氨基酸残基，其与39-聚体的第11 -30号氨基酸残基完全相同（氨 基酸序列相同性：100% )且其相较于39-聚体的氨基酸序列相同性同样也是100%。
[0058] 本案与在先申请所揭载的实验亦显示，另外有两种衍生自小鼠PEDF的合成肽同 样也能够有效地预防和/或缓和个体的皮肤老化。第一种衍生自小鼠的肽在本公开中称 为Mo29-聚体，其序列如SEQIDN0:8(SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST)所示，此序列与 39-聚体的氨基酸序列相同性为83%，且其前20个氨基酸残基与39-聚体第11 - 30位残 基的氨基酸序列相同性为90%。另一种衍生自小鼠PEDF的合成肽称为Mo20-聚体，其序 列如SEQIDN0:9(SLGAEHRTESVIHRALYYDL)所示。Mo20-聚体与 39-聚体或 39-聚体的第 11 - 30号氨基酸残基的氨基酸序列相同性皆为90%。
[0059] 在可任选的实施例中，所述的合成肽中有至少四个连续的氨基酸与SEQIDNO: 1 的氨基酸残基11-14相同。据信SEQIDNO: 1所示序列的第11-14号氨基酸残基（即 SLGA)对于维持短PEDF合成肽的生物学功能扮演了重要的角色。举例来说，下文提出的多 个实施例显示，不具有此SLGA残基的18-聚体肽（EQRTESIIHRALYYDLIS;SEQIDN0:7)无 法保护个体对抗皮肤老化。此外，由本案与在先申请所载的实验可以发现，不含SLGA残基 的25-聚体肽（EQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT;SEQIDN0:4)也无法有效预防和/或缓和个 体的皮肤老化。
[0060] 可利用常用技术来合成本发明的合成肽，譬如使用t-B0C或FM0C来保护a-氨 基。这两种方法都采用了逐步合成法，由该肽的C端开始，每次加上一个氨基酸。亦可利用 已知的固态肽合成法来合成本发明的合成肽。
[0061] 本发明的范围亦涵盖了其它相较于39-聚体具有保守性突变的合成肽。本文所用 术语"保守性突变"指利用另一种在生物学上相似的残基来取代某一残基。保守性突变的 例示包括疏水性残基（如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸与甲硫氨酸）彼此间的置换，或极性残 基（如精氨酸与赖氨酸；或谷氨酸与天冬氨酸，或谷氨酰胺与天冬酰胺）彼此间的置换等。 "保守性突变"在此亦指利用取代的氨基酸来取代未取代的原始氨基酸，只要针对该取代的 多肽产生的抗体也能与该未取代的多肽发生免疫反应即可。
[0062] 依据本发明多种实施例，所述的皮肤老化是由紫外线（特别是UVB)照射所引起 的。
[0063] 依据本公开多种实施例，所述的个体可以是归类为哺乳动物的任何动物，包括人。
[0064] 亦可将上述实施方式所述的各种合成肽配制成一药物组合物，用以预防和/或缓 和个体皮肤老化；此种药物组合物即属于本发明另一方面之范围。
[0065] 根据本公开一实施方式，上述药物组合物包含任一根据本发明上述方面/实施例 的合成肽，且此合成肽的含量足以预防和/或缓和该个体的皮肤老化。此药物组合物亦包 含可用以携带该合成肽的药学上可接受的赋形剂。
[0066] 可根据既有的药学程序来制备上述药物组合物，譬如《雷明顿制药科学》 (Remington'sPharmaceuticalSciences)(第 17 版，AlfonosoR.Gennaro编，麦克出版 公司（MackPublishingCompany)，伊斯顿，宾夕法尼亚（1985)) -书中有详细的记载。 [0067] 在选择适用于投递合成肽的赋形剂时，主要需考虑此药物组合物的给药方式。根 据本发明的可任选实施例，该药物组合物或含于其中的该合成肽可经皮递送至个体的真 皮；因而，此处可使用任何适用于此途径的赋形剂。可使用皮肤学上可接受的各种惰性赋形 剂。典型的惰性赋形剂可以是例如水、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、矿物油、硬脂醇、及可 形成胶状物的材料。
[0068] 于可任选的实施例中，可先将合成肽包埋在可形成微泡的载体中，如脂质体、微球 体或纳米体（nanosome)，而后再配制成所欲的剂型。这些可形成微泡的载体可促进本发明 合成肽的经皮递送效率。此外，它们可作为缓释剂型，以确保该治疗可提供较长效的治疗作 用。
[0069] 在一替代性或可并用的方案中，此药物组合物还可包含一种可任选的穿透促 进剂，其能够促进合成肽或药物组合物的经皮递送效率。举例来说，穿透促进剂能够 打乱原本规则排列的角质层脂质、和细胞间蛋白质相互作用，或提升药物、共同促进剂 (co-enhancer)或载体进入角质层的比例（partition)。穿透促进剂的例子包括但不限 于：亚砜化合物如：二甲亚砜（DMS0)与二甲基甲酰胺（DMF);氮酮化合物，如：1_正十二 烷基氮杂环庚烷-2-酮；吡咯烷酮，如：N-甲基-2吡咯烷酮；油，如：萜油与L-薄荷醇；恶 唑烷酮，如：4_癸基恶唑烷-2-酮；脂肪酸，如：月桂酸、肉豆蔻酸与癸酸；乙二醇，如：二甘 醇与四甘醇；表面活性剂，如：聚氧乙烯-2-十八烯基醚与聚氧乙烯-2-硬脂醚；穿孔肽 (pore-formingpeptides)，如：爪蟾抗菌肽；以及细胞穿透肽，如：转运素（transportan) 与穿透肽（penetratin)。
[0070] 同样可任选地，本发明的药物组合物亦可包含所属技术领域中具有通常知识者所 熟知的药学上（尤其是皮肤学上）可接受的一或多种添加剂。上述添加剂包括但不限于： 干燥剂、抗痒剂、 抗发泡剂、缓冲剂、中和剂、pH调节剂、着色剂、脱色剂、润肤剂、乳化剂、乳 液稳定剂、增黏剂（viscositybuilders)、保湿剂、添味剂（odorants)、防腐剂、抗氧化剂、 化学稳定剂、增稠剂、硬化剂、或悬浮剂。
[0071] 依据本发明多种实施例，所述药物组合物可调制成各种适合经皮递送的剂型，如 溶液、喷剂、气雾剂、泡沫、霜剂、洗剂、软膏、凝胶或敷料。
[0072] 根据本公开的可任选实施例，此药物组合物中所述合成肽的含量为约0. 1 _ 100 1^;较佳为约1-25 1^。举例来说，合成肽的浓度可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.3、 0?7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95或100yM。具体而言，下文实施例中针对约20克重的小鼠所用的浓度为约25yM。 本发明所属技术领域具有通常知识者可基于本说明书提出的动物给药剂量计算出本发明 合成肽或药物组合物的人体等效剂量（HE?。譬如，美国食品暨卫生管理局（FDA)已批准了 工业指南，题为"成年健康志愿者临床治疗实验中最大安全起始剂量的估算"（Estimating theMaximumSafeStartingDoseinInitialClinicalTrialsforTherapeuticsin AdultHealthyVolunteers)〇
[0073] 在又一方面中，本发明提出了一种用以预防和/或缓和个体的皮肤老化的方法。 所述个体可以是任何哺乳动物，包括人类。根据本公开的原则和精神，所述皮肤老化由UV 辐射引起。
[0074] 于一实施例中，上述方法包含对该个体给予有效量的根据本发明上述方面/实施 例的合成肽，藉使所述肽经皮递送至个体的真皮。
[0075] 于可任选的实施例中，可将所述合成肽配制为上述本发明方面/实施例所述的药 物组合物。
[0076] 于一实施例中，可将所述药物组合物以局部施用至该个体的皮肤，在使用或不使 用外来刺激的情形下，所述合成肽或药物组合物经皮递送至该个体的真皮。
[0077] 在不使用外来刺激时，可将该药物组合物局部涂敷、涂抹、按摩、喷涂或其它方式 施用至该个体的皮肤上。此时，所述药物组合物较佳可包含至少一种任选的上文所述的穿 透促进剂。或者或此外，亦可根据上文所述的方法，将合成肽包裹以促进合成肽的经皮递送 效率。
[0078] 已知有多种外来刺激可增加皮肤对化合物（如本发明合成肽）的通透性。所述的 外来刺激包括但不限于：机械刺激、电刺激、热刺激、超声波刺激或无线射频刺激。于实际操 作中，可在将上述组合物施用至皮肤之前、同时或之后，对皮肤施加此外来刺激。相似地，搭 配外来刺激来协助所述药物组合物或合成肽之投递时，组合物中亦可任选的包含上述穿透 促进剂和/或微泡形成载体。
[0079] 于一实施例中，可利用具有微结构的施用器对皮肤施加机械刺激；上述施用器如 微针系统或微通道系统。微针系统可具有多个实心或中空的微针，微针的长度约为100-1000UM。采用实心微针系统时，可将本发明合成肽或药物组合物涂布于每一微针的尖端，施 用时，微针会穿过角质层并停留于皮肤中，因而可将本发明合成肽或药物组合物递送至真 皮。使用中空微针系统时，可将组合物调制为液态，而后将其填充于每一微针内部的空腔， 施用后，微针穿透皮肤，使液体由装置流入皮肤的真皮内。或者是，可将本发明的药物组合 物局部施用于皮肤上，而后将具有多个微针的微通道系统压到皮肤上，而使得多根微针穿 过皮肤（穿透深度小于100微米），藉以在皮肤上行成多个微通道，而使得该药物组合物能 够经皮递送。又或者是，可先于皮肤上形成上述微通道之后，再将本发明药物组合物局部施 用于皮肤上。
[0080] 此外，本公开任选实施例的合成肽或局部给予的药物组合物可在指定条件下给予 (如特定的湿度或温度）。譬如在较为温暖潮湿的条件下给药可促进合成肽在目标位置的 吸收。
[0081] 下文提出多个实施例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有 通常知识者实施本发明。不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人 员在阅读了本文的描述后，可完整利用本发明。本文所引用的所有公开文献，其全文均以引 用的方式纳入本文。
[0082] 实验例
[0083] 材料与方法
[0084]〈材料〉
[0085]DMEM培养基、胎牛血清（FBS)与0.25%胰蛋白酶皆购自英杰生命技术有限公 司（Invitrogen，加利福尼亚，卡尔斯巴德）。轻矿物油、甘油、二甲亚砜（DMS0)、牛血清 白蛋白（BSA)、5_ 溴-2' -脱氧尿苷（简称fcdU)、Hoechst33258 染料、Hoechst33342 染 料、抗-肌动蛋白抗体与其它化学材料皆购自西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich，圣路 易斯，密苏里州）。分散酶II与I型胶原酶购自罗氏（印第安纳州，印第安纳波利斯）。 抗-BrdU抗体（GTX42641)、抗-MMP-1抗体与抗-波形蛋白抗体（GTX100619)皆购自基泰 (GeneTex，台北，台湾）。抗-胶原蛋白1A1抗体购自圣克鲁斯生物技术公司（SantaCruz Biotechnology，加利福尼亚，圣克鲁斯）。各种焚光染料结合的二级抗体皆购自生物传奇公 司（BioLegend，加利福尼亚，圣地亚哥）。苏木精与曙红（H&E)染料购自默克（美国新泽西 州，雷威（Rayway))。
[0086] 合成FITC-结合之29-聚体与其它短合成肽（包括29-聚体（SEQIDN0:3)、24-聚 体（SEQIDNO: 5)、20-聚体（SEQIDNO: 6)与 18-聚体（SEQIDNO: 7))，并将其N端乙酰 化、C端酰胺化而进行修饰。然后以质谱仪（金斯瑞，新泽西州皮斯卡塔市）表征修饰的肽 (纯度>95% )。以DMS0重构各PEDF衍生的短合成肽（所述29-聚体、24-聚体或20-聚 体，下文称为PEDF肽），制成浓度为5mM的储备溶液，并储存于-20°C中以供后续使用。
[0087]将白凡士林（10%w/w)、甘油（10%w/w)与轻矿物油（1%w/w)和蒸馏水混合，以 制得皮肤软膏。将5y1的PEDF肽储备溶液溶解在lg的乳膏中，以制得含PEDF肽的乳膏。 对于用在载体对照的软膏，将5y1DMS0溶解在lg软膏中。
[0088] 〈动物〉
[0089] 本公开所载实施例所用的所有动物皆饲育于有温度与湿度控制的饲养笼中，饲养 温度约24°C至25°C，光暗循环为12 :12小时。试验过程中提供饮水与标准使用时饲料供任 食。实验计划皆通过马偕纪念医院（新北市，台湾）伦理委员会核准，并遵循国家动物保护 相关规范。
[0090]〈自小鼠真皮分离并培养皮肤成纤维细胞〉
[0091] 由C57BL/6小鼠背部取得完整深度的皮肤组织。小心地由该皮肤切下皮下组织， 并以无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS)冲洗三次。之后将组织切成小片（l-2mm3)。在4°C下以 〇. 1 %的分散酶过夜后，移除表皮层；余下的真皮组织在37°C下以0. 1 %的胶原酶I处理4 小时。透过离心（400g，5分钟）收集消化的细胞，并重新悬浮于高葡萄糖浓度的DMEM培养 基中，上述培养基中添加了FBS(10% )、L-谷酰胺（2mM)与青霉素/链霉素（1% )。以每 平方厘米IX103个细胞的密度将细胞接种于组织培养板上（福康实验室设备公司（Falcon Labware)，美国新泽西）上，并于37°C与5%二氧化碳的环境下维持。24小时后，弃置培养 基以移除未吸附细胞，并补充新鲜培养基。欲进行继代时，利用0.25%胰蛋白酶/EDTA)来 收集几近长满的细胞。
[0092] 〈WS-1细胞培养〉
[0093] 人皮肤成纤维细胞WS-1细胞系取自财团法人食品工业发展研宄所（新竹，台湾）。 在湿度调节的培养箱内于37°C、5%二氧化碳的条件下，将WS-1细胞以单层形式培养于培 养瓶中。细胞在10%FBS-DMEM中培养，该培养基添加了L-谷酰胺（2mM)、非必须氨基酸 (0.ImM)与青霉素/链霉素（1% )。欲进行继代时，利用0.25%胰蛋白酶/EDTA来收集几 近长满的细胞。
[0094]〈组织学〉
[0095] 皮肤样品经4%多聚甲醛固定后，以一系列浓度梯度的乙醇脱水，再以石蜡包埋。 将组织切成约5-ym的薄片。于使用前，在二甲苯中移除固定样品的石蜡，并以一系列浓度 梯度的乙醇恢复。
[0096]利用苏木精与曙红（H&E)染色进行一般组织学观察。根据制造商所述方法，利用 麦森三色染剂（西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州）将脱蜡的皮肤组织切片染色。 以尼康Eclipse80i光学显微镜观察样品并撷取影像（原始倍率：400倍）。欲对胶原蛋 白面积进行半定量分析时，在光学显微镜下自每一玻片选取10个视野，并利用Image-Pro Plus4. 5. 1系统（传媒控制公司（MediaCybernetics))来测量整个切片面积中，经蓝色染 色之区域的面积（mm2/mm2)。
[0097]〈免疫荧光染色与BrdU染色〉
[0098] 细胞经4%甲多聚醛固定后后，以冷甲醇处理2分钟，接着在室温下以1NHC1处理 1小时，而后再进行免疫荧光染色。
[0099] 欲进行动物实验时，在DMS0中重构BrdU，获得储备溶液（80mM)。将10y1的BrdU 储备溶液和90y1的PBS混合后，经腹膜内注射至小鼠体内，并于16小时后将小鼠安乐死。 将经甲醛固定与石蜡包埋的皮肤样品置于二甲苯中，以移除石蜡，并以一系列浓度梯度的 乙醇恢复。接着将样品在室温下和INHC1接触1小时，再进行后续的免疫荧光染色分析。
[0100] 利用抗-BrdU多克隆抗体与若丹明结合的驴-抗-兔-IgG来侦测经BrdU标记的 DNA。接着，以Hoechst33258染剂（蓝色）将细胞核进行对比染色。
[0101] 〈免疫印迹分析〉
[0102] 在冰冷的裂解缓冲液中使皮肤组织匀浆，该裂解缓冲液含有20mMHEPES(pH 7.4)、150mMNaCl、l%SDS、lmM乙二胺四乙酸（EDTA)、5mM苯基甲磺酰氟（PMSF)与ImM二 硫苏糖醇OTT)，1%TritonX-100,以及新加入的蛋白酶抑制剂混合物（购自罗氏，印第安 纳州，印第安纳波利斯）。接着将所得均质物在4°C下以12, 000g离心30分钟，收集上清液 储存于-70°C。利用Bradford分析法来测定裂解物中的蛋白质成分。使用上述裂解缓冲液 制备全细胞裂解物。接着将溶解物等份以SDS-PAGE分离后，电转到聚偏氟乙烯（PVDF)膜 (密理博（Millipore);得克萨斯州，贝德福德）上，而后进行免疫印迹分析。
[0103]免疫印迹分析中所用的抗体包含抗-I型胶原蛋白1A1抗体（稀释倍率：1 :1000)、 抗-MMP-1抗体（稀释倍率：1 :500)以及抗-0-肌动蛋白抗体（稀释倍率1:10000)。接着利 用适当的IgG-HRP二级抗体与ECL制剂（安玛西亚公司（Amersham);伊利诺斯州，阿灵顿山 庄）来侦测目标蛋白质。利用GS-700型成像比重计（伯乐公司（Bio-RadLaborator ies); 加州，赫克里斯（Hercules))来扫目苗X光片，并以Labworks4.0软件进行分析。定量分析 采用来自至少三个独立试验的印迹。
[0104] 〈RNA提取与反转录聚合酶链式反应〉
[0105] 利用TRIzol(英杰生命技术有限公司（Invitrogen))自细胞内提取出全RNA，并 以不含RNA酶的DNA酶1(恰根，加州，圣地克拉力塔（SantaClarita))处理以移除基因 组DNA，之后以RNA纯化试剂盒（Dynabeads，英杰生命技术有限公司）进行纯化。在20y1 的反应缓冲液（含〇? 25yg的随机引物与0? 8mMdNTPs)中加入1yg取自原代皮肤成纤 维细胞的全RNA与200单位的扩增反转录酶（罗氏，德国曼海姆），于42°C下反应1小时， 以将该RNA反转录为cDNA。取2y1的cDNA作为PCR反应模板。PCR反应的反应体积为 30y1，其中含有 15y1 的EconoTaq?PLUSGREEN2XMasterMix(Lucigen? 公司）、 1UM的各种引物以2y1的模板DNA。在18 - 22个循环的扩增反应中合成cDNA(变性：20 秒、94°C;退火：30秒、57°C;以及聚合：40秒、72°C)。选择每种引物组所用的循环数，使 其落在扩增的线性范围内。特异性PCR引物的序列是小鼠MMP-13 (登陆号：NM_008607)， 正向：ATCCTGGCCACCTTCTTCTT(SEQIDN0:12);反向：ITTCTCGGAGCCTGTCAACT(SEQID N0:13) ;PCR产物：201bp;和小鼠甘油醛3-磷酸去氢酶（GAPDH，登陆号：M32599)，正向： AACITTGGCAITGTGGAAGG(SEQIDN0:14);反向：ACACAITGGGGGTAGGAACA(SEQIDN0:15);PCR产物，223bp。利用含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，并以UV光照 使其显影。利用富士LAS-3000系统与MultiGaugeVer. 1.01软件（富士胶片株式会社， 日本东京）对PCR产物进行密度法定量分析。
[0106]〈统计分析〉
[0107] 将结果表示为平均值土平均值的标准差（SEM)。利用单向AN0VA分析来进行统计 比较。除非另有说明，P〈〇. 05时具有统计上的显著差异。
[0108] 实施例1
[0109]PEDF肽的经皮递送
[0110] 本试验采用荧光素（FITC)结合的29-聚体肽来研宄本发明PEDF肽的体内经皮递 送。
[0111] 首先，将8周龄磁性C57BL/6小鼠全身麻醉后，以融化的蜡/松脂（1 :1)混合物除 去其背部毛发。隔天，将含有FITC结合的29-聚体肽的软膏（浓度25yM)涂抹于小鼠背 部皮肤上，然后用微针片（3M?微通道皮肤系统，新加坡3M)轻轻按压于背部皮肤上，使得微 针穿透肌肤不超过100微米（FITC-29聚体/MN组）。对照组（S卩，FITC-29聚体/CT组） 小鼠涂抹软膏，但未进行后续微针处理。24小时候，收集皮肤样品，固定，低温切片，并以荧 光显微镜观察。图1提供了三次独立试验所得的代表性照片（原始倍率：400倍）。
[0112] 图1左图H&E染色切片突出显示了样品的表皮与真皮。图1中间与右图的荧光照 片呈现出FITC结合的29-聚体在皮肤样品中的分布情况。具体来说，FITC-29聚体/MN组 的表皮和真皮中皆可观察到荧光素发出的明显的绿色信号，代表FITC结合的29-聚体肽被 成功地递送至真皮中。相较之下，在FITC-29聚体/CT组中，绿色荧光素信号在真皮中几乎 检测不到，而大多数的荧光素信号都停留在表皮中。
[0113] 实施例2
[0114]PEDF肽增加皮肤胶原蛋白含量
[0115] 胶原蛋白构成真皮的主要基质成分，可形成坚固的纤维架构，为皮肤提供弹性。本 实施例研宄本发明PEDF肽是否能增加皮肤中胶原蛋白的含量。小鼠依实施例1所述的方 法脱毛后，随机分派至几个实验组中，并如下处理。每一只小鼠于背部中线的一侧（约2平 方厘米）上接受50y1的软膏（含29-聚体、20-聚体或DMS0的软膏），且之后进行微针处 理；在中线的另一侧仅接受50y1的相同软膏，而不进行微针处理。持续两周，每周进行两 次上述处理，皮肤直接暴露于空气中，并于第一次处理后14天取得皮肤样品。以麦森氏三 色染剂（蓝）将皮肤样品中的胶原蛋白染色；代表性照片请见图2。根据上文"材料与方法" 一节所述的方法来定量皮肤中经染色的胶原蛋白面积，所得结果以载体/MN组的面积为准 进行标准化。同样利用上文所述的免疫印迹分析来定量I型胶原蛋白C0L1A1的含量，所得 结果以载体/CT组的含量为准进行标准化。定量分析结果整理于表1。
[0116]表 1
[0117]
[0118] *P〈0. 05,相较于载体/MN组；**P〈0. 002,相较于载体/CT组。
[0119] 图2的照片显示，在29-聚体/MN与20-聚体/MN组的切片中，可观察到较为明显 的蓝色染色（相较于载体/MN组），故可推知以29-聚体或20-聚体搭配微针处理可增加真 皮中胶原蛋白含量。此外，比较载体/CT与载体/MN组的切片可以发现，单用微针处理并没 有提升胶原蛋白含量的效果。再者，载体/CT、20-聚体/CT与29-聚体/CT组别中，胶原蛋 白的含量没有明显的差异，表明不同受试个体间胶原蛋白的含量没有显著改变。
[0120] I型胶原蛋白（C0L1A1)是皮肤胶原蛋白的主要成分，免疫印迹分析显示29-聚体 /MN与20-聚体/MN处理可显著提高C0L1A1含量（相较于载体/CT对照组）。
[0121] 实施例3
[0122]PEDF肽促进皮肤成纤维细胞增殖
[0123] 成纤维细胞为人类皮肤中负责产生胶原蛋白的主要细胞，因而进行了多项体外与 体内分析，以评估本发明PEDF肽对皮肤成纤维细胞增殖的影响。
[0124] 实施例3.1
[0125]PEDF肽体外促进皮肤成纤维细胞增殖
[0126] 根据"材料与方法"一节的记载来分离并培养原代小鼠皮肤成纤维细胞。将第2代 的皮肤成纤维细胞以每孔2X105的密度接种于6孔板中以明胶涂覆的玻片上，并以生长培 养基（DMEM+10 %FBS)培养24小时，而后以仅含1 %FBS的基本生长培养基（对照组）或含 1 %FBS与50nM的PEDF衍生肽（即，29-聚体、24-聚体、20-聚体、18-聚体、Mo29-聚体或 Mo20-聚体）的培养基培养24小时。欲进行BrdU标记分析时，将BrdU(最终浓度10yM) 加入培养系统中2小时。另外，以成纤维细胞分子标记一波形蛋白（vimentin)来染色成纤 维细胞；代表性照片请见图3。BrdU-与波形蛋白双阳性细胞的数量表示为BrdU-与波形蛋 白双阳性细胞占全部波形蛋白阳性细胞的百分比（BrdU/波形蛋白标记指数）；结果整理于 表2。
[0127]表 2
[0128]
[0129]
[0130] *P〈0. 002,相较于未处理细胞。
[0131] 总结来看，培养于含有本发明实施例的PEDF肽（如29-聚体、24-聚体、20-聚体 与两种小鼠同源肽）的培养基中的皮肤成纤维细胞，其增殖活性较对照培养基高出5倍以 上。相反地，以不含SLGA序列的18-聚体处理时，则无法达到此种效果。
[0132] 实施例3. 2
[0133]PEDF肽体内促进皮肤成纤维细胞增殖
[0134] 将上文实施例2的样品染色，以侦测成纤维细胞分子标记（波形蛋白），并于显微 镜下计算波形蛋白阳性细胞数目（。
[0135]表 3
[0136]
[0137] *P〈0. 002,相较于载体/MN组。
[0138] 表3的数据显示，经29-聚体/MN与20-聚体/MN处理的样品在皮肤区域中具有 明显较高的成纤维细胞数量（相较于载体/MN组与单用载体组（即载体/CT组））。此结果 显示本发明PEDF肽的经皮递送与真皮中成纤维细胞的密度成正相关。
[0139] 为了探宄本发明PEDF肽的经皮递送是否能够促进体内皮肤成纤维细胞的增殖， 小鼠经PEDF肽/MN处理或载体/MN处理后，以腹膜内注射BrdU并于16个小时后安乐死。 皮肤切片染色侦测波形蛋白（绿色）与BrdU(红色）。BrdU-与波形蛋白双阳性细胞的数 量表示为BrdU-与波形蛋白双阳性细胞占全部波形蛋白阳性细胞的百分比（BrdU/波形蛋 白标记指数）；结果整理于表4。
[0140]表 4
[0141]
[0142] *P〈0. 05,相较于载体/MN组。
[0143] 由表4可以看出，相较于以含DMS0的软膏处理（载体/MN组）的切片，29-聚体/ MN与20-聚体/MN处理组的皮肤切片中有更多增殖的成纤维细胞。此结果显示，本发明合 成肽的经皮递送能够有效提升皮肤成纤维细胞的增殖活性。此处皮肤成纤维细胞增殖活性 提高的结果与本发明PEDF肽经皮递送提高胶原蛋白含量的结果（上表1)相呼应。
[0144] 实施例3.3
[0145]PEDF肽体内促进受光损伤皮肤中皮肤成纤维细胞的增殖
[0146] 已知紫外线辐射（UVB)会导致皮肤胶原蛋白基质断裂，进而导致成纤维细胞的细 胞周期停滞。因此，本实施例中我们研宄本发明PEDF肽的经皮递送是否可有效恢复因UVB 照射而受损的成纤维细胞的增殖活性。
[0147] 六周大的雌性裸鼠（BALB/cAnN.Cg-Foxnlnu/CrlNarl)背部以UVB照射，每周五 次，持续八周；所用光源包含五盏紫外线灯（型号为XL-1000B，Spectr〇linkerTM装置；发射 峰：312nm)，距离动物背部上方约20厘米。在UVB照射期间，小鼠可自由在笼内移动。照 射强度以最低红斑剂量（MED)来表示，实验中，前两周所用的照射强度为lMED(60mJ/cm2)， 之后逐步提升，第3到4周的照射强度为2MED(120mJ/cm2);第5到6周的照射强度提高至 3MED(180mJ/cm2);第7到8周的强度为4MED(240mJ/cm2)。经过8周UVB照射后，试验动 物背部出现了明显的皱纹，此时将动物随机分成以下4组，每组3只小鼠。在UVB/载体、 UVB/29-聚体、UVB/20-聚体与UVB/18-聚体等组别中，将350y1的软膏（分别含有DMS0、 29-聚体、20-聚体或18-聚体PEDF)施用至背部皮肤，之后利用微针片穿刺该经软膏处理 的皮肤而实现经皮递送。此外，以未经UVB照射的小鼠作为对照（正常组）。持续两周、每 周两次进行软膏/微针处理。在最后一次处理后，将BrdU经腹腔注射至小鼠体内，并于16 小时后安乐死。对所得皮肤切片染色以侦测波形蛋白与BrdU。BrdU-与波形蛋白双阳性细 胞的数量表示为BrdU-与波形蛋白双阳性细胞占全部波形蛋白阳性细胞的百分比（BrdU/ 波形蛋白标记指数）。定量结果整理于表5。
[0148]表 5
[0149]
[0150] *P〈0. 01，相较于正常组；**P〈0. 05,相较于UVB/载体组。
[0151] 由表5可以看出，相较于未经UVB照射的皮肤（正常：4. 1±0. 8% )，经UVB照射 后（UVB/载体：2. 1±1. 1%)，皮肤成纤维细胞的增殖活性降低了约50%。另一方面，在UVB 照射后，经皮递送29-聚体与20-聚体可将皮肤成纤维细胞的增殖活性提高约2. 5倍（相 较于UVB/载体组）。可注意到，经29-聚体或20-聚体处理的动物的增殖活性甚至高于未 经UVB照射的动物，虽然此差异较不显著。相反地，不具有SLGA序列的18-聚体则无法促 进皮肤成纤维细胞的增殖。
[0152] 总结来说，实施例3 (包括实施例3. 1至3. 3)中的各种数据证实，本发明PEDF肽 能够有效促进正常皮肤组织（即，未经过辐射照射）中皮肤成纤维细胞的增殖活性，亦可提 升经光照而受损的皮肤组织（即，经UVB照射并具有该照射导致的明显皱纹）中皮肤成纤 维细胞的增殖活性。由于成纤维细胞负责胶原蛋白合成，提升的成纤维细胞增殖活性以及 所导致的较高的成纤维细胞密度可能有助于提升胶原蛋白合成。因此，本发明PEDF肽能够 引发皮肤的内生修补机制而刺激胶原蛋白合成。
[0153] 实施例4
[0154]PEDF肽降低由UVB引发的MMP-1表达
[0155]MMP-1 (间质胶原酶）是唯一一种能够切断I型与III型胶原蛋白中胶原蛋白三股 螺旋的酶。此外，MMP-1是人类皮肤中的主要溶胶原酶，且响应UV辐射而上调。啮齿类动 物不具有MMP-1基因，这些动物中其功能则由MMP-13来取代。因此，本实施例之目的在探 讨本发明合成肽是否能够降低由UVB照射引发的MMP-1与MMP-13的表达。
[0156] 我们的初步实验显示，在经过15mJ/cm2的UVB照射后，细胞存活率为对照的细胞 存活率的95%以上（数据未显示）。人类皮肤成纤维细胞（WS-1细胞）与原代小鼠皮肤成 纤维细胞经过l〇〇nM29-聚体预处理24小时未使细胞存活率有明显改变（数据未显示）， 且如转移盘（transwell)实验所测也未使细胞迀移有明显的改变（数据未显示）。我们还 发现，此剂量的UV照射导致MMP表达量增加。因此以下实验所用的照射量为15mJ/cm2。
[0157] 将WS-1细胞以IX105个细胞的密度培养于六孔板上，并于10%FBS-DMEM培养基 中培养24小时，之后以添加或未添加100nMPEDF肽的1 %FBS-DMEM培养基再培养24小 时。细胞经PBS冲洗两次后，以PBS覆盖并照射UVB。在细胞培养通风橱中，以UVB灯（型号XL-1000B，Spectrolinker?公司）进行照射，最终剂量为15mJ/cm2,照射时间约100秒。以 台盼蓝拒染实验来分析细胞存活率（大于95% )。在UVB照射之后，以添加或不添加PEDF 肽的1%FBS-DMEM来取代PBS，并继续培养48小时，之后蛋白质印迹法分析蛋白提取物中 的MMP-1蛋白质表达。以未经过UVB照射的细胞作为对照（正常组）。以载体/UVB组的表 达量（设定为100% )为准，将MMP-1的表达量标准化，定量分析结果如表6所示。
[0158]表6
[0159]
[0160] *P〈0. 02,相较于载体/UVB组。
[0161] 比较载体/UVB与正常组，可以发现UVB照射会导致MMP-1蛋白质的表达量大幅提 高（载体/UVB组：100% ;正常组：约5%)。然而，成纤维细胞经过29-聚体、24-聚体或 20-聚体预先处理后，可使得MMP-1蛋白质水平大幅降低至载体/UVB组的约二分之一。
[0162] 将单层细胞培养第二代的原代小鼠皮肤成纤维细胞于添加或未添加100nMPEDF 肽的1 %FBS-DMEM培养基中培养24小时，之后根据上文所述的方法进行UVB照射。于UVB 照射结束后，以添加或不添加PEDF肽的1 %FBS-DMEM来取代PBS，并继续培养24小时；接 着提取细胞的总RNA并进行后续的RT-PCR分析。以载体/UVB组的表达量（设定为100% ) 为准，将MMP-13的表达量标准化，定量分析结果如表7所示。
[0163]表7
[0164]
[0165] *P〈0.0001，相较于载体/UVB组。
[0166] 表6的发现相似，MMP-13的表达量也因UVB照射而上调（UVB/载体组相对于正 常组）。此外，在经过本发明PEDF肽处理的细胞中，所述上调明显减低（29-聚体/UVB组、 24-聚体/UVB组与20-聚体/UVB组相较于载体/UVB组）。另外，不含SLGA序列的18-聚 体则没有降低受UVB引发的MMP-13表达量上调。
[0167] 这些结果显示，本发明PEDF肽可保护人类皮肤成纤维细胞对抗UVB引发的MMP-1 诱导。MMP-1所导致的I型胶原蛋白降解是光老化的关键贡献因子。因此，本发明PEDF肽 可做为抗光老化剂使用。
[0168] 实施例5
[0169]PEDF肽减少紫外线引发的皱纹
[0170] 皱纹形成和反复暴露于紫外线照射有紧密的关联。具体来说，UVB照射可胶原蛋 白降解并可抑制真皮内前胶原的生物合成；进而导致胶原蛋白损失而形成皱纹。本实施例 中，我们探宄了本发明PEDF肽在裸（即无毛）鼠体内的抗皱纹效果。根据上文实施例3. 3 所述的方法，对小鼠进行八周的UVB照射以引发皱纹。在UVB照射之前（正常）、UVB照射 后（UVB/UT)与经过两周软膏处理（UVB/载体、UVB/29-聚体、UVB/20-聚体与UVB/18-聚 体）后，撷取小鼠外观照片，代表性照片如图4所示。
[0171] 由图4可以看出，经UVB照射后，小鼠会形成大量既深且长的皱纹（正常组相较 于UVB/UT组）。接受含载体或18-聚体的软膏处理的小鼠同样具有既深且长的皱纹，表明 18-聚体无法减少原本受UVB照射而形成的皱纹。相较之下，在经过本发明PEDF肽（如， 29-聚体与20-聚体）处理的小鼠中，皱纹的数量较少也较浅（相较于UVB/UT、UVB/载体 与UVB/18-聚体组别）。
[0172] 对皮肤样品进行麦森氏三色染色，以估计胶原蛋白含量，代表性照片如图5(原始 倍率：200倍）所示。此外，利用免疫印迹分析来研宄I型胶原蛋白（C0L1A1)的含量，并以 未经照射的正常组的含量（设定为100% )为准，将所得结果标准化。定量结果整理于表 8〇
[0173] 表 8
[0174]
[0175] *P〈0. 0001，相较于未照射组；**P〈0. 001，相较于UVB/载体组。
[0176] 同时参照图5与表8,可以发现相较于未处理的正常组中的正常小鼠，反复暴露于 UVB中会使真皮中的胶原蛋白信号以及C0L1A1含量大幅降低（UVB/UT组）。相反地，经皮 递送本发明PEDF肽（如，UVB/29-聚体与UVB/20-聚体组）明显提升真皮中胶原蛋白与 C0L1AL的含量（相较于UVB/载体组）。这些结果显示，经皮递送本发明PEDF肽可在经UVB 损伤的真皮中引发胶原蛋白合成，此结果可进一步证实本发明PEDF肽处理的小鼠中减少 的皱纹形成。
[0177] 本公开首度证实以经皮递送短的PEDF合成肽能够对抗皮肤老化。相较于以静脉 内或肌肉内注射来投递表达全长PEDF肽的载体而言，经皮递送短的PEDF合成肽不但较为 安全，且成本也相对低廉。
[0178] 应理解，上述实施方式仅仅是以实施例的方式提供，本领域技术人员可作出各种 改动。上述说明书、实施例和数据完整地描述了本发明示例性实施方式的结构和用途。虽 然较详尽地或结合一个或多个实施例描述了本发明的各实施方式，但本领域技术人员在不 悖离本发明原理与精神的情形下可对所公开的各实施方式作出各种改动。
【主权项】
1. 合成肽在预防和/或缓和个体皮肤老化中的用途，其中，所述合成肽由长20 - 39 个氨基酸残基并与SEQIDNO:l具有至少80%的氨基酸序列相同性的氨基酸序列组成，其 中，所述氨基酸序列含有的至少20个连续的残基与SEQIDNO: 1的残基11 一 30具有至少 90%的氨基酸序列相同性。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述合成肽的至少4个连续的残基与SEQID NO: 1的残基11 一 14相同。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述皮肤老化是光老化。4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述个体是人。5. -种用于预防和/或缓和个体皮肤老化的药物组合物，其特征在于，所述药物组合 物含有： 有效量的权利要求1的合成肽；和 药学上可接受的赋形剂。6. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述合成肽的至少4个连续的残基与 SEQIDNO: 1的残基11 一 14相同。7. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为溶液、喷剂、气雾 剂、泡沫、面霜、洗剂、软膏、凝胶或敷料的形式。8. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有穿透增强剂。9. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述皮肤老化是光老化。10. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述个体是人。11. 一种预防和/或缓和个体皮肤老化的方法，其特征在于，所述方法包括： 通过经皮递送权利要求1所述的合成肽至个体的真皮而将有效量的所述合成肽给予 该个体。12. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述合成肽的至少4个连续的残基与SEQ IDNO: 1的残基11 一 14相同。13. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述合成肽被配制成含有所述合成肽和 药学上可接受的赋形剂的药物组合物。14. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述药物组合物为溶液、喷剂、气雾剂、泡 沫、面霜、洗剂、软膏、凝胶或敷料的形式。15. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，经所述药物组合物局部给予至该个体的 皮肤。16. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，在局部给予所述药物组 合物之前、同时或之后，对该个体的皮肤施加外来刺激。17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述外来刺激是机械、电、热、超声波或无 线射频刺激。18. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述药物组合物还含有穿透增强剂。19. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述皮肤老化是光老化。20. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述个体是人。
【专利摘要】本发明提供一种合成肽，该合成肽由具有20–39个氨基酸残基，且其序列与SEQ ID NO:1具有至少80％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列组成，其中，该氨基酸序列含有的至少20个连续氨基酸残基与SEQ ID NO:1的第11–30位氨基酸残基具有至少90％的氨基酸序列相同性。本发明还提供含有此合成肽的组合物及其在预防和/或缓和皮肤老化中的用途。
【IPC分类】C07K14/435, A61Q19/08, A61K38/17, A61K38/10, A61P17/00, C07K7/08
【公开号】CN104903346
【申请号】CN201280077079
【发明人】曹友平, 何宗权
【申请人】财团法人台湾基督长老教会马偕纪念社会事业基金会马偕纪念医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2012年9月19日
【公告号】EP2897976A1, US20150232523, WO2014043861A1
【专利说明】PEDF衍生的多肽在预防和/或缓和皮肤老化中的用途
[0001] 发明背景 1、发明领域
[0002] 本公开涉及预防和/或缓和皮肤老化。具体而言，所公开的发明涉及使用PEDF衍 生的合成肽来预防和/或缓和皮肤老化。
[0003] 2、相关技术的描述
[0004] 人类皮肤和其它活体组织一样，会随着时间而老化。皮肤老化导致皱纹与细纹形 成、皮肤变薄、皮肤脱色或色素沉着过多，并且失去紧致与弹性。可根据皮肤老化的成因，将 其分为内因性老化与外因性老化。内因性老化又称为自然老化，此一过程会影响几乎所有 内部器官，主要受到个体遗传组成的调控。外因性老化则是暴露于多种环境因子、尤其是紫 外线（UV)辐射所导致的老化，，故此一过程又称为光老化。暴露于阳光的部分，譬如脸部、 颈部、手背等，会受到内因性老化与光老化的双重影响，因此在这些部分老化的痕迹也特别 明显。
[0005] 胶原蛋白是构成结缔组织的主要成分，其外观呈纤维状，属于细胞外的不可溶蛋 白质。在各种胶原蛋白中，I型与III型胶原蛋白最为重要。I型胶原蛋白是人类皮肤最 主要的结构蛋白质，占皮肤干重中90%以上的重量；而III型胶原蛋白广泛分布于身体各 部位，在胚胎组织内的含量较为丰富。随着皮肤老化，皮肤中总体胶原蛋白的含量减少，且 I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的比例也会下降；再者，细胞外基质（ECM)也会变得较不规 贝1J。举例来说，内因性老化与紫外线B(UVB)暴露会削弱胶原蛋白纤维（尤其是I型胶原蛋 白纤维）的更新。此外，UVB暴露会提高多种降解胶原蛋白的酶的生产，这些酶已知被称为 基质金属蛋白酶（MMP)。在UVB暴露后数小时内，即可诱导人体产生基质金属蛋白酶（特别 是胶原酶与明胶酶）。以上现象都可能导致皮肤细胞外基质组成的改变。
[0006]目前已有多种可对抗皮肤老化的处置方式。举例来说，由于胶原蛋白的在老化中 的重要性，已开发出多种含有胶原蛋白的局部给药产品。许多美妆保养产品也采用了据称 可刺激胶原蛋白合成的成分，如视黄酸、维他命C与透明质酸等。另外还有一些美容手术 (如激光换肤），亦可有效减少脸部皱纹与皮肤不平整。
[0007] 虽然已有许多减少老化痕迹或刺激皮肤再生的解决方案，但现有的方法都无法启 动皮肤的内生修补机制（即，胶原蛋白合成）。因此，本领域亟需一种能够有效治疗皮肤老 化（尤其是光老化）的措施。
【发明内容】
[0008] 下文提供本公开的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明 内容并非本公开的完整概述，且其未指出本发明的重要/关键组件或界定本发明的范围。 本部分内容的目的仅是以简化形式阐明一些概念，更详细的内容将在后文予以呈现。
[0009] 本发明至少部分是基于发现色素上皮衍生因子（PEDF)衍生的合成肽能够刺激胶 原蛋白生成、促进皮肤成纤维细胞增殖，以及降低UVB引发的MMP-1表达；因此这些肽能够 有效预防和/或缓和个体的皮肤老化。因此，本发明PEDF衍生的合成肽能够作为抗皮肤老 化的制剂或药物。
[0010] 有鉴于此，一方面，本发明涉及一种用于预防和/或缓和个体的皮肤老化的合成 肽。
[0011] 根据本公开多个实施例，所述的合成肽长度为20 - 39个氨基酸残基，且具有与 SEQIDNO: 1至少80%相同的氨基酸序列。此外，上述氨基酸序列包含的至少20个连续的 残基与SEQIDNO: 1的残基11-30至少90%相同，而使得此合成肽能用于预防和/或缓和 个体的皮肤老化。
[0012] 在本公开可任选的实施例中，上述合成肽中有至少四个连续的氨基酸与SEQID NO: 1的残基11-14相同。此种合成肽的非限制性例示包括具有SEQIDNO: 1(39-聚 体）、5￡〇10勵：2(34-聚体）、5￡〇10勵：3(29-聚体）、5￡〇10勵：5(24-聚体）、5￡〇10 勵:6(2〇-聚体）、5￡〇1〇勵:8 0\?)29-聚体）与5￡〇1〇勵:9(]\?)2〇-聚体）所示的氨基酸 序列的合成肽。根据本公开某些实施例，上述合成肽的氨基酸序列为SEQIDN0:3(29-聚 体）、SEQIDNO: 5 (24-聚体）或SEQIDNO: 6 (20-聚体）。
[0013] 依据本公开多种实施例，所述的皮肤老化是由紫外线辐射所致。
[0014] 根据本公开多种实施例，所述的个体可以是任何归类为哺乳动物的动物，包括人 类。
[0015] 另一方面，本公开涉及一种用以预防和/或缓和个体皮肤老化的药物组合物。所 述的个体可以是任何哺乳动物，包括人类。
[0016] 根据本公开一实施方式，上述药物组合物包含任一根据本发明上述方面/实施例 的合成肽，且此合成肽以足以治疗该个体的皮肤老化的有效量存在。此药物组合物亦包含 可用以携带该合成肽的药学上可接受的赋形剂。
[0017] 在某些任选实施例中，该药物组合物还含有至少一种用于促进本发明合成肽或药 物组合物流动（flux)的穿透增强剂。
[0018] 依据本公开多种实施例，所述的药物组合物可以是以下任一种剂型：溶液、喷剂、 气雾剂、泡沫、面霜、洗剂、软膏、凝胶或敷料。
[0019] 又一方面，本发明涉及一种用以预防和/或缓和个体皮肤老化的方法。所述的个 体可以是任何哺乳类动物，包括人类。
[0020] 于一实施例中，上述方法包含对该个体给予有效量的根据本发明上述方面/实施 例的合成肽，以使得此合成肽经皮递送至该个体的真皮。
[0021] 于可任选的实施例中，可将合成肽调制为根据上述方面/实施例所述的药物组合 物。于一实施例中，可将此药物组合物局部给予个体的皮肤上。在可任选的实施例中，此方 法还包含于上述局部给予该药物组合物之前、同时或之后，对该个体的皮肤施加外来刺激 (如，机械、电、热、超声波或无线射频刺激），藉以促进所述合成肽或药物组合物的经皮递 送。同样可任选地，此药物组合物还可包含至少一种穿透促进剂，以促进此合成肽或组合物 的流动。
[0022] 依据本发明多种实施例，所述的皮肤老化是由紫外线辐射所致。
[0023] 在参阅下文详细描述，并结合附图后，本公开许多附带的特征和优点将更易于理 解。
[0024] 附图简要说明
[0025] 本专利或申请文件包含至少一幅彩图。在提出请求并缴纳所需费用后，专利局将 提供带有彩图的此专利或专利申请出版物的副本。
[0026] 结合附图及下文详述，本说明书将更易于理解。
[0027] 图1显示本公开一实施例中皮肤样本的经H&E染色的切片照片（左图）以及荧光 照片（中间、右图）；
[0028] 图2显示本公开另一实施例中经麦森（Masson)三色染色以突出胶原蛋白纤维的 皮肤组织切片的代表性照片；
[0029] 图3为原代皮肤成纤维细胞免疫染色（波形蛋白：绿色；BrdU:红色）的代表性照 片以及与Hoechst33258(细胞核：蓝色）染色样本的合并照片；
[0030] 图4的代表性照片呈现各实验条件下小鼠的皱纹形成；以及
[0031] 图5显示本公开又一实施例中经麦森三色染色以突出胶原蛋白纤维的皮肤组织 切片的代表性照片。
[0032] 详述
[0033] 下文结合附图详细描述的内容仅仅是对本实施例的描述，并非是实施或运用本发 明具体实施例的唯一形式。此部分公开了实施例的功能以及用于建构与操作这些具体实施 例的步骤的顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或等同的功能与顺序。
[0034] 出于方便，本申请（包括说明书、实施例和权利要求书）所用的某些术语汇集于 此。除非本说明书另有定义，本公开所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域 中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。此外，除非另有说明，应理解的是，所用的单 数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。具体而言，如本 文及权利要求书所用，除非另有说明，单数形式"一"包括其复数形式。
[0035] 虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数界是约略的数值，具体实施例的 相关数值已尽可能精确地呈现。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所 致的标准偏差而导致的误差。同时，本文中，"约"通常指实际数值在一给定数值或范围的正 负10%、5%、1%或0.5%之内。或者是，"约"代表实际数值落在平均值的可接受标准误差 之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实施例之外，或除非另有 明确的说明，当可理解本文所用的所有数值范围、数量、数值与百分比（例如用以描述材料 用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例等）均经过"约"的修饰。因此，除非另有相反的 说明，本公开与权利要求书所涉及的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更改。至少应 将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
[0036] 本文中，术语"肽"指氨基酸残基的多聚物。本文中，术语"合成肽"指未包含存在 于自然界的完整蛋白质分子的肽。此种肽是"合成的"，因为其由人类利用技术手段所得，譬 如化学合成、重组遗传技术或将整个蛋白切段等。于本公开中，任何指定氨基酸残基于一肽 中的位置系由该肽的N端起算。
[0037] 本文所用"增殖"指族群中的细胞数目通过细胞分裂而增加。
[0038] 本文针对合成多肽序列所述的"氨基酸序列相同性百分比（％ )"系指该候选合 成肽的氨基酸残基与参考多肽的氨基酸残基完全相同的百分比。进行上述比对时，可将该 候选合成肽与该参考多肽并排，并于必要时引入间隙（gap)，以使两条序列形成最高的序列 相同性，且在计算相同性时，并未将保守性取代的氨基酸残基纳入考虑。可采用本领域已 有的多种方法进行上述比对，以确定序列相同性百分比，譬如可使用可公开取得的软件如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)。本领域技术人员可确定比对时的适当参 数，包括需要在对比序列的整个长度上获得最大比对所需的各种算法。为了本文的目的，二 氨基酸序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心（NCBI)所提供的计算机程序 Blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)来进行。给定氨基酸序列A相较于给定氨基酸序列B的 氨基酸序列相同性百分比（亦称为给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B具有特定百分比 (% )的氨基酸序列相同性）的计算方式如下：
[0039]
[0040] 其中X是利用比对程序BLAST对A和B进行比对后所得到的计为完全匹配的氨基 酸残基的数量，而Y是A或B中较短者的氨基酸残基总数。
[0041]本文所用"治疗"指将本公开合成肽或药物组合物给予或施用于一个体，此个体具 有皮肤老化的征兆或易于发生皮肤老化，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻皮肤老化 的一或多种征兆或特征，或延缓其发生、抑制其进展、减轻其严重性和/或减低其发生率。 [0042]本文所用术语"有效量"指一成分的用量足以产生所欲的反应。具体的有效量取 决于多种因素，诸如欲治疗的特定病症、患者的身体条件（如患者体重、年龄或性别）、接受 治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、共同施与的疗法（如果有的话）的本质以及 所用的具体配方。有效量亦指于此用量下，该化合物或组合物的毒 性或负面效果不及于其 所带来的正面疗效。
[0043]术语"施用"或"给药"在本文中可互换使用，指将本发明合成肽或药物组合物提 供给个体，以预防和/或缓和皮肤老化的措施。根据本公开各实施方式，较佳的递送方式为 经皮递送。例如，将本发明合成肽或药物组合物局部施用至个体的皮肤上，并使该合成肽或 本发明的药物组合物到达目标部位（如，真皮），以预防和/或缓和皮肤老化。
[0044]本文所用术语"赋形剂"指可作为本公开所述合成的PEDF肽的媒剂/载体的任何 惰性物质（如粉末或液体）。赋形剂通常是安全、无毒的，且广义上可包括制药产业中用于 制备药物组合物的任何已知物质，如填充剂、稀释剂、凝结剂、黏合剂、润滑剂、助流剂、稳定 剂、着色剂、润湿剂、崩解剂等。
[0045]在本文中，"药学上可接受"的成分指其适用于人类和/或动物，且在合理的效益/ 风险比之下不会产生不当的副作用（如毒性、刺激与过敏反应）。此外，每一种赋形剂必须 和药学配方中的其它成分兼容，才是"可接受"的。载体可以是固体、半固体、液体稀释剂、 霜或胶囊的形式。
[0046]术语"个体"指可接受本发明的合成肽、组合物和/或方法来进行治疗的哺乳动物 (包括人类）。除非另有指明，术语"个体"包含雄性与雌性。
[0047]本文所用术语"经皮"指一活性制剂（如本发明合成肽或药物组合物）通过表皮 到达真皮。
[0048]色素上皮衍生因子（PEDF)是一种多功能的分泌性蛋白质，其具有抗血管新生、抗 肿瘤生成与神经滋养功能。人PEDF蛋白质（SEQIDN0:11)是一种大小约50kDa的分泌性 蛋白质，长418个氨基酸。已知PEDF的34-聚体片段（第44 - 77号残基）与44-聚体片 段（第78 - 121号残基；SEQIDNO: 10)分别具有抗血管新生与神经滋养性质。
[0049] 本公开至少部分是基于发现来自PEDF的44-聚体合成肽能够透过多种机制来保 护皮肤免受皮肤老化所致的损伤。本公开提供的实施例证明，所述合成肽可增加真皮中胶 原蛋白的水平，诱导真皮成纤维细胞增殖，以及降低MMP-1 (可被UVB诱发的胶原酶）的表 达。本发明的另一创新特征在于所述合成肽比全长PEDF短了许多（最多有39个氨基酸残 基）；因此，本发明克服了传统蛋白质药物在临床使用上经常面临的困境，诸如制造成本高 昂、生物利用率低与药物动力学表现不佳等。因此，这些合成肽可用以预防和/或缓和皮肤 老化。
[0050] 因此，一方面，本公开涉及一种用于预防和/或缓和个体皮肤老化的合成肽。
[0051] 根据本公开多个实施例，此合成肽有20 - 39个氨基酸残基，且其氨基酸序列与 SEQIDN0:1(LSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)有至少 80%的氨基酸序列相 同性。举例来说，此合成肽与SEQIDN0:1的氨基酸序列相同性可为约80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。另外，此合成肽包含的至少 20个连续的氨基酸残基与SEQIDNO: 1第11-30个残基有至少90%的相同性。具体来说， 这20个连续氨基酸残基与SEQIDNO: 1第11 - 30个残基的氨基酸序列相同性可为约90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。
[0052] 在一实施例中，所述的合成肽具有SEQIDN0:1所示的序列，其长39个氨基酸。下 文亦将此合成肽称为39-聚体。此种39-聚体肽对应于人PEDF的第83-121位残基，因此 是已知PEDF的44-聚体片段（PEDF第78 - 121号残基）的一种较短的变体。
[0053] 本发明人先前所做的实验（如待批美国专利申请第13/428996号，在此将该在先 申请的内容一并纳入为本说明书的一部分）与本文所提供的实验显示，其它数种来自此 39-聚体的短PEDF合成肽也能够用以预防和/或缓和皮肤老化。
[0054] 譬如，由下文与在先申请的实验可知，SEQIDN0:2(ALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDL ISSPDIHGT)所示的34-聚体合成肽能够有效地预防和/或缓和个体的皮肤老化。此34-聚 体合成肽对应于人PEDF的第88 - 121号残基。根据上文所述的计算两条给定序列之间的 序列相同性百分比的方法，此34-聚体与39-聚体的氨基酸序列相同性为100%，且34-聚 体的第6 - 25号氨基酸残基与39-聚体的第11 - 30号氨基酸残基的氨基酸序列相同性也 是 100%〇
[0055]此外，下文多个实施例证明，SEQIDN0:3(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所 示的29-聚体合成肽能够有效预防和/或缓和个体的皮肤老化。此29-聚体合成肽对应 于人PEDF的第93 - 121号氨基酸残基；其与39-聚体的氨基酸序列相同性为100%。且此 29-聚体的第1 - 20号氨基酸残基与39-聚体的第11 - 30号氨基酸残基的氨基酸序列相同 性亦为100%。
[0056] -些实施例中，已证实24-聚体亦可有效预防和/或缓和个体的皮肤老化。此 24-聚体的序列如SEQ ID N0:5(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSP)所示，且对应于人PEDF第 93 - 116号氨基酸残基。此外，此24-聚体肽与39-聚体具有100%的氨基酸序列相同性， 其中其前20个氨基酸残基与所述39-聚体第11 - 30号氨基酸残基具有100%的氨基酸序 列相同性。
[0057] 在其它实施例中，已证实20-聚体亦可有效预防和/或缓和个体的皮肤老化。该 20-聚体具有SEQIDN0:6所示的序列（SLGAEQRTESIIHRALYYDL)。此20-聚体的序列对应 于人PEDF第93- 112号氨基酸残基，其与39-聚体的第11 -30号氨基酸残基完全相同（氨 基酸序列相同性：100% )且其相较于39-聚体的氨基酸序列相同性同样也是100%。
[0058] 本案与在先申请所揭载的实验亦显示，另外有两种衍生自小鼠PEDF的合成肽同 样也能够有效地预防和/或缓和个体的皮肤老化。第一种衍生自小鼠的肽在本公开中称 为Mo29-聚体，其序列如SEQIDN0:8(SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST)所示，此序列与 39-聚体的氨基酸序列相同性为83%，且其前20个氨基酸残基与39-聚体第11 - 30位残 基的氨基酸序列相同性为90%。另一种衍生自小鼠PEDF的合成肽称为Mo20-聚体，其序 列如SEQIDN0:9(SLGAEHRTESVIHRALYYDL)所示。Mo20-聚体与 39-聚体或 39-聚体的第 11 - 30号氨基酸残基的氨基酸序列相同性皆为90%。
[0059] 在可任选的实施例中，所述的合成肽中有至少四个连续的氨基酸与SEQIDNO: 1 的氨基酸残基11-14相同。据信SEQIDNO: 1所示序列的第11-14号氨基酸残基（即 SLGA)对于维持短PEDF合成肽的生物学功能扮演了重要的角色。举例来说，下文提出的多 个实施例显示，不具有此SLGA残基的18-聚体肽（EQRTESIIHRALYYDLIS;SEQIDN0:7)无 法保护个体对抗皮肤老化。此外，由本案与在先申请所载的实验可以发现，不含SLGA残基 的25-聚体肽（EQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT;SEQIDN0:4)也无法有效预防和/或缓和个 体的皮肤老化。
[0060] 可利用常用技术来合成本发明的合成肽，譬如使用t-B0C或FM0C来保护a-氨 基。这两种方法都采用了逐步合成法，由该肽的C端开始，每次加上一个氨基酸。亦可利用 已知的固态肽合成法来合成本发明的合成肽。
[0061] 本发明的范围亦涵盖了其它相较于39-聚体具有保守性突变的合成肽。本文所用 术语"保守性突变"指利用另一种在生物学上相似的残基来取代某一残基。保守性突变的 例示包括疏水性残基（如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸与甲硫氨酸）彼此间的置换，或极性残 基（如精氨酸与赖氨酸；或谷氨酸与天冬氨酸，或谷氨酰胺与天冬酰胺）彼此间的置换等。 "保守性突变"在此亦指利用取代的氨基酸来取代未取代的原始氨基酸，只要针对该取代的 多肽产生的抗体也能与该未取代的多肽发生免疫反应即可。
[0062] 依据本发明多种实施例，所述的皮肤老化是由紫外线（特别是UVB)照射所引起 的。
[0063] 依据本公开多种实施例，所述的个体可以是归类为哺乳动物的任何动物，包括人。
[0064] 亦可将上述实施方式所述的各种合成肽配制成一药物组合物，用以预防和/或缓 和个体皮肤老化；此种药物组合物即属于本发明另一方面之范围。
[0065] 根据本公开一实施方式，上述药物组合物包含任一根据本发明上述方面/实施例 的合成肽，且此合成肽的含量足以预防和/或缓和该个体的皮肤老化。此药物组合物亦包 含可用以携带该合成肽的药学上可接受的赋形剂。
[0066] 可根据既有的药学程序来制备上述药物组合物，譬如《雷明顿制药科学》 (Remington'sPharmaceuticalSciences)(第 17 版，AlfonosoR.Gennaro编，麦克出版 公司（MackPublishingCompany)，伊斯顿，宾夕法尼亚（1985)) -书中有详细的记载。 [0067] 在选择适用于投递合成肽的赋形剂时，主要需考虑此药物组合物的给药方式。根 据本发明的可任选实施例，该药物组合物或含于其中的该合成肽可经皮递送至个体的真 皮；因而，此处可使用任何适用于此途径的赋形剂。可使用皮肤学上可接受的各种惰性赋形 剂。典型的惰性赋形剂可以是例如水、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、矿物油、硬脂醇、及可 形成胶状物的材料。
[0068] 于可任选的实施例中，可先将合成肽包埋在可形成微泡的载体中，如脂质体、微球 体或纳米体（nanosome)，而后再配制成所欲的剂型。这些可形成微泡的载体可促进本发明 合成肽的经皮递送效率。此外，它们可作为缓释剂型，以确保该治疗可提供较长效的治疗作 用。
[0069] 在一替代性或可并用的方案中，此药物组合物还可包含一种可任选的穿透促 进剂，其能够促进合成肽或药物组合物的经皮递送效率。举例来说，穿透促进剂能够 打乱原本规则排列的角质层脂质、和细胞间蛋白质相互作用，或提升药物、共同促进剂 (co-enhancer)或载体进入角质层的比例（partition)。穿透促进剂的例子包括但不限 于：亚砜化合物如：二甲亚砜（DMS0)与二甲基甲酰胺（DMF);氮酮化合物，如：1_正十二 烷基氮杂环庚烷-2-酮；吡咯烷酮，如：N-甲基-2吡咯烷酮；油，如：萜油与L-薄荷醇；恶 唑烷酮，如：4_癸基恶唑烷-2-酮；脂肪酸，如：月桂酸、肉豆蔻酸与癸酸；乙二醇，如：二甘 醇与四甘醇；表面活性剂，如：聚氧乙烯-2-十八烯基醚与聚氧乙烯-2-硬脂醚；穿孔肽 (pore-formingpeptides)，如：爪蟾抗菌肽；以及细胞穿透肽，如：转运素（transportan) 与穿透肽（penetratin)。
[0070] 同样可任选地，本发明的药物组合物亦可包含所属技术领域中具有通常知识者所 熟知的药学上（尤其是皮肤学上）可接受的一或多种添加剂。上述添加剂包括但不限于： 干燥剂、抗痒剂、 抗发泡剂、缓冲剂、中和剂、pH调节剂、着色剂、脱色剂、润肤剂、乳化剂、乳 液稳定剂、增黏剂（viscositybuilders)、保湿剂、添味剂（odorants)、防腐剂、抗氧化剂、 化学稳定剂、增稠剂、硬化剂、或悬浮剂。
[0071] 依据本发明多种实施例，所述药物组合物可调制成各种适合经皮递送的剂型，如 溶液、喷剂、气雾剂、泡沫、霜剂、洗剂、软膏、凝胶或敷料。
[0072] 根据本公开的可任选实施例，此药物组合物中所述合成肽的含量为约0. 1 _ 100 1^;较佳为约1-25 1^。举例来说，合成肽的浓度可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.3、 0?7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95或100yM。具体而言，下文实施例中针对约20克重的小鼠所用的浓度为约25yM。 本发明所属技术领域具有通常知识者可基于本说明书提出的动物给药剂量计算出本发明 合成肽或药物组合物的人体等效剂量（HE?。譬如，美国食品暨卫生管理局（FDA)已批准了 工业指南，题为"成年健康志愿者临床治疗实验中最大安全起始剂量的估算"（Estimating theMaximumSafeStartingDoseinInitialClinicalTrialsforTherapeuticsin AdultHealthyVolunteers)〇
[0073] 在又一方面中，本发明提出了一种用以预防和/或缓和个体的皮肤老化的方法。 所述个体可以是任何哺乳动物，包括人类。根据本公开的原则和精神，所述皮肤老化由UV 辐射引起。
[0074] 于一实施例中，上述方法包含对该个体给予有效量的根据本发明上述方面/实施 例的合成肽，藉使所述肽经皮递送至个体的真皮。
[0075] 于可任选的实施例中，可将所述合成肽配制为上述本发明方面/实施例所述的药 物组合物。
[0076] 于一实施例中，可将所述药物组合物以局部施用至该个体的皮肤，在使用或不使 用外来刺激的情形下，所述合成肽或药物组合物经皮递送至该个体的真皮。
[0077] 在不使用外来刺激时，可将该药物组合物局部涂敷、涂抹、按摩、喷涂或其它方式 施用至该个体的皮肤上。此时，所述药物组合物较佳可包含至少一种任选的上文所述的穿 透促进剂。或者或此外，亦可根据上文所述的方法，将合成肽包裹以促进合成肽的经皮递送 效率。
[0078] 已知有多种外来刺激可增加皮肤对化合物（如本发明合成肽）的通透性。所述的 外来刺激包括但不限于：机械刺激、电刺激、热刺激、超声波刺激或无线射频刺激。于实际操 作中，可在将上述组合物施用至皮肤之前、同时或之后，对皮肤施加此外来刺激。相似地，搭 配外来刺激来协助所述药物组合物或合成肽之投递时，组合物中亦可任选的包含上述穿透 促进剂和/或微泡形成载体。
[0079] 于一实施例中，可利用具有微结构的施用器对皮肤施加机械刺激；上述施用器如 微针系统或微通道系统。微针系统可具有多个实心或中空的微针，微针的长度约为100-1000UM。采用实心微针系统时，可将本发明合成肽或药物组合物涂布于每一微针的尖端，施 用时，微针会穿过角质层并停留于皮肤中，因而可将本发明合成肽或药物组合物递送至真 皮。使用中空微针系统时，可将组合物调制为液态，而后将其填充于每一微针内部的空腔， 施用后，微针穿透皮肤，使液体由装置流入皮肤的真皮内。或者是，可将本发明的药物组合 物局部施用于皮肤上，而后将具有多个微针的微通道系统压到皮肤上，而使得多根微针穿 过皮肤（穿透深度小于100微米），藉以在皮肤上行成多个微通道，而使得该药物组合物能 够经皮递送。又或者是，可先于皮肤上形成上述微通道之后，再将本发明药物组合物局部施 用于皮肤上。
[0080] 此外，本公开任选实施例的合成肽或局部给予的药物组合物可在指定条件下给予 (如特定的湿度或温度）。譬如在较为温暖潮湿的条件下给药可促进合成肽在目标位置的 吸收。
[0081] 下文提出多个实施例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有 通常知识者实施本发明。不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人 员在阅读了本文的描述后，可完整利用本发明。本文所引用的所有公开文献，其全文均以引 用的方式纳入本文。
[0082] 实验例
[0083] 材料与方法
[0084]〈材料〉
[0085]DMEM培养基、胎牛血清（FBS)与0.25%胰蛋白酶皆购自英杰生命技术有限公 司（Invitrogen，加利福尼亚，卡尔斯巴德）。轻矿物油、甘油、二甲亚砜（DMS0)、牛血清 白蛋白（BSA)、5_ 溴-2' -脱氧尿苷（简称fcdU)、Hoechst33258 染料、Hoechst33342 染 料、抗-肌动蛋白抗体与其它化学材料皆购自西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich，圣路 易斯，密苏里州）。分散酶II与I型胶原酶购自罗氏（印第安纳州，印第安纳波利斯）。 抗-BrdU抗体（GTX42641)、抗-MMP-1抗体与抗-波形蛋白抗体（GTX100619)皆购自基泰 (GeneTex，台北，台湾）。抗-胶原蛋白1A1抗体购自圣克鲁斯生物技术公司（SantaCruz Biotechnology，加利福尼亚，圣克鲁斯）。各种焚光染料结合的二级抗体皆购自生物传奇公 司（BioLegend，加利福尼亚，圣地亚哥）。苏木精与曙红（H&E)染料购自默克（美国新泽西 州，雷威（Rayway))。
[0086] 合成FITC-结合之29-聚体与其它短合成肽（包括29-聚体（SEQIDN0:3)、24-聚 体（SEQIDNO: 5)、20-聚体（SEQIDNO: 6)与 18-聚体（SEQIDNO: 7))，并将其N端乙酰 化、C端酰胺化而进行修饰。然后以质谱仪（金斯瑞，新泽西州皮斯卡塔市）表征修饰的肽 (纯度>95% )。以DMS0重构各PEDF衍生的短合成肽（所述29-聚体、24-聚体或20-聚 体，下文称为PEDF肽），制成浓度为5mM的储备溶液，并储存于-20°C中以供后续使用。
[0087]将白凡士林（10%w/w)、甘油（10%w/w)与轻矿物油（1%w/w)和蒸馏水混合，以 制得皮肤软膏。将5y1的PEDF肽储备溶液溶解在lg的乳膏中，以制得含PEDF肽的乳膏。 对于用在载体对照的软膏，将5y1DMS0溶解在lg软膏中。
[0088] 〈动物〉
[0089] 本公开所载实施例所用的所有动物皆饲育于有温度与湿度控制的饲养笼中，饲养 温度约24°C至25°C，光暗循环为12 :12小时。试验过程中提供饮水与标准使用时饲料供任 食。实验计划皆通过马偕纪念医院（新北市，台湾）伦理委员会核准，并遵循国家动物保护 相关规范。
[0090]〈自小鼠真皮分离并培养皮肤成纤维细胞〉
[0091] 由C57BL/6小鼠背部取得完整深度的皮肤组织。小心地由该皮肤切下皮下组织， 并以无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS)冲洗三次。之后将组织切成小片（l-2mm3)。在4°C下以 〇. 1 %的分散酶过夜后，移除表皮层；余下的真皮组织在37°C下以0. 1 %的胶原酶I处理4 小时。透过离心（400g，5分钟）收集消化的细胞，并重新悬浮于高葡萄糖浓度的DMEM培养 基中，上述培养基中添加了FBS(10% )、L-谷酰胺（2mM)与青霉素/链霉素（1% )。以每 平方厘米IX103个细胞的密度将细胞接种于组织培养板上（福康实验室设备公司（Falcon Labware)，美国新泽西）上，并于37°C与5%二氧化碳的环境下维持。24小时后，弃置培养 基以移除未吸附细胞，并补充新鲜培养基。欲进行继代时，利用0.25%胰蛋白酶/EDTA)来 收集几近长满的细胞。
[0092] 〈WS-1细胞培养〉
[0093] 人皮肤成纤维细胞WS-1细胞系取自财团法人食品工业发展研宄所（新竹，台湾）。 在湿度调节的培养箱内于37°C、5%二氧化碳的条件下，将WS-1细胞以单层形式培养于培 养瓶中。细胞在10%FBS-DMEM中培养，该培养基添加了L-谷酰胺（2mM)、非必须氨基酸 (0.ImM)与青霉素/链霉素（1% )。欲进行继代时，利用0.25%胰蛋白酶/EDTA来收集几 近长满的细胞。
[0094]〈组织学〉
[0095] 皮肤样品经4%多聚甲醛固定后，以一系列浓度梯度的乙醇脱水，再以石蜡包埋。 将组织切成约5-ym的薄片。于使用前，在二甲苯中移除固定样品的石蜡，并以一系列浓度 梯度的乙醇恢复。
[0096]利用苏木精与曙红（H&E)染色进行一般组织学观察。根据制造商所述方法，利用 麦森三色染剂（西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州）将脱蜡的皮肤组织切片染色。 以尼康Eclipse80i光学显微镜观察样品并撷取影像（原始倍率：400倍）。欲对胶原蛋 白面积进行半定量分析时，在光学显微镜下自每一玻片选取10个视野，并利用Image-Pro Plus4. 5. 1系统（传媒控制公司（MediaCybernetics))来测量整个切片面积中，经蓝色染 色之区域的面积（mm2/mm2)。
[0097]〈免疫荧光染色与BrdU染色〉
[0098] 细胞经4%甲多聚醛固定后后，以冷甲醇处理2分钟，接着在室温下以1NHC1处理 1小时，而后再进行免疫荧光染色。
[0099] 欲进行动物实验时，在DMS0中重构BrdU，获得储备溶液（80mM)。将10y1的BrdU 储备溶液和90y1的PBS混合后，经腹膜内注射至小鼠体内，并于16小时后将小鼠安乐死。 将经甲醛固定与石蜡包埋的皮肤样品置于二甲苯中，以移除石蜡，并以一系列浓度梯度的 乙醇恢复。接着将样品在室温下和INHC1接触1小时，再进行后续的免疫荧光染色分析。
[0100] 利用抗-BrdU多克隆抗体与若丹明结合的驴-抗-兔-IgG来侦测经BrdU标记的 DNA。接着，以Hoechst33258染剂（蓝色）将细胞核进行对比染色。
[0101] 〈免疫印迹分析〉
[0102] 在冰冷的裂解缓冲液中使皮肤组织匀浆，该裂解缓冲液含有20mMHEPES(pH 7.4)、150mMNaCl、l%SDS、lmM乙二胺四乙酸（EDTA)、5mM苯基甲磺酰氟（PMSF)与ImM二 硫苏糖醇OTT)，1%TritonX-100,以及新加入的蛋白酶抑制剂混合物（购自罗氏，印第安 纳州，印第安纳波利斯）。接着将所得均质物在4°C下以12, 000g离心30分钟，收集上清液 储存于-70°C。利用Bradford分析法来测定裂解物中的蛋白质成分。使用上述裂解缓冲液 制备全细胞裂解物。接着将溶解物等份以SDS-PAGE分离后，电转到聚偏氟乙烯（PVDF)膜 (密理博（Millipore);得克萨斯州，贝德福德）上，而后进行免疫印迹分析。
[0103]免疫印迹分析中所用的抗体包含抗-I型胶原蛋白1A1抗体（稀释倍率：1 :1000)、 抗-MMP-1抗体（稀释倍率：1 :500)以及抗-0-肌动蛋白抗体（稀释倍率1:10000)。接着利 用适当的IgG-HRP二级抗体与ECL制剂（安玛西亚公司（Amersham);伊利诺斯州，阿灵顿山 庄）来侦测目标蛋白质。利用GS-700型成像比重计（伯乐公司（Bio-RadLaborator ies); 加州，赫克里斯（Hercules))来扫目苗X光片，并以Labworks4.0软件进行分析。定量分析 采用来自至少三个独立试验的印迹。
[0104] 〈RNA提取与反转录聚合酶链式反应〉
[0105] 利用TRIzol(英杰生命技术有限公司（Invitrogen))自细胞内提取出全RNA，并 以不含RNA酶的DNA酶1(恰根，加州，圣地克拉力塔（SantaClarita))处理以移除基因 组DNA，之后以RNA纯化试剂盒（Dynabeads，英杰生命技术有限公司）进行纯化。在20y1 的反应缓冲液（含〇? 25yg的随机引物与0? 8mMdNTPs)中加入1yg取自原代皮肤成纤 维细胞的全RNA与200单位的扩增反转录酶（罗氏，德国曼海姆），于42°C下反应1小时， 以将该RNA反转录为cDNA。取2y1的cDNA作为PCR反应模板。PCR反应的反应体积为 30y1，其中含有 15y1 的EconoTaq?PLUSGREEN2XMasterMix(Lucigen? 公司）、 1UM的各种引物以2y1的模板DNA。在18 - 22个循环的扩增反应中合成cDNA(变性：20 秒、94°C;退火：30秒、57°C;以及聚合：40秒、72°C)。选择每种引物组所用的循环数，使 其落在扩增的线性范围内。特异性PCR引物的序列是小鼠MMP-13 (登陆号：NM_008607)， 正向：ATCCTGGCCACCTTCTTCTT(SEQIDN0:12);反向：ITTCTCGGAGCCTGTCAACT(SEQID N0:13) ;PCR产物：201bp;和小鼠甘油醛3-磷酸去氢酶（GAPDH，登陆号：M32599)，正向： AACITTGGCAITGTGGAAGG(SEQIDN0:14);反向：ACACAITGGGGGTAGGAACA(SEQIDN0:15);PCR产物，223bp。利用含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，并以UV光照 使其显影。利用富士LAS-3000系统与MultiGaugeVer. 1.01软件（富士胶片株式会社， 日本东京）对PCR产物进行密度法定量分析。
[0106]〈统计分析〉
[0107] 将结果表示为平均值土平均值的标准差（SEM)。利用单向AN0VA分析来进行统计 比较。除非另有说明，P〈〇. 05时具有统计上的显著差异。
[0108] 实施例1
[0109]PEDF肽的经皮递送
[0110] 本试验采用荧光素（FITC)结合的29-聚体肽来研宄本发明PEDF肽的体内经皮递 送。
[0111] 首先，将8周龄磁性C57BL/6小鼠全身麻醉后，以融化的蜡/松脂（1 :1)混合物除 去其背部毛发。隔天，将含有FITC结合的29-聚体肽的软膏（浓度25yM)涂抹于小鼠背 部皮肤上，然后用微针片（3M?微通道皮肤系统，新加坡3M)轻轻按压于背部皮肤上，使得微 针穿透肌肤不超过100微米（FITC-29聚体/MN组）。对照组（S卩，FITC-29聚体/CT组） 小鼠涂抹软膏，但未进行后续微针处理。24小时候，收集皮肤样品，固定，低温切片，并以荧 光显微镜观察。图1提供了三次独立试验所得的代表性照片（原始倍率：400倍）。
[0112] 图1左图H&E染色切片突出显示了样品的表皮与真皮。图1中间与右图的荧光照 片呈现出FITC结合的29-聚体在皮肤样品中的分布情况。具体来说，FITC-29聚体/MN组 的表皮和真皮中皆可观察到荧光素发出的明显的绿色信号，代表FITC结合的29-聚体肽被 成功地递送至真皮中。相较之下，在FITC-29聚体/CT组中，绿色荧光素信号在真皮中几乎 检测不到，而大多数的荧光素信号都停留在表皮中。
[0113] 实施例2
[0114]PEDF肽增加皮肤胶原蛋白含量
[0115] 胶原蛋白构成真皮的主要基质成分，可形成坚固的纤维架构，为皮肤提供弹性。本 实施例研宄本发明PEDF肽是否能增加皮肤中胶原蛋白的含量。小鼠依实施例1所述的方 法脱毛后，随机分派至几个实验组中，并如下处理。每一只小鼠于背部中线的一侧（约2平 方厘米）上接受50y1的软膏（含29-聚体、20-聚体或DMS0的软膏），且之后进行微针处 理；在中线的另一侧仅接受50y1的相同软膏，而不进行微针处理。持续两周，每周进行两 次上述处理，皮肤直接暴露于空气中，并于第一次处理后14天取得皮肤样品。以麦森氏三 色染剂（蓝）将皮肤样品中的胶原蛋白染色；代表性照片请见图2。根据上文"材料与方法" 一节所述的方法来定量皮肤中经染色的胶原蛋白面积，所得结果以载体/MN组的面积为准 进行标准化。同样利用上文所述的免疫印迹分析来定量I型胶原蛋白C0L1A1的含量，所得 结果以载体/CT组的含量为准进行标准化。定量分析结果整理于表1。
[0116]表 1
[0117]
[0118] *P〈0. 05,相较于载体/MN组；**P〈0. 002,相较于载体/CT组。
[0119] 图2的照片显示，在29-聚体/MN与20-聚体/MN组的切片中，可观察到较为明显 的蓝色染色（相较于载体/MN组），故可推知以29-聚体或20-聚体搭配微针处理可增加真 皮中胶原蛋白含量。此外，比较载体/CT与载体/MN组的切片可以发现，单用微针处理并没 有提升胶原蛋白含量的效果。再者，载体/CT、20-聚体/CT与29-聚体/CT组别中，胶原蛋 白的含量没有明显的差异，表明不同受试个体间胶原蛋白的含量没有显著改变。
[0120] I型胶原蛋白（C0L1A1)是皮肤胶原蛋白的主要成分，免疫印迹分析显示29-聚体 /MN与20-聚体/MN处理可显著提高C0L1A1含量（相较于载体/CT对照组）。
[0121] 实施例3
[0122]PEDF肽促进皮肤成纤维细胞增殖
[0123] 成纤维细胞为人类皮肤中负责产生胶原蛋白的主要细胞，因而进行了多项体外与 体内分析，以评估本发明PEDF肽对皮肤成纤维细胞增殖的影响。
[0124] 实施例3.1
[0125]PEDF肽体外促进皮肤成纤维细胞增殖
[0126] 根据"材料与方法"一节的记载来分离并培养原代小鼠皮肤成纤维细胞。将第2代 的皮肤成纤维细胞以每孔2X105的密度接种于6孔板中以明胶涂覆的玻片上，并以生长培 养基（DMEM+10 %FBS)培养24小时，而后以仅含1 %FBS的基本生长培养基（对照组）或含 1 %FBS与50nM的PEDF衍生肽（即，29-聚体、24-聚体、20-聚体、18-聚体、Mo29-聚体或 Mo20-聚体）的培养基培养24小时。欲进行BrdU标记分析时，将BrdU(最终浓度10yM) 加入培养系统中2小时。另外，以成纤维细胞分子标记一波形蛋白（vimentin)来染色成纤 维细胞；代表性照片请见图3。BrdU-与波形蛋白双阳性细胞的数量表示为BrdU-与波形蛋 白双阳性细胞占全部波形蛋白阳性细胞的百分比（BrdU/波形蛋白标记指数）；结果整理于 表2。
[0127]表 2
[0128]
[0129]
[0130] *P〈0. 002,相较于未处理细胞。
[0131] 总结来看，培养于含有本发明实施例的PEDF肽（如29-聚体、24-聚体、20-聚体 与两种小鼠同源肽）的培养基中的皮肤成纤维细胞，其增殖活性较对照培养基高出5倍以 上。相反地，以不含SLGA序列的18-聚体处理时，则无法达到此种效果。
[0132] 实施例3. 2
[0133]PEDF肽体内促进皮肤成纤维细胞增殖
[0134] 将上文实施例2的样品染色，以侦测成纤维细胞分子标记（波形蛋白），并于显微 镜下计算波形蛋白阳性细胞数目（。
[0135]表 3
[0136]
[0137] *P〈0. 002,相较于载体/MN组。
[0138] 表3的数据显示，经29-聚体/MN与20-聚体/MN处理的样品在皮肤区域中具有 明显较高的成纤维细胞数量（相较于载体/MN组与单用载体组（即载体/CT组））。此结果 显示本发明PEDF肽的经皮递送与真皮中成纤维细胞的密度成正相关。
[0139] 为了探宄本发明PEDF肽的经皮递送是否能够促进体内皮肤成纤维细胞的增殖， 小鼠经PEDF肽/MN处理或载体/MN处理后，以腹膜内注射BrdU并于16个小时后安乐死。 皮肤切片染色侦测波形蛋白（绿色）与BrdU(红色）。BrdU-与波形蛋白双阳性细胞的数 量表示为BrdU-与波形蛋白双阳性细胞占全部波形蛋白阳性细胞的百分比（BrdU/波形蛋 白标记指数）；结果整理于表4。
[0140]表 4
[0141]
[0142] *P〈0. 05,相较于载体/MN组。
[0143] 由表4可以看出，相较于以含DMS0的软膏处理（载体/MN组）的切片，29-聚体/ MN与20-聚体/MN处理组的皮肤切片中有更多增殖的成纤维细胞。此结果显示，本发明合 成肽的经皮递送能够有效提升皮肤成纤维细胞的增殖活性。此处皮肤成纤维细胞增殖活性 提高的结果与本发明PEDF肽经皮递送提高胶原蛋白含量的结果（上表1)相呼应。
[0144] 实施例3.3
[0145]PEDF肽体内促进受光损伤皮肤中皮肤成纤维细胞的增殖
[0146] 已知紫外线辐射（UVB)会导致皮肤胶原蛋白基质断裂，进而导致成纤维细胞的细 胞周期停滞。因此，本实施例中我们研宄本发明PEDF肽的经皮递送是否可有效恢复因UVB 照射而受损的成纤维细胞的增殖活性。
[0147] 六周大的雌性裸鼠（BALB/cAnN.Cg-Foxnlnu/CrlNarl)背部以UVB照射，每周五 次，持续八周；所用光源包含五盏紫外线灯（型号为XL-1000B，Spectr〇linkerTM装置；发射 峰：312nm)，距离动物背部上方约20厘米。在UVB照射期间，小鼠可自由在笼内移动。照 射强度以最低红斑剂量（MED)来表示，实验中，前两周所用的照射强度为lMED(60mJ/cm2)， 之后逐步提升，第3到4周的照射强度为2MED(120mJ/cm2);第5到6周的照射强度提高至 3MED(180mJ/cm2);第7到8周的强度为4MED(240mJ/cm2)。经过8周UVB照射后，试验动 物背部出现了明显的皱纹，此时将动物随机分成以下4组，每组3只小鼠。在UVB/载体、 UVB/29-聚体、UVB/20-聚体与UVB/18-聚体等组别中，将350y1的软膏（分别含有DMS0、 29-聚体、20-聚体或18-聚体PEDF)施用至背部皮肤，之后利用微针片穿刺该经软膏处理 的皮肤而实现经皮递送。此外，以未经UVB照射的小鼠作为对照（正常组）。持续两周、每 周两次进行软膏/微针处理。在最后一次处理后，将BrdU经腹腔注射至小鼠体内，并于16 小时后安乐死。对所得皮肤切片染色以侦测波形蛋白与BrdU。BrdU-与波形蛋白双阳性细 胞的数量表示为BrdU-与波形蛋白双阳性细胞占全部波形蛋白阳性细胞的百分比（BrdU/ 波形蛋白标记指数）。定量结果整理于表5。
[0148]表 5
[0149]
[0150] *P〈0. 01，相较于正常组；**P〈0. 05,相较于UVB/载体组。
[0151] 由表5可以看出，相较于未经UVB照射的皮肤（正常：4. 1±0. 8% )，经UVB照射 后（UVB/载体：2. 1±1. 1%)，皮肤成纤维细胞的增殖活性降低了约50%。另一方面，在UVB 照射后，经皮递送29-聚体与20-聚体可将皮肤成纤维细胞的增殖活性提高约2. 5倍（相 较于UVB/载体组）。可注意到，经29-聚体或20-聚体处理的动物的增殖活性甚至高于未 经UVB照射的动物，虽然此差异较不显著。相反地，不具有SLGA序列的18-聚体则无法促 进皮肤成纤维细胞的增殖。
[0152] 总结来说，实施例3 (包括实施例3. 1至3. 3)中的各种数据证实，本发明PEDF肽 能够有效促进正常皮肤组织（即，未经过辐射照射）中皮肤成纤维细胞的增殖活性，亦可提 升经光照而受损的皮肤组织（即，经UVB照射并具有该照射导致的明显皱纹）中皮肤成纤 维细胞的增殖活性。由于成纤维细胞负责胶原蛋白合成，提升的成纤维细胞增殖活性以及 所导致的较高的成纤维细胞密度可能有助于提升胶原蛋白合成。因此，本发明PEDF肽能够 引发皮肤的内生修补机制而刺激胶原蛋白合成。
[0153] 实施例4
[0154]PEDF肽降低由UVB引发的MMP-1表达
[0155]MMP-1 (间质胶原酶）是唯一一种能够切断I型与III型胶原蛋白中胶原蛋白三股 螺旋的酶。此外，MMP-1是人类皮肤中的主要溶胶原酶，且响应UV辐射而上调。啮齿类动 物不具有MMP-1基因，这些动物中其功能则由MMP-13来取代。因此，本实施例之目的在探 讨本发明合成肽是否能够降低由UVB照射引发的MMP-1与MMP-13的表达。
[0156] 我们的初步实验显示，在经过15mJ/cm2的UVB照射后，细胞存活率为对照的细胞 存活率的95%以上（数据未显示）。人类皮肤成纤维细胞（WS-1细胞）与原代小鼠皮肤成 纤维细胞经过l〇〇nM29-聚体预处理24小时未使细胞存活率有明显改变（数据未显示）， 且如转移盘（transwell)实验所测也未使细胞迀移有明显的改变（数据未显示）。我们还 发现，此剂量的UV照射导致MMP表达量增加。因此以下实验所用的照射量为15mJ/cm2。
[0157] 将WS-1细胞以IX105个细胞的密度培养于六孔板上，并于10%FBS-DMEM培养基 中培养24小时，之后以添加或未添加100nMPEDF肽的1 %FBS-DMEM培养基再培养24小 时。细胞经PBS冲洗两次后，以PBS覆盖并照射UVB。在细胞培养通风橱中，以UVB灯（型号XL-1000B，Spectrolinker?公司）进行照射，最终剂量为15mJ/cm2,照射时间约100秒。以 台盼蓝拒染实验来分析细胞存活率（大于95% )。在UVB照射之后，以添加或不添加PEDF 肽的1%FBS-DMEM来取代PBS，并继续培养48小时，之后蛋白质印迹法分析蛋白提取物中 的MMP-1蛋白质表达。以未经过UVB照射的细胞作为对照（正常组）。以载体/UVB组的表 达量（设定为100% )为准，将MMP-1的表达量标准化，定量分析结果如表6所示。
[0158]表6
[0159]
[0160] *P〈0. 02,相较于载体/UVB组。
[0161] 比较载体/UVB与正常组，可以发现UVB照射会导致MMP-1蛋白质的表达量大幅提 高（载体/UVB组：100% ;正常组：约5%)。然而，成纤维细胞经过29-聚体、24-聚体或 20-聚体预先处理后，可使得MMP-1蛋白质水平大幅降低至载体/UVB组的约二分之一。
[0162] 将单层细胞培养第二代的原代小鼠皮肤成纤维细胞于添加或未添加100nMPEDF 肽的1 %FBS-DMEM培养基中培养24小时，之后根据上文所述的方法进行UVB照射。于UVB 照射结束后，以添加或不添加PEDF肽的1 %FBS-DMEM来取代PBS，并继续培养24小时；接 着提取细胞的总RNA并进行后续的RT-PCR分析。以载体/UVB组的表达量（设定为100% ) 为准，将MMP-13的表达量标准化，定量分析结果如表7所示。
[0163]表7
[0164]
[0165] *P〈0.0001，相较于载体/UVB组。
[0166] 表6的发现相似，MMP-13的表达量也因UVB照射而上调（UVB/载体组相对于正 常组）。此外，在经过本发明PEDF肽处理的细胞中，所述上调明显减低（29-聚体/UVB组、 24-聚体/UVB组与20-聚体/UVB组相较于载体/UVB组）。另外，不含SLGA序列的18-聚 体则没有降低受UVB引发的MMP-13表达量上调。
[0167] 这些结果显示，本发明PEDF肽可保护人类皮肤成纤维细胞对抗UVB引发的MMP-1 诱导。MMP-1所导致的I型胶原蛋白降解是光老化的关键贡献因子。因此，本发明PEDF肽 可做为抗光老化剂使用。
[0168] 实施例5
[0169]PEDF肽减少紫外线引发的皱纹
[0170] 皱纹形成和反复暴露于紫外线照射有紧密的关联。具体来说，UVB照射可胶原蛋 白降解并可抑制真皮内前胶原的生物合成；进而导致胶原蛋白损失而形成皱纹。本实施例 中，我们探宄了本发明PEDF肽在裸（即无毛）鼠体内的抗皱纹效果。根据上文实施例3. 3 所述的方法，对小鼠进行八周的UVB照射以引发皱纹。在UVB照射之前（正常）、UVB照射 后（UVB/UT)与经过两周软膏处理（UVB/载体、UVB/29-聚体、UVB/20-聚体与UVB/18-聚 体）后，撷取小鼠外观照片，代表性照片如图4所示。
[0171] 由图4可以看出，经UVB照射后，小鼠会形成大量既深且长的皱纹（正常组相较 于UVB/UT组）。接受含载体或18-聚体的软膏处理的小鼠同样具有既深且长的皱纹，表明 18-聚体无法减少原本受UVB照射而形成的皱纹。相较之下，在经过本发明PEDF肽（如， 29-聚体与20-聚体）处理的小鼠中，皱纹的数量较少也较浅（相较于UVB/UT、UVB/载体 与UVB/18-聚体组别）。
[0172] 对皮肤样品进行麦森氏三色染色，以估计胶原蛋白含量，代表性照片如图5(原始 倍率：200倍）所示。此外，利用免疫印迹分析来研宄I型胶原蛋白（C0L1A1)的含量，并以 未经照射的正常组的含量（设定为100% )为准，将所得结果标准化。定量结果整理于表 8〇
[0173] 表 8
[0174]
[0175] *P〈0. 0001，相较于未照射组；**P〈0. 001，相较于UVB/载体组。
[0176] 同时参照图5与表8,可以发现相较于未处理的正常组中的正常小鼠，反复暴露于 UVB中会使真皮中的胶原蛋白信号以及C0L1A1含量大幅降低（UVB/UT组）。相反地，经皮 递送本发明PEDF肽（如，UVB/29-聚体与UVB/20-聚体组）明显提升真皮中胶原蛋白与 C0L1AL的含量（相较于UVB/载体组）。这些结果显示，经皮递送本发明PEDF肽可在经UVB 损伤的真皮中引发胶原蛋白合成，此结果可进一步证实本发明PEDF肽处理的小鼠中减少 的皱纹形成。
[0177] 本公开首度证实以经皮递送短的PEDF合成肽能够对抗皮肤老化。相较于以静脉 内或肌肉内注射来投递表达全长PEDF肽的载体而言，经皮递送短的PEDF合成肽不但较为 安全，且成本也相对低廉。
[0178] 应理解，上述实施方式仅仅是以实施例的方式提供，本领域技术人员可作出各种 改动。上述说明书、实施例和数据完整地描述了本发明示例性实施方式的结构和用途。虽 然较详尽地或结合一个或多个实施例描述了本发明的各实施方式，但本领域技术人员在不 悖离本发明原理与精神的情形下可对所公开的各实施方式作出各种改动。
【主权项】
1. 合成肽在预防和/或缓和个体皮肤老化中的用途，其中，所述合成肽由长20 - 39 个氨基酸残基并与SEQIDNO:l具有至少80%的氨基酸序列相同性的氨基酸序列组成，其 中，所述氨基酸序列含有的至少20个连续的残基与SEQIDNO: 1的残基11 一 30具有至少 90%的氨基酸序列相同性。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述合成肽的至少4个连续的残基与SEQID NO: 1的残基11 一 14相同。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述皮肤老化是光老化。4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述个体是人。5. -种用于预防和/或缓和个体皮肤老化的药物组合物，其特征在于，所述药物组合 物含有： 有效量的权利要求1的合成肽；和 药学上可接受的赋形剂。6. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述合成肽的至少4个连续的残基与 SEQIDNO: 1的残基11 一 14相同。7. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为溶液、喷剂、气雾 剂、泡沫、面霜、洗剂、软膏、凝胶或敷料的形式。8. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有穿透增强剂。9. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述皮肤老化是光老化。10. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述个体是人。11. 一种预防和/或缓和个体皮肤老化的方法，其特征在于，所述方法包括： 通过经皮递送权利要求1所述的合成肽至个体的真皮而将有效量的所述合成肽给予 该个体。12. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述合成肽的至少4个连续的残基与SEQ IDNO: 1的残基11 一 14相同。13. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述合成肽被配制成含有所述合成肽和 药学上可接受的赋形剂的药物组合物。14. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述药物组合物为溶液、喷剂、气雾剂、泡 沫、面霜、洗剂、软膏、凝胶或敷料的形式。15. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，经所述药物组合物局部给予至该个体的 皮肤。16. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，在局部给予所述药物组 合物之前、同时或之后，对该个体的皮肤施加外来刺激。17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述外来刺激是机械、电、热、超声波或无 线射频刺激。18. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述药物组合物还含有穿透增强剂。19. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述皮肤老化是光老化。20. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述个体是人。
【专利摘要】本发明提供一种合成肽，该合成肽由具有20–39个氨基酸残基，且其序列与SEQ ID NO:1具有至少80％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列组成，其中，该氨基酸序列含有的至少20个连续氨基酸残基与SEQ ID NO:1的第11–30位氨基酸残基具有至少90％的氨基酸序列相同性。本发明还提供含有此合成肽的组合物及其在预防和/或缓和皮肤老化中的用途。
【IPC分类】C07K14/435, A61Q19/08, A61K38/17, A61K38/10, A61P17/00, C07K7/08
【公开号】CN104903346
【申请号】CN201280077079
【发明人】曹友平, 何宗权
【申请人】财团法人台湾基督长老教会马偕纪念社会事业基金会马偕纪念医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2012年9月19日
【公告号】EP2897976A1, US20150232523, WO2014043861A1
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