肽的制作方法
肽的制作方法
【专利说明】肽 发明领域
[0001] 本发明涉及肽，其至少部分可衍生于VIII因子（FVIII)。所述肽可以用于减少或 阻止VIII因子抑制物抗体的形成（例如在A型血友病治疗和获得性血友病中）。
[0002] 发明背景
[0003] 血友病
[0004] 血友病属于一组可遗传血液病症，其包括A型血友病、B型血友病（Christmas病） 以及冯维勒布兰德氏病（VonWillebrand'sdisease)。
[0005] 在血友病中，由于基本凝血因子部分或完全缺失，血液凝结的能力严重降低，导致 出血时间增加。
[0006]A型血友病是凝血因子VIII的缺陷，而B型血友病是凝血因子IX的缺陷。在两种 疾病中，缺陷基因发现于X染色体上，因此这些病患是X连锁的。A型血友病比B型血友病 常见五倍。
[0007] 血友病是一种终身的遗传基因病患，其影响作为携带者的女性以及遗传病患的男 性。约三分之一的新诊断没有以前的家族史。其出现于世界各地，并在所有人种群体中发 生。在英国，约有6000人受到血友病的影响。
[0008] 血友病患者在损伤后长时间出血。外部损伤例如割伤和擦伤通常不造成严重问 题；通过应用一定程度的压力并覆盖受到影响的区域（例如使用膏药），通常可能止血。
[0009] 主要的问题是进入关节、肌肉和软组织的内出血，其可以自发发生。内出血例如进 入脑部的出血非常难以应对，并可能致命。关节中的反复出血导致剧烈的疼痛并可能导致 关节炎和/或长期关节损伤，导致残疾。
[0010] 血友病的治疗通常是通过置换缺失的凝血因子。在轻度或中度血友病中，可以在 出血发生时给予注射（按需治疗）。然而，在重度血友病中，给予定期预防性注射来帮助血 液凝结，并最小化长期关节损伤的可能性。
[0011]A型血友病的凝血因子置换疗法的潜在严重并发症是中和VIII因子促凝血功能 的抗体的形成。VIII因子抑制物发生于大约25%的重度A型血友病中。由于患有先天性A 型血友病的患者可能是FVIII遗传缺陷的，抑制物的合成是针对施用来阻止或治疗出血事 件的外源蛋白的同种免疫应答。
[0012] ⑶4+T细胞在针对FVIII的免疫应答中扮演中心角色。在被抗原提呈细胞 (APCs)吸收后，FVIII经历蛋白降解为肽片段（Reding等，（2006)Haemophilia12(supp 6) 30-36)。这些肽然后与MHCII类分子联合，提呈在APC的表面。这一复合物然后被FVIII 特异性的CD4+T细胞的T细胞受体识别。在合适的共刺激信号存在下，这一识别最终引起 CD4+细胞指导B细胞的抗体合成。
[0013] 抑制物形成的发生率最初随着VIII因子治疗的数量而增加，但在50-100暴露天 数后似乎达到稳定。抑制物的形成在重度血友病中比在中度或轻度疾病中更为常见，并且 一些分子缺陷（最清楚的是VIII因子轻链中的大缺失和无义突变）似乎偏向于抑制物的 形成。参数例如浓度、置换因子的类型（纯化的或重组的），以及治疗史也可能影响抗体产 生的可能性。
[0014] 带有抑制物的血友病患者的处理是持续的挑战。使用脱敏技术的免疫耐受诱导 (ITI)在一些带有针对VIII因子的同种抗体的相同患者中是成功的。这种治疗方法要求对 因子置换疗法的进行中的暴露，因此是一种长期的策略。
[0015] 虽然ITI可以是成功的，但相当大比例（约30% )的患者未能对ITI响应。带 有高抑制物滴度的患者不太可能对治疗响应。另一个重要的影响因素是ITI开始时的年 龄，当患者超过20岁时，成功率大幅下降（Hay等，（2005)SeminarsinThrombosisand Hemostasis32:15-21)。
[0016]当ITI疗法不成功时，抑制物通常会存留一生，并且因为这些病人通常是高反应 者，必须使用FVIII绕过产品（例如活化的凝血酶原复合物浓缩物（FEIBA?)，以及重组活化 的FVII)治疗出血事件。然而，这些试剂的使用与不良反应关联，例如弥散性血管内凝血， 急性心肌梗塞，肺检子和血检形成（Acharya和DiMichele(2006)BestPractice&Research ClinicalHaematology19:51-66)。
[0017] 免疫抑制疗法有时用于未能对ITI反应的患者。治疗包括施用免疫抑制药物例如 环磷酰胺（cyclophosphamide)、泼尼松（prednisone)、硫挫嗓呤（azathioprine)和环抱素 (cyclosporine)，其非特异性靶向免疫系统。这些治疗可以具有与一般的免疫抑制相关的 副作用。
[0018]对使用Rituximab?(-种针对B细胞⑶20抗原的人源化单克隆抗体）的选择性B细胞耗竭有新的兴趣。然而，在一些使用这种药物治疗的儿童中发生了输注反应、血清病 以及机会性感染（X*iMichele(2007)JThrombHaemost5:143-50)。
[0019] 获得性血友病
[0020] 获得性血友病是一种罕见的自身免疫病患，其在每百万人中影响1到4个人。在 这种病患中，生来没有血友病的受试者形成出针对一种凝血因子例如VIII因子的抗体。据 认为怀孕和自身免疫疾病例如类风湿性关节炎和癌症可能增加形成获得性血友病的风险。 虽然引起其产生的根本免疫机制不同，在响应凝结因子置换疗法中产生的FVIII抑制物的 临床表现和那些在获得性血友病中产生的FVIII抑制物的临床表现类似。
[0021] 获得性血友病患者具有接近25%的死亡率，部分因为获得性抑制物和严重出血并 发症相关。获得性自身抗体抑制物的疗法主要是基于需要控制或阻止急性出血并发症（其 通常威胁生命和肢体），其次是根除自身抗体来恢复正常凝血。
[0022] -些与低滴度自身抗体抑制物（〈5个Bethesda单位）相关的出血可以通过高剂 量FVIII浓缩物的施用有效治疗。猪FVIII浓缩物曾经被认为是用于获得性血友病相关出 血的重要一线疗法，因为其是提供在实验室中实际测量输注后FVIII凝结活性水平的机会 的唯一置换疗法。因为猪血浆库被猪细小病毒污染，这一产品在2004年从市场上移除。现 在，"绕过"试剂是最为常用的，但存在促凝性（thrombogenicity)的潜在风险，并且对于每 个产品仅有约80%的效力。通过血衆除去法（plasmapheresis)和身体外免疫吸附的血衆 置换对于临时减少抑制物滴度，使得足以绕过试剂或FVIII置换提供充分止血可以是必要 的。
[0023]自身抗体抑制物的根除依赖于免疫抑制措施，例如：（1)在3-6周中施用 30% -50%效力的皮质类固醇；（2)使用细胞毒性和骨髓抑制性化疗试剂，例如环磷酰胺、 环孢素、2-氯脱氧腺苷；（3)使用静脉内免疫球蛋白的免疫调节；以及（4)使用利普西单抗 (rituximab)的选择性B淋巴细胞耗竭。Rituximab?的响应者可能要求同时使用类固醇， 而且复发可能响应再治疗。
[0024] 因此，所有目前可用的降低A型血友病治疗相关的同种抗体产生和获得性血友病 中自身抗体产生的方法都有缺点。因此，需要改进的方法来在A型血友病和获得性血友病 中解决抗FVIII抗体的问题。
[0025] 本发明的发明人已经发现，有可能通过使用FVIII衍生肽预耐受化 (pre-toerise)患者来阻止FVIII抑制物抗体的形成，以及通过施用FVIII衍生肽以减少 FVIII抑制物抗体来治疗病患，例如血友病。
[0026] 发明概述
[0027] 因此，本发明的第一个方面涉及能够诱导或恢复对FVIII的耐受性的肽，其至少 部分序列衍生于FVIII。
[0028] 在本发明第一个方面的第一个实施方案中，本发明提供包含FVIII衍生序列 DNMVTFRNQASRPY的肽，其具有以下序列中的一项：
[0029] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 17)
[0030] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 18)
[0031] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys(SEQ ID No. 19)
[0032] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 25)
[0033] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 26)
[0034] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys(SEQ ID No. 27)
[0035] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 29)
[0036] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 30)以及
[0037] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys(SEQ ID No.31)。
[0038] 在第二个实施方案中，本发明提供包含FVIII衍生序列PRCLTRYYSSFVNME的肽，其 具有以下序列中的一项：
[0039] Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 1)
[0040] Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 2)
[0041] Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys(SEQIDNo. 3)
[0042] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ IDNo.5)
[0043] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys(SEQ IDNo.7)
[0044] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ IDNo.9)
[0045] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu(SEQ IDNo.10)
[0046] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys(SEQ IDNo.11)以及
[0047] Glu-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ IDNo.13)。
[0048] 在第二个方面，本发明提供包含多种肽的组合物，其包括根据本发明第一个方面 的一种或多种肽。
[0049] 所述组合物可以包含根据本发明第一个方面的第一个实施方案的至少一种肽和 根据第二个实施方案的至少一种肽。
[0050] 所述组合物可以包含具有SEQIDNO. 1的肽和具有SEQIDN0. 17的肽。
[0051] 所述组合物可以是试剂盒的形式，其中所述多种肽是分开提供的，用于分开、随 后、序贯或同时施用。
[0052] 本发明的所述肽或试剂盒可以用于抑制、减轻或阻止VIII因子抑制物抗体的形 成。
[0053] 本发明还提供了此类肽或组合物在制造抑制、减少或阻止VIII因子抑制物抗体 形成的药物中的用途。
[0054] 本发明也提供用于抑制、阻止或减少受试者中VIII因子抑制物抗体的形成的方 法，其包含将这种肽或组合物施用于所述受试者的步骤。
[0055] 所述受试者可以是FVIII缺陷的，特别是所述受试者可以具有A型血友病，并可以 或即将经历VIII因子置换疗法。
[0056] 或者，所述受试者可以具有或有风险染上获得性血友病。
[0057] VIII因子抑制物在表达HLA-DR2的个体中更常找到。因此，通过本发明所述方法 治疗的受试者可以是HLA-DR2阳性的。
[0058] 附图简述
[0059] 图1:修饰的FVIII肽的溶解度
[0060]共测试了 32 种肽：其中 16 种基于FVIII肽PRCLTRYYSSFVNME( "PRCLT"）（SEQID No. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13) ;16 种基于FVIII肽DNMVTFRNQASRPY( "DNMV"） (SEQIDN〇.17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32)。测试了其相对于无 关对照肽（4Y)的溶解度，已知所述无关对照肽对于作为耐受化抗原的应用是足够可溶的。 在图表中，绿色代表至少与4Y-样可溶的肽，橙色代表不太与4Y-样可溶，但相当接近的 肽，红色代表不与4Y-样可溶的肽。编码为绿色的 肽与对照肽4Y-样可溶，编码为红色的 肽难溶，而编码为琥珀色的一种肽具有中间溶解度。
[0061] 图2 :标记的肽（taggedpeptide)在水溶液中的溶解度。
[0062] 溶解于DMS0 (对照）或PBS后，溶液中肽的浓度通过分光光度计确定，并与预期值 4mg/ml比较。实际和预期浓度间较大的差距对应较低的相对溶解度。
[0063] 图3:标记的肽起apitopes作用。
[0064] 使用新鲜的和固定的抗原呈递细胞进行抗原呈递测定法来研宄标记肽是否与亲 代肽PRCLT和DNMV-样能够结合MHC分子，并在不经抗原处理的情况下被呈递给T细胞。 (a)PRCLT肽；（b)DNMV肽。
[0065] 图4 :具有SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2的肽调节对PRCLT的T细胞应答。
[0066] 本图显示了来自用SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2或对照（PBS)处理并用PRCLT引 发的HLA-DR2转基因小鼠的回忆应答（recallresponse)。在一定范围的肽浓度间且针对 FVIII以及对照PH)显示T细胞刺激指数。
[0067] 图5 :具有SEQIDNo. 17和SEQIDNo. 18的肽调节对DNMV的T细胞应答。
[0068] 本图显示了来自用SEQIDNo. 17、SEQIDNo. 18或对照（PBS)处理并用DNMV引 发的HLA-DR2转基因小鼠的回忆应答。在一定范围的肽浓度间且针对FVIII以及对照PPD 显示T细胞刺激指数。
[0069] 图6 :具有SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 17的肽调节对其亲代肽的T细胞应答。
[0070] 本图显示了来自用SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 17或对照（PBS)处理并用PRCLT和 DNMV引发并且在体外用PRCLT、DNMV或FVIII回忆的HLA-DR2转基因小鼠的回忆应答。 在一定范围的肽浓度间和针对FVIII显示T细胞刺激指数。有对亲代肽的T细胞应答的显 著抑制。
[0071] 图7 :具有SEQIDNo. 1的肽和具有SEQIDNo. 17的肽的联合抑制体内抗FVIII 抗体的产生。
[0072] 本图显示了使用SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 17(或对照PBS)联合处理并使用8 次每周FVIII免疫法免疫的小鼠的终点抗FVIII抗体滴度。
[0073] 图7a:第28天的结果
[0074] 图7b:第56天的结果
[0075] 图8 :具有SEQIDNo. 1的肽和具有SEQIDNo. 17的肽的联合阻止FVIII暴露后 体内中和性抗FVIII抗体的产生。
[0076] 本图显示了在8次每周FVIII免疫法之前或期间，使用SEQIDNo. 1和SEQID No. 17 (或对照PBS)联合处理的小鼠中，中和性抗FVIII抗体的水平。在第56天，在使用肽 治疗的小鼠中中和性抗体有显著下降。
[0077] 图9:具有SEQIDNo. 1的肽和具有SEQIDNo. 17的肽的联合抑制对FVIII的T 细胞应答。
[0078] 本图显示了来自用SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 17或对照（PBS)联合处理并用 DNMV和PRCLT引发的HLA-DR2转基因小鼠的回忆应答。在一定范围的FVIII浓度间显示 T细胞刺激指数。
[0079] 图10:具有SEQIDNo. 1的肽和具有SEQIDNo. 17的肽的联合在具有正在进行 FVIII免疫反应的治疗动物模型中抑制中和性抗FVIII抗体产生。
[0080] 本图显示在诱导FVIII免疫反应和抗FVIII抗体产生后，使用SEQIDNo. 1和SEQ IDNo. 17或前列腺酸性磷酸酶（PAD) 133-152对照肽（序列描述于PCT/US2006/031961， SEQIDN0. 15)处理的小鼠中，中和性抗FVIII抗体的水平。小鼠在rFVIII免疫法后3周 和rFVIII增强免疫之前，接受肽处理。在FVIII增强免疫后两周（第7周），在肽处理的小 鼠中，中和性抗FVIII抗体有显著的减少，并在实验过程中维持直到第13周。
[0081] 发明详述
[0082]肽
[0083] 本发明涉及肽。
[0084] 术语"肽"用在正常意义下表示通常通过a_氨基和相邻氨基酸的羧基基团之间 的肽键彼此相连的一系列残基（通常是L-氨基酸）。所述术语包括修饰的肽和合成的肽类 似物。
[0085]本发明的肽可以使用化学方法（?6口1：1(16〇161]1181^7，六口四(31：；[0311611：13001^ MikosBodansky，Springer_Verlag，Berlin.)制造。例如，肽可以通过固相技术（Roberge JY等，（1995)SCienCe 269:202-204)合成，从树脂上切下，并通过制备用高效液相色谱法 (例如Creighton(1983)ProteinsStructuresAndMolecularPrinciples,WHFreeman andCo,NewYorkNY)纯化。可以实现自动化合成，例如，依照制造商提供的说明书使用 431A肽合成器（PerkinElmer)进行。
[0086] 或者，所述肽可以通过重组方法，或通过从VIII因子切割肽，接着修饰一个末端 或两个末端生成。肽的构成可以通过氨基酸分析或测序（例如Edman降解程序）来确认。[0087] 为了实践目的，存在着肽可以显示的各种其它特性。例如，重要的是，肽在体内足 够稳定，从而是治疗上有用的。所述肽的体内半衰期可以为至少10分钟、30分钟、4小时、 或24小时。
[0088] 所述肽可以也表现出良好的体内生物利用度。肽可以维持使其能够在无过多阻碍 的情况下结合细胞表面的MHC分子的体内构象。
[0089]Apitopes
[0090] 在适应性免疫反应中，T淋巴细胞能够识别蛋白抗原的内部表位。抗原呈递细胞 (APC)摄取抗原并将其降解为短的肽片段。肽可以结合细胞内的主要组织相容性复合体 (MHC)I类或II类分子，并被携带到细胞表面。当与MHC分子相连被呈递到细胞表面时，所 述肽可以被T细胞识别（通过T细胞受体（TCR))，在这种情况下所述肽是T细胞表位。 [0091] 因此，表位是可衍生于抗原的肽，其能够结合MHCI类或II类分子的肽结合沟，并 被T细胞识别。
[0092] 最小表位是可衍生于表位的最短片段，其能够结合MHCI类或II类分子的肽结合 沟，并被T细胞识别。对于给定的免疫原性区，通常可能产生起表位作用的重叠肽的"嵌套 集合（nestedset)"，它们全部包含最小表位，但在其侧翼区上不同。
[0093] 出于同样的原因，对于特定的MHC分子：T细胞联合，可能通过测量对于截短肽的 响应鉴定最小表位。例如，如果对重叠库中包含残基1-15的肽获得响应，可以使用在两端 截短的组（即1-14、1-13、1-12等，以及2-15、3-15、4-15等）来鉴定最小表位。
[0094] 本发明的发明人之前已经确定了肽在不经进一步抗原处理的情况下结合MHC I或II类分子并被呈递给T细胞的能力和肽在体内诱导耐受性的能力之间有联系（W0 02/16410)。如果肽太长以至于在不经过进一步处理（例如修剪）的情况下不能结合MHC分子的肽结合沟，或以不适当的构象结合，则其在体内将不会是致耐受性的。另一方面，如 果所述肽的大小和构象适合于直接结合MHC肽结合沟，并被呈递给T细胞，则这种肽可以预 测为对于诱导耐受性是有用的。
[0095] 因此，可能通过研宄其在没有进一步抗原处理的情况下能否在体外结合MHC I或 II类分子并被呈递给T细胞来研宄肽的致耐受性能力。
[0096] 本发明所述的肽是apitopes(抗原处理非依赖性表位，Antigen Processing-IndependentepiTOPES)，因为其能够在不经进一步抗原处理的情况下结合 MHCII类分子并刺激来自VIII因子特异性T细胞的应答。根据描述于W0 02/16410的基 于规则的方法，可以预测这种apitopes导致对FVIII的耐受性。
[0097] 本发明的肽可以是任何长度，其能够在不经进一步处理的情况下结合MHCI或II 类分子。典型地，本发明的所述肽能够结合MHCII类分子。
[0098] 结合MHCI类分子的肽的长度通常为7到13,更通常8到10个氨基酸。肽的结合 在其两端通过肽主链和所有MHCI类分子的肽结合沟中的不变位点中的原子之间的接触稳 定。在沟的两端有不变位点，其结合肽的氨基和羧基端。肽长度的变化通过所述肽主链中 通常在允许所需柔性的脯氨酸或甘氨酸残基的扭结来适应。
[0099] 结合MHCII类分子肽通常为长度8到20氨基酸，更通常长度10到17个氨基酸 长，并可以更长（例如多达40个氨基酸）。这些肽沿着（与MHCI类肽结合沟不同）在两 端开口的MHCII肽结合沟以伸展构象展开。所述肽主要通过主链原子与作为肽结合沟衬 里的保守残基的接触保持在适当位置。
[0100] 肽序列
[0101] 本发明的第一个实施方案涉及包含FVIII衍生序列的肽。实施例中所研宄的 FVIII衍生序列具有以下序列
[0102] SEQIDNo.l:
[0103]Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys
[0104]SEQIDNo. 2:
[0105]Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu
[0106]SEQIDNo. 3:
[0107]Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys
[0108]SEQIDNo. 4:
[0109]Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Glu
[0110]SEQIDNo. 5:
[0111]Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys
[0112] SEQIDNo. 6:
[0113] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu
[0114] SEQ IDNo.7:
[0115] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys
[0116] SEQ IDNo.8:
[0117] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Glu
[0118] SEQ IDNo.9:
[0119] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys
[0120] SEQ IDNo.10:
[0121] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu
[0122] SEQ IDNo.11:
[0123] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys
[0124] SEQ IDNo.12:
[0125] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Glu
[0126] SEQ IDNo.13:
[0127] Glu-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys
[0128] SEQ IDNo.14:
[0129] Glu-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu
[0130] SEQ IDNo.15:
[0131] Glu-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys
[0132] SEQ IDNo.16:
[0133] Glu-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Glu
[0134] SEQ IDNo.17:
[0135] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys
[0136] SEQ IDNo.18:
[0137] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu
[0138] SEQ IDNo.19:
[0139] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys
[0140] SEQ IDNo.20:
[0141] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Glu
[0142] SEQ IDNo.21:
[0143] Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys
[0144] SEQ IDNo.22:
[0145] Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu
[0146] SEQ IDNo.23:
[0147] Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys
[0148] SEQ IDNo.24:
[0149] Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Glu
[0150] SEQ IDNo.25:
[0151] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys
[0152] SEQ IDNo.26:
[0153] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu
[0154] SEQ IDNo.27:
[0155] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys
[0156] SEQ IDNo.28:
[0157] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Glu
[0158] SEQ IDNo.29:
[0159] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys
[0160] SEQ IDNo.30:
[0161] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu
[0162] SEQ IDNo.31:
[0163] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys.
[0164] SEQ IDNo.32:
[0165] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr_G1y_G1u_G1u〇
[0166] 术语"具有"意图用于表示所述肽组成为所给的氨基酸序列。
[0167] 本发明提供了肽，其包含序列DNMVTFRNQASRPY，并具有下述序列中的一项：SEQ IDNo. 17、18、19、25、26、27、29、30 或 31。
[0168] 所述肽可以具有以下序列中的一项：SEQIDNo. 17、18、25或26。
[0169] 所述肽可以具有SEQIDNo. 17或18。
[0170] 所述肽可以具有SEQIDNo.17。
[0171] 本发明也提供了肽，其包含序列PRCLTRYYSSFVNME，并具有以下序列中的一项：SEQ IDNo. 1、2、3、5、7、9、10、11 或 13。
[0172] 所述肽可以具有以下序列中的一项：SEQIDNo. 1、2、9或10。
[0173] 所述肽可以具有SEQIDNo.1或2。
[0174] 所述肽可以具有SEQIDNo. 1。
[0175]VIII因子
[0176] 形成本发明所述肽的中心部位的序列DNMVTFRNQASRPY和PRCLTRYYSSFVNME都衍 生于VIII因子。
[0177]VIII因子参与血液凝固的内在途径；VIII因子是IXa因子的辅因子，其在Ca+2和 磷脂质的存在下，将X因子转换为活化形式的Xa。
[0178]VIII因子基因产生两种可变剪切转录物。转录物变体1编码一种大糖蛋白（同 种型a)，其在血衆中循环，并与非共价复合物中的冯维勒布兰德因子（vonWillebrand factor)联合。这种蛋白经历多次剪切事件。转录物变体2编码一种推定的小蛋白（同种 型b)，其主要组成为VIIIc因子的磷脂质结合域。这一结合域对于凝血剂活性是至关重要 的。
[0179] 人VIII因子基因的完整186, 000个碱基对序列在20世纪80年代中期被阐明 (Gitschier等，（1984)Nature312326-330)。同时，编码完整的2351个氨基酸序列的DNA 克隆被用于在培养的哺乳动物细胞中生产生物活性的VIII因子（Wood等，（1984)Nature 312:330-337)。人VIII因子完整的2351个氨基酸的序列提供在SEQIDNo. 33中。
[0180] 溶解度
[0181] 本发明第一个实施方案的肽是一种以下肽的修饰形式
[0182]
[0183] 已经显示这些肽起apitopes的作用并且是体内致耐受的（见实施例和国际专利 申请号PCT/GB2008/003996)。
[0184]自此之后已经为人所知的是在肽介导的耐受性诱导中，溶解度是一个重要的考 虑。
[0185] 本发明人发现了溶解度可以通过在两端掺入甘氨酸间隔物，随后通过在N和C端 的两个额外氨基酸的联合来改善，所述额外的氨基酸可以是赖氨酸（K)和/或谷氨酸（E)。 因此，在所给末端的可能的组合为KK、KE、EK或EE。
[0186] 因此，本发明的修饰的肽相比亲代DNIVM和PRCLT肽具有6个额外的氨基酸（每 端3个）。
[0187] 本发明所述肽具有以下通式：
[0188] XXGDNMVTFRNQASRPYGXX或
[0189] XXGPRCLTRYYSSFVNMEGXX
[0190] 其中X是赖氨酸或谷氨酸。
[0191] 所述修饰的肽可以比亲代（未修饰的）肽更可溶。修饰的肽可以具有比亲本肽大 2、3、4或5倍的溶解度。所述肽可以在浓度高达0. 5mg/ml、lmg/ml或5mg/ml时可溶。
[0192] 耐受性
[0193]T细胞表位在对任何抗原（不论自身或外源的）的适应性免疫反应中扮演中心角 色。T细胞表位在超敏感性疾病（其包括过敏、自身免疫性疾病和移植物排斥）中所扮演的 中心角色已经通过实验模型的使用证明。通过注射合成肽（基于T细胞表位的结构）联合 佐剂可能诱导炎性或过敏性疾病。
[0194] 比较而言，已经显示了可能通过施用可溶形式的肽表位来诱导对特定抗原的免 疫耐受性。可溶性肽抗原的施用已被证明为一种在实验性自身免疫脑脊髓炎（EAE: - 种多发性硬化症（MS)的模型）（Metzler和Wraith(1993)Int.Immunol. 5:1159-1165; Liu和Wraith(1995)Int.Immunol.7:1255-1263;Anderton和Wraith(1998)Eur. J.Immunol. 28:1251-1261);以及在关节炎、糖尿病和葡萄膜视网膜的实验模型中（综述于 Anderton和Wraith(1998)同上）中抑制疾病的有效手段。这也被证明是在EAE中治疗正 在进行的疾病的一种方法（Anderton和Wraith(1998)同上）。
[0195] 耐受性是未能对抗原应答。对自身抗原的耐受性是免疫系统的基本特点，当这失 去时可以导致自身免疫性疾病。适应性免疫系统必须保持对极其多种感染原的响应的能 力，同时避免自身免疫攻击在其自身组织中所包含的自身抗原。这在很大程度上通过胸腔 中未成熟的T淋巴细胞对凋亡性细胞死亡的敏感性来控制（中心耐受性）。然而，并非所有 的自身抗原都在胸腔被检测到，因此自身反应性胸腺细胞的死亡仍然不完全。因此，也存在 外周组织中的成熟自身反应性T淋巴细胞获得耐受性的机制（外周耐受性）。中枢和外周 耐受性机制的综述参见Anderton等，（1999)(ImmunologicalReviewsl69:123_137)〇
[0196] 在A型血友病中，患者在VIII因子基因中有缺陷。这表示VIII因子不被免疫系 统识别为"自身"抗原。因此，当在凝血因子置换疗法中施用VIII因子时，产生了针对外源 蛋白的同种免疫反应，导致FVIII抑制物抗体的产生。
[0197] 本发明的肽能够诱导对VIII因子的耐受性，使得当FVIII预防性施用时，其不诱 导免疫反应，并且FVIII的抑制物不形成；当其治疗性施用时，减少或抑制进行中的FVIII 抑制物产生。
[0198] 获得性血友病是一种自身免疫性疾病，其中对VIII因子的耐受性失效。在这种情 况下，可以施用本发明的肽来恢复对这种自身蛋白的耐受，以及减轻致病性免疫反应。
[0199] 耐受性可以源自或特征在于在至少部分CD4+T细胞中诱导无反应力。为了激活T 细胞，肽必须与能够向T细胞传递两种信号的"专门的"APC联合。第一信号（信号1)由 APC细胞表面上的MHC-肽复合物传递，并且通过TCR被T细胞接收。第二信号（信号2)由 APC表面上的共刺激分子（如⑶80和⑶86)传递，并且通过T细胞表面上的⑶28接收。据 认为，当T细胞在不存在信号2的情况中接收信号1时，其不被激活，并且实际上变为无反 应力的。无反应力的T细胞对于后续抗原攻击是不起反应的，并且可以能够抑制其它免疫 反应。无反应力的T细胞被认为参与介导T细胞耐受性。
[0200] 不希望受理论的束缚，本发明人预测在其能够与MHC分子一起被呈递之前需要处 理的肽不诱导耐受性，因为其必须被成熟的抗原呈递细胞处理。成熟的抗原呈递细胞（例 如巨噬细胞、B细胞和树突细胞）能够处理抗原，而且还能向T细胞传递信号1和信号2两 者，导致T细胞活化。另一方面，Apitopes将能够结合未成熟APC上的II类MHC。因此，它 们在没有共刺激下被呈递给T细胞，导致T细胞无反应力和耐受性。
[0201] 当然，apitopes也能够结合成熟APC细胞表面的MHC分子。然而，相比成熟APC， 免疫系统包含更丰富的未成熟APC(已经提出少于10%的树突细胞是激活的，Summers等， (2001)Am.J.Pathol. 159:285-295)。因此，apitope的默认位置为无反应力/耐受性，而非 激活。
[0202] 可以通过本领域的已知技术通过查看下列各项的水平的降低在体内监控对FVIII 的耐受性的诱导：
[0203] ⑴FVIII抑制性抗体；
[0204] (ii)FVIII特异性的CD4+T细胞；
[0205] (iii)能够分泌FVIII抑制性抗体的B细胞。
[0206] 因此，耐受性的诱导也可以通过各种技术监控，包括：
[0207] (a)在⑶4+T细胞中诱导无反应力（其可以通过体外FVIII的后续激发来检测）。
[0208] (b)CD4+T细胞群的改变，包括
[0209] ⑴增殖的减少；
[0210] (ii)IL-2、IFN-y和IL-4 产生的下调；以及
[0211] (iii)IL-lO产生的增加。
[0212] 如本文使用的，术语"致耐受的"表示能够诱导耐受性。
[0213] 组合物
[0214]本发明也涉及组合物，如包含根据本发明的一种或多种肽的药学组合物。
[0215]所述组合物可以包含肽DNMVTFRNQASRPY的修饰形式和肽PRCLTRYYSSFVNME的修 饰形式。
[0216]所述肽可以包含多种肽，例如，两种、三种、四种、五种或六种肽。
[0217]本发明的所述组合物可以用于预防性或治疗性用途。
[0218] 当用于预防性用途施用时，所述组合物可以减少或阻止对FVIII的免疫应答的产 生。免疫应答的水平小于尚未使用所述组合物治疗的患者中会获得的水平。术语"减少"指 示观察到免疫应答的部分减少，如在尚未使用所述组合物治疗的患者中观察到的应答（或 在未治疗的患者中相同时间范围内观察到的应答）的50%、70%、80%或90%减少。术语 "预防"指示没有观察到可感知的对FVIII的免疫应答。
[0219] 当用于治疗性用途施用时，所述组合物可以抑制已经在进行的对FVIII的免疫应 答。术语"抑制"指示与肽治疗之前的水平相比，或与尚未给予治疗在相同时间点时观察到 的水平相比正在进行的免疫应答水平的降低。
[0220] 使用本发明所述组合物的治疗可能导致以下任意项或所有项的水平降低：
[0221] (i)FVIII抑制性抗体
[0222] (ii)FVIII特异性CD4+T细胞
[0223] (iii)分泌FVIII抑制性抗体的B细胞。
[0224] 所有这些因子的检测可以使用本领域已知技术（如ELISA、流式细胞术、显色凝血 试验等）实施。
[0225] 使用本发明所述组合物的治疗也或备选可以导致FVIII特异性的CD4+T细胞的无 反应力。无反应力可以通过例如在体外用FVIII的后续攻击检测到。
[0226] 重要的是记住不是所有对FVIII的免疫应答都是致病的。非抑制性抗FVIII抗体 可以在没有抑制物的血友病患者（Moreau等，（2000)Blood95:3435-41)和约15%的健康献 血者（Algiman等，（1992)89:3795-9)中发现。
[0227]FVIII抑制物可以通过凝血Bethesda测定法的Nijmegen修改来检测，其中检测患 者血浆使正常血浆中的FVIII失活的能力。Bethesda单位定义为中和50%血浆FVIII活 性的抗体量，并且滴度〇. 6BU或更高提示抗体的存在。
[0228] 抑制物通常被分为低滴度（如果所述水平〈5BU)和高滴度（如果所述水平 彡 5BU)〇
[0229] 循环FVIII抑制物抗体的水平可以减少到对尚未接受治疗的患者会观察到的抗 体水平的 90%、75%、50% 、20%、10%、5%。
[0230] 循环FVIII抑制性抗体的水平可以减少到5、4、3、2、1或0.5个BU。
[0231] 本发明的所述肽和组合物可以增加可用于帮助患者凝血的治疗性施用的FVIII 的量或比例。这是由于FVIII抑制物的减少，所述FVIII抑制物可以消除一定比例的FVIII， 从而不能执行其治疗功能。本发明的所述肽或组合物可以将可用FVIII的量增加例如 10%、25%、50%、75%或100%〇
[0232] 因此，本发明的所述肽和组合物可以减少患者中帮助凝血需要施用的FVIII量。
[0233] 制剂
[0234] 所述组合物可以制备为可注射液（作为液体溶液或悬浮液）；也可以制备成注射 前适于在液体中溶解或悬浮的固体形式。也可以乳化制剂，或在脂质体中包囊肽。活性成 分可以与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的并且与所述活性成分相容。适合的赋 形剂是例如水、盐水（例如磷酸盐缓冲盐水）、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。
[0235] 另外，如果需要，组合物可以包含少量的辅助物质，例如润湿或乳化剂和/或pH缓 冲试剂。缓冲盐包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、盐酸盐和/或可以使用氢氧化钠进行pH调 节。对于稳定化，可以使用二糖，如蔗糖或海藻糖。
[0236] 如果所述组合物包含多种肽，那么所述肽的相对比率可以大约相等。或者，每种肽 的相对比例可以是改变的，例如，以将致耐受性应答聚焦于特定的自身反应性T细胞子集， 或如果发现一种肽比其它肽在特定的HLA类型中更好起作用。
[0237] 配制后，所述组合物可以掺入到无菌的容器中，其然后被密封并储存于低温，例如 4°C或它可以被冻干。
[0238]便利地，组合物被制备为冻干（冷冻干燥）粉。冻干允许以稳定形式长期 储存。冻干步骤是本领域众所周知的，见例如http://www.devicelink,com/ivdt/ archive/97/01/006.html〇在冷冻干燥前通常使用膨胀剂（bulkingagent)，例如甘露醇、 右旋糖酐或甘氨酸。
[0239]组合物可以通过方便的方式施用，例如通过口服、静脉内（其水溶性的情况中）、 肌肉内、皮下、舌下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入（例如使用缓慢释放分子）。
[0240] 组合物可以有利地通过鼻内、皮下或皮内途径施用。
[0241] 本发明的所述肽和组合物可以用于治疗人类受试者。受试者可以患有A型血友 病，尤其是重度A型血友病。受试者可以是FVIII遗传缺陷的。受试者可以患有获得性血 友病。受试者可以具有抑制性抗FVIII抗体。
[0242] 受试者可以正经历或将要经历使用FVIII的凝血剂置换疗法。
[0243] 受试者可以正经历或将要经历使用绕过试剂的疗法（有或没有使用FVIII的凝血 剂置换疗法）。
[0244] 受试者可以正经历或将要经历使用FVIII基因的基因疗法。
[0245] 受试者可以是与有形成抑制性抗FVIII同种抗体或自身抗体的素因相关的HLA单 倍型（haplotype)。受试者可以表达HLA-DR2。确定个体HLA单倍型的方法是本领域已知 的。
[0246] 典型地，内科医师将确定最适合用于个体受试者的实际剂量，并且它随着具体患 者的年龄、体重和反应而变化。
[0247] 在一个优选的实施方案中，可以遵循"剂量递增"方案，其中以上升浓度对患者给 予多种剂量。例如，已经在针对蜂毒液过敏性的免疫治疗应用中对磷脂酶A2肽应用这种方 法（Muller等，（1998)J.AllergyClinImmunol. 101:747-754 和Akdis等，（1998)工（]1;[11. Invest. 102:98-106)0
[0248] 试剂盒
[0249] 便利地，如果所述组合物包含多种肽，那么它们可以以混合的组合物或混合物的 形式一起施用。然而，可以存在着如下的情况，其中优选以试剂盒的形式分开提供所述肽， 用于同时、单独、序贯或联合施用。
[0250] 所述试剂盒也可以包含混合和/或施用方式（例如用于鼻内施用的蒸发器 (vapouriser)，或用于皮下/皮内剂量给药的注射器或针）。所述试剂盒也可以包含使用说 明书。
[0251] 本发明所述的药物组合物或试剂盒可以用于治疗和/或预防疾病。
[0252] 具体地，组合物/试剂盒可以用于治疗和/或预防A型血友病或获得性血友病患 者中抗FVIII抑制物的形成。组合物/试剂盒可以用于治疗以中和性FVIII抗体的存在受 损害的血友病。
[0253]A型血友病
[0254]A型血友病（经典血友病）是由VIII因子的缺陷导致的。
[0255]A型血友病估计发病率为10000位男性中1位，而B型血友病估计为发生于40000 位男性中1位。5000女性中约1位是A型血友病的携带者，并且20000中的1位是B型血 友病的携带者。
[0256] 基于血液中凝血因子的水平，血友病通常分为三类：重度、中度和轻度。在重度血 友病中，有少于1%的正常凝血因子。严重程度在世代之间倾向于是一致的。
[0257] 与大众看法相反，小的割伤和创伤对血友病患者通常不呈现威胁。更确切地，最大 的危险来自于可能发生在关节和肌肉中的自发出血。这在快速生长的年龄期间（通常在年 龄5和15岁之间）最倾向于发生。
[0258] 关节中反复的自发出血可导致关节炎，以及相邻肌肉变得虚弱。由于血液的积累 导致的对神经的压力可以导致疼痛、麻木以及暂时无法移动受影响的区域。
[0259]A型血友病通常使用血液测试来诊断，所述血液测试用于确定凝血效率以及研宄 凝血因子水平是否异常。
[0260] 20世纪70年代从捐献的血液中分离的纯化凝血因子的开发显著改善了血友病患 者的长期展望。轻度到中度的血友病患者可以按特设基础使用FVIII治疗，而重度血友病 患者可能需要定期的无限期治疗。
[0261] 以前，对患者给予从数千份血浆捐献合并的VIII因子浓缩物。这引起了病毒病原 污染的严重问题，尤其是人类免疫缺陷病毒和肝炎病毒。单克隆抗体纯化技术、热失活和杀 病毒去污剂处理使得血浆来源的浓缩物相对安全。
[0262] 重组DNA技术现在已经提供了可一系列合成产品，例如Recombinate?和 Kogenate?。Kogenate使用表达人VIII因子的幼仓鼠肾细胞制备。产生的因子是高度纯 化的，消除任何从血浆传递病毒的可能性。
[0263] 本发明的所述肽或组合物可以在VIII因子置换疗法之前和/或期间施用。
[0264]A型血友病是一种用于基因疗法的理想疾病目标，因为i)其由单个鉴定基因 中的突变导致，ii)体内凝血因子水平的略微上升可以将重度血友病转变为更轻微的疾 病，iii)认为目前的置换疗法是亚最佳的。还有，如果有凝血活性的期望水平的"过调量 (overshoot)"，那么有较宽的安全性范围。
[0265] 不幸的是，至今基因疗法作为血友病治愈的希望还没有被实现，主要因为难以找 到非免疫原性足以允许长期表达凝血因子的基因传递系统。
[0266] 本发明的所述肽也适合用于在使用VIII因子的基因疗法之前耐受化受试者和/ 或基因疗法后在患者中管理FVIII抑制物形成。
[0267] 获得性血友病
[0268] 获得性血友病的特征为在以前正常凝血的个体中针对FVIII的自身抗体抑制物 的存在。它是一种稀有的病患，其估计发病率为每百万人群中每年1-3例。与获得的自身 抗体抑制物相关的死亡率接近25%，相比之下那些带有同种抗体的个体中的死亡风险实质 性更低。
[0269] 与同种抗体抑制物患者相比，获得性血友病特点为：（1)更为严重的出血模式； (2)在老年人群中较高发病率；（3)与可鉴定的潜在自身免疫疾病、淋巴增生性或实体瘤恶 性、妊娠，和在大约50 %的病例中使用某种抗生素例如青霉素和磺胺类一起发生；以及（4) 遵循II类药代动力学模式的体外抑制物活性及自身抗体对靶定凝血因子的不完全中和， 这通常导致患者血浆中范围在2%-18%的剩余VIII因子水平。
[0270] 本发明的所述肽或组合物可以施用于获得性血友病患者，或认为由于例如下列各 项而具有形成获得性血友病的风险的患者：
[0271] i)用例如青霉素或磺胺类药迫切治疗；
[0272] ii)肿瘤或其它恶性肿瘤的进展；
[0273] iii)即将到来的或早期妊娠。
[0274] 本发明现在将进一步通过实施例的方式描述，这是为了用于协助本领域的普通技 术人员实施本发明，而不是意图以任何方式限制本发明的范围。 实施例
[0275] 实施例1研宄FVIII衍生肽的溶解度
[0276] 共测试了 32 种肽：其中 16 种基于FVIII肽PRCLTRYYSSFVNME(〃PRCLT〃）； 16 种肽 基于FVIII肽DNMVTFRNQASRPY(〃DNMV〃）。所述肽总结于下面的表1和表2中。
[0277]表 1-PRCLT衍牛肽
[0278]
[0279]
[0280] 表2-DN頂V衍牛肽
[0281]
[0282]
[0283]
[0284] 20mg/ml的每种检测肽的储液制备于DMS0中。对照肽（一种称为4Y的MBP衍生 肽）的储液也制备于DMS0中。肽4Y具有序列Ac-ASQYRPSQR。其结构上与所述测试肽不 同，但已知对于作为耐受化抗原的应用是足够可溶的。
[0285] 通过向96孔板中加水以得到浓度10、5、2. 5和1. 25mg/ml，制备40y1体积肽溶液 的连续稀释。
[0286] 将所述板置于室温1小时，使允许任何沉淀物形成，然后在14800rpm离心10分钟 来分离沉淀的/胶体的肽与真正溶解的溶质。
[0287] 将每个管中最上部的2y1样品取出用于分析。在280nm波长测量吸光度并计算 浓度（mg/ml)。
[0288] 结果示于图1中。一些标记的肽证明与4Y相等的溶解度，甚至在高浓度时。编码 为绿色的肽与对照肽4Y同样可溶，编码为红色的肽难溶，而编码为琥珀色的肽具有中间溶 解度。
[0289] 实施例2将标记的肽以临床相关的浓度直接溶解于水性溶剂中
[0290] 对于每种测试肽以及亲本肽（PRCLT和DNMV)，以在DMS0 (对照）或PBS中的4mg/ ml制备两管。
[0291] 每个管在微型离心机中全速旋转5分钟。从每个溶液的上部取出10y1样品，并 且记录每种肽的分子量和吸光系数。
[0292] 上清液的吸光度使用NanoDrop测量，并计算浓度。实际浓度和期望值4mg/ml相 比，结果示于图2中。在这个图中，实际和期望浓度之间的较大差距对应较低的相对溶解 度。
[0293] 如图2所述，标记肽5￡〇10吣.1、2、9、10、17、18、25和26与亲本肽相比，在卩83 中都具有改善的溶解度。
[0294] 实施例3_所述标记肽起.apitopes的作用
[0295] 用亲本肽PRCLT或DNMV引发HLA-DR2转基因小鼠。然后，收获脾和淋巴结，并在 ⑶4纯化后，细胞使用lyg/ml人重组FVIII再刺激。与BW5147细胞融合后，扩增产生的克 隆，并"筛选"针对DNIMV或PRCLT的特异性。这通过将杂交瘤细胞和5xl04DR-2阳性抗原 呈递细胞（MGAR细胞系）和10ug/mlPRCLT/DNMV或培养基孵育48小时来进行。然后，通 过ELISA对上清液分析IL-2的产生。
[0296] 扩增当与肽孵育时特异性产生IL-2的克隆并再次用FVIII(lug/ml)筛选。
[0297] 响应FVIII和肽两者而产生IL-2的克隆接着用于评估修饰的DNMV和PRCLT肽 是否是apitopes，即它们是否能够结合MHC分子并被固定的和新鲜的APC呈递给T细胞。
[0298] 将51104个杂交瘤细胞与51104个新鲜的或固定的1^1?细胞、和10 1^/1111肽、 1yg/mlFVIII或培养基一起孵育48小时。然后，使用ELISA对上清液分析IL-2。PRCLT的结果示于图3a，DNIMV的结果示于图3b。
[0299] 所有的标记肽都能够被固定的抗原呈递细胞呈递，指示它们与亲本肽PRCLT和 DNIMV一样都是apitopes。
[0300] 实施例4 :离体T细朐耐#件
[0301] 为了确定修饰的apitope是否能够调节对亲本肽的T细胞应答，雄性HLA-DR2转 基因小鼠使用3X100yg肽（肽SEQIDNo. 1，2, 17或18)或PBS作为对照处理，接着使用 完全弗氏佐剂中的亲本肽（PRCLT和DNMV)各100yg免疫。10天后，收集引流淋巴结和 脾，并使用PRCLT或DNIMV在体外刺激。结果示于图4 (PRCLT)和5 (DNIMV)中。使用修饰 肽SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 2处理减轻了对PRCLT的T细胞应答，而使用修饰肽SEQID No. 17或SEQIDNo. 18处理减轻了对DNMV的T细胞应答。因此，所述修饰肽能够减轻使 用亲本肽免疫的小鼠的免疫反应。
[0302] 实施例5 :离体T细朐耐#件
[0303] 为了确认修饰的apitope对调节T细胞对亲本肽的应答的影响是否延伸到调节对 FVIII的应答，用3xl00yg肽（肽SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 17)处理雌性HLA-DR2转基因 小鼠，接着使用完全弗氏佐剂中的亲本肽（PRCLT和DNMV)各100yg引发。10天后，收集 引流淋巴结和脾，并使用PRCLT、DNMV或重组FVIII在体外刺激。结果示于图6中。肽SEQ IDNo. 1显著（p〈0. 01)减轻了对PRCLT肽的T细胞应答。肽SEQIDNo. 17显著（p〈0. 02) 减轻了对DNIMV肽的T细胞应答。
[0304] 肽SEQIDNo. 1调节对PRCLT的应答，而肽SEQIDNo. 17调节对DNMV的应答。 使用个体肽，对FVIII的反应也有一些减轻，其是不显著的。为了增强所述肽对FVIII免疫 反应的效力，在进一步的实验中使用修饰的DNIMV和修饰的PRCLT的联合。
[0305] 实施例6 :用剂量涕增的PRCLT和DN頂V修饰肽的联合讲行抗体牛成阳lh
[0306] 遵循剂量递增方法处理使用肽SEQIDNo. 1和肽SEQIDNo. 17的联合处理雄性 HLA-DR2转基因小鼠。以下述剂量给予所述联合的六次注射：0. 1 ;1.0 ;10和3x100yg(联 合中的每种肽）。
[0307] 接着，动物每周用lyg重组人FVIII引发，并使用肽SEQIDNo. 1/SEQIDNo. 17 的联合（每种100Ug) 同时治疗（rFVIII免疫3天后），从4次和8次FVIII免疫后（分 别为第28天，图7a;第56天，图7b)取得的血液样品中分析抗FVIII抗体的生成。滴定血 清，并通过直接ELISA分析。未免疫小鼠的抗体滴度在所有情况下都是阴性的，而认为抗 FVIII抗体在处理鼠的血清中存在，其中结合率（使用阴性血清来计算比率）大于1.9。实 验第28天和第56天的结果分别示于图7a和7b中。
[0308] 另外，在第56天测量了中和性FVIII抗体。FVIII中和性抗体使用显色法确定。 简单的说，样品与lIU/mlFVIII混合，通过加入FIX、FX、凝血酶、CaCl2和磷脂质来起始凝 血。孵育后，产生的FXa的量通过加入显色第五S-2760来确定，并测量0D信号。0D信号 与样品中FVIII的活性成比例，并与含有已知量FVIII和无中和性抗体的样品相比。测试 样品的％残留活性通过与对照样品相比计算，并以Bethesda样单位表示，并且示于图8中。 使用肽SEQID1和SEQID17处理的小鼠与PBS处理的小鼠相比具有显著更低的中和性 抗FVIII抗体水平。
[0309]实施例7 :伸用剂量涕增的PRCLT和DN頂V修饰肽的联合得到的离体T细朐耐# 性
[0310] 遵循如实施例6所述的剂量递增方法对雄性/雌性DR2小鼠使用肽SEQIDNo. 1/ SEQIDNo. 17的联合处理。
[0311] 用CFA中的lOOygPRCLT和lOOygDNMV引发动物。十天后分离引流淋巴结细 胞和脾细胞，并在体外使用重组人FVIII再刺激。
[0312] 通过增殖试验评估T细胞应答（图9)。当小鼠使用SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 17 的联合处理时，在测试的所有浓度的FVIII中都看到了对FVIII的T细胞应答的显著减少。
[0313]实施例8 :在治疗件动物樽塑中，伸用剂量涕增的PRCLT和DN頂V修饰肽的联合抑 制中和件抗体牛成。
[0314] 用CFA中的3ygrFVIII引发HLA-DE2转基因小鼠，并在免疫三周后，遵循剂量 递增方法处理使用肽SEQIDNo. 1和肽SEQIDNo. 17的联合处理。在下述剂量给予所述 联合的六次注射：〇. 1;1.〇;1〇和3x100yg(联合中的每种肽）。使用相同的剂量递增方 法使用无关FVIIIDR2结合前列腺酸性磷酸酶（PAP) 133-152肽（序列如描述于专利PCT/ US2006/031961，SEQIDNo. 15)处理对照动物。所有动物在rFVIII免疫后5周以及最后一 轮肽治疗后4天接受IFA中的3ygrhFVIII的加强免疫。在第一次FVIII免疫后3周以 及任何肽处理前，第5周（FVIII加强免疫前以及肽处理后）和随访期期间第7周、第9周 和第13周采集的血浆样品中分析中和性抗体的生成。血浆样品中的中和性FVIII抗体水 平如实施例6所述确定。
[0315] 图10中的结果显示了在FVIII免疫后3周（第3周）与对照肽处理相比，使用肽 SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 17处理在加强免疫后（第5周）显著抑制中和性抗体的形成。
[0316] 上述说明书中所提到的所有出版物通过提述并入本文。不脱离本发明的范围和精 神，对本发明的方法和系统的各种修改和变化对于本领域的技术人员将是显而易见的。虽 然本发明结合特定的优选实施方案描述，但应当理解本发明的权利要求不应不适当的受限 于这些特定的实施方案。事实上，对于分子免疫学或相关领域的技术人员显而易见的对实 施本发明的方式的各种修改也应在所附权利要求书的范围内。
[0317]SEQIDNo. 33
[0318] 1mqielstcfflcllrfcfsatrryylgavelswdymqsdlgelpvdarfpprvpksfpfn
[0319] 61tsvvykktlfveftdhlfniakprppwmgllgptiqaevydtvvitlknmashpvslhav
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[0321] 181 vdlvkdlnsgligallvcregslakektqtlhkfillfavfdegkswhsetknslmqdrd
[0322] 241 aasarawpkmhtvngyvnrslpgligchrksvywhvigmgttpevhsifleghtflvrnh
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[0357] 2341 evlgceaqdly
【主权项】
1. 一种包含FVIII衍生序列DNMVTFRNQASRPY的肽，该肽（a)具有通式 XXGDNIMVTFRNQASRPYGXX 其中X是赖氨酸或谷氨酸；以及 (b)具有以下序列中的一项： KKGDNIMVTFRNQASRPYGKK(SEQIDNo. 17) KKGDNIMVTFRNQASRPYGKE(SEQIDNo. 18) KKGDNIMVTFRNQASRPYGEK(SEQIDNo. 19) KE⑶NMVTFRNQASRPYGKK(SEQIDNo. 25) KE⑶NMVTFRNQASRPYGKE(SEQIDNo. 26) KE⑶NMVTFRNQASRPYGEK(SEQIDNo. 27) EKGDNIMVTFRNQASRPYGKK(SEQIDNo. 29) EKGDNMVTFRNQASRPYGKE(SEQIDNo. 30)和EKGDNMVTFRNQASRPYGEK(SEQIDNo.31)。2. -种包含FVIII衍生序列PRCLTRYYSSFVNME的肽，该肽（a)具有通式 XXGPRCLTRYYSSFVNMEGXX 其中X是赖氨酸或谷氨酸；以及 (b)具有以下序列中的一项： KKGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQIDNo. 1) KKGPRCLTRYYSSFVNMEGKE(SEQIDNo. 2) KKGPRCLTRYYSSFVNMEGEK(SEQIDNo. 3) EEGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQIDNo. 5) EEGPRCLTRYYSSFVNMEGEK(SEQIDNo. 7) KEGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQIDNo. 9) KEGPRCLTRYYSSFVNMEGKE(SEQIDNo. 10) KEGPRCLTRYYSSFVNMEGEK(SEQIDNo. 11)和EKGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQIDNo.13)。3. -种包含多种肽的组合物，其包括根据权利要求2的一种或多种肽。4. 根据权利要求3的组合物，其包含根据权利要求1的至少一种肽和根据权利要求2 的至少一种肽。5. 根据权利要求4的组合物，其包含具有SEQIDNo. 1的肽和具有SEQIDNo. 17的 肽。6. 根据权利要求1或2的肽或根据权利要求3至5中任一项的组合物，其在体内抑制 或阻止VIII因子抑制物抗体的产生中使用。7. 根据权利要求1或2的肽或根据权利要求3至5中任一项的组合物在制备在体内抑 制或阻止VIII因子抑制物抗体产生的药物中的用途。8. -种用于在受试者中抑制或阻止VIII因子抑制物抗体的产生的方法，其包含将根 据权利要求1或2的肽，或权利要求3至5中任一项的组合物施用于所述受试者的步骤。9. 一种用于治疗受试者中的血友病的方法，其包含将根据权利要求1或2的肽，或权利 要求3至5中任一项的组合物施用于所述受试者的步骤。10. 根据权利要求8或9的方法，其中所述受试者患有A型血友病，并正经历或将要经 历VIII因子置换疗法和/或FVIII绕过疗法。11. 根据权利要求8或9的方法，其中所述受试者患有或有风险染上获得性血友病。12. 根据权利要求8至11中任一项的方法，其中所述受试者是HLA-DR2。
【专利摘要】本发明提供了部分可衍生于FVIII的肽，其能够在不经进一步抗原处理的情况下结合MHC II类分子，并被VIII因子特异性T细胞识别。具体地，本发明提供了包含序列DNIMVTFRNQASRPY或PRCLTRYYSSFVNME且具有N-和C-端修饰的肽。本发明也涉及这种肽在A型血友病和/或获得性血友病中阻止或抑制抑制物抗体形成的用途。
【IPC分类】A61K38/00, C07K14/755, A61K38/37, A61K39/00
【公开号】CN104903347
【申请号】CN201380069078
【发明人】D.赖思, H.斯特里特
【申请人】艾匹托普国际股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月11日
【公告号】CA2890835A1, EP2917232A1, US20150306192, WO2014072958A1
【专利说明】肽 发明领域
[0001] 本发明涉及肽，其至少部分可衍生于VIII因子（FVIII)。所述肽可以用于减少或 阻止VIII因子抑制物抗体的形成（例如在A型血友病治疗和获得性血友病中）。
[0002] 发明背景
[0003] 血友病
[0004] 血友病属于一组可遗传血液病症，其包括A型血友病、B型血友病（Christmas病） 以及冯维勒布兰德氏病（VonWillebrand'sdisease)。
[0005] 在血友病中，由于基本凝血因子部分或完全缺失，血液凝结的能力严重降低，导致 出血时间增加。
[0006]A型血友病是凝血因子VIII的缺陷，而B型血友病是凝血因子IX的缺陷。在两种 疾病中，缺陷基因发现于X染色体上，因此这些病患是X连锁的。A型血友病比B型血友病 常见五倍。
[0007] 血友病是一种终身的遗传基因病患，其影响作为携带者的女性以及遗传病患的男 性。约三分之一的新诊断没有以前的家族史。其出现于世界各地，并在所有人种群体中发 生。在英国，约有6000人受到血友病的影响。
[0008] 血友病患者在损伤后长时间出血。外部损伤例如割伤和擦伤通常不造成严重问 题；通过应用一定程度的压力并覆盖受到影响的区域（例如使用膏药），通常可能止血。
[0009] 主要的问题是进入关节、肌肉和软组织的内出血，其可以自发发生。内出血例如进 入脑部的出血非常难以应对，并可能致命。关节中的反复出血导致剧烈的疼痛并可能导致 关节炎和/或长期关节损伤，导致残疾。
[0010] 血友病的治疗通常是通过置换缺失的凝血因子。在轻度或中度血友病中，可以在 出血发生时给予注射（按需治疗）。然而，在重度血友病中，给予定期预防性注射来帮助血 液凝结，并最小化长期关节损伤的可能性。
[0011]A型血友病的凝血因子置换疗法的潜在严重并发症是中和VIII因子促凝血功能 的抗体的形成。VIII因子抑制物发生于大约25%的重度A型血友病中。由于患有先天性A 型血友病的患者可能是FVIII遗传缺陷的，抑制物的合成是针对施用来阻止或治疗出血事 件的外源蛋白的同种免疫应答。
[0012] ⑶4+T细胞在针对FVIII的免疫应答中扮演中心角色。在被抗原提呈细胞 (APCs)吸收后，FVIII经历蛋白降解为肽片段（Reding等，（2006)Haemophilia12(supp 6) 30-36)。这些肽然后与MHCII类分子联合，提呈在APC的表面。这一复合物然后被FVIII 特异性的CD4+T细胞的T细胞受体识别。在合适的共刺激信号存在下，这一识别最终引起 CD4+细胞指导B细胞的抗体合成。
[0013] 抑制物形成的发生率最初随着VIII因子治疗的数量而增加，但在50-100暴露天 数后似乎达到稳定。抑制物的形成在重度血友病中比在中度或轻度疾病中更为常见，并且 一些分子缺陷（最清楚的是VIII因子轻链中的大缺失和无义突变）似乎偏向于抑制物的 形成。参数例如浓度、置换因子的类型（纯化的或重组的），以及治疗史也可能影响抗体产 生的可能性。
[0014] 带有抑制物的血友病患者的处理是持续的挑战。使用脱敏技术的免疫耐受诱导 (ITI)在一些带有针对VIII因子的同种抗体的相同患者中是成功的。这种治疗方法要求对 因子置换疗法的进行中的暴露，因此是一种长期的策略。
[0015] 虽然ITI可以是成功的，但相当大比例（约30% )的患者未能对ITI响应。带 有高抑制物滴度的患者不太可能对治疗响应。另一个重要的影响因素是ITI开始时的年 龄，当患者超过20岁时，成功率大幅下降（Hay等，（2005)SeminarsinThrombosisand Hemostasis32:15-21)。
[0016]当ITI疗法不成功时，抑制物通常会存留一生，并且因为这些病人通常是高反应 者，必须使用FVIII绕过产品（例如活化的凝血酶原复合物浓缩物（FEIBA?)，以及重组活化 的FVII)治疗出血事件。然而，这些试剂的使用与不良反应关联，例如弥散性血管内凝血， 急性心肌梗塞，肺检子和血检形成（Acharya和DiMichele(2006)BestPractice&Research ClinicalHaematology19:51-66)。
[0017] 免疫抑制疗法有时用于未能对ITI反应的患者。治疗包括施用免疫抑制药物例如 环磷酰胺（cyclophosphamide)、泼尼松（prednisone)、硫挫嗓呤（azathioprine)和环抱素 (cyclosporine)，其非特异性靶向免疫系统。这些治疗可以具有与一般的免疫抑制相关的 副作用。
[0018]对使用Rituximab?(-种针对B细胞⑶20抗原的人源化单克隆抗体）的选择性B细胞耗竭有新的兴趣。然而，在一些使用这种药物治疗的儿童中发生了输注反应、血清病 以及机会性感染（X*iMichele(2007)JThrombHaemost5:143-50)。
[0019] 获得性血友病
[0020] 获得性血友病是一种罕见的自身免疫病患，其在每百万人中影响1到4个人。在 这种病患中，生来没有血友病的受试者形成出针对一种凝血因子例如VIII因子的抗体。据 认为怀孕和自身免疫疾病例如类风湿性关节炎和癌症可能增加形成获得性血友病的风险。 虽然引起其产生的根本免疫机制不同，在响应凝结因子置换疗法中产生的FVIII抑制物的 临床表现和那些在获得性血友病中产生的FVIII抑制物的临床表现类似。
[0021] 获得性血友病患者具有接近25%的死亡率，部分因为获得性抑制物和严重出血并 发症相关。获得性自身抗体抑制物的疗法主要是基于需要控制或阻止急性出血并发症（其 通常威胁生命和肢体），其次是根除自身抗体来恢复正常凝血。
[0022] -些与低滴度自身抗体抑制物（〈5个Bethesda单位）相关的出血可以通过高剂 量FVIII浓缩物的施用有效治疗。猪FVIII浓缩物曾经被认为是用于获得性血友病相关出 血的重要一线疗法，因为其是提供在实验室中实际测量输注后FVIII凝结活性水平的机会 的唯一置换疗法。因为猪血浆库被猪细小病毒污染，这一产品在2004年从市场上移除。现 在，"绕过"试剂是最为常用的，但存在促凝性（thrombogenicity)的潜在风险，并且对于每 个产品仅有约80%的效力。通过血衆除去法（plasmapheresis)和身体外免疫吸附的血衆 置换对于临时减少抑制物滴度，使得足以绕过试剂或FVIII置换提供充分止血可以是必要 的。
[0023]自身抗体抑制物的根除依赖于免疫抑制措施，例如：（1)在3-6周中施用 30% -50%效力的皮质类固醇；（2)使用细胞毒性和骨髓抑制性化疗试剂，例如环磷酰胺、 环孢素、2-氯脱氧腺苷；（3)使用静脉内免疫球蛋白的免疫调节；以及（4)使用利普西单抗 (rituximab)的选择性B淋巴细胞耗竭。Rituximab?的响应者可能要求同时使用类固醇， 而且复发可能响应再治疗。
[0024] 因此，所有目前可用的降低A型血友病治疗相关的同种抗体产生和获得性血友病 中自身抗体产生的方法都有缺点。因此，需要改进的方法来在A型血友病和获得性血友病 中解决抗FVIII抗体的问题。
[0025] 本发明的发明人已经发现，有可能通过使用FVIII衍生肽预耐受化 (pre-toerise)患者来阻止FVIII抑制物抗体的形成，以及通过施用FVIII衍生肽以减少 FVIII抑制物抗体来治疗病患，例如血友病。
[0026] 发明概述
[0027] 因此，本发明的第一个方面涉及能够诱导或恢复对FVIII的耐受性的肽，其至少 部分序列衍生于FVIII。
[0028] 在本发明第一个方面的第一个实施方案中，本发明提供包含FVIII衍生序列 DNMVTFRNQASRPY的肽，其具有以下序列中的一项：
[0029] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 17)
[0030] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 18)
[0031] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys(SEQ ID No. 19)
[0032] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 25)
[0033] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 26)
[0034] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys(SEQ ID No. 27)
[0035] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 29)
[0036] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 30)以及
[0037] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys(SEQ ID No.31)。
[0038] 在第二个实施方案中，本发明提供包含FVIII衍生序列PRCLTRYYSSFVNME的肽，其 具有以下序列中的一项：
[0039] Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 1)
[0040] Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 2)
[0041] Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys(SEQIDNo. 3)
[0042] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ IDNo.5)
[0043] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys(SEQ IDNo.7)
[0044] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ IDNo.9)
[0045] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu(SEQ IDNo.10)
[0046] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys(SEQ IDNo.11)以及
[0047] Glu-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ IDNo.13)。
[0048] 在第二个方面，本发明提供包含多种肽的组合物，其包括根据本发明第一个方面 的一种或多种肽。
[0049] 所述组合物可以包含根据本发明第一个方面的第一个实施方案的至少一种肽和 根据第二个实施方案的至少一种肽。
[0050] 所述组合物可以包含具有SEQIDNO. 1的肽和具有SEQIDN0. 17的肽。
[0051] 所述组合物可以是试剂盒的形式，其中所述多种肽是分开提供的，用于分开、随 后、序贯或同时施用。
[0052] 本发明的所述肽或试剂盒可以用于抑制、减轻或阻止VIII因子抑制物抗体的形 成。
[0053] 本发明还提供了此类肽或组合物在制造抑制、减少或阻止VIII因子抑制物抗体 形成的药物中的用途。
[0054] 本发明也提供用于抑制、阻止或减少受试者中VIII因子抑制物抗体的形成的方 法，其包含将这种肽或组合物施用于所述受试者的步骤。
[0055] 所述受试者可以是FVIII缺陷的，特别是所述受试者可以具有A型血友病，并可以 或即将经历VIII因子置换疗法。
[0056] 或者，所述受试者可以具有或有风险染上获得性血友病。
[0057] VIII因子抑制物在表达HLA-DR2的个体中更常找到。因此，通过本发明所述方法 治疗的受试者可以是HLA-DR2阳性的。
[0058] 附图简述
[0059] 图1:修饰的FVIII肽的溶解度
[0060]共测试了 32 种肽：其中 16 种基于FVIII肽PRCLTRYYSSFVNME( "PRCLT"）（SEQID No. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13) ;16 种基于FVIII肽DNMVTFRNQASRPY( "DNMV"） (SEQIDN〇.17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32)。测试了其相对于无 关对照肽（4Y)的溶解度，已知所述无关对照肽对于作为耐受化抗原的应用是足够可溶的。 在图表中，绿色代表至少与4Y-样可溶的肽，橙色代表不太与4Y-样可溶，但相当接近的 肽，红色代表不与4Y-样可溶的肽。编码为绿色的 肽与对照肽4Y-样可溶，编码为红色的 肽难溶，而编码为琥珀色的一种肽具有中间溶解度。
[0061] 图2 :标记的肽（taggedpeptide)在水溶液中的溶解度。
[0062] 溶解于DMS0 (对照）或PBS后，溶液中肽的浓度通过分光光度计确定，并与预期值 4mg/ml比较。实际和预期浓度间较大的差距对应较低的相对溶解度。
[0063] 图3:标记的肽起apitopes作用。
[0064] 使用新鲜的和固定的抗原呈递细胞进行抗原呈递测定法来研宄标记肽是否与亲 代肽PRCLT和DNMV-样能够结合MHC分子，并在不经抗原处理的情况下被呈递给T细胞。 (a)PRCLT肽；（b)DNMV肽。
[0065] 图4 :具有SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2的肽调节对PRCLT的T细胞应答。
[0066] 本图显示了来自用SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2或对照（PBS)处理并用PRCLT引 发的HLA-DR2转基因小鼠的回忆应答（recallresponse)。在一定范围的肽浓度间且针对 FVIII以及对照PH)显示T细胞刺激指数。
[0067] 图5 :具有SEQIDNo. 17和SEQIDNo. 18的肽调节对DNMV的T细胞应答。
[0068] 本图显示了来自用SEQIDNo. 17、SEQIDNo. 18或对照（PBS)处理并用DNMV引 发的HLA-DR2转基因小鼠的回忆应答。在一定范围的肽浓度间且针对FVIII以及对照PPD 显示T细胞刺激指数。
[0069] 图6 :具有SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 17的肽调节对其亲代肽的T细胞应答。
[0070] 本图显示了来自用SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 17或对照（PBS)处理并用PRCLT和 DNMV引发并且在体外用PRCLT、DNMV或FVIII回忆的HLA-DR2转基因小鼠的回忆应答。 在一定范围的肽浓度间和针对FVIII显示T细胞刺激指数。有对亲代肽的T细胞应答的显 著抑制。
[0071] 图7 :具有SEQIDNo. 1的肽和具有SEQIDNo. 17的肽的联合抑制体内抗FVIII 抗体的产生。
[0072] 本图显示了使用SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 17(或对照PBS)联合处理并使用8 次每周FVIII免疫法免疫的小鼠的终点抗FVIII抗体滴度。
[0073] 图7a:第28天的结果
[0074] 图7b:第56天的结果
[0075] 图8 :具有SEQIDNo. 1的肽和具有SEQIDNo. 17的肽的联合阻止FVIII暴露后 体内中和性抗FVIII抗体的产生。
[0076] 本图显示了在8次每周FVIII免疫法之前或期间，使用SEQIDNo. 1和SEQID No. 17 (或对照PBS)联合处理的小鼠中，中和性抗FVIII抗体的水平。在第56天，在使用肽 治疗的小鼠中中和性抗体有显著下降。
[0077] 图9:具有SEQIDNo. 1的肽和具有SEQIDNo. 17的肽的联合抑制对FVIII的T 细胞应答。
[0078] 本图显示了来自用SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 17或对照（PBS)联合处理并用 DNMV和PRCLT引发的HLA-DR2转基因小鼠的回忆应答。在一定范围的FVIII浓度间显示 T细胞刺激指数。
[0079] 图10:具有SEQIDNo. 1的肽和具有SEQIDNo. 17的肽的联合在具有正在进行 FVIII免疫反应的治疗动物模型中抑制中和性抗FVIII抗体产生。
[0080] 本图显示在诱导FVIII免疫反应和抗FVIII抗体产生后，使用SEQIDNo. 1和SEQ IDNo. 17或前列腺酸性磷酸酶（PAD) 133-152对照肽（序列描述于PCT/US2006/031961， SEQIDN0. 15)处理的小鼠中，中和性抗FVIII抗体的水平。小鼠在rFVIII免疫法后3周 和rFVIII增强免疫之前，接受肽处理。在FVIII增强免疫后两周（第7周），在肽处理的小 鼠中，中和性抗FVIII抗体有显著的减少，并在实验过程中维持直到第13周。
[0081] 发明详述
[0082]肽
[0083] 本发明涉及肽。
[0084] 术语"肽"用在正常意义下表示通常通过a_氨基和相邻氨基酸的羧基基团之间 的肽键彼此相连的一系列残基（通常是L-氨基酸）。所述术语包括修饰的肽和合成的肽类 似物。
[0085]本发明的肽可以使用化学方法（?6口1：1(16〇161]1181^7，六口四(31：；[0311611：13001^ MikosBodansky，Springer_Verlag，Berlin.)制造。例如，肽可以通过固相技术（Roberge JY等，（1995)SCienCe 269:202-204)合成，从树脂上切下，并通过制备用高效液相色谱法 (例如Creighton(1983)ProteinsStructuresAndMolecularPrinciples,WHFreeman andCo,NewYorkNY)纯化。可以实现自动化合成，例如，依照制造商提供的说明书使用 431A肽合成器（PerkinElmer)进行。
[0086] 或者，所述肽可以通过重组方法，或通过从VIII因子切割肽，接着修饰一个末端 或两个末端生成。肽的构成可以通过氨基酸分析或测序（例如Edman降解程序）来确认。[0087] 为了实践目的，存在着肽可以显示的各种其它特性。例如，重要的是，肽在体内足 够稳定，从而是治疗上有用的。所述肽的体内半衰期可以为至少10分钟、30分钟、4小时、 或24小时。
[0088] 所述肽可以也表现出良好的体内生物利用度。肽可以维持使其能够在无过多阻碍 的情况下结合细胞表面的MHC分子的体内构象。
[0089]Apitopes
[0090] 在适应性免疫反应中，T淋巴细胞能够识别蛋白抗原的内部表位。抗原呈递细胞 (APC)摄取抗原并将其降解为短的肽片段。肽可以结合细胞内的主要组织相容性复合体 (MHC)I类或II类分子，并被携带到细胞表面。当与MHC分子相连被呈递到细胞表面时，所 述肽可以被T细胞识别（通过T细胞受体（TCR))，在这种情况下所述肽是T细胞表位。 [0091] 因此，表位是可衍生于抗原的肽，其能够结合MHCI类或II类分子的肽结合沟，并 被T细胞识别。
[0092] 最小表位是可衍生于表位的最短片段，其能够结合MHCI类或II类分子的肽结合 沟，并被T细胞识别。对于给定的免疫原性区，通常可能产生起表位作用的重叠肽的"嵌套 集合（nestedset)"，它们全部包含最小表位，但在其侧翼区上不同。
[0093] 出于同样的原因，对于特定的MHC分子：T细胞联合，可能通过测量对于截短肽的 响应鉴定最小表位。例如，如果对重叠库中包含残基1-15的肽获得响应，可以使用在两端 截短的组（即1-14、1-13、1-12等，以及2-15、3-15、4-15等）来鉴定最小表位。
[0094] 本发明的发明人之前已经确定了肽在不经进一步抗原处理的情况下结合MHC I或II类分子并被呈递给T细胞的能力和肽在体内诱导耐受性的能力之间有联系（W0 02/16410)。如果肽太长以至于在不经过进一步处理（例如修剪）的情况下不能结合MHC分子的肽结合沟，或以不适当的构象结合，则其在体内将不会是致耐受性的。另一方面，如 果所述肽的大小和构象适合于直接结合MHC肽结合沟，并被呈递给T细胞，则这种肽可以预 测为对于诱导耐受性是有用的。
[0095] 因此，可能通过研宄其在没有进一步抗原处理的情况下能否在体外结合MHC I或 II类分子并被呈递给T细胞来研宄肽的致耐受性能力。
[0096] 本发明所述的肽是apitopes(抗原处理非依赖性表位，Antigen Processing-IndependentepiTOPES)，因为其能够在不经进一步抗原处理的情况下结合 MHCII类分子并刺激来自VIII因子特异性T细胞的应答。根据描述于W0 02/16410的基 于规则的方法，可以预测这种apitopes导致对FVIII的耐受性。
[0097] 本发明的肽可以是任何长度，其能够在不经进一步处理的情况下结合MHCI或II 类分子。典型地，本发明的所述肽能够结合MHCII类分子。
[0098] 结合MHCI类分子的肽的长度通常为7到13,更通常8到10个氨基酸。肽的结合 在其两端通过肽主链和所有MHCI类分子的肽结合沟中的不变位点中的原子之间的接触稳 定。在沟的两端有不变位点，其结合肽的氨基和羧基端。肽长度的变化通过所述肽主链中 通常在允许所需柔性的脯氨酸或甘氨酸残基的扭结来适应。
[0099] 结合MHCII类分子肽通常为长度8到20氨基酸，更通常长度10到17个氨基酸 长，并可以更长（例如多达40个氨基酸）。这些肽沿着（与MHCI类肽结合沟不同）在两 端开口的MHCII肽结合沟以伸展构象展开。所述肽主要通过主链原子与作为肽结合沟衬 里的保守残基的接触保持在适当位置。
[0100] 肽序列
[0101] 本发明的第一个实施方案涉及包含FVIII衍生序列的肽。实施例中所研宄的 FVIII衍生序列具有以下序列
[0102] SEQIDNo.l:
[0103]Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys
[0104]SEQIDNo. 2:
[0105]Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu
[0106]SEQIDNo. 3:
[0107]Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys
[0108]SEQIDNo. 4:
[0109]Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Glu
[0110]SEQIDNo. 5:
[0111]Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys
[0112] SEQIDNo. 6:
[0113] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu
[0114] SEQ IDNo.7:
[0115] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys
[0116] SEQ IDNo.8:
[0117] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Glu
[0118] SEQ IDNo.9:
[0119] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys
[0120] SEQ IDNo.10:
[0121] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu
[0122] SEQ IDNo.11:
[0123] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys
[0124] SEQ IDNo.12:
[0125] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Glu
[0126] SEQ IDNo.13:
[0127] Glu-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys
[0128] SEQ IDNo.14:
[0129] Glu-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu
[0130] SEQ IDNo.15:
[0131] Glu-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys
[0132] SEQ IDNo.16:
[0133] Glu-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Glu
[0134] SEQ IDNo.17:
[0135] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys
[0136] SEQ IDNo.18:
[0137] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu
[0138] SEQ IDNo.19:
[0139] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys
[0140] SEQ IDNo.20:
[0141] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Glu
[0142] SEQ IDNo.21:
[0143] Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys
[0144] SEQ IDNo.22:
[0145] Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu
[0146] SEQ IDNo.23:
[0147] Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys
[0148] SEQ IDNo.24:
[0149] Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Glu
[0150] SEQ IDNo.25:
[0151] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys
[0152] SEQ IDNo.26:
[0153] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu
[0154] SEQ IDNo.27:
[0155] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys
[0156] SEQ IDNo.28:
[0157] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Glu
[0158] SEQ IDNo.29:
[0159] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys
[0160] SEQ IDNo.30:
[0161] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu
[0162] SEQ IDNo.31:
[0163] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys.
[0164] SEQ IDNo.32:
[0165] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr_G1y_G1u_G1u〇
[0166] 术语"具有"意图用于表示所述肽组成为所给的氨基酸序列。
[0167] 本发明提供了肽，其包含序列DNMVTFRNQASRPY，并具有下述序列中的一项：SEQ IDNo. 17、18、19、25、26、27、29、30 或 31。
[0168] 所述肽可以具有以下序列中的一项：SEQIDNo. 17、18、25或26。
[0169] 所述肽可以具有SEQIDNo. 17或18。
[0170] 所述肽可以具有SEQIDNo.17。
[0171] 本发明也提供了肽，其包含序列PRCLTRYYSSFVNME，并具有以下序列中的一项：SEQ IDNo. 1、2、3、5、7、9、10、11 或 13。
[0172] 所述肽可以具有以下序列中的一项：SEQIDNo. 1、2、9或10。
[0173] 所述肽可以具有SEQIDNo.1或2。
[0174] 所述肽可以具有SEQIDNo. 1。
[0175]VIII因子
[0176] 形成本发明所述肽的中心部位的序列DNMVTFRNQASRPY和PRCLTRYYSSFVNME都衍 生于VIII因子。
[0177]VIII因子参与血液凝固的内在途径；VIII因子是IXa因子的辅因子，其在Ca+2和 磷脂质的存在下，将X因子转换为活化形式的Xa。
[0178]VIII因子基因产生两种可变剪切转录物。转录物变体1编码一种大糖蛋白（同 种型a)，其在血衆中循环，并与非共价复合物中的冯维勒布兰德因子（vonWillebrand factor)联合。这种蛋白经历多次剪切事件。转录物变体2编码一种推定的小蛋白（同种 型b)，其主要组成为VIIIc因子的磷脂质结合域。这一结合域对于凝血剂活性是至关重要 的。
[0179] 人VIII因子基因的完整186, 000个碱基对序列在20世纪80年代中期被阐明 (Gitschier等，（1984)Nature312326-330)。同时，编码完整的2351个氨基酸序列的DNA 克隆被用于在培养的哺乳动物细胞中生产生物活性的VIII因子（Wood等，（1984)Nature 312:330-337)。人VIII因子完整的2351个氨基酸的序列提供在SEQIDNo. 33中。
[0180] 溶解度
[0181] 本发明第一个实施方案的肽是一种以下肽的修饰形式
[0182]
[0183] 已经显示这些肽起apitopes的作用并且是体内致耐受的（见实施例和国际专利 申请号PCT/GB2008/003996)。
[0184]自此之后已经为人所知的是在肽介导的耐受性诱导中，溶解度是一个重要的考 虑。
[0185] 本发明人发现了溶解度可以通过在两端掺入甘氨酸间隔物，随后通过在N和C端 的两个额外氨基酸的联合来改善，所述额外的氨基酸可以是赖氨酸（K)和/或谷氨酸（E)。 因此，在所给末端的可能的组合为KK、KE、EK或EE。
[0186] 因此，本发明的修饰的肽相比亲代DNIVM和PRCLT肽具有6个额外的氨基酸（每 端3个）。
[0187] 本发明所述肽具有以下通式：
[0188] XXGDNMVTFRNQASRPYGXX或
[0189] XXGPRCLTRYYSSFVNMEGXX
[0190] 其中X是赖氨酸或谷氨酸。
[0191] 所述修饰的肽可以比亲代（未修饰的）肽更可溶。修饰的肽可以具有比亲本肽大 2、3、4或5倍的溶解度。所述肽可以在浓度高达0. 5mg/ml、lmg/ml或5mg/ml时可溶。
[0192] 耐受性
[0193]T细胞表位在对任何抗原（不论自身或外源的）的适应性免疫反应中扮演中心角 色。T细胞表位在超敏感性疾病（其包括过敏、自身免疫性疾病和移植物排斥）中所扮演的 中心角色已经通过实验模型的使用证明。通过注射合成肽（基于T细胞表位的结构）联合 佐剂可能诱导炎性或过敏性疾病。
[0194] 比较而言，已经显示了可能通过施用可溶形式的肽表位来诱导对特定抗原的免 疫耐受性。可溶性肽抗原的施用已被证明为一种在实验性自身免疫脑脊髓炎（EAE: - 种多发性硬化症（MS)的模型）（Metzler和Wraith(1993)Int.Immunol. 5:1159-1165; Liu和Wraith(1995)Int.Immunol.7:1255-1263;Anderton和Wraith(1998)Eur. J.Immunol. 28:1251-1261);以及在关节炎、糖尿病和葡萄膜视网膜的实验模型中（综述于 Anderton和Wraith(1998)同上）中抑制疾病的有效手段。这也被证明是在EAE中治疗正 在进行的疾病的一种方法（Anderton和Wraith(1998)同上）。
[0195] 耐受性是未能对抗原应答。对自身抗原的耐受性是免疫系统的基本特点，当这失 去时可以导致自身免疫性疾病。适应性免疫系统必须保持对极其多种感染原的响应的能 力，同时避免自身免疫攻击在其自身组织中所包含的自身抗原。这在很大程度上通过胸腔 中未成熟的T淋巴细胞对凋亡性细胞死亡的敏感性来控制（中心耐受性）。然而，并非所有 的自身抗原都在胸腔被检测到，因此自身反应性胸腺细胞的死亡仍然不完全。因此，也存在 外周组织中的成熟自身反应性T淋巴细胞获得耐受性的机制（外周耐受性）。中枢和外周 耐受性机制的综述参见Anderton等，（1999)(ImmunologicalReviewsl69:123_137)〇
[0196] 在A型血友病中，患者在VIII因子基因中有缺陷。这表示VIII因子不被免疫系 统识别为"自身"抗原。因此，当在凝血因子置换疗法中施用VIII因子时，产生了针对外源 蛋白的同种免疫反应，导致FVIII抑制物抗体的产生。
[0197] 本发明的肽能够诱导对VIII因子的耐受性，使得当FVIII预防性施用时，其不诱 导免疫反应，并且FVIII的抑制物不形成；当其治疗性施用时，减少或抑制进行中的FVIII 抑制物产生。
[0198] 获得性血友病是一种自身免疫性疾病，其中对VIII因子的耐受性失效。在这种情 况下，可以施用本发明的肽来恢复对这种自身蛋白的耐受，以及减轻致病性免疫反应。
[0199] 耐受性可以源自或特征在于在至少部分CD4+T细胞中诱导无反应力。为了激活T 细胞，肽必须与能够向T细胞传递两种信号的"专门的"APC联合。第一信号（信号1)由 APC细胞表面上的MHC-肽复合物传递，并且通过TCR被T细胞接收。第二信号（信号2)由 APC表面上的共刺激分子（如⑶80和⑶86)传递，并且通过T细胞表面上的⑶28接收。据 认为，当T细胞在不存在信号2的情况中接收信号1时，其不被激活，并且实际上变为无反 应力的。无反应力的T细胞对于后续抗原攻击是不起反应的，并且可以能够抑制其它免疫 反应。无反应力的T细胞被认为参与介导T细胞耐受性。
[0200] 不希望受理论的束缚，本发明人预测在其能够与MHC分子一起被呈递之前需要处 理的肽不诱导耐受性，因为其必须被成熟的抗原呈递细胞处理。成熟的抗原呈递细胞（例 如巨噬细胞、B细胞和树突细胞）能够处理抗原，而且还能向T细胞传递信号1和信号2两 者，导致T细胞活化。另一方面，Apitopes将能够结合未成熟APC上的II类MHC。因此，它 们在没有共刺激下被呈递给T细胞，导致T细胞无反应力和耐受性。
[0201] 当然，apitopes也能够结合成熟APC细胞表面的MHC分子。然而，相比成熟APC， 免疫系统包含更丰富的未成熟APC(已经提出少于10%的树突细胞是激活的，Summers等， (2001)Am.J.Pathol. 159:285-295)。因此，apitope的默认位置为无反应力/耐受性，而非 激活。
[0202] 可以通过本领域的已知技术通过查看下列各项的水平的降低在体内监控对FVIII 的耐受性的诱导：
[0203] ⑴FVIII抑制性抗体；
[0204] (ii)FVIII特异性的CD4+T细胞；
[0205] (iii)能够分泌FVIII抑制性抗体的B细胞。
[0206] 因此，耐受性的诱导也可以通过各种技术监控，包括：
[0207] (a)在⑶4+T细胞中诱导无反应力（其可以通过体外FVIII的后续激发来检测）。
[0208] (b)CD4+T细胞群的改变，包括
[0209] ⑴增殖的减少；
[0210] (ii)IL-2、IFN-y和IL-4 产生的下调；以及
[0211] (iii)IL-lO产生的增加。
[0212] 如本文使用的，术语"致耐受的"表示能够诱导耐受性。
[0213] 组合物
[0214]本发明也涉及组合物，如包含根据本发明的一种或多种肽的药学组合物。
[0215]所述组合物可以包含肽DNMVTFRNQASRPY的修饰形式和肽PRCLTRYYSSFVNME的修 饰形式。
[0216]所述肽可以包含多种肽，例如，两种、三种、四种、五种或六种肽。
[0217]本发明的所述组合物可以用于预防性或治疗性用途。
[0218] 当用于预防性用途施用时，所述组合物可以减少或阻止对FVIII的免疫应答的产 生。免疫应答的水平小于尚未使用所述组合物治疗的患者中会获得的水平。术语"减少"指 示观察到免疫应答的部分减少，如在尚未使用所述组合物治疗的患者中观察到的应答（或 在未治疗的患者中相同时间范围内观察到的应答）的50%、70%、80%或90%减少。术语 "预防"指示没有观察到可感知的对FVIII的免疫应答。
[0219] 当用于治疗性用途施用时，所述组合物可以抑制已经在进行的对FVIII的免疫应 答。术语"抑制"指示与肽治疗之前的水平相比，或与尚未给予治疗在相同时间点时观察到 的水平相比正在进行的免疫应答水平的降低。
[0220] 使用本发明所述组合物的治疗可能导致以下任意项或所有项的水平降低：
[0221] (i)FVIII抑制性抗体
[0222] (ii)FVIII特异性CD4+T细胞
[0223] (iii)分泌FVIII抑制性抗体的B细胞。
[0224] 所有这些因子的检测可以使用本领域已知技术（如ELISA、流式细胞术、显色凝血 试验等）实施。
[0225] 使用本发明所述组合物的治疗也或备选可以导致FVIII特异性的CD4+T细胞的无 反应力。无反应力可以通过例如在体外用FVIII的后续攻击检测到。
[0226] 重要的是记住不是所有对FVIII的免疫应答都是致病的。非抑制性抗FVIII抗体 可以在没有抑制物的血友病患者（Moreau等，（2000)Blood95:3435-41)和约15%的健康献 血者（Algiman等，（1992)89:3795-9)中发现。
[0227]FVIII抑制物可以通过凝血Bethesda测定法的Nijmegen修改来检测，其中检测患 者血浆使正常血浆中的FVIII失活的能力。Bethesda单位定义为中和50%血浆FVIII活 性的抗体量，并且滴度〇. 6BU或更高提示抗体的存在。
[0228] 抑制物通常被分为低滴度（如果所述水平〈5BU)和高滴度（如果所述水平 彡 5BU)〇
[0229] 循环FVIII抑制物抗体的水平可以减少到对尚未接受治疗的患者会观察到的抗 体水平的 90%、75%、50% 、20%、10%、5%。
[0230] 循环FVIII抑制性抗体的水平可以减少到5、4、3、2、1或0.5个BU。
[0231] 本发明的所述肽和组合物可以增加可用于帮助患者凝血的治疗性施用的FVIII 的量或比例。这是由于FVIII抑制物的减少，所述FVIII抑制物可以消除一定比例的FVIII， 从而不能执行其治疗功能。本发明的所述肽或组合物可以将可用FVIII的量增加例如 10%、25%、50%、75%或100%〇
[0232] 因此，本发明的所述肽和组合物可以减少患者中帮助凝血需要施用的FVIII量。
[0233] 制剂
[0234] 所述组合物可以制备为可注射液（作为液体溶液或悬浮液）；也可以制备成注射 前适于在液体中溶解或悬浮的固体形式。也可以乳化制剂，或在脂质体中包囊肽。活性成 分可以与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的并且与所述活性成分相容。适合的赋 形剂是例如水、盐水（例如磷酸盐缓冲盐水）、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。
[0235] 另外，如果需要，组合物可以包含少量的辅助物质，例如润湿或乳化剂和/或pH缓 冲试剂。缓冲盐包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、盐酸盐和/或可以使用氢氧化钠进行pH调 节。对于稳定化，可以使用二糖，如蔗糖或海藻糖。
[0236] 如果所述组合物包含多种肽，那么所述肽的相对比率可以大约相等。或者，每种肽 的相对比例可以是改变的，例如，以将致耐受性应答聚焦于特定的自身反应性T细胞子集， 或如果发现一种肽比其它肽在特定的HLA类型中更好起作用。
[0237] 配制后，所述组合物可以掺入到无菌的容器中，其然后被密封并储存于低温，例如 4°C或它可以被冻干。
[0238]便利地，组合物被制备为冻干（冷冻干燥）粉。冻干允许以稳定形式长期 储存。冻干步骤是本领域众所周知的，见例如http://www.devicelink,com/ivdt/ archive/97/01/006.html〇在冷冻干燥前通常使用膨胀剂（bulkingagent)，例如甘露醇、 右旋糖酐或甘氨酸。
[0239]组合物可以通过方便的方式施用，例如通过口服、静脉内（其水溶性的情况中）、 肌肉内、皮下、舌下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入（例如使用缓慢释放分子）。
[0240] 组合物可以有利地通过鼻内、皮下或皮内途径施用。
[0241] 本发明的所述肽和组合物可以用于治疗人类受试者。受试者可以患有A型血友 病，尤其是重度A型血友病。受试者可以是FVIII遗传缺陷的。受试者可以患有获得性血 友病。受试者可以具有抑制性抗FVIII抗体。
[0242] 受试者可以正经历或将要经历使用FVIII的凝血剂置换疗法。
[0243] 受试者可以正经历或将要经历使用绕过试剂的疗法（有或没有使用FVIII的凝血 剂置换疗法）。
[0244] 受试者可以正经历或将要经历使用FVIII基因的基因疗法。
[0245] 受试者可以是与有形成抑制性抗FVIII同种抗体或自身抗体的素因相关的HLA单 倍型（haplotype)。受试者可以表达HLA-DR2。确定个体HLA单倍型的方法是本领域已知 的。
[0246] 典型地，内科医师将确定最适合用于个体受试者的实际剂量，并且它随着具体患 者的年龄、体重和反应而变化。
[0247] 在一个优选的实施方案中，可以遵循"剂量递增"方案，其中以上升浓度对患者给 予多种剂量。例如，已经在针对蜂毒液过敏性的免疫治疗应用中对磷脂酶A2肽应用这种方 法（Muller等，（1998)J.AllergyClinImmunol. 101:747-754 和Akdis等，（1998)工（]1;[11. Invest. 102:98-106)0
[0248] 试剂盒
[0249] 便利地，如果所述组合物包含多种肽，那么它们可以以混合的组合物或混合物的 形式一起施用。然而，可以存在着如下的情况，其中优选以试剂盒的形式分开提供所述肽， 用于同时、单独、序贯或联合施用。
[0250] 所述试剂盒也可以包含混合和/或施用方式（例如用于鼻内施用的蒸发器 (vapouriser)，或用于皮下/皮内剂量给药的注射器或针）。所述试剂盒也可以包含使用说 明书。
[0251] 本发明所述的药物组合物或试剂盒可以用于治疗和/或预防疾病。
[0252] 具体地，组合物/试剂盒可以用于治疗和/或预防A型血友病或获得性血友病患 者中抗FVIII抑制物的形成。组合物/试剂盒可以用于治疗以中和性FVIII抗体的存在受 损害的血友病。
[0253]A型血友病
[0254]A型血友病（经典血友病）是由VIII因子的缺陷导致的。
[0255]A型血友病估计发病率为10000位男性中1位，而B型血友病估计为发生于40000 位男性中1位。5000女性中约1位是A型血友病的携带者，并且20000中的1位是B型血 友病的携带者。
[0256] 基于血液中凝血因子的水平，血友病通常分为三类：重度、中度和轻度。在重度血 友病中，有少于1%的正常凝血因子。严重程度在世代之间倾向于是一致的。
[0257] 与大众看法相反，小的割伤和创伤对血友病患者通常不呈现威胁。更确切地，最大 的危险来自于可能发生在关节和肌肉中的自发出血。这在快速生长的年龄期间（通常在年 龄5和15岁之间）最倾向于发生。
[0258] 关节中反复的自发出血可导致关节炎，以及相邻肌肉变得虚弱。由于血液的积累 导致的对神经的压力可以导致疼痛、麻木以及暂时无法移动受影响的区域。
[0259]A型血友病通常使用血液测试来诊断，所述血液测试用于确定凝血效率以及研宄 凝血因子水平是否异常。
[0260] 20世纪70年代从捐献的血液中分离的纯化凝血因子的开发显著改善了血友病患 者的长期展望。轻度到中度的血友病患者可以按特设基础使用FVIII治疗，而重度血友病 患者可能需要定期的无限期治疗。
[0261] 以前，对患者给予从数千份血浆捐献合并的VIII因子浓缩物。这引起了病毒病原 污染的严重问题，尤其是人类免疫缺陷病毒和肝炎病毒。单克隆抗体纯化技术、热失活和杀 病毒去污剂处理使得血浆来源的浓缩物相对安全。
[0262] 重组DNA技术现在已经提供了可一系列合成产品，例如Recombinate?和 Kogenate?。Kogenate使用表达人VIII因子的幼仓鼠肾细胞制备。产生的因子是高度纯 化的，消除任何从血浆传递病毒的可能性。
[0263] 本发明的所述肽或组合物可以在VIII因子置换疗法之前和/或期间施用。
[0264]A型血友病是一种用于基因疗法的理想疾病目标，因为i)其由单个鉴定基因 中的突变导致，ii)体内凝血因子水平的略微上升可以将重度血友病转变为更轻微的疾 病，iii)认为目前的置换疗法是亚最佳的。还有，如果有凝血活性的期望水平的"过调量 (overshoot)"，那么有较宽的安全性范围。
[0265] 不幸的是，至今基因疗法作为血友病治愈的希望还没有被实现，主要因为难以找 到非免疫原性足以允许长期表达凝血因子的基因传递系统。
[0266] 本发明的所述肽也适合用于在使用VIII因子的基因疗法之前耐受化受试者和/ 或基因疗法后在患者中管理FVIII抑制物形成。
[0267] 获得性血友病
[0268] 获得性血友病的特征为在以前正常凝血的个体中针对FVIII的自身抗体抑制物 的存在。它是一种稀有的病患，其估计发病率为每百万人群中每年1-3例。与获得的自身 抗体抑制物相关的死亡率接近25%，相比之下那些带有同种抗体的个体中的死亡风险实质 性更低。
[0269] 与同种抗体抑制物患者相比，获得性血友病特点为：（1)更为严重的出血模式； (2)在老年人群中较高发病率；（3)与可鉴定的潜在自身免疫疾病、淋巴增生性或实体瘤恶 性、妊娠，和在大约50 %的病例中使用某种抗生素例如青霉素和磺胺类一起发生；以及（4) 遵循II类药代动力学模式的体外抑制物活性及自身抗体对靶定凝血因子的不完全中和， 这通常导致患者血浆中范围在2%-18%的剩余VIII因子水平。
[0270] 本发明的所述肽或组合物可以施用于获得性血友病患者，或认为由于例如下列各 项而具有形成获得性血友病的风险的患者：
[0271] i)用例如青霉素或磺胺类药迫切治疗；
[0272] ii)肿瘤或其它恶性肿瘤的进展；
[0273] iii)即将到来的或早期妊娠。
[0274] 本发明现在将进一步通过实施例的方式描述，这是为了用于协助本领域的普通技 术人员实施本发明，而不是意图以任何方式限制本发明的范围。 实施例
[0275] 实施例1研宄FVIII衍生肽的溶解度
[0276] 共测试了 32 种肽：其中 16 种基于FVIII肽PRCLTRYYSSFVNME(〃PRCLT〃）； 16 种肽 基于FVIII肽DNMVTFRNQASRPY(〃DNMV〃）。所述肽总结于下面的表1和表2中。
[0277]表 1-PRCLT衍牛肽
[0278]
[0279]
[0280] 表2-DN頂V衍牛肽
[0281]
[0282]
[0283]
[0284] 20mg/ml的每种检测肽的储液制备于DMS0中。对照肽（一种称为4Y的MBP衍生 肽）的储液也制备于DMS0中。肽4Y具有序列Ac-ASQYRPSQR。其结构上与所述测试肽不 同，但已知对于作为耐受化抗原的应用是足够可溶的。
[0285] 通过向96孔板中加水以得到浓度10、5、2. 5和1. 25mg/ml，制备40y1体积肽溶液 的连续稀释。
[0286] 将所述板置于室温1小时，使允许任何沉淀物形成，然后在14800rpm离心10分钟 来分离沉淀的/胶体的肽与真正溶解的溶质。
[0287] 将每个管中最上部的2y1样品取出用于分析。在280nm波长测量吸光度并计算 浓度（mg/ml)。
[0288] 结果示于图1中。一些标记的肽证明与4Y相等的溶解度，甚至在高浓度时。编码 为绿色的肽与对照肽4Y同样可溶，编码为红色的肽难溶，而编码为琥珀色的肽具有中间溶 解度。
[0289] 实施例2将标记的肽以临床相关的浓度直接溶解于水性溶剂中
[0290] 对于每种测试肽以及亲本肽（PRCLT和DNMV)，以在DMS0 (对照）或PBS中的4mg/ ml制备两管。
[0291] 每个管在微型离心机中全速旋转5分钟。从每个溶液的上部取出10y1样品，并 且记录每种肽的分子量和吸光系数。
[0292] 上清液的吸光度使用NanoDrop测量，并计算浓度。实际浓度和期望值4mg/ml相 比，结果示于图2中。在这个图中，实际和期望浓度之间的较大差距对应较低的相对溶解 度。
[0293] 如图2所述，标记肽5￡〇10吣.1、2、9、10、17、18、25和26与亲本肽相比，在卩83 中都具有改善的溶解度。
[0294] 实施例3_所述标记肽起.apitopes的作用
[0295] 用亲本肽PRCLT或DNMV引发HLA-DR2转基因小鼠。然后，收获脾和淋巴结，并在 ⑶4纯化后，细胞使用lyg/ml人重组FVIII再刺激。与BW5147细胞融合后，扩增产生的克 隆，并"筛选"针对DNIMV或PRCLT的特异性。这通过将杂交瘤细胞和5xl04DR-2阳性抗原 呈递细胞（MGAR细胞系）和10ug/mlPRCLT/DNMV或培养基孵育48小时来进行。然后，通 过ELISA对上清液分析IL-2的产生。
[0296] 扩增当与肽孵育时特异性产生IL-2的克隆并再次用FVIII(lug/ml)筛选。
[0297] 响应FVIII和肽两者而产生IL-2的克隆接着用于评估修饰的DNMV和PRCLT肽 是否是apitopes，即它们是否能够结合MHC分子并被固定的和新鲜的APC呈递给T细胞。
[0298] 将51104个杂交瘤细胞与51104个新鲜的或固定的1^1?细胞、和10 1^/1111肽、 1yg/mlFVIII或培养基一起孵育48小时。然后，使用ELISA对上清液分析IL-2。PRCLT的结果示于图3a，DNIMV的结果示于图3b。
[0299] 所有的标记肽都能够被固定的抗原呈递细胞呈递，指示它们与亲本肽PRCLT和 DNIMV一样都是apitopes。
[0300] 实施例4 :离体T细朐耐#件
[0301] 为了确定修饰的apitope是否能够调节对亲本肽的T细胞应答，雄性HLA-DR2转 基因小鼠使用3X100yg肽（肽SEQIDNo. 1，2, 17或18)或PBS作为对照处理，接着使用 完全弗氏佐剂中的亲本肽（PRCLT和DNMV)各100yg免疫。10天后，收集引流淋巴结和 脾，并使用PRCLT或DNIMV在体外刺激。结果示于图4 (PRCLT)和5 (DNIMV)中。使用修饰 肽SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 2处理减轻了对PRCLT的T细胞应答，而使用修饰肽SEQID No. 17或SEQIDNo. 18处理减轻了对DNMV的T细胞应答。因此，所述修饰肽能够减轻使 用亲本肽免疫的小鼠的免疫反应。
[0302] 实施例5 :离体T细朐耐#件
[0303] 为了确认修饰的apitope对调节T细胞对亲本肽的应答的影响是否延伸到调节对 FVIII的应答，用3xl00yg肽（肽SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 17)处理雌性HLA-DR2转基因 小鼠，接着使用完全弗氏佐剂中的亲本肽（PRCLT和DNMV)各100yg引发。10天后，收集 引流淋巴结和脾，并使用PRCLT、DNMV或重组FVIII在体外刺激。结果示于图6中。肽SEQ IDNo. 1显著（p〈0. 01)减轻了对PRCLT肽的T细胞应答。肽SEQIDNo. 17显著（p〈0. 02) 减轻了对DNIMV肽的T细胞应答。
[0304] 肽SEQIDNo. 1调节对PRCLT的应答，而肽SEQIDNo. 17调节对DNMV的应答。 使用个体肽，对FVIII的反应也有一些减轻，其是不显著的。为了增强所述肽对FVIII免疫 反应的效力，在进一步的实验中使用修饰的DNIMV和修饰的PRCLT的联合。
[0305] 实施例6 :用剂量涕增的PRCLT和DN頂V修饰肽的联合讲行抗体牛成阳lh
[0306] 遵循剂量递增方法处理使用肽SEQIDNo. 1和肽SEQIDNo. 17的联合处理雄性 HLA-DR2转基因小鼠。以下述剂量给予所述联合的六次注射：0. 1 ;1.0 ;10和3x100yg(联 合中的每种肽）。
[0307] 接着，动物每周用lyg重组人FVIII引发，并使用肽SEQIDNo. 1/SEQIDNo. 17 的联合（每种100Ug) 同时治疗（rFVIII免疫3天后），从4次和8次FVIII免疫后（分 别为第28天，图7a;第56天，图7b)取得的血液样品中分析抗FVIII抗体的生成。滴定血 清，并通过直接ELISA分析。未免疫小鼠的抗体滴度在所有情况下都是阴性的，而认为抗 FVIII抗体在处理鼠的血清中存在，其中结合率（使用阴性血清来计算比率）大于1.9。实 验第28天和第56天的结果分别示于图7a和7b中。
[0308] 另外，在第56天测量了中和性FVIII抗体。FVIII中和性抗体使用显色法确定。 简单的说，样品与lIU/mlFVIII混合，通过加入FIX、FX、凝血酶、CaCl2和磷脂质来起始凝 血。孵育后，产生的FXa的量通过加入显色第五S-2760来确定，并测量0D信号。0D信号 与样品中FVIII的活性成比例，并与含有已知量FVIII和无中和性抗体的样品相比。测试 样品的％残留活性通过与对照样品相比计算，并以Bethesda样单位表示，并且示于图8中。 使用肽SEQID1和SEQID17处理的小鼠与PBS处理的小鼠相比具有显著更低的中和性 抗FVIII抗体水平。
[0309]实施例7 :伸用剂量涕增的PRCLT和DN頂V修饰肽的联合得到的离体T细朐耐# 性
[0310] 遵循如实施例6所述的剂量递增方法对雄性/雌性DR2小鼠使用肽SEQIDNo. 1/ SEQIDNo. 17的联合处理。
[0311] 用CFA中的lOOygPRCLT和lOOygDNMV引发动物。十天后分离引流淋巴结细 胞和脾细胞，并在体外使用重组人FVIII再刺激。
[0312] 通过增殖试验评估T细胞应答（图9)。当小鼠使用SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 17 的联合处理时，在测试的所有浓度的FVIII中都看到了对FVIII的T细胞应答的显著减少。
[0313]实施例8 :在治疗件动物樽塑中，伸用剂量涕增的PRCLT和DN頂V修饰肽的联合抑 制中和件抗体牛成。
[0314] 用CFA中的3ygrFVIII引发HLA-DE2转基因小鼠，并在免疫三周后，遵循剂量 递增方法处理使用肽SEQIDNo. 1和肽SEQIDNo. 17的联合处理。在下述剂量给予所述 联合的六次注射：〇. 1;1.〇;1〇和3x100yg(联合中的每种肽）。使用相同的剂量递增方 法使用无关FVIIIDR2结合前列腺酸性磷酸酶（PAP) 133-152肽（序列如描述于专利PCT/ US2006/031961，SEQIDNo. 15)处理对照动物。所有动物在rFVIII免疫后5周以及最后一 轮肽治疗后4天接受IFA中的3ygrhFVIII的加强免疫。在第一次FVIII免疫后3周以 及任何肽处理前，第5周（FVIII加强免疫前以及肽处理后）和随访期期间第7周、第9周 和第13周采集的血浆样品中分析中和性抗体的生成。血浆样品中的中和性FVIII抗体水 平如实施例6所述确定。
[0315] 图10中的结果显示了在FVIII免疫后3周（第3周）与对照肽处理相比，使用肽 SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 17处理在加强免疫后（第5周）显著抑制中和性抗体的形成。
[0316] 上述说明书中所提到的所有出版物通过提述并入本文。不脱离本发明的范围和精 神，对本发明的方法和系统的各种修改和变化对于本领域的技术人员将是显而易见的。虽 然本发明结合特定的优选实施方案描述，但应当理解本发明的权利要求不应不适当的受限 于这些特定的实施方案。事实上，对于分子免疫学或相关领域的技术人员显而易见的对实 施本发明的方式的各种修改也应在所附权利要求书的范围内。
[0317]SEQIDNo. 33
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[0357] 2341 evlgceaqdly
【主权项】
1. 一种包含FVIII衍生序列DNMVTFRNQASRPY的肽，该肽（a)具有通式 XXGDNIMVTFRNQASRPYGXX 其中X是赖氨酸或谷氨酸；以及 (b)具有以下序列中的一项： KKGDNIMVTFRNQASRPYGKK(SEQIDNo. 17) KKGDNIMVTFRNQASRPYGKE(SEQIDNo. 18) KKGDNIMVTFRNQASRPYGEK(SEQIDNo. 19) KE⑶NMVTFRNQASRPYGKK(SEQIDNo. 25) KE⑶NMVTFRNQASRPYGKE(SEQIDNo. 26) KE⑶NMVTFRNQASRPYGEK(SEQIDNo. 27) EKGDNIMVTFRNQASRPYGKK(SEQIDNo. 29) EKGDNMVTFRNQASRPYGKE(SEQIDNo. 30)和EKGDNMVTFRNQASRPYGEK(SEQIDNo.31)。2. -种包含FVIII衍生序列PRCLTRYYSSFVNME的肽，该肽（a)具有通式 XXGPRCLTRYYSSFVNMEGXX 其中X是赖氨酸或谷氨酸；以及 (b)具有以下序列中的一项： KKGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQIDNo. 1) KKGPRCLTRYYSSFVNMEGKE(SEQIDNo. 2) KKGPRCLTRYYSSFVNMEGEK(SEQIDNo. 3) EEGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQIDNo. 5) EEGPRCLTRYYSSFVNMEGEK(SEQIDNo. 7) KEGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQIDNo. 9) KEGPRCLTRYYSSFVNMEGKE(SEQIDNo. 10) KEGPRCLTRYYSSFVNMEGEK(SEQIDNo. 11)和EKGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQIDNo.13)。3. -种包含多种肽的组合物，其包括根据权利要求2的一种或多种肽。4. 根据权利要求3的组合物，其包含根据权利要求1的至少一种肽和根据权利要求2 的至少一种肽。5. 根据权利要求4的组合物，其包含具有SEQIDNo. 1的肽和具有SEQIDNo. 17的 肽。6. 根据权利要求1或2的肽或根据权利要求3至5中任一项的组合物，其在体内抑制 或阻止VIII因子抑制物抗体的产生中使用。7. 根据权利要求1或2的肽或根据权利要求3至5中任一项的组合物在制备在体内抑 制或阻止VIII因子抑制物抗体产生的药物中的用途。8. -种用于在受试者中抑制或阻止VIII因子抑制物抗体的产生的方法，其包含将根 据权利要求1或2的肽，或权利要求3至5中任一项的组合物施用于所述受试者的步骤。9. 一种用于治疗受试者中的血友病的方法，其包含将根据权利要求1或2的肽，或权利 要求3至5中任一项的组合物施用于所述受试者的步骤。10. 根据权利要求8或9的方法，其中所述受试者患有A型血友病，并正经历或将要经 历VIII因子置换疗法和/或FVIII绕过疗法。11. 根据权利要求8或9的方法，其中所述受试者患有或有风险染上获得性血友病。12. 根据权利要求8至11中任一项的方法，其中所述受试者是HLA-DR2。
【专利摘要】本发明提供了部分可衍生于FVIII的肽，其能够在不经进一步抗原处理的情况下结合MHC II类分子，并被VIII因子特异性T细胞识别。具体地，本发明提供了包含序列DNIMVTFRNQASRPY或PRCLTRYYSSFVNME且具有N-和C-端修饰的肽。本发明也涉及这种肽在A型血友病和/或获得性血友病中阻止或抑制抑制物抗体形成的用途。
【IPC分类】A61K38/00, C07K14/755, A61K38/37, A61K39/00
【公开号】CN104903347
【申请号】CN201380069078
【发明人】D.赖思, H.斯特里特
【申请人】艾匹托普国际股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月11日
【公告号】CA2890835A1, EP2917232A1, US20150306192, WO2014072958A1
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