Il-6拮抗剂及其应用
Il-6拮抗剂及其应用
【专利说明】IL-6拮抗剂及其应用
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2012年11月8日提交的美国申请系列号61/723, 972和于2013年 6月6日提交的美国申请系列号61/831，699的优先权。前述每个申请的全部内容通过引用 并入本发明。 发明领域
[0003] 本发明领域涉及IL-6。更具体地，所述领域涉及IL-6的调节剂以及在治疗如眼病 中的应用。
【背景技术】
[0004]IL-6是一种在炎症、造血（hematopoiesis)、血管生成、细胞分化和神经元存活中 具有报导作用的多效性细胞因子。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明涉及具有某些特征（包括对IL-6的位点II特异性结合）的IL-6抗体及 片段，和此类抗体和片段的衍生物，以及使用该抗体、片段和衍生物的方法。因此，本发明涉 及能够特异性结合IL-6的位点II的抗体、片段或其衍生物。在一些实施方式中，抗体、片 段或衍生物能够以240pM或更低的KD结合IL-6。在一些实施方式中，抗体、片段或衍生物 具有70°C或更高的Tm。在一些实施方式中，抗体、片段或衍生物能够以240pM或更低的Kd 结合IL-6,并具有70°C或更高的Tm。在某些情况下，抗体或片段或其衍生物结合人IL-6的 R24、K27、Y31、D34、S118或V121的至少一个；在某些情况下，抗体或片段或其衍生物能够 结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121。在实施方式中，抗体或片段或其衍生物能 够结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121中的至少1个、至少2个、至少3个、至 少4个或至少5个。
[0007] 本发明一方面提供了能够特异性结合人IL-6的位点II的抗体或其片段（如其抗 原结合片段）。
[0008] 实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）能够以200pM或更低的KD结合 IL-6〇
[0009] 实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）能够以200pM或更低的KD结合 IL-6和/或具有70°C或更高的Tm。
[0010] 实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）能够以200pM或更低的KD结合 IL-6和/或具有80°C或更高的Tm。
[0011] 实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）结合人IL-6的R24、K27、Y31、 D34、S118和V121中的至少一个。实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）结合人 IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121中的至少两个。实施方式中，抗体或其片段（如其 抗原结合片段）结合人11-6的1?24、1(27、￥31、034、5118和￥121中的至少三个。实施方式 中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121 中的至少四个。实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121中的至少五个。实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段） 结合人IL-6 的R24、K27、Y31、D34、S118 和V121。
[0012] 一方面本发明提供一种抗体（如分离的抗体，如分离的单克隆抗体）或其片段 (如其抗原结合片段），其包含（a)如SEQIDN0 :4所示的VHCDR1，如SEQIDN0 :5所示 的VHCDR2,和如SEQIDN0 :6所示的VHCDR3 ;以及任选地（b)如SEQIDN0 :7所示的VL CDR1，如SEQIDN0:8所示的VLCDR2,和如SEQIDN0:9所示的VLCDR3,其中所述抗体或 其片段（如其抗原结合片段）能够特异性结合人IL-6。在实施方式中，抗体或其片段包含 分别与SEQIDN0:4、SEQIDN0:5和SEQIDN0:6所示的CDR序列相同，或与所述CDR序 列的差异总共不超过1、2、3、4或5个氨基酸的重链CDRsVHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。 在实施方式中，抗体或其片段包含分别与SEQIDN0:7、SEQIDN0:8和SEQIDN0:9所示 的⑶R序列相同，或与所述⑶R序列的差异总共不超过1、2、3、4或5个氨基酸的轻链⑶Rs VLCDR1、VLCDR2 和VLCDR3。
[0013] 一方面本发明提供一种IL-6抗体（如分离的IL-6抗体）或其片段（如其抗原结 合片段），其能够以240pM或更低的KD (如通过表面等离振子共振确定）与人IL-6解离。在 实施方式中，抗体能够以255pM或更低的IC50中和IL-6活性，如通过体外HEK-Blue?IL-6 测定法测定的。
[0014] 一方面本发明提供一种IL-6抗体（如分离的IL-6抗体）或其片段（如抗原结合 片段），其能够竞争性抑制包含SEQIDN0 :1和SEQIDN0 :2的抗体或其片段（如抗原结 合片段）或包含SEQIDN0:3和SEQIDN0:2的抗体或其片段（如抗原结合片段）与人 IL-6的结合。
[0015] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）具有在pH5. 5下2nM或更高 的单价Kd。
[0016] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）是IgG2抗体。
[0017] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）与参考抗体（reference antibody)相比具有改变的FcRn结合。在实施方式中，与参考抗体相比，所述FcRn结合是 下降的。在实施方式中，与参考抗体相比抗体或片段的Fc结构域是改变的。
[0018] -方面本发明提供一种IL-6抗体（能够结合IL-6,如人IL-6的位点II的抗体） 或其片段，其具有修饰的Fc结构域并与具有野生型Fc结构域的相应的抗体相比展示出降 低的FcRn结合。
[0019] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）包含在SEQIDN0:23的 H311、1254和H436中的一个或多个的突变。
[0020] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）包含在SEQIDN0:23的 H311、D313、1254和H436中的两个或多个的突变。
[0021] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）包含在SEQIDN0:23的 H311、D313、1254和H436中的三个或多个的突变。
[0022] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）包含在SEQIDN0:23的 H311、D313、1254和H436中的每个的突变。
[0023] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）包含选自由H311A、H311E、 H311N、D313T、I254A、I254R和H435A构成的组的一个或多个突变（如1、2、3或4个突变）。
[0024] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）是分离的。
[0025] 在实施方式中，抗体是单克隆抗体或其片段（如其抗原结合片段）。在实施方式中 抗体是人单克隆抗体。
[0026] 在实施方式中，抗体是分离的单克隆抗体或其片段（如其抗原结合片段）。
[0027] 在实施方式中，抗体（如分离的单克隆抗体）包含SEQIDN0 :23。
[0028] 本发明还提供了一种抗体或其片段（如抗原结合片段）（如本发明所记载的IL-6 抗体或其片段），或包含该抗体或其片段的组合物，用于治疗IL-6相关的疾病（如用于治 疗患有IL-6相关疾病的受试者，如人受试者）。在实施方式中，所述疾病是以玻璃体内升 高的IL-6水平为特征的眼部疾病。在实施方式中，所述疾病是糖尿病黄斑水肿（diabetic macularedema，DME)、糖尿病视网膜病（diabeticretinopathy)、葡萄膜炎（uveitis)、 干眼病（dryeyedisease)、葡萄膜炎（uveitis)、年龄相关性黄斑变性（age-related maculardegeneration，AMD)、增生型糖尿病视网膜病变（proliferativediabetic retinopathy，H3R)、视网膜静脉阻塞（retinalveinocclusion，RV0)、视神经脊髓炎 (neuromyelitisoptica，NM0)、角膜移植物（cornealtransplant)、角膜擦伤（corneal abrasion)或眼睛物理损伤（physicalinjurytotheeye)。在实施方式中，所述疾病是 DME。在实施方式中，所述疾病是干眼病。在实施方式中，所述疾病是干眼综合症。在实施 方式中，所述疾病是葡萄膜炎。在实施方式中，所述疾病是AMD。在实施方式中，所述疾病是 TOR。在实施方式中，所述疾病是TOR。在实施方式中，所述疾病是角膜移植、角膜擦伤或眼 睛物理损伤。在实施方式中，抗体或其片段（如抗原结合片段）适于递送至眼睛的玻璃体。 在实施方式中，将抗体或其片段（如抗原结合片段）递送至眼睛的玻璃体。
[0029] 本发明还提供了一种治疗IL-6相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用 IL-6抗体或其片段（如其抗原结合片段），例如本发明所描述的IL-6抗体或其片段。在实 施方式中，以治疗有效量施用IL-6抗体或其片段（如其抗原结合片段）。在实施方式中， IL-6相关疾病是以玻璃体内升高的IL-6水平为特征的眼部疾病。在实施方式中，所述疾病 是糖尿病黄斑水肿（DME)、糖尿病视网膜病、葡萄膜炎、干眼综合症、干眼病、葡萄膜炎、年龄 相关性黄斑变性（AMD)、增生型糖尿病视网膜病变（PDR)、视网膜静脉阻塞（RV0)、视神经脊 髓炎（NM0)、角膜移植物、角膜擦伤或眼睛物理损伤。在实施方式中，抗体或其片段（如其抗 原结合片段）适于递送至眼睛的玻璃体。在实施方式中，将抗体或其片段（如其抗原结合 片段）递送至受试者眼睛的玻璃体。在实施方式中，IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿且将 抗体或其片段递送至受试者眼睛的玻璃体。
[0030] 另一方面本发明提供一种包含编码本发明所述的IL-6抗体或其片段（如其抗原 结合片段）的序列的载体。在实施方式中，所述载体包含编码SEQIDNO:4、SEQIDN0 :5、 SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8 或SEQIDNO:9 的序列。
[0031] 本发明的另一方面提供一种表达本发明所述的IL-6抗体或其片段（如其抗原结 合片段）序列的细胞。在实施方式中，所述细胞表达SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQID NO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8 或SEQIDNO:9 中的一种或多种。
[0032] 在另一个方面，本发明涉及在受试者中降低抑制IL-6的系统性效应的方法，所述 方法包括向受试者施用能够抑制IL-6的活性，并与野生型Fc结构域的相应的抗体或其片 段相比具有降低的Fc活性的抗体或其片段。在一些情况下，在所述受试者中降低抑制IL-6 的系统性效应的方法包括向受试者施用例如在低pH下（如pH5. 5)具有高于1yM的FcRn 结合的IL-6拮抗剂。
[0033] 如本发明所用，术语"抗体"与免疫球蛋白含义相同，且在本领域中是公知的。术 语抗体不受制备抗体的任何特定方法的限制。例如，术语抗体包括，特别是重组抗体、单克 隆抗体和多克隆抗体。如本发明所用，抗体是一种四聚体，且除非另外公开，每个抗体均由 两对相同的多肽链组成，其中每对具有一个轻链和一个重链。每一条链的氨基端包含在抗 原识别中起主要作用的约100到120或更多氨基酸的可变区。每一条链的羧基端包含在抗 体效应子功能（antibodyeffectorfunction)中起主要作用的恒定区。人轻链的种类被 称为kappa和lambda轻链。重链种类为mu、delta、gamma、alpha或epsilon，并定义了抗 体的同种型。抗体的同种型分别为181、1§0、1§6、1 §4和1§￡。在轻链和重链中，可变区和 恒定区通过约12或更多个氨基酸的"J"区连接，重链还包括一个约3个或更多个氨基酸的 "D" 区。
[0034] 每一重链/轻链对（VH和VL)的可变区分别形成抗原结合位点。因此，例如完整 的IgG抗体具有两个结合位点。除双功能或双特异性抗体外，所述的两个结合位点是相同 的。
[0035] 抗体重链和轻链的可变区表现出通过3个高变区（也称为互补决定区或⑶R)连 接的相对保守框架区（FR)的相同通用结构。术语"可变"指抗体间可变域的某些位点在序 列上存在广泛的差异，并且这些位点涉及每一特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。可 变性（variability)主要位于CDRs中，其被更加高度保守的框架区（FRs)分开。根据Kabat SequencesofProteinsofImmnunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth, Bethesda，MD，1987 和 1991)或Chothia和Lesk，JMolBiol196:901-917(1987);Chothia 等，Nature342 :878-883 (1989)(其记载了本领域公知的方法）的定义进行每个结构域的 氨基酸的分配。
[0036] "野生型"可指一个群体中最为普遍的等位基因或种类，或指来自于未经操作的 动物的抗体，后者是与来自某种形式的操作的等位基因或多态性或变体或衍生物相较而言 的，所述操作是例如诱变、使用重组方法等来改变该抗原结合分子的氨基酸。
[0037] 术语"抗体片段"是指完整或全长链或抗体的一部分，通常为靶结合区或可变区。 抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab'）2和Fv片段。"功能片段"或"抗-IL-6的 位点II抗体的类似物"是可防止或实质降低IL-6结合到受体的能力、降低IL-6/IL-6R复 合物结合到gpl30的能力或降低配体结合到gpl30或起始信号（initialsignaling)的能 力。如本发明所用，功能片段通常与"抗体片段"含义相同，并且就抗体而言可指能防止或 实质降低IL-6结合到受体的能力、降低IL-6/IL-6R复合物结合到gpl30的能力或降低配 体结合到gpl30或起始信号能力的片段，例如Fv、Fab、F(ab' )2等。
[0038] 抗体的"衍生物"是能够特异地结合IL-6的位点II的且与IL-6的位点II抗体 共享序列，例如共享能够特异地结合人IL-6的位点II的抗体的至少一个CDR的多肽。
[0039] "竞争"是指第一抗体或其片段能够与第二抗体或其片段竞争结合，使得与第二抗 体不存在时第一抗体的结合相比，在第二抗体存在下，可检测到第一抗体与其表位结合的 降低。在某些情况下，该术语也指在第一抗体存在下，第二抗体与其表位的结合是可检测的 降低。在非限制性的例子中，该竞争的机制可通过位阻、构象改变或与共同表位结合。
[0040] 核酸序列内容中的术语"序列同一性百分比"是指当比对以获得最大对应时，两 序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以超过至少约9个核苷酸，例如，至少约18 个、至少约24个、至少约28个、至少约32个、至少约36个或至少约48个或更多个核苷酸。 可以使用本领域中已知的算法测量核苷酸序列的同一性。例如，可以使用FASTA、Gap或 Bestfit(WisconsinPackage10.0 版本，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI) 比较多核苷酸序列。FASTA，包括例如程序FASTA2和FASTA3,提供查询和搜索序列之间最 佳重叠区域的比对和序列同一性百分比（Pearson，MethodsEnzymol183 :63_98 (1990); Pearson,MethodsMolBiol132:185-219(2000) ；Pearson,MethodsEnzymol266： 227-258(1996) ;Pearson，JMolBiol276:71-84 (1998);通过引用并入本文）。通常使用特 定程序或算法的缺省参数。例如，可以使用FASTA及其缺省参数（字长为6和用于计分矩 阵的N0PAM系数）确定核酸序列间序列同一性百分比，或使用GCG第6. 1版提供的具有默 认参数的Gap来确定，通过引用并入本文。
[0041] 氨基酸序列中的术语"序列同一性百分比"是指当比对以获得最大对应性时，两序 列中相同的残基。序列同一性比对的长度可以超过至少5个氨基酸残基，例如，至少20个 氨基酸残基、至少30个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少 150个氨基酸残基或至少200个或更多个氨基酸残基。通常使用序列分析软件测量多肽的 序列同一性。用于确定序列同一性百分比的算法是已知的。例如可以使用FASTA、Gap或 Bestfit(WisconsinPackage第 10.0版，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI)比 较氨基酸序列。蛋白分析软件使用比对多种取代、缺失以及包括保守性氨基酸置换的其他 修饰的相似性的测量来匹配序列。例如，GCG含有诸如"Gap"和"Bestfit"程序，它们可以与 默认参数一起用来决定密切相关的多肽（诸如来自不同物种之生物的同源性多肽）或野生 型蛋白与其类似物之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG第6. 1版（University ofWisconsin，Madison，WI)。多肽序列也可以使用默认或建议参数的FASTA(参见GCG第 6. 1版）来比对。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的 比对和序列同一性百分比（Pearson，MethodsEnzymol183 :63_98 (1990) ;Pearson，Methods MolBioi132:185-219(2000))。当要将序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库比 对时，可以使用的另一种算法是BLAST，例如blastp或tblastn，使用程序提供的默认参数。 参见例如Altschul等，JMolBioi215:403-410(1990);Altschuletal.，NucleicAcids Res25 ：3389-402(1997)〇
[0042] 当样品的至少约60或75%显示出单一种类的多肽时，蛋白或多肽是"基本纯净 的，""基本均质的，"或"基本纯化的"。多肽或蛋白可以是单体或多聚体。基本纯的多肽 或蛋白可包含约50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%纯品；例如，一个基本纯的 多肽或蛋白是50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%纯的。蛋白的纯度或均质性可 通过任何适当的方法评价，如蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过观察一条或多条 与蛋白或多肽相关的条带（如在染色的凝胶上）、大小排阻HPLC、阳离子交换HPLC、SDS中 的减压毛细管电泳、肽图谱或聚糖图谱。例如可使用现有技术中的已知方法或其他纯化方 式实现高分辨率。
[0043]当指核酸或其片段时，术语"基本相似性"是指当以适当核苷酸插入或缺失，与另 一核酸（或其互补链）进行最佳比对时，通过任何已知的序列同一性算法，如FASTA、BLAST或Gap测量的核苷酸碱基的核苷酸序列的同一性为至少约85%、至少约90%，和至少约 95%、96%、97%、98%或 99% 的序列同一性。
[0044] 当用在多肽上时，术语"基本同一性"或"基本相似性"是指当两个多肽序列用 如GAP或BESTFIT程序使用默认空位权重进行最佳比对时，共享至少约70%、75%、80%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性；例如，70%、75%、80%、90%、95%、 96 %、97 %、98 %或99 %的序列同一性。在某些实施方式中，不相同的残基位置的差异在于 保守氨基酸变化。
[0045] "治疗有效量"是指施用该剂量的治疗剂将缓解所治疗疾病的至少一种征兆或症 状或增加或提高可用于治疗IL-6相关疾病的另一疗法（如另一种治疗剂）的预防和或治 疗效果。应当理解治疗有效量可以在有限的时间内多剂量施用或作为长期治疗。
[0046] "治疗"是指缓解征兆或症状或疾病的方法。
[0047] 如本发明所用，术语"疾病"包括疾病和病症。
[0048] 本发明所提到的每一个专利文件和科学文章的全部公开，以及在此所引用的这些 专利文件和科学文章，出于所有的目的通过引用明确地并入本文中。
[0049] 本发明其他的特点和优势在下面详细描述。
[0050] 附图简述
[0051] 图1是说明实验结果的图表，该实验在大鼠CNV模型中IVT施用抗IL-6抗体。抗 VEGF抗体作为阳性对照被施用且阴性对照是载体本身。抗-IL-6对载体对照，第15天时p =0? 0054,第 22 天时p= 0? 0005。
[0052] 图2是说明测试鼠64抗体抑制IL-6/IL-6R结合gpl30的能力的结合实验结果的 图表。
[0053] 图3A是说明实验的图表，该实验中测试了 020在缺乏过多的可溶性IL-6Ra的情 况下阻断IL-6信号传导（signaling)的能力。实验是在具有0? 2ng/mLIL-6和2yg/mL IL6Ra情况中在HEK-Blue-IL-6细胞上进行。
[0054] 图3B是说明实验的图表，该实验中测试了020在过多的可溶性IL-6R a缺乏存在 的情况下阻断IL-6信号传导的能力。实验是在具有0. 2ng/mL IL-6和2yg/mL IL6Ra的 情况中在HEK-Blue-IL-6细胞上进行。
[0055] 发明详述
[0056] 已经暗示IL-6在诸如类风湿性关节炎的多种疾病中起作用，且已经报道在包括 眼部疾病在内的多种疾病中显著上调。IL-6可通过顺式和反式机制起作用。在顺式机制 中，认为游离的IL-6结合至膜结合型IL-6受体（IL-6R，也称为IL-6Ra和CD126)，且然后， IL-6/IL-6R复合物与gpl30 (也称作CD130、制瘤素M受体、IL-6Rbeta和IL-6信号转导物） 相互作用，以激活含有所述复合物的细胞中的信号传导。在反式机制中，游离的IL-6结合 可溶性IL-6受体（SIL-6R)。IL-6/sIL-6R复合物然后能够结合存在于细胞膜上的gpl30。 这些机制间关键的不同之处在于表达gpl30的细胞类型多于表达IL-6R(其表达是更有限 的）的细胞类型。因此在希望抑制IL-6信号传导的疾病中，例如在那些希望广泛地抑制 IL-6信号传导的疾病中，抑制顺式和反式IL-6信号两者是有用的。申请人已经制备出了 IL-6拮抗剂，如抗IL-6抗体、片段和衍生物，该拮抗剂能够抑制IL-6的顺式和反式的信号 传导。另外，申请人已经制备了该IL-6拮抗剂以实现增强的玻璃体保留和更快的全身清 除。
[0057]IL-6拮抗剂（IL_6a)的特点
[0058] -般而言，本发明描述的IL-6拮抗剂（IL_6a)特异地结合IL-6的位点II(位点 2)，且对于IL-6相关的眼病和某些其他疾病的治疗是有用的。IL-6相关的眼病是一种疾 病，其中不希望的症状或疾病的生物学活性与IL-6的表达或存在有关。在一些实施方式 中IL-6a对游离的和结合的IL-6具有高亲和力，在机体中是相对稳定的，能够抑制结合到 IL-6R的IL-6 (本发明中被称为IL-6/IL-6R复合物或IL-6/IL-6R)与gpl30的结合，并且 能具有治疗效果。一般来说，IL_6a是抗体或衍生自抗体。例如，IL_6a是高亲和性的人源 化Fab，其能够特异地结合IL-6的位点II并有效阻止顺式和反式IL-6信号传导。在另一 个例子中，IL_6a是全长抗体，如IgGl或IgG2抗体。
[0059] 在一些实施方式中，Fab也被设置为Fc-工程化的序列或位于全长的抗体中。在 一些实施方式中，Fc-工程化的IL_6a(如Fc-工程化的Fab)与适当的对照相比，如与相应 的不具有工程化的Fc的抗体、其片段或衍生物相比，具有增加的玻璃体停留时间和/或更 快的全身清除。IL_6a的这些和其他特点在本发明中被进一步描述。[0060] 申请人已经设计出选择地结合IL-6的位点II的IL-6拮抗剂以提供IL-6信号 传导的广泛抑制，因为这类分子可以抑制gpl30与IL-6的结合，无论IL-6是结合膜IL-6R 还是结合SIL-6R。此外，靶向配体（IL-6)相对于IL-6受体可以避免受体介导的清除和由 ADCC带来的毒性（抗体依赖的细胞介导的细胞毒性）。由于IL-6在疾病中起到病理和保 护性作用，因此使用IL-6拮抗剂（IL-6a)治疗与增加的IL-6相关的疾病可以改善某些方 面的状况，但也可能造成显著的副作用，如系统性效应。这种IL-6通路的双重性（如具有 希望的和/或不希望的效应的能力）使其不适合作为全身性抑制剂治疗IL-6相关病症。 因此，本发明提供的组合物和方法对于治疗是有用的，所述组合物抑制至少一种IL-6的活 性但对IL-6的积极活性不具有不当的影响，部分因为所述组合物能被配制为局部递送，如 配制为局部递送至眼睛。例如，在某些方面，IL_6a被设计为适于递送至特定位点的尺寸。 在一些实施方式中，IL_6a是全长抗体。在一些实施方式中，IL_6a衍生自抗体且处于一种 可在眼睛的玻璃体中具有更长的停留期和有限的系统性漏出（systemicleakage)的方式。 在一些实施方式中，IL_6a是修饰的抗体（如具有修饰的Fc结构域的抗体），与相应的未修 饰的抗体相比，其在眼睛的玻璃体中具有更长的停留期和/或更为有限的全身性漏出。在 一些实施方式中IL-6a是IgG2抗体。
[0061] 在一些方面，IL_6a是相对小的IL_6a，如抗体的片段或其他抗体衍生物即小于全 长抗体，例如衍生自IL-6抗体的Fab。在一些情况下，IL_6a处于一种能够从一个组织的一 部分传递到另一个组织并与相应的全长IL-6抗体相比具有增加的动力学的形式。在一些 实施方式中，IL_6a是被工程化为更大分子的Fab，其与Fab单独相比更可能在被递送的区 域中具有延长的停留，例如IL_6a通过Fc结构域二聚化。在某些实施方式中，Fc结构域被 工程化从而使Fc部分具有消弱的（ablated)或减弱的FcRn结合，从而可导致延长的局部 停留，如与包含野生型Fc的相同的IL-6结合体（IL-6bindingentity)相比增加玻璃体 停留和减少全身积累。
[0062] 本发明所描述的IL-6拮抗剂还对其靶标IL-6具有足够高的亲和性从而有效改善 IL-6的至少一个不希望的效应。所述抑制剂还是足够稳定的以有助于其作为治疗剂。
[0063] 一般而言，IL_6a的PK，如适合用在眼睛中的IL_6a在递送的位点（如玻璃体）中 具有足以提供治疗效果的PK。在非限定的例子中，所述PK可以是至少12小时、24小时、2 天、3天、4天、5天、8天、10天、14天、21天、28天或30天的半衰期。
[0064] 结合到位点II的IL-6拮抗剂的鉴定
[0065] 一般来说，本领域中已知的任何方法都可用于生产能够结合IL-6的分子，例如， 实验中，多肽文库或分子文库可用于筛选具有结合到IL-6的能力的多肽或化合物的候选 化合物。一旦鉴定了该候选化合物，可以使用本领域中已知的方法确定化合物的结合位点。 例如，可以测试分子结合到野生型IL-6的能力并将该结合力与该分子与在位点I、位点II 或位点III突变了的IL-6的结合能力作比较。在实施方式中，本发明所述的IL-6a保留结 合到IL-6/IL-6Ra复合物和结合到IL-6的能力，并阻止IL-6/IL-6Ra结合到gP130。在 实施方式中，例如本发明所述的IL-6a通过与IL-6的位点II的结合能够与gpl30竞争结 合IL-6/IL-6RCI复合物。可以使用本领域已知的方法测定该结合能力。
[0066]例如，可使用HEK-Blue?IL-6 测定系统（InvivoGen，SanDiego)测试IL_6a候选 物。HEK-Blue?IL-6细胞是稳定转染了人IL-6R和STAT3-可诱导SEAP报告基因的HEK293细 胞。在IL-6存在下，STAT3被激活且SEAP被分泌。例如可以使用QUANTI-Blue?(InvivoGen， SanDiego)测定SEAP。向细胞加入IL-6拮抗剂抑制了游离和可溶性受体与IL-6的结合， 从而阻止了SEAP的分泌或降低了SEAP的水平。
[0067] KD指特定抗体-抗原相互作用或抗体片段-抗原相互作用的结合亲和平衡常数。 当KD低于或等于 250pM，如低于或等于 225pM、220pM、210pM、205pM、150pM、100pM、50pM、 20pM、10pM或lpM时，抗体或其片段被认为是特异性与抗原结合。可使用现有技术中已知的 方法确定KD，例如表面等离振子共振，如使用BiaCore?系统确定KD。
[0068] K#指特定抗体-抗原相互作用或抗体片段-抗原复合物的解离速率常数。可使 用表面等离振子共振，例如使用BiaCore?系统确定解离速率常数。一个相对慢的K可产 生治疗所希望的特征，如允许以低频率向需要该治疗的个体施用抑制剂。
[0069] 特异性
[0070] 本发明所公开的IL-6拮抗剂的特点涉及它们的结合特异性。如上文所讨论，IL-6 可作为游离IL-6和作为结合到可溶性IL-6Ra的IL-6存在。申请人已经鉴定出，与结合 IL-6位点I的抑制剂相比，IL-6的位点II是IL-6拮抗剂的最佳靶点。位点I的抑制剂可抑 制游离IL-6与IL-6Ra的结合。然而，该抑制剂不能阻止由事先存在的复合物所引起的活 性，除非通过替换，其受限于IL-6/IL-6R复合物的1(。"。在另一个可选方案中，结合IL-6Ra 的抑制剂是不太合适的，因为除非其以饱和浓度存在，该抑制剂具有有限的阻止IL-6活性 的能力。由于IL-6受体的量较IL-6的量通常是相当高的，因此这种方法可能需要施用不 期望的大量的通过与受体结合来抑制IL-6活性的化合物。在实施方式中，本发明所描述的 IL-6拮抗剂（如本发明所描述的抗体和片段及其衍生物）能够甚至当IL-6结合到IL-6R 时阻断IL-6的活性。因此，本发明所描述的IL-6a的优势在于与靶向IL-6受体的抑制剂 相比，实现治疗效果所需施用的化合物的量相对较小。抗受体抗体已被报道通过受体介导 的清除被快速清除，这显著限制了抗体的PK，因此需要加大剂量、更高频给药或使用前述两 者。另外，抗受体抗体和抗位点IIL-6抗体的问题在于它们通过阻断配体的正常受体介导 的清除途径显著地增加了IL-6的组织浓度，从而使受试者处于组织中IL-6的潜在不需要 的水平。此外，使用靶向IL-6Ra的抑制剂可能使抑制剂必需存在于寻求抑制剂的位点和 不希望的位点（如全身治疗）附近。使用与位点II(gpl30结合该位点）结合的IL-6a允 许抑制游离的IL-6以及结合了IL-6R的IL-6,但并不激活经过gpl30的IL-6途径。因此， 本发明所描述的IL-6拮抗剂被设计为结合两种形式的IL-6(可溶的和结合到受体的），特 别是结合到IL-6的位点II的拮抗剂，该拮抗剂能够结合两种形式的IL-6。本发明所描述 的包含IL-6a的组合物可通过IL-6抑制顺式和反式信号。
[0071] 在某些情况下，本发明所提供的化合物和方法被设计为提供一种有效的IL-6阻 断剂，其足以治疗至少一种IL-6相关病症的征兆或症状，如抑制血管发生和/或炎症。
[0072] 本发明所描述的化合物还可用于治疗以不期望的高水平IL-6为特征的眼病， 如在玻璃体中的疾病（参见Yuukietal.，JDiabetesCompl15 ;257 (2001);Funatsu etal. ,Ophthalmology110:1690, (2003) ；0hetal. ,CurrEyeRes35:1116(2010)； Nomaetal.，Eye22 :42 (2008);Kawashimaetal.，JpnJOphthalmol51 :100 (2007); Kauffmanetal. ,InvestOphthalmolVisSci35 ：900(1994)；Miaoetal. ,MolecVis 18 ：574(2012))〇
[0073] 通常，本发明所描述的IL_6a是IL-6信号传导强效拮抗剂。这部分地通过设计对 IL-6具有高亲和力的分子来实现，例如，在使用10pMIL-6的HEK-BlueIL-6试验中IC50 小于或等于l〇〇pM。可根据IL-6a的Kd确定IL-6a的高亲和性，例如，小于或等于InM的Kd、 小于或等于500pM的Kd、小于或等于400pM的Kd、小于或等于300pM的Kd、小于或等于240pM 的KD或小于或等于200pM的KD。
[0074] 为了制备可用于治疗与增加的IL-6表达或活性有关病症的生物制剂IL_6a(例 如蛋白或多肽如抗体、片段或其衍生物），通常最好是所述生物制剂IL_6a具有高的产率。 例如，合适的产率为高于或等于lg/L(如高于或等于2g/L、高于或等于5g/L或高于或等于 l〇g/L)〇
[0075] 为了有效地施用IL-6拮抗剂，需要抑制剂具有与将要施用的浓度相匹配的溶解 度。例如，在全长抗体的IL-6a的情况下，其溶解度大于或等于20mg/ml、大于或等于10mg/ ml、大于或等于5mg/ml或大于或等于lmg/ml。
[0076] 另外，抑制剂必须具有递送的体温下的高度稳定性和活性位点及储存稳定性从而 成为一种可行的治疗。例如高于或等于60°C的Tm (如高于或等于60°C、高于或等于62. 5°C、 高于或等于65°C、高于或等于70°C、高于或等于73°C、高于或等于75°C)和高于或等于 45°C的Tmset，如高于或等于50°C、高于或等于51°C、高于或等于55°C或高于或等于60°C。 可以用本领域已知的方法确定L和T_61的方法。
[0077] 可从本领域中已知的分子的类型中选择具有所需要的特性的拮抗剂，例如抗体， 包括靶向IL-6的位点II的抗体的片段和衍生物，其一般保留或维持足够的亲本IL-6抗 体的特征（如需要的结合特性）。该拮抗剂包括Fab片段、scFvs、工程化的含有Fc部分的 Fab片段，以及工程化的具有不同于亲本IL-6的位点II靶向抗体框架的全长抗体。
[0078] 在一些方面中，本发明所描述的IL_6a包括人抗体抗原结合位点，该位点能够竞 争或交叉竞争能够结合IL-6的位点II的抗体或其片段。例如，抗体或其片段可以由本发 明中公开的VH结构域和VL结构域组成，且VH和VL结构域包含本发明中公开的IL-6/位 点II结合抗体的一组⑶Rs。
[0079] 可使用任何合适的方法，例如通过突变IL-6上的多种位点来确定与IL_6a结合 的结构域和/或表位。那些含有突变的表位阻止或降低IL_6a的结合，且IL-6配体直接 参与与IL_6a的结合或如通过影响IL-6的构型间接影响结合位点。可以使用其他方法确 定IL-6a所结合的氨基酸。例如，可以使用肽-结合扫描，如基于PEPSCAN的酶联免疫试验 (ELISA)。在这种类型的肽-结合扫描中，源自抗原的短重叠肽被系统地针对其与结合成员 的结合进行筛选。所述肽可以共价地连接于支持物表面，以形成肽阵列。肽可以是线性的 或受限的构象。可以使用在每一肽序列的末端具有半胱氨酸（cys)残基的多肽产生受限的 构象。可将cys残基直接或间接共价偶联到支持物表面从而使肽保持环形构象。因此，所 述方法中所使用的肽可能具有一个添加在与抗原片段相关的肽的每一末端的cys残基。还 可使用双环形肽，其中cys残基额外地定位于或靠近肽序列的中间部位。可将cys残基直 接或间接共价偶联到支持物表面从而使肽形成双环的在中央cys残基的每一侧具有一个 环的构象。可以合成产生肽，因而可以在需要的位置修饰cys残基，尽管其不是在IL-6的 位点II序列天然发生的。任选地，可在肽-结合试验中筛选线性或构象受限的肽。肽-结 合扫描可包括鉴定（如使用ELISA) -组结合到结合成员的肽，其中所述肽具有与IL-6a的 片段相对应的氨基酸序列（如包括IL-6a的约5、10或15个连续残基的肽），以及比对所述 肽以确定结合成员所结合的残基的足迹，其中该足迹包含重叠肽共同的残基。可选地或额 外地，可以使用肽-结合扫描方法以至少选定的信号：噪音比鉴定IL_6a要结合的肽。
[0080] 可使用本领域中已知的其他方法确定抗体所结合的残基，和/或确认肽-结合扫 描结果，包括例如，定点突变（如本发明所描述的）、氢氘交换、质谱、NMR和X-射线晶体法。
[0081] 一般地，本发明所描述的有用的IL-6a是人抗体分子、人源化抗体分子或其结合 片段。通常，抗体是单克隆抗体。该抗体的来源可以是人、小鼠、大鼠、骆驼、兔子、羊、猪或 牛，且可按照那些本领域中已知的方法生产所述抗体。
[0082] 通常，IL_6a至少包含抗体的⑶R，所述⑶R特异地结合IL-6的位点II(如人 IL-6)。带有本发明的CDR或一组CDRs的结构可以是抗体重链或轻链序列或其实质性部分， 在重链和轻链中⑶R或一组⑶Rs位于天然发生的由重排免疫球蛋白基因编码的VH和VL 抗体可变结构域的⑶R或一组⑶Rs的对应位置。可通过参考Kabat等人，1983 (国立健康 研宄院）以及使用任何因特网搜索引擎在"Kabat"下查找到的更新（updates)来确定免疫 球蛋白可变结构域的结构和位置。
[0083] 作为抗体的IL-6a-般包含抗体VH结构域（如SEQIDN0 :1或SEQIDN0 :3)和 /或VL结构域（如SEQIDN0 :2)。VH结构域包含一组重链CDRs(VHCDRs)，以及VL结构域 包含一组轻链⑶Rs(VIXDRs)。实施例3中提供了该⑶Rs的例子，该⑶Rs的例子被描述于 SEQIDN0s:4-9中。抗体分子可包含一个含有VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3和框架的抗体VH 结构域。其可选地或还包含含有VIXDR1、VIXDR2和VIXDR3和框架的抗体VL结构域。
[0084] 本发明所公开的IL-6拮抗剂包含如那些在本发明中所公开的VHCDR1和/或 VHCDR2和/或VHCDR3和/如那些在本发明中所公开的VIXDR1和/或VIXDR2和/或VIXDR3。 IL_6a可包含一个或多个本发明所描述的任何抗体、片段或衍生物的⑶Rs。IL_6a可包含一 组VHCDRs(如VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)，且可选地其还可以包含一组VLCDRs(如VLCDR1、 VIXDR2和VIXDR3)。⑶Rs可源于一种或多种本发明所描述的抗体、片段或衍生物。例如， VLCDRs可源于与VHCDRs相同或不同的抗体。
[0085] 通常，VH结构域与VL结构域配对以提供一个抗体抗原结合位点。例如SEQIDN0 : 1或SEQIDNO:3的HC结构域与SEQIDNO:2的LC结构域配对。在某些情况下，VH或VL 结构域独自可以用作IL_6a。
[0086] 在某些方面，IL_6a是抗体分子、片段或其衍生物，其包含（i)与本发明所描述的 VH结构域（例如SEQIDN0 :1或SEQIDN0 :3的VH结构域）具有至少60、70、80、85、90、 95、98或99%氨基酸序列同一性的￥11结构域序列，或（^)那些序列（在（1)中定义的序 列）的一组VHCDRs(如，VHCDR1、VHCDR2和/或VHCDR3)。在实施方式中，抗体分子、片段或 其衍生物包含SEQIDN0 :1 的VHCDR1、VHCDR和VHCDR3 或SEQIDN0 :3 的VHCDR1、VHCDR 和VHCDR3。在实施方式中，抗体分子、片段或其衍生物包含SEQIDN0:1的VHCDR1、VHCDR2 和VHCDR3且整体上与SEQIDNO:1的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的差异不超过1个、不超 过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个氨基酸。在实施方式中，抗体分子、片段或其 衍生物包含SEQIDN0:3 的VHCDR1、VHCDR2 和VHCDR3 且整体上与SEQIDN0:3 的VHCDR1、 VHCDR2和VHCDR3的差异不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个氨 基酸。
[0087] 抗体分子、片段或其衍生物还可以任选地包含（i)与本发明所描述的VL结构域 (例如SEQIDN0:2的VL结构域）具有至少60、70、80、85、90、95、98或99%氨基酸序列 同一性的VL结构域序列，或（ii)那些序列（在（i)中定义的序列）的一组VLCDRs(如， VIXDR1、VIXDR2和/或VIXDR3)。在实施方式中，抗体分子、片段或其衍生物包含SEQID NO:2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在实施方式中，抗体分子、片段或衍生物包含VLCDR1、 VLCDR2和VLCDR3且整体上与SEQIDN0 :3的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的差异不超过1 个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个氨基酸。能够用于计算两氨基酸序 列百分比同一性的算法包括例如BLAST、FASTA，或Smith-Waterman算法，如采用缺省参数。
[0088] 本发明所描述的IL_6a可包含抗体恒定区或其部分，如人抗体恒定区或其部分。 例如，VL结构域可以在其C-末端附着包括人CK或CL链的抗体轻链恒定结构域。相似的， 基于VH结构域的IL-6a能够在其C-末端附着免疫球蛋白重链的全部或部分（如CH1结构 域），该重链源于任何同种型抗体，如IgG、IgA、IgE和IgM以及任何的同种型亚类，特别是 IgGl、IgG2、IgG3 和IgG4。
[0089] 在某些情况下，本发明的抗体被进一步使用本领域已知的方法修饰以制备具有特 定同种异型（allotype)的序列，例如一种在具有特定地域起源的人群中占主导地位的同 种异型。在某些情况下，修饰人类重链恒定区以达到该目的。
[0090] IL-6a可以是抗体分子、其结合片段或变体，其具有在抗体框架内的一个或多个 CDRs，例如一组CDRs。例如，抗体（例如本发明所描述的抗体或其片段或衍生物）的一个或 多个CDRs或一组CDRs可以被移植到框架中（如人框架）以提供抗体分子。框架区可以是 源自人种系基因序列，或可以是非种系来源的。
[0091]VH和/或VL框架残基可以如所讨论的那样被修饰并在本发明中作为例子，如使用 位点特异性突变。
[0092] 可以在源自靶向IL-6的位点II的抗体IL_6a(本发明中定义为"参考IL-6抗 体"）的一个或多个框架区和/或一个或多个CDRs中使用本领域已知的方法和参数进行氨 基酸改变。本发明中还包括所产生的IL-6拮抗剂，其保留了与IL-6的位点II(如人JL-6 的位点II)的结合且与参考IL-6抗体相比通常具有至少相同的结合或提高的亲和力。在 一些情况下，为了改善诸如稳定性的参数，可以引入导致与参考IL-6a(如参考抗体）相比 降低的结合亲和力的变化以制备有用的IL_6a。在某些实施方式中，例如在某些情况下，其 中所述参考涉及FcRn结合或药代动力学（PK)参数，如在玻璃体中的半衰期或全身的半衰 期（如，在血液、血浆、血清、淋巴、肝、肾、其他组织或体液），参考抗体可以是非特异地结合 IL-6的抗体。
[0093]IL_6a多肽的氨基酸序列中的变化可包括用非天然发生或非标准氨基酸取代一个 或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修饰为非天然发生或非标准形式，或在序列 中插入一个或多个非天然发生或非标准氨基酸。本发明序列中改变的数量和位置的例子在 本发明别处描述。天然发生的氨基酸包括20种"标准的"L-氨基酸，其由它们的标准单字 母被确定为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R，、H、D、E。非天然发生氨基酸包括 任何其他能够渗入多肽骨架或源自已有氨基酸残基修饰的残基。非标准氨基酸可以是天然 发生或非天然发生的氨基酸。本领域已知数种天然发生的非标准氨基酸，如4-羟脯氨酸、 5-羟赖氨酸、3-甲基组氨酸和N-乙酰丝氨酸。那些在N-alpha位置衍生化的氨基酸残基 将仅能位于氨基酸序列的N-末端。氨基酸一般地为L-氨基酸。在一些情况下，氨基酸是 D-氨基酸。因此改造可以包含将L-氨基酸修饰为，或将其替换为D-氨基酸。氨基酸的甲 基化、乙酰化和/或磷酸化形式是已知的，且本发明中的氨基酸可进行该种修饰。
[0094] 本发明的抗体结构域和结合成员中的氨基酸序列可包含本发明所讨论的非天然 或非标准氨基酸。可以使用本领域中已知的方法，例如分子的合成或合成后修饰或氨基酸 的替换，将非标准氨基酸（如D-氨基酸）渗入氨基酸序列。在一些情况下，D-氨基酸被用 于增加IL_6a的PK。
[0095] 可通过随机突变一个或多个选择的VH和/或VL核酸序列在整个可变结构域中产 生突变的方式产生本发明携带CDR来源序列的新的VH或VL区。例如可使用易错PCR(Chao 等，NatureProtocols，l:755-768(2006))。在一些实施方式中，在整个可变区或一组CDRs 中进行一个或两个氨基酸替换。可使用其他本领域中已知的方法产生突变，例如一般在一 个或多个CDRs中的定点突变。
[0096] 用于产生抗体IL_6a的一个方法是通过添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基 酸来改变VH结构域，如那些描述于SEQIDN0:1和SEQIDN0:3的结构域。改变的结构 域可与如描述于SEQIDN0 :2的VL结构域组合，所述VL结构域也可以使用本领域中已知 的方法如本发明所描述方式被改变。测试这些改变了的分子结合IL-6的位点II的能力以 及任选地测试其他需要的特性如与参考分子相比增加的亲和力。在某些情况下，变体VH或 VL结构域可具有1、2、3、4或5个这样的改变（如1、2、3、4或5个氨基酸替换）。
[0097] 本发明的IL_6a可以是结合IL-6的位点II的抗体的片段，只要所述片段包含抗 原结合位点，如能够结合IL-6的位点II的抗原结合位点即可。本发明的抗体片段一般从 参考（亲本）抗体分子获得，如包含SEQIDN0 :1和SEQIDN0 :2或SEQIDN0 :3和SEQ IDNO:2.的抗体分子。可使用本领域中已知的方法如重组DNA、酶切割（如使用胃蛋白酶 或木瓜蛋白酶）、抗体的化学切割（如二硫桥的化学还原）的方式产生抗体片段。包含抗 体抗原结合位点的抗体片段包括，但不限于分子如Fab、Fab'、Fab' -SH、scFv、Fv、dAb、 Fd和二硫键稳定的可变区（dsFv)。可以改造包括一个或多个抗体抗原结合位点的多种其 他抗体，包括例如F(ab'）2、F(ab) 3、双抗体、三链抗体、四链抗体和迷你抗体。抗体分子以 及它们的构建和使用方法的例子描述于Holliger和Hudson，2005，NatBiotechnol23: 1126-1136。结合片段的非限定性的例子是由VL、VH、恒定轻链结构域（CL)和恒定重链结构 域1 (CH1)结构域构成的Fab片段；由VH和CH1结构域构成的Fd片段；由单链抗体（single antibody)的VL和VH结构域构成的Fv片段；由VH或VL结构域构成的dAb片段；分离 的⑶R区；F(ab' )2片段、含有两个连接的Fab片段的二价片段；单链Fv分子（scFv)，其 中VH结构域和VL结构域由肽连接子（linker)连接从而联合两结构域以形成抗原结合位 点；双特异性单链Fv二聚体（如公开于W0 1993/011161)以及使用基因融合（如公开于 W094/13804)构建的多价或双特异性片段的双抗体。可通过渗入连接VH和VL结构域的二 硫桥来稳定Fv、scFv或双抗体。还可以使用包含scFv连接到CH3结构域的迷你抗体作为 IL_6a。其他可用作IL_6a的抗体的片段和衍生物包括Fab'，其通过在重链CH1结构域的 羧基末端添加数个氨基酸残基（包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸）而不同于Fab片 段，以及包括恒定区的半胱氨酸分子带有一个游离巯基的Fab' -SH。
[0098] 在一些情况下，IL_6a是抗体片段，其已被化学修饰以增强或引入需要的特性，如 PEG化或以增加半衰期或整合。
[0099]dAb(结构域抗体）是抗体的小单体抗原结合片段（抗体重链或轻链的可变区。VH dAbs天然发生于骆驼科动物中（例如 骆驼和美洲驼）并能通过用靶抗原免疫骆驼类动物、 分离抗原特异性B细胞和直接从单个B细胞中克隆dAb基因的方式产生。本发明的IL-6a 可以是包含大体上本发明中VH或VL结构域的dAb，或包含大体上本发明中的一组⑶Rs的 VH或VL结构域。
[0100] 本发明的抗体包括双特异性抗体，该抗体的两个不同的结构域被组合到相同分子 中。可将IL-6a作为双特异性抗体的一部分渗入，所述抗体可使用本领域已知方法制备，例 如化学制备或从杂交瘤制备。该分子可以是前文已讨论过的类型的双特异性抗体片段。产 生双特异性抗体的方法的一个非限制性的例子是BiTETM技术，该技术中可使用具有不同 特异性的两个抗体的结合结构域并通过短的柔性肽直接连接。这将两抗体组合成一个短的 单肽链。可不使用Fc区而仅使用可变结构域来构建双抗体和scFv，这潜在地减轻了抗独特 型反应。双特异性抗体可构建为整个IgG、构建为双特异性Fab' 2、构建为Fab'PEG、构建 为双抗体或构建为其他双特异性scFv。此外，两种双特异性抗体可利用本领域中已知的常 规方法进行连接以形成四价抗体。
[0101] 双特异性双抗体，与双特异性完全抗体相对，是有用的，在某种程度上是因为它们 能够被构建并在大肠杆菌中并表达。可从文库中使用噬菌体展示（W0 1994/13804)容易地 选择出合适的结合特异性的双抗体（以及许多其他多肽，如抗体片段）。如果保持双抗体的 一个臂恒定，例如，直接针对IL-6的位点II的特异性，则可以产生其他臂可变的文库，从而 选择合适特异性的抗体。
[0102] 双特异性全抗体可通过其他描述于W0 1996/27011、W0 1998/50431和W0 2006/028936的改造工程化方法制备。
[0103] 在某些情况下，本发明的IL-6a在非抗体分子中包含抗原结合位点，例如，通过合 并一个或多个CDRs，如在非抗体蛋白骨架中的一组CDRs，将在下文中进一步讨论。在某些 情况下，CDRs被合并到非抗体的骨架中。可通过在非抗体蛋白骨架（如纤连蛋白或细胞 色素B)上排列CDRs来提供IL-6的位点II的结合位点，或通过随机或突变蛋白骨架内环 (loop)的氨基酸残基来赋予对IL-6的位点II的结合特异性。用于蛋白中工程化的新的 结合位点的骨架是现有技术已知的。例如用于抗体模拟物的蛋白骨架在W0200034784被 公开，其描述了包括具有至少一个随机化的环的纤连蛋白III型结构域的蛋白（抗体模拟 物）。任何免疫球蛋白超家族的结构域成员可提供适合于移植入一个或多个CDRs，如一组 HCDRs的骨架。骨架可以是人或非人蛋白。非抗体蛋白骨架的优势在于其可以在骨架分子 中提供抗原结合位点，所述骨架分子至少比一些抗体分子更小和/或更易制备。小尺寸的 结合成员可带来有用的生理特性，如进入细胞的能力、深度穿透组织或到达其他结构内的 靶位，或结合靶抗原蛋白穴的能力。典型的是具有稳定主链和一个或多个可变环的蛋白质， 在可变环中一个环或多个环的氨基酸序列被特别或随机突变以产生具有结合靶抗原特异 性的抗原结合位点。该蛋白包括来自金黄色葡萄球菌（S.aureus)蛋白质A的IgG结合结 构域、转铁蛋白、四连接素（tetranectin)、纤连蛋白（如第10纤连蛋白的III型结构域） 和脂笼蛋白（lipocalins)以及y-晶体和其他Affilin?骨架（ScilProteins，Halle， Germany)。其他方法的例子包括合成的微体，其基于环肽（cyclotides) -具有分子内二 硫键的小蛋白（如Versabodies?，AmunixInc.，MountainView，CA)和销蛋白重复蛋白 (DARPins，如来自MolecularPartnersAG，Zurich-Schlieren，Switzerland)。这些蛋白 也包括小的，改造的蛋白结构域，如，免疫结构域（参见例如，美国专利公开第2003/082630 和2003/157561号）。免疫结构域含有抗体的至少一个互补决定区（⑶R)。
[0104]IL_6a可包含额外的氨基酸，如赋予所述分子除结合抗原的能力以外的其他功能 特征的氨基酸。
[0105] 在一些情况下，IL_6a携带一个可检测的标记，或与毒素或靶向部分或酶缀合 (如，通过肽键或连接子）。例如，IL_6a可包含一催化位点（如在酶结构域中）和一抗原 结合位点（如针对IL-6的位点II的结合位点），这样，抗原结合位点与抗原结合并因此靶 向催化位点到IL-6或IL-6/IL-6R复合物。所述催化位点能够，在一些情况下，进一步抑制 IL-6的生物学功能，如通过切割IL-6、IL-6R，或其他与IL-6a/IL-6复合物有关的分子。
[0106] 在一些方面中，本发明包括与参考抗体相比已经被修饰的抗体IL_6a以改变，例 如增加、降低或消除IL-6a的生物学效应。在一个实施例中，Fc区被修饰或用修饰的Fc结 构域替换亲本Fc结构域以改变（与未修饰的亲本相比）修饰的IL_6a的药代动力学。在 一些实施方式中，IL-6a经改造以具有IgG2框架。在其他实施方式中，IgGl或IgG2框架中 的IL-6a具有修饰的Fc，与亲本或其他参考IL-6a相比，所述IL-6a在pH6. 0时增加了结 合亲和力而在PH7. 0时基本上不改变结合亲和力，或Fc结构域被修饰且与亲本或其他参考 IL_6a相比，修饰的IL_6a具有增加的半衰期。
[0107] 在一些实施方式中，抗体IL_6a被修饰以增加补体结合和补体依赖性细胞毒性。 在其他方面中，抗体IL_6a被修饰以增加（与参考抗体相比）抗体激活效应细胞和参与抗 体依赖的细胞毒性（ADCC)的能力。在一些情况下，本发明中所公开的抗体可以被修饰以增 强其激活效应细胞和参与抗体介导的细胞毒性（ADCC)的能力以及增加其补体结合和参与 补体依赖性细胞毒性（CDC)的能力。
[0108] 在一些实施方式中，本发明所公开的抗体被修饰以减小其固定补体和参与补体依 赖性细胞毒性（CDC)的能力。在另一个的实施方式中，抗体被修饰以减小其抗体激活效应 细胞和参与抗体依赖的细胞毒性（ADCC)的能力。在又一实施方式中，本发明所公开的抗体 可以被修饰以减小其激活效应细胞和参与抗体介导的细胞毒性（ADCC)的能力以及减小其 补体结合和参与补体依赖性细胞毒性（CDC)的能力。
[0109]避免频繁地递送IL-6a剂量通常是有利的，例如，当注射递送入眼睛时。为了促进 这一特征，在某些实施方式中，本发明所公开的IL_6a在递送位点如玻璃体的半衰期为至 少4天、例如至少7天、至少9天、至少11天或至少14天。在某些实施方式中，IL_6a的平均 半衰期为至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15 天、16天、17天、18天、19天、20天、25天、30天、40天、50天或60天。增加抗体半衰期的方 法是本领域中已知的，例如描述于美国专利第6, 277, 375号和国际公开第W0 1998/23289 号和第W0 1997/3461号。在一些实施方式中，IL-6a在靶向递送位点如玻璃体的半衰期大 于全身半衰期，如血液、血浆、淋巴、肝、肾或其他组织或体液中的半衰期）。
[0110] 在其他实施方式中，本发明提供了一种包括容器的制造品。所述容器包括含有本 发明所公开的IL_6a的组合物，以及指示该组合物可用于治疗IL-6相关病症的包装说明书 或标签。一般地，该组合物是包含IL-6a和药学上可接受的赋形剂的组合物。
[0111] 在一些情况下，本发明是含有包含本发明所公开的IL-6a的组合物以及指示施用 者向需要治疗的受试者施用所述组合物的说明的试剂盒。
[0112] 在需要大的IL_6a的实施方式中，例如增强IL_6a位于或在递送位点附近的保留， 增加大小但不显著地对IL-6a的功能（如对IL-6或IL-6/IL-6R复合物的结合亲和力）产 生不利影响的部分可与IL_6a联合。例如可基因工程化Fab以表达含Fab和Fc部分的单 个多肽。
[0113] 在需要相对小尺寸的IL_6a的实施方式中，可使用IL-6的抗体或片段，例如scFv 或Fab片段。IgG抗体的大小约为150kD，Fab约为50kD，而scFv约为25kD。在一些实施 方式中，本发明所描述的IL-6a的大小小于约50kD。这种拮抗剂可以是，例如，小于或等于 50kD并大于10kD、小于或等于50kD并大于20kD、小于或等于50kD并大于25kD。
[0114] 在一些情况下，通过制造变体来提高IL-6诘抗剂（如具有二硫键的抗体或其他抑 制剂）的稳定性，其中该变体的一个或多个二硫桥比亲本分子的更为稳定。
[0115] 本发明所描述的某些IL_6a分子的其他优势可以是有效的分子的可用性，所述有 效的分子具有合适的递送方式、递送位点或活性模式的大小。例如，Fab形式的IL_6a可用 于局部应用。改造该分子的方法在本发明中所描述并且是本领域已知的。
[0116] 适应症/IL-6相关疾病
[0117]可用本发明的IL_6a治疗的疾病包括这些疾病，在这些疾病中升高的IL-6与疾病 状态相关或作为疾病状态的先决条件。这样的疾病包括由IL-6驱动的导致血管发生和炎 症的疾病病理。这包括与正常水平相比升高的IL-6,例如玻璃体中IL-6升高的疾病（如糖 尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病和葡萄膜炎）或眼组织中IL-6升高的疾病。某些眼病 的例子包括但不限于干眼综合症、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性（AMD)、增生型糖尿病视 网膜病变（PDR)、糖尿病黄斑水肿（DME)、视网膜静脉阻塞（RV0)、视神经脊髓炎（NM0)。可 以治疗的其它眼疾病包括那些由外伤引起眼病，如角膜移植、角膜擦伤，或其他对眼睛造成 的该类物理伤害。因此，本发明包括使用本发明所描述的IL-6a治疗患有IL-6相关疾病的 受试者的方法。在一些实施方式中，受试者的治疗还包括确定受试者是否患有IL-6相关疾 病，和任选地，患者是否抵抗其他非IL-6抑制治疗，如类固醇或抗VEGF治疗。
[0118] 某些基于抗体治疗的一个问题在于抗体在特定位置如眼睛，例如在玻璃体中，是 有效的，但全身施用会导致副作用。一种解决方案是提供一种如本发明所述的分子为例 的治疗剂，相对于全身递送，该治疗剂可以局部递送。由于一些局部递送的（如递送到 玻璃体中）的治疗剂在一定程度上会出现全身递送，因此设计将具有相对快的全身清除 (systemicturnover)的分子是有利的。申请人已经设计了该分子的一个例子；一种被设 计为例如与亲本分子或参考抗体相比能快速全身清除的IL_6a抗体。这是通过修饰分子的 FcRn结合以减少FcRn介导的IL-6a的循环来实现的。这种设计（如减少FcRn循环）的进 一步的优点在于可以通过降低随着IVT施用抗体从玻璃体的流出提高其在玻璃体中的停 留。因此，在一些实施方式中，具有低FcRn结合的IL-6a能够降低给药频率。
[0119] 糖尿病黄斑水肿（DME)。糖尿病黄斑水肿（DME)参与视网膜血管的阻塞和渗漏，造 成视力下降和潜在的失明。对DME的标准治疗方法包括局部施用类固醇或抗VEGF抗体。然 而很多病人对这些疗法是难治的。糖尿病黄斑水肿的发病机理涉及血管发生、炎症和氧化 应激。IL-6由缺氧和高血糖诱导并能增加血管炎症、血管通透性和病理性血管发生。IL-6 可直接诱导VEGF的表达并能在动物模型中促进脉络膜血管新生。在DME患者中，眼睛的 IL-6水平与黄斑厚度和疾病的严重程度正相关。IL-6水平被报道在抗VEGF疗法失败的患 者中升高而在抗VEGF响应的患者中降低。因此，施用本发明所描述的IL-6a与抗VEGF治 疗剂组合来治疗糖尿病患者或作为抗VEGF治疗的替代（包括那些对抗VEGF治疗不响应的 患者）是有用的。用IL_6a治疗黄斑水肿还可通过去除完全抑制任何一种机制以抑制病症 的需求来提高其安全性，从而保留了各细胞因子的一些需要的生理作用。因此，局部IL_6a 治疗与VEGF抑制相组合能够降低给药频率并减轻治疗的副作用。
[0120] 在DME中，玻璃体IL-6水平与疾病严重程度和VEGF难治的受试者两者正相关。 因此本发明所记载的IL-6a可用于治疗对类固醇疗法、抗VEGF疗法或两者难治的DME受试 者。在一些情况下，IL-6a与抗VEGF疗法或类固醇疗法组合使用，如治疗DME。
[0121] 本发明所记载的IL_6a还可用于治疗病症例如癌症，如前列腺癌（prostate cancer)、白血病（leukemia)、多发性骨髓瘤（multiplemyeloma)，炎性病（如慢性炎 症增生疾病（chronicinflammatoryproliferativediseases))和自身免疫性疾 病（autoimmunedisease)，如类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis)、卡斯尔曼病 (Castleman'sdisease)(巨大或血管滤泡淋巴结增生（giantorangiofollicular lymphnodehyperplasia)、淋巴错构瘤（lymphoidhamartoma)，血管滤泡性淋巴结增生 (angiofollicularlymphnodehyperplasia))、幼年特发性关节炎（juvenileidiopathic arthritis)(包括多关节幼年特发性关节炎（polyarticularjuvenileidiopathic arthritis)和系统性幼年特发性关节炎（systemicjuvenileidiopathicarthritis))、 斯蒂尔病（Still'sdisease)(包括幼年特发性关节炎（juvenileidiopathic arthritis)和成年型斯蒂尔病（adultonsetStill'sdisease))、成年型斯蒂尔病（adult onsetStill'sdisease)、淀粉样蛋白A淀粉样变性病（amyloidAamyloidosis)、风 湿性多肌痛（polymyalgiarheumatica)、缓解性血清阴性对称性滑膜炎伴凹陷性水肿 (remittingseronegativesymmetricalsynovitiswithpittingedema)、脊椎关节炎 (spondyloarthritides)、白塞氏病（Behget'Sdisease)(包括治疗眼部表现（ocular manifestations)的治疗）、动脉粥样硬化（atherosclerosis)、银肩病（psoriasis)、系统 性红斑狼疮（systemiclupuserythematosis)、多发性肌炎（polymyositis)(炎症性肌病 inflammatorymyopathy)、复发性多软骨炎（relapsingpolychondritis)、获得性血友病 A(acquiredhemophiliaA)，多发性硬化症（multiplesclerosis)，炎症性贫血（anemia ofinflammation)，和克罗恩病（Crohn'sdisease)。
[0122] IL-6拮抗剂还可用于治疗某些神经疾病，例如抑郁症和阿尔茨海默氏病。
[0123] 可用本发明中所记载的IL_6a治疗其他疾病，包括但不限于全身性硬化症 (systemicsclerosis)、多发性大动脉炎（Takayasuarteritis)、巨细胞性动脉炎（giant cellarteritis)、移植物抗宿主病（graftversushostdisease)、与肿瘤坏死因子受体相 关周期性综合症（TNF-receptor-associatedperiodicsyndromeTRAPS) 〇
[0124] 剂量
[0125] 可将IL-6抗体或其片段施用给受试者（如患者），所述受试者表达，例如异常的 高水平的IL-6。抗体或其片段可一次施用，或可多次施用。可施用抗体，例如，从每天三次 到每六个月一次或更久。可以按计划施用如每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、 每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次和每六个月一 次。抗体或片段可经由迷你泵或其他途径如可植入的缓释胶裳或通过生产抗体或其片段的 细胞持续施用。抗体或其片段可经由粘膜、□腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌内、肠胃外、目艮 内或肿瘤内途径给药。抗体或其片段可施用一次、至少两次或在至少病症被治疗、减轻或治 愈的时间段内施用。一般将施用抗体或其片段，只要病症存在。抗体或其片段，一般将其作 为本发明所描述的药物组合物的一部分施用。抗体的剂量一般将在〇. 1到l〇〇mg/kg、0. 5到 50mg/kg，、1到20mg/kg和1到10mg/kg的范围内。可通过任何合适的方法测量抗体或其片 段的血清浓度。本发明所描述的某些化合物的一个特征在于它们需要相对不频繁的给药， 例如每周一次、每周两次、每周三次、每四周一次、每两周一次、每8周一次、每12周一次、每 16周一次、每32周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次。在一些 情况下，在需要的基础上，确定（例如通过受试者的状态）化合物的施用。本发明所描述的 允许相对不频繁给药的IL-6诘抗剂的一个特征在于将高效力（至少部分是通过一旦结合 到IL-6则具有慢解离速率实现的）和递送相对高浓度的化合物的能力相组合。
[0126] 在一些情况下，IL_6a作为单一疗法施用。在其他实施方式中，IL_6a与甲氨蝶呤 或其它疾病改善抗关节炎药物同时施用。
[0127] 抗体的产生
[0128] 可使用本领域已知方法如单克隆抗体方法学（如，参见Kohlerand Milstein(1975)Nature256:495)生产抗体IL-6a或其衍生物或片段。还可采用其他制造 单克隆抗体的技术如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。
[0129] 可基于使用本领域已知方法制备的小鼠单克隆抗体制备嵌合或人源化抗体。编码 重链和轻链免疫球蛋白的DNA可从感兴趣的小鼠杂交瘤中获得，以及所述DNA可使用标准 分子生物学技术改造以包含非小鼠（如人）的免疫球蛋白序列。例如，为了制备嵌合抗体， 可使用本领域已知技术（参见例如美国专利第4, 816, 567号）将小鼠可变区与人恒定区相 连接。为了制造人源化抗体，可使用本领域已知技术（参见例如美国专利第5, 225, 539号 和第5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762号；和第6, 180, 370号）将小鼠CDR区插入人框架。
[0130] 在实施方式中，本发明所描述的IL_6a(如抗IL-6抗体或其衍生物或片段）能够 特异地结合人IL-6。在实施方式中，IL-6a能够特异地结合IL-6的位点II(如人IL-6的 位点II)。
[0131] 在一些实施方式中，IL_6a抗体是人单克隆抗体。该抗体可使用包含部分人免 疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生。这些转基因和转染色体小鼠包括 本发明中分别称之为HuMAbMouse?和KMMouse?的小鼠，并在本发明中统称为"人 Ig小鼠"（参见美国专利号 5, 545, 806 ;5, 569, 825 ;5, 625, 126 ;5, 633, 425 ;5, 789, 650 ; 5, 877, 397 ;5, 661，016 ;5, 814, 318 ;5, 874, 299 和 5, 770, 429 号；美国专利号 5, 545, 807 ; PCT公开号WO92/03918，W0 93/12227，W0 94/25585，W0 97/13852，W0 98/24884 和W0 99/45962 ;和PCT公开号WO01/14424 号）。
[0132] 在其他方面中，可使用在转基因或转染色体中携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如 携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来生产人抗IL-6抗体。这类小鼠在PCT公开 号W0 02/43478中详细描述。
[0133] 其他表达人免疫球蛋白基因的转基因动物系统是本领域可获得的，且能被用于生 产抗体IL_6a。例如可使用称作Xenomouse?(Abgenix，Inc.)的备选转基因系统；此类小 鼠被描述于例如美国专利号 5, 939, 598 ;6, 075, 181 ;6, 114, 598 ;6, 150, 584 ;和 6, 162, 963 中。此外，表达人免疫球蛋白基因的转染色体动物系统是本领域可获得的，并可用于生产抗 体IL-6a。例如携带人重链转染色体和人轻链转染色体两者的小鼠被描述于Tomizuka等 中（2000，ProcNatlAcadSciUSA97 :722-727)。还可以使用SCID小鼠制备人单克隆抗 体，其中在该小鼠中重建了人免疫细胞从而可以通过免疫接种来产生人抗体应答。此类小 鼠被描述于例如美国专利号5, 476, 996和5, 698, 767中。
[0134] 噬菌体展示文库
[0135] 在一些情况下，抗体IL_6a抗体或其衍生物或片段是在使用噬菌体合成人抗体文 库、用IL_6(例如人IL-6)或其片段筛选所述文库、分离结合IL-6的噬菌体以及从所述噬 菌体获得抗体的方法中产生的。
[0136] 还可以通过筛选重组组合抗体文库来分离重组人抗体IL_6a。一般来说，所述文 库是scFv噬菌体文库，该文库是用人VL和VHcDNAs(从分离自B细胞的mRNA中制备）产 生的。制备和筛选这类文库是本领域已知的。用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是商业上 可获得的（如Pharmacia公司的重组菌体抗体系统，目录号27-9400-01 ;和Stratagene SurfZApTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。其他可用于生产和筛选抗体噬菌体文库的 方法和试剂是本领域已知的（参见，例如美国专利号5, 223, 409 ;PCT公开号W0 92/18619、 TO91/17271、TO92/20791、TO92/15679、TO93/01288、TO92/01047、TO92/09690; Fuchs等，Bio/Technology9:1370-1372(1991);Hay等，HumAntibodHybridomas3: 81-85(1992);Huse等，Science246:1275-1281 (1989);McCaffert等，Nature348: 552-554(1990);Griffiths等，EMB0J12 :725-734(1993);Hawkinsetal.，JMolBiol 226 :889-896 (1992);Clackson等，Nature352 :624-628 (1991);Gram等，ProcNatl AcadSciUSA89:3576-3580(1992);Garrad等，Bio/Technology9:1373-1377(1991); Hoogenboom等，NucAcidRes19:4133-4137(1991);和Barbas等，ProcNatlAcadSci USA88 :7978-7982(1991)，作为参考全部并入本文。
[0137] 在一个分离和生产具有所需要特征的IL-6抗体的例子中，首先用人IL-6抗体， 使用表位印迹法来选择相似IL-6结合能力的重链和轻链序列，所述方法描述于PCT公开 号TO93/06213中，作为参考并入本文。这一方法中所使用的抗体文库一般为scFv文 库，该文库的制备和筛选描述于PCT公开号W0 92/01047 ;McCafferty等，Nature348 : 552-554(1990);andGriffiths等，EMBOJ12:725-734(1993)，作为参考全部并入本文。
[0138] 一旦选择了初始人VL和VH结构域，就进行"混合并匹配"实验，在该实验中筛选 不同对的初始选择的VL和VH片段的IL-6结合能力以选择优选的VL/VH对组合物。为了 选择IL-6a所需要的特征，可随机突变所选对的VL和/或VH片段。这种体外亲和成熟例 如可通过使用与所选择的VH和VL结构域的一个或两者的CDR互补的PCR引物扩增VH和 VL结构域的方式实现，其中所述引物包含在某些位点的四个核苷酸碱基的随机组合，从而 所产生的PCR产物编码引入了随机突变的VH和/或VL的片 段。这类随机突变的VH和VL 片段可被用来筛选IL-6的结合片段，例如IL-6的位点II的结合片段。
[0139] 在从重组的免疫球蛋白展示文库中筛选和分离抗体IL_6a后，可从展示包装 (display package)(例如从菌体基因组）回收编码选择的抗体的核酸，并通过本领域已 知的重组DNA技术将其亚克隆入其他表达载体。可对这类抗体进一步操作以产生抗体片 段，如那些在本发明中记载的抗体片段。
[0M0] 药代动力学（PK)
[0141] 可使用本领域已知方法进行PK测试。需要使用动物进行测定例如测定PK的一个 障碍在于人类的IL-6与那些通常用于此类测试的一些动物的IL-6具有小于50%的同源 性。因此测试PK的一种方法是使用表达人IL-6的转基因小鼠。在一些实施方式中，使用 非人灵长类动物来测定PK。
[0142] 在一些实施方式中，抗IL-6抗体是突变的以改变其PK，例如通过改变FcRn结合的 pH敏感性而改变其PK。获得这类突变的方法记载于实施例中。因此，在一些实施方式中， 与亲本IL_6a或参考分子相比，所述IL_6a具有改变的全身PK(systemicPK)。在一些情况 下，PK在玻璃体中是不改变的或是改善的。在一些实施方式中，与亲本IL-6a或参考分子 相比，IL-6a在玻璃体中具有相同或增加的PK(如增加的半衰期）以及减少的全身PK(例 如在循环液如血液、血浆、淋巴液、血清、肝脏、肾脏、其它组织或其他体液中测定的）。
[0143] 用于测试IL-6拮抗剂的模型
[0144] 可在疾病模型中测试IL-6拮抗剂的IL-6相关递送，特别是测试治疗效果和有 限的针对IL-6有利特性的副作用。例如可以在大鼠或小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎 模型中，使用在完全弗氏佐剂（CFA)中的感光细胞间受体视黄醇类结合蛋白（IRBP)免疫 接种来测试葡萄膜炎（Caspi，InvestOphthalmolVisSci52:1873;Agarwal等，900: 443-69, 2012)。其他模型包括那些本领域中已知的树突状细胞诱导的葡萄膜炎、培养的 效应T细胞的过继转移、在IRBPTcRTg小鼠中的自发EAU、内毒素诱导的葡萄膜炎、自 身免疫性葡萄膜视网膜炎（Haruta等，InvestOphthalmolVisSci53:3264(2011); Yoshimura等，Rheumatology48:347-354(2009))。其他能够用于测定IL_6a疾病效果 的模型系统有例如，脉络膜新生血管（CNV)模型（Izumi-Nagai等，AmJPathol170: 6(2007);Krzystolik等，ArchOphthalmol120:338(2002))和糖尿病模型如那些描述于 Kern等（AnimalModelsOfDiabeticComplicationsConsortium(P01DK57733)，Update Report(September2001-January2004)的模型。用于测试IL_6a在类风湿关节炎中的 动物模型是本领域已知的，例如参见Asquith等（EurJImmunol39 :2040_4(2009))and Kollias等（AnnRheumDis70:1357-62(2011)。
[0145] 联合疗法
[0146] 在一些实施方式中，将IL_6a与第二治疗性实体（therapeuticentity)组合施 用。例如在包括VEGF抑制剂如ranidizumab的治疗方案中施用IL-6a。在一些实施方式 中，在包括TOGF抑制剂的治疗方案中施用IL-6a，其中所述TOGF抑制剂如抗TOGF抗体或抗 H)GF受体抗体（如伊马替尼）。
[0147]IL-6拮抗剂的递送
[0148]IL-6拮抗剂可局部递送，直接接触或邻近进行IL-6抑制的靶细胞或组织。这种递 送方法的非限制性的实例包括注射、输液或植入含有IL-6拮抗剂的物质。
[0149] 在一些实施方式中，IL_6a组合物作为眼用制剂施用。该方法可包括施用IL_6a组 合物和眼可接受的载体。在某些实施方式中，眼用制剂是液体、半固体、插入物（insert)、 膜、微粒或纳米颗粒。
[0150] 在一些实施方式中，IL_6a组合物被配制用于局部给药，如眼睛给药。所述局部制 剂可以是液体制剂或半固体，例如，局部制剂可以包括水溶液、水性悬浮液、软膏或凝胶。眼 用的IL_6a的制剂可以局部施用于眼睛的前部、上眼睑下，下眼睑上和在cul-de-sac内。 一般地，眼用制剂是无菌的。IL_6a眼用制剂可含有适于眼用制剂的制备的一种或多种药 物赋形剂。这些赋形剂的例子为防腐剂、缓冲剂、螯合剂、抗氧化剂和用于调节渗透压的盐。 包括软膏剂和悬浮液的眼用制剂一般具有适合于所选的施用路径的粘度。在一些实施方式 中，眼用制剂具有从约1，〇〇〇至约30, 000厘泊的粘度。
[0151] 在一些实施方式中，所述制剂是一种包含聚合物的液体制剂。这类聚合物可用于 改善的生物利用度、提高粘度或降低液体制剂从眼睛中排出。合适的聚合物包括但不限于， 在Wagh等人（AsianJPharm，2:12-17,2008)描述的那些聚合物。在非限制性的例子中， 聚合物是透明质酸酶的钠盐、壳多糖、环糊精（如羟丙基0环糊精）、聚半乳糖醛酸、木葡 聚糖、黄原胶、结冷胶、硫醇化聚合物、聚（原酸醋）（如Einmahl，AdvDrugDelivRev53 : 45_73,2001)或罗望子种子多糖（如，Ghelardi等，AntimicrobAgentsChemother48 : 3396-3401，2004)。
[0152] 在一些实施方式中，包含用于眼部递送的IL_6a制剂可含有一种或多种的表面活 性剂、辅助剂，佐剂、抗氧化剂、张力调节剂、防腐剂（如EDTA、BAK(苯扎氯铵）、亚氯酸钠、 过硼酸钠、聚季按盐-1 (P〇lyquaterium-l))、增稠剂或粘度调节剂（如羧甲基纤维素、轻甲 基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、乙二醇400、丙二醇羟甲基纤维素、羟丙基瓜耳豆胶、透明质 酸和羟丙基纤维素）等。制剂中的添加剂可以包括，但不限于，氯化钠、碳酸氢钠、山梨酸、 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定（chlorhexidine)、蓖麻油和过硼酸钠。
[0153] 在一些实施方式中，纯水或去离子水可用于组合物中。可通过添加任何生理和眼 用可接受的pH调节的酸、碱或缓冲剂将pH调节至约5. 0至8. 5的范围内，如pH7. 0、pH7. 3、 pH7. 4或pH7. 5。眼用可接受的酸的例子包括乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、盐酸等，碱的 例子包括氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠、氨基丁三醇、三羟基甲基氨 基甲烷等。可用于制剂的盐和缓冲液的例子包括柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠、氯化铵以及 上述酸和碱的混合物。
[0154] 在一些实施方式中，眼用组合物的渗透压可以为约10毫渗透摩尔 (milliosmolar) (mOsM)至约 400m0sM，例如 200 至 400m0sM或 220 至 370m0sM。通常，可 以用生理上和眼科可接受的盐或赋形剂来调节渗透压。在一些实施方式中，制剂中包括氯 化钠，例如，氯化钠存在于制剂中的浓度按重量计为0. 01 %至1 %或按重量计为0. 05%至 0. 45%，基于组合物的总重量。还可使用由一种或多种等量的由阳离子（如钾，铵等）和阴 离子（如氯离子，柠檬酸根，抗坏血酸根，硼酸根，磷酸根，碳酸氢根，硫酸根，硫代硫酸根， 硫酸氢盐，硫酸氢钠，硫酸铵等）组成的盐与氯化钠一同或替代氯化钠以实现在需要的范 围内的渗透压。在一些实施方式中，还可使用糖，如甘露糖醇，右旋糖，山梨糖醇，葡萄糖等， 来调节渗透压。
[0155]在一些实施方式中，所述方法包括形成或提供与眼外表面接触的药剂的储库(depotoftheagent)。储库指的是试剂的供给源，所述储库不会被泪液或其他眼部清除 机制除去。这允许通过单次应用，连续、持续高浓度的药剂存在于眼睛外表面的流体中。在 一些实施方式中，储库可以保持多达八个小时以上。在一些实施方式中，眼储库制剂包括但 不限于，聚合物水性悬浮液、软膏和固体插入物（solidinserts)。
[0156]在一些实施方式中，半固体组合物是一种施用到眼时增加粘度的液体制剂，所述 粘度通常是由于液体制剂中存在聚合物，随着温度、pH或电解质浓度的变化粘度有所增加。 聚合物可以是例如，乙酰基邻苯二甲酸纤维素（celluloseacetophthalate)、聚丙稀酸，结 冷胶，透明质酸酶，壳多糖，藻酸盐（如藻酸钠）或环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物（如， 普鲁兰尼克?,BASF;泊洛沙姆）。在一些实施方式中，聚丙烯酸是交联的丙烯酸（如， 卡波姆? )。在一些实施方式中，半固体组合物含有卡波姆以及环氧乙烷和环氧丙烷的嵌 段共聚物的混合物；甲基纤维素和羟乙基纤维素的混合物；或聚乙二醇以及环氧乙烷和环 氧丙烷的嵌段共聚物的混合物。
[0157]在一些实施方式中，包含IL_6a的眼用制剂是软膏或凝胶。在一些实施方式中，眼 用制剂是油基递送载体。例如，制剂可包含加入IL_6a组合物（如在0.1 %至2%)的石油 或羊毛脂基载体和赋形剂。常见的基质（base)包括但不限于矿物油、矿脂及其组合。在一 些实施方式中，软膏作为条带（ribbon)施用至下眼睑。
[0158]在一些实施方式中，眼用组合物是眼用插入物（insert)。例如所述眼用插入 物是生物学惰性的、柔软的、生物可腐蚀的、粘弹性的（viscoelastic)、暴露于治疗剂后 稳定灭菌的、对空气传播细菌感染抗性的、生物可腐蚀的、生物相容的和/或粘弹性的 (viscoelastic)。在一些实施方式中，插入物包含眼用可接受的基质，例如，聚合物基质。所 述基质一般是一种聚合物，且IL_6a组合物分散在基质内或结合到聚合物基质。在一些实 施方式中，药剂从基质通过溶解或水解共价键而缓慢释放。在一些实施方式中，聚合物是生 物可腐蚀（溶解）的，且其溶解速度可控制分散在聚合物基质中药剂的释放速度。在另一 种形式中，聚合物基质是可生物降解的聚合物，该聚合物例如通过水解而分解，从而释放出 与其结合或分散在其中的药剂。在进一步的实施方式中，可用另外的聚合物包衣包围基质 和药剂以进一步控制释放。在一些实施方式中，插入物包含可生物降解的聚合物，如聚己内 酯（PCL)、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物（EVA)、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨酯、尼龙或聚DL-丙 交酯-共-乙交酯）（PLGA)或任意这些的共聚物。在一些情况下，药剂被分散到基质材料 或分散在单体组合物中，所述单体组合物用于在聚合前制造基质材料。在一些实施方式中， 药剂的量为约〇. 1至约50%或从约2至约20%。可使用可生物可降解的或生物可腐蚀的 聚合物基质，从而不必从眼睛中移除过的插入物。随着生物可降解或生物可腐蚀聚合物的 降解或溶解，所述药剂得以释放。
[0159] 在进一步的实施方式中，眼用插入物包含一种聚合物，包括但不限于，那些在 ffagh,等，"Polymersusedinoculardosageformanddrugdeliverysystems"， AsianJ.Pharm.，pages12-17(January2008)中记载的聚合物，通过全文引用并入本文。 在一些实施方式中，插入物包含聚合物，所述聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、丙烯酸酯 或甲基丙烯酸酯聚合物或共聚物（如，来自Rohm或Degussa盼EUDRAGIT?:聚合物家 族）、羟甲基纤维素、聚丙烯酸、聚（酰氨基胺）树枝状聚合物、聚（二甲基硅氧烷）、聚环氧 乙烷、聚（丙交酯共乙交酯）、聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）、聚乙烯基醇）或聚（丙烯富马 酸酯）。在一些实施方式中，插入物是450kDa的半胱氨酸-聚丙烯酸缀合物。
[0160] 插入物可包括含有IL_6a组合物的芯（core)和外套管（如描述于美国专利公开 第20040009222号中）。在一些情况下，外管对药物可以是渗透性的，半渗透性的或不渗透 的。在一些实施方式中，芯包括对IL-6a组合物的释放速度不产生显著影响的聚合物基质。 在一些情况下，外套管、芯的聚合物基质或两者是生物可腐蚀的。共挤出产品（co-extruded product)可分割为（segmentedinto)药物递送装置。在一些实施方式中，所述装置是未包 被的以使各自的端部是开放的，或所述装置用例如膜（layer)包被，所述膜对IL_6a组合物 是可渗透的、对IL_6a组合物是半渗透的或生物可腐蚀的。在某些实施方式中，IL_6a组合 物和至少一种聚合物以粉末形式混合。
[0161] 在一些实施方式中，眼用组合物是眼用膜。适合于此类膜的聚合物包括但不限 于那些描述于Wagh等（同前）的聚合物。在一些实施方式中，所述膜是软性隐形眼镜 (soft-contractlens)，例如由N，N-二乙基丙稀酰胺和与乙二醇二甲基交联的甲基丙稀酸 的共聚物组成的眼镜。
[0162] 在某些实施方式中，IL_6a位于管状的插入物中，且可以是分割的（segmented)。
[0163] 在一些实施方式中，IL_6a组合物被配制为治疗有效量，由聚合物基质包被的或 分在聚合物基质中，使得IL_6a组合物为粒状或颗粒形式。在一些实施方式中，当颗粒中 的药物溶解到或在基质中，沿基质扩散，并被释放到周围生理性液体中时，IL_6a组合物 从配置物中释放出来。在一些实施方式中，释放速率主要受IL_6a组合物从颗粒/微粒 溶解到基质中的速率的限制；沿基质扩散和分散到周围液体中的步骤不是主要的释放速 率限制因素。在某些实施方式中，聚合物基质是非生物可腐蚀的，而在其他实施方式中其 是可生物腐蚀的。示例性的可形成非生物可腐蚀聚合物基质可以是聚氨酯、聚硅氧烷、 聚（乙烯-共-乙酸乙烯酯）（EVA)、聚乙烯醇及其衍生物和共聚物。示例性的可形成非 生物可腐蚀聚合物基质可以是聚酐、聚乳酸、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯 (polyalkylcyanoacrylate)及其衍生物和共聚物。
[0164] 在一些情况下，在胶原材料中配制IL_6a组合物。例如，插入物可以是可溶性 眼用药物插入物（如能够被引入到上结膜囊用以药物递送的椭圆形聚合物薄膜；椭圆的 插入物如由乙烯醋酸乙烯酯制成的OCUSERT?(毛果芸香碱眼部治疗系统，由Alza Corporation开发）；Lacrisert?，由纤维素制成的杆状插入物；新型眼科药物输送系统 (NODS)，由聚（乙稀醇）制成；或那些描述于Fabrizio(AdvDrugDelivRev16:95-106， 1998)中的插入物。在一些情况下，插入物包含胶原、明胶或聚合物，其中所述聚合物选自聚 己内酯（PCL)、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物（EVA)、氰基丙烯酸酯、聚氨酯、尼龙、聚（DL-丙交 酯-共-乙交酯（PLGA)或任何这些的共聚物。在一些情况下，在上眼睑下植入插入物。在 一些情况下，插入物被植入到在眼睛的后段、脉络膜空间或巩膜内。在一些实施方式中，在 玻璃体内或视网膜下植入插入物。
[0165] 在一些实施方式中，视网膜下注射插入物。施用的方法和插入物的制备技术阐述 于Remington's：ThePracticeofScienceofPharmacy,20thedition(Lippincott Williams&Wilkins，2006)中，通过引用将其全部并入本发明。
[0166] 在其他实施方式中，包含的IL_6a组合物的插入物提供了药剂到眼睛玻璃体的 持续释放。如本发明所用，"持续释放"是指组合物以受控的方式在延长的时间内释放药 剂。在一些实施方式中，插入物以一种的速率释放药剂，使得在药剂的释放过程中，水中 (aqueousagent)的药剂的浓度持续低于玻璃体中药剂的浓度。在一些实施方式中，水中 (aqueousagent)的药剂的浓度为从约 0? 002yg/mL到约 0? 01yg/mL或从约 0? 01yg/mL， 到约0. 05yg/mL或到低于约0. 05yg/mL。在一些实施方式中，以约1yg/天到约50yg/ 天，或从1yg/天到约10yg/天的速率释放药剂。在一些实施方式中，插入物还包含如上 文详述的额外的治疗剂，例如氟轻松（如存在于眼部插入物Retisert?中）。
[0167] 在一些实施方式中，眼用组合物包含微球或纳米颗粒。在一些实施方式中，所述微 球包含明胶。在一些实施方式中，微球被注射到眼睛的后段、脉络膜空间或巩膜内。在一些 实施方式中，微球或纳米颗粒包含聚合物，包括但不限于那些在Wagh，等（AsianJPharm 2:12-17,2008)中描述的聚合物。在一些实施方式中，聚合物是壳多糖、聚羧酸，如聚丙烯 酸、白蛋白颗粒、透明质酸酯、聚衣康酸、聚（丁基）氰基丙烯酸酯、聚己内酯、聚（异丁基） 己内酯、聚（乳酸_共-乙醇酸）或聚（乳酸）。在一些实施方式中，微球或纳米颗粒包含 固体脂质颗粒。
[0168] 在一些实施方式中，IL_6a组合物包含离子交换树脂。在一些实施方式中，离子交 换树脂是无机沸石树脂或合成的有机树脂。在一些实施方式中，离子交换树脂包括但不限 于Wagh等中描述的树脂（同上），通过引用将其全部并入本发明。在一些实施方式中，离子 交换树脂为部分中和的聚丙烯酸。
[0169] 可以在水性聚合物悬液中提供IL_6a组合物。在一些实施方式中，IL_6a组合物或 聚合物悬液悬浮于水性介质（如具有前文所述特性的水性水性介质）中。聚合悬浮试剂的 例子包括，但不限于，葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝胶、介尔雷特?、纤维素 聚合物如羟丙基甲基纤维素和含羧基的聚合物，如丙烯酸的聚合物或共聚物，以及其它聚 合物缓和剂（polymericdemulcents)。在一些实施方式中，该聚合物缓和剂是水可溶胀的、 水不溶性聚合物，特别是交联的含羧基的聚合物。在一些实施方式中，以所存在的单体的总 重量为基准计，该聚合物悬浮剂包含至少约90重量％到约99. 9 %，或约95 %到约99. 9 %的 一种或多种含羧基的单烯属不饱和单体。在一些实施方式中，该含羧基的单烯属不饱和单 体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸、甲基丙烯酸（巴豆酸）、顺式-a-甲基巴豆酸（当 归酸）、反式_a-甲基巴豆酸（a-甲基巴豆酸）、a- 丁基巴豆酸、a-苯基丙烯酸、a-苄 基丙烯酸、a-环己基丙烯酸、苯基丙烯酸（肉桂酸）、香豆酸（邻羟基肉桂酸）以及伞形酸 (对羟基香豆酸）。在一些实施方案中，该聚合物是通过多官能团交联剂（如，双官能的交 联剂）来交联。在一些实施方式中，以所存在的单体的总重量为基准计，该交联剂的含量为 约0. 01%到约5%，或约0. 1%到约5. 0%，或约0. 2%到约1%。在一些实施方式中，该交 联剂是非聚烯基聚醚双官能交联用单体，例如二乙烯基乙二醇、2, 3-二羟基己-1，5二烯、 2, 5-二甲基-1，5-己二烯、二乙烯基苯、N，N-二烯丙基丙烯酰胺、N，N-二烯丙基甲基丙烯 酰胺；每一分子含有两个或更多个烯基醚基团的聚烯基聚醚交联剂，如含有末端H2C=C基 团的烯基醚基团，通过用卤代烯烃如烯丙基溴等将含有至少四个碳原子和至少三个羟基的 多元醇醚化来制备，如聚烯丙基蔗糖，聚烯丙基季戊四醇等；分子量约400到约8000的二烯 属非亲水性大分子交联剂，，例如二醇和多元醇的不溶性二丙烯酸酯和多丙烯酸酯和甲基 丙烯酸酯，由聚酯二醇、聚醚二醇或聚硅氧烷二醇与甲基丙烯酸羟烷基酯衍生的异氰酸酯 终端的预聚物的二异氰酸酯丙烯酸或甲基丙烯酸羟烷基酯反应产物等
[0170] 在一些实施方式中，交联聚合物可由作为唯一存在的单烯属不饱和单体的一种或 多种含羧基的单烯属不饱和单体与一种或多种交联剂制备。在一些实施方式中，聚合物是 其中至多约40%，优选约0%到约20%的一种或多种含羧基的单烯属不饱和单体被一种或 多种不含羧基、仅含生理上和眼科学无害的取代基的单烯属不饱和单体替代的聚合物，所 述单体包括丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，例如甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙 烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯，丙烯酸3-羟丙酯等，乙酸乙烯 酯，N-乙烯基吡咯烷酮等（如Mueller等，美国专利第4, 548, 990号）。在一些实施方式中， 聚合物包括聚卡波非（NoveonAA-l)、Carb〇p〇l?*DuraSite⑧。在一些实施方式中，该 交联聚合物通过使用常规自由基聚合催化剂将单体悬浮或乳液聚合至当量球径不超过约 50ym的干燥粒度来制备。在一些实施方式中，该平均干燥粒度为当量球径约1到约30ym， 或约3约20ym。在一些实施方式中，聚合物颗粒通过将较大的聚合物颗粒机械研磨来获 得。在其他实施方式中，此类聚合物具有约250, 000到约4, 000, 000,以及3, 000, 000, 000到 4, 000, 000, 000的分子量。在其他实施方式中，交联聚合物的颗粒是单分散的，是指它们所 具有的粒度分布应使得至少约80%、约90%或约95%的颗粒落入主粒度分布的ym带内。 在其他实施方式中，单分散粒度是指不超过约20 %，约10 %，或约5 %颗粒的粒度在1ym 以下。在一些实施方式中，聚合物水性悬浮液包括约0. 05到约1%、约0. 1到约0. 5%、或 约0. 1到约0. 5%的治疗剂和约0. 1到约10%、约0. 5到约6. 5%、约0. 5到约2. 0%、约 0. 5%到约1. 2%、约0. 6到约0. 9%、或约0. 6到约0. 8%的聚合物悬浮剂。虽然提到的是 单种，但应该理解，在总量处于规定范围的情况下，可以使用一种或多种聚合物悬浮剂。在 一个实施方式中，不溶性的轻度交联的聚合物颗粒的量、pH和渗透压能够彼此相关，并且 与交联度相关，以提供具有约500到约100, 000厘泊，优选约1，000到约30, 000厘泊或约 1，000到约10, 000厘泊的粘度的组合物，所述粘度使用装有25号芯轴和13R小样品接头的 Brookfield数字LVT粘度计在12rpm和室温（约25°C)下测定。在一些实施方案中，该粘 度为约10到约400厘泊，约10到约200厘泊或约10到约25厘泊。
[0171] 在一些实施方式中，可以配制聚合物水性悬浮液，使得它们在眼中保持与给药于 眼睛之前的粘度相同或基本上相同的粘度。在一些实施方式中，可以配制它们，使得其在 与泪液接触时凝胶化增强。例如，当pH低于约6. 7的含有DumSite?」或其他类似聚丙烯 酸类聚合物的制剂给药于眼睛时，该聚合物在与泪液接触时可能溶胀，因为它具有较高的pH(大约7)。该凝胶化或凝胶化的增强可能导致悬浮颗粒的夹带，从而延长了组合物在眼 睛中的停留时间。在一些实施方式中，随着悬浮颗粒经时溶解，该治疗剂慢慢地释放。在一 些实施方式中，该输送途径增加了患者舒适感，增加了治疗剂与眼组织的接触时间，从而增 加了药物吸收的程度和制剂在眼睛中的作用持续时间。在这些药物输送系统中含有的治疗 剂可以取决于诸如药物本身及其外形、药物加载的程度和系统的pH以及还可能存在的任 何药物输送助剂如与眼表相容的离子交换树脂之类的因素的速率从凝胶中释放。
[0172] 在一些实施方式中，使用基因递送，如局部遗传递送，将IL-6拮抗剂提供给受 试者。这种递送可通过瞬时表达系统递送，一种稳定的（如整合的）表达系统（如由 BluebirdBio(Cambridge，MA)生产的慢病毒递送系统），或在细胞工厂中递送，如那些由 Neurotech(Cumberland，RhodeIsland)所生产的细胞工厂。
[0173] 所有技术特征可以这些特征的所有可能的组合方式单独地组合。
[0174] 等同方案
[0175] 本发明可用其他不违背其精神或主要特征的其他具体形式来体现。前述实施方式 因此在所有方面被认为是说明性的而非对本发明所述发明的限制。 实施例
[0176] 下列非限制性实施例进一步说明了本发明所述的本发明的实施方式。
[0177] 实施例1:在脉络膜新生血管（CNV)模型中验证局部IL-6的阻断
[0178] 为了确定局部IL-6阻断是否能够有效治疗眼睛疾病，例如糖尿病性黄斑水肿 (DME)或湿性AMD，抗IL-6抗体被局部施用到脉络膜新生血管模型系统中。激光诱导的CNV 模型（eyecro.com/in-vivo/laser-induced-choroidal-neovascularization-cnv/)再现 许多DME下的病理过程，包括炎症和血管发生。EyeCR0(0klahomaCity，0K)在大鼠中进行 了研宄。在第〇天时，每组中的6只动物进行双侧激光处理以产生每只眼睛3处损伤。在 第3天和第10天时，将3yg多克隆抗大鼠IL-6抗体（R&DSystemsAF506 ;Minneapolis， MN)玻璃体（IVT)注射到实验组中，而将PBS或抗VEGF多克隆抗体（R&DSystemsAF564) 分别施用到载体和阳性对照组。在第15和22天体内造影以测量病变区域。在第15天和第 22天抗IL-6治疗组相对于载体对照显著地降低血管发生。抗IL-6治疗组和抗VEGF阳性 对照之间在应答上（response)没有显著差异。图1示出了该实验的结果。这些数据表明， IVT施用IL-6a，例如抗IL6抗体，可以在CNV大鼠模型中降低血管发生到与抗VEGF阳性对 照相似的水平（抗IL-6对载体对照，在第15天p= 0. 0054和在第22天p= 0. 0005)。
[0179] 这些数据表明，局部阻断IL-6对治疗眼病，例如涉及血管渗漏的眼病，如黄斑水 肿是有用的。
[0180] 实施例2 :候选抗体IL-6拮抗剂
[0181] 使用首先涉及免疫接种的流程开发候选抗体IL-6拮抗剂。免疫接种在发明人的 指示下由合同研宄组织（CR0)实施。向5只BALB/C小鼠皮下注射含80yg人IL-6(R&D Systems，cat#206-IL/CF，Minneapolis，MN)，1MNaCl和弗氏佐剂的PBS。用 80yg和 50yg的IL-6进行两次加强免疫。从最高滴度的小鼠中收集脾细胞并与P3x763Ag8. 653骨髓瘤 细胞融合以形成杂交瘤。
[0182] 对杂交瘤上清液筛选IL-6结合和拮抗性。对于结合ELISA，用含1yg/mL人IL-6 的PBS包被Costar9018板，4°C过夜。用含有2 %BSA的PBS封闭孔，洗涤，然后与50yL每 种杂交瘤上清液孵育，所述杂交瘤上清液用含2%BSA的PBS以1 : 2稀释。60分钟后，将 孔用含〇. 1 %Tween-20的300y1PBS洗涤三次。然后每孔加入于PBS-BSA中以1 : 3000 稀释的抗小鼠HRP，并孵育30分钟。板孔作如上的洗涤，然后加入3,3'，5,5'-四甲基联 苯胺（TMB)底物，并在450和550nm处测量信号。对于拮抗研宄，HEK-BlueTM-IL6报告细胞 (InvivoGen，SanDiego,CA)在1 :10稀释的杂交瘤上清液的存在下与浓度递增的人IL-6 孵育。20-24 小时后，20y1 上清液与 180y1QuantiBlue?(InvivoGen)混合，并在 655nm 处测量吸光度。
[0183] 基于结合和拮抗研宄，由申请人筛选出作为前导（lead)的杂交瘤64并在CR0 亚克隆。进一步用酶联免疫吸附实验（ELISA)测试杂交瘤64(小鼠单克隆）抑制IL-6/ IL-6Ra复合物结合到gP130的能力。通过ELISA，1. 5yg/ml浓度的杂交瘤64显著地减弱 了IL-6/IL-6Ra复合物结合到固定化的gP130(图2)。
[0184] 再筛选所述亚克隆并用5'RACEPCR扩增亚克隆64. 58的可变结构域并测序。小 鼠可变结构域的序列（称为m64)如下：
[0185]m64VH(可变重链）
[0186]QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVITPGSGTINYNEKFKGKAV LTADKSSSTVYMQLSSLTSDDSAVYFCAKSRWDPLYYYALEYWGQGTSVTVSS(SEQIDNO：13)
[0187]m64VL(可变轻链）
[0188]DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGS GSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPLTFGAGTKLELK(SEQIDNO：14)
[0189] 为了创建人源化序列，m64的互补决定区（CDR)被移植到通过计算算法选择的与 小鼠序列相似的人种系框架（germlineframework)中。人源化序列（称为h64)如下（与 m64序列相比改变的残基用下划线标示）且与小鼠序列具有约79. 5%的同一性（VH)和 84.4%的同一性以1):
[0190]h64VH
[0191]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEffVRQAPGQGLEffMGVITPGSGTINYAQKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSS(SEQIDNO：15)
[0192]h64VL
[0193]DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGISFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPDRFSGS GSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPLTFGQGTKLEIK(SEQIDNO: 16)
[0194] 用DNA2.0(MenloPark，CA)合成人源化序列，然后将其与人IgGl恒定结构域融合 一并克隆入pcDNA3. 1来源的表达载体。通过瞬时转染Freestyle?-293细胞（Invitrogen， GrandIsland，NY)表达，并通过蛋白A层析纯化IgG。在结合和诘抗研宄中，与其m64祖先 (predecessor)相比，h64IgG表现出相当大的效力降低。因此利用酵母展示来恢复丧失的 亲和力。
[0195] 为了实施目的为恢复或提高人源化h64IgG亲和力的亲和力成熟（affinity maturation)，h64抗体序列被重新克隆到pYC2/CT来源的酵母载体中以生产Fab分子，其中 所述载体中FabH链通过（G4S)3连接子与抗FITCscFv4m5. 3融合。然后通过易错PCR(依 照Chao等（2006,NatureProtocols，1 :755-768)的方案）产生h64 变体文库。表达H64 变体并通过标记有FITC-PEG-NHS的酵母在表面捕获变体，然后与生物素化的人IL-6孵育。 用亲和素-APC检测结合的IL-6,且在BDFACSAria?分选仪上选择结合有最高量IL-6的细 胞，其中结合的IL-6的量与展示的Fabs的量相关。经过四轮筛选，高亲和力变体群体被选 择和测序。由亲和力成熟所选择的克隆序列（称为h64-l. 4)如下，其中所选择的突变（如 与h64的VH和VL序列相比的突变）以粗体显示，且⑶Rs用下划线标示。这些是018的可 变结构域（以及下述的020和029的IL-6a分子）。需要注意的是完整的Fabs包括CK和 IgGl的CH1结构域。在本申请的上下文中，提及的"Fab"重链或轻链氨基酸序列是指序列 可以是由轻链衍生序列和重链衍生的序列组成的起作用的Fab的一部分。
[0196]hM-l. 4VH(OISVH)(可变结构域）
[0197] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEWVRQAPGQGLEWM
[0198] GVITPGSGTINYAOKFOGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSR WDPLYYYALEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 17)
[0199]h64_l. 4VL(018VL)(可变结构域）
[0200] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGIPFMNWYQQKPGQPPKL LIYAASNRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSEEVPLT FGQGTKLEIKRTV (SEQ ID NO: 18)
[0201]h64-l. 4可变结构域被重新克隆到pcDNA3. 1人IgGl载体中，并在 Freestyle?_HEK293细胞（LifeTechnologies)中表达全长的IgGl。所获得的纯化的IgG 比原来的h64抗体在结合及细胞拮抗研宄中是明显更为有效的。使用酵母系统测试了亲和 力，所述亲和力从最初的人源化分子的343pM提高到43pM。使用HEK-Blue细胞系统测定的 拮抗剂的效力提高了约10倍。
[0202] 将h64_l. 4IgG重排为Fab以在眼部和其他适应症中使用。此外，进行另一轮的 文库生成和基于酵母的筛选，以进一步提高亲和力。经过四轮筛选，存在具有A76V突变的 VH变体的显著富集。包含A79V的抗体、变体及其片段称为019IL-6a抗体、变体及其片段。
[0203] 实施例3 :形式的选择
[0204] 为了研宄基于抗体的IL-6拮抗剂的适合的形式，测试了如前文所述的选择出的 IL-6抗体的瞬时表达、稳定性、聚集性、结合亲和力和IC50,其中所述抗体使用018序列的 Fab、scFv(VH-VL)和scFv(VH-VL)形式。
[0205] 候选IL_6a分子（包含018可变区的序列）其中之一的前述实验结果示于表1。
[0206]表1
[0207]
[0209] 这些数据展示了鉴定基于IL-6拮抗剂抗体的各种形式的关键特征的方法，并阐 明了对于包含018可变区的IL-6拮抗剂而言，018Fab形式与scFv结构相比，在最多的关键 类别（如表达、稳定性、聚集和结合亲和性）中具有最受欢迎的特征。〇18Fab的IC50落在 用于治疗的合理的范围内。
[0210] 实施例4 :IL_6a抗体、片段和衍生物的例子
[0211] 使用本发明所描述的方法，申请人已鉴定出下述序列。下划线的序列代表重链和 轻链的CDRs。其它序列可在整个说明书中找到。
[0212] IgGl框架中的018重链（全长；fl018HC)多肽序列
[0213]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEffVRQAPGQGLEffMGVITPGSGTINYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRffDPLYYYALEYffGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO： 19)
[0214]IgGl框架中的018重链（全长；fl018HC)核酸序列
[0215]CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCAGGGGCCGAGGTTAAGAAGCCAGGGAGCAGCGTCAAGGTATCTTGTAAA GCGTCTGGTTACGCCCTTTCAAACTACCTGATCGAATGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAAGGCCTGGAATGGATGGG AGTTATCACCCCTGGGAGCGGCACCATTAATTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGAGTGACGATTACCGCCGACGAGT CCACCAGTACTGCCTACATGGAGCTGTCCTCACTCCGCAGCGAGGACACGGCAGTTTACTACTGCGCCCGGAGTCGA TGGGACCCTCTTTACTATTATGCTCTGGAATACTGGGGCCAGGGAACGACCGTTACAGTGTCATCTGCTAGCACAAA AGGACCATCAGTCTTCCCACTTGCTCCTTCATCTAAGAGCACAAGTGGTGGCACTGCAGCCCTTGGCTGCCTGGTGA AAGATTATTTCCCCGAACCTGTTACAGTTTCTTGGAACTCCGGTGCACTGACATCCGGAGTACACACTTTCCCAGCT GTGCTGCAGAGCTCAGGACTGTATAGCCTGTCTTCGGTGGTCACTGTTCCATCGTCGAGTCTTGGCACACAGACATA TATTTGCAACGTCAATCACAAGCCCTCCAACACAAAAGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAGACCC ATACGTGTCCTCCCTGTCCCGCCCCTGAACTGCTGGGAGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGAC ACTCTGATGATCAGCCGGACTCCCGAGGTTACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAGGTTAAGTT CAATTGGTACGTGGATGGCGTCGAGGTGCATAACGCAAAAACCAAGCCGAGAGAGGAGCAGTACaatAGCACCTATA GAGTAGTGAGCGTCCTGACTGTCTTACATCAGGATTGGCTCAATGGTAAAGAATATAAGTGCAAGGTAAGCAACAAG GCCCTACCCGCACCAATAGAGAAGACCATCTCCAAGGCGAAAGGTCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTTTATACACTGCC TCCCTCACGCGACGAATTAACAAAGAATCAGGTGTCTCTCACCTGTCTCGTCAAGGGCTTTTACCCTTCCGACATCG CCGTGGAGTGGGAATCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTATAAGACAACTCCCCCAGTCCTGGATTCAGATGGGTCG TTCTTTCTATATAGTAAGTTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAACAGGGGAACGTGTTCTCTTGCTCTGTTATGCA TGAAGCGCTGCACAATCATTATACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGGAAG(SEQIDNO：20)
[0216]IgGl框架中的018Fab重链（018FabHC)多肽序列。CDRs以下划线标示
[0217]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEffVRQAPGQGLEWMGVITPGSGTINYAQKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRffDPLYYYALEYffGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SC(SEQIDNO：1)
[0218] 018全长轻链（fl018LC)多肽序列。CDRs以下划线标示
[0219] DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASESVD NYGIPFMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNRGS GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSEEVPL TFGQGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID NO:2)
[0220] 这也是020和029IL-6拮抗剂的轻链
[0221]IgGl框架中的018全长轻链（018LC)核酸序列
[0222] GACATAGTGA TGACTCAAAG TCCGGACAGC CTGGCGGTGT CACTCGGCGA ACGGGCAACT ATCAACTGCC GAGCCAGCGA GAGCGTCGAT AATTACGGCA TCCCCTTCAT GAACTGGTAT CAGCAGAAGC CAGGACAGCC GCCCAAGCTG CTTATCTACG CCGCTTCCAA CCGGGGATCA GGGGTGCCCG ATCGATTTAG TGGAAGCGGT AGTGGGACCG ATTTCACACT GACCATCAGC TCCCTTCAGG CCGAGGATGT GGCTGTCTAT TATTGTCAGC AATCCGAGGA AGTGCCGCTC ACGTTTGGTC AGGGAACCAA ACTGGAGATC AAGCGGACCG TAGCGGCGCC TAGTGTCTTC ATCTTCCCAC CCTCCGACGA ACAGCTGAAG TCTGGCACTG CTTCCGTCGT GTGCCTGCTC AACAACTTTT ACCCTAGAGA GGCAAAAGTT CAATGGAAAG TAGACAATGC CTTGCAGTCC GGGAACTCCC AGGAGTCTGT CACAGAGCAG GATAGTAAGG ACTCAACCTA CAGCCTGTCC AGCACACTGA CCCTCTCCAA AGCCGACTAC GAGAAGCACA AAGTGTACGC TTGCGAAGTT ACGCATCAGG GGCTGTCCTC ACCCGTTACA AAAAGTTTTA ACAGAGGGGA GTGC ( SEQ ID NO: 26 )
[0223] 019Fab重链（019FabHC，除A79V(粗体/斜体）外与018FabHC序列相同
[0224] QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTFY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT
[0225] VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSC (SEQ ID NO:3)
[0226] 019VH(可变区/019HC，除A79V(粗体/斜体）外与018HC可变区序列相同
[0227] QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTFY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO:27)
[0228] 019抗体轻链（019LC)序列（多肽和核酸）与018LC相同
[0229] 018HC的 CDR1(VHCDR1 018) :GYALSNYLIE(SEQIDN0 :4)
[0230] 018HC的 CDR2(VHCDR2 018) :VITPGSGTIN(SEQIDNO:5)
[0231] 018HC的CDR3(VHCDR3 018) :SRWDPLYYYALEY(SEQIDNO:6)
[0232] 018LC的CDR1(VLCDR1) :RASESVDNYGIPFMN(SEQIDNO:7)
[0233] 018LC的CDR2(VLCDR2) :AASNRGS(SEQIDNO:8)
[0234] 018LC的CDR3(VLCDR3) :QQSEEVPLT(SEQIDNO:9)
[0235] 019HC的 CDR1(VHCDR1 019) :GYALSNYLIE(SEQIDNO:4)
[0236] 019HC的 CDR2(VHCDR2 019) :VITPGSGTIN(SEQIDNO:5)
[0237] 019HC的CDR3(VHCDR3 019) :SRWDPLYYYALEY(SEQIDNO:6)
[0238] 实施例5:表位和结构作图
[0239] 表位作图
[0240] 对所选择的候选IL-6诘抗剂进行功能表位作图。发现在ELISA中候选抗体（小 鼠64抗体）没有减弱IL-6Ra对IL-6的结合，表明该候选抗体不结合位点I。额外进行的 实验证明表明在ELISA中嵌合小鼠64抗体减弱IL-6/IL-6Ra复合物对gP130的结合，说 明IL-6的位点II或位点III携带该抗体的结合位点。还发现小鼠64抗体不显著阻断已 知的位点III结合抗体AH_65(Immunotech，Marseille，France)与IL-6的结合，说明该候 选抗体结合IL-6的位点II。这些数据表明可产生针对位点II的抗体，以及证明了鉴定该 抗体的方法。
[0241]为了进一步定义表位，在酵母中产生了IL-6的突变，其与4m5. 3(Boderetal.， 2000，ProcNatlAcadSciUSA97，10701_10705;Chaoetal.，2006，NatProtoc1， 755-768)相融合。所表达的突变体是在人IL-6中具有下述单或双突变的突变体：R24E/ D27E、R30E、Y31E、D34R、S118R/V121E、W157E、Q159E/T162P、K171E和R179E。所述表达的 突变的IL-6分子被用于与018(Fab)的结合研宄。观察到018(FAB)的R24E/K27E、Y31E、 D34R和S118R/V121R亲和力的降低，其均位于IL-6的位点II中。因此，本发明所描述的 发明包括抗体，其能够结合到人IL-6位置24、27、31、34、118和121中的至少一个，两个，三 个，四个，五个或六个氨基酸，或能够结合IL-6中的等效位点。
[0242] 位点II表位的结构定义
[0243] 计算下列距离以在结构上定义位点II。该计算基于IL-6/IL-6a/gpl30六聚体 的晶体结构，PDBlP9M(Boulangeretal.，2003,Science300:2101-2104)。IL-6 的螺旋 1位于（runs)位点I和位点II之间，导致某些残基接近于位点II但具有指向位点I的侧 链，如R30。D2和D3是指IL-6Ra的细胞外结构域。
[0244] 下列IL-6的氨基酸被确定为落入gpl30-D2-D3的5A:以内：L19、R24、K27、Q28、 R30、Y31、D34、E110、Q111、R113、A114、M117、S118、V121、Q124、F125 和K128。
[0245] 下列IL-6的氨基酸被确定为落入gpl30-D2-D3的7A以内：L19、E23、R24、125、 K27、Q28、I29、R30、Y31、D34、K41、Q102、E109、E110、Q111、A112、R113、A114、V115、Q116、 M117、S118、K120、V121、L122、Q124、F125 和K128。
[0246] 因此，能够结合一个或多个IL-6中落入位点II5A或7A的氨基酸的分子，如抗体 或其片段，可以是IL-6a。
[0247] 提供下面的人IL-6序列作为参考（下划线所标示的序列是前导序列）。 gpl30-D2-D3的7A以内的氨基酸用斜体标记。氨基酸编号，如用于定义表位的突变，不含前 导序列。
[0248]人IL-6
[0249] MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHR OPLTSS^ /D^g/i?nLDGISALRAETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQ
[0250] SGFNEETCLVKIITGLLEFE V YLE YL0NRFESSEEQARA VQMSTKVLIQFLQ^KAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSS LRALRQM (SEQ ID NO:21)
[0251] 进行实验测试了h64_l.4人源化抗体的Fab片段，并证明该片段由于靶向位点II， 从而能够阻断IL-6顺式和反式信号。可溶性IL-6受体（SIL-6R)的存在不改变Fab片段的 效力。这与抗IL-6RIgG相反，其在sIL6R的存在下效力有所降低，且其仅阻断顺式信号。
[0252] 这些实验证明靶向位点II的抗体或该抗体的片段，如Fab片段可用于抑制IL-6 的顺式和反式信号。
[0253] 实施例6 :灵长类动物研宄
[0254]由于非灵长类动物可以与灵长类动物的活力（activities)具有很大差异，因此 一般使用非人灵长类动物进一步评价候选IL-6拮抗剂的PK和其他参数。人IL-6与食蟹 猴和猕猴IL-6有7个位点的不同，其中的一个位于位点（氨基酸28)II内且与非洲绿猴 IL-6的位点II相同。这似乎只降低了含018序列的抗体约3-4倍的结合能力。结合到非 人灵长类动物IL-6的能力是IL-6拮抗剂的一个有用的特征，其促进作为药物的候选物的 开发，如通过使在非灵长类动物中的测试，如毒性测试成为可能。
[0255] 如同大多数IL-6抗体一样，因为IL-6的低序列同源性，本发明所描述的抗IL-6 抗体不与啮齿动物、兔或犬的IL-6发生交叉反应。然而，在亲和力研宄中，发现018Fab近 似以人亲和力结合食蟹猴和非洲绿猴的IL-6(表2)。
[0256] 表2 :对各种物种的各种IL-6的单价亲和力（018Fab)
[0257]
[0258]
[0259] 这些数据进一步证明了本发明所描述的IL_6a特异性结合的能力以及在适合的 动物中形成具有允许检测（如毒理学和生殖研宄）的特征的分子的能力。
[0260] 实施例7 :提高IL_6a的表达
[0261] 为了提高018Fab和019的Fab多肽的表达，利用本领域已知方法制备了向重链 CH1/铰链区引入5个额外氨基酸（DKTHT)的构建体。改变了的018Fab重链的序列示于下 面的SEQIDN0 :24。改变的018序列在本发明中称为020且改变的019序列在本发明中 称为021。020分子（020Fab重链和018Fab轻链）与具有018Fab重链和018Fab轻链的亲 本Fab相比具有改善的表达。019分子与020分子相比未展现出显著的亲和力差异。020 和019的表达分别增加了约2倍，亲和力未受改变的影响。
[0262] 020重链（在羧基末端具有DKTHT的Fab))
[0263] QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT (SEQ ID NO:24)
[0264]使用 〇2〇Fab在HEK-BlueTMIL_6 受体细胞（InvivoGen，SanDiego,CA)中测量IL-6 的诘抗作用。在含10pMIL-6和各种浓度的020或IL-6Ra抗体（CellSciences，Canton， MA)的混合液（含或不含50nMIL-6Ra)中孵育细胞，孵育20-24小时后，20yL细胞培养 上清液与180yLQuantiBlueTM(InviV〇Gen)底物混合并孵育1小时；在655nm处测量吸光 度。图3A和图3B显示了这些实验的数据，证明了在存在或缺乏IL-6R下，020抑制IL-6活 性的能力。
[0265]实施例 8 :IgG2IL-6 抗体
[0266] 使用本领域已知方法将018重构（reformat)入人IgG2同种型框架中以与IgGl形 式的抗体相比减少FcyR的结合以及减少ADCC。另外，预期018重构为全长形式（如IgG2) 由于分子的更大大小而降低从玻璃体中的清除率。
[0267] 构建/纯化抗IL-6IgG2抗体
[0268]为了使用如前文所述的抗-IL-6序列构建人IgG2抗体，从cDNA中PCR扩增出分 别在N-和C-末端带有Nhel和Mlul限制性位点的人IgG2恒定结构域。纯化PCR产物，用 Nhel和Mlul酶切消化，然后连接入pTT5载体中，所述载体包含抗IL6可变结构域，如SEQ IDN0 :1(见上文）。这样得到全长的IgG2重链序列。含有包含018序列的全长轻链的质 粒被用于提供轻链。
[0269] 为了进一步减少FcRn的结合并因此减少IL_6a的再循环，在重链中进行了点突 变。使用QuikChange?'诱变（AgilentTechnologies，SantaClara，CA)制造突变。使 用聚（乙烯亚胺）（PEI)将重链和轻链质粒共转染到lOOmLHEK293-6E细胞的瞬时培养物 中，并培养以允许进行约5天的表达。这种产生的抗体含有抗IL-6的位点II结合部分和 IgG2结构。含有018⑶Rs的这种结构在本发明中称为018IgG2或029。在残基1253处制 造点突变。
[0270] 所述IgG2分子被很好地表达且在细胞学实验中以与020Fab相比略微改善的效力 阻断IL-6。
[0271] 029成熟序列（⑶Rs用下划线标示）
[0272] 029 重链
[0273] QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARM WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKYSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
[0274] GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 11)
[0275] 029 轻链
[0276] DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASESVD NYGIPFMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNRGS GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSEEVPL IFGQGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID NO: 12)
[0277] 改变的FcRn结合
[0278]IL-6可以具有某些积极的系统性效应。因此改造IL-6使其在玻璃体中具有良好 的滞留但具有有限的全身半衰期是有利的。减少或消除FcRn结合应当减少任何逃入循环 的药物的系统性积累，从而提高IL_6a的安全性。
[0279] 因此，由于FcRn介导的运输可能增加抗体从眼中流出，因此通过在Fc的残基 I254、H311 或H436 引入突变（参见SEQIDN0:23)编号根据Martin等，MolecularCell， 7 :4,867-877 (2001))，进一步修饰020IgG2以消除FcRn的结合。突变的位点在SEQIDNO: 23中以粗体标明；1254突变为A或R;H311突变为A或E、H311突变为N且D313突变为T， 以及H436突变为A(在前导序列后开始编号，所述前导序列在SEQIDNO:23中以下划线标 明。含有该序列的IL-6拮抗剂称为018IgG2m。
[0280] 抗IL-6重链（IgG2)(常规字体：VH;斜体：CH)(无前导序列）显示突变位点（粗 体）
[0281] QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV
[0282] KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO:23)
[0283] 抗IL-6重链（IgG2)(常规字体：VH;斜体：CH)有前导序列（下划线）显示突变位 点（粗体）
[0284] MDWTWRILFLVAAATGAHSOVOLVOSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTVSSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO:28)
[0285] 因此，一些实施方式中包括具有重链序列的抗体，所述重链序列描述于SEQID N0:23中，并具有1254(如A或R)、H311(突变为A或E)、H436(突变为A)，或D313(突变 为T)且H311突变为N的突变。
[0286]SEQIDNO:25 因此提供了一种序列，当在 1133(如I133A或I133R)、H190(如 H190A或H190E)、H315 (H315A)，或D192 和H190 (如D192T和H190N)处发生突变时，该序列 可用于抗体、片段或其衍生物以产生在低pH下（如pH5. 5)或溶酶体pH下具有减弱Fc结 合的多肽，和/或产生与亲本或其他不含该序列的参考分子相比具有减弱的全身半衰期的 多肽。
[0287] SASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
[0288] GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO:25)
[0289] 抗IL-6轻链（IgG2)(常规字体：VH;斜体：CH)
[0290] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGIPFMNWYQQKPGQPPKL LIYAASNRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSEEVPLTF GQGTKLEmJUVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSP VTKSFNRGEC(SEQ ID NO:22)
[0291] 实施例9:制剂稳定性
[0292] 测试了抗IL-6/IgGlFab片段（包含IgGlCHI结构域）的稳定性，所述测试通过 使用差示扫描荧光确定最初在PBS中的Tm，然后在一系列缓冲液和赋形剂中的Tm。发现柠 檬酸盐缓冲液（PH5. 5)将Tm提高到超过80°C。因此，在一些实施方式中，IL-6a提供于柠 檬酸盐缓冲液中且在一些情况下具有至少80°C的Tm。
[0293] 使用SEC-MALS测试了聚集程度且20mg/ml在磷酸盐缓冲液（PBS)中未观察到聚 集。
[0294] 实施例10 :适合于增强PK的对pH敏感的抗体
[0295]IL-6可以具有某些积极的系统性效应。因此改造IL-6使其在玻璃体中具有良好 的滞留但具有有限的全身半衰期是有利的。减少或消除与FcRn的结合能够减少任何逃入 循环的药物在全身的积累，从而提高IL_6a的安全性。因此，由于FcRn介导的运输可能增 加抗体从眼中流出，因此通过在Fc的残基L254、H311或H435引入突变（编号根据Martin 等，MolecularCell，7 :4,867-877 (2001))，以进一步修饰 020IgG2 以减弱FcRn的结合。这 种抗体在本发明中称为IL-6pH抗体或抗IL-6pH并在下面进一步描述。
[0296]IL_6ipH抗体的产生
[0297] 组氨酸的pKa为约6. 0,且在结合界面上插入的组氨酸能够在低pH时在侧链质子 化作用后破坏结合。使用如本发明中所述的抗IL-6位点II靶向抗体，从018中产生一个 包含富含组氨酸的CDR变体的文库，且使用酵母展示从该文库中筛选pH敏感的结合。产生 的文库是具有CDRs的组合文库，所述CDR是由简并密码子编码，使得每个残基是一个野生 型残基（即，与亲本抗体相同），或组氨酸残基。通过交替排序在生理pH(7. 4)下高结合和 在内涵体pH(5. 5)下低结合进行筛选。
[0298] 鉴定出了一个酵母-选择的突变体，其具有在pH7. 4下相对高的结合（该突变体 具有407pM的单价Kd相比亲本的192pM的Kd)和在pH5. 5下相对低的结合（该突变体具 有2. 362nM的单价Kd相比亲本的195pM的Kd)。这构成在pH5. 5下亲和力约5. 8倍的变 化。这种突变体包含在轻链⑶R1处的多个组氨酸突变。因此，该突变体显示出在PH7. 4下 与亲本分子相似的结合能力，以及在PH5. 5下亲和力的显著丧失。通过本领域已知的方法， 使用ELISA、FACS和SPR分析验证了这一观察。
[0299] 这些数据表明，可以创建基于抗体的IL_6a，其具有靶向IL-6的位点II的抗IL-6 的特征，可用于抑制IL-6的顺式和反式活性，且具有与亲本抗体或其他具有野生型Fc结构 域的抗体相比增加的PK，至少部分通过在pH5. 5下改变的结合实现。
[0300] 其他实施方式在所附权利要求书的范围之内。
【主权项】
1. 一种分离的抗体或其抗原结合片段，其能够特异性地结合人IL-6的位点II。2. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含 a. SEQIDNO:4 所示的VHCDRl、SEQIDNO:5 所示的VHCDR2,和SEQIDNO:6 所示 的VHCDR3 ;和 b. 含有SEQIDNO:7 所示的VLCDR1、SEQIDNO:8 所示的VLCDR2 ;和SEQIDNO:9 所示的VLCDR3， 其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合人IL-6 (如，能够特异性地结合人IL-6的位点II)。3. 权利要求1或权利要求2所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原 结合片段能够以240pM或更低的Kd结合IL-6,并具有70°C或更高的Tm。4. 权利要求1或权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片 段能够以240pM或更低的Kd结合IL-6,并具有80°C或更高的Tm。5. 权利要求1、权利要求2、权利要求3或权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其 中所述抗体或其抗原结合片段与人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118或V121的至少一个结 合。6. 权利要求1，权利要求2,权利要求3或权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中 所述抗体或其抗原结合片段结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121。7. -种分离的IL-6抗体或其抗原结合片段，其 a. 根据表面等离振子共振的测定，能够以240pM或更低的Kd与人IL-6解离，和 b. 在体外HEK-Blue?IL-6测定中能够以255pM或更低的IC50中和IL-6活性。8. -种分离的IL-6抗体或其抗原结合片段，其能够竞争性抑制含有SEQIDNO:1和 SEQIDNO:2的抗体或其抗原结合片段或含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:2.的抗体或其 抗原结合片段对人IL-6的结合。9. 一种分离的抗体或其片段，其能够特异性地结合人IL-6的位点II，其中所述抗体或 其片段包含：（a)包含与SEQIDNO:12的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的轻链可 变域，和包含与SEQIDNO:11的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的重链可变域。10. 权利要求1-9任一项所述的分离的IL-6抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或 其抗原结合片段具有在PH5. 5下2nM或更高的单价KcL11. 权利要求1-10任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体为IgG2抗体。12. 权利要求1-11任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段 与参考抗体或其片段相比具有改变的FcRn结合。13. 权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中所述FcRn结合与参考抗体相比是下 降的。14. 权利要求12或13所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段的 Fc结构域与参考抗体相比是改变的。15. 权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含在 SEQIDN0:23的H311、D313、I254或H436中一个或多个的突变。16. 权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含选自由H311A、H311E、 H311N和D313T、I254A、I254R、和H436A构成的组中的一个或多个突变。17. -种分离的单克隆抗体，其包含SEQIDNO:25。18. -种分离的IL-6抗体或其片段，其特异性地结合人IL-6的位点II，并与具有野生 型Fc结构域的相应的抗体相比表现出降低的FcRn结合。19. 前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，用于治疗患有IL-6相关疾病的 受试者（如人）。20. 权利要求19所述的抗体或抗原结合片段，其中所述疾病是以在玻璃体中升高的 IL-6水平为特征的眼部疾病。21. 权利要求19或20所述的抗体或抗原结合片段，用于治疗患有糖尿病黄斑水肿 (DME)、糖尿病视网膜病、葡萄膜炎、干眼综合症、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性（AMD)、增 生型糖尿病视网膜病变（PDR)、视网膜静脉阻塞（RVO)、视神经脊髓炎（NMO)、角膜移植物、 角膜擦伤或眼睛物理损伤的受试者（如人）。22. 权利要求21所述的抗体或抗原结合片段，用于治疗患有DME的受试者（如人）。23. -种组合物，其包含权利要求1-18任一项所述的抗体或抗原结合片段。24. -种组合物，其包含权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述抗体是人单克 隆抗体。25. 权利要求23或24所述的组合物，其用于治疗IL-6相关疾病。26. 权利要求25所述的组合物，其用于治疗以在玻璃体中升高的IL-6水平为特征的眼 部疾病。27. 权利要求23或24所述的组合物，其用于治疗糖尿病黄斑水肿（DME)、糖尿病视 网膜病、葡萄膜炎、干眼综合症、年龄相关性黄斑变性（AMD)、增生型糖尿病视网膜病变 (TOR)、视网膜静脉阻塞（RVO)、视神经脊髓炎（NMO)、角膜移植物、角膜擦伤或眼睛物理损 伤。28. -种治疗IL-6相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要 求1-18任一项所述的IL-6抗体或其片段。29. 权利要求28所述的方法，其中所述IL-6相关疾病是以在玻璃体中升高的IL-6水 平为特征的眼部疾病。30. 权利要求28或29所述的方法，其中所述IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿（DME)、 糖尿病视网膜病、干眼综合症、年龄相关性黄斑变性（AMD)、增生型糖尿病视网膜病变 (TOR)、视网膜静脉阻塞（RVO)、视神经脊髓炎（NMO)、角膜移植物、角膜擦伤或眼睛物理损 伤。31. 权利要求29所述的方法，其中将所述抗体或抗原结合片段递送到受试者眼睛的玻 璃体。32. 权利要求29的方法，其中所述IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿且将所述抗体或其 片段递送到受试者眼睛的玻璃体。 33?-种载体，其包含编码SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8 或SEQIDNO:9 的序列。 34?-种细胞，其能够表达SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8 或SEQIDNO:9 中一个或多个。35. -种在受试者中减少抑制IL-6的系统性效应的方法，所述方法包括向受试者施用
【专利摘要】提供了特异性结合IL-6的位点II的IL-6拮抗剂。公开了使用该抑制剂治疗IL-6相关疾病，例如眼病，如糖尿病性黄斑水肿的方法。
【IPC分类】A61P27/02, C07K16/24
【公开号】CN104903349
【申请号】CN201380058297
【发明人】M.M.施密特, D.V.厄布, T.M.巴恩斯, E.S.弗法恩, A.蒂斯代尔
【申请人】十一生物治疗股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月8日
【公告号】CA2886987A1, EP2917238A1, US20150125468, WO2014074905A1
【专利说明】IL-6拮抗剂及其应用
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2012年11月8日提交的美国申请系列号61/723, 972和于2013年 6月6日提交的美国申请系列号61/831，699的优先权。前述每个申请的全部内容通过引用 并入本发明。 发明领域
[0003] 本发明领域涉及IL-6。更具体地，所述领域涉及IL-6的调节剂以及在治疗如眼病 中的应用。
【背景技术】
[0004]IL-6是一种在炎症、造血（hematopoiesis)、血管生成、细胞分化和神经元存活中 具有报导作用的多效性细胞因子。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明涉及具有某些特征（包括对IL-6的位点II特异性结合）的IL-6抗体及 片段，和此类抗体和片段的衍生物，以及使用该抗体、片段和衍生物的方法。因此，本发明涉 及能够特异性结合IL-6的位点II的抗体、片段或其衍生物。在一些实施方式中，抗体、片 段或衍生物能够以240pM或更低的KD结合IL-6。在一些实施方式中，抗体、片段或衍生物 具有70°C或更高的Tm。在一些实施方式中，抗体、片段或衍生物能够以240pM或更低的Kd 结合IL-6,并具有70°C或更高的Tm。在某些情况下，抗体或片段或其衍生物结合人IL-6的 R24、K27、Y31、D34、S118或V121的至少一个；在某些情况下，抗体或片段或其衍生物能够 结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121。在实施方式中，抗体或片段或其衍生物能 够结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121中的至少1个、至少2个、至少3个、至 少4个或至少5个。
[0007] 本发明一方面提供了能够特异性结合人IL-6的位点II的抗体或其片段（如其抗 原结合片段）。
[0008] 实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）能够以200pM或更低的KD结合 IL-6〇
[0009] 实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）能够以200pM或更低的KD结合 IL-6和/或具有70°C或更高的Tm。
[0010] 实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）能够以200pM或更低的KD结合 IL-6和/或具有80°C或更高的Tm。
[0011] 实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）结合人IL-6的R24、K27、Y31、 D34、S118和V121中的至少一个。实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）结合人 IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121中的至少两个。实施方式中，抗体或其片段（如其 抗原结合片段）结合人11-6的1?24、1(27、￥31、034、5118和￥121中的至少三个。实施方式 中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121 中的至少四个。实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121中的至少五个。实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段） 结合人IL-6 的R24、K27、Y31、D34、S118 和V121。
[0012] 一方面本发明提供一种抗体（如分离的抗体，如分离的单克隆抗体）或其片段 (如其抗原结合片段），其包含（a)如SEQIDN0 :4所示的VHCDR1，如SEQIDN0 :5所示 的VHCDR2,和如SEQIDN0 :6所示的VHCDR3 ;以及任选地（b)如SEQIDN0 :7所示的VL CDR1，如SEQIDN0:8所示的VLCDR2,和如SEQIDN0:9所示的VLCDR3,其中所述抗体或 其片段（如其抗原结合片段）能够特异性结合人IL-6。在实施方式中，抗体或其片段包含 分别与SEQIDN0:4、SEQIDN0:5和SEQIDN0:6所示的CDR序列相同，或与所述CDR序 列的差异总共不超过1、2、3、4或5个氨基酸的重链CDRsVHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。 在实施方式中，抗体或其片段包含分别与SEQIDN0:7、SEQIDN0:8和SEQIDN0:9所示 的⑶R序列相同，或与所述⑶R序列的差异总共不超过1、2、3、4或5个氨基酸的轻链⑶Rs VLCDR1、VLCDR2 和VLCDR3。
[0013] 一方面本发明提供一种IL-6抗体（如分离的IL-6抗体）或其片段（如其抗原结 合片段），其能够以240pM或更低的KD (如通过表面等离振子共振确定）与人IL-6解离。在 实施方式中，抗体能够以255pM或更低的IC50中和IL-6活性，如通过体外HEK-Blue?IL-6 测定法测定的。
[0014] 一方面本发明提供一种IL-6抗体（如分离的IL-6抗体）或其片段（如抗原结合 片段），其能够竞争性抑制包含SEQIDN0 :1和SEQIDN0 :2的抗体或其片段（如抗原结 合片段）或包含SEQIDN0:3和SEQIDN0:2的抗体或其片段（如抗原结合片段）与人 IL-6的结合。
[0015] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）具有在pH5. 5下2nM或更高 的单价Kd。
[0016] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）是IgG2抗体。
[0017] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）与参考抗体（reference antibody)相比具有改变的FcRn结合。在实施方式中，与参考抗体相比，所述FcRn结合是 下降的。在实施方式中，与参考抗体相比抗体或片段的Fc结构域是改变的。
[0018] -方面本发明提供一种IL-6抗体（能够结合IL-6,如人IL-6的位点II的抗体） 或其片段，其具有修饰的Fc结构域并与具有野生型Fc结构域的相应的抗体相比展示出降 低的FcRn结合。
[0019] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）包含在SEQIDN0:23的 H311、1254和H436中的一个或多个的突变。
[0020] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）包含在SEQIDN0:23的 H311、D313、1254和H436中的两个或多个的突变。
[0021] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）包含在SEQIDN0:23的 H311、D313、1254和H436中的三个或多个的突变。
[0022] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）包含在SEQIDN0:23的 H311、D313、1254和H436中的每个的突变。
[0023] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）包含选自由H311A、H311E、 H311N、D313T、I254A、I254R和H435A构成的组的一个或多个突变（如1、2、3或4个突变）。
[0024] 在实施方式中，抗体或其片段（如其抗原结合片段）是分离的。
[0025] 在实施方式中，抗体是单克隆抗体或其片段（如其抗原结合片段）。在实施方式中 抗体是人单克隆抗体。
[0026] 在实施方式中，抗体是分离的单克隆抗体或其片段（如其抗原结合片段）。
[0027] 在实施方式中，抗体（如分离的单克隆抗体）包含SEQIDN0 :23。
[0028] 本发明还提供了一种抗体或其片段（如抗原结合片段）（如本发明所记载的IL-6 抗体或其片段），或包含该抗体或其片段的组合物，用于治疗IL-6相关的疾病（如用于治 疗患有IL-6相关疾病的受试者，如人受试者）。在实施方式中，所述疾病是以玻璃体内升 高的IL-6水平为特征的眼部疾病。在实施方式中，所述疾病是糖尿病黄斑水肿（diabetic macularedema，DME)、糖尿病视网膜病（diabeticretinopathy)、葡萄膜炎（uveitis)、 干眼病（dryeyedisease)、葡萄膜炎（uveitis)、年龄相关性黄斑变性（age-related maculardegeneration，AMD)、增生型糖尿病视网膜病变（proliferativediabetic retinopathy，H3R)、视网膜静脉阻塞（retinalveinocclusion，RV0)、视神经脊髓炎 (neuromyelitisoptica，NM0)、角膜移植物（cornealtransplant)、角膜擦伤（corneal abrasion)或眼睛物理损伤（physicalinjurytotheeye)。在实施方式中，所述疾病是 DME。在实施方式中，所述疾病是干眼病。在实施方式中，所述疾病是干眼综合症。在实施 方式中，所述疾病是葡萄膜炎。在实施方式中，所述疾病是AMD。在实施方式中，所述疾病是 TOR。在实施方式中，所述疾病是TOR。在实施方式中，所述疾病是角膜移植、角膜擦伤或眼 睛物理损伤。在实施方式中，抗体或其片段（如抗原结合片段）适于递送至眼睛的玻璃体。 在实施方式中，将抗体或其片段（如抗原结合片段）递送至眼睛的玻璃体。
[0029] 本发明还提供了一种治疗IL-6相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用 IL-6抗体或其片段（如其抗原结合片段），例如本发明所描述的IL-6抗体或其片段。在实 施方式中，以治疗有效量施用IL-6抗体或其片段（如其抗原结合片段）。在实施方式中， IL-6相关疾病是以玻璃体内升高的IL-6水平为特征的眼部疾病。在实施方式中，所述疾病 是糖尿病黄斑水肿（DME)、糖尿病视网膜病、葡萄膜炎、干眼综合症、干眼病、葡萄膜炎、年龄 相关性黄斑变性（AMD)、增生型糖尿病视网膜病变（PDR)、视网膜静脉阻塞（RV0)、视神经脊 髓炎（NM0)、角膜移植物、角膜擦伤或眼睛物理损伤。在实施方式中，抗体或其片段（如其抗 原结合片段）适于递送至眼睛的玻璃体。在实施方式中，将抗体或其片段（如其抗原结合 片段）递送至受试者眼睛的玻璃体。在实施方式中，IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿且将 抗体或其片段递送至受试者眼睛的玻璃体。
[0030] 另一方面本发明提供一种包含编码本发明所述的IL-6抗体或其片段（如其抗原 结合片段）的序列的载体。在实施方式中，所述载体包含编码SEQIDNO:4、SEQIDN0 :5、 SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8 或SEQIDNO:9 的序列。
[0031] 本发明的另一方面提供一种表达本发明所述的IL-6抗体或其片段（如其抗原结 合片段）序列的细胞。在实施方式中，所述细胞表达SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQID NO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8 或SEQIDNO:9 中的一种或多种。
[0032] 在另一个方面，本发明涉及在受试者中降低抑制IL-6的系统性效应的方法，所述 方法包括向受试者施用能够抑制IL-6的活性，并与野生型Fc结构域的相应的抗体或其片 段相比具有降低的Fc活性的抗体或其片段。在一些情况下，在所述受试者中降低抑制IL-6 的系统性效应的方法包括向受试者施用例如在低pH下（如pH5. 5)具有高于1yM的FcRn 结合的IL-6拮抗剂。
[0033] 如本发明所用，术语"抗体"与免疫球蛋白含义相同，且在本领域中是公知的。术 语抗体不受制备抗体的任何特定方法的限制。例如，术语抗体包括，特别是重组抗体、单克 隆抗体和多克隆抗体。如本发明所用，抗体是一种四聚体，且除非另外公开，每个抗体均由 两对相同的多肽链组成，其中每对具有一个轻链和一个重链。每一条链的氨基端包含在抗 原识别中起主要作用的约100到120或更多氨基酸的可变区。每一条链的羧基端包含在抗 体效应子功能（antibodyeffectorfunction)中起主要作用的恒定区。人轻链的种类被 称为kappa和lambda轻链。重链种类为mu、delta、gamma、alpha或epsilon，并定义了抗 体的同种型。抗体的同种型分别为181、1§0、1§6、1 §4和1§￡。在轻链和重链中，可变区和 恒定区通过约12或更多个氨基酸的"J"区连接，重链还包括一个约3个或更多个氨基酸的 "D" 区。
[0034] 每一重链/轻链对（VH和VL)的可变区分别形成抗原结合位点。因此，例如完整 的IgG抗体具有两个结合位点。除双功能或双特异性抗体外，所述的两个结合位点是相同 的。
[0035] 抗体重链和轻链的可变区表现出通过3个高变区（也称为互补决定区或⑶R)连 接的相对保守框架区（FR)的相同通用结构。术语"可变"指抗体间可变域的某些位点在序 列上存在广泛的差异，并且这些位点涉及每一特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。可 变性（variability)主要位于CDRs中，其被更加高度保守的框架区（FRs)分开。根据Kabat SequencesofProteinsofImmnunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth, Bethesda，MD，1987 和 1991)或Chothia和Lesk，JMolBiol196:901-917(1987);Chothia 等，Nature342 :878-883 (1989)(其记载了本领域公知的方法）的定义进行每个结构域的 氨基酸的分配。
[0036] "野生型"可指一个群体中最为普遍的等位基因或种类，或指来自于未经操作的 动物的抗体，后者是与来自某种形式的操作的等位基因或多态性或变体或衍生物相较而言 的，所述操作是例如诱变、使用重组方法等来改变该抗原结合分子的氨基酸。
[0037] 术语"抗体片段"是指完整或全长链或抗体的一部分，通常为靶结合区或可变区。 抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab'）2和Fv片段。"功能片段"或"抗-IL-6的 位点II抗体的类似物"是可防止或实质降低IL-6结合到受体的能力、降低IL-6/IL-6R复 合物结合到gpl30的能力或降低配体结合到gpl30或起始信号（initialsignaling)的能 力。如本发明所用，功能片段通常与"抗体片段"含义相同，并且就抗体而言可指能防止或 实质降低IL-6结合到受体的能力、降低IL-6/IL-6R复合物结合到gpl30的能力或降低配 体结合到gpl30或起始信号能力的片段，例如Fv、Fab、F(ab' )2等。
[0038] 抗体的"衍生物"是能够特异地结合IL-6的位点II的且与IL-6的位点II抗体 共享序列，例如共享能够特异地结合人IL-6的位点II的抗体的至少一个CDR的多肽。
[0039] "竞争"是指第一抗体或其片段能够与第二抗体或其片段竞争结合，使得与第二抗 体不存在时第一抗体的结合相比，在第二抗体存在下，可检测到第一抗体与其表位结合的 降低。在某些情况下，该术语也指在第一抗体存在下，第二抗体与其表位的结合是可检测的 降低。在非限制性的例子中，该竞争的机制可通过位阻、构象改变或与共同表位结合。
[0040] 核酸序列内容中的术语"序列同一性百分比"是指当比对以获得最大对应时，两 序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以超过至少约9个核苷酸，例如，至少约18 个、至少约24个、至少约28个、至少约32个、至少约36个或至少约48个或更多个核苷酸。 可以使用本领域中已知的算法测量核苷酸序列的同一性。例如，可以使用FASTA、Gap或 Bestfit(WisconsinPackage10.0 版本，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI) 比较多核苷酸序列。FASTA，包括例如程序FASTA2和FASTA3,提供查询和搜索序列之间最 佳重叠区域的比对和序列同一性百分比（Pearson，MethodsEnzymol183 :63_98 (1990); Pearson,MethodsMolBiol132:185-219(2000) ；Pearson,MethodsEnzymol266： 227-258(1996) ;Pearson，JMolBiol276:71-84 (1998);通过引用并入本文）。通常使用特 定程序或算法的缺省参数。例如，可以使用FASTA及其缺省参数（字长为6和用于计分矩 阵的N0PAM系数）确定核酸序列间序列同一性百分比，或使用GCG第6. 1版提供的具有默 认参数的Gap来确定，通过引用并入本文。
[0041] 氨基酸序列中的术语"序列同一性百分比"是指当比对以获得最大对应性时，两序 列中相同的残基。序列同一性比对的长度可以超过至少5个氨基酸残基，例如，至少20个 氨基酸残基、至少30个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少 150个氨基酸残基或至少200个或更多个氨基酸残基。通常使用序列分析软件测量多肽的 序列同一性。用于确定序列同一性百分比的算法是已知的。例如可以使用FASTA、Gap或 Bestfit(WisconsinPackage第 10.0版，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI)比 较氨基酸序列。蛋白分析软件使用比对多种取代、缺失以及包括保守性氨基酸置换的其他 修饰的相似性的测量来匹配序列。例如，GCG含有诸如"Gap"和"Bestfit"程序，它们可以与 默认参数一起用来决定密切相关的多肽（诸如来自不同物种之生物的同源性多肽）或野生 型蛋白与其类似物之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG第6. 1版（University ofWisconsin，Madison，WI)。多肽序列也可以使用默认或建议参数的FASTA(参见GCG第 6. 1版）来比对。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的 比对和序列同一性百分比（Pearson，MethodsEnzymol183 :63_98 (1990) ;Pearson，Methods MolBioi132:185-219(2000))。当要将序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库比 对时，可以使用的另一种算法是BLAST，例如blastp或tblastn，使用程序提供的默认参数。 参见例如Altschul等，JMolBioi215:403-410(1990);Altschuletal.，NucleicAcids Res25 ：3389-402(1997)〇
[0042] 当样品的至少约60或75%显示出单一种类的多肽时，蛋白或多肽是"基本纯净 的，""基本均质的，"或"基本纯化的"。多肽或蛋白可以是单体或多聚体。基本纯的多肽 或蛋白可包含约50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%纯品；例如，一个基本纯的 多肽或蛋白是50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%纯的。蛋白的纯度或均质性可 通过任何适当的方法评价，如蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过观察一条或多条 与蛋白或多肽相关的条带（如在染色的凝胶上）、大小排阻HPLC、阳离子交换HPLC、SDS中 的减压毛细管电泳、肽图谱或聚糖图谱。例如可使用现有技术中的已知方法或其他纯化方 式实现高分辨率。
[0043]当指核酸或其片段时，术语"基本相似性"是指当以适当核苷酸插入或缺失，与另 一核酸（或其互补链）进行最佳比对时，通过任何已知的序列同一性算法，如FASTA、BLAST或Gap测量的核苷酸碱基的核苷酸序列的同一性为至少约85%、至少约90%，和至少约 95%、96%、97%、98%或 99% 的序列同一性。
[0044] 当用在多肽上时，术语"基本同一性"或"基本相似性"是指当两个多肽序列用 如GAP或BESTFIT程序使用默认空位权重进行最佳比对时，共享至少约70%、75%、80%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性；例如，70%、75%、80%、90%、95%、 96 %、97 %、98 %或99 %的序列同一性。在某些实施方式中，不相同的残基位置的差异在于 保守氨基酸变化。
[0045] "治疗有效量"是指施用该剂量的治疗剂将缓解所治疗疾病的至少一种征兆或症 状或增加或提高可用于治疗IL-6相关疾病的另一疗法（如另一种治疗剂）的预防和或治 疗效果。应当理解治疗有效量可以在有限的时间内多剂量施用或作为长期治疗。
[0046] "治疗"是指缓解征兆或症状或疾病的方法。
[0047] 如本发明所用，术语"疾病"包括疾病和病症。
[0048] 本发明所提到的每一个专利文件和科学文章的全部公开，以及在此所引用的这些 专利文件和科学文章，出于所有的目的通过引用明确地并入本文中。
[0049] 本发明其他的特点和优势在下面详细描述。
[0050] 附图简述
[0051] 图1是说明实验结果的图表，该实验在大鼠CNV模型中IVT施用抗IL-6抗体。抗 VEGF抗体作为阳性对照被施用且阴性对照是载体本身。抗-IL-6对载体对照，第15天时p =0? 0054,第 22 天时p= 0? 0005。
[0052] 图2是说明测试鼠64抗体抑制IL-6/IL-6R结合gpl30的能力的结合实验结果的 图表。
[0053] 图3A是说明实验的图表，该实验中测试了 020在缺乏过多的可溶性IL-6Ra的情 况下阻断IL-6信号传导（signaling)的能力。实验是在具有0? 2ng/mLIL-6和2yg/mL IL6Ra情况中在HEK-Blue-IL-6细胞上进行。
[0054] 图3B是说明实验的图表，该实验中测试了020在过多的可溶性IL-6R a缺乏存在 的情况下阻断IL-6信号传导的能力。实验是在具有0. 2ng/mL IL-6和2yg/mL IL6Ra的 情况中在HEK-Blue-IL-6细胞上进行。
[0055] 发明详述
[0056] 已经暗示IL-6在诸如类风湿性关节炎的多种疾病中起作用，且已经报道在包括 眼部疾病在内的多种疾病中显著上调。IL-6可通过顺式和反式机制起作用。在顺式机制 中，认为游离的IL-6结合至膜结合型IL-6受体（IL-6R，也称为IL-6Ra和CD126)，且然后， IL-6/IL-6R复合物与gpl30 (也称作CD130、制瘤素M受体、IL-6Rbeta和IL-6信号转导物） 相互作用，以激活含有所述复合物的细胞中的信号传导。在反式机制中，游离的IL-6结合 可溶性IL-6受体（SIL-6R)。IL-6/sIL-6R复合物然后能够结合存在于细胞膜上的gpl30。 这些机制间关键的不同之处在于表达gpl30的细胞类型多于表达IL-6R(其表达是更有限 的）的细胞类型。因此在希望抑制IL-6信号传导的疾病中，例如在那些希望广泛地抑制 IL-6信号传导的疾病中，抑制顺式和反式IL-6信号两者是有用的。申请人已经制备出了 IL-6拮抗剂，如抗IL-6抗体、片段和衍生物，该拮抗剂能够抑制IL-6的顺式和反式的信号 传导。另外，申请人已经制备了该IL-6拮抗剂以实现增强的玻璃体保留和更快的全身清 除。
[0057]IL-6拮抗剂（IL_6a)的特点
[0058] -般而言，本发明描述的IL-6拮抗剂（IL_6a)特异地结合IL-6的位点II(位点 2)，且对于IL-6相关的眼病和某些其他疾病的治疗是有用的。IL-6相关的眼病是一种疾 病，其中不希望的症状或疾病的生物学活性与IL-6的表达或存在有关。在一些实施方式 中IL-6a对游离的和结合的IL-6具有高亲和力，在机体中是相对稳定的，能够抑制结合到 IL-6R的IL-6 (本发明中被称为IL-6/IL-6R复合物或IL-6/IL-6R)与gpl30的结合，并且 能具有治疗效果。一般来说，IL_6a是抗体或衍生自抗体。例如，IL_6a是高亲和性的人源 化Fab，其能够特异地结合IL-6的位点II并有效阻止顺式和反式IL-6信号传导。在另一 个例子中，IL_6a是全长抗体，如IgGl或IgG2抗体。
[0059] 在一些实施方式中，Fab也被设置为Fc-工程化的序列或位于全长的抗体中。在 一些实施方式中，Fc-工程化的IL_6a(如Fc-工程化的Fab)与适当的对照相比，如与相应 的不具有工程化的Fc的抗体、其片段或衍生物相比，具有增加的玻璃体停留时间和/或更 快的全身清除。IL_6a的这些和其他特点在本发明中被进一步描述。[0060] 申请人已经设计出选择地结合IL-6的位点II的IL-6拮抗剂以提供IL-6信号 传导的广泛抑制，因为这类分子可以抑制gpl30与IL-6的结合，无论IL-6是结合膜IL-6R 还是结合SIL-6R。此外，靶向配体（IL-6)相对于IL-6受体可以避免受体介导的清除和由 ADCC带来的毒性（抗体依赖的细胞介导的细胞毒性）。由于IL-6在疾病中起到病理和保 护性作用，因此使用IL-6拮抗剂（IL-6a)治疗与增加的IL-6相关的疾病可以改善某些方 面的状况，但也可能造成显著的副作用，如系统性效应。这种IL-6通路的双重性（如具有 希望的和/或不希望的效应的能力）使其不适合作为全身性抑制剂治疗IL-6相关病症。 因此，本发明提供的组合物和方法对于治疗是有用的，所述组合物抑制至少一种IL-6的活 性但对IL-6的积极活性不具有不当的影响，部分因为所述组合物能被配制为局部递送，如 配制为局部递送至眼睛。例如，在某些方面，IL_6a被设计为适于递送至特定位点的尺寸。 在一些实施方式中，IL_6a是全长抗体。在一些实施方式中，IL_6a衍生自抗体且处于一种 可在眼睛的玻璃体中具有更长的停留期和有限的系统性漏出（systemicleakage)的方式。 在一些实施方式中，IL_6a是修饰的抗体（如具有修饰的Fc结构域的抗体），与相应的未修 饰的抗体相比，其在眼睛的玻璃体中具有更长的停留期和/或更为有限的全身性漏出。在 一些实施方式中IL-6a是IgG2抗体。
[0061] 在一些方面，IL_6a是相对小的IL_6a，如抗体的片段或其他抗体衍生物即小于全 长抗体，例如衍生自IL-6抗体的Fab。在一些情况下，IL_6a处于一种能够从一个组织的一 部分传递到另一个组织并与相应的全长IL-6抗体相比具有增加的动力学的形式。在一些 实施方式中，IL_6a是被工程化为更大分子的Fab，其与Fab单独相比更可能在被递送的区 域中具有延长的停留，例如IL_6a通过Fc结构域二聚化。在某些实施方式中，Fc结构域被 工程化从而使Fc部分具有消弱的（ablated)或减弱的FcRn结合，从而可导致延长的局部 停留，如与包含野生型Fc的相同的IL-6结合体（IL-6bindingentity)相比增加玻璃体 停留和减少全身积累。
[0062] 本发明所描述的IL-6拮抗剂还对其靶标IL-6具有足够高的亲和性从而有效改善 IL-6的至少一个不希望的效应。所述抑制剂还是足够稳定的以有助于其作为治疗剂。
[0063] 一般而言，IL_6a的PK，如适合用在眼睛中的IL_6a在递送的位点（如玻璃体）中 具有足以提供治疗效果的PK。在非限定的例子中，所述PK可以是至少12小时、24小时、2 天、3天、4天、5天、8天、10天、14天、21天、28天或30天的半衰期。
[0064] 结合到位点II的IL-6拮抗剂的鉴定
[0065] 一般来说，本领域中已知的任何方法都可用于生产能够结合IL-6的分子，例如， 实验中，多肽文库或分子文库可用于筛选具有结合到IL-6的能力的多肽或化合物的候选 化合物。一旦鉴定了该候选化合物，可以使用本领域中已知的方法确定化合物的结合位点。 例如，可以测试分子结合到野生型IL-6的能力并将该结合力与该分子与在位点I、位点II 或位点III突变了的IL-6的结合能力作比较。在实施方式中，本发明所述的IL-6a保留结 合到IL-6/IL-6Ra复合物和结合到IL-6的能力，并阻止IL-6/IL-6Ra结合到gP130。在 实施方式中，例如本发明所述的IL-6a通过与IL-6的位点II的结合能够与gpl30竞争结 合IL-6/IL-6RCI复合物。可以使用本领域已知的方法测定该结合能力。
[0066]例如，可使用HEK-Blue?IL-6 测定系统（InvivoGen，SanDiego)测试IL_6a候选 物。HEK-Blue?IL-6细胞是稳定转染了人IL-6R和STAT3-可诱导SEAP报告基因的HEK293细 胞。在IL-6存在下，STAT3被激活且SEAP被分泌。例如可以使用QUANTI-Blue?(InvivoGen， SanDiego)测定SEAP。向细胞加入IL-6拮抗剂抑制了游离和可溶性受体与IL-6的结合， 从而阻止了SEAP的分泌或降低了SEAP的水平。
[0067] KD指特定抗体-抗原相互作用或抗体片段-抗原相互作用的结合亲和平衡常数。 当KD低于或等于 250pM，如低于或等于 225pM、220pM、210pM、205pM、150pM、100pM、50pM、 20pM、10pM或lpM时，抗体或其片段被认为是特异性与抗原结合。可使用现有技术中已知的 方法确定KD，例如表面等离振子共振，如使用BiaCore?系统确定KD。
[0068] K#指特定抗体-抗原相互作用或抗体片段-抗原复合物的解离速率常数。可使 用表面等离振子共振，例如使用BiaCore?系统确定解离速率常数。一个相对慢的K可产 生治疗所希望的特征，如允许以低频率向需要该治疗的个体施用抑制剂。
[0069] 特异性
[0070] 本发明所公开的IL-6拮抗剂的特点涉及它们的结合特异性。如上文所讨论，IL-6 可作为游离IL-6和作为结合到可溶性IL-6Ra的IL-6存在。申请人已经鉴定出，与结合 IL-6位点I的抑制剂相比，IL-6的位点II是IL-6拮抗剂的最佳靶点。位点I的抑制剂可抑 制游离IL-6与IL-6Ra的结合。然而，该抑制剂不能阻止由事先存在的复合物所引起的活 性，除非通过替换，其受限于IL-6/IL-6R复合物的1(。"。在另一个可选方案中，结合IL-6Ra 的抑制剂是不太合适的，因为除非其以饱和浓度存在，该抑制剂具有有限的阻止IL-6活性 的能力。由于IL-6受体的量较IL-6的量通常是相当高的，因此这种方法可能需要施用不 期望的大量的通过与受体结合来抑制IL-6活性的化合物。在实施方式中，本发明所描述的 IL-6拮抗剂（如本发明所描述的抗体和片段及其衍生物）能够甚至当IL-6结合到IL-6R 时阻断IL-6的活性。因此，本发明所描述的IL-6a的优势在于与靶向IL-6受体的抑制剂 相比，实现治疗效果所需施用的化合物的量相对较小。抗受体抗体已被报道通过受体介导 的清除被快速清除，这显著限制了抗体的PK，因此需要加大剂量、更高频给药或使用前述两 者。另外，抗受体抗体和抗位点IIL-6抗体的问题在于它们通过阻断配体的正常受体介导 的清除途径显著地增加了IL-6的组织浓度，从而使受试者处于组织中IL-6的潜在不需要 的水平。此外，使用靶向IL-6Ra的抑制剂可能使抑制剂必需存在于寻求抑制剂的位点和 不希望的位点（如全身治疗）附近。使用与位点II(gpl30结合该位点）结合的IL-6a允 许抑制游离的IL-6以及结合了IL-6R的IL-6,但并不激活经过gpl30的IL-6途径。因此， 本发明所描述的IL-6拮抗剂被设计为结合两种形式的IL-6(可溶的和结合到受体的），特 别是结合到IL-6的位点II的拮抗剂，该拮抗剂能够结合两种形式的IL-6。本发明所描述 的包含IL-6a的组合物可通过IL-6抑制顺式和反式信号。
[0071] 在某些情况下，本发明所提供的化合物和方法被设计为提供一种有效的IL-6阻 断剂，其足以治疗至少一种IL-6相关病症的征兆或症状，如抑制血管发生和/或炎症。
[0072] 本发明所描述的化合物还可用于治疗以不期望的高水平IL-6为特征的眼病， 如在玻璃体中的疾病（参见Yuukietal.，JDiabetesCompl15 ;257 (2001);Funatsu etal. ,Ophthalmology110:1690, (2003) ；0hetal. ,CurrEyeRes35:1116(2010)； Nomaetal.，Eye22 :42 (2008);Kawashimaetal.，JpnJOphthalmol51 :100 (2007); Kauffmanetal. ,InvestOphthalmolVisSci35 ：900(1994)；Miaoetal. ,MolecVis 18 ：574(2012))〇
[0073] 通常，本发明所描述的IL_6a是IL-6信号传导强效拮抗剂。这部分地通过设计对 IL-6具有高亲和力的分子来实现，例如，在使用10pMIL-6的HEK-BlueIL-6试验中IC50 小于或等于l〇〇pM。可根据IL-6a的Kd确定IL-6a的高亲和性，例如，小于或等于InM的Kd、 小于或等于500pM的Kd、小于或等于400pM的Kd、小于或等于300pM的Kd、小于或等于240pM 的KD或小于或等于200pM的KD。
[0074] 为了制备可用于治疗与增加的IL-6表达或活性有关病症的生物制剂IL_6a(例 如蛋白或多肽如抗体、片段或其衍生物），通常最好是所述生物制剂IL_6a具有高的产率。 例如，合适的产率为高于或等于lg/L(如高于或等于2g/L、高于或等于5g/L或高于或等于 l〇g/L)〇
[0075] 为了有效地施用IL-6拮抗剂，需要抑制剂具有与将要施用的浓度相匹配的溶解 度。例如，在全长抗体的IL-6a的情况下，其溶解度大于或等于20mg/ml、大于或等于10mg/ ml、大于或等于5mg/ml或大于或等于lmg/ml。
[0076] 另外，抑制剂必须具有递送的体温下的高度稳定性和活性位点及储存稳定性从而 成为一种可行的治疗。例如高于或等于60°C的Tm (如高于或等于60°C、高于或等于62. 5°C、 高于或等于65°C、高于或等于70°C、高于或等于73°C、高于或等于75°C)和高于或等于 45°C的Tmset，如高于或等于50°C、高于或等于51°C、高于或等于55°C或高于或等于60°C。 可以用本领域已知的方法确定L和T_61的方法。
[0077] 可从本领域中已知的分子的类型中选择具有所需要的特性的拮抗剂，例如抗体， 包括靶向IL-6的位点II的抗体的片段和衍生物，其一般保留或维持足够的亲本IL-6抗 体的特征（如需要的结合特性）。该拮抗剂包括Fab片段、scFvs、工程化的含有Fc部分的 Fab片段，以及工程化的具有不同于亲本IL-6的位点II靶向抗体框架的全长抗体。
[0078] 在一些方面中，本发明所描述的IL_6a包括人抗体抗原结合位点，该位点能够竞 争或交叉竞争能够结合IL-6的位点II的抗体或其片段。例如，抗体或其片段可以由本发 明中公开的VH结构域和VL结构域组成，且VH和VL结构域包含本发明中公开的IL-6/位 点II结合抗体的一组⑶Rs。
[0079] 可使用任何合适的方法，例如通过突变IL-6上的多种位点来确定与IL_6a结合 的结构域和/或表位。那些含有突变的表位阻止或降低IL_6a的结合，且IL-6配体直接 参与与IL_6a的结合或如通过影响IL-6的构型间接影响结合位点。可以使用其他方法确 定IL-6a所结合的氨基酸。例如，可以使用肽-结合扫描，如基于PEPSCAN的酶联免疫试验 (ELISA)。在这种类型的肽-结合扫描中，源自抗原的短重叠肽被系统地针对其与结合成员 的结合进行筛选。所述肽可以共价地连接于支持物表面，以形成肽阵列。肽可以是线性的 或受限的构象。可以使用在每一肽序列的末端具有半胱氨酸（cys)残基的多肽产生受限的 构象。可将cys残基直接或间接共价偶联到支持物表面从而使肽保持环形构象。因此，所 述方法中所使用的肽可能具有一个添加在与抗原片段相关的肽的每一末端的cys残基。还 可使用双环形肽，其中cys残基额外地定位于或靠近肽序列的中间部位。可将cys残基直 接或间接共价偶联到支持物表面从而使肽形成双环的在中央cys残基的每一侧具有一个 环的构象。可以合成产生肽，因而可以在需要的位置修饰cys残基，尽管其不是在IL-6的 位点II序列天然发生的。任选地，可在肽-结合试验中筛选线性或构象受限的肽。肽-结 合扫描可包括鉴定（如使用ELISA) -组结合到结合成员的肽，其中所述肽具有与IL-6a的 片段相对应的氨基酸序列（如包括IL-6a的约5、10或15个连续残基的肽），以及比对所述 肽以确定结合成员所结合的残基的足迹，其中该足迹包含重叠肽共同的残基。可选地或额 外地，可以使用肽-结合扫描方法以至少选定的信号：噪音比鉴定IL_6a要结合的肽。
[0080] 可使用本领域中已知的其他方法确定抗体所结合的残基，和/或确认肽-结合扫 描结果，包括例如，定点突变（如本发明所描述的）、氢氘交换、质谱、NMR和X-射线晶体法。
[0081] 一般地，本发明所描述的有用的IL-6a是人抗体分子、人源化抗体分子或其结合 片段。通常，抗体是单克隆抗体。该抗体的来源可以是人、小鼠、大鼠、骆驼、兔子、羊、猪或 牛，且可按照那些本领域中已知的方法生产所述抗体。
[0082] 通常，IL_6a至少包含抗体的⑶R，所述⑶R特异地结合IL-6的位点II(如人 IL-6)。带有本发明的CDR或一组CDRs的结构可以是抗体重链或轻链序列或其实质性部分， 在重链和轻链中⑶R或一组⑶Rs位于天然发生的由重排免疫球蛋白基因编码的VH和VL 抗体可变结构域的⑶R或一组⑶Rs的对应位置。可通过参考Kabat等人，1983 (国立健康 研宄院）以及使用任何因特网搜索引擎在"Kabat"下查找到的更新（updates)来确定免疫 球蛋白可变结构域的结构和位置。
[0083] 作为抗体的IL-6a-般包含抗体VH结构域（如SEQIDN0 :1或SEQIDN0 :3)和 /或VL结构域（如SEQIDN0 :2)。VH结构域包含一组重链CDRs(VHCDRs)，以及VL结构域 包含一组轻链⑶Rs(VIXDRs)。实施例3中提供了该⑶Rs的例子，该⑶Rs的例子被描述于 SEQIDN0s:4-9中。抗体分子可包含一个含有VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3和框架的抗体VH 结构域。其可选地或还包含含有VIXDR1、VIXDR2和VIXDR3和框架的抗体VL结构域。
[0084] 本发明所公开的IL-6拮抗剂包含如那些在本发明中所公开的VHCDR1和/或 VHCDR2和/或VHCDR3和/如那些在本发明中所公开的VIXDR1和/或VIXDR2和/或VIXDR3。 IL_6a可包含一个或多个本发明所描述的任何抗体、片段或衍生物的⑶Rs。IL_6a可包含一 组VHCDRs(如VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)，且可选地其还可以包含一组VLCDRs(如VLCDR1、 VIXDR2和VIXDR3)。⑶Rs可源于一种或多种本发明所描述的抗体、片段或衍生物。例如， VLCDRs可源于与VHCDRs相同或不同的抗体。
[0085] 通常，VH结构域与VL结构域配对以提供一个抗体抗原结合位点。例如SEQIDN0 : 1或SEQIDNO:3的HC结构域与SEQIDNO:2的LC结构域配对。在某些情况下，VH或VL 结构域独自可以用作IL_6a。
[0086] 在某些方面，IL_6a是抗体分子、片段或其衍生物，其包含（i)与本发明所描述的 VH结构域（例如SEQIDN0 :1或SEQIDN0 :3的VH结构域）具有至少60、70、80、85、90、 95、98或99%氨基酸序列同一性的￥11结构域序列，或（^)那些序列（在（1)中定义的序 列）的一组VHCDRs(如，VHCDR1、VHCDR2和/或VHCDR3)。在实施方式中，抗体分子、片段或 其衍生物包含SEQIDN0 :1 的VHCDR1、VHCDR和VHCDR3 或SEQIDN0 :3 的VHCDR1、VHCDR 和VHCDR3。在实施方式中，抗体分子、片段或其衍生物包含SEQIDN0:1的VHCDR1、VHCDR2 和VHCDR3且整体上与SEQIDNO:1的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的差异不超过1个、不超 过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个氨基酸。在实施方式中，抗体分子、片段或其 衍生物包含SEQIDN0:3 的VHCDR1、VHCDR2 和VHCDR3 且整体上与SEQIDN0:3 的VHCDR1、 VHCDR2和VHCDR3的差异不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个氨 基酸。
[0087] 抗体分子、片段或其衍生物还可以任选地包含（i)与本发明所描述的VL结构域 (例如SEQIDN0:2的VL结构域）具有至少60、70、80、85、90、95、98或99%氨基酸序列 同一性的VL结构域序列，或（ii)那些序列（在（i)中定义的序列）的一组VLCDRs(如， VIXDR1、VIXDR2和/或VIXDR3)。在实施方式中，抗体分子、片段或其衍生物包含SEQID NO:2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在实施方式中，抗体分子、片段或衍生物包含VLCDR1、 VLCDR2和VLCDR3且整体上与SEQIDN0 :3的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的差异不超过1 个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个氨基酸。能够用于计算两氨基酸序 列百分比同一性的算法包括例如BLAST、FASTA，或Smith-Waterman算法，如采用缺省参数。
[0088] 本发明所描述的IL_6a可包含抗体恒定区或其部分，如人抗体恒定区或其部分。 例如，VL结构域可以在其C-末端附着包括人CK或CL链的抗体轻链恒定结构域。相似的， 基于VH结构域的IL-6a能够在其C-末端附着免疫球蛋白重链的全部或部分（如CH1结构 域），该重链源于任何同种型抗体，如IgG、IgA、IgE和IgM以及任何的同种型亚类，特别是 IgGl、IgG2、IgG3 和IgG4。
[0089] 在某些情况下，本发明的抗体被进一步使用本领域已知的方法修饰以制备具有特 定同种异型（allotype)的序列，例如一种在具有特定地域起源的人群中占主导地位的同 种异型。在某些情况下，修饰人类重链恒定区以达到该目的。
[0090] IL-6a可以是抗体分子、其结合片段或变体，其具有在抗体框架内的一个或多个 CDRs，例如一组CDRs。例如，抗体（例如本发明所描述的抗体或其片段或衍生物）的一个或 多个CDRs或一组CDRs可以被移植到框架中（如人框架）以提供抗体分子。框架区可以是 源自人种系基因序列，或可以是非种系来源的。
[0091]VH和/或VL框架残基可以如所讨论的那样被修饰并在本发明中作为例子，如使用 位点特异性突变。
[0092] 可以在源自靶向IL-6的位点II的抗体IL_6a(本发明中定义为"参考IL-6抗 体"）的一个或多个框架区和/或一个或多个CDRs中使用本领域已知的方法和参数进行氨 基酸改变。本发明中还包括所产生的IL-6拮抗剂，其保留了与IL-6的位点II(如人JL-6 的位点II)的结合且与参考IL-6抗体相比通常具有至少相同的结合或提高的亲和力。在 一些情况下，为了改善诸如稳定性的参数，可以引入导致与参考IL-6a(如参考抗体）相比 降低的结合亲和力的变化以制备有用的IL_6a。在某些实施方式中，例如在某些情况下，其 中所述参考涉及FcRn结合或药代动力学（PK)参数，如在玻璃体中的半衰期或全身的半衰 期（如，在血液、血浆、血清、淋巴、肝、肾、其他组织或体液），参考抗体可以是非特异地结合 IL-6的抗体。
[0093]IL_6a多肽的氨基酸序列中的变化可包括用非天然发生或非标准氨基酸取代一个 或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修饰为非天然发生或非标准形式，或在序列 中插入一个或多个非天然发生或非标准氨基酸。本发明序列中改变的数量和位置的例子在 本发明别处描述。天然发生的氨基酸包括20种"标准的"L-氨基酸，其由它们的标准单字 母被确定为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R，、H、D、E。非天然发生氨基酸包括 任何其他能够渗入多肽骨架或源自已有氨基酸残基修饰的残基。非标准氨基酸可以是天然 发生或非天然发生的氨基酸。本领域已知数种天然发生的非标准氨基酸，如4-羟脯氨酸、 5-羟赖氨酸、3-甲基组氨酸和N-乙酰丝氨酸。那些在N-alpha位置衍生化的氨基酸残基 将仅能位于氨基酸序列的N-末端。氨基酸一般地为L-氨基酸。在一些情况下，氨基酸是 D-氨基酸。因此改造可以包含将L-氨基酸修饰为，或将其替换为D-氨基酸。氨基酸的甲 基化、乙酰化和/或磷酸化形式是已知的，且本发明中的氨基酸可进行该种修饰。
[0094] 本发明的抗体结构域和结合成员中的氨基酸序列可包含本发明所讨论的非天然 或非标准氨基酸。可以使用本领域中已知的方法，例如分子的合成或合成后修饰或氨基酸 的替换，将非标准氨基酸（如D-氨基酸）渗入氨基酸序列。在一些情况下，D-氨基酸被用 于增加IL_6a的PK。
[0095] 可通过随机突变一个或多个选择的VH和/或VL核酸序列在整个可变结构域中产 生突变的方式产生本发明携带CDR来源序列的新的VH或VL区。例如可使用易错PCR(Chao 等，NatureProtocols，l:755-768(2006))。在一些实施方式中，在整个可变区或一组CDRs 中进行一个或两个氨基酸替换。可使用其他本领域中已知的方法产生突变，例如一般在一 个或多个CDRs中的定点突变。
[0096] 用于产生抗体IL_6a的一个方法是通过添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基 酸来改变VH结构域，如那些描述于SEQIDN0:1和SEQIDN0:3的结构域。改变的结构 域可与如描述于SEQIDN0 :2的VL结构域组合，所述VL结构域也可以使用本领域中已知 的方法如本发明所描述方式被改变。测试这些改变了的分子结合IL-6的位点II的能力以 及任选地测试其他需要的特性如与参考分子相比增加的亲和力。在某些情况下，变体VH或 VL结构域可具有1、2、3、4或5个这样的改变（如1、2、3、4或5个氨基酸替换）。
[0097] 本发明的IL_6a可以是结合IL-6的位点II的抗体的片段，只要所述片段包含抗 原结合位点，如能够结合IL-6的位点II的抗原结合位点即可。本发明的抗体片段一般从 参考（亲本）抗体分子获得，如包含SEQIDN0 :1和SEQIDN0 :2或SEQIDN0 :3和SEQ IDNO:2.的抗体分子。可使用本领域中已知的方法如重组DNA、酶切割（如使用胃蛋白酶 或木瓜蛋白酶）、抗体的化学切割（如二硫桥的化学还原）的方式产生抗体片段。包含抗 体抗原结合位点的抗体片段包括，但不限于分子如Fab、Fab'、Fab' -SH、scFv、Fv、dAb、 Fd和二硫键稳定的可变区（dsFv)。可以改造包括一个或多个抗体抗原结合位点的多种其 他抗体，包括例如F(ab'）2、F(ab) 3、双抗体、三链抗体、四链抗体和迷你抗体。抗体分子以 及它们的构建和使用方法的例子描述于Holliger和Hudson，2005，NatBiotechnol23: 1126-1136。结合片段的非限定性的例子是由VL、VH、恒定轻链结构域（CL)和恒定重链结构 域1 (CH1)结构域构成的Fab片段；由VH和CH1结构域构成的Fd片段；由单链抗体（single antibody)的VL和VH结构域构成的Fv片段；由VH或VL结构域构成的dAb片段；分离 的⑶R区；F(ab' )2片段、含有两个连接的Fab片段的二价片段；单链Fv分子（scFv)，其 中VH结构域和VL结构域由肽连接子（linker)连接从而联合两结构域以形成抗原结合位 点；双特异性单链Fv二聚体（如公开于W0 1993/011161)以及使用基因融合（如公开于 W094/13804)构建的多价或双特异性片段的双抗体。可通过渗入连接VH和VL结构域的二 硫桥来稳定Fv、scFv或双抗体。还可以使用包含scFv连接到CH3结构域的迷你抗体作为 IL_6a。其他可用作IL_6a的抗体的片段和衍生物包括Fab'，其通过在重链CH1结构域的 羧基末端添加数个氨基酸残基（包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸）而不同于Fab片 段，以及包括恒定区的半胱氨酸分子带有一个游离巯基的Fab' -SH。
[0098] 在一些情况下，IL_6a是抗体片段，其已被化学修饰以增强或引入需要的特性，如 PEG化或以增加半衰期或整合。
[0099]dAb(结构域抗体）是抗体的小单体抗原结合片段（抗体重链或轻链的可变区。VH dAbs天然发生于骆驼科动物中（例如 骆驼和美洲驼）并能通过用靶抗原免疫骆驼类动物、 分离抗原特异性B细胞和直接从单个B细胞中克隆dAb基因的方式产生。本发明的IL-6a 可以是包含大体上本发明中VH或VL结构域的dAb，或包含大体上本发明中的一组⑶Rs的 VH或VL结构域。
[0100] 本发明的抗体包括双特异性抗体，该抗体的两个不同的结构域被组合到相同分子 中。可将IL-6a作为双特异性抗体的一部分渗入，所述抗体可使用本领域已知方法制备，例 如化学制备或从杂交瘤制备。该分子可以是前文已讨论过的类型的双特异性抗体片段。产 生双特异性抗体的方法的一个非限制性的例子是BiTETM技术，该技术中可使用具有不同 特异性的两个抗体的结合结构域并通过短的柔性肽直接连接。这将两抗体组合成一个短的 单肽链。可不使用Fc区而仅使用可变结构域来构建双抗体和scFv，这潜在地减轻了抗独特 型反应。双特异性抗体可构建为整个IgG、构建为双特异性Fab' 2、构建为Fab'PEG、构建 为双抗体或构建为其他双特异性scFv。此外，两种双特异性抗体可利用本领域中已知的常 规方法进行连接以形成四价抗体。
[0101] 双特异性双抗体，与双特异性完全抗体相对，是有用的，在某种程度上是因为它们 能够被构建并在大肠杆菌中并表达。可从文库中使用噬菌体展示（W0 1994/13804)容易地 选择出合适的结合特异性的双抗体（以及许多其他多肽，如抗体片段）。如果保持双抗体的 一个臂恒定，例如，直接针对IL-6的位点II的特异性，则可以产生其他臂可变的文库，从而 选择合适特异性的抗体。
[0102] 双特异性全抗体可通过其他描述于W0 1996/27011、W0 1998/50431和W0 2006/028936的改造工程化方法制备。
[0103] 在某些情况下，本发明的IL-6a在非抗体分子中包含抗原结合位点，例如，通过合 并一个或多个CDRs，如在非抗体蛋白骨架中的一组CDRs，将在下文中进一步讨论。在某些 情况下，CDRs被合并到非抗体的骨架中。可通过在非抗体蛋白骨架（如纤连蛋白或细胞 色素B)上排列CDRs来提供IL-6的位点II的结合位点，或通过随机或突变蛋白骨架内环 (loop)的氨基酸残基来赋予对IL-6的位点II的结合特异性。用于蛋白中工程化的新的 结合位点的骨架是现有技术已知的。例如用于抗体模拟物的蛋白骨架在W0200034784被 公开，其描述了包括具有至少一个随机化的环的纤连蛋白III型结构域的蛋白（抗体模拟 物）。任何免疫球蛋白超家族的结构域成员可提供适合于移植入一个或多个CDRs，如一组 HCDRs的骨架。骨架可以是人或非人蛋白。非抗体蛋白骨架的优势在于其可以在骨架分子 中提供抗原结合位点，所述骨架分子至少比一些抗体分子更小和/或更易制备。小尺寸的 结合成员可带来有用的生理特性，如进入细胞的能力、深度穿透组织或到达其他结构内的 靶位，或结合靶抗原蛋白穴的能力。典型的是具有稳定主链和一个或多个可变环的蛋白质， 在可变环中一个环或多个环的氨基酸序列被特别或随机突变以产生具有结合靶抗原特异 性的抗原结合位点。该蛋白包括来自金黄色葡萄球菌（S.aureus)蛋白质A的IgG结合结 构域、转铁蛋白、四连接素（tetranectin)、纤连蛋白（如第10纤连蛋白的III型结构域） 和脂笼蛋白（lipocalins)以及y-晶体和其他Affilin?骨架（ScilProteins，Halle， Germany)。其他方法的例子包括合成的微体，其基于环肽（cyclotides) -具有分子内二 硫键的小蛋白（如Versabodies?，AmunixInc.，MountainView，CA)和销蛋白重复蛋白 (DARPins，如来自MolecularPartnersAG，Zurich-Schlieren，Switzerland)。这些蛋白 也包括小的，改造的蛋白结构域，如，免疫结构域（参见例如，美国专利公开第2003/082630 和2003/157561号）。免疫结构域含有抗体的至少一个互补决定区（⑶R)。
[0104]IL_6a可包含额外的氨基酸，如赋予所述分子除结合抗原的能力以外的其他功能 特征的氨基酸。
[0105] 在一些情况下，IL_6a携带一个可检测的标记，或与毒素或靶向部分或酶缀合 (如，通过肽键或连接子）。例如，IL_6a可包含一催化位点（如在酶结构域中）和一抗原 结合位点（如针对IL-6的位点II的结合位点），这样，抗原结合位点与抗原结合并因此靶 向催化位点到IL-6或IL-6/IL-6R复合物。所述催化位点能够，在一些情况下，进一步抑制 IL-6的生物学功能，如通过切割IL-6、IL-6R，或其他与IL-6a/IL-6复合物有关的分子。
[0106] 在一些方面中，本发明包括与参考抗体相比已经被修饰的抗体IL_6a以改变，例 如增加、降低或消除IL-6a的生物学效应。在一个实施例中，Fc区被修饰或用修饰的Fc结 构域替换亲本Fc结构域以改变（与未修饰的亲本相比）修饰的IL_6a的药代动力学。在 一些实施方式中，IL-6a经改造以具有IgG2框架。在其他实施方式中，IgGl或IgG2框架中 的IL-6a具有修饰的Fc，与亲本或其他参考IL-6a相比，所述IL-6a在pH6. 0时增加了结 合亲和力而在PH7. 0时基本上不改变结合亲和力，或Fc结构域被修饰且与亲本或其他参考 IL_6a相比，修饰的IL_6a具有增加的半衰期。
[0107] 在一些实施方式中，抗体IL_6a被修饰以增加补体结合和补体依赖性细胞毒性。 在其他方面中，抗体IL_6a被修饰以增加（与参考抗体相比）抗体激活效应细胞和参与抗 体依赖的细胞毒性（ADCC)的能力。在一些情况下，本发明中所公开的抗体可以被修饰以增 强其激活效应细胞和参与抗体介导的细胞毒性（ADCC)的能力以及增加其补体结合和参与 补体依赖性细胞毒性（CDC)的能力。
[0108] 在一些实施方式中，本发明所公开的抗体被修饰以减小其固定补体和参与补体依 赖性细胞毒性（CDC)的能力。在另一个的实施方式中，抗体被修饰以减小其抗体激活效应 细胞和参与抗体依赖的细胞毒性（ADCC)的能力。在又一实施方式中，本发明所公开的抗体 可以被修饰以减小其激活效应细胞和参与抗体介导的细胞毒性（ADCC)的能力以及减小其 补体结合和参与补体依赖性细胞毒性（CDC)的能力。
[0109]避免频繁地递送IL-6a剂量通常是有利的，例如，当注射递送入眼睛时。为了促进 这一特征，在某些实施方式中，本发明所公开的IL_6a在递送位点如玻璃体的半衰期为至 少4天、例如至少7天、至少9天、至少11天或至少14天。在某些实施方式中，IL_6a的平均 半衰期为至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15 天、16天、17天、18天、19天、20天、25天、30天、40天、50天或60天。增加抗体半衰期的方 法是本领域中已知的，例如描述于美国专利第6, 277, 375号和国际公开第W0 1998/23289 号和第W0 1997/3461号。在一些实施方式中，IL-6a在靶向递送位点如玻璃体的半衰期大 于全身半衰期，如血液、血浆、淋巴、肝、肾或其他组织或体液中的半衰期）。
[0110] 在其他实施方式中，本发明提供了一种包括容器的制造品。所述容器包括含有本 发明所公开的IL_6a的组合物，以及指示该组合物可用于治疗IL-6相关病症的包装说明书 或标签。一般地，该组合物是包含IL-6a和药学上可接受的赋形剂的组合物。
[0111] 在一些情况下，本发明是含有包含本发明所公开的IL-6a的组合物以及指示施用 者向需要治疗的受试者施用所述组合物的说明的试剂盒。
[0112] 在需要大的IL_6a的实施方式中，例如增强IL_6a位于或在递送位点附近的保留， 增加大小但不显著地对IL-6a的功能（如对IL-6或IL-6/IL-6R复合物的结合亲和力）产 生不利影响的部分可与IL_6a联合。例如可基因工程化Fab以表达含Fab和Fc部分的单 个多肽。
[0113] 在需要相对小尺寸的IL_6a的实施方式中，可使用IL-6的抗体或片段，例如scFv 或Fab片段。IgG抗体的大小约为150kD，Fab约为50kD，而scFv约为25kD。在一些实施 方式中，本发明所描述的IL-6a的大小小于约50kD。这种拮抗剂可以是，例如，小于或等于 50kD并大于10kD、小于或等于50kD并大于20kD、小于或等于50kD并大于25kD。
[0114] 在一些情况下，通过制造变体来提高IL-6诘抗剂（如具有二硫键的抗体或其他抑 制剂）的稳定性，其中该变体的一个或多个二硫桥比亲本分子的更为稳定。
[0115] 本发明所描述的某些IL_6a分子的其他优势可以是有效的分子的可用性，所述有 效的分子具有合适的递送方式、递送位点或活性模式的大小。例如，Fab形式的IL_6a可用 于局部应用。改造该分子的方法在本发明中所描述并且是本领域已知的。
[0116] 适应症/IL-6相关疾病
[0117]可用本发明的IL_6a治疗的疾病包括这些疾病，在这些疾病中升高的IL-6与疾病 状态相关或作为疾病状态的先决条件。这样的疾病包括由IL-6驱动的导致血管发生和炎 症的疾病病理。这包括与正常水平相比升高的IL-6,例如玻璃体中IL-6升高的疾病（如糖 尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病和葡萄膜炎）或眼组织中IL-6升高的疾病。某些眼病 的例子包括但不限于干眼综合症、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性（AMD)、增生型糖尿病视 网膜病变（PDR)、糖尿病黄斑水肿（DME)、视网膜静脉阻塞（RV0)、视神经脊髓炎（NM0)。可 以治疗的其它眼疾病包括那些由外伤引起眼病，如角膜移植、角膜擦伤，或其他对眼睛造成 的该类物理伤害。因此，本发明包括使用本发明所描述的IL-6a治疗患有IL-6相关疾病的 受试者的方法。在一些实施方式中，受试者的治疗还包括确定受试者是否患有IL-6相关疾 病，和任选地，患者是否抵抗其他非IL-6抑制治疗，如类固醇或抗VEGF治疗。
[0118] 某些基于抗体治疗的一个问题在于抗体在特定位置如眼睛，例如在玻璃体中，是 有效的，但全身施用会导致副作用。一种解决方案是提供一种如本发明所述的分子为例 的治疗剂，相对于全身递送，该治疗剂可以局部递送。由于一些局部递送的（如递送到 玻璃体中）的治疗剂在一定程度上会出现全身递送，因此设计将具有相对快的全身清除 (systemicturnover)的分子是有利的。申请人已经设计了该分子的一个例子；一种被设 计为例如与亲本分子或参考抗体相比能快速全身清除的IL_6a抗体。这是通过修饰分子的 FcRn结合以减少FcRn介导的IL-6a的循环来实现的。这种设计（如减少FcRn循环）的进 一步的优点在于可以通过降低随着IVT施用抗体从玻璃体的流出提高其在玻璃体中的停 留。因此，在一些实施方式中，具有低FcRn结合的IL-6a能够降低给药频率。
[0119] 糖尿病黄斑水肿（DME)。糖尿病黄斑水肿（DME)参与视网膜血管的阻塞和渗漏，造 成视力下降和潜在的失明。对DME的标准治疗方法包括局部施用类固醇或抗VEGF抗体。然 而很多病人对这些疗法是难治的。糖尿病黄斑水肿的发病机理涉及血管发生、炎症和氧化 应激。IL-6由缺氧和高血糖诱导并能增加血管炎症、血管通透性和病理性血管发生。IL-6 可直接诱导VEGF的表达并能在动物模型中促进脉络膜血管新生。在DME患者中，眼睛的 IL-6水平与黄斑厚度和疾病的严重程度正相关。IL-6水平被报道在抗VEGF疗法失败的患 者中升高而在抗VEGF响应的患者中降低。因此，施用本发明所描述的IL-6a与抗VEGF治 疗剂组合来治疗糖尿病患者或作为抗VEGF治疗的替代（包括那些对抗VEGF治疗不响应的 患者）是有用的。用IL_6a治疗黄斑水肿还可通过去除完全抑制任何一种机制以抑制病症 的需求来提高其安全性，从而保留了各细胞因子的一些需要的生理作用。因此，局部IL_6a 治疗与VEGF抑制相组合能够降低给药频率并减轻治疗的副作用。
[0120] 在DME中，玻璃体IL-6水平与疾病严重程度和VEGF难治的受试者两者正相关。 因此本发明所记载的IL-6a可用于治疗对类固醇疗法、抗VEGF疗法或两者难治的DME受试 者。在一些情况下，IL-6a与抗VEGF疗法或类固醇疗法组合使用，如治疗DME。
[0121] 本发明所记载的IL_6a还可用于治疗病症例如癌症，如前列腺癌（prostate cancer)、白血病（leukemia)、多发性骨髓瘤（multiplemyeloma)，炎性病（如慢性炎 症增生疾病（chronicinflammatoryproliferativediseases))和自身免疫性疾 病（autoimmunedisease)，如类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis)、卡斯尔曼病 (Castleman'sdisease)(巨大或血管滤泡淋巴结增生（giantorangiofollicular lymphnodehyperplasia)、淋巴错构瘤（lymphoidhamartoma)，血管滤泡性淋巴结增生 (angiofollicularlymphnodehyperplasia))、幼年特发性关节炎（juvenileidiopathic arthritis)(包括多关节幼年特发性关节炎（polyarticularjuvenileidiopathic arthritis)和系统性幼年特发性关节炎（systemicjuvenileidiopathicarthritis))、 斯蒂尔病（Still'sdisease)(包括幼年特发性关节炎（juvenileidiopathic arthritis)和成年型斯蒂尔病（adultonsetStill'sdisease))、成年型斯蒂尔病（adult onsetStill'sdisease)、淀粉样蛋白A淀粉样变性病（amyloidAamyloidosis)、风 湿性多肌痛（polymyalgiarheumatica)、缓解性血清阴性对称性滑膜炎伴凹陷性水肿 (remittingseronegativesymmetricalsynovitiswithpittingedema)、脊椎关节炎 (spondyloarthritides)、白塞氏病（Behget'Sdisease)(包括治疗眼部表现（ocular manifestations)的治疗）、动脉粥样硬化（atherosclerosis)、银肩病（psoriasis)、系统 性红斑狼疮（systemiclupuserythematosis)、多发性肌炎（polymyositis)(炎症性肌病 inflammatorymyopathy)、复发性多软骨炎（relapsingpolychondritis)、获得性血友病 A(acquiredhemophiliaA)，多发性硬化症（multiplesclerosis)，炎症性贫血（anemia ofinflammation)，和克罗恩病（Crohn'sdisease)。
[0122] IL-6拮抗剂还可用于治疗某些神经疾病，例如抑郁症和阿尔茨海默氏病。
[0123] 可用本发明中所记载的IL_6a治疗其他疾病，包括但不限于全身性硬化症 (systemicsclerosis)、多发性大动脉炎（Takayasuarteritis)、巨细胞性动脉炎（giant cellarteritis)、移植物抗宿主病（graftversushostdisease)、与肿瘤坏死因子受体相 关周期性综合症（TNF-receptor-associatedperiodicsyndromeTRAPS) 〇
[0124] 剂量
[0125] 可将IL-6抗体或其片段施用给受试者（如患者），所述受试者表达，例如异常的 高水平的IL-6。抗体或其片段可一次施用，或可多次施用。可施用抗体，例如，从每天三次 到每六个月一次或更久。可以按计划施用如每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、 每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次和每六个月一 次。抗体或片段可经由迷你泵或其他途径如可植入的缓释胶裳或通过生产抗体或其片段的 细胞持续施用。抗体或其片段可经由粘膜、□腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌内、肠胃外、目艮 内或肿瘤内途径给药。抗体或其片段可施用一次、至少两次或在至少病症被治疗、减轻或治 愈的时间段内施用。一般将施用抗体或其片段，只要病症存在。抗体或其片段，一般将其作 为本发明所描述的药物组合物的一部分施用。抗体的剂量一般将在〇. 1到l〇〇mg/kg、0. 5到 50mg/kg，、1到20mg/kg和1到10mg/kg的范围内。可通过任何合适的方法测量抗体或其片 段的血清浓度。本发明所描述的某些化合物的一个特征在于它们需要相对不频繁的给药， 例如每周一次、每周两次、每周三次、每四周一次、每两周一次、每8周一次、每12周一次、每 16周一次、每32周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次。在一些 情况下，在需要的基础上，确定（例如通过受试者的状态）化合物的施用。本发明所描述的 允许相对不频繁给药的IL-6诘抗剂的一个特征在于将高效力（至少部分是通过一旦结合 到IL-6则具有慢解离速率实现的）和递送相对高浓度的化合物的能力相组合。
[0126] 在一些情况下，IL_6a作为单一疗法施用。在其他实施方式中，IL_6a与甲氨蝶呤 或其它疾病改善抗关节炎药物同时施用。
[0127] 抗体的产生
[0128] 可使用本领域已知方法如单克隆抗体方法学（如，参见Kohlerand Milstein(1975)Nature256:495)生产抗体IL-6a或其衍生物或片段。还可采用其他制造 单克隆抗体的技术如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。
[0129] 可基于使用本领域已知方法制备的小鼠单克隆抗体制备嵌合或人源化抗体。编码 重链和轻链免疫球蛋白的DNA可从感兴趣的小鼠杂交瘤中获得，以及所述DNA可使用标准 分子生物学技术改造以包含非小鼠（如人）的免疫球蛋白序列。例如，为了制备嵌合抗体， 可使用本领域已知技术（参见例如美国专利第4, 816, 567号）将小鼠可变区与人恒定区相 连接。为了制造人源化抗体，可使用本领域已知技术（参见例如美国专利第5, 225, 539号 和第5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762号；和第6, 180, 370号）将小鼠CDR区插入人框架。
[0130] 在实施方式中，本发明所描述的IL_6a(如抗IL-6抗体或其衍生物或片段）能够 特异地结合人IL-6。在实施方式中，IL-6a能够特异地结合IL-6的位点II(如人IL-6的 位点II)。
[0131] 在一些实施方式中，IL_6a抗体是人单克隆抗体。该抗体可使用包含部分人免 疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生。这些转基因和转染色体小鼠包括 本发明中分别称之为HuMAbMouse?和KMMouse?的小鼠，并在本发明中统称为"人 Ig小鼠"（参见美国专利号 5, 545, 806 ;5, 569, 825 ;5, 625, 126 ;5, 633, 425 ;5, 789, 650 ; 5, 877, 397 ;5, 661，016 ;5, 814, 318 ;5, 874, 299 和 5, 770, 429 号；美国专利号 5, 545, 807 ; PCT公开号WO92/03918，W0 93/12227，W0 94/25585，W0 97/13852，W0 98/24884 和W0 99/45962 ;和PCT公开号WO01/14424 号）。
[0132] 在其他方面中，可使用在转基因或转染色体中携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如 携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来生产人抗IL-6抗体。这类小鼠在PCT公开 号W0 02/43478中详细描述。
[0133] 其他表达人免疫球蛋白基因的转基因动物系统是本领域可获得的，且能被用于生 产抗体IL_6a。例如可使用称作Xenomouse?(Abgenix，Inc.)的备选转基因系统；此类小 鼠被描述于例如美国专利号 5, 939, 598 ;6, 075, 181 ;6, 114, 598 ;6, 150, 584 ;和 6, 162, 963 中。此外，表达人免疫球蛋白基因的转染色体动物系统是本领域可获得的，并可用于生产抗 体IL-6a。例如携带人重链转染色体和人轻链转染色体两者的小鼠被描述于Tomizuka等 中（2000，ProcNatlAcadSciUSA97 :722-727)。还可以使用SCID小鼠制备人单克隆抗 体，其中在该小鼠中重建了人免疫细胞从而可以通过免疫接种来产生人抗体应答。此类小 鼠被描述于例如美国专利号5, 476, 996和5, 698, 767中。
[0134] 噬菌体展示文库
[0135] 在一些情况下，抗体IL_6a抗体或其衍生物或片段是在使用噬菌体合成人抗体文 库、用IL_6(例如人IL-6)或其片段筛选所述文库、分离结合IL-6的噬菌体以及从所述噬 菌体获得抗体的方法中产生的。
[0136] 还可以通过筛选重组组合抗体文库来分离重组人抗体IL_6a。一般来说，所述文 库是scFv噬菌体文库，该文库是用人VL和VHcDNAs(从分离自B细胞的mRNA中制备）产 生的。制备和筛选这类文库是本领域已知的。用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是商业上 可获得的（如Pharmacia公司的重组菌体抗体系统，目录号27-9400-01 ;和Stratagene SurfZApTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。其他可用于生产和筛选抗体噬菌体文库的 方法和试剂是本领域已知的（参见，例如美国专利号5, 223, 409 ;PCT公开号W0 92/18619、 TO91/17271、TO92/20791、TO92/15679、TO93/01288、TO92/01047、TO92/09690; Fuchs等，Bio/Technology9:1370-1372(1991);Hay等，HumAntibodHybridomas3: 81-85(1992);Huse等，Science246:1275-1281 (1989);McCaffert等，Nature348: 552-554(1990);Griffiths等，EMB0J12 :725-734(1993);Hawkinsetal.，JMolBiol 226 :889-896 (1992);Clackson等，Nature352 :624-628 (1991);Gram等，ProcNatl AcadSciUSA89:3576-3580(1992);Garrad等，Bio/Technology9:1373-1377(1991); Hoogenboom等，NucAcidRes19:4133-4137(1991);和Barbas等，ProcNatlAcadSci USA88 :7978-7982(1991)，作为参考全部并入本文。
[0137] 在一个分离和生产具有所需要特征的IL-6抗体的例子中，首先用人IL-6抗体， 使用表位印迹法来选择相似IL-6结合能力的重链和轻链序列，所述方法描述于PCT公开 号TO93/06213中，作为参考并入本文。这一方法中所使用的抗体文库一般为scFv文 库，该文库的制备和筛选描述于PCT公开号W0 92/01047 ;McCafferty等，Nature348 : 552-554(1990);andGriffiths等，EMBOJ12:725-734(1993)，作为参考全部并入本文。
[0138] 一旦选择了初始人VL和VH结构域，就进行"混合并匹配"实验，在该实验中筛选 不同对的初始选择的VL和VH片段的IL-6结合能力以选择优选的VL/VH对组合物。为了 选择IL-6a所需要的特征，可随机突变所选对的VL和/或VH片段。这种体外亲和成熟例 如可通过使用与所选择的VH和VL结构域的一个或两者的CDR互补的PCR引物扩增VH和 VL结构域的方式实现，其中所述引物包含在某些位点的四个核苷酸碱基的随机组合，从而 所产生的PCR产物编码引入了随机突变的VH和/或VL的片 段。这类随机突变的VH和VL 片段可被用来筛选IL-6的结合片段，例如IL-6的位点II的结合片段。
[0139] 在从重组的免疫球蛋白展示文库中筛选和分离抗体IL_6a后，可从展示包装 (display package)(例如从菌体基因组）回收编码选择的抗体的核酸，并通过本领域已 知的重组DNA技术将其亚克隆入其他表达载体。可对这类抗体进一步操作以产生抗体片 段，如那些在本发明中记载的抗体片段。
[0M0] 药代动力学（PK)
[0141] 可使用本领域已知方法进行PK测试。需要使用动物进行测定例如测定PK的一个 障碍在于人类的IL-6与那些通常用于此类测试的一些动物的IL-6具有小于50%的同源 性。因此测试PK的一种方法是使用表达人IL-6的转基因小鼠。在一些实施方式中，使用 非人灵长类动物来测定PK。
[0142] 在一些实施方式中，抗IL-6抗体是突变的以改变其PK，例如通过改变FcRn结合的 pH敏感性而改变其PK。获得这类突变的方法记载于实施例中。因此，在一些实施方式中， 与亲本IL_6a或参考分子相比，所述IL_6a具有改变的全身PK(systemicPK)。在一些情况 下，PK在玻璃体中是不改变的或是改善的。在一些实施方式中，与亲本IL-6a或参考分子 相比，IL-6a在玻璃体中具有相同或增加的PK(如增加的半衰期）以及减少的全身PK(例 如在循环液如血液、血浆、淋巴液、血清、肝脏、肾脏、其它组织或其他体液中测定的）。
[0143] 用于测试IL-6拮抗剂的模型
[0144] 可在疾病模型中测试IL-6拮抗剂的IL-6相关递送，特别是测试治疗效果和有 限的针对IL-6有利特性的副作用。例如可以在大鼠或小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎 模型中，使用在完全弗氏佐剂（CFA)中的感光细胞间受体视黄醇类结合蛋白（IRBP)免疫 接种来测试葡萄膜炎（Caspi，InvestOphthalmolVisSci52:1873;Agarwal等，900: 443-69, 2012)。其他模型包括那些本领域中已知的树突状细胞诱导的葡萄膜炎、培养的 效应T细胞的过继转移、在IRBPTcRTg小鼠中的自发EAU、内毒素诱导的葡萄膜炎、自 身免疫性葡萄膜视网膜炎（Haruta等，InvestOphthalmolVisSci53:3264(2011); Yoshimura等，Rheumatology48:347-354(2009))。其他能够用于测定IL_6a疾病效果 的模型系统有例如，脉络膜新生血管（CNV)模型（Izumi-Nagai等，AmJPathol170: 6(2007);Krzystolik等，ArchOphthalmol120:338(2002))和糖尿病模型如那些描述于 Kern等（AnimalModelsOfDiabeticComplicationsConsortium(P01DK57733)，Update Report(September2001-January2004)的模型。用于测试IL_6a在类风湿关节炎中的 动物模型是本领域已知的，例如参见Asquith等（EurJImmunol39 :2040_4(2009))and Kollias等（AnnRheumDis70:1357-62(2011)。
[0145] 联合疗法
[0146] 在一些实施方式中，将IL_6a与第二治疗性实体（therapeuticentity)组合施 用。例如在包括VEGF抑制剂如ranidizumab的治疗方案中施用IL-6a。在一些实施方式 中，在包括TOGF抑制剂的治疗方案中施用IL-6a，其中所述TOGF抑制剂如抗TOGF抗体或抗 H)GF受体抗体（如伊马替尼）。
[0147]IL-6拮抗剂的递送
[0148]IL-6拮抗剂可局部递送，直接接触或邻近进行IL-6抑制的靶细胞或组织。这种递 送方法的非限制性的实例包括注射、输液或植入含有IL-6拮抗剂的物质。
[0149] 在一些实施方式中，IL_6a组合物作为眼用制剂施用。该方法可包括施用IL_6a组 合物和眼可接受的载体。在某些实施方式中，眼用制剂是液体、半固体、插入物（insert)、 膜、微粒或纳米颗粒。
[0150] 在一些实施方式中，IL_6a组合物被配制用于局部给药，如眼睛给药。所述局部制 剂可以是液体制剂或半固体，例如，局部制剂可以包括水溶液、水性悬浮液、软膏或凝胶。眼 用的IL_6a的制剂可以局部施用于眼睛的前部、上眼睑下，下眼睑上和在cul-de-sac内。 一般地，眼用制剂是无菌的。IL_6a眼用制剂可含有适于眼用制剂的制备的一种或多种药 物赋形剂。这些赋形剂的例子为防腐剂、缓冲剂、螯合剂、抗氧化剂和用于调节渗透压的盐。 包括软膏剂和悬浮液的眼用制剂一般具有适合于所选的施用路径的粘度。在一些实施方式 中，眼用制剂具有从约1，〇〇〇至约30, 000厘泊的粘度。
[0151] 在一些实施方式中，所述制剂是一种包含聚合物的液体制剂。这类聚合物可用于 改善的生物利用度、提高粘度或降低液体制剂从眼睛中排出。合适的聚合物包括但不限于， 在Wagh等人（AsianJPharm，2:12-17,2008)描述的那些聚合物。在非限制性的例子中， 聚合物是透明质酸酶的钠盐、壳多糖、环糊精（如羟丙基0环糊精）、聚半乳糖醛酸、木葡 聚糖、黄原胶、结冷胶、硫醇化聚合物、聚（原酸醋）（如Einmahl，AdvDrugDelivRev53 : 45_73,2001)或罗望子种子多糖（如，Ghelardi等，AntimicrobAgentsChemother48 : 3396-3401，2004)。
[0152] 在一些实施方式中，包含用于眼部递送的IL_6a制剂可含有一种或多种的表面活 性剂、辅助剂，佐剂、抗氧化剂、张力调节剂、防腐剂（如EDTA、BAK(苯扎氯铵）、亚氯酸钠、 过硼酸钠、聚季按盐-1 (P〇lyquaterium-l))、增稠剂或粘度调节剂（如羧甲基纤维素、轻甲 基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、乙二醇400、丙二醇羟甲基纤维素、羟丙基瓜耳豆胶、透明质 酸和羟丙基纤维素）等。制剂中的添加剂可以包括，但不限于，氯化钠、碳酸氢钠、山梨酸、 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定（chlorhexidine)、蓖麻油和过硼酸钠。
[0153] 在一些实施方式中，纯水或去离子水可用于组合物中。可通过添加任何生理和眼 用可接受的pH调节的酸、碱或缓冲剂将pH调节至约5. 0至8. 5的范围内，如pH7. 0、pH7. 3、 pH7. 4或pH7. 5。眼用可接受的酸的例子包括乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、盐酸等，碱的 例子包括氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠、氨基丁三醇、三羟基甲基氨 基甲烷等。可用于制剂的盐和缓冲液的例子包括柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠、氯化铵以及 上述酸和碱的混合物。
[0154] 在一些实施方式中，眼用组合物的渗透压可以为约10毫渗透摩尔 (milliosmolar) (mOsM)至约 400m0sM，例如 200 至 400m0sM或 220 至 370m0sM。通常，可 以用生理上和眼科可接受的盐或赋形剂来调节渗透压。在一些实施方式中，制剂中包括氯 化钠，例如，氯化钠存在于制剂中的浓度按重量计为0. 01 %至1 %或按重量计为0. 05%至 0. 45%，基于组合物的总重量。还可使用由一种或多种等量的由阳离子（如钾，铵等）和阴 离子（如氯离子，柠檬酸根，抗坏血酸根，硼酸根，磷酸根，碳酸氢根，硫酸根，硫代硫酸根， 硫酸氢盐，硫酸氢钠，硫酸铵等）组成的盐与氯化钠一同或替代氯化钠以实现在需要的范 围内的渗透压。在一些实施方式中，还可使用糖，如甘露糖醇，右旋糖，山梨糖醇，葡萄糖等， 来调节渗透压。
[0155]在一些实施方式中，所述方法包括形成或提供与眼外表面接触的药剂的储库(depotoftheagent)。储库指的是试剂的供给源，所述储库不会被泪液或其他眼部清除 机制除去。这允许通过单次应用，连续、持续高浓度的药剂存在于眼睛外表面的流体中。在 一些实施方式中，储库可以保持多达八个小时以上。在一些实施方式中，眼储库制剂包括但 不限于，聚合物水性悬浮液、软膏和固体插入物（solidinserts)。
[0156]在一些实施方式中，半固体组合物是一种施用到眼时增加粘度的液体制剂，所述 粘度通常是由于液体制剂中存在聚合物，随着温度、pH或电解质浓度的变化粘度有所增加。 聚合物可以是例如，乙酰基邻苯二甲酸纤维素（celluloseacetophthalate)、聚丙稀酸，结 冷胶，透明质酸酶，壳多糖，藻酸盐（如藻酸钠）或环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物（如， 普鲁兰尼克?,BASF;泊洛沙姆）。在一些实施方式中，聚丙烯酸是交联的丙烯酸（如， 卡波姆? )。在一些实施方式中，半固体组合物含有卡波姆以及环氧乙烷和环氧丙烷的嵌 段共聚物的混合物；甲基纤维素和羟乙基纤维素的混合物；或聚乙二醇以及环氧乙烷和环 氧丙烷的嵌段共聚物的混合物。
[0157]在一些实施方式中，包含IL_6a的眼用制剂是软膏或凝胶。在一些实施方式中，眼 用制剂是油基递送载体。例如，制剂可包含加入IL_6a组合物（如在0.1 %至2%)的石油 或羊毛脂基载体和赋形剂。常见的基质（base)包括但不限于矿物油、矿脂及其组合。在一 些实施方式中，软膏作为条带（ribbon)施用至下眼睑。
[0158]在一些实施方式中，眼用组合物是眼用插入物（insert)。例如所述眼用插入 物是生物学惰性的、柔软的、生物可腐蚀的、粘弹性的（viscoelastic)、暴露于治疗剂后 稳定灭菌的、对空气传播细菌感染抗性的、生物可腐蚀的、生物相容的和/或粘弹性的 (viscoelastic)。在一些实施方式中，插入物包含眼用可接受的基质，例如，聚合物基质。所 述基质一般是一种聚合物，且IL_6a组合物分散在基质内或结合到聚合物基质。在一些实 施方式中，药剂从基质通过溶解或水解共价键而缓慢释放。在一些实施方式中，聚合物是生 物可腐蚀（溶解）的，且其溶解速度可控制分散在聚合物基质中药剂的释放速度。在另一 种形式中，聚合物基质是可生物降解的聚合物，该聚合物例如通过水解而分解，从而释放出 与其结合或分散在其中的药剂。在进一步的实施方式中，可用另外的聚合物包衣包围基质 和药剂以进一步控制释放。在一些实施方式中，插入物包含可生物降解的聚合物，如聚己内 酯（PCL)、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物（EVA)、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨酯、尼龙或聚DL-丙 交酯-共-乙交酯）（PLGA)或任意这些的共聚物。在一些情况下，药剂被分散到基质材料 或分散在单体组合物中，所述单体组合物用于在聚合前制造基质材料。在一些实施方式中， 药剂的量为约〇. 1至约50%或从约2至约20%。可使用可生物可降解的或生物可腐蚀的 聚合物基质，从而不必从眼睛中移除过的插入物。随着生物可降解或生物可腐蚀聚合物的 降解或溶解，所述药剂得以释放。
[0159] 在进一步的实施方式中，眼用插入物包含一种聚合物，包括但不限于，那些在 ffagh,等，"Polymersusedinoculardosageformanddrugdeliverysystems"， AsianJ.Pharm.，pages12-17(January2008)中记载的聚合物，通过全文引用并入本文。 在一些实施方式中，插入物包含聚合物，所述聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、丙烯酸酯 或甲基丙烯酸酯聚合物或共聚物（如，来自Rohm或Degussa盼EUDRAGIT?:聚合物家 族）、羟甲基纤维素、聚丙烯酸、聚（酰氨基胺）树枝状聚合物、聚（二甲基硅氧烷）、聚环氧 乙烷、聚（丙交酯共乙交酯）、聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）、聚乙烯基醇）或聚（丙烯富马 酸酯）。在一些实施方式中，插入物是450kDa的半胱氨酸-聚丙烯酸缀合物。
[0160] 插入物可包括含有IL_6a组合物的芯（core)和外套管（如描述于美国专利公开 第20040009222号中）。在一些情况下，外管对药物可以是渗透性的，半渗透性的或不渗透 的。在一些实施方式中，芯包括对IL-6a组合物的释放速度不产生显著影响的聚合物基质。 在一些情况下，外套管、芯的聚合物基质或两者是生物可腐蚀的。共挤出产品（co-extruded product)可分割为（segmentedinto)药物递送装置。在一些实施方式中，所述装置是未包 被的以使各自的端部是开放的，或所述装置用例如膜（layer)包被，所述膜对IL_6a组合物 是可渗透的、对IL_6a组合物是半渗透的或生物可腐蚀的。在某些实施方式中，IL_6a组合 物和至少一种聚合物以粉末形式混合。
[0161] 在一些实施方式中，眼用组合物是眼用膜。适合于此类膜的聚合物包括但不限 于那些描述于Wagh等（同前）的聚合物。在一些实施方式中，所述膜是软性隐形眼镜 (soft-contractlens)，例如由N，N-二乙基丙稀酰胺和与乙二醇二甲基交联的甲基丙稀酸 的共聚物组成的眼镜。
[0162] 在某些实施方式中，IL_6a位于管状的插入物中，且可以是分割的（segmented)。
[0163] 在一些实施方式中，IL_6a组合物被配制为治疗有效量，由聚合物基质包被的或 分在聚合物基质中，使得IL_6a组合物为粒状或颗粒形式。在一些实施方式中，当颗粒中 的药物溶解到或在基质中，沿基质扩散，并被释放到周围生理性液体中时，IL_6a组合物 从配置物中释放出来。在一些实施方式中，释放速率主要受IL_6a组合物从颗粒/微粒 溶解到基质中的速率的限制；沿基质扩散和分散到周围液体中的步骤不是主要的释放速 率限制因素。在某些实施方式中，聚合物基质是非生物可腐蚀的，而在其他实施方式中其 是可生物腐蚀的。示例性的可形成非生物可腐蚀聚合物基质可以是聚氨酯、聚硅氧烷、 聚（乙烯-共-乙酸乙烯酯）（EVA)、聚乙烯醇及其衍生物和共聚物。示例性的可形成非 生物可腐蚀聚合物基质可以是聚酐、聚乳酸、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯 (polyalkylcyanoacrylate)及其衍生物和共聚物。
[0164] 在一些情况下，在胶原材料中配制IL_6a组合物。例如，插入物可以是可溶性 眼用药物插入物（如能够被引入到上结膜囊用以药物递送的椭圆形聚合物薄膜；椭圆的 插入物如由乙烯醋酸乙烯酯制成的OCUSERT?(毛果芸香碱眼部治疗系统，由Alza Corporation开发）；Lacrisert?，由纤维素制成的杆状插入物；新型眼科药物输送系统 (NODS)，由聚（乙稀醇）制成；或那些描述于Fabrizio(AdvDrugDelivRev16:95-106， 1998)中的插入物。在一些情况下，插入物包含胶原、明胶或聚合物，其中所述聚合物选自聚 己内酯（PCL)、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物（EVA)、氰基丙烯酸酯、聚氨酯、尼龙、聚（DL-丙交 酯-共-乙交酯（PLGA)或任何这些的共聚物。在一些情况下，在上眼睑下植入插入物。在 一些情况下，插入物被植入到在眼睛的后段、脉络膜空间或巩膜内。在一些实施方式中，在 玻璃体内或视网膜下植入插入物。
[0165] 在一些实施方式中，视网膜下注射插入物。施用的方法和插入物的制备技术阐述 于Remington's：ThePracticeofScienceofPharmacy,20thedition(Lippincott Williams&Wilkins，2006)中，通过引用将其全部并入本发明。
[0166] 在其他实施方式中，包含的IL_6a组合物的插入物提供了药剂到眼睛玻璃体的 持续释放。如本发明所用，"持续释放"是指组合物以受控的方式在延长的时间内释放药 剂。在一些实施方式中，插入物以一种的速率释放药剂，使得在药剂的释放过程中，水中 (aqueousagent)的药剂的浓度持续低于玻璃体中药剂的浓度。在一些实施方式中，水中 (aqueousagent)的药剂的浓度为从约 0? 002yg/mL到约 0? 01yg/mL或从约 0? 01yg/mL， 到约0. 05yg/mL或到低于约0. 05yg/mL。在一些实施方式中，以约1yg/天到约50yg/ 天，或从1yg/天到约10yg/天的速率释放药剂。在一些实施方式中，插入物还包含如上 文详述的额外的治疗剂，例如氟轻松（如存在于眼部插入物Retisert?中）。
[0167] 在一些实施方式中，眼用组合物包含微球或纳米颗粒。在一些实施方式中，所述微 球包含明胶。在一些实施方式中，微球被注射到眼睛的后段、脉络膜空间或巩膜内。在一些 实施方式中，微球或纳米颗粒包含聚合物，包括但不限于那些在Wagh，等（AsianJPharm 2:12-17,2008)中描述的聚合物。在一些实施方式中，聚合物是壳多糖、聚羧酸，如聚丙烯 酸、白蛋白颗粒、透明质酸酯、聚衣康酸、聚（丁基）氰基丙烯酸酯、聚己内酯、聚（异丁基） 己内酯、聚（乳酸_共-乙醇酸）或聚（乳酸）。在一些实施方式中，微球或纳米颗粒包含 固体脂质颗粒。
[0168] 在一些实施方式中，IL_6a组合物包含离子交换树脂。在一些实施方式中，离子交 换树脂是无机沸石树脂或合成的有机树脂。在一些实施方式中，离子交换树脂包括但不限 于Wagh等中描述的树脂（同上），通过引用将其全部并入本发明。在一些实施方式中，离子 交换树脂为部分中和的聚丙烯酸。
[0169] 可以在水性聚合物悬液中提供IL_6a组合物。在一些实施方式中，IL_6a组合物或 聚合物悬液悬浮于水性介质（如具有前文所述特性的水性水性介质）中。聚合悬浮试剂的 例子包括，但不限于，葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝胶、介尔雷特?、纤维素 聚合物如羟丙基甲基纤维素和含羧基的聚合物，如丙烯酸的聚合物或共聚物，以及其它聚 合物缓和剂（polymericdemulcents)。在一些实施方式中，该聚合物缓和剂是水可溶胀的、 水不溶性聚合物，特别是交联的含羧基的聚合物。在一些实施方式中，以所存在的单体的总 重量为基准计，该聚合物悬浮剂包含至少约90重量％到约99. 9 %，或约95 %到约99. 9 %的 一种或多种含羧基的单烯属不饱和单体。在一些实施方式中，该含羧基的单烯属不饱和单 体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸、甲基丙烯酸（巴豆酸）、顺式-a-甲基巴豆酸（当 归酸）、反式_a-甲基巴豆酸（a-甲基巴豆酸）、a- 丁基巴豆酸、a-苯基丙烯酸、a-苄 基丙烯酸、a-环己基丙烯酸、苯基丙烯酸（肉桂酸）、香豆酸（邻羟基肉桂酸）以及伞形酸 (对羟基香豆酸）。在一些实施方案中，该聚合物是通过多官能团交联剂（如，双官能的交 联剂）来交联。在一些实施方式中，以所存在的单体的总重量为基准计，该交联剂的含量为 约0. 01%到约5%，或约0. 1%到约5. 0%，或约0. 2%到约1%。在一些实施方式中，该交 联剂是非聚烯基聚醚双官能交联用单体，例如二乙烯基乙二醇、2, 3-二羟基己-1，5二烯、 2, 5-二甲基-1，5-己二烯、二乙烯基苯、N，N-二烯丙基丙烯酰胺、N，N-二烯丙基甲基丙烯 酰胺；每一分子含有两个或更多个烯基醚基团的聚烯基聚醚交联剂，如含有末端H2C=C基 团的烯基醚基团，通过用卤代烯烃如烯丙基溴等将含有至少四个碳原子和至少三个羟基的 多元醇醚化来制备，如聚烯丙基蔗糖，聚烯丙基季戊四醇等；分子量约400到约8000的二烯 属非亲水性大分子交联剂，，例如二醇和多元醇的不溶性二丙烯酸酯和多丙烯酸酯和甲基 丙烯酸酯，由聚酯二醇、聚醚二醇或聚硅氧烷二醇与甲基丙烯酸羟烷基酯衍生的异氰酸酯 终端的预聚物的二异氰酸酯丙烯酸或甲基丙烯酸羟烷基酯反应产物等
[0170] 在一些实施方式中，交联聚合物可由作为唯一存在的单烯属不饱和单体的一种或 多种含羧基的单烯属不饱和单体与一种或多种交联剂制备。在一些实施方式中，聚合物是 其中至多约40%，优选约0%到约20%的一种或多种含羧基的单烯属不饱和单体被一种或 多种不含羧基、仅含生理上和眼科学无害的取代基的单烯属不饱和单体替代的聚合物，所 述单体包括丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，例如甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙 烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯，丙烯酸3-羟丙酯等，乙酸乙烯 酯，N-乙烯基吡咯烷酮等（如Mueller等，美国专利第4, 548, 990号）。在一些实施方式中， 聚合物包括聚卡波非（NoveonAA-l)、Carb〇p〇l?*DuraSite⑧。在一些实施方式中，该 交联聚合物通过使用常规自由基聚合催化剂将单体悬浮或乳液聚合至当量球径不超过约 50ym的干燥粒度来制备。在一些实施方式中，该平均干燥粒度为当量球径约1到约30ym， 或约3约20ym。在一些实施方式中，聚合物颗粒通过将较大的聚合物颗粒机械研磨来获 得。在其他实施方式中，此类聚合物具有约250, 000到约4, 000, 000,以及3, 000, 000, 000到 4, 000, 000, 000的分子量。在其他实施方式中，交联聚合物的颗粒是单分散的，是指它们所 具有的粒度分布应使得至少约80%、约90%或约95%的颗粒落入主粒度分布的ym带内。 在其他实施方式中，单分散粒度是指不超过约20 %，约10 %，或约5 %颗粒的粒度在1ym 以下。在一些实施方式中，聚合物水性悬浮液包括约0. 05到约1%、约0. 1到约0. 5%、或 约0. 1到约0. 5%的治疗剂和约0. 1到约10%、约0. 5到约6. 5%、约0. 5到约2. 0%、约 0. 5%到约1. 2%、约0. 6到约0. 9%、或约0. 6到约0. 8%的聚合物悬浮剂。虽然提到的是 单种，但应该理解，在总量处于规定范围的情况下，可以使用一种或多种聚合物悬浮剂。在 一个实施方式中，不溶性的轻度交联的聚合物颗粒的量、pH和渗透压能够彼此相关，并且 与交联度相关，以提供具有约500到约100, 000厘泊，优选约1，000到约30, 000厘泊或约 1，000到约10, 000厘泊的粘度的组合物，所述粘度使用装有25号芯轴和13R小样品接头的 Brookfield数字LVT粘度计在12rpm和室温（约25°C)下测定。在一些实施方案中，该粘 度为约10到约400厘泊，约10到约200厘泊或约10到约25厘泊。
[0171] 在一些实施方式中，可以配制聚合物水性悬浮液，使得它们在眼中保持与给药于 眼睛之前的粘度相同或基本上相同的粘度。在一些实施方式中，可以配制它们，使得其在 与泪液接触时凝胶化增强。例如，当pH低于约6. 7的含有DumSite?」或其他类似聚丙烯 酸类聚合物的制剂给药于眼睛时，该聚合物在与泪液接触时可能溶胀，因为它具有较高的pH(大约7)。该凝胶化或凝胶化的增强可能导致悬浮颗粒的夹带，从而延长了组合物在眼 睛中的停留时间。在一些实施方式中，随着悬浮颗粒经时溶解，该治疗剂慢慢地释放。在一 些实施方式中，该输送途径增加了患者舒适感，增加了治疗剂与眼组织的接触时间，从而增 加了药物吸收的程度和制剂在眼睛中的作用持续时间。在这些药物输送系统中含有的治疗 剂可以取决于诸如药物本身及其外形、药物加载的程度和系统的pH以及还可能存在的任 何药物输送助剂如与眼表相容的离子交换树脂之类的因素的速率从凝胶中释放。
[0172] 在一些实施方式中，使用基因递送，如局部遗传递送，将IL-6拮抗剂提供给受 试者。这种递送可通过瞬时表达系统递送，一种稳定的（如整合的）表达系统（如由 BluebirdBio(Cambridge，MA)生产的慢病毒递送系统），或在细胞工厂中递送，如那些由 Neurotech(Cumberland，RhodeIsland)所生产的细胞工厂。
[0173] 所有技术特征可以这些特征的所有可能的组合方式单独地组合。
[0174] 等同方案
[0175] 本发明可用其他不违背其精神或主要特征的其他具体形式来体现。前述实施方式 因此在所有方面被认为是说明性的而非对本发明所述发明的限制。 实施例
[0176] 下列非限制性实施例进一步说明了本发明所述的本发明的实施方式。
[0177] 实施例1:在脉络膜新生血管（CNV)模型中验证局部IL-6的阻断
[0178] 为了确定局部IL-6阻断是否能够有效治疗眼睛疾病，例如糖尿病性黄斑水肿 (DME)或湿性AMD，抗IL-6抗体被局部施用到脉络膜新生血管模型系统中。激光诱导的CNV 模型（eyecro.com/in-vivo/laser-induced-choroidal-neovascularization-cnv/)再现 许多DME下的病理过程，包括炎症和血管发生。EyeCR0(0klahomaCity，0K)在大鼠中进行 了研宄。在第〇天时，每组中的6只动物进行双侧激光处理以产生每只眼睛3处损伤。在 第3天和第10天时，将3yg多克隆抗大鼠IL-6抗体（R&DSystemsAF506 ;Minneapolis， MN)玻璃体（IVT)注射到实验组中，而将PBS或抗VEGF多克隆抗体（R&DSystemsAF564) 分别施用到载体和阳性对照组。在第15和22天体内造影以测量病变区域。在第15天和第 22天抗IL-6治疗组相对于载体对照显著地降低血管发生。抗IL-6治疗组和抗VEGF阳性 对照之间在应答上（response)没有显著差异。图1示出了该实验的结果。这些数据表明， IVT施用IL-6a，例如抗IL6抗体，可以在CNV大鼠模型中降低血管发生到与抗VEGF阳性对 照相似的水平（抗IL-6对载体对照，在第15天p= 0. 0054和在第22天p= 0. 0005)。
[0179] 这些数据表明，局部阻断IL-6对治疗眼病，例如涉及血管渗漏的眼病，如黄斑水 肿是有用的。
[0180] 实施例2 :候选抗体IL-6拮抗剂
[0181] 使用首先涉及免疫接种的流程开发候选抗体IL-6拮抗剂。免疫接种在发明人的 指示下由合同研宄组织（CR0)实施。向5只BALB/C小鼠皮下注射含80yg人IL-6(R&D Systems，cat#206-IL/CF，Minneapolis，MN)，1MNaCl和弗氏佐剂的PBS。用 80yg和 50yg的IL-6进行两次加强免疫。从最高滴度的小鼠中收集脾细胞并与P3x763Ag8. 653骨髓瘤 细胞融合以形成杂交瘤。
[0182] 对杂交瘤上清液筛选IL-6结合和拮抗性。对于结合ELISA，用含1yg/mL人IL-6 的PBS包被Costar9018板，4°C过夜。用含有2 %BSA的PBS封闭孔，洗涤，然后与50yL每 种杂交瘤上清液孵育，所述杂交瘤上清液用含2%BSA的PBS以1 : 2稀释。60分钟后，将 孔用含〇. 1 %Tween-20的300y1PBS洗涤三次。然后每孔加入于PBS-BSA中以1 : 3000 稀释的抗小鼠HRP，并孵育30分钟。板孔作如上的洗涤，然后加入3,3'，5,5'-四甲基联 苯胺（TMB)底物，并在450和550nm处测量信号。对于拮抗研宄，HEK-BlueTM-IL6报告细胞 (InvivoGen，SanDiego,CA)在1 :10稀释的杂交瘤上清液的存在下与浓度递增的人IL-6 孵育。20-24 小时后，20y1 上清液与 180y1QuantiBlue?(InvivoGen)混合，并在 655nm 处测量吸光度。
[0183] 基于结合和拮抗研宄，由申请人筛选出作为前导（lead)的杂交瘤64并在CR0 亚克隆。进一步用酶联免疫吸附实验（ELISA)测试杂交瘤64(小鼠单克隆）抑制IL-6/ IL-6Ra复合物结合到gP130的能力。通过ELISA，1. 5yg/ml浓度的杂交瘤64显著地减弱 了IL-6/IL-6Ra复合物结合到固定化的gP130(图2)。
[0184] 再筛选所述亚克隆并用5'RACEPCR扩增亚克隆64. 58的可变结构域并测序。小 鼠可变结构域的序列（称为m64)如下：
[0185]m64VH(可变重链）
[0186]QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVITPGSGTINYNEKFKGKAV LTADKSSSTVYMQLSSLTSDDSAVYFCAKSRWDPLYYYALEYWGQGTSVTVSS(SEQIDNO：13)
[0187]m64VL(可变轻链）
[0188]DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGS GSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPLTFGAGTKLELK(SEQIDNO：14)
[0189] 为了创建人源化序列，m64的互补决定区（CDR)被移植到通过计算算法选择的与 小鼠序列相似的人种系框架（germlineframework)中。人源化序列（称为h64)如下（与 m64序列相比改变的残基用下划线标示）且与小鼠序列具有约79. 5%的同一性（VH)和 84.4%的同一性以1):
[0190]h64VH
[0191]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEffVRQAPGQGLEffMGVITPGSGTINYAQKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSS(SEQIDNO：15)
[0192]h64VL
[0193]DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGISFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPDRFSGS GSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPLTFGQGTKLEIK(SEQIDNO: 16)
[0194] 用DNA2.0(MenloPark，CA)合成人源化序列，然后将其与人IgGl恒定结构域融合 一并克隆入pcDNA3. 1来源的表达载体。通过瞬时转染Freestyle?-293细胞（Invitrogen， GrandIsland，NY)表达，并通过蛋白A层析纯化IgG。在结合和诘抗研宄中，与其m64祖先 (predecessor)相比，h64IgG表现出相当大的效力降低。因此利用酵母展示来恢复丧失的 亲和力。
[0195] 为了实施目的为恢复或提高人源化h64IgG亲和力的亲和力成熟（affinity maturation)，h64抗体序列被重新克隆到pYC2/CT来源的酵母载体中以生产Fab分子，其中 所述载体中FabH链通过（G4S)3连接子与抗FITCscFv4m5. 3融合。然后通过易错PCR(依 照Chao等（2006,NatureProtocols，1 :755-768)的方案）产生h64 变体文库。表达H64 变体并通过标记有FITC-PEG-NHS的酵母在表面捕获变体，然后与生物素化的人IL-6孵育。 用亲和素-APC检测结合的IL-6,且在BDFACSAria?分选仪上选择结合有最高量IL-6的细 胞，其中结合的IL-6的量与展示的Fabs的量相关。经过四轮筛选，高亲和力变体群体被选 择和测序。由亲和力成熟所选择的克隆序列（称为h64-l. 4)如下，其中所选择的突变（如 与h64的VH和VL序列相比的突变）以粗体显示，且⑶Rs用下划线标示。这些是018的可 变结构域（以及下述的020和029的IL-6a分子）。需要注意的是完整的Fabs包括CK和 IgGl的CH1结构域。在本申请的上下文中，提及的"Fab"重链或轻链氨基酸序列是指序列 可以是由轻链衍生序列和重链衍生的序列组成的起作用的Fab的一部分。
[0196]hM-l. 4VH(OISVH)(可变结构域）
[0197] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEWVRQAPGQGLEWM
[0198] GVITPGSGTINYAOKFOGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSR WDPLYYYALEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 17)
[0199]h64_l. 4VL(018VL)(可变结构域）
[0200] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGIPFMNWYQQKPGQPPKL LIYAASNRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSEEVPLT FGQGTKLEIKRTV (SEQ ID NO: 18)
[0201]h64-l. 4可变结构域被重新克隆到pcDNA3. 1人IgGl载体中，并在 Freestyle?_HEK293细胞（LifeTechnologies)中表达全长的IgGl。所获得的纯化的IgG 比原来的h64抗体在结合及细胞拮抗研宄中是明显更为有效的。使用酵母系统测试了亲和 力，所述亲和力从最初的人源化分子的343pM提高到43pM。使用HEK-Blue细胞系统测定的 拮抗剂的效力提高了约10倍。
[0202] 将h64_l. 4IgG重排为Fab以在眼部和其他适应症中使用。此外，进行另一轮的 文库生成和基于酵母的筛选，以进一步提高亲和力。经过四轮筛选，存在具有A76V突变的 VH变体的显著富集。包含A79V的抗体、变体及其片段称为019IL-6a抗体、变体及其片段。
[0203] 实施例3 :形式的选择
[0204] 为了研宄基于抗体的IL-6拮抗剂的适合的形式，测试了如前文所述的选择出的 IL-6抗体的瞬时表达、稳定性、聚集性、结合亲和力和IC50,其中所述抗体使用018序列的 Fab、scFv(VH-VL)和scFv(VH-VL)形式。
[0205] 候选IL_6a分子（包含018可变区的序列）其中之一的前述实验结果示于表1。
[0206]表1
[0207]
[0209] 这些数据展示了鉴定基于IL-6拮抗剂抗体的各种形式的关键特征的方法，并阐 明了对于包含018可变区的IL-6拮抗剂而言，018Fab形式与scFv结构相比，在最多的关键 类别（如表达、稳定性、聚集和结合亲和性）中具有最受欢迎的特征。〇18Fab的IC50落在 用于治疗的合理的范围内。
[0210] 实施例4 :IL_6a抗体、片段和衍生物的例子
[0211] 使用本发明所描述的方法，申请人已鉴定出下述序列。下划线的序列代表重链和 轻链的CDRs。其它序列可在整个说明书中找到。
[0212] IgGl框架中的018重链（全长；fl018HC)多肽序列
[0213]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEffVRQAPGQGLEffMGVITPGSGTINYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRffDPLYYYALEYffGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO： 19)
[0214]IgGl框架中的018重链（全长；fl018HC)核酸序列
[0215]CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCAGGGGCCGAGGTTAAGAAGCCAGGGAGCAGCGTCAAGGTATCTTGTAAA GCGTCTGGTTACGCCCTTTCAAACTACCTGATCGAATGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAAGGCCTGGAATGGATGGG AGTTATCACCCCTGGGAGCGGCACCATTAATTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGAGTGACGATTACCGCCGACGAGT CCACCAGTACTGCCTACATGGAGCTGTCCTCACTCCGCAGCGAGGACACGGCAGTTTACTACTGCGCCCGGAGTCGA TGGGACCCTCTTTACTATTATGCTCTGGAATACTGGGGCCAGGGAACGACCGTTACAGTGTCATCTGCTAGCACAAA AGGACCATCAGTCTTCCCACTTGCTCCTTCATCTAAGAGCACAAGTGGTGGCACTGCAGCCCTTGGCTGCCTGGTGA AAGATTATTTCCCCGAACCTGTTACAGTTTCTTGGAACTCCGGTGCACTGACATCCGGAGTACACACTTTCCCAGCT GTGCTGCAGAGCTCAGGACTGTATAGCCTGTCTTCGGTGGTCACTGTTCCATCGTCGAGTCTTGGCACACAGACATA TATTTGCAACGTCAATCACAAGCCCTCCAACACAAAAGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAGACCC ATACGTGTCCTCCCTGTCCCGCCCCTGAACTGCTGGGAGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGAC ACTCTGATGATCAGCCGGACTCCCGAGGTTACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAGGTTAAGTT CAATTGGTACGTGGATGGCGTCGAGGTGCATAACGCAAAAACCAAGCCGAGAGAGGAGCAGTACaatAGCACCTATA GAGTAGTGAGCGTCCTGACTGTCTTACATCAGGATTGGCTCAATGGTAAAGAATATAAGTGCAAGGTAAGCAACAAG GCCCTACCCGCACCAATAGAGAAGACCATCTCCAAGGCGAAAGGTCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTTTATACACTGCC TCCCTCACGCGACGAATTAACAAAGAATCAGGTGTCTCTCACCTGTCTCGTCAAGGGCTTTTACCCTTCCGACATCG CCGTGGAGTGGGAATCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTATAAGACAACTCCCCCAGTCCTGGATTCAGATGGGTCG TTCTTTCTATATAGTAAGTTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAACAGGGGAACGTGTTCTCTTGCTCTGTTATGCA TGAAGCGCTGCACAATCATTATACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGGAAG(SEQIDNO：20)
[0216]IgGl框架中的018Fab重链（018FabHC)多肽序列。CDRs以下划线标示
[0217]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEffVRQAPGQGLEWMGVITPGSGTINYAQKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRffDPLYYYALEYffGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SC(SEQIDNO：1)
[0218] 018全长轻链（fl018LC)多肽序列。CDRs以下划线标示
[0219] DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASESVD NYGIPFMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNRGS GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSEEVPL TFGQGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID NO:2)
[0220] 这也是020和029IL-6拮抗剂的轻链
[0221]IgGl框架中的018全长轻链（018LC)核酸序列
[0222] GACATAGTGA TGACTCAAAG TCCGGACAGC CTGGCGGTGT CACTCGGCGA ACGGGCAACT ATCAACTGCC GAGCCAGCGA GAGCGTCGAT AATTACGGCA TCCCCTTCAT GAACTGGTAT CAGCAGAAGC CAGGACAGCC GCCCAAGCTG CTTATCTACG CCGCTTCCAA CCGGGGATCA GGGGTGCCCG ATCGATTTAG TGGAAGCGGT AGTGGGACCG ATTTCACACT GACCATCAGC TCCCTTCAGG CCGAGGATGT GGCTGTCTAT TATTGTCAGC AATCCGAGGA AGTGCCGCTC ACGTTTGGTC AGGGAACCAA ACTGGAGATC AAGCGGACCG TAGCGGCGCC TAGTGTCTTC ATCTTCCCAC CCTCCGACGA ACAGCTGAAG TCTGGCACTG CTTCCGTCGT GTGCCTGCTC AACAACTTTT ACCCTAGAGA GGCAAAAGTT CAATGGAAAG TAGACAATGC CTTGCAGTCC GGGAACTCCC AGGAGTCTGT CACAGAGCAG GATAGTAAGG ACTCAACCTA CAGCCTGTCC AGCACACTGA CCCTCTCCAA AGCCGACTAC GAGAAGCACA AAGTGTACGC TTGCGAAGTT ACGCATCAGG GGCTGTCCTC ACCCGTTACA AAAAGTTTTA ACAGAGGGGA GTGC ( SEQ ID NO: 26 )
[0223] 019Fab重链（019FabHC，除A79V(粗体/斜体）外与018FabHC序列相同
[0224] QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTFY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT
[0225] VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSC (SEQ ID NO:3)
[0226] 019VH(可变区/019HC，除A79V(粗体/斜体）外与018HC可变区序列相同
[0227] QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTFY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO:27)
[0228] 019抗体轻链（019LC)序列（多肽和核酸）与018LC相同
[0229] 018HC的 CDR1(VHCDR1 018) :GYALSNYLIE(SEQIDN0 :4)
[0230] 018HC的 CDR2(VHCDR2 018) :VITPGSGTIN(SEQIDNO:5)
[0231] 018HC的CDR3(VHCDR3 018) :SRWDPLYYYALEY(SEQIDNO:6)
[0232] 018LC的CDR1(VLCDR1) :RASESVDNYGIPFMN(SEQIDNO:7)
[0233] 018LC的CDR2(VLCDR2) :AASNRGS(SEQIDNO:8)
[0234] 018LC的CDR3(VLCDR3) :QQSEEVPLT(SEQIDNO:9)
[0235] 019HC的 CDR1(VHCDR1 019) :GYALSNYLIE(SEQIDNO:4)
[0236] 019HC的 CDR2(VHCDR2 019) :VITPGSGTIN(SEQIDNO:5)
[0237] 019HC的CDR3(VHCDR3 019) :SRWDPLYYYALEY(SEQIDNO:6)
[0238] 实施例5:表位和结构作图
[0239] 表位作图
[0240] 对所选择的候选IL-6诘抗剂进行功能表位作图。发现在ELISA中候选抗体（小 鼠64抗体）没有减弱IL-6Ra对IL-6的结合，表明该候选抗体不结合位点I。额外进行的 实验证明表明在ELISA中嵌合小鼠64抗体减弱IL-6/IL-6Ra复合物对gP130的结合，说 明IL-6的位点II或位点III携带该抗体的结合位点。还发现小鼠64抗体不显著阻断已 知的位点III结合抗体AH_65(Immunotech，Marseille，France)与IL-6的结合，说明该候 选抗体结合IL-6的位点II。这些数据表明可产生针对位点II的抗体，以及证明了鉴定该 抗体的方法。
[0241]为了进一步定义表位，在酵母中产生了IL-6的突变，其与4m5. 3(Boderetal.， 2000，ProcNatlAcadSciUSA97，10701_10705;Chaoetal.，2006，NatProtoc1， 755-768)相融合。所表达的突变体是在人IL-6中具有下述单或双突变的突变体：R24E/ D27E、R30E、Y31E、D34R、S118R/V121E、W157E、Q159E/T162P、K171E和R179E。所述表达的 突变的IL-6分子被用于与018(Fab)的结合研宄。观察到018(FAB)的R24E/K27E、Y31E、 D34R和S118R/V121R亲和力的降低，其均位于IL-6的位点II中。因此，本发明所描述的 发明包括抗体，其能够结合到人IL-6位置24、27、31、34、118和121中的至少一个，两个，三 个，四个，五个或六个氨基酸，或能够结合IL-6中的等效位点。
[0242] 位点II表位的结构定义
[0243] 计算下列距离以在结构上定义位点II。该计算基于IL-6/IL-6a/gpl30六聚体 的晶体结构，PDBlP9M(Boulangeretal.，2003,Science300:2101-2104)。IL-6 的螺旋 1位于（runs)位点I和位点II之间，导致某些残基接近于位点II但具有指向位点I的侧 链，如R30。D2和D3是指IL-6Ra的细胞外结构域。
[0244] 下列IL-6的氨基酸被确定为落入gpl30-D2-D3的5A:以内：L19、R24、K27、Q28、 R30、Y31、D34、E110、Q111、R113、A114、M117、S118、V121、Q124、F125 和K128。
[0245] 下列IL-6的氨基酸被确定为落入gpl30-D2-D3的7A以内：L19、E23、R24、125、 K27、Q28、I29、R30、Y31、D34、K41、Q102、E109、E110、Q111、A112、R113、A114、V115、Q116、 M117、S118、K120、V121、L122、Q124、F125 和K128。
[0246] 因此，能够结合一个或多个IL-6中落入位点II5A或7A的氨基酸的分子，如抗体 或其片段，可以是IL-6a。
[0247] 提供下面的人IL-6序列作为参考（下划线所标示的序列是前导序列）。 gpl30-D2-D3的7A以内的氨基酸用斜体标记。氨基酸编号，如用于定义表位的突变，不含前 导序列。
[0248]人IL-6
[0249] MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHR OPLTSS^ /D^g/i?nLDGISALRAETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQ
[0250] SGFNEETCLVKIITGLLEFE V YLE YL0NRFESSEEQARA VQMSTKVLIQFLQ^KAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSS LRALRQM (SEQ ID NO:21)
[0251] 进行实验测试了h64_l.4人源化抗体的Fab片段，并证明该片段由于靶向位点II， 从而能够阻断IL-6顺式和反式信号。可溶性IL-6受体（SIL-6R)的存在不改变Fab片段的 效力。这与抗IL-6RIgG相反，其在sIL6R的存在下效力有所降低，且其仅阻断顺式信号。
[0252] 这些实验证明靶向位点II的抗体或该抗体的片段，如Fab片段可用于抑制IL-6 的顺式和反式信号。
[0253] 实施例6 :灵长类动物研宄
[0254]由于非灵长类动物可以与灵长类动物的活力（activities)具有很大差异，因此 一般使用非人灵长类动物进一步评价候选IL-6拮抗剂的PK和其他参数。人IL-6与食蟹 猴和猕猴IL-6有7个位点的不同，其中的一个位于位点（氨基酸28)II内且与非洲绿猴 IL-6的位点II相同。这似乎只降低了含018序列的抗体约3-4倍的结合能力。结合到非 人灵长类动物IL-6的能力是IL-6拮抗剂的一个有用的特征，其促进作为药物的候选物的 开发，如通过使在非灵长类动物中的测试，如毒性测试成为可能。
[0255] 如同大多数IL-6抗体一样，因为IL-6的低序列同源性，本发明所描述的抗IL-6 抗体不与啮齿动物、兔或犬的IL-6发生交叉反应。然而，在亲和力研宄中，发现018Fab近 似以人亲和力结合食蟹猴和非洲绿猴的IL-6(表2)。
[0256] 表2 :对各种物种的各种IL-6的单价亲和力（018Fab)
[0257]
[0258]
[0259] 这些数据进一步证明了本发明所描述的IL_6a特异性结合的能力以及在适合的 动物中形成具有允许检测（如毒理学和生殖研宄）的特征的分子的能力。
[0260] 实施例7 :提高IL_6a的表达
[0261] 为了提高018Fab和019的Fab多肽的表达，利用本领域已知方法制备了向重链 CH1/铰链区引入5个额外氨基酸（DKTHT)的构建体。改变了的018Fab重链的序列示于下 面的SEQIDN0 :24。改变的018序列在本发明中称为020且改变的019序列在本发明中 称为021。020分子（020Fab重链和018Fab轻链）与具有018Fab重链和018Fab轻链的亲 本Fab相比具有改善的表达。019分子与020分子相比未展现出显著的亲和力差异。020 和019的表达分别增加了约2倍，亲和力未受改变的影响。
[0262] 020重链（在羧基末端具有DKTHT的Fab))
[0263] QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT (SEQ ID NO:24)
[0264]使用 〇2〇Fab在HEK-BlueTMIL_6 受体细胞（InvivoGen，SanDiego,CA)中测量IL-6 的诘抗作用。在含10pMIL-6和各种浓度的020或IL-6Ra抗体（CellSciences，Canton， MA)的混合液（含或不含50nMIL-6Ra)中孵育细胞，孵育20-24小时后，20yL细胞培养 上清液与180yLQuantiBlueTM(InviV〇Gen)底物混合并孵育1小时；在655nm处测量吸光 度。图3A和图3B显示了这些实验的数据，证明了在存在或缺乏IL-6R下，020抑制IL-6活 性的能力。
[0265]实施例 8 :IgG2IL-6 抗体
[0266] 使用本领域已知方法将018重构（reformat)入人IgG2同种型框架中以与IgGl形 式的抗体相比减少FcyR的结合以及减少ADCC。另外，预期018重构为全长形式（如IgG2) 由于分子的更大大小而降低从玻璃体中的清除率。
[0267] 构建/纯化抗IL-6IgG2抗体
[0268]为了使用如前文所述的抗-IL-6序列构建人IgG2抗体，从cDNA中PCR扩增出分 别在N-和C-末端带有Nhel和Mlul限制性位点的人IgG2恒定结构域。纯化PCR产物，用 Nhel和Mlul酶切消化，然后连接入pTT5载体中，所述载体包含抗IL6可变结构域，如SEQ IDN0 :1(见上文）。这样得到全长的IgG2重链序列。含有包含018序列的全长轻链的质 粒被用于提供轻链。
[0269] 为了进一步减少FcRn的结合并因此减少IL_6a的再循环，在重链中进行了点突 变。使用QuikChange?'诱变（AgilentTechnologies，SantaClara，CA)制造突变。使 用聚（乙烯亚胺）（PEI)将重链和轻链质粒共转染到lOOmLHEK293-6E细胞的瞬时培养物 中，并培养以允许进行约5天的表达。这种产生的抗体含有抗IL-6的位点II结合部分和 IgG2结构。含有018⑶Rs的这种结构在本发明中称为018IgG2或029。在残基1253处制 造点突变。
[0270] 所述IgG2分子被很好地表达且在细胞学实验中以与020Fab相比略微改善的效力 阻断IL-6。
[0271] 029成熟序列（⑶Rs用下划线标示）
[0272] 029 重链
[0273] QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARM WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKYSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
[0274] GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 11)
[0275] 029 轻链
[0276] DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASESVD NYGIPFMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNRGS GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSEEVPL IFGQGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID NO: 12)
[0277] 改变的FcRn结合
[0278]IL-6可以具有某些积极的系统性效应。因此改造IL-6使其在玻璃体中具有良好 的滞留但具有有限的全身半衰期是有利的。减少或消除FcRn结合应当减少任何逃入循环 的药物的系统性积累，从而提高IL_6a的安全性。
[0279] 因此，由于FcRn介导的运输可能增加抗体从眼中流出，因此通过在Fc的残基 I254、H311 或H436 引入突变（参见SEQIDN0:23)编号根据Martin等，MolecularCell， 7 :4,867-877 (2001))，进一步修饰020IgG2以消除FcRn的结合。突变的位点在SEQIDNO: 23中以粗体标明；1254突变为A或R;H311突变为A或E、H311突变为N且D313突变为T， 以及H436突变为A(在前导序列后开始编号，所述前导序列在SEQIDNO:23中以下划线标 明。含有该序列的IL-6拮抗剂称为018IgG2m。
[0280] 抗IL-6重链（IgG2)(常规字体：VH;斜体：CH)(无前导序列）显示突变位点（粗 体）
[0281] QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV
[0282] KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO:23)
[0283] 抗IL-6重链（IgG2)(常规字体：VH;斜体：CH)有前导序列（下划线）显示突变位 点（粗体）
[0284] MDWTWRILFLVAAATGAHSOVOLVOSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTVSSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO:28)
[0285] 因此，一些实施方式中包括具有重链序列的抗体，所述重链序列描述于SEQID N0:23中，并具有1254(如A或R)、H311(突变为A或E)、H436(突变为A)，或D313(突变 为T)且H311突变为N的突变。
[0286]SEQIDNO:25 因此提供了一种序列，当在 1133(如I133A或I133R)、H190(如 H190A或H190E)、H315 (H315A)，或D192 和H190 (如D192T和H190N)处发生突变时，该序列 可用于抗体、片段或其衍生物以产生在低pH下（如pH5. 5)或溶酶体pH下具有减弱Fc结 合的多肽，和/或产生与亲本或其他不含该序列的参考分子相比具有减弱的全身半衰期的 多肽。
[0287] SASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
[0288] GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO:25)
[0289] 抗IL-6轻链（IgG2)(常规字体：VH;斜体：CH)
[0290] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGIPFMNWYQQKPGQPPKL LIYAASNRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSEEVPLTF GQGTKLEmJUVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSP VTKSFNRGEC(SEQ ID NO:22)
[0291] 实施例9:制剂稳定性
[0292] 测试了抗IL-6/IgGlFab片段（包含IgGlCHI结构域）的稳定性，所述测试通过 使用差示扫描荧光确定最初在PBS中的Tm，然后在一系列缓冲液和赋形剂中的Tm。发现柠 檬酸盐缓冲液（PH5. 5)将Tm提高到超过80°C。因此，在一些实施方式中，IL-6a提供于柠 檬酸盐缓冲液中且在一些情况下具有至少80°C的Tm。
[0293] 使用SEC-MALS测试了聚集程度且20mg/ml在磷酸盐缓冲液（PBS)中未观察到聚 集。
[0294] 实施例10 :适合于增强PK的对pH敏感的抗体
[0295]IL-6可以具有某些积极的系统性效应。因此改造IL-6使其在玻璃体中具有良好 的滞留但具有有限的全身半衰期是有利的。减少或消除与FcRn的结合能够减少任何逃入 循环的药物在全身的积累，从而提高IL_6a的安全性。因此，由于FcRn介导的运输可能增 加抗体从眼中流出，因此通过在Fc的残基L254、H311或H435引入突变（编号根据Martin 等，MolecularCell，7 :4,867-877 (2001))，以进一步修饰 020IgG2 以减弱FcRn的结合。这 种抗体在本发明中称为IL-6pH抗体或抗IL-6pH并在下面进一步描述。
[0296]IL_6ipH抗体的产生
[0297] 组氨酸的pKa为约6. 0,且在结合界面上插入的组氨酸能够在低pH时在侧链质子 化作用后破坏结合。使用如本发明中所述的抗IL-6位点II靶向抗体，从018中产生一个 包含富含组氨酸的CDR变体的文库，且使用酵母展示从该文库中筛选pH敏感的结合。产生 的文库是具有CDRs的组合文库，所述CDR是由简并密码子编码，使得每个残基是一个野生 型残基（即，与亲本抗体相同），或组氨酸残基。通过交替排序在生理pH(7. 4)下高结合和 在内涵体pH(5. 5)下低结合进行筛选。
[0298] 鉴定出了一个酵母-选择的突变体，其具有在pH7. 4下相对高的结合（该突变体 具有407pM的单价Kd相比亲本的192pM的Kd)和在pH5. 5下相对低的结合（该突变体具 有2. 362nM的单价Kd相比亲本的195pM的Kd)。这构成在pH5. 5下亲和力约5. 8倍的变 化。这种突变体包含在轻链⑶R1处的多个组氨酸突变。因此，该突变体显示出在PH7. 4下 与亲本分子相似的结合能力，以及在PH5. 5下亲和力的显著丧失。通过本领域已知的方法， 使用ELISA、FACS和SPR分析验证了这一观察。
[0299] 这些数据表明，可以创建基于抗体的IL_6a，其具有靶向IL-6的位点II的抗IL-6 的特征，可用于抑制IL-6的顺式和反式活性，且具有与亲本抗体或其他具有野生型Fc结构 域的抗体相比增加的PK，至少部分通过在pH5. 5下改变的结合实现。
[0300] 其他实施方式在所附权利要求书的范围之内。
【主权项】
1. 一种分离的抗体或其抗原结合片段，其能够特异性地结合人IL-6的位点II。2. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含 a. SEQIDNO:4 所示的VHCDRl、SEQIDNO:5 所示的VHCDR2,和SEQIDNO:6 所示 的VHCDR3 ;和 b. 含有SEQIDNO:7 所示的VLCDR1、SEQIDNO:8 所示的VLCDR2 ;和SEQIDNO:9 所示的VLCDR3， 其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合人IL-6 (如，能够特异性地结合人IL-6的位点II)。3. 权利要求1或权利要求2所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原 结合片段能够以240pM或更低的Kd结合IL-6,并具有70°C或更高的Tm。4. 权利要求1或权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片 段能够以240pM或更低的Kd结合IL-6,并具有80°C或更高的Tm。5. 权利要求1、权利要求2、权利要求3或权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其 中所述抗体或其抗原结合片段与人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118或V121的至少一个结 合。6. 权利要求1，权利要求2,权利要求3或权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中 所述抗体或其抗原结合片段结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121。7. -种分离的IL-6抗体或其抗原结合片段，其 a. 根据表面等离振子共振的测定，能够以240pM或更低的Kd与人IL-6解离，和 b. 在体外HEK-Blue?IL-6测定中能够以255pM或更低的IC50中和IL-6活性。8. -种分离的IL-6抗体或其抗原结合片段，其能够竞争性抑制含有SEQIDNO:1和 SEQIDNO:2的抗体或其抗原结合片段或含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:2.的抗体或其 抗原结合片段对人IL-6的结合。9. 一种分离的抗体或其片段，其能够特异性地结合人IL-6的位点II，其中所述抗体或 其片段包含：（a)包含与SEQIDNO:12的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的轻链可 变域，和包含与SEQIDNO:11的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的重链可变域。10. 权利要求1-9任一项所述的分离的IL-6抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或 其抗原结合片段具有在PH5. 5下2nM或更高的单价KcL11. 权利要求1-10任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体为IgG2抗体。12. 权利要求1-11任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段 与参考抗体或其片段相比具有改变的FcRn结合。13. 权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中所述FcRn结合与参考抗体相比是下 降的。14. 权利要求12或13所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段的 Fc结构域与参考抗体相比是改变的。15. 权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含在 SEQIDN0:23的H311、D313、I254或H436中一个或多个的突变。16. 权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含选自由H311A、H311E、 H311N和D313T、I254A、I254R、和H436A构成的组中的一个或多个突变。17. -种分离的单克隆抗体，其包含SEQIDNO:25。18. -种分离的IL-6抗体或其片段，其特异性地结合人IL-6的位点II，并与具有野生 型Fc结构域的相应的抗体相比表现出降低的FcRn结合。19. 前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，用于治疗患有IL-6相关疾病的 受试者（如人）。20. 权利要求19所述的抗体或抗原结合片段，其中所述疾病是以在玻璃体中升高的 IL-6水平为特征的眼部疾病。21. 权利要求19或20所述的抗体或抗原结合片段，用于治疗患有糖尿病黄斑水肿 (DME)、糖尿病视网膜病、葡萄膜炎、干眼综合症、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性（AMD)、增 生型糖尿病视网膜病变（PDR)、视网膜静脉阻塞（RVO)、视神经脊髓炎（NMO)、角膜移植物、 角膜擦伤或眼睛物理损伤的受试者（如人）。22. 权利要求21所述的抗体或抗原结合片段，用于治疗患有DME的受试者（如人）。23. -种组合物，其包含权利要求1-18任一项所述的抗体或抗原结合片段。24. -种组合物，其包含权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述抗体是人单克 隆抗体。25. 权利要求23或24所述的组合物，其用于治疗IL-6相关疾病。26. 权利要求25所述的组合物，其用于治疗以在玻璃体中升高的IL-6水平为特征的眼 部疾病。27. 权利要求23或24所述的组合物，其用于治疗糖尿病黄斑水肿（DME)、糖尿病视 网膜病、葡萄膜炎、干眼综合症、年龄相关性黄斑变性（AMD)、增生型糖尿病视网膜病变 (TOR)、视网膜静脉阻塞（RVO)、视神经脊髓炎（NMO)、角膜移植物、角膜擦伤或眼睛物理损 伤。28. -种治疗IL-6相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要 求1-18任一项所述的IL-6抗体或其片段。29. 权利要求28所述的方法，其中所述IL-6相关疾病是以在玻璃体中升高的IL-6水 平为特征的眼部疾病。30. 权利要求28或29所述的方法，其中所述IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿（DME)、 糖尿病视网膜病、干眼综合症、年龄相关性黄斑变性（AMD)、增生型糖尿病视网膜病变 (TOR)、视网膜静脉阻塞（RVO)、视神经脊髓炎（NMO)、角膜移植物、角膜擦伤或眼睛物理损 伤。31. 权利要求29所述的方法，其中将所述抗体或抗原结合片段递送到受试者眼睛的玻 璃体。32. 权利要求29的方法，其中所述IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿且将所述抗体或其 片段递送到受试者眼睛的玻璃体。 33?-种载体，其包含编码SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8 或SEQIDNO:9 的序列。 34?-种细胞，其能够表达SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8 或SEQIDNO:9 中一个或多个。35. -种在受试者中减少抑制IL-6的系统性效应的方法，所述方法包括向受试者施用
【专利摘要】提供了特异性结合IL-6的位点II的IL-6拮抗剂。公开了使用该抑制剂治疗IL-6相关疾病，例如眼病，如糖尿病性黄斑水肿的方法。
【IPC分类】A61P27/02, C07K16/24
【公开号】CN104903349
【申请号】CN201380058297
【发明人】M.M.施密特, D.V.厄布, T.M.巴恩斯, E.S.弗法恩, A.蒂斯代尔
【申请人】十一生物治疗股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月8日
【公告号】CA2886987A1, EP2917238A1, US20150125468, WO2014074905A1
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