特异于clec14a的新抗体及其用图
特异于clec14a的新抗体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及新的抗体及其用途，所述抗体特异性结合c型凝集素结构域家族14 的成员A(clecl4a)。更具体地，本发明涉及特异性结合clecl4a的C型凝集素样结构域 (CTLD)的抗体，制备此抗体的方法，用于抑制血管生成的包含此抗体的组合物，通过施用抗 体或组合物来抑制血管生成的方法，用于预防或治疗癌症的包含抗体的组合物，通过施用 抗体或组合物来治疗癌症的方法，用于诊断癌症的包含抗体的组合物，用于诊断癌症的包 含此组合物的试剂盒，使用此组合物诊断癌症的方法，用于抑制血管生成的包含用于抑制 clecl4a表达的物质的组合物，用于血管生成的包含此组合物的试剂盒，使用组合物抑制血 管生成或治疗癌症的方法，以及clecl4a的CTLD作为抑制血管生成的抗体的表位的用途。
【背景技术】
[0002] 重组抗体技术近期的快速发展已在全球范围内产生了约30种被批准用于人类治 疗的抗体以及超过270种目前处于临床开发的用于范围广泛的疾病的抗体。然而，传统的 抗体筛选仍然是时间和劳动密集型的且是昂贵的。传统上，使用目标蛋白的胞外区域以筛 选抗体。因此，大多数所选择的抗体结合到细胞，但其不是具有治疗潜力的功能性抗体。由 于分子生物学和蛋白质生物化学的最新进展，大量的可以将蛋白质结构域和基序的结构与 细胞功能联系起来的信息是可用的。使用功能性结构域以筛选重组抗体可以是鉴定功能性 抗体和研宄潜在作用模式的一种有效的方法。
[0003] 肿瘤的血管生成在肿瘤的发展中起到了重要的作用。血管内皮生长因子 (VEGF)和表皮生长因子受体（EGFR)在血管生成中是关键的因素，并且靶向血管生成 已成为癌症治疗的有前途的策略。已经使用抗-VEGF抗体贝伐单抗（bevacizumab)来 治疗患有转移性结肠直肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、恶性脑胶质瘤的患者。西妥昔 单抗（Cetuximab)(其是抗-EGFR抗体）可以抑制内皮细胞与细胞的接触以及血管生 成因子如VEGF、白介素-8和碱性成纤维细胞生长因子的表达。然而，由于肿瘤分泌 的血管生成因子的冗余，其包括胎盘生长因子、血管生成素、碱性成纤维细胞生长因 子、肝细胞生长因子，这些药物在肿瘤中产生了抗性表型（KopetzS等人，PhaseII trialofinfusionalfluorouracil，irinotecan，andbevacizumabformetastatic colorectalcancer:efficacyandcirculatingangiogenicbiomarkersassociated withtherapeuticresistance.JournalofClinicalOncology.28 (3) :453-9 ; Lucio-EterovicAK等人，Mediatorsofglioblastomaresistanceandinvasionduring antivascularendothelialgrowthfactortherapy.ClinicalCancerResearch. 2009 ； 15(14) : 4589-99) 〇
[0004] 贝伐单抗（人VEGF抗体）现被用于治疗多种癌症患者。然而，由于VEGF受体 (VEGFR)也在正常细胞中表达，它的使用可能与包括高血压、蛋白尿和胃肠穿孔的副作用相 关。副作用也可能限制抗促血管生成因子如VEGFR-2和血管生成素-2的许多抗体的治疗 用途。因此，鉴定通过抑制血管生成来治疗癌症患者的新的癌症特异性靶标对于开发具有 较少副作用的治疗性抗体是至关重要的。
[0005] 此外，贝伐单抗和西妥昔单抗是治疗性抗体，其通过抑制可溶性血管生长因子与 它们的受体的相互作用来抑制血管生成。然而，由于肿瘤细胞分泌的促血管生成生长因子 的冗余，这些药物的长期使用产生了抗性肿瘤表型。这可能对在需要长期治疗的患者中使 用抗可溶性生长因子的抗体形成最大的挑战。
[0006]Clecl4a是I型跨膜蛋白，其细胞外结构域由C型凝集素样结构域（CTLD)、一系列 的表皮生长因子样结构域和寿司样结构域组成。一些报道表明了clecl4a在肿瘤血管生成 中的作用。Rho等人报道称，clecl4a是内皮细胞特异性的，并且可能在血管生成中的细胞 与细胞的接触中发挥了关键作用（RhoSS等人，Clecl4aisspecificallyexpressedin endothelialcellsandmediatescelltocelladhesion.Biochemical&Biophysical ResearchCommunications. 404(1): 103-8)。Mura等人表明，clecl4a对于调节与外肉伪 足形成、细胞迀移和内皮血管形成相关的促血管生成表型是至关重要的；这个小组还鉴 定了作为肿瘤内皮细胞标记物的clecl4a没有在正常组织的内皮细胞中表达（MuraM等 人，Identificationandangiogenicroleofthenoveltumorendothelialmarker CLEC14A.Oncogene. 31 (3):293-305)。
[0007] 尽管近年来对clecl4a的兴趣增加了，其分子机制尚未被清楚地鉴定。必须对 clel4a负责血管生成的功能部分或结构域进行研宄，以便挖掘和开发临床上可应用的抗 体。此时，迫切需求一种单克隆抗体，其特异性结合小鼠和人的clecl4a并可转换成人源化 抗体或人抗体，以用于临床前和临床研宄。优选地，需要一种抗体，其在临床上可用于抑制 肿瘤血管生成并从而治疗癌症。此外，需要鉴定一个新的部分，其抑制肿瘤血管生成并从而 进一步抑制血管生成并治疗癌症。
[0008]
【背景技术】部分所公开的上述信息仅用于增加对本发明背景的理解，因此其可能包 含本领域技术人员已知的不形成现有技术的信息。
【发明内容】
[0009] 技术问题
[0010] 本发明人首次鉴定了CTLD在细胞迀移和外肉伪足形成中的功能，其是血管生成 中的关键事件。通过使用噬菌体展示技术，本发明人开发了抗人和小鼠clecl4aCTLD的重 组人抗体。功能测定表明，所述抗体特异性抑制内皮细胞的迀移和血管的形成，而不影响活 力或活化。最后，本发明人提出了一种作用机制，借此，抗体可以通过调节CTLD介导的细胞 与细胞的相互作用并下调内皮细胞表面上的clecl4a表达来抑制血管生成。这些结果证明 了CTLD在血管生成中的功能重要性和CTLD特异性人抗体阻止clecl4a介导的肿瘤血管生 成的潜力。
[0011] 问题的解决方案
[0012] 为了达到上述目的，本发明提供了一种抗体，其特异性结合clecl4a(C型凝集素 结构域家族14,成员A)。
[0013] 本发明还提供了一种编码所述抗体的核酸。
[0014] 本发明还提供了包含所述核酸的载体。
[0015] 本发明还提供了一种宿主细胞，其包含所述载体或所述核酸。
[0016] 本发明还提供了一种生产所述抗体的方法，包括培养所述宿主细胞，使得所述核 酸表达以产生所述抗体。
[0017] 本发明还提供了一种抗体-药物偶联物，其包含附着到药物上的所述抗体。
[0018] 本发明还提供了一种用于预防或治疗血管生成相关疾病的药物组合物，其包含所 述抗体。
[0019] 本发明还提供了一种所述抗体用于制备预防或治疗血管生成相关疾病的药物组 合物的用途。
[0020] 本发明还提供了所述抗体，其用于预防或治疗血管生成相关疾病。
[0021] 本发明还提供了一种治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施 用所述抗体或所述药物组合物。
[0022] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的组合物，其包含所述抗体。
[0023] 本发明还提供了一种所述抗体用于制备抑制血管生成的组合物的用途。
[0024] 本发明还提供了所述抗体，其用于抑制血管生成。
[0025] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的方法，其包括向有需要的受试者施用所 述抗体或所述药物组合物。
[0026] 本发明还提供了用于血管生成相关疾病的诊断组合物，其包含所述抗体。
[0027] 本发明还提供了一种所述抗体用于制备用于血管生成相关疾病的诊断组合物的 用途。
[0028] 本发明还提供了所述抗体，其用于血管生成相关疾病的体外诊断。
[0029] 本发明还提供了一种用于血管生成相关疾病的诊断试剂盒，其包含所述诊断组合 物。
[0030] 本发明还提供了一种用于诊断血管生成相关疾病的方法，其包括从疑似患有血管 生成相关疾病的受试者中分离的生物样品中通过抗原-抗体复合物检测clecl4a。
[0031] 本发明还提供了一种多肽，其包含Clecl4a的分离的CTLD，其用作能够诱导产生 抑制血管生成的抗体的表位。
[0032] 本发明还提供了一种多肽，其包含clecl4a的分离的CTLD的N-末端或C-末端， 作为能够诱导产生抑制血管生成的抗体的表位。
[0033] 本发明还提供了一种多肽，其包含clecl4a的CTLD中的第1个氨基酸至第42个 氨基酸的氨基酸片段或clecl4a的CTLD中的第122个氨基酸至第142个氨基酸的氨基酸 片段，其作为能够诱导产生抑制血管生成的抗体的表位。
[0034] 本发明还提供了一种用于制备特异性结合至clecl4a(C型凝集素结构域家族14， 成员A)的抗体的方法，其包括：使用所述多肽作为表位进行生物淘选。
[0035] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的组合物，其包括用于抑制clecl4a表达 的物质。
[0036] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的试剂盒，其包括所述组合物。
[0037] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的方法，其包括向有需要的受试者施用所 述组合物。
[0038] 本发明还提供了一种治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施 用所述组合物。
[0039] 本发明还提供了所述用于抑制clecl4a表达的材料用于制备抑制血管生成的组 合物的用途。
[0040] 本发明还提供了用于抑制Clecl4a表达的所述材料，其用于抑制血管生成。
[0041] 本发明还提供了用于预防或治疗血管生成相关疾病的药物组合物，其包括 clecl4a的CTLD和Fc的融合蛋白。
[0042] 本发明还提供了clecl4a的CTLD和Fc的所述融合蛋白用于制备预防或治疗血管 生成相关疾病的药物组合物的用途。
[0043] 本发明还提供了clecl4a的CTLD和Fc的所述融合蛋白，其用于预防或治疗血管 生成相关疾病。
[0044] 本发明还提供了一种用于治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试 者施用clecl4a的CTLD和Fc的所述融合蛋白或所述药物组合物。
[0045] 从下列详细的描述和所附的权利要求将可以更加清楚地了解本发明的其它特征 和实施方式。
【附图说明】
[0046] 图1示出了clecl4aCTLD在细胞迀移中的作用。a.在光学显微镜下监测伤口愈 合测定中的转染了GFP、clecl4a_GFP或clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细胞的迀移。在0小 时（上）和20小时（下）时捕捉图像。b?将迀移距离表示为对照迀移的百分比。数值代 表了三个独立实验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0047] 图2示出了clecl4aCTLD对外肉伪足形成的作用。固定转染了GFP、clecl4a_GFP 和clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细胞（a)和HUVEC(b)，用罗丹明-鬼笔环肽和Hoechst染 色，并通过荧光显微镜（1000X)进行检查。箭头表示外肉伪足形成区域。结果是三个独立 的实验的代表。
[0048] 图3示出了特异于人类和小鼠的CTLD的scFv克隆的分离。a.用Fc结合剂预清 洗合成的人类scFv抗体库并通过使用重组的hCTLD-Fc或mCTLD-Fc的交替生物淘洗进行 筛选。b-d.随机选择96个展示了scFv的噬菌体克隆（1-96)并通过噬菌体ELISA分析上 清液。通过测量450nm处的吸光度分析所选择的scFv克隆对人类和小鼠CTLD的反应性。 箭头表示与hCTLD-Fc( ，黑色）和与mCTLD-Fc(，灰色）反应的scFv克隆，以及不与 Fc( □)反应的scFv克隆。BSA(园）作为背景对照。
[0049] 图4示出了clecl4a_CTLDIgG与人和小鼠CTLD的交叉物种反应性。用纯化的、 所选择的IgGscFv克隆（克隆1-4)在包被有hCTLD-Fc( ，黑色）、mCTLD-Fc(，灰色） 和Fc(D)的96孔微量滴定板上进行ELISA。BSA(図）作为背景对照。数值代表了两个 独立实验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0050] 图5示出了clecl4a_CTLDIgG对内皮细胞的迀移和血管形成的作用。a.受伤后， 通过光学显微镜监测在不存在（MOCK)或存在clecl4a-CTLDIgG(克隆1-4)或存在西妥昔 单抗的情况下孵育的HUVEC的迀移。在0小时（上）和9小时（下）时捕捉图像。b?将迀 移距离表示为对照（MOCK)迀移的百分比。数值代表了三个独立实验之一的一式三份的测 量的平均值土SD。C.在不存在（MOCK)或存在clecl4a-CTLDIgG(克隆1-4)或存在西妥 昔单抗的情况下分析血管的形成。D.血管形成的程度表示为对照（MOCK)血管形成的百分 比。数值代表了三个独立实验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0051] 图6示出了clecl4a_CTLDIgG对内皮细胞增殖和活化的作用。a.在不存在（MOCK) 或存在clecl4a-CTLDIgG、西妥昔单抗或5-FU(阳性对照）的情况下孵育HUVEC2天。通 过测量450nm处的吸光度评估细胞活力。数值代表了两个独立实验之一的一式三份的测量 的平均值土SD。b?在不存在（虚线）或存在hTNFa、clec14a-CTLDIgG或西妥昔单抗（实 线）的情况下培养HUVEC;用抗-VCAM-1 (上）或ICAM-1 (下）多克隆抗体进行染色；并通 过流式细胞术进行分析。hTNFa作为内皮细胞活化的阳性对照。结果是三个独立实验的代 表。
[0052] 图7示出了clecl4a_CTLDIgG对clecl4a介导的细胞-细胞接触的作用。a?在 不存在（MOCK)或存在clecl4a-CTLDIgG或西妥昔单抗的情况下孵育转染了GFP和 clecl4a-GFP的HEK293F细胞8小时。在光学显微镜下计数细胞聚集体（细胞团>4个细 胞；箭头）。每视野的聚集体的数量示于b中。数值代表了三个独立实验之一的一式三份 的测量的平均值土SD。
[0053] 图8示出了clecl4a_CTLDIgG对CTLD-CTLD相互作用的作用。a?用抗-GFP或 抗-0 -肌动蛋白抗体通过免疫印迹对转染了GFP、clecl4a_GFP或clecl4aACTLD-GFP 的C0S-7细胞的裂解物进行分析。b.将表达GFP(白色）、clecl4a-GFP(黑色）或 clecl4aACTLD-GFP(浅灰色）的C0S-7细胞用0. 15yg的hCTLD-Fc或Fc进行孵育并通过 ELISA测定CTLD-CTLD相互作用。c.将转染了GFP或clecl4a-GFP的C0S-7细胞的裂解物 与hCTLD-Fc-起孵育，其中hCTLD-Fc已与增加浓度的clecl4a-CTLDIgG(克隆1) 一起预 孵育。数值代表了三个独立实验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0054] 图9示出了clecl4a_CTLDIgG对内皮细胞表面的clecl4a的下调的作用。a.在 存在（虚线）或不存在（实线）clecl4a-CTLDIgG(克隆1)的情况下孵育固定的和未固定 的HUVEC并通过流式细胞术进行分析。b.通过细胞ELISA分析与clecl4a-CTLDIgG(白 色）或Fc(黑色）一起孵育指定时间的HUVEC表面上的Clecl4a。数值代表了三个独立实 验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0055] 图10示出了clecl4a_CTLDIgG对clecl4a的CTLD的部分片段的特异性。a.Fc 与clecl4a的CTLD的部分片段的融合蛋白。b.图分别示出了克隆1(上图）和克隆2(下 图）的clecl4a-CTLDIgG对Fc与clecl4a的CTLD的部分片段的融合蛋白、wtCTLD-Fc和 Fc的特异性。
[0056] 图11是示出了hCTLD-Fc对血管形成的抑制作用的图。
【具体实施方式】
[0057] 根据本发明的一个方面，本发明提供了特异性结合clecl4a(C型凝集素结构域家 族14,成员A)的抗体。
[0058] 优选地，抗体可以是特异性结合clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员A)的 CTLD(C型凝集素样结构域）的抗体。
[0059] 如本文所用，术语"抗体"是指一种蛋白分子，其包含对某一抗原具有免疫反应性 的免疫球蛋白分子，作为特异性识别抗原的受体，并包括多克隆抗体、单克隆抗体、完整抗 体和抗体片段。此外，嵌合抗体（如人源化鼠抗体）、二价或双特异性分子（如双特异性抗体(bispecificantibodies))、双特异抗体（diabodies)、三特异抗体和四特异抗体都在对本 发明有用的抗体的范围之内。完整的抗体由两个全长的轻链和两个全长的重链组成，在轻 链与重链之间有二硫键。在哺乳动物中，已知存在5种抗体同种型，称为IgA、IgD、IgE、IgM 和IgG，且IgG进一步分为四种亚型：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。术语"抗体片段"是指至少 保留了抗原结合功能的片段，并且可包括Fab、F(ab'）、F(ab'）2和Fv。Fab包含各个重链和 轻链的一个可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区（CHI)，具有抗原结合位点。Fab'与 Fab的差异在于其进一步包括重链CH1结构域的C末端的至少一个半胱氨酸残基。F(ab'）2 由两分子的Fab'和铰链区的半胱氨酸残基之间的二硫键组成。Fv(可变片段）包含每个重 链和轻链的一个可变区，其是包含亲本免疫球蛋白的原有特异性的最小抗体片段。通过利 用二硫键连接重链的可变区与轻链的可变区形成二硫键稳定的Fv(dsFv)。单链Fv(scFv) 是一种Fv，其中通过肽接头共价连接重链和轻链的各个可变区。可以通过使用蛋白酶（例 如，用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整的抗体分别获得Fab或F(ab'）2)来获得这些抗体片 段，并优选可以通过基因重组技术来构建。
[0060] 照 惯例，使用靶蛋白的整体细胞外区域进行抗体筛选，从而导致存在抗体分离的 问题。在本发明中，抗体筛选的改进是通过使用靶蛋白的功能结构域实现的，以便更迅速地 产生抗体。在本发明的一个实施方式中，clecl4a的CTLD被鉴定为在血管生成中发挥了重 要作用并用于抗体筛选。抗体筛选的方法以图示方式示于图3a中。
[0061] 如本文所用，术语"单克隆抗体"是指具有相同的分子组成的抗体分子，其获得自 基本上相同的抗体群，其显示了针对单一表位的结合特异性和亲和力。
[0062] 通常，免疫球蛋白具有由两个重链和两个轻链组成的基本结构单元。每个重链包 括一个可变区（也被称为"区域"）和三个恒定结构域，而每个轻链包括一个可变区和一个 恒定结构域。每个轻链和重链的可变区包括三个互补决定区（以下称为"CDR"）和4个框 架区。CDR的功能是结合抗体的表位上。每个链上的CDR起始于N末端并依次排列为CDR1、 ⑶R2和⑶R3。通过它们所在的链来将其进行区分。
[0063] 如本文所用，术语"人抗体"是一种分子，其完全由人免疫球蛋白的所有组分的氨 基酸序列组成，其中包括CDR、框架区等。在人类疾病的治疗中，人抗体具有至少三个潜在 的优势。首先，人抗体更优选地与人免疫系统相互作用，通过如补体依赖性细胞毒性（CDC) 或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)来更有效地破坏靶细胞。另一个优势是，人类 的免疫系统不会将人抗体识别为外来分子。此外，人抗体的半衰期与那些天然存在于人体 循环系统中的抗体相似，即使当其以较小剂量或较少频率进行施用时。因此，根据本发明 的抗体也可以优选人单克隆抗体，其可用于血管生成相关疾病或癌症的治疗，这不仅是因 为其具有对clecl4a(优选在人内皮细胞表达的有效抑制了clecl4a介导的血管生成的 Clecl4a-CTLD)的强亲和力，，而且还因为其显示了低免疫原性，这是因为其重链和轻链都 来源于人类。
[0064] 如本文所用，术语"clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员A) "是指C型凝集素 /C-型凝集素样结构域（CTL/CTLD)超家族的成员。Clecl4a是I型跨膜蛋白，其细胞外结构 域由C型凝集素样结构域（CTLD)、一系列表皮生长因子样结构域和寿司样结构域组成。关 于clecl4a的信息可以从公共数据库如NCBIGenBank中获得。例如，人clecl4a可以具有 Gene IDNo161198,但不限于此。已知Clecl4a参与细胞对细胞的粘附和血管生成，但其 具体的机制和负责血管生成的实质性的区域仍然不明。是本发明人首次发现了CTLD在血 管生成中发挥了关键的作用，CTLD是clel4a的氨基酸序列上横跨第31个氨基酸至第172 个氨基酸的区域。
[0065] 如本文所用，术语"clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员A)的C型凝集素样结 构域（CTLD)"可以与术语"clecl4a-CTLD"或"clecl4aCTLD"互换使用。
[0066] 根据另一个方面，本发明提供了clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员 A)-CTLD(C型凝集素样结构域）的分离的多肽作为表位，其可用于抑制血管生成。优选地，clecl4a可以来源于人类、黑猩猩或小鼠。
[0067] 如本文所用，术语"表位"是指确定抗原特异性的抗原部分，并且可以与抗原决定 簇或抗原决定位点互换使用。对于本发明的目的，表位是指具有clel4a的氨基酸序列的横 跨第31个氨基酸至第172个氨基酸的氨基酸序列的CTLD，其可用于抑制血管生成，或者表 位可以是指具有与CTLD相同功能的多肽。因此，可以包括CTLD的额外的区域。只要多肽具 有与CTLD相同的作用，任何多肽都可用作表位，如具有80%、85%、90%、95%、98 %或99 % 或更高同一性的氨基酸序列的多肽。人类、小鼠和黑猩猩的CTLD的氨基酸序列（从第31 个氨基酸至第172个氨基酸）列于表1中，并分别命名为SEQIDN0 :9、10和133。本发明 人首先发现，SEQIDN0 :9、10和133的氨基酸序列可以作为表位，其可用于制备抑制血管 生成的抗体。
[0068] 此外，在一个优选的实施方式中，表明了CTLD的N-末端或C-末端区域可以作为 表位，其可用于生产抑制血管生成的抗体（图l〇b)。优选地，CTLD的N-末端区域可以是包 含CTLD上第1个氨基酸至第42个氨基酸的氨基酸片段的区域或包含CTLD上第1个氨基 酸至第62个氨基酸的氨基酸片段的区域。优选地，CTLD的C-末端区域可以是包含CTLD 上第82个氨基酸至第142个氨基酸的氨基酸片段的区域、包含CTLD上第62个氨基酸至第 142个氨基酸的氨基酸片段的区域或包含CTLD上第122个氨基酸至第142个氨基酸的氨基 酸片段的区域。
[0069] 抗体可以特异性结合于clecl4a_CTLD或其有效片段以抑制血管生成，本发明人 表明，clecl4a-CTLD是一个独特的结构域，其以CTLD-CTLD相互作用依赖性的方式调节血 管生成。第一，clecl4a-CTLD(尤其是氨基酸31-172)通过调节肌动蛋白细胞骨架重排在 clecl4a介导的细胞迀移中发挥了关键作用。第二，与我们的观察一致，clecl4a-CTLDIgG 特异性抑制clecl4a介导的细胞-细胞接触。第三，通过clecl4a_CTLDIgG调节clecl4a 特异性抑制HUVEC的迀移和血管形成。最后，通过clecl4a_CTLDIgG特异性抑制clecl4a CTLD-CTLD复合物的形成。
[0070] 高亲和力的clecl4a-CTLDIgG特异性抑制内皮细胞的迀移和血管形成，而不影响 细胞活力和活化。clecl4a仅表达于内皮细胞中且可能是特异性的肿瘤内皮细胞标记物。 有理由推测，Clecl4a-CTLD抗体可能在正常内皮细胞中有较少的副作用，靶向仅表达于肿 瘤内皮细胞的clecl4a，并在clecl4a介导的肿瘤进展中抑制血管生成。此外，贝伐单抗和 西妥昔单抗是治疗性抗体，其通过抑制可溶性血管生长因子和其受体的相互作用来抑制血 管生成。然而，由于肿瘤细胞分泌的促血管生成因子的冗余，长期使用这些药物会产生抗性 肿瘤表型。这可能对在需要长期治疗的患者中使用抗可溶性生长因子的抗体造成最大的挑 战。Clecl4a是I型跨膜蛋白，其对内皮细胞与细胞的接触是至关重要的。本文所开发的clecl4a-CTLDIgG以浓度依赖的方式特异性阻断CTLD-CTLD相互作用，并且通过IgG交联 clecl4a来诱导clecl4a在内皮细胞膜上的下调。在交联的2小时内，clecl4a_CTLDIgG 以点状图案出现在HUVEC内，这表明了抗体诱导的内吞作用。因此，clecl4a-CTLDIgG在 抑制血管生成中可能有双重作用机制。
[0071]因此，抗体可抑制血管生成，优选通过抑制细胞迀移、血管形成或细胞-细胞接 触，更优选通过抑制clecl4a介导的细胞迀移、血管形成、clecl4a介导的细胞-细胞接触 或clecl4aCTLD-CTLD复合物的形成或诱导血管内皮细胞的表面上的clecl4a的下调。
[0072] 由于对内皮细胞的活力和活化没有影响（图6A和6B)，本发明的抗体可以用作治 疗性抗体。
[0073] 在本发明的一个实施方式中，本发明的clecl4a_CTLDIgG被鉴定为抑制内皮细胞 迀移（图5a和5b)和血管形成（图5c和5d)，并且特异性抑制clecl4a介导的细胞-细 胞接触（图7a和7b)，这表明此抗体可以在肿瘤血管生成中抑制内皮细胞-细胞接触。此 外，clecl4a-CTLDIgG阻断了clecl4aCTLD-CTLD相互作用（图 8a、8b和 8c)。此外，发现 本发明的抗体在HUVEC的表面上诱导clecl4a的下调（图9a和9b)。这些结果表明，本发 明的抗体有效地抑制了clecl4a介导的血管生成，因此，可以应用于与血管生成相关疾病 或癌症的治疗中。
[0074] 优选地，本发明的抗体可以包括重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含 由SEQIDN0:14的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDN0:16的氨基酸序列定义的重 链⑶R2和由SEQIDN0:18的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区包含由SEQIDN0: 42的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDNO:44的氨基酸序列定义的轻链⑶R2和由 SEQIDN0:46的氨基酸序列定义的轻链CDR3,更优选抗体可以包含具有SEQIDN0:125的 氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO:129的氨基酸序列的轻链可变区，但不限于此。 编码抗体的核酸可以包含重链核酸序列和轻链核酸序列，其中重链核酸序列包含示于SEQ IDN0:70的重链CDR1核苷酸序列、示于SEQIDN0:72的重链CDR2核苷酸序列和示于SEQ IDN0 :74的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序列包含示于SEQIDN0 :77的轻链⑶R1核 苷酸序列、示于SEQIDN0:79的轻链CDR2核苷酸序列和示于SEQIDN0:81的轻链CDR3 核苷酸序列，但不限于此。在本发明的一个实施方式中，包含具有SEQIDNO:125的氨基酸 序列的重链可变区和具有SEQIDN0 :129的氨基酸序列的轻链可变区的人单克隆抗体被命 名为克隆1，编码抗体的核酸可以包含编码重链可变区的SEQIDN0 :133的核苷酸序列和 编码轻链可变区的SEQIDN0 :134的核苷酸序列，但不限于此。
[0075] 在一个优选的实施方式中，本发明的抗体可以包括重链可变区和轻链可变区，其 中重链可变区包含由SEQIDN0:21的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDN0:23的氨 基酸序列定义的重链⑶R2和由SEQIDNO:25的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区 包含由SEQIDN0:49的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDN0:51的氨基酸序列定义 的轻链⑶R2和由SEQIDN0 :53的氨基酸序列定义的轻链⑶R3,更优选地，抗体可以包含具 有SEQIDN0:126的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDN0:130的氨基酸序列的轻链 可变区，但不限于此。编码抗体的核酸可以包括重链核酸序列和轻链核酸序列，其中重链核 酸序列包含示于SEQIDN0 :84的重链CDR1核苷酸序列、示于SEQIDN0 :86的重链CDR2 核苷酸序列和示于SEQIDNO:88的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序列包含示于SEQID N0:91的轻链CDR1核苷酸序列、示于SEQIDN0:93的轻链CDR2核苷酸序列和示于SEQID NO:95的轻链⑶R3核苷酸序列，但不限于此。在本发明的一个实施方式中，包含具有SEQ IDNO: 126的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO: 130的氨基酸序列的轻链可变区 的人单克隆抗体被命名为克隆2,编码抗体的核酸可以包含编码重链可变区的SEQIDNO: 135的核苷酸序列和编码轻链可变区的SEQIDNO:136的核苷酸序列，但不限于此。
[0076] 在另一个优选的实施方式中，本发明的抗体可以包括重链可变区和轻链可变区， 其中重链可变区包含由SEQIDN0:28的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDN0:30的 氨基酸序列定义的重链⑶R2和由SEQIDNO:32的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变 区包含由SEQIDN0:56的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDN0:58的氨基酸序列定 义的轻链⑶R2和由SEQIDN0 :60的氨基酸序列定义的轻链⑶R3,更优选地抗体可以包含 具有SEQIDN0:127的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDN0:131的氨基酸序列的 轻链可变区，但不限于此。编码抗体的核酸可以包括重链核酸序列和轻链核酸序列，其中重 链核酸序列包含示于SEQIDN0 :98的重链⑶R1核苷酸序列、示于SEQIDN0 :100的重链 ⑶R2核苷酸序列和示于SEQIDN0 :102的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序列包含示于 SEQIDN0:105的轻链CDR1核苷酸序列、示于SEQIDN0:107的轻链CDR2核苷酸序列和 示于SEQIDN0 :109的轻链⑶R3核苷酸序列，但不限于此。在本发明的一个实施方式中， 包含具有SEQIDN0:127的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDN0:131的氨基酸序列 的轻链可变区的人单克隆抗体被命名为克隆3,编码抗体的核酸可以包含编码重链可变区 的SEQIDN0 :137的核苷酸序列和编码轻链可变区的SEQIDN0 :138的核苷酸序列，但不 限于此。
[0077] 在进一步的实施方式中，本发明的抗体可以包括重链可变区和轻链可变区，其中 重链可变区包含由SEQIDN0:35的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDN0:37的氨基 酸序列定义的重链⑶R2和由SEQIDNO:39的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区包 含由SEQIDN0:63的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDN0:65的氨基酸序列定义的 轻链⑶R2和由SEQIDN0 :67的氨基酸序列定义的轻链⑶R3,更优选地抗体可以包含具有 SEQIDN0:128的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDN0:132的氨基酸序列的轻链可 变区，但不限于此。编码抗体的核酸可以包括重链核酸序列和轻链核酸序列，其中重链核酸 序列包含示于SEQIDN0:112的重链CDR1核苷酸序列、示于SEQIDN0:114的重链CDR2 核苷酸序列和示于SEQIDNO:116的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序列包含示于SEQID NO: 119的轻链CDR1核苷酸序列、示于SEQIDNO: 121的轻链CDR2核苷酸序列和示于SEQ IDNO:123的轻链⑶R3核苷酸序列，但不限于此。在本发明的一个实施方式中，包含具有 SEQIDN0:128的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDN0:132的氨基酸序列的轻链可 变区的人单克隆抗体被命名为克隆4,编码抗体的核酸可以包含编码重链可变区的SEQID NO:139的核苷酸序列和编码轻链可变区的SEQIDNO:140的核苷酸序列，但不限于此。
[0078] 因此，只要抗体特异性识别Clecl4a-CTLD，发现即使由异源序列组成的抗体也能 抑制血管生成。因此，它们被鉴定为有效地适用于血管生成相关疾病或癌症的预防或治疗。
[0079] 当本发明的抗体包含恒定区，其可以衍生自1^6、]^4、]^0、]^￡、]^|/[或其组合或其 杂交体。
[0080] 如本文所用，"组合"是指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc片段的多肽被连接到 不同来源的单链多肽上以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可以由选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的恒定结构域中的两个或更多个恒定结构域形成。
[0081] 如本文所用，术语"杂交体"是指编码不同来源的两个或更多个重链恒定结构域的 序列共存于一个单链免疫球蛋白的重链恒定结构域中。例如，结构域杂交体可以包含选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的CH1、CH2、CH3和CH4的一个至四个结构域。此外，组合或杂交 体可以用来自IgG亚型IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定结构域制备。组合和杂交体如 上所定义。
[0082] 此外，当本发明的抗体进一步包含轻链恒定区时，其可以衍生自A轻链或k轻 链。
[0083] 优选地，抗体可以是人单克隆抗体，其可以特异性结合鼠clecl4a_CTLD和人 Clecl4a-CTLD，从而抑制血管生成。人抗体于人类和小鼠中均其作用的能力（即交叉反应 性）提供了使人抗体适用于小鼠中的临床前研宄的优势。
[0084] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种包含所述核酸的载体和包含所述载 体或所述核酸的宿主细胞。
[0085] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种制备特异性结合clecl4a(C型凝集 素结构域家族14,成员A)的抗体的方法，其中优选结合人类clecl4a-CTLD(C型凝集素样结 构域）或人和鼠clecl4a_CTLD。优选地，抗体可以是人单克隆抗体。制备抗体的方法可以 包括使用功能结构域进行生物淘选。此外，本发明提供了生产所述抗体的方法，其包括培养 所述宿主细胞，使得核酸表达以产生抗体。
[0086] 可以使用公知技术容易地制备本发明的单克隆抗体。可以通过例如但不限于用来 自免疫动物的B淋巴细胞构建的杂交瘤（Koeher和Milstein，1976，Nature，256:495)或噬 菌体展示技术来进行单克隆抗体的生产。
[0087]优选地，本发明的单克隆抗体的生产可以通过使用噬菌体展示技术来实 现。本发明的方法可以参照如Barbas等人（METHODS:ACompaniontoMethodsin Enzymology2:119, 1991andJ.Virol. 2001Jul;75 (14): 6692-9)和Winter等人（Ann.Rev. Immunol. 12:433, 1994)逐步进行。用于构建抗体文库的噬菌体可以是丝状噬菌体，其可以 例如是fd、M13、fl、Ifl、Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pfl和Pf3,但不限于此。可用于在丝状噬菌体 表面展示外源基因的载体的实例包括噬菌体载体，如fUSE5、fAFFl、fdCATl和fdtetDOG，或 噬菌粒载体，如pHENl、pComb3、pComb8和pSEX，但不限于此。使用辅助噬菌体以提供外壳 蛋白的野生型版本，这些蛋白是用于扩增的重组噬菌体成功再感染所需要的，辅助噬菌体 可以是M13K07和VSCM13,但不限于此。
[0088] 通过使用典型方法，可以容易地分离根据本发明的编码杂交瘤衍生的单克隆抗体 或噬菌体展示克隆的多核苷酸并进行测序。例如，可以使用寡核苷酸引物，其被设计来特异 性扩增来自杂交瘤或噬菌体模板DNA的重链和轻链的编码区。一旦将其分离，可以将多核 苷酸插入到表达载体中，然后将表达载体导入宿主细胞。所得的宿主细胞（即转化体）进 而可产生目标单克隆抗体。因此，本发明的抗体的制备方法可以包括扩增携带编码抗体的 多核苷酸的表达载体。优选地，可以通过从人类scFv文库中预清除Fc结合剂并用功能结 构域进行生物淘选技术以选择特异性克隆来制备重组抗体。
[0089] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了编码表位或抗体的多核苷酸、携带多核 苷酸的表达载体和将载体锚定的转化体。
[0090] 抗体如上所述。
[0091] 携带根据本发明的表位或抗体的表达载体可以包括但不限于，允许多核苷酸在真 核或原核细胞（如哺乳动物细胞（如人类、猴、兔、大鼠、仓鼠、小鼠等）、植物细胞、酵母、昆 虫细胞和细菌细胞（如大肠杆菌））中复制和/或表达的载体。优选地，载体具有合适的启 动子和至少一个选择标记物，其中启动子有效连接至多核苷酸以便诱导目标基因的表达。 例如，可以将多核苷酸引入进噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。 [0092]携带编码抗体的多核苷酸的表达载体可以是分别携带编码 抗体重链和编码抗体 轻链的多核苷酸的表达载体的组合物，或者是同时携带编码抗体重链和轻链的多核苷酸的 表达载体。
[0093]通过引入根据本发明的表达载体所产生的转化体的实例包括但不限于，细菌细 胞如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；酵母菌；真菌如毕赤酵母；昆虫细胞如果蝇、夜 蛾Sf9 ;动物细胞如CH0(中国仓鼠卵巢细胞）、SP2/0(小鼠骨髓瘤）、人淋巴母细胞、C0S、 NS0 (小鼠骨髓瘤）、293T、黑色素瘤细胞、HT-1080、BHK(幼仓鼠肾细胞）、HEK(人胚肾细胞） 和PERC. 6 (人视网膜细胞）和植物细胞。
[0094]如本文所用，术语"引入"是指将编码表位或抗体的多核苷酸递送到细胞中。可以 通过使用本领域公知的各种方法进行引入，其包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导 的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、Lipofectamine转染和原生质 体融合。转导是指一种方法，通过该方法，经由病毒载体在感染的基础上将外源DNA转移至 另一细胞中。此外，可以通过基因轰击来实现载体到宿主细胞的递送。在本发明中，引入可 以与转化互换使用。
[0095]根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于抑制血管生成的组合物，其中组合 物包含所述抗体。
[0096]由于本发明的抗体能够有效地抑制血管生成，包含作为活性成分的抗体的组合物 可以用于抑制血管生成，并进一步用于预防或治疗血管生成相关疾病。
[0097] 如本文所用，术语"抑制血管生成"是指抑制从预先存在的血管来的新血管的形 成或生长。对于本发明的目的，通过抑制细胞迀移、细胞与细胞的接触来实现血管生成的 抑制，更优选地通过抑制clecl4a介导的细胞的迀移、clecl4a介导的细胞-细胞的接触、 HUVEC的迀移或血管的形成、clecl4aCLTD-CLTD复合物的形成。
[0098]如本文所用，术语"血管生成相关疾病"是指在其发作或进展中涉及血管生成的疾 病。只要可以用该抗体治疗，任何疾病均可以落入血管生成相关疾病的范围内，而没有限 制。血管生成相关疾病的实例包括癌症、转移、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、角膜 移植排斥、视网膜黄斑变性、新生血管性青光眼、皮肤红变、增殖性视网膜病变、银肩病、血 友病性关节炎、动脉粥样硬化斑块中的毛细血管形成、瘢痕瘤、伤口肉芽、血管粘附、类风湿 关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、猫抓病、溃 疡、肝硬化、肾炎、糖尿病性肾病、糖尿病、炎性疾病和神经变性疾病，但不限于此。此外，癌 症选自食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、结肠癌、乳癌、子宫颈癌、子 宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、结缔组织癌、皮肤 癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤和多发性骨髓血癌，但不限于此。
[0099] 如本文所用，术语"阻止"或"预防"是指由于施用根据本发明的抗体或组合物，而 导致目标疾病发作的抑制或延迟的任何行为。术语"治疗"或"疗法"是指由于施用根据本 发明的抗体或组合物，而导致目标疾病症状的好转或症状的有益改善的任何行为。
[0100] 包含本发明的抗体的组合物优选是药物组合物，并且可以进一步包括通常用于本 领域中的合适的载体、赋形剂或稀释剂。
[0101] 包含药学上可接受载体的药物组合物可以是各种口服或非口服的剂型，如片剂、 丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂、内用溶液、乳剂、糖浆剂、无菌水溶液、非水性溶液、悬 浮液、冻干剂和栓剂。在这方面中，本发明的药物组合物可以与稀释剂或赋形剂联合配制， 其中稀释剂或赋形剂是如填料、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。用于口服 给药的固体制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等的形式。对于这些固体制剂，本 发明的化合物与至少一种赋形剂联合配制，其中赋形剂是如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明 胶。除了简单的赋形剂，可以使用润滑剂如硬脂酸镁、滑石等。用于口服给药的液体制剂是 混悬液、内用溶液、乳剂、糖浆等。除了简单的稀释剂如水或液体石蜡，可以在液体制剂中包 含各种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。此外，本发明的药物组合物可以是肠 胃外剂型，如无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮液、乳剂、冻干剂、栓剂等。可注射的丙二醇、聚 乙二醇、植物油如橄榄油和酯如油酸乙酯可以适合于非水溶剂和悬浮剂。栓剂的基础材料 包括Wit印sol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂脂和甘油明胶。
[0102] 以药学上有效的量施用本发明的组合物。
[0103] 如本文所用，术语"药学上有效的量"是指处于合理的利益/风险比并适用于任何 的医学治疗的足够用于治疗疾病的药物组合物的量。有效量可以取决于各种因素而变化， 这些因素包括所治疗的疾病的严重程度、患者的年龄和性别、疾病的种类、药物的活性、对 药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄速率、治疗的时间段、药物的联合给药和其它本领 域公知的参数。本发明的组合物可单独施用或与其它治疗剂组合施用。在这种情况下，可 以顺序地或同时地与常规疗法一起进行施用。此外，可以以单个剂量或可被分成多个剂量 施用组合物。在充分考虑这些因素的情况下，施用足以产生最大效果而无副作用的最小剂 量是重要的。本领域的专家可以容易地确定剂量。本发明的药物组合物的剂量不受特殊的 限制，但取决于各种因素而变化，这包括患者的健康状态和体重、疾病的严重程度、药物的 种类、给药途径、给药时间。可以每天单个剂量或多个剂量、经任何通常可接受的途径向哺 乳动物施用组合物，哺乳动物包括大鼠、家畜、人类等，通常可接受的途径为如口服给药、直 肠给药、静脉内给药、皮下给药、子宫内给药或脑血管内给药。
[0104] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了抑制血管生成的方法，其包括向有需要 的受试者施用抗体或组合物。
[0105] 抗体、组合物和抑制血管生成如上所述。
[0106] 详细地，本发明的抑制方法包括向需要抑制血管生成的受试者施用药学上有效剂 量的药物组合物。受试者可以是哺乳动物如狗、牛、马、兔、小鼠、大鼠、鸡和人类，但不限于 此。可以经肠胃外、皮下、腹膜内、肺内或鼻内或经合适的方法（包括（如果需要的话）用 于局部治疗的病灶内注射）施用药物组合物。本发明的药物组合物的优选剂量取决于各 种因素，这包括受试者的健康状况和体重、疾病的严重程度、药物的种类、给药途径、给药时 间，这些可由本领域技术人员容易地确定。
[0107] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其 中药物组合物包含抗体。
[0108] 术语"抗体"、"预防"和"治疗"如上所定义。
[0109] 只要可以用本发明的肽进行治疗，癌症不受任何限制。优选的是其中发生Clecl4a 介导的肿瘤进展的癌症。详细地，用本发明的抗体通过抑制血管生成来阻止癌症的发作或 进展。癌症的实例包括食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、结肠癌、乳 癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、结 缔组织癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤和多发性骨髓血液癌，但 并不限于此。
[0110] 此外，可以出于各种目的将本发明的抗体与其它的抗体或生物活性剂或材料组合 使用。
[0111] 在本发明的一个实施方式中，发现本发明的抗体抑制血管生成，从而导致癌症发 作或进展的延缓或阻止。因此，本发明的抗体有效地适用于预防或治疗癌症。
[0112] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法，其包括向有需要 的受试者施用抗体或药物组合物以预防或治疗癌症。
[0113] 抗体、组合物和癌症如上所述。
[0114] 在治疗方法中，向疑似癌症受试者施用药学上有效量的药物组合物。受试者可以 是哺乳动物，如狗、牛、马、兔、小鼠、大鼠、鸡和人类，但不限于此。可以经肠胃外、皮下、腹膜 内、肺内或鼻内或经合适的方法（包括（如果需要的话）用于局部治疗的病灶内注射）来 施用药物组合物。本发明的药物组合物的优选剂量取决于各种因素，这包括受试者的健康 状况和体重、疾病的严重程度、药物的种类、给药途径、给药时间，且这些可由本领域技术人 员容易地确定。
[0115] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于癌症的诊断组合物，其包含抗 体。
[0116] 抗体和癌症如上所述。
[0117] 优选的是，其中特异性表达clecl4a的癌症。
[0118] 如本文所用，术语"诊断"是指病理状态的存在或性质的评价。出于本发明的目的， 诊断是确定癌症的发病率。
[0119] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于癌症的诊断试剂盒，其包括诊 断组合物。
[0120] 本发明的试剂盒可检测癌症的标记物_clecl4a，优选clecl4a的CTLD。本发明的 检测试剂盒可包含选择性识别标记物的抗体、以及一种或多种组合物、溶液或适合于分析 方法的装置。
[0121] 优选地，诊断试剂盒可包括用于抗体的免疫学检测的基质、合适的缓冲液、着色酶 或标记有荧光物质的二抗、着色底物等。基质可以使用硝酸纤维素膜、聚乙烯树脂制造的96 孔板、聚苯乙烯树脂制造的96孔板和载物玻璃。着色酶可以使用过氧化物酶和碱性磷酸 酶。荧光物质可以使用FITC和RITC，并且着色底物溶液可以使用ABTS(2,2'_连氮基-双 (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸））、0PD(邻苯二胺）或TMB(四甲基联苯胺）。
[0122] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于诊断癌症的方法，其包含通过 抗原-抗体复合物从疑似癌症受试者中分离的生物样品中检测clecl4a，优选检测 clecl4a_CTLD〇
[0123] 抗体、癌症和诊断如上所述。
[0124] 更具体地，可以通过已知的方法从生物样品中分离蛋白。
[0125] 如本文所用，术语"生物样品"包括展示了癌症标记物clecl4a，优选 clecl4a-CTLD，的表达水平差异的样品，如组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、痰、脑脊液或 尿液，但不限于此。
[0126] 通过使用检测方法，也可以通过比较clecl4a(优选clecl4a_CTLD)在疑似癌症患 者中的表达水平和正常对照组中的表达水平来诊断癌症的发生。即，将疑似癌症细胞中的 本发明的标记物的表达水平与正常细胞中的表达水平相比较。如果观察到在疑似癌症细胞 中标记物的表达水平显著增加，则可以将疑似癌症诊断为癌症。
[0127] 用于测定蛋白水平的分析方法包括但不限于，Western印迹、ELISA、放射免疫分 析、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组化染色、免疫沉淀分析、补 体固定分析、FACS和蛋白芯片分析。通过使用分析方法，将疑似癌症患者与正常对照的形 成的抗原-抗体复合物的量进行比较，并通过评估癌症标记物基因的蛋白表达水平的显著 增加来诊断患者的疑似癌症。
[0128] 如本文所用，术语"抗原_抗体复合物"是指癌症标记物蛋白与其特异性抗体的结 合产物。形成的抗原-抗体复合物的量可以通过测量检测标记的信号强度来定量地确定。
[0129] 这样的检测标记物可以选自酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒、氧化还原分子 和放射性同位素，但本发明不限于这些实例。可作为检测标记的酶的实例包括但不限于， 0 _葡糖醛酸酶、0 -D-葡萄糖苷酶、-D-半乳糖苷酶、尿素酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶、 乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDP酶、核糖核酸酶、葡萄糖氧化酶和荧光素酶、 磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶和 内酰胺酶。荧光物质的实例包括但不限于，荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝 蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。配体的实例包括但不限于，生物素衍生物。发光物 质的实例包括但不限于，吖啶酯、荧光素和荧光素酶。微粒的实例包括但不限于，胶体金和 有色乳胶。氧化还原分子的实例包括但不限于，二茂铁、钌络合物、紫精、醌、Ti离子、Cs离 子、二酰亚胺、1，4_ 苯醌、氢醌、K4W(CN)8、[0s(bpy)3]2+、[RU(bpy)3]2+和[MO(CN) 8]4-。放射 性同位素的实例包括但不限于，3H、14C、32P、35S、36C1、51Cr、57Co、58Co、59Fe、9°Y、1251、1311 和 186Re。
[0130] 优选地，通过ELISA测量蛋白的表达水平。ELISA的实例包括直接ELISA，其使用标 记的抗体识别固定在固体支持物上的抗原；间接ELISA，其使用标记的抗体识别捕获抗体， 与固定在固体支持物上的抗原形成复合物；直接夹心ELISA，其使用另一个标记的抗体识 别固定在固体支持物上的抗原-抗体复合物中的抗原，以及间接夹心ELISA，其中另一个标 记的抗体与固定在固体支持物上的抗原-抗体复合物中的抗原反应，然后使用标记的次级 抗体识别另一个标记抗体。更优选地，通过夹心ELISA检测蛋白表达水平，其中样品与固定 在固体支持物上的抗体反应，并通过加入特异于抗原的标记抗体来检测所得到的抗原-抗 体复合物，然后通过酶促颜色显影，或通过加入特异于识别抗原-抗体复合物的抗原的抗 体的标记的次级抗体，然后通过酶促显影。可以通过测量癌症标记物蛋白和其抗体的复合 物形成的程度来诊断癌症的发生。
[0131] 此外，优选地，通过Western印迹使用一种或多种针对癌症标记物的抗体来测量 蛋白质的表达水平。从样品中分离总蛋白，进行电泳以按大小将蛋白分离，转印至硝酸纤维 素膜，并与抗体反应。通过使用标记的抗体测量利所产生的抗原-抗体复合物的量来测定 由基因表达产生的蛋白质的量，借此诊断癌症的发生。检测方法包括评估在对照和发生癌 症的细胞中的标记基因的表达水平的方法。mRNA或蛋白质水平可以表示为标记蛋白质的量 的绝对的（例如，yg/ml)或相对的（例如，信号的相对强度）差异。
[0132] 此外，优选地，通过使用一种或多种抗癌症标记物的抗体的免疫组化染色来测量 蛋白质的表达水平。收集并固定正常的上皮组织和疑似癌症组织，然后根据广泛已知的方 法制备石蜡包埋块。将块切成小的切片（数ym厚）并附着到玻璃载片上，并根据已知的 方法与所选的一种或多种抗体反应。
[0133] 随后，洗绦未反应的抗体，将反应的抗体与选自上述提及的检测标记进行标记，然 后在显微镜下进行观察。
[0134] 还优选地，使用蛋白芯片分析蛋白水平，蛋白芯片中排布一种或多种抗癌症标记 物的抗体并以高密度固定于衬底的预定位置上。在此方面中，从样品中分离蛋白质并与蛋 白芯片杂交以形成抗原-抗体复合物，然后对其进行读取以检查目标蛋白的存在或表达水 平，从而诊断癌症的发生。
[0135] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于抑制血管生成的组合物，其包括用 于抑制clecl4a表达的物质。
[0136] 优选地，所述物质可以是用于抑制clecl4a的CTLD的表达的物质。
[0137] 在本发明的一个实施方式中，鉴定了clecl4a的CTLD在抑制细胞迀移和血管形 成（如外肉伪足的形成）中发挥了重要的作用（图la、lb、2a和2b)。这些结果表明，抑制 clecl4a(优选clecl4a_CTLD)表达的物质抑制了血管生成。
[0138] 用于抑制clecl4a(优选clecl4a_CTLD)表达的物质包括反义寡核苷酸、siRNA寡 核苷酸、抗体、适配体、单链可变区片段、肽、低分子量化合物和天然提取物，但不限于此。
[0139] 优选地，用于抑制clecl4a(优选clecl4a_CTLD)表达的物质是特异性结合物质上 以抑制clecl4a(优选clecl4a-CTLD基因）表达的反义寡核苷酸或siRNA寡核苷酸。
[0140] 如本文所用，术语"反义寡核苷酸"是指DNA或RNA或其衍生物，其包含与特定 mRNA序列互补并结合到mRNA内的互补序列上以抑制mRNA翻译成蛋白质的核酸序列。反 义寡核苷酸序列可以是与clecl4a(优选clecl4a_CTLD)mRNA互补并能结合clecl4a(优选 clecl4a-CTLD)mRNA并能抑制clecl4a(优选clecl4a-CTLD)mRNA的翻译、细胞质易位或成 熟或所有其它整体生物功能所必需的活性的DNA或RNA序列。反义寡核苷酸具有6至100 个碱基，优选8至60个碱基，更优选10至40个碱基长度。
[0141] 可以在碱基、糖或骨架中的一个或多个位置上修饰反义寡核苷酸，以便改善效果 (DeMesmaeker等人，CurrOpinStructBiol. ,5(3) :343_55(1995))。可以使用例如硫代磷 酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基、环烷基或短链杂原子或杂环糖间键来修饰寡核苷 酸骨架。此外，反义寡核苷酸可以包含一个或多个取代的糖部分（moieties)。反义寡核苷酸 还可以包含经修饰的碱基。经修饰的碱基的实例包括次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧 啶（尤其是5-甲基胞嘧啶）、5_羟甲基胞嘧啶（HMC)、糖基HMC、龙胆二糖基HMC、2-氨基腺 嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱 氮鸟嘌呤、N6-(6-氨基己基）腺嘌呤和2, 6-二氨基嘌呤。此外，本发明的反义寡核苷酸可 以化学键合到一个或多个部分或缀合物上，以增强反义寡核苷酸的活性和细胞摄取。例如， 亲脂部分包括但不限于，胆固醇部分、胆留醇部分、胆酸、硫醚、巯基胆固醇、脂肪链、磷脂、 聚胺链、聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八烷基胺部分和己基氨基-羰基-羟胆固 醇部分。制备包括脂质部分的寡核苷酸的方法是本领域公知的（美国专利号5, 138, 045、 5, 218, 105和5, 459, 255)。经修饰的寡核苷酸在存在核酸酶的情况下可以具有增强的稳定 性以及对靶mRNA的增强的结合亲和力。
[0142] 可以在体外通过常规方法合成反义寡核苷酸并施用到体内，或可以在体内进行合 成。用于体外合成反义寡核苷酸的方法使用了RNA聚合酶I。用于在体内合成反义RNA的 方法包括使用在相反的方向上包含多克隆位点（MCS)的载体来进行反义RNA的转录。这样 的反义RNA优选地在其序列中包含翻译终止密码子以阻止翻译成肽序列。
[0143] 可以通过本领域已知的方法并参考clecl4a(优选clecl4a_CTLD)的核 苷酸序列来容易地设计本发明所用的反义寡核苷酸（Weiss,B.(编）：Antisense 01igodeoxynucleotidesandAntisenseRNA:NovelPharmacologicalandTherapeutic Agents，CRC出版社，BocaRaton，FL，1997 ;Weiss，B.等人，Antisen seRNAgene therapyforstudyingandmodulatingbiologicalprocesses.Cell.Mol.Life Sci.，55:334-358(1999))。
[0144] 如本文所用，术语"siRNA"是指一种核酸分子，其能够介导RNA干扰或基因沉 默（参考：W0 00/44895、W0 01/36646、W0 99/32619、W0 01/29058、W0 99/07409 和W0 00/44914)。由于siRNA能抑制靶基因的表达，其提供了一种有效的基因敲除或基因治疗的 方式。首先发现于植物、虫、果蝇和寄生虫中，最近对siRNA进行开发并用于哺乳动物细胞 的研宄。
[0145] 在将siRNA分子用于本发明的情况下，其可以具有一种结构，其中其有义链（对应 于clecl4a(优选clecl4a_CTLD)mRNA序列的序列）和其反义链（互补于clecl4a(优选 clecl4a-CTLD)mRNA序列的序列）形成双链。或者，其也可以是具有自互补的有义和反义链 的单链结构。
[0146]siRNA不限于其中双链RNA部分构成了完整的对的那些，也包括未配对部分如错 配（对应的碱基不互补）、凸出（在一条链上没有相应的碱基）等。siRNA的总长可以是10 至100个碱基，优选为15至80个碱基，更优选为20至70个碱基。
[0147]siRNA的末端可以是平末端或粘末端，只要其能够经RNA干扰（RNAi)抑制 clecl4a(优选clecl4a_CTLD基因）的表达。粘末端可以是3'或5'-粘末端。
[0148] 在本发明中，siRNA分子可具有插入在自互补的有义和反义链之间的短核苷酸序 列（如约5-15个核苷酸）。在这种情况下，自核苷酸序列的表达所形成的siRNA分子经分 子内杂交形成发夹结构，导致整个形成茎-环结构。将茎-环结构在体外或体内进行处理 以得到活化的能够介导RNAi的siRNA分子。
[0149] 如本文所用，术语"适配体"是指对特定靶分子具有结合亲和性的核酸分子。适配 体也可以通过结合特定靶分子来抑制特定靶分子的活性。本发明的适配体可以是RNA、DNA、 经修饰的核酸或其混合物。本发明的适配体还可以是线性或环状形式。本发明的适配体对 其长度没有特别地限制。通常，其可以具有约15-200个核苷酸的长度，例如约100个核苷 酸或更少，优选约80个核苷酸或更少，更优选约60个核苷酸或更少，最优选约45个核苷酸 或更少。本发明的适配体也可以具有约18、20或25个核苷酸或更多的长度。当核苷酸的 总数较小时，更容易进行化学合成和大量生产，并且在成本方面具有很大的优势。也容易进 行化学修饰，体内的稳定性高且毒性低。
[0150] 可以利用SELEX方法或其改进版（例如，Ellington等人，Nature, 1990 346,818-822;Tuerk等人，Science, 1990 249,505-510)来制备本发明的适配体。SELEX方 法是一种从具有10-14个不同核苷酸序列的寡核苷酸池中选择特异性结合靶分子的寡核 苷酸的方法。所使用的寡核苷酸具有约40个残基的随机序列，其侧翼为引物序列。此寡 核苷酸池被允许与靶分子混合，并且通过使用过滤器（filter)等仅收集结合至靶分子的 RNA。通过RT-PCR扩增所收集的寡核苷酸，并且将其作为下一循环的模板。通过重复此操 作约10次，获得特异性结合靶分子的适配体。通过增加循环数或使用竞争物质，浓缩并选 择显示出对靶分子具有更强结合潜力的适配体。因此，通过调整SELEX的循环数和/或改 变竞争性条件，能够在某些情况下获得具有不同的结合力或结合模式的适配体以及具有相 同的结合力或结合模式但具有不同碱基序列的适配体。SELEX方法包括通过PCR扩增的过 程；通过在过程中使用锰离子等造成突变，可能使SELEX具有更高的多样性。
[0151] 除了已知的SELEX方法，也可以对复合革E(complextargets)、活细胞或组织 使用Cell-SELEX方法以获得适配体（Guo等人，Int.丄]?〇1.5(^.，9(4):668,2008)，并且 Cell-SELEX方法具有针对疾病直接选择适配体而不需要表面上的靶分子的现有知识的优 势。此外，Cell-SELEX方法比传统SELEX方法优越之处在于，在选择过程中使用针对生理 状态下的靶蛋白的功能研宄是可能的，因为当分离时靶蛋白可能不显示其固有性状。
[0152] 同时，适配体以很多种结合方式结合靶分子，如基于磷酸基团的负电荷的离子键、 基于核糖的疏水键和氢键以及基于核酸碱基的氢键和堆积相互作用。特别地，基于以与构 成的核苷酸的数量相同的数量存在的磷酸基团的负电荷的离子键是强的，并且结合至存在 于蛋白正电荷表面上的赖氨酸和精氨酸。出于此原因，可以取代不直接结合到靶分子的核 酸碱基。特别地，由于茎结构的区域已经形成碱基对并朝向双螺旋结构的内侧，所以核酸碱 基不可能直接结合至靶分子上。因此，即使当一个碱基对被另一个碱基对替代时，适配体的 活性往往也不会降低。在其中没有碱基对形成的结构中，如环结构，只要核酸碱基不直接结 合到靶分子上，则碱基替代是可能的。例如，在核糖的2'位上，羟基基团被任何原子或基团 取代。原子或基团的实例可以包括氢原子、氟原子或-〇-烷基基团（如-〇-ch3)、-〇-酰基 基团（如-0-CH0)和氨基基团（如-NH2)。适配体总是保持其活性，除非直接结合到靶分子 上的官能团被取代或删除。
[0153] 此外，适配体是易于修饰的，这是因为它们允许化学合成。对于适配体而言，通过 使用MF0LD程序预测二级结构或通过X-射线分析或NMR分析预测立体结构，可以在一定程 度上预测哪个核苷酸会被取代或删除以及在哪里会插入一个新的核苷酸。可以容易地化学 合成所预测的具有新序列的适配体，并且可以使用现有分析系统来测定适配体是否保留了 活性。
[0154] 本发明的适配体可以是这样一种适配体，其中各个核苷酸的糖残基（如核糖）已 被修饰以增加结合活性、稳定性、药物递送性等。糖残基上的修饰的实例可以是在2'-位 的氧原子的替代、糖残基的3'-位和/或4'-位被另一个原子替代等。修饰的类型可以有 氣化、〇_烷基化（如〇_甲基化、〇_乙基化）、〇_芳基化、S-烷基化（如S-甲基化、S-乙 基化）、S-芳基化和胺化（如-nh2)。糖残基中的此类变化可以按已知的方法实施（例 如，Sproat等人，Nucle. Acid. Res. 1991 19, 733-738 ;Cotton等人，Nucl. Acid. Res. 1991 19, 2629-2635 ;Hobbs等人，Biochemistry 1973 12, 5138-5145)。
[0155] 本发明的适配体还可以具有改变（如通过化学取代）的核酸碱基（如嘌呤或嘧 啶）以增加结合活性。此类改变的实例可以是在5位上的嘧啶改变、在6-和/或8-位上 的嗓呤改变、具有环外胺（extracyclicamine)的改变、用4-硫尿苷的取代和用5-溴-尿 嘧啶或5-碘-尿嘧啶的取代。
[0156] 可以改变本发明的适配体中所包含的磷酸基团，以赋予对核酸酶和水解的抗性。 例如，P(0) 0基团可以被P(0)S(硫代酯（thioate))、P(S)S(二硫代酯）、P(0)NR2 (酰胺化 物）、P(0)R、R(0)OR'、C0 或CH2 (甲乙缩醛（formacetal))或 3' -胺（-NH-CH2CH2_)所取代 [其中，R或R'的各个单元独立地是H或者是取代的或未取代的烷基（如甲基、乙基）]。连 接基团是，例如-〇_、-N-或-S-，并且核苷酸可以经这些连接基团结合到相邻的核苷酸上。
[0157] 改变还可以包括这样的改变，如在3'和5'加帽。改变还可以通过进一 步向末端添加聚乙二醇、氨基酸、肽、反向dT、核酸、核苷、肉豆蔻、石胆酸-油烯基 (lithocolic-oleyl)、二十二酰基（docosanyl)、月桂酰、硬脂酰、棕榈酰、油酰、亚油酰 (linoleoyl)、其它脂质、类固醇、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光物质、抗癌剂、毒素、 酶、放射性物质、生物素等来进行。对于此类改变，参见例如美国专利号5, 660, 985和 5, 756, 703。
[0158] 此外，适配体被附着于脂质体或纳米颗粒的表面以将包封于脂质体或纳米颗粒中 的抗癌剂、毒素、肿瘤抑制基因和siRNA(小干扰RNA)递送到靶细胞中。
[0159] 在本发明中，用于抑制clecl4a(优选clecl4a_CTLD)的表达的材料，特别地，其活 性优选是特异性结合到clecl4a(优选clecl4a_CTLD)的抗体、肽、低分子量化合物或天然 提取物。
[0160] 可以特异性结合到clecl4a(优选clecl4a_CTLD)的抗体如上所阐明。
[0161] 可以通过本领域已知的典型方法获得特异性结合到clecl4a(优选 clecl4a_CTLD)以抑制其活性的肽，例如通过菌体展示（SmithGP,"Filamentousfusion phage:novelexpressionvectorsthatdisplayclonedantigensonthevirion surface".Science228 (4705):1315-1317 (1985);SmithGP,PetrenkoVA,"Phage display" ?Chem.Rev. 97 (2) : 391-410 (1997))。
[0162] 优选地，用于抑制血管生成的组合物可以通过抑制血管生成来治疗癌症。
[0163] 优选地，用于抑制血管生成的组合物可以通过抑制血管生成来治疗血管生成相关 疾病。
[0164] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于抑制血管生成的试剂盒，其包 括所述组合物，并且其中，所述组合物包含用于抑制clecl4a(优选Clecl4a-CTLD)的表达 的物质。
[0165] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于抑制血管生成的方法，其 包括向有需要的受试者施用组合物，并且其中，组合物包含用于抑制clecl4a(优选 Clecl4a-CTLD)的表达的材料。根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于治 疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用组合物，并且其中，组合物包含用于抑制 clecl4a(优选clecl4a_CTLD)的表达的材料。
[0166] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种抗体-药物偶联物，其包括附着到 药物上的如权利要求1至17任一项所述的抗体。药物可以是选自毒素、化疗剂、抗癌药、抗 生素、ADP-核糖基转移酶、放射性同位素和溶核中的任一个，但不限于此。
[0167] 优选地，抗体-药物偶联物能够被内化至细胞中。更优选地，细胞可以是癌细胞。 在本发明的一个实施方式中，clecl4a_CTLDIgG可以被内化至表达clecl4a的细胞如癌症 细胞中（图9a、9b)。
[0168] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗血管生成相关疾病的药 物组合物，其包括clecl4a的CTLD与Fc的融合蛋白。
[0169] 在本发明的一个实施方式中，hCTLD-Fc以浓度依赖的方式抑制血管的形成（图 11) 〇
【具体实施方式】
[0170]
[0171] 以下，参考实施例对本发明进行更详细地说明。对于本领域技术人员而言，显而易 见的是，这些实施例是说明性的目的，且不应被解释为限制本发明的范围。
[0172] 实施例1:细胞培养和转染
[0173] 在内皮生长培养基-2 (EGM-2)中维持人脐静脉内皮细胞 (HUVEC，Lonza，Baltimore,MD，美国）。在含有 10% (v/v)胎牛血清和 1% (v/v)青霉素 /链霉素的Dulbecco氏改良Eagle培养基中培养小鼠主动脉内皮细胞（MAEC)和C0S-7 细胞。将细胞维持于37°C和5 % 0)2的湿润的C02-受控培养箱中（Sanyo,Panasonic HealthcareCompany，Secaucus，NJ,美国）。于37°C和8%C02、在湿润的振荡孵育摇床 (InforsHT，Bottmingen,瑞士）中，将HEK293F细胞维持在补充有1% (v/v)青霉素/链 霉素的Freestyle?293表达培养基（Invitrogen)中。按制造商说明，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen,Carlsbad,CA,美国）将编码GFP、clecl4a_GFP(野生型clecl4a)或 clecl4aACTLD-GFP(clecl4aCTLD缺失突变体）的载体转染HUVEC和C0S-7 细胞。
[0174] 实施例2 :构建和制备人和小鼠的CTLDFc融合蛋白
[0175]使用引物 5' -TCGCGCGGCCGCTGCTCGGCCTCGGGGGCCTGC-3'（SEQIDN0 :1)和 5'-TC GCCTCGAGCTTGCACAGGTAGCCGITGG-3'（SEQIDN0:2)扩增编码hCTLD的氨基酸残基 31-172 的DNA。使用引物 5' -TCGCGGCCCAGGCGGCCTGITCGGCCTCGGGGGCTTG-3'（SEQIDN0 :3)和 5' -TCGCGGCCGGCCTGGCCCTTGCATAGGTAGCCATCGG-3'（SEQIDN0 :4)扩增编码mCTLD的相 同残基的DNA。用SfiI(NEB,Ipswich，MA,美国）酶切PCR片段（NEB，Ipswich，MA，美 国）并将其克隆到修饰的哺乳动物表达载体pCEP4(Invitrogen)中，其中pCEP4在克隆位 点的3'区域中编码人IgGl的铰链和CH2-CH3结构域（Dr.Chung馈赠，SeoulNational University,Seoul,南朝鲜）。将连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5a细胞中，并制备质 粒DNA。取 0? 75mg的各种DNA使用 1. 5mg聚乙稀亚胺（Polysciences,Inc.，Warrington, PA，美国）转染HEK293F细胞（6X108个细胞）。将转染的细胞维持在补充有1% (v/v)青 霉素/链霉素的Freestyle? 293表达培养基中。培养7天后，收集培养基并通过亲和层析 用蛋白ASepharose(RepliGen,Waltham,MA,美国）纯化融合蛋白。使用NanoDrop分光光 度计（Wilmington,DE，美国）对蛋白浓度进行定量。用PBS透析样品并用SDS-PAGE和考 马斯亮蓝染色分析样品。将最终的合并级分的等分试样储存于-80°C。
[0176]实施例3 :合成的人类scFv库的预清洗
[01 77]将合成的人类SCFV库再扩增（1^1^38〇?.?11386(118。137:3 13130四1：0^11^11皿1.ColdSpringHarbor,N.Y.:ColdSpringHarborLaboratoryPress;2001)。为了预清洗 Fc结合剂，将人类免疫球蛋白 _G(GreenCrossPharmaDerivativesCorp，Yong_in,韩国） 固定于蛋白质ASepharose上，并将抗体-蛋白质A复合物于37°C与文库孵育2小时。短 暂离心后，收集上清液并弃去沉淀。将此过程重复两次。通过噬菌体ELISA分析最终的上 清液，以评估清洗的程度。
[0178] 实施例4 :使用噬菌体展示来选择CTLD-特异性scFv
[0179]用免疫管（Immuno?tubemaxisorp,Nunc,Rochester,NY,美国）或包 被有4yg重组人（hCTLD-FC)或小鼠（mCTLD-Fc)融合蛋白的磁珠（Dynabeads M-270epoxy,Invitrogen)进行三轮生物淘洗，以选择具有跨物种反应性的克隆，如前所述 (BarbasCF.Phagedisplay:alaboratorymanual.ColdSpringHarbor,N.Y.:冷泉港实 验室出版社；2001;VestweberD.Lymphocytetraffickingthroughbloodandlymphatic vessels:morethanjustselectins,chemokinesandintegrins.EuropeanJournalof Immunology. 2003 ;33(5):1361-4)。从生长于输出板（outputplates)的克隆中随机选择 96个噬菌体克隆，并通过噬菌体酶免疫分析测试其对人类和小鼠CTLD的反应性。将最终的 scFv克隆的DNA进行测序，并将其归类至具有不同的互补决定区序列的4种scFv克隆中。
[0180]实施例 5 :clecl4a-CTLDIgG的制备
[0181]使用引物 5'-CGGGAATTCGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGCTGTCA GTAACTACAGGTGTCCTCTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTG-3'（SEQIDN0:5)和 5'-GGCGGGCCCTTG GTGGAGGCTGAGCTCACGGTGACCAGTGCCCTTGGCCCC-3'（SEQIDNO:6)扩增所选择的scFv克隆 (克隆 1-4)的重链可变区（VH)基因。使用引物 5'-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACACAITC TCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGAAGGACCAGTCTGTGCTGACTCAGCC-3'（SEQID N0:7)和 5'-GGCCGTACGTAGGACCGTCAGCTTGGTGCCTCCGCCTAAGACATAACCACC-3'（SEQIDNO: 8)扩增克隆的轻链可变区（VL)基因。设计Vg|物以在5'和3'末端添加EcoRI和Apal 限制性酶切位点。设计VL引物在末端添加Hindlll和BsiWI酶切位点。用合适的限制性 内切酶（NEB，Ipswich，MA，美国）酶切PCR片段并将其克隆到双顺反子哺乳动物表达载体 PCDNA3.l(Invitrogen)中，其中pCDNA3. 1在VH克隆位点的3'编码人类IgGl的铰链和 CH2-CH3 结构域（Dr.Hong馈赠，KangwonNationalUniversity,Chuncheon，Kangwon,南 卓月鲜）（SambrookJ,RussellDW.Molecularcloning:alaboratorymanual.第 3 版，冷 泉港；N.Y.:冷泉港实验室出版社；2001)。如前所述，制备并纯化Clecl4a-CTLDIgG(Kim HY,TsaiS,LoSC,WearDJ,IzadjooMJ.Productionandcharacterizatio nofchimeric monoclonalantibodiesagainstBurkholderiapseudomalleiandB.malleiusingthe DHFRexpressionsystem.PLoSONE[电子资源].6(5) :el9867)〇
[0182] 实施例6:伤口愈合和细胞迀移分析
[0183] 按制造商说明，使用CytoSelect?24孔伤口愈合分析试剂盒（CellBiolabs Inc,SanDiego,CA,美国）。简言之，通过仔细地向伤口愈合插件（insert)顶端的开口末 端插入枪头来向每个孔中加入转染了GFP、clecl4a_GFP或clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细 胞。当细胞生长至汇合时，将插件从孔中移除，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS)洗涤细胞两次。 在伤害后20小时获取图像。
[0184] 为了分析内皮细胞的迀移，在插件中培养HUVEC直至形成单层，并于37°C在没有 或存在20yg/ml的clecl4a-CTLDIgG或西妥昔单抗的情况下孵育9小时。用PBS洗涤 细胞两次，并用结晶紫（Sigma，St.Louis，M0,美国）染色。对于定量分析，在光学显微镜 (NikonTS100,Melville，NY，美国）下对每个板拍摄5个视野，并人工测量迀移距离。
[0185] 实施例7:免疫细胞化学
[0186]如前所述，进行免疫细胞化学（LeeS等人，Hydrogenperoxideincreaseshuman leukocyteadhesiontoporcineaorticendothelialcellsviaNFkappaB-dependent up-regulationofVCAM-l.IntImmunol. 2007Dec;19(12):1349-5926)。简言之，将在胶原 包被的盖玻片上生长1天的转染了GFP、clecl4a_GFP或clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细胞 和HUVEC，于37°C用4% (w/v)的低聚甲醛固定30分钟。用PBS洗涤细胞两次并于37°C在 含有5% (w/v)牛血清白蛋白（BSA)和0. 1%TX-100的PBS中孵育1小时以阻断反应。用 〇. 1单位/孔的罗丹明鬼笔环肽和2yg/ml的Hoechst孵育细胞1小时，并在荧光显微镜 (LeicaDM25〇0，Wetzlar，德国）下观察。
[0187]实施例 8:ELISA
[0188] 将PBS中的25nM的重组hCTLD-Fc、mCTLD-Fc或IgGl的Fc片段加入到96孔微量 滴定板中。于37°C孵育过夜后，用含有0.05% (v/v)吐温20的PBS(PBST)洗涤板三次，并 于37°C用含有3% (w/v)BSA的PBST孵育1小时。然后于37°C将板与在含有3% (w/v)BSA 的PBST中的67nM的clecl4a-CTLDIgG孵育3小时。用PBST洗涤板两次，并于37°C与在 含有3% (w/v)BSA的PBST中的辣根过氧化物酶（HRP)-缀合的抗-人X轻链抗体（Bethyl Laboratories,Montgomery,TX,美国，稀释 1 :1000)孵育 1 小时。
[0189] 为了测量CTLD-CTLD的相互作用，将转染了GFP、clecl4a_GFP或 clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细胞的裂解物（20yg)加入到96孔板的孔中，并于37°C用 在PBST中的3% (w/v)BSA孵育1小时，随后加入相同缓冲液中的0. 15yg的hCTLD-Fc或 Fc，并于37°C孵育2小时。为了分析与clecl4a-CTLDIgG的竞争，于37°C将hCTLD-Fc与 在含有3% (w/v)BSA的PBST中的增加浓度的clecl4a-CTLDIgG孵育2小时。然后将蛋 白质复合物加入到孔中并于37°C孵育2小时。在PBST中洗涤孔三次，并加入HRP-缀合的 驴抗-人FcIgG(1 :5000 ;JacksonImmunoresearchLaboratories,Inc. ,WestGrove,PA, 美国）并于37°C孵育1小时。在PBST中洗涤孔三次，并将100y1的TMB底物溶液（BD Biosciences，SanJose，CA，美国）加入到每个孔中。使用微量滴定板读数器（VICTOR? X4,PerkinElmer，Waltham，MA,美国）测量 450nm处的光密度。
[0190] 实施例9:流式细胞术
[0191] 将在6孔微量滴定板中生长的HUVEC(3X105)在没有或存在20ng/ml的 hTNFa(Millipore,Billerica,MA,美国）或 20yg/ml的clecl4a-CTLDIgG或西妥昔 单抗的情况下孵育24小时。收获细胞并于37°C与在流式细胞缓冲液中的20yg/ml的 抗-VCAM-1或ICAM-1多克隆抗体染色1小时。用流式细胞缓冲液洗涤细胞三次，lOOOXg离心10分钟并于37°C与在流式细胞缓冲液中的AlexaFluor488-标记的抗兔抗体（1: 1000;JacksonImmunoResearch)孵育 1 小时。
[0192] 用4% (w/v)的低聚甲醛固定在6孔微量滴定板中生长的HUVEC(3X105)。用PBS 洗涤固定和未固定的细胞两次，并于37°C在没有或存在20yg/ml的clecl4a-CTLDIgG的 情况下孵育2小时。于37°C用7. 5yg/ml的绵羊抗-clecl4a多克隆抗体染色细胞2小时。 用流式细胞缓冲液洗涤细胞三次，并与在流式细胞缓冲液中的NorthernLights?493荧光 染料（NL493)-标记的抗-绵羊抗体（1 :200 ;R&DSystems,Minneapolis,MN,美国）进行孵 育，并通过流式细胞仪进行分析（BDFACSCalibur,BDBioscience,Miami，FL,美国）。
[0193] 实施例10 :血管形成
[0194] 如前所述，进行血管形成的分析（RhoSS等人，Clecl4aisspecifically expressedinendothelialcellsandmediatescelltocelladhesion. Biochemical&BiophysicalResearchCommunications. 404 (1) : 103-8) 〇 简言之，将 250y1 的基质胶（BDBiosciences，Bedford，MA)加入到24孔板的孔中并于37°C聚合20分钟。收 获培养于EGM-2中的HUVEC，在EGM-2中重悬，并接种到基质胶（1X105细胞/孔）中。于 37°C将培养物在没有或存在clecl4a-CTLDIgG或西妥昔单抗的情况下孵育并在21小时时 拍照。人工计数血管。
[0195] 实施例11 :HUVEC细胞活力分析
[0196] 将HUVEC(104)接种于96孔微量滴定板中并于37°C与20yg/ml的clecl4a-CTLD IgG、西妥昔单抗或5-FU(Sigma)孵育2天。按制造商说明，使用CellCounting Kit-8(Dojindo，Kumamoto，日本）测量细胞活力。用VICTOR?X4分光光度计（Perkin Elmer)测定450nm处的吸光度。
[0197] 实施例12 :细胞-细胞接触的测量
[0198] 如前所述，进行细胞-细胞接触分析（RhoSS等人，Clecl4aisspecifically expressedinendothelialcellsandmediatescelltocelladhesion. Biochemical&BiophysicalResearchCommunications. 404(1) : 103-8)。简言之，用表达 GFP、Clecl4a-GFP和Clecl4aACTLD-GFP的质粒转染 1. 5X107的悬浮的HEK293F细胞，在 FreestyleTM293表达培养基中培养过夜，并接种于6孔板（5X105个细胞/孔）中。将细胞 在没有或存在20yg/ml的clecl4a-CTLDIgG或西妥昔单抗的情况下维持8小时。在至少 10个视野中对细胞团块（团块>4个细胞）进行计数并确定平均土标准偏差（SD)。
[0199] 实施例13 :免疫印迹分析
[0200] 如前所述，进行免疫印迹分析（VanMeterKE等人，Amonoclonal antibodythatinhibitstranslationinSf2lcel1lysatesisspecific forglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase.ArchivesofInsect Biochemistry&Physiology. 2008 ;69(3) : 107-17)D 简言之，通过 12%的聚丙稀酰胺凝胶电 泳分离转染了GFP-、clecl4a-GFP-或clecl4aACTLD-GFP的C0S-7 细胞的裂解物（20ug)。 使用湿式转印系统（GEHealthcareLifeSciences，Pittsburgh，PA，美国）将蛋白质转 移到硝酸纤维素膜上。于室温在含有5% (w/v)的脱脂奶粉的10mMTris/HCKpH7. 5)、 150mMNaCl和0. 05% (V/V)的吐温20(TTBS)中孵育膜1小时，随后于4°C与在相同溶液 中的抗_GFP单克隆抗体（1 :5000;SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA,美国）或 抗 肌动蛋白单克隆抗体（1 :5000;AppliedBiologicalMaterials,Richmond,BC,加 拿大）孵育过夜。用TTBS洗涤膜并于室温与在含有5% (w/v)脱脂奶粉的TTBS中的HRP-缀 合的AffiniPure山羊抗-小鼠IgG(l:5000;JacksonImmunoResearch，WestGrove,PA,美 国）孵育1小时。之后用TTBS洗涤数次，按制造商说明，使用SuperSignalWestPico化 学发光底物（Pierce,Rockford,IL,美国）将蛋白质条带可视化。
[0201] 实施例14 :细胞ELISA
[0202] 于 37°C将铺于 96 孔板中的HUVEC(104)与 20yg/ml的clecl4a-CTLDIgG或Fc 孵育0、10、30、60、120或180分钟。用冰冷的PBS洗涤细胞两次，于4°C用在PBS中的3% (w/v)BSA的封闭1小时，并于4°C与在封闭液中的绵羊抗_clecl4a多克隆抗体（1 :1000) 孵育2小时。用冰冷的PBS洗涤细胞三次，并于4°C与HRP-缀合的抗-绵羊IgG(l:5000 ; SantaCruzBiotechnology)孵育1小时。用PBS数次洗绦后，将100y1的TMB底物溶液 加入到各个孔中。使用微量滴定板读数器测量450nm处的光密度。
[0203] 实施例15 :用于表位定位的ELISA
[0204] 分别将在PBS中的10yg/ml的hCTLD-Fc、Fc或hCTLD-Fc的N-末端或C-末端 片段加入到96孔板中。于37°C将板孵育过夜，用含有0. 05% (v/v)吐温20的PBS(PBST) 洗涤三次，并于37°C用3% (w/v)BSA的PBST孵育1小时。于37°C在含有3% (w/v)BSA的 PBST中与10yg/ml的clecl4a-CTLDIgG孵育2小时。然后用PBST洗涤两次，于37°C与在 含有3% (w/v)BSA的PBST中的辣根过氧化物（HRP)缀合的抗-人A轻链抗体（1:1〇〇〇 ; Bethyl Laboratories, TX,美国）解育 1 小时。
[0205] 实施例16:在没有或存在hCTLD-Fc的情况下的血管形成分析
[0206] 将250y1的基质胶（BDBiosciences)加入到24孔板中并使其于37°C聚合20分 钟。收获培养于EGM-2中的HUVEC，并重悬于EGM-2中，并接种到基质胶上（1X105细胞/ 孔）。于37°C在没有或存在10和25yg/ml的hCTLDFc或Fc的情况下孵育培养物并在8 小时时拍照。
[0207] 实验实施例1 :Clecl4aCTLD在细胞迀移和外肉伪足形成中可能发挥了关键作用
[0208] 为了阐明CTLD在clecl4a介导的细胞迀移中的作用，用绿色荧光蛋白（GFP)、 融合了GFP的野生型clecl4a(clecl4a_GFP)或融合了GFP的clecl4aCTLD缺失突变体 (clecl4aACTLD-GFP)转染C0S-7细胞，并在伤口愈合分析中、在0和20小时时分析迀移。 表达野生型clecl4a的细胞的迀移程度是仅表达GFP的细胞的迀移程度的约1. 6倍，而 clecl4aACTLD缺失突变体的表达对迀移影响很小（图la和lb)。
[0209] 由于肌动蛋白细胞骨架重排特异性调节细胞迀移，使用免疫细胞化学来研宄表达 GFP、clecl4a-GFP或clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC)中的 肌动蛋白网络组织。在这两种细胞类型中，clecl4a-GFP的过表达急剧增加了外肉伪足的 形成，而GFP或clecl4aACTLD-GFP的影响最小（图2a和2b)。
[0210] 总而言之，这些结果表明，CTLD通过调节肌动蛋白细胞骨架重排在内皮细胞的迀 移中发挥了关键的作用。
[0211] 实验实施例2 :CTLD_特异性单链可变片段（scFv)的分离
[0212] 由于人类、小鼠或黑猩猩的clecl4a的CTLD(表1)是Fc融合蛋白，实施两个连续 的预清洗步骤以从合成的人类scFv文库中除去Fc结合剂；由噬菌体酶联免疫吸附分析验 证除去约90%。
[0213] [表 1]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217] 本发明中所使用的氨基酸序列上的氨基酸残基根据IUPAC-IUB命名法由缩写表 不〇
[0218] 丙氨酸：A 精氨酸：R
[0219] 天冬酰胺：N天冬氨酸：D
[0220] 半胱氨酸：C谷氨酸：E
[0221] 谷氨酰胺：Q甘氨酸：G
[0222] 组氨酸异亮氨酸：1
[0223] 亮氨酸：L赖氨酸：K
[0224] 甲硫氨酸：M苯丙氨酸：F
[0225] 脯氨酸：P丝氨酸：S
[0226] 苏氨酸：T色氨酸
[0227] 酪氨酸：Y缬氨酸：V
[0228] 然后用人（hCTLD-Fc)或小鼠（mCTLD-Fc)的CTLD融合蛋白、使用CTLD-Fc包被 的免疫管和磁性珠，交替地生物淘选文库，以分离具有跨物种CTLD反应性的克隆（图3a); 仅用磁珠鉴定出数个这样的克隆（图3b-3d)。随机选择96个噬菌体克隆，通过噬菌体酶 免疫分析挽救（rescue)。将克隆DNA测序，并选择四个同时识别人和小鼠的CTLD且具有 不同的互补决定区序列的克隆（克隆1-4)(表2至9)。同时，四个克隆可以特异性识别黑 猩猩的CTLD，具有交叉反应性，这是因为黑猩猩的clecl4a-凝集素的氨基酸序列与人类clecl4a-凝集素的氨基酸序列相同。
[0229] [表2]
[0230]
[0247] 同样，克隆1-4的核酸序列与下述表10至17是相同的。
[0248] [表 10]
[0249]
[0250]
[0263][表16]
[0264]
[0267]
[0268] 实验实施例3 :Clecl4a-CTLDIgG特异性识别人类和小鼠的clecl4a_CTLD
[0269] 将scFv克隆转化为IgG，表达于人胚胎肾293F(HEK293F)细胞中并纯化。通过十二 烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色，四个IgG克隆示出了大于 90%的纯度。ELISA表明，纯化的CTLD-特异性IgG(clecl4a-CTLDIgG)特异性结合人和小 鼠的CTLD-Fc，而不能仅是Fc。克隆1和2比克隆3和4示出了更大的亲和力（图4)。
[0270] 实验实施例4 :Clecl4a-CTLDIgG特异性抑制内皮细胞迀移和血管形成
[0271] 为了研宄clecl4a-CTLDIgG对内皮细胞迀移的抑制效果，在没有或存在 clecl4a-CTLDIgG的情况下用HUVEC进行伤口愈合分析。使用西妥昔单抗、抗-EGFR抗体 作为对照IgG。在所选择的clecl4a-CTLDIgG中，克隆1和2分别显著地抑制了约44% 和54%的HUVEC细胞迀移，而克隆3和4以及仅使用西妥昔单抗几乎没有效果。（图5a和 5b)〇
[0272] 为了确定clecl4a_CTLDIgG对血管形成的影响，在没有或存在clecl4a_CTLDIgG 和西妥昔单抗的情况下分析血管形成。如前述所报道的克隆1和2以及西妥昔单抗阻断了 HUVEC血管的形成，而其它克隆没有显著的效果（图5c和5d)。
[0273] 这些结果有力地表明，clecl4a_CTLDIgG特异性抑制肿瘤血管生成。
[0274] 实验实施例5 :Clecl4a-CTLDIgG对内皮细胞活力和活化的作用
[0275] 为了研宄clecl4a-CTLDIgG对内皮细胞活力的作用，在没有或存在clecl4a-CTLD IgG、西妥昔单抗或5-氟尿嘧啶（5-FU)、细胞凋亡诱导剂的情况下培养HUVEC两天，并使用 细胞计数试剂盒检测细胞活力。抗体对HUVEC活力几乎没有影响，而5-FU特异性降低了活 力（图6a)。
[0276] 为了确定clecl4a-CTLDIgG对内皮细胞活化的作用，在没有或存在clecl4a-CTLD IgG、西妥昔单抗或人肿瘤坏死因子a(hTNFa)的情况下培养HUVEC。基于血管细胞粘附 分子-l(VCAM-l)和细胞间粘附分子-l(ICAM-l)的表达（由流式细胞技术测定）来确定活 化。用hTNFa处理细胞，其诱导VCAM-1和ICAM-1的上调，并将其作为阳性对照。抗体和 西妥昔单抗对HUVEC活化没有效果（图6b)。
[0277] 综合考虑，这些结果表明，clecl4a-CTLDIgG对内皮细胞活力或活化几乎没有影 响。
[0278] 实验实施例6 :Clecl4a-CTLDIgG特异性抑制clecl4a介导的细胞-细胞接触
[0279] 为了阐明clecl4a_CTLDIgG在内皮细胞-细胞接触中的作用，测定细胞团块的 数量（其是clecl4a介导的细胞-细胞接触的指示剂），所述细胞团块由转染了GFP或 clecl4a-GFP并在没有或存在clecl4a-CTLDIgG或西妥昔单抗的情况下生长的HEK293F 细胞形成。表达clecl4a-GFP的细胞形成的细胞团块的数量比仅表达GFP的细胞高约4倍 (图7a和7b)。此外，克隆1和2显著地抑制了转染了clecl4a_GFP的细胞的成团，而其它 克隆和西妥昔单抗几乎没有效果。
[0280] 综合考虑，这些结果表明，clecl4a_CTLDIgG可能在肿瘤血管生成中的 clecl4a_介导的内皮细胞-细胞接触发挥了抑制作用。
[0281] 实验实施例7 :Clecl4a-CTLDIgG特异性阻断clecl4aCTLD-CTLD的相互作用
[0282] 使用免疫分析以确认转染的C0S-7细胞的裂解物中GFP、clecl4a-GFP和 clecl4aACTLD-GFP的表达（图8a)。然后将裂解物与hCTLD-Fc或Fc孵育以观察CTLD之 间的相互作用。虽然hCTLD-Fc可以与C0S-7细胞裂解物中的一些其它的蛋白质相互作用， 但其强烈地结合到clecl4a_GFP上但不结合到clecl4aACTLD-GFP上，这表明在内皮细胞 中存在特异性的CTLDCTLD相互作用（图8b)。
[0283] 为了确定clecl4a-CTLDIgG是否阻断CTLD-CTLD相互作用，用升高浓度的 clecl4a-CTLDIgG(克隆1)孵育hCTLD-Fc，并将蛋白质复合物与转染GFP或clecl4a-GFP 的细胞的裂解物一起孵育。竞争性ELISA表明，clecl4a-CTLDIgG以浓度依赖性方式特异 性抑制CTLD-CTLD的相互作用（图8c)，这表明clecl4a-CTLDIgG可以特异性阻断在内皮 细胞中的clecl4aCTLD-CTLD的相互作用。
[0284] 实验实施例8:与clecl4a_CTLDIgG的交联下调了HUVEC表面上的clecl4a
[0285] 为了研宄clecl4a-CTLDIgG在抑制前血管生成表型中可能的作用，使用流式细胞 技术以比较用clecl4a_CTLDIgG(克隆1)处理前后的HUVEC膜上的clecl4a表达水平。 IgG处理显著地降低了活细胞中的clecl4a，而不是多聚甲醛固定的细胞中的clecl4a(图 9a)〇
[0286] 为了确认clecl4a_CTLDIgG对HUVEC膜上的clecl4a的下调，用IgG(克隆1)或 Fc处理细胞并通过细胞ELISA测定膜clecl4a。Clecl4a_CTLDIgG以时间依赖性方式下调 HUVEC膜上的clecl4a(图 9b)。
[0287]这些结果有力地表明，clecl4a的clecl4a_CTLDIgG交联（cross-linking)特异 性下调了内皮细胞膜上的clecl4a。此外，这些结果表明，clecl4a_CTLDIgG能够被内化至 表达clecl4a的细胞如癌症细胞中。
[0288] 实验实施例9 :表位的精细定位
[0289]为了 精细定位表位，通过ELISA测试clecl4a_CTLD IgG对Clecl4a wtCTLD和 hCTLD-Fc的片段的特异性（图10a)。
[0290] 结果如图10b所示，克隆1和克隆2的clecl4a_CTLD IgG特异性结合hCTLD以及 wthCTLD的N-末端和C-末端。
[0291] 这些结果有力地表明，CTLD如克隆1和克隆2的clecl4a_CTLD IgG的N-末端或 C-末端区域特异性结合包含hCTLD中第1个氨基酸到第42个氨基酸的氨基酸片段的融合 蛋白、包含hCTLD中第1个氨基酸到第62个氨基酸的氨基酸片段的融合蛋白、包含hCTLD 中第82个氨基酸到第142个氨基酸的氨基酸片段的融合蛋白、包含hCTLD中第62个氨基 酸到第142个氨基酸的氨基酸片段的融合蛋白以及包含hCTLD中第122个氨基酸到第142 个氨基酸的氨基酸片段的融合蛋白，其可以被用作表位。
[0292] 实验实施例10:检测CTLD-Fc是否抑制血管形成的测试
[0293] 为了研宄hCTLD-Fc对血管生成的抑制作用，根据实施例16,在存在hCTLD-Fc或 Fc的情况下分析血管的形成。
[0294] 结果如图11所述，hCTLD-Fc以浓度依赖性方式抑制血管的形成。
[0295] 这些结果有力地表明，hCTLD-Fc特异性抑制肿瘤血管生成。
[0296] 工业实用性
[0297] 基于这一新的发现，即clecl4a的CTLD在细胞的迀移和外肉伪足的形成中发挥了 重要的作用，本发明鉴定了一种新的抗CTLD的抗体在抑制血管生成中的功能。因此，本发 明提供了一种可以用于抑制血管生成的新的靶结构域。此外，本发明的抗体可有效地用于 预防或治疗血管生成相关疾病或clecl4a介导的癌症。
[0298] 虽然本发明已参照具体特征进行了详细的描述，对于本领域技术人员而言，显而 易见的是，这些描述仅用于优选的实施方式，且并不限制本发明的范围。因此，本发明的实 质性的范围将由所附的权利要求及其等同物所限定。
[0299] 独立文本的序列表
[0300] 随附了电子文档。
【主权项】
1. 一种抗体，其特异性结合clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员A)。2. 如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性结合clecl4a的CTLD(C型凝集素样 结构域）。3. 如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性结合到clecl4a的CTLD的N末端或 C末端。4. 如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性结合到包含clecl4a的CTLD中的 第1个氨基酸至第42个氨基酸的氨基酸片段或clecl4a的CTLD中的第122个氨基酸至第 142个氨基酸的氨基酸片段的区域。5. 如权利要求2所述的抗体，其中所述抗体特异性结合具有交叉反应性的人、黑猩猩 和小鼠的clecl4a的CTLD。6. 如权利要求1所述的抗体，其抑制血管生成。7. 如权利要求2所述的抗体，其中CTLD是clel4a的氨基酸序列上横跨第31个氨基酸 至第172个氨基酸的区域的多肽。8. 如权利要求2所述的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含 由SEQIDNO:14的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDNO:16的氨基酸序列定义的重 链⑶R2和由SEQIDNO:18的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区包含由SEQIDNO: 42的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDNO:44的氨基酸序列定义的轻链⑶R2和由 SEQIDN0:46的氨基酸序列定义的轻链CDR3。9. 如权利要求2所述的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含 由SEQIDNO:21的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDNO:23的氨基酸序列定义的重 链⑶R2和由SEQIDNO:25的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区包含由SEQIDNO: 49的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDNO:51的氨基酸序列定义的轻链⑶R2和由 SEQIDNO:53的氨基酸序列定义的轻链⑶R3。10. 如权利要求2所述的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含 由SEQIDNO:28的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDNO:30的氨基酸序列定义的重 链⑶R2和由SEQIDNO:32的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区包含由SEQIDNO: 56的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDNO:58的氨基酸序列定义的轻链⑶R2和由 SEQIDNO:60的氨基酸序列定义的轻链⑶R3。11. 如权利要求2所述的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含 由SEQIDNO:35的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDNO:37的氨基酸序列定义的重 链⑶R2和由SEQIDNO:39的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区包含由SEQIDNO: 63的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDNO:65的氨基酸序列定义的轻链⑶R2和由 SEQIDNO:67的氨基酸序列定义的轻链⑶R3。12. 如权利要求2所述的抗体，其中所述抗体选自：包含具有SEQIDNO: 125的氨基 酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO:129的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；包含具有 SEQIDNO: 126的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO: 130的氨基酸序列的轻链可 变区的抗体；包含具有SEQIDNO:127的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO:131 的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；包含具有SEQIDNO:128的氨基酸序列的重链可变区 和具有SEQIDNO:132的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。13. 如权利要求1所述的抗体，其功能在于抑制细胞的迀移。14. 如权利要求1所述的抗体，其功能在于抑制血管的形成。15. 如权利要求1所述的抗体，其功能在于抑制细胞与细胞的接触。16. 如权利要求1所述的抗体，其功能在于抑制clecl4aCTLD-CTLD复合物的形成。17. 如权利要求1所述的抗体，其功能在于诱导血管内皮细胞表面上的clecl4a的下 调。18. -种核酸，其编码权利要求1至17中任一项所述的抗体。19. 如权利要求18所述的核酸，其中编码抗体的核酸包含重链核酸序列和轻链核酸序 列，其中重链核酸序列包含示于SEQIDNO:70的重链⑶Rl核苷酸序列、示于SEQIDNO: 72的重链⑶R2核苷酸序列和示于SEQIDNO:74的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序列 包含示于SEQIDNO:77的轻链CDRl核苷酸序列、示于SEQIDNO:79的轻链CDR2核苷酸 序列和示于SEQIDNO:81的轻链⑶R3核苷酸序列。20. 如权利要求18所述的核酸，其中编码抗体的核酸包括重链核酸序列和轻链核酸序 列，其中重链核酸序列包含示于SEQIDNO:84的重链⑶Rl核苷酸序列、示于SEQIDNO: 86的重链⑶R2核苷酸序列和示于SEQIDNO:88的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序列 包含示于SEQIDNO:91的轻链CDRl核苷酸序列、示于SEQIDNO:93的轻链CDR2核苷酸 序列和示于SEQIDNO:95的轻链⑶R3核苷酸序列。21. 如权利要求18所述的核酸，其中编码抗体的核酸包括重链核酸序列和轻链核酸序 列，其中重链核酸序列包含示于SEQIDNO:98的重链⑶Rl核苷酸序列、示于SEQIDNO: 100的重链⑶R2核苷酸序列和示于SEQIDNO: 102的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序 列包含示于SEQIDNO: 105的轻链CDRl核苷酸序列、示于SEQIDNO: 107的轻链CDR2核 苷酸序列和示于SEQIDNO: 109的轻链⑶R3核苷酸序列。22. 如权利要求18所述的核酸，其中编码抗体的核酸包括重链核酸序列和轻链核酸序 列，其中重链核酸序列包含示于SEQIDNO:112的重链⑶Rl核苷酸序列、示于SEQIDNO: 114的重链⑶R2核苷酸序列和示于SEQIDNO: 116的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序 列包含示于SEQIDNO: 119的轻链CDRl核苷酸序列、示于SEQIDNO: 121的轻链CDR2核 苷酸序列和示于SEQIDNO: 123的轻链⑶R3核苷酸序列。23. 如权利要求18所述的核酸，其中编码抗体的核酸选自：包含作为重链可变区的SEQ IDNO:133的核苷酸序列和作为轻链可变区的SEQIDNO:134的核苷酸序列的核酸、包含 作为重链可变区的SEQIDNO:135的核苷酸序列和作为轻链可变区的SEQIDNO:136的核 苷酸序列的核酸、包含作为重链可变区的SEQIDNO:137的核苷酸序列和作为轻链可变区 的SEQIDNO:138的核苷酸序列的核酸和包含作为重链可变区的SEQIDNO:139的核苷酸 序列和作为轻链可变区的SEQIDNO:140的核苷酸序列的核酸。24. -种载体，其包含权利要求18至23中任一项所述的核酸。25. -种宿主细胞，其包含权利要求20所述的载体或权利要求18至23中任一项所述 的核酸。26. -种生产权利要求1至17中任一项所述的抗体的方法，其包含培养权利要求21所 述的宿主细胞，使得表达核酸以生产抗体。27. -种抗体-药物缀合物，其包括附着到药物上的权利要求1至17中任一项所述的 抗体。28. 如权利要求27所述的抗体-药物缀合物，其中所述药物选自下述任意一种：毒素、 化疗剂、抗癌药、抗生素、ADP-核糖基转移酶、放射性同位素和溶核酶。29. 如权利要求27所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物能够被内化 至细胞中。30. 如权利要求29所述的抗体-药物缀合物，其中所述细胞是癌症细胞。31. -种用于预防或治疗血管生成相关疾病的药物组合物，其包含权利要求1至17中 任一项所述的抗体。32. 如权利要求31所述的药物组合物，其中所述血管生成相关疾病选自：癌症、转移、 糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥、视网膜黄斑变性、新生血管性青光 目艮、皮肤红变、增殖性视网膜病变、银肩病、血友病性关节炎、动脉粥样硬化斑块中的毛细血 管形成、瘢痕瘤、伤口肉芽、血管粘附、类风湿关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩 病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、猫抓病、溃疡、肝硬化、肾炎、糖尿病性肾病、糖尿病、炎 性疾病和神经变性疾病。33. 如权利要求31所述的药物组合物，其中所述癌症选自：食道癌、胃癌、大肠癌、直肠 癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、结肠癌、乳癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸 癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、结缔组织癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、霍奇金 淋巴瘤、淋巴瘤和多发性骨髓血癌。34. -种用于治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求 1所述的抗体或权利要求31所述的药物组合物。35. -种用于抑制血管生成的组合物，其包括权利要求1至17中任一项所述的抗体。36. -种用于抑制血管生成的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求1所述的 抗体或权利要求31所述的药物组合物。37. -种用于血管生成相关疾病的诊断组合物，其包括权利要求1至17中任一项所述 的抗体。38. 如权利要求37所述的诊断组合物，其中所述血管生成相关疾病选自：癌症、转移、 糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥、视网膜黄斑变性、新生血管性青光 目艮、皮肤红变、增殖性视网膜病变、银肩病、血友病性关节炎、动脉粥样硬化斑块中的毛细血 管形成、瘢痕瘤、伤口肉芽、血管粘附、类风湿关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩 病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、猫抓病、溃疡、肝硬化、肾炎、糖尿病性肾病、糖尿病、炎 性疾病和神经变性疾病。39. 如权利要求38所述的诊断组合物，其中所述癌症的特征在于表达clecl4a。40. -种用于血管生成相关疾病的诊断试剂盒，其包括权利要求37所述的诊断组合 物。41. 一种用于诊断血管生成相关疾病的方法，其包括通过抗原-抗体复合物检测从疑 似患有血管生成相关疾病的受试者的分离的生物样品中的cIec14a。42. -种多肽，其包含分离的clecl4a的CTLD，其用作能够诱导生产抑制血管生成的抗 体的表位。43. -种多肽，其包含分离的clecl4a的CTLD的N-末端或C-末端，其用作能够诱导生 产抑制血管生成的抗体的表位。44. 一种多肽，其包含clecl4a的CTLD中的第1个氨基酸到第42个氨基酸的氨基酸片 段或clecl4a的CTLD中的第122个氨基酸到第142个氨基酸的氨基酸片段，其用作能够诱 导生产抑制血管生成的抗体的表位。45. -种用于制备特异性结合到clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员A)的抗体的 方法，其包括：使用权利要求42至44中任一项所述的多肽作为表位进行生物淘选。46. -种用于抑制血管生成的组合物，其包括用于抑制clecl4a表达的物质。47. 如权利要求46所述的组合物，其中所述物质是用于抑制clecl4a的CTLD的表达的 物质。48. 如权利要求46所述的组合物，其中所述物质选自：特异于clecl4a的反义寡核苷 酸、siRNA、适配体和抗体。49. 如权利要求46所述的组合物，其通过抑制血管生成来治疗血管生成相关疾病。50. -种用于抑制血管生成的试剂盒，其包括权利要求46至49中任一项所述的组合 物。51. -种用于抑制血管生成的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求46至49中 任一项所述的组合物。52. -种用于治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求 46至49中任一项所述的组合物。53. -种用于预防或治疗血管生成相关疾病的药物组合物，其包括clecl4a的CTLD与 Fc的融合蛋白。54. 如权利要求53所述的药物组合物，其中所述血管生成相关疾病选自：癌症、转移、 糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥、视网膜黄斑变性、新生血管性青光 目艮、皮肤红变、增殖性视网膜病变、银肩病、血友病性关节炎、动脉粥样硬化斑块中的毛细血 管形成、瘢痕瘤、伤口肉芽、血管粘附、类风湿关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩 病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、猫抓病、溃疡、肝硬化、肾炎、糖尿病性肾病、糖尿病、炎 性疾病和神经变性疾病。55. -种用于治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用clecl4a 的CTLD与Fe的融合蛋白或权利要求53所述的药物组合物。
【专利摘要】本发明涉及新的特异性结合clec14a(C型凝集素结构域家族14，成员A)的抗体及其用途。更具体地，本发明涉及特异性结合clec14a的CTLD(C型凝集素样结构域)的抗体，用于制备所述抗体的方法，包含所述抗体的用于抑制血管生成的组合物，通过施用抗体或组合物来抑制血管生成的方法，包含所述抗体的用于预防或治疗癌症的组合物，通过施用抗体或组合物来治疗癌症的方法，包括所述抗体的用于诊断癌症的组合物，包括所述组合物的用于诊断癌症的试剂盒，使用组合物来诊断癌症的方法，用于抑制血管生成的组合物，其包含用于抑制clec14a表达的材料，包含所述组合物的用于血管生成的试剂盒，使用所述组合物来抑制血管生成或治疗癌症的方法以及clec14a的CTLD作为抑制血管生成的抗体的表位的用途。所述抗体可有效抑制cle14a介导的癌症进展。
【IPC分类】C12N15/13, C07K16/28, A61K39/395, A61P35/00
【公开号】CN104903350
【申请号】CN201380043426
【发明人】李硕默, 奇珉庚, 郑美贤, 崔钟湁
【申请人】斯克里普斯抗体研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年6月14日
【公告号】EP2861623A1, EP2861623A4, US20150140001, WO2013187556A1, WO2013187724A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及新的抗体及其用途，所述抗体特异性结合c型凝集素结构域家族14 的成员A(clecl4a)。更具体地，本发明涉及特异性结合clecl4a的C型凝集素样结构域 (CTLD)的抗体，制备此抗体的方法，用于抑制血管生成的包含此抗体的组合物，通过施用抗 体或组合物来抑制血管生成的方法，用于预防或治疗癌症的包含抗体的组合物，通过施用 抗体或组合物来治疗癌症的方法，用于诊断癌症的包含抗体的组合物，用于诊断癌症的包 含此组合物的试剂盒，使用此组合物诊断癌症的方法，用于抑制血管生成的包含用于抑制 clecl4a表达的物质的组合物，用于血管生成的包含此组合物的试剂盒，使用组合物抑制血 管生成或治疗癌症的方法，以及clecl4a的CTLD作为抑制血管生成的抗体的表位的用途。
【背景技术】
[0002] 重组抗体技术近期的快速发展已在全球范围内产生了约30种被批准用于人类治 疗的抗体以及超过270种目前处于临床开发的用于范围广泛的疾病的抗体。然而，传统的 抗体筛选仍然是时间和劳动密集型的且是昂贵的。传统上，使用目标蛋白的胞外区域以筛 选抗体。因此，大多数所选择的抗体结合到细胞，但其不是具有治疗潜力的功能性抗体。由 于分子生物学和蛋白质生物化学的最新进展，大量的可以将蛋白质结构域和基序的结构与 细胞功能联系起来的信息是可用的。使用功能性结构域以筛选重组抗体可以是鉴定功能性 抗体和研宄潜在作用模式的一种有效的方法。
[0003] 肿瘤的血管生成在肿瘤的发展中起到了重要的作用。血管内皮生长因子 (VEGF)和表皮生长因子受体（EGFR)在血管生成中是关键的因素，并且靶向血管生成 已成为癌症治疗的有前途的策略。已经使用抗-VEGF抗体贝伐单抗（bevacizumab)来 治疗患有转移性结肠直肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、恶性脑胶质瘤的患者。西妥昔 单抗（Cetuximab)(其是抗-EGFR抗体）可以抑制内皮细胞与细胞的接触以及血管生 成因子如VEGF、白介素-8和碱性成纤维细胞生长因子的表达。然而，由于肿瘤分泌 的血管生成因子的冗余，其包括胎盘生长因子、血管生成素、碱性成纤维细胞生长因 子、肝细胞生长因子，这些药物在肿瘤中产生了抗性表型（KopetzS等人，PhaseII trialofinfusionalfluorouracil，irinotecan，andbevacizumabformetastatic colorectalcancer:efficacyandcirculatingangiogenicbiomarkersassociated withtherapeuticresistance.JournalofClinicalOncology.28 (3) :453-9 ; Lucio-EterovicAK等人，Mediatorsofglioblastomaresistanceandinvasionduring antivascularendothelialgrowthfactortherapy.ClinicalCancerResearch. 2009 ； 15(14) : 4589-99) 〇
[0004] 贝伐单抗（人VEGF抗体）现被用于治疗多种癌症患者。然而，由于VEGF受体 (VEGFR)也在正常细胞中表达，它的使用可能与包括高血压、蛋白尿和胃肠穿孔的副作用相 关。副作用也可能限制抗促血管生成因子如VEGFR-2和血管生成素-2的许多抗体的治疗 用途。因此，鉴定通过抑制血管生成来治疗癌症患者的新的癌症特异性靶标对于开发具有 较少副作用的治疗性抗体是至关重要的。
[0005] 此外，贝伐单抗和西妥昔单抗是治疗性抗体，其通过抑制可溶性血管生长因子与 它们的受体的相互作用来抑制血管生成。然而，由于肿瘤细胞分泌的促血管生成生长因子 的冗余，这些药物的长期使用产生了抗性肿瘤表型。这可能对在需要长期治疗的患者中使 用抗可溶性生长因子的抗体形成最大的挑战。
[0006]Clecl4a是I型跨膜蛋白，其细胞外结构域由C型凝集素样结构域（CTLD)、一系列 的表皮生长因子样结构域和寿司样结构域组成。一些报道表明了clecl4a在肿瘤血管生成 中的作用。Rho等人报道称，clecl4a是内皮细胞特异性的，并且可能在血管生成中的细胞 与细胞的接触中发挥了关键作用（RhoSS等人，Clecl4aisspecificallyexpressedin endothelialcellsandmediatescelltocelladhesion.Biochemical&Biophysical ResearchCommunications. 404(1): 103-8)。Mura等人表明，clecl4a对于调节与外肉伪 足形成、细胞迀移和内皮血管形成相关的促血管生成表型是至关重要的；这个小组还鉴 定了作为肿瘤内皮细胞标记物的clecl4a没有在正常组织的内皮细胞中表达（MuraM等 人，Identificationandangiogenicroleofthenoveltumorendothelialmarker CLEC14A.Oncogene. 31 (3):293-305)。
[0007] 尽管近年来对clecl4a的兴趣增加了，其分子机制尚未被清楚地鉴定。必须对 clel4a负责血管生成的功能部分或结构域进行研宄，以便挖掘和开发临床上可应用的抗 体。此时，迫切需求一种单克隆抗体，其特异性结合小鼠和人的clecl4a并可转换成人源化 抗体或人抗体，以用于临床前和临床研宄。优选地，需要一种抗体，其在临床上可用于抑制 肿瘤血管生成并从而治疗癌症。此外，需要鉴定一个新的部分，其抑制肿瘤血管生成并从而 进一步抑制血管生成并治疗癌症。
[0008]
【背景技术】部分所公开的上述信息仅用于增加对本发明背景的理解，因此其可能包 含本领域技术人员已知的不形成现有技术的信息。
【发明内容】
[0009] 技术问题
[0010] 本发明人首次鉴定了CTLD在细胞迀移和外肉伪足形成中的功能，其是血管生成 中的关键事件。通过使用噬菌体展示技术，本发明人开发了抗人和小鼠clecl4aCTLD的重 组人抗体。功能测定表明，所述抗体特异性抑制内皮细胞的迀移和血管的形成，而不影响活 力或活化。最后，本发明人提出了一种作用机制，借此，抗体可以通过调节CTLD介导的细胞 与细胞的相互作用并下调内皮细胞表面上的clecl4a表达来抑制血管生成。这些结果证明 了CTLD在血管生成中的功能重要性和CTLD特异性人抗体阻止clecl4a介导的肿瘤血管生 成的潜力。
[0011] 问题的解决方案
[0012] 为了达到上述目的，本发明提供了一种抗体，其特异性结合clecl4a(C型凝集素 结构域家族14,成员A)。
[0013] 本发明还提供了一种编码所述抗体的核酸。
[0014] 本发明还提供了包含所述核酸的载体。
[0015] 本发明还提供了一种宿主细胞，其包含所述载体或所述核酸。
[0016] 本发明还提供了一种生产所述抗体的方法，包括培养所述宿主细胞，使得所述核 酸表达以产生所述抗体。
[0017] 本发明还提供了一种抗体-药物偶联物，其包含附着到药物上的所述抗体。
[0018] 本发明还提供了一种用于预防或治疗血管生成相关疾病的药物组合物，其包含所 述抗体。
[0019] 本发明还提供了一种所述抗体用于制备预防或治疗血管生成相关疾病的药物组 合物的用途。
[0020] 本发明还提供了所述抗体，其用于预防或治疗血管生成相关疾病。
[0021] 本发明还提供了一种治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施 用所述抗体或所述药物组合物。
[0022] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的组合物，其包含所述抗体。
[0023] 本发明还提供了一种所述抗体用于制备抑制血管生成的组合物的用途。
[0024] 本发明还提供了所述抗体，其用于抑制血管生成。
[0025] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的方法，其包括向有需要的受试者施用所 述抗体或所述药物组合物。
[0026] 本发明还提供了用于血管生成相关疾病的诊断组合物，其包含所述抗体。
[0027] 本发明还提供了一种所述抗体用于制备用于血管生成相关疾病的诊断组合物的 用途。
[0028] 本发明还提供了所述抗体，其用于血管生成相关疾病的体外诊断。
[0029] 本发明还提供了一种用于血管生成相关疾病的诊断试剂盒，其包含所述诊断组合 物。
[0030] 本发明还提供了一种用于诊断血管生成相关疾病的方法，其包括从疑似患有血管 生成相关疾病的受试者中分离的生物样品中通过抗原-抗体复合物检测clecl4a。
[0031] 本发明还提供了一种多肽，其包含Clecl4a的分离的CTLD，其用作能够诱导产生 抑制血管生成的抗体的表位。
[0032] 本发明还提供了一种多肽，其包含clecl4a的分离的CTLD的N-末端或C-末端， 作为能够诱导产生抑制血管生成的抗体的表位。
[0033] 本发明还提供了一种多肽，其包含clecl4a的CTLD中的第1个氨基酸至第42个 氨基酸的氨基酸片段或clecl4a的CTLD中的第122个氨基酸至第142个氨基酸的氨基酸 片段，其作为能够诱导产生抑制血管生成的抗体的表位。
[0034] 本发明还提供了一种用于制备特异性结合至clecl4a(C型凝集素结构域家族14， 成员A)的抗体的方法，其包括：使用所述多肽作为表位进行生物淘选。
[0035] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的组合物，其包括用于抑制clecl4a表达 的物质。
[0036] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的试剂盒，其包括所述组合物。
[0037] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的方法，其包括向有需要的受试者施用所 述组合物。
[0038] 本发明还提供了一种治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施 用所述组合物。
[0039] 本发明还提供了所述用于抑制clecl4a表达的材料用于制备抑制血管生成的组 合物的用途。
[0040] 本发明还提供了用于抑制Clecl4a表达的所述材料，其用于抑制血管生成。
[0041] 本发明还提供了用于预防或治疗血管生成相关疾病的药物组合物，其包括 clecl4a的CTLD和Fc的融合蛋白。
[0042] 本发明还提供了clecl4a的CTLD和Fc的所述融合蛋白用于制备预防或治疗血管 生成相关疾病的药物组合物的用途。
[0043] 本发明还提供了clecl4a的CTLD和Fc的所述融合蛋白，其用于预防或治疗血管 生成相关疾病。
[0044] 本发明还提供了一种用于治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试 者施用clecl4a的CTLD和Fc的所述融合蛋白或所述药物组合物。
[0045] 从下列详细的描述和所附的权利要求将可以更加清楚地了解本发明的其它特征 和实施方式。
【附图说明】
[0046] 图1示出了clecl4aCTLD在细胞迀移中的作用。a.在光学显微镜下监测伤口愈 合测定中的转染了GFP、clecl4a_GFP或clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细胞的迀移。在0小 时（上）和20小时（下）时捕捉图像。b?将迀移距离表示为对照迀移的百分比。数值代 表了三个独立实验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0047] 图2示出了clecl4aCTLD对外肉伪足形成的作用。固定转染了GFP、clecl4a_GFP 和clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细胞（a)和HUVEC(b)，用罗丹明-鬼笔环肽和Hoechst染 色，并通过荧光显微镜（1000X)进行检查。箭头表示外肉伪足形成区域。结果是三个独立 的实验的代表。
[0048] 图3示出了特异于人类和小鼠的CTLD的scFv克隆的分离。a.用Fc结合剂预清 洗合成的人类scFv抗体库并通过使用重组的hCTLD-Fc或mCTLD-Fc的交替生物淘洗进行 筛选。b-d.随机选择96个展示了scFv的噬菌体克隆（1-96)并通过噬菌体ELISA分析上 清液。通过测量450nm处的吸光度分析所选择的scFv克隆对人类和小鼠CTLD的反应性。 箭头表示与hCTLD-Fc( ，黑色）和与mCTLD-Fc(，灰色）反应的scFv克隆，以及不与 Fc( □)反应的scFv克隆。BSA(园）作为背景对照。
[0049] 图4示出了clecl4a_CTLDIgG与人和小鼠CTLD的交叉物种反应性。用纯化的、 所选择的IgGscFv克隆（克隆1-4)在包被有hCTLD-Fc( ，黑色）、mCTLD-Fc(，灰色） 和Fc(D)的96孔微量滴定板上进行ELISA。BSA(図）作为背景对照。数值代表了两个 独立实验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0050] 图5示出了clecl4a_CTLDIgG对内皮细胞的迀移和血管形成的作用。a.受伤后， 通过光学显微镜监测在不存在（MOCK)或存在clecl4a-CTLDIgG(克隆1-4)或存在西妥昔 单抗的情况下孵育的HUVEC的迀移。在0小时（上）和9小时（下）时捕捉图像。b?将迀 移距离表示为对照（MOCK)迀移的百分比。数值代表了三个独立实验之一的一式三份的测 量的平均值土SD。C.在不存在（MOCK)或存在clecl4a-CTLDIgG(克隆1-4)或存在西妥 昔单抗的情况下分析血管的形成。D.血管形成的程度表示为对照（MOCK)血管形成的百分 比。数值代表了三个独立实验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0051] 图6示出了clecl4a_CTLDIgG对内皮细胞增殖和活化的作用。a.在不存在（MOCK) 或存在clecl4a-CTLDIgG、西妥昔单抗或5-FU(阳性对照）的情况下孵育HUVEC2天。通 过测量450nm处的吸光度评估细胞活力。数值代表了两个独立实验之一的一式三份的测量 的平均值土SD。b?在不存在（虚线）或存在hTNFa、clec14a-CTLDIgG或西妥昔单抗（实 线）的情况下培养HUVEC;用抗-VCAM-1 (上）或ICAM-1 (下）多克隆抗体进行染色；并通 过流式细胞术进行分析。hTNFa作为内皮细胞活化的阳性对照。结果是三个独立实验的代 表。
[0052] 图7示出了clecl4a_CTLDIgG对clecl4a介导的细胞-细胞接触的作用。a?在 不存在（MOCK)或存在clecl4a-CTLDIgG或西妥昔单抗的情况下孵育转染了GFP和 clecl4a-GFP的HEK293F细胞8小时。在光学显微镜下计数细胞聚集体（细胞团>4个细 胞；箭头）。每视野的聚集体的数量示于b中。数值代表了三个独立实验之一的一式三份 的测量的平均值土SD。
[0053] 图8示出了clecl4a_CTLDIgG对CTLD-CTLD相互作用的作用。a?用抗-GFP或 抗-0 -肌动蛋白抗体通过免疫印迹对转染了GFP、clecl4a_GFP或clecl4aACTLD-GFP 的C0S-7细胞的裂解物进行分析。b.将表达GFP(白色）、clecl4a-GFP(黑色）或 clecl4aACTLD-GFP(浅灰色）的C0S-7细胞用0. 15yg的hCTLD-Fc或Fc进行孵育并通过 ELISA测定CTLD-CTLD相互作用。c.将转染了GFP或clecl4a-GFP的C0S-7细胞的裂解物 与hCTLD-Fc-起孵育，其中hCTLD-Fc已与增加浓度的clecl4a-CTLDIgG(克隆1) 一起预 孵育。数值代表了三个独立实验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0054] 图9示出了clecl4a_CTLDIgG对内皮细胞表面的clecl4a的下调的作用。a.在 存在（虚线）或不存在（实线）clecl4a-CTLDIgG(克隆1)的情况下孵育固定的和未固定 的HUVEC并通过流式细胞术进行分析。b.通过细胞ELISA分析与clecl4a-CTLDIgG(白 色）或Fc(黑色）一起孵育指定时间的HUVEC表面上的Clecl4a。数值代表了三个独立实 验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0055] 图10示出了clecl4a_CTLDIgG对clecl4a的CTLD的部分片段的特异性。a.Fc 与clecl4a的CTLD的部分片段的融合蛋白。b.图分别示出了克隆1(上图）和克隆2(下 图）的clecl4a-CTLDIgG对Fc与clecl4a的CTLD的部分片段的融合蛋白、wtCTLD-Fc和 Fc的特异性。
[0056] 图11是示出了hCTLD-Fc对血管形成的抑制作用的图。
【具体实施方式】
[0057] 根据本发明的一个方面，本发明提供了特异性结合clecl4a(C型凝集素结构域家 族14,成员A)的抗体。
[0058] 优选地，抗体可以是特异性结合clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员A)的 CTLD(C型凝集素样结构域）的抗体。
[0059] 如本文所用，术语"抗体"是指一种蛋白分子，其包含对某一抗原具有免疫反应性 的免疫球蛋白分子，作为特异性识别抗原的受体，并包括多克隆抗体、单克隆抗体、完整抗 体和抗体片段。此外，嵌合抗体（如人源化鼠抗体）、二价或双特异性分子（如双特异性抗体(bispecificantibodies))、双特异抗体（diabodies)、三特异抗体和四特异抗体都在对本 发明有用的抗体的范围之内。完整的抗体由两个全长的轻链和两个全长的重链组成，在轻 链与重链之间有二硫键。在哺乳动物中，已知存在5种抗体同种型，称为IgA、IgD、IgE、IgM 和IgG，且IgG进一步分为四种亚型：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。术语"抗体片段"是指至少 保留了抗原结合功能的片段，并且可包括Fab、F(ab'）、F(ab'）2和Fv。Fab包含各个重链和 轻链的一个可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区（CHI)，具有抗原结合位点。Fab'与 Fab的差异在于其进一步包括重链CH1结构域的C末端的至少一个半胱氨酸残基。F(ab'）2 由两分子的Fab'和铰链区的半胱氨酸残基之间的二硫键组成。Fv(可变片段）包含每个重 链和轻链的一个可变区，其是包含亲本免疫球蛋白的原有特异性的最小抗体片段。通过利 用二硫键连接重链的可变区与轻链的可变区形成二硫键稳定的Fv(dsFv)。单链Fv(scFv) 是一种Fv，其中通过肽接头共价连接重链和轻链的各个可变区。可以通过使用蛋白酶（例 如，用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整的抗体分别获得Fab或F(ab'）2)来获得这些抗体片 段，并优选可以通过基因重组技术来构建。
[0060] 照 惯例，使用靶蛋白的整体细胞外区域进行抗体筛选，从而导致存在抗体分离的 问题。在本发明中，抗体筛选的改进是通过使用靶蛋白的功能结构域实现的，以便更迅速地 产生抗体。在本发明的一个实施方式中，clecl4a的CTLD被鉴定为在血管生成中发挥了重 要作用并用于抗体筛选。抗体筛选的方法以图示方式示于图3a中。
[0061] 如本文所用，术语"单克隆抗体"是指具有相同的分子组成的抗体分子，其获得自 基本上相同的抗体群，其显示了针对单一表位的结合特异性和亲和力。
[0062] 通常，免疫球蛋白具有由两个重链和两个轻链组成的基本结构单元。每个重链包 括一个可变区（也被称为"区域"）和三个恒定结构域，而每个轻链包括一个可变区和一个 恒定结构域。每个轻链和重链的可变区包括三个互补决定区（以下称为"CDR"）和4个框 架区。CDR的功能是结合抗体的表位上。每个链上的CDR起始于N末端并依次排列为CDR1、 ⑶R2和⑶R3。通过它们所在的链来将其进行区分。
[0063] 如本文所用，术语"人抗体"是一种分子，其完全由人免疫球蛋白的所有组分的氨 基酸序列组成，其中包括CDR、框架区等。在人类疾病的治疗中，人抗体具有至少三个潜在 的优势。首先，人抗体更优选地与人免疫系统相互作用，通过如补体依赖性细胞毒性（CDC) 或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)来更有效地破坏靶细胞。另一个优势是，人类 的免疫系统不会将人抗体识别为外来分子。此外，人抗体的半衰期与那些天然存在于人体 循环系统中的抗体相似，即使当其以较小剂量或较少频率进行施用时。因此，根据本发明 的抗体也可以优选人单克隆抗体，其可用于血管生成相关疾病或癌症的治疗，这不仅是因 为其具有对clecl4a(优选在人内皮细胞表达的有效抑制了clecl4a介导的血管生成的 Clecl4a-CTLD)的强亲和力，，而且还因为其显示了低免疫原性，这是因为其重链和轻链都 来源于人类。
[0064] 如本文所用，术语"clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员A) "是指C型凝集素 /C-型凝集素样结构域（CTL/CTLD)超家族的成员。Clecl4a是I型跨膜蛋白，其细胞外结构 域由C型凝集素样结构域（CTLD)、一系列表皮生长因子样结构域和寿司样结构域组成。关 于clecl4a的信息可以从公共数据库如NCBIGenBank中获得。例如，人clecl4a可以具有 Gene IDNo161198,但不限于此。已知Clecl4a参与细胞对细胞的粘附和血管生成，但其 具体的机制和负责血管生成的实质性的区域仍然不明。是本发明人首次发现了CTLD在血 管生成中发挥了关键的作用，CTLD是clel4a的氨基酸序列上横跨第31个氨基酸至第172 个氨基酸的区域。
[0065] 如本文所用，术语"clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员A)的C型凝集素样结 构域（CTLD)"可以与术语"clecl4a-CTLD"或"clecl4aCTLD"互换使用。
[0066] 根据另一个方面，本发明提供了clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员 A)-CTLD(C型凝集素样结构域）的分离的多肽作为表位，其可用于抑制血管生成。优选地，clecl4a可以来源于人类、黑猩猩或小鼠。
[0067] 如本文所用，术语"表位"是指确定抗原特异性的抗原部分，并且可以与抗原决定 簇或抗原决定位点互换使用。对于本发明的目的，表位是指具有clel4a的氨基酸序列的横 跨第31个氨基酸至第172个氨基酸的氨基酸序列的CTLD，其可用于抑制血管生成，或者表 位可以是指具有与CTLD相同功能的多肽。因此，可以包括CTLD的额外的区域。只要多肽具 有与CTLD相同的作用，任何多肽都可用作表位，如具有80%、85%、90%、95%、98 %或99 % 或更高同一性的氨基酸序列的多肽。人类、小鼠和黑猩猩的CTLD的氨基酸序列（从第31 个氨基酸至第172个氨基酸）列于表1中，并分别命名为SEQIDN0 :9、10和133。本发明 人首先发现，SEQIDN0 :9、10和133的氨基酸序列可以作为表位，其可用于制备抑制血管 生成的抗体。
[0068] 此外，在一个优选的实施方式中，表明了CTLD的N-末端或C-末端区域可以作为 表位，其可用于生产抑制血管生成的抗体（图l〇b)。优选地，CTLD的N-末端区域可以是包 含CTLD上第1个氨基酸至第42个氨基酸的氨基酸片段的区域或包含CTLD上第1个氨基 酸至第62个氨基酸的氨基酸片段的区域。优选地，CTLD的C-末端区域可以是包含CTLD 上第82个氨基酸至第142个氨基酸的氨基酸片段的区域、包含CTLD上第62个氨基酸至第 142个氨基酸的氨基酸片段的区域或包含CTLD上第122个氨基酸至第142个氨基酸的氨基 酸片段的区域。
[0069] 抗体可以特异性结合于clecl4a_CTLD或其有效片段以抑制血管生成，本发明人 表明，clecl4a-CTLD是一个独特的结构域，其以CTLD-CTLD相互作用依赖性的方式调节血 管生成。第一，clecl4a-CTLD(尤其是氨基酸31-172)通过调节肌动蛋白细胞骨架重排在 clecl4a介导的细胞迀移中发挥了关键作用。第二，与我们的观察一致，clecl4a-CTLDIgG 特异性抑制clecl4a介导的细胞-细胞接触。第三，通过clecl4a_CTLDIgG调节clecl4a 特异性抑制HUVEC的迀移和血管形成。最后，通过clecl4a_CTLDIgG特异性抑制clecl4a CTLD-CTLD复合物的形成。
[0070] 高亲和力的clecl4a-CTLDIgG特异性抑制内皮细胞的迀移和血管形成，而不影响 细胞活力和活化。clecl4a仅表达于内皮细胞中且可能是特异性的肿瘤内皮细胞标记物。 有理由推测，Clecl4a-CTLD抗体可能在正常内皮细胞中有较少的副作用，靶向仅表达于肿 瘤内皮细胞的clecl4a，并在clecl4a介导的肿瘤进展中抑制血管生成。此外，贝伐单抗和 西妥昔单抗是治疗性抗体，其通过抑制可溶性血管生长因子和其受体的相互作用来抑制血 管生成。然而，由于肿瘤细胞分泌的促血管生成因子的冗余，长期使用这些药物会产生抗性 肿瘤表型。这可能对在需要长期治疗的患者中使用抗可溶性生长因子的抗体造成最大的挑 战。Clecl4a是I型跨膜蛋白，其对内皮细胞与细胞的接触是至关重要的。本文所开发的clecl4a-CTLDIgG以浓度依赖的方式特异性阻断CTLD-CTLD相互作用，并且通过IgG交联 clecl4a来诱导clecl4a在内皮细胞膜上的下调。在交联的2小时内，clecl4a_CTLDIgG 以点状图案出现在HUVEC内，这表明了抗体诱导的内吞作用。因此，clecl4a-CTLDIgG在 抑制血管生成中可能有双重作用机制。
[0071]因此，抗体可抑制血管生成，优选通过抑制细胞迀移、血管形成或细胞-细胞接 触，更优选通过抑制clecl4a介导的细胞迀移、血管形成、clecl4a介导的细胞-细胞接触 或clecl4aCTLD-CTLD复合物的形成或诱导血管内皮细胞的表面上的clecl4a的下调。
[0072] 由于对内皮细胞的活力和活化没有影响（图6A和6B)，本发明的抗体可以用作治 疗性抗体。
[0073] 在本发明的一个实施方式中，本发明的clecl4a_CTLDIgG被鉴定为抑制内皮细胞 迀移（图5a和5b)和血管形成（图5c和5d)，并且特异性抑制clecl4a介导的细胞-细 胞接触（图7a和7b)，这表明此抗体可以在肿瘤血管生成中抑制内皮细胞-细胞接触。此 外，clecl4a-CTLDIgG阻断了clecl4aCTLD-CTLD相互作用（图 8a、8b和 8c)。此外，发现 本发明的抗体在HUVEC的表面上诱导clecl4a的下调（图9a和9b)。这些结果表明，本发 明的抗体有效地抑制了clecl4a介导的血管生成，因此，可以应用于与血管生成相关疾病 或癌症的治疗中。
[0074] 优选地，本发明的抗体可以包括重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含 由SEQIDN0:14的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDN0:16的氨基酸序列定义的重 链⑶R2和由SEQIDN0:18的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区包含由SEQIDN0: 42的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDNO:44的氨基酸序列定义的轻链⑶R2和由 SEQIDN0:46的氨基酸序列定义的轻链CDR3,更优选抗体可以包含具有SEQIDN0:125的 氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO:129的氨基酸序列的轻链可变区，但不限于此。 编码抗体的核酸可以包含重链核酸序列和轻链核酸序列，其中重链核酸序列包含示于SEQ IDN0:70的重链CDR1核苷酸序列、示于SEQIDN0:72的重链CDR2核苷酸序列和示于SEQ IDN0 :74的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序列包含示于SEQIDN0 :77的轻链⑶R1核 苷酸序列、示于SEQIDN0:79的轻链CDR2核苷酸序列和示于SEQIDN0:81的轻链CDR3 核苷酸序列，但不限于此。在本发明的一个实施方式中，包含具有SEQIDNO:125的氨基酸 序列的重链可变区和具有SEQIDN0 :129的氨基酸序列的轻链可变区的人单克隆抗体被命 名为克隆1，编码抗体的核酸可以包含编码重链可变区的SEQIDN0 :133的核苷酸序列和 编码轻链可变区的SEQIDN0 :134的核苷酸序列，但不限于此。
[0075] 在一个优选的实施方式中，本发明的抗体可以包括重链可变区和轻链可变区，其 中重链可变区包含由SEQIDN0:21的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDN0:23的氨 基酸序列定义的重链⑶R2和由SEQIDNO:25的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区 包含由SEQIDN0:49的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDN0:51的氨基酸序列定义 的轻链⑶R2和由SEQIDN0 :53的氨基酸序列定义的轻链⑶R3,更优选地，抗体可以包含具 有SEQIDN0:126的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDN0:130的氨基酸序列的轻链 可变区，但不限于此。编码抗体的核酸可以包括重链核酸序列和轻链核酸序列，其中重链核 酸序列包含示于SEQIDN0 :84的重链CDR1核苷酸序列、示于SEQIDN0 :86的重链CDR2 核苷酸序列和示于SEQIDNO:88的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序列包含示于SEQID N0:91的轻链CDR1核苷酸序列、示于SEQIDN0:93的轻链CDR2核苷酸序列和示于SEQID NO:95的轻链⑶R3核苷酸序列，但不限于此。在本发明的一个实施方式中，包含具有SEQ IDNO: 126的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO: 130的氨基酸序列的轻链可变区 的人单克隆抗体被命名为克隆2,编码抗体的核酸可以包含编码重链可变区的SEQIDNO: 135的核苷酸序列和编码轻链可变区的SEQIDNO:136的核苷酸序列，但不限于此。
[0076] 在另一个优选的实施方式中，本发明的抗体可以包括重链可变区和轻链可变区， 其中重链可变区包含由SEQIDN0:28的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDN0:30的 氨基酸序列定义的重链⑶R2和由SEQIDNO:32的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变 区包含由SEQIDN0:56的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDN0:58的氨基酸序列定 义的轻链⑶R2和由SEQIDN0 :60的氨基酸序列定义的轻链⑶R3,更优选地抗体可以包含 具有SEQIDN0:127的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDN0:131的氨基酸序列的 轻链可变区，但不限于此。编码抗体的核酸可以包括重链核酸序列和轻链核酸序列，其中重 链核酸序列包含示于SEQIDN0 :98的重链⑶R1核苷酸序列、示于SEQIDN0 :100的重链 ⑶R2核苷酸序列和示于SEQIDN0 :102的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序列包含示于 SEQIDN0:105的轻链CDR1核苷酸序列、示于SEQIDN0:107的轻链CDR2核苷酸序列和 示于SEQIDN0 :109的轻链⑶R3核苷酸序列，但不限于此。在本发明的一个实施方式中， 包含具有SEQIDN0:127的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDN0:131的氨基酸序列 的轻链可变区的人单克隆抗体被命名为克隆3,编码抗体的核酸可以包含编码重链可变区 的SEQIDN0 :137的核苷酸序列和编码轻链可变区的SEQIDN0 :138的核苷酸序列，但不 限于此。
[0077] 在进一步的实施方式中，本发明的抗体可以包括重链可变区和轻链可变区，其中 重链可变区包含由SEQIDN0:35的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDN0:37的氨基 酸序列定义的重链⑶R2和由SEQIDNO:39的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区包 含由SEQIDN0:63的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDN0:65的氨基酸序列定义的 轻链⑶R2和由SEQIDN0 :67的氨基酸序列定义的轻链⑶R3,更优选地抗体可以包含具有 SEQIDN0:128的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDN0:132的氨基酸序列的轻链可 变区，但不限于此。编码抗体的核酸可以包括重链核酸序列和轻链核酸序列，其中重链核酸 序列包含示于SEQIDN0:112的重链CDR1核苷酸序列、示于SEQIDN0:114的重链CDR2 核苷酸序列和示于SEQIDNO:116的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序列包含示于SEQID NO: 119的轻链CDR1核苷酸序列、示于SEQIDNO: 121的轻链CDR2核苷酸序列和示于SEQ IDNO:123的轻链⑶R3核苷酸序列，但不限于此。在本发明的一个实施方式中，包含具有 SEQIDN0:128的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDN0:132的氨基酸序列的轻链可 变区的人单克隆抗体被命名为克隆4,编码抗体的核酸可以包含编码重链可变区的SEQID NO:139的核苷酸序列和编码轻链可变区的SEQIDNO:140的核苷酸序列，但不限于此。
[0078] 因此，只要抗体特异性识别Clecl4a-CTLD，发现即使由异源序列组成的抗体也能 抑制血管生成。因此，它们被鉴定为有效地适用于血管生成相关疾病或癌症的预防或治疗。
[0079] 当本发明的抗体包含恒定区，其可以衍生自1^6、]^4、]^0、]^￡、]^|/[或其组合或其 杂交体。
[0080] 如本文所用，"组合"是指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc片段的多肽被连接到 不同来源的单链多肽上以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可以由选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的恒定结构域中的两个或更多个恒定结构域形成。
[0081] 如本文所用，术语"杂交体"是指编码不同来源的两个或更多个重链恒定结构域的 序列共存于一个单链免疫球蛋白的重链恒定结构域中。例如，结构域杂交体可以包含选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的CH1、CH2、CH3和CH4的一个至四个结构域。此外，组合或杂交 体可以用来自IgG亚型IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定结构域制备。组合和杂交体如 上所定义。
[0082] 此外，当本发明的抗体进一步包含轻链恒定区时，其可以衍生自A轻链或k轻 链。
[0083] 优选地，抗体可以是人单克隆抗体，其可以特异性结合鼠clecl4a_CTLD和人 Clecl4a-CTLD，从而抑制血管生成。人抗体于人类和小鼠中均其作用的能力（即交叉反应 性）提供了使人抗体适用于小鼠中的临床前研宄的优势。
[0084] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种包含所述核酸的载体和包含所述载 体或所述核酸的宿主细胞。
[0085] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种制备特异性结合clecl4a(C型凝集 素结构域家族14,成员A)的抗体的方法，其中优选结合人类clecl4a-CTLD(C型凝集素样结 构域）或人和鼠clecl4a_CTLD。优选地，抗体可以是人单克隆抗体。制备抗体的方法可以 包括使用功能结构域进行生物淘选。此外，本发明提供了生产所述抗体的方法，其包括培养 所述宿主细胞，使得核酸表达以产生抗体。
[0086] 可以使用公知技术容易地制备本发明的单克隆抗体。可以通过例如但不限于用来 自免疫动物的B淋巴细胞构建的杂交瘤（Koeher和Milstein，1976，Nature，256:495)或噬 菌体展示技术来进行单克隆抗体的生产。
[0087]优选地，本发明的单克隆抗体的生产可以通过使用噬菌体展示技术来实 现。本发明的方法可以参照如Barbas等人（METHODS:ACompaniontoMethodsin Enzymology2:119, 1991andJ.Virol. 2001Jul;75 (14): 6692-9)和Winter等人（Ann.Rev. Immunol. 12:433, 1994)逐步进行。用于构建抗体文库的噬菌体可以是丝状噬菌体，其可以 例如是fd、M13、fl、Ifl、Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pfl和Pf3,但不限于此。可用于在丝状噬菌体 表面展示外源基因的载体的实例包括噬菌体载体，如fUSE5、fAFFl、fdCATl和fdtetDOG，或 噬菌粒载体，如pHENl、pComb3、pComb8和pSEX，但不限于此。使用辅助噬菌体以提供外壳 蛋白的野生型版本，这些蛋白是用于扩增的重组噬菌体成功再感染所需要的，辅助噬菌体 可以是M13K07和VSCM13,但不限于此。
[0088] 通过使用典型方法，可以容易地分离根据本发明的编码杂交瘤衍生的单克隆抗体 或噬菌体展示克隆的多核苷酸并进行测序。例如，可以使用寡核苷酸引物，其被设计来特异 性扩增来自杂交瘤或噬菌体模板DNA的重链和轻链的编码区。一旦将其分离，可以将多核 苷酸插入到表达载体中，然后将表达载体导入宿主细胞。所得的宿主细胞（即转化体）进 而可产生目标单克隆抗体。因此，本发明的抗体的制备方法可以包括扩增携带编码抗体的 多核苷酸的表达载体。优选地，可以通过从人类scFv文库中预清除Fc结合剂并用功能结 构域进行生物淘选技术以选择特异性克隆来制备重组抗体。
[0089] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了编码表位或抗体的多核苷酸、携带多核 苷酸的表达载体和将载体锚定的转化体。
[0090] 抗体如上所述。
[0091] 携带根据本发明的表位或抗体的表达载体可以包括但不限于，允许多核苷酸在真 核或原核细胞（如哺乳动物细胞（如人类、猴、兔、大鼠、仓鼠、小鼠等）、植物细胞、酵母、昆 虫细胞和细菌细胞（如大肠杆菌））中复制和/或表达的载体。优选地，载体具有合适的启 动子和至少一个选择标记物，其中启动子有效连接至多核苷酸以便诱导目标基因的表达。 例如，可以将多核苷酸引入进噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。 [0092]携带编码抗体的多核苷酸的表达载体可以是分别携带编码 抗体重链和编码抗体 轻链的多核苷酸的表达载体的组合物，或者是同时携带编码抗体重链和轻链的多核苷酸的 表达载体。
[0093]通过引入根据本发明的表达载体所产生的转化体的实例包括但不限于，细菌细 胞如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；酵母菌；真菌如毕赤酵母；昆虫细胞如果蝇、夜 蛾Sf9 ;动物细胞如CH0(中国仓鼠卵巢细胞）、SP2/0(小鼠骨髓瘤）、人淋巴母细胞、C0S、 NS0 (小鼠骨髓瘤）、293T、黑色素瘤细胞、HT-1080、BHK(幼仓鼠肾细胞）、HEK(人胚肾细胞） 和PERC. 6 (人视网膜细胞）和植物细胞。
[0094]如本文所用，术语"引入"是指将编码表位或抗体的多核苷酸递送到细胞中。可以 通过使用本领域公知的各种方法进行引入，其包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导 的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、Lipofectamine转染和原生质 体融合。转导是指一种方法，通过该方法，经由病毒载体在感染的基础上将外源DNA转移至 另一细胞中。此外，可以通过基因轰击来实现载体到宿主细胞的递送。在本发明中，引入可 以与转化互换使用。
[0095]根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于抑制血管生成的组合物，其中组合 物包含所述抗体。
[0096]由于本发明的抗体能够有效地抑制血管生成，包含作为活性成分的抗体的组合物 可以用于抑制血管生成，并进一步用于预防或治疗血管生成相关疾病。
[0097] 如本文所用，术语"抑制血管生成"是指抑制从预先存在的血管来的新血管的形 成或生长。对于本发明的目的，通过抑制细胞迀移、细胞与细胞的接触来实现血管生成的 抑制，更优选地通过抑制clecl4a介导的细胞的迀移、clecl4a介导的细胞-细胞的接触、 HUVEC的迀移或血管的形成、clecl4aCLTD-CLTD复合物的形成。
[0098]如本文所用，术语"血管生成相关疾病"是指在其发作或进展中涉及血管生成的疾 病。只要可以用该抗体治疗，任何疾病均可以落入血管生成相关疾病的范围内，而没有限 制。血管生成相关疾病的实例包括癌症、转移、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、角膜 移植排斥、视网膜黄斑变性、新生血管性青光眼、皮肤红变、增殖性视网膜病变、银肩病、血 友病性关节炎、动脉粥样硬化斑块中的毛细血管形成、瘢痕瘤、伤口肉芽、血管粘附、类风湿 关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、猫抓病、溃 疡、肝硬化、肾炎、糖尿病性肾病、糖尿病、炎性疾病和神经变性疾病，但不限于此。此外，癌 症选自食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、结肠癌、乳癌、子宫颈癌、子 宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、结缔组织癌、皮肤 癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤和多发性骨髓血癌，但不限于此。
[0099] 如本文所用，术语"阻止"或"预防"是指由于施用根据本发明的抗体或组合物，而 导致目标疾病发作的抑制或延迟的任何行为。术语"治疗"或"疗法"是指由于施用根据本 发明的抗体或组合物，而导致目标疾病症状的好转或症状的有益改善的任何行为。
[0100] 包含本发明的抗体的组合物优选是药物组合物，并且可以进一步包括通常用于本 领域中的合适的载体、赋形剂或稀释剂。
[0101] 包含药学上可接受载体的药物组合物可以是各种口服或非口服的剂型，如片剂、 丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂、内用溶液、乳剂、糖浆剂、无菌水溶液、非水性溶液、悬 浮液、冻干剂和栓剂。在这方面中，本发明的药物组合物可以与稀释剂或赋形剂联合配制， 其中稀释剂或赋形剂是如填料、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。用于口服 给药的固体制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等的形式。对于这些固体制剂，本 发明的化合物与至少一种赋形剂联合配制，其中赋形剂是如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明 胶。除了简单的赋形剂，可以使用润滑剂如硬脂酸镁、滑石等。用于口服给药的液体制剂是 混悬液、内用溶液、乳剂、糖浆等。除了简单的稀释剂如水或液体石蜡，可以在液体制剂中包 含各种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。此外，本发明的药物组合物可以是肠 胃外剂型，如无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮液、乳剂、冻干剂、栓剂等。可注射的丙二醇、聚 乙二醇、植物油如橄榄油和酯如油酸乙酯可以适合于非水溶剂和悬浮剂。栓剂的基础材料 包括Wit印sol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂脂和甘油明胶。
[0102] 以药学上有效的量施用本发明的组合物。
[0103] 如本文所用，术语"药学上有效的量"是指处于合理的利益/风险比并适用于任何 的医学治疗的足够用于治疗疾病的药物组合物的量。有效量可以取决于各种因素而变化， 这些因素包括所治疗的疾病的严重程度、患者的年龄和性别、疾病的种类、药物的活性、对 药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄速率、治疗的时间段、药物的联合给药和其它本领 域公知的参数。本发明的组合物可单独施用或与其它治疗剂组合施用。在这种情况下，可 以顺序地或同时地与常规疗法一起进行施用。此外，可以以单个剂量或可被分成多个剂量 施用组合物。在充分考虑这些因素的情况下，施用足以产生最大效果而无副作用的最小剂 量是重要的。本领域的专家可以容易地确定剂量。本发明的药物组合物的剂量不受特殊的 限制，但取决于各种因素而变化，这包括患者的健康状态和体重、疾病的严重程度、药物的 种类、给药途径、给药时间。可以每天单个剂量或多个剂量、经任何通常可接受的途径向哺 乳动物施用组合物，哺乳动物包括大鼠、家畜、人类等，通常可接受的途径为如口服给药、直 肠给药、静脉内给药、皮下给药、子宫内给药或脑血管内给药。
[0104] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了抑制血管生成的方法，其包括向有需要 的受试者施用抗体或组合物。
[0105] 抗体、组合物和抑制血管生成如上所述。
[0106] 详细地，本发明的抑制方法包括向需要抑制血管生成的受试者施用药学上有效剂 量的药物组合物。受试者可以是哺乳动物如狗、牛、马、兔、小鼠、大鼠、鸡和人类，但不限于 此。可以经肠胃外、皮下、腹膜内、肺内或鼻内或经合适的方法（包括（如果需要的话）用 于局部治疗的病灶内注射）施用药物组合物。本发明的药物组合物的优选剂量取决于各 种因素，这包括受试者的健康状况和体重、疾病的严重程度、药物的种类、给药途径、给药时 间，这些可由本领域技术人员容易地确定。
[0107] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其 中药物组合物包含抗体。
[0108] 术语"抗体"、"预防"和"治疗"如上所定义。
[0109] 只要可以用本发明的肽进行治疗，癌症不受任何限制。优选的是其中发生Clecl4a 介导的肿瘤进展的癌症。详细地，用本发明的抗体通过抑制血管生成来阻止癌症的发作或 进展。癌症的实例包括食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、结肠癌、乳 癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、结 缔组织癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤和多发性骨髓血液癌，但 并不限于此。
[0110] 此外，可以出于各种目的将本发明的抗体与其它的抗体或生物活性剂或材料组合 使用。
[0111] 在本发明的一个实施方式中，发现本发明的抗体抑制血管生成，从而导致癌症发 作或进展的延缓或阻止。因此，本发明的抗体有效地适用于预防或治疗癌症。
[0112] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法，其包括向有需要 的受试者施用抗体或药物组合物以预防或治疗癌症。
[0113] 抗体、组合物和癌症如上所述。
[0114] 在治疗方法中，向疑似癌症受试者施用药学上有效量的药物组合物。受试者可以 是哺乳动物，如狗、牛、马、兔、小鼠、大鼠、鸡和人类，但不限于此。可以经肠胃外、皮下、腹膜 内、肺内或鼻内或经合适的方法（包括（如果需要的话）用于局部治疗的病灶内注射）来 施用药物组合物。本发明的药物组合物的优选剂量取决于各种因素，这包括受试者的健康 状况和体重、疾病的严重程度、药物的种类、给药途径、给药时间，且这些可由本领域技术人 员容易地确定。
[0115] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于癌症的诊断组合物，其包含抗 体。
[0116] 抗体和癌症如上所述。
[0117] 优选的是，其中特异性表达clecl4a的癌症。
[0118] 如本文所用，术语"诊断"是指病理状态的存在或性质的评价。出于本发明的目的， 诊断是确定癌症的发病率。
[0119] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于癌症的诊断试剂盒，其包括诊 断组合物。
[0120] 本发明的试剂盒可检测癌症的标记物_clecl4a，优选clecl4a的CTLD。本发明的 检测试剂盒可包含选择性识别标记物的抗体、以及一种或多种组合物、溶液或适合于分析 方法的装置。
[0121] 优选地，诊断试剂盒可包括用于抗体的免疫学检测的基质、合适的缓冲液、着色酶 或标记有荧光物质的二抗、着色底物等。基质可以使用硝酸纤维素膜、聚乙烯树脂制造的96 孔板、聚苯乙烯树脂制造的96孔板和载物玻璃。着色酶可以使用过氧化物酶和碱性磷酸 酶。荧光物质可以使用FITC和RITC，并且着色底物溶液可以使用ABTS(2,2'_连氮基-双 (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸））、0PD(邻苯二胺）或TMB(四甲基联苯胺）。
[0122] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于诊断癌症的方法，其包含通过 抗原-抗体复合物从疑似癌症受试者中分离的生物样品中检测clecl4a，优选检测 clecl4a_CTLD〇
[0123] 抗体、癌症和诊断如上所述。
[0124] 更具体地，可以通过已知的方法从生物样品中分离蛋白。
[0125] 如本文所用，术语"生物样品"包括展示了癌症标记物clecl4a，优选 clecl4a-CTLD，的表达水平差异的样品，如组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、痰、脑脊液或 尿液，但不限于此。
[0126] 通过使用检测方法，也可以通过比较clecl4a(优选clecl4a_CTLD)在疑似癌症患 者中的表达水平和正常对照组中的表达水平来诊断癌症的发生。即，将疑似癌症细胞中的 本发明的标记物的表达水平与正常细胞中的表达水平相比较。如果观察到在疑似癌症细胞 中标记物的表达水平显著增加，则可以将疑似癌症诊断为癌症。
[0127] 用于测定蛋白水平的分析方法包括但不限于，Western印迹、ELISA、放射免疫分 析、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组化染色、免疫沉淀分析、补 体固定分析、FACS和蛋白芯片分析。通过使用分析方法，将疑似癌症患者与正常对照的形 成的抗原-抗体复合物的量进行比较，并通过评估癌症标记物基因的蛋白表达水平的显著 增加来诊断患者的疑似癌症。
[0128] 如本文所用，术语"抗原_抗体复合物"是指癌症标记物蛋白与其特异性抗体的结 合产物。形成的抗原-抗体复合物的量可以通过测量检测标记的信号强度来定量地确定。
[0129] 这样的检测标记物可以选自酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒、氧化还原分子 和放射性同位素，但本发明不限于这些实例。可作为检测标记的酶的实例包括但不限于， 0 _葡糖醛酸酶、0 -D-葡萄糖苷酶、-D-半乳糖苷酶、尿素酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶、 乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDP酶、核糖核酸酶、葡萄糖氧化酶和荧光素酶、 磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶和 内酰胺酶。荧光物质的实例包括但不限于，荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝 蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。配体的实例包括但不限于，生物素衍生物。发光物 质的实例包括但不限于，吖啶酯、荧光素和荧光素酶。微粒的实例包括但不限于，胶体金和 有色乳胶。氧化还原分子的实例包括但不限于，二茂铁、钌络合物、紫精、醌、Ti离子、Cs离 子、二酰亚胺、1，4_ 苯醌、氢醌、K4W(CN)8、[0s(bpy)3]2+、[RU(bpy)3]2+和[MO(CN) 8]4-。放射 性同位素的实例包括但不限于，3H、14C、32P、35S、36C1、51Cr、57Co、58Co、59Fe、9°Y、1251、1311 和 186Re。
[0130] 优选地，通过ELISA测量蛋白的表达水平。ELISA的实例包括直接ELISA，其使用标 记的抗体识别固定在固体支持物上的抗原；间接ELISA，其使用标记的抗体识别捕获抗体， 与固定在固体支持物上的抗原形成复合物；直接夹心ELISA，其使用另一个标记的抗体识 别固定在固体支持物上的抗原-抗体复合物中的抗原，以及间接夹心ELISA，其中另一个标 记的抗体与固定在固体支持物上的抗原-抗体复合物中的抗原反应，然后使用标记的次级 抗体识别另一个标记抗体。更优选地，通过夹心ELISA检测蛋白表达水平，其中样品与固定 在固体支持物上的抗体反应，并通过加入特异于抗原的标记抗体来检测所得到的抗原-抗 体复合物，然后通过酶促颜色显影，或通过加入特异于识别抗原-抗体复合物的抗原的抗 体的标记的次级抗体，然后通过酶促显影。可以通过测量癌症标记物蛋白和其抗体的复合 物形成的程度来诊断癌症的发生。
[0131] 此外，优选地，通过Western印迹使用一种或多种针对癌症标记物的抗体来测量 蛋白质的表达水平。从样品中分离总蛋白，进行电泳以按大小将蛋白分离，转印至硝酸纤维 素膜，并与抗体反应。通过使用标记的抗体测量利所产生的抗原-抗体复合物的量来测定 由基因表达产生的蛋白质的量，借此诊断癌症的发生。检测方法包括评估在对照和发生癌 症的细胞中的标记基因的表达水平的方法。mRNA或蛋白质水平可以表示为标记蛋白质的量 的绝对的（例如，yg/ml)或相对的（例如，信号的相对强度）差异。
[0132] 此外，优选地，通过使用一种或多种抗癌症标记物的抗体的免疫组化染色来测量 蛋白质的表达水平。收集并固定正常的上皮组织和疑似癌症组织，然后根据广泛已知的方 法制备石蜡包埋块。将块切成小的切片（数ym厚）并附着到玻璃载片上，并根据已知的 方法与所选的一种或多种抗体反应。
[0133] 随后，洗绦未反应的抗体，将反应的抗体与选自上述提及的检测标记进行标记，然 后在显微镜下进行观察。
[0134] 还优选地，使用蛋白芯片分析蛋白水平，蛋白芯片中排布一种或多种抗癌症标记 物的抗体并以高密度固定于衬底的预定位置上。在此方面中，从样品中分离蛋白质并与蛋 白芯片杂交以形成抗原-抗体复合物，然后对其进行读取以检查目标蛋白的存在或表达水 平，从而诊断癌症的发生。
[0135] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于抑制血管生成的组合物，其包括用 于抑制clecl4a表达的物质。
[0136] 优选地，所述物质可以是用于抑制clecl4a的CTLD的表达的物质。
[0137] 在本发明的一个实施方式中，鉴定了clecl4a的CTLD在抑制细胞迀移和血管形 成（如外肉伪足的形成）中发挥了重要的作用（图la、lb、2a和2b)。这些结果表明，抑制 clecl4a(优选clecl4a_CTLD)表达的物质抑制了血管生成。
[0138] 用于抑制clecl4a(优选clecl4a_CTLD)表达的物质包括反义寡核苷酸、siRNA寡 核苷酸、抗体、适配体、单链可变区片段、肽、低分子量化合物和天然提取物，但不限于此。
[0139] 优选地，用于抑制clecl4a(优选clecl4a_CTLD)表达的物质是特异性结合物质上 以抑制clecl4a(优选clecl4a-CTLD基因）表达的反义寡核苷酸或siRNA寡核苷酸。
[0140] 如本文所用，术语"反义寡核苷酸"是指DNA或RNA或其衍生物，其包含与特定 mRNA序列互补并结合到mRNA内的互补序列上以抑制mRNA翻译成蛋白质的核酸序列。反 义寡核苷酸序列可以是与clecl4a(优选clecl4a_CTLD)mRNA互补并能结合clecl4a(优选 clecl4a-CTLD)mRNA并能抑制clecl4a(优选clecl4a-CTLD)mRNA的翻译、细胞质易位或成 熟或所有其它整体生物功能所必需的活性的DNA或RNA序列。反义寡核苷酸具有6至100 个碱基，优选8至60个碱基，更优选10至40个碱基长度。
[0141] 可以在碱基、糖或骨架中的一个或多个位置上修饰反义寡核苷酸，以便改善效果 (DeMesmaeker等人，CurrOpinStructBiol. ,5(3) :343_55(1995))。可以使用例如硫代磷 酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基、环烷基或短链杂原子或杂环糖间键来修饰寡核苷 酸骨架。此外，反义寡核苷酸可以包含一个或多个取代的糖部分（moieties)。反义寡核苷酸 还可以包含经修饰的碱基。经修饰的碱基的实例包括次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧 啶（尤其是5-甲基胞嘧啶）、5_羟甲基胞嘧啶（HMC)、糖基HMC、龙胆二糖基HMC、2-氨基腺 嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱 氮鸟嘌呤、N6-(6-氨基己基）腺嘌呤和2, 6-二氨基嘌呤。此外，本发明的反义寡核苷酸可 以化学键合到一个或多个部分或缀合物上，以增强反义寡核苷酸的活性和细胞摄取。例如， 亲脂部分包括但不限于，胆固醇部分、胆留醇部分、胆酸、硫醚、巯基胆固醇、脂肪链、磷脂、 聚胺链、聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八烷基胺部分和己基氨基-羰基-羟胆固 醇部分。制备包括脂质部分的寡核苷酸的方法是本领域公知的（美国专利号5, 138, 045、 5, 218, 105和5, 459, 255)。经修饰的寡核苷酸在存在核酸酶的情况下可以具有增强的稳定 性以及对靶mRNA的增强的结合亲和力。
[0142] 可以在体外通过常规方法合成反义寡核苷酸并施用到体内，或可以在体内进行合 成。用于体外合成反义寡核苷酸的方法使用了RNA聚合酶I。用于在体内合成反义RNA的 方法包括使用在相反的方向上包含多克隆位点（MCS)的载体来进行反义RNA的转录。这样 的反义RNA优选地在其序列中包含翻译终止密码子以阻止翻译成肽序列。
[0143] 可以通过本领域已知的方法并参考clecl4a(优选clecl4a_CTLD)的核 苷酸序列来容易地设计本发明所用的反义寡核苷酸（Weiss,B.(编）：Antisense 01igodeoxynucleotidesandAntisenseRNA:NovelPharmacologicalandTherapeutic Agents，CRC出版社，BocaRaton，FL，1997 ;Weiss，B.等人，Antisen seRNAgene therapyforstudyingandmodulatingbiologicalprocesses.Cell.Mol.Life Sci.，55:334-358(1999))。
[0144] 如本文所用，术语"siRNA"是指一种核酸分子，其能够介导RNA干扰或基因沉 默（参考：W0 00/44895、W0 01/36646、W0 99/32619、W0 01/29058、W0 99/07409 和W0 00/44914)。由于siRNA能抑制靶基因的表达，其提供了一种有效的基因敲除或基因治疗的 方式。首先发现于植物、虫、果蝇和寄生虫中，最近对siRNA进行开发并用于哺乳动物细胞 的研宄。
[0145] 在将siRNA分子用于本发明的情况下，其可以具有一种结构，其中其有义链（对应 于clecl4a(优选clecl4a_CTLD)mRNA序列的序列）和其反义链（互补于clecl4a(优选 clecl4a-CTLD)mRNA序列的序列）形成双链。或者，其也可以是具有自互补的有义和反义链 的单链结构。
[0146]siRNA不限于其中双链RNA部分构成了完整的对的那些，也包括未配对部分如错 配（对应的碱基不互补）、凸出（在一条链上没有相应的碱基）等。siRNA的总长可以是10 至100个碱基，优选为15至80个碱基，更优选为20至70个碱基。
[0147]siRNA的末端可以是平末端或粘末端，只要其能够经RNA干扰（RNAi)抑制 clecl4a(优选clecl4a_CTLD基因）的表达。粘末端可以是3'或5'-粘末端。
[0148] 在本发明中，siRNA分子可具有插入在自互补的有义和反义链之间的短核苷酸序 列（如约5-15个核苷酸）。在这种情况下，自核苷酸序列的表达所形成的siRNA分子经分 子内杂交形成发夹结构，导致整个形成茎-环结构。将茎-环结构在体外或体内进行处理 以得到活化的能够介导RNAi的siRNA分子。
[0149] 如本文所用，术语"适配体"是指对特定靶分子具有结合亲和性的核酸分子。适配 体也可以通过结合特定靶分子来抑制特定靶分子的活性。本发明的适配体可以是RNA、DNA、 经修饰的核酸或其混合物。本发明的适配体还可以是线性或环状形式。本发明的适配体对 其长度没有特别地限制。通常，其可以具有约15-200个核苷酸的长度，例如约100个核苷 酸或更少，优选约80个核苷酸或更少，更优选约60个核苷酸或更少，最优选约45个核苷酸 或更少。本发明的适配体也可以具有约18、20或25个核苷酸或更多的长度。当核苷酸的 总数较小时，更容易进行化学合成和大量生产，并且在成本方面具有很大的优势。也容易进 行化学修饰，体内的稳定性高且毒性低。
[0150] 可以利用SELEX方法或其改进版（例如，Ellington等人，Nature, 1990 346,818-822;Tuerk等人，Science, 1990 249,505-510)来制备本发明的适配体。SELEX方 法是一种从具有10-14个不同核苷酸序列的寡核苷酸池中选择特异性结合靶分子的寡核 苷酸的方法。所使用的寡核苷酸具有约40个残基的随机序列，其侧翼为引物序列。此寡 核苷酸池被允许与靶分子混合，并且通过使用过滤器（filter)等仅收集结合至靶分子的 RNA。通过RT-PCR扩增所收集的寡核苷酸，并且将其作为下一循环的模板。通过重复此操 作约10次，获得特异性结合靶分子的适配体。通过增加循环数或使用竞争物质，浓缩并选 择显示出对靶分子具有更强结合潜力的适配体。因此，通过调整SELEX的循环数和/或改 变竞争性条件，能够在某些情况下获得具有不同的结合力或结合模式的适配体以及具有相 同的结合力或结合模式但具有不同碱基序列的适配体。SELEX方法包括通过PCR扩增的过 程；通过在过程中使用锰离子等造成突变，可能使SELEX具有更高的多样性。
[0151] 除了已知的SELEX方法，也可以对复合革E(complextargets)、活细胞或组织 使用Cell-SELEX方法以获得适配体（Guo等人，Int.丄]?〇1.5(^.，9(4):668,2008)，并且 Cell-SELEX方法具有针对疾病直接选择适配体而不需要表面上的靶分子的现有知识的优 势。此外，Cell-SELEX方法比传统SELEX方法优越之处在于，在选择过程中使用针对生理 状态下的靶蛋白的功能研宄是可能的，因为当分离时靶蛋白可能不显示其固有性状。
[0152] 同时，适配体以很多种结合方式结合靶分子，如基于磷酸基团的负电荷的离子键、 基于核糖的疏水键和氢键以及基于核酸碱基的氢键和堆积相互作用。特别地，基于以与构 成的核苷酸的数量相同的数量存在的磷酸基团的负电荷的离子键是强的，并且结合至存在 于蛋白正电荷表面上的赖氨酸和精氨酸。出于此原因，可以取代不直接结合到靶分子的核 酸碱基。特别地，由于茎结构的区域已经形成碱基对并朝向双螺旋结构的内侧，所以核酸碱 基不可能直接结合至靶分子上。因此，即使当一个碱基对被另一个碱基对替代时，适配体的 活性往往也不会降低。在其中没有碱基对形成的结构中，如环结构，只要核酸碱基不直接结 合到靶分子上，则碱基替代是可能的。例如，在核糖的2'位上，羟基基团被任何原子或基团 取代。原子或基团的实例可以包括氢原子、氟原子或-〇-烷基基团（如-〇-ch3)、-〇-酰基 基团（如-0-CH0)和氨基基团（如-NH2)。适配体总是保持其活性，除非直接结合到靶分子 上的官能团被取代或删除。
[0153] 此外，适配体是易于修饰的，这是因为它们允许化学合成。对于适配体而言，通过 使用MF0LD程序预测二级结构或通过X-射线分析或NMR分析预测立体结构，可以在一定程 度上预测哪个核苷酸会被取代或删除以及在哪里会插入一个新的核苷酸。可以容易地化学 合成所预测的具有新序列的适配体，并且可以使用现有分析系统来测定适配体是否保留了 活性。
[0154] 本发明的适配体可以是这样一种适配体，其中各个核苷酸的糖残基（如核糖）已 被修饰以增加结合活性、稳定性、药物递送性等。糖残基上的修饰的实例可以是在2'-位 的氧原子的替代、糖残基的3'-位和/或4'-位被另一个原子替代等。修饰的类型可以有 氣化、〇_烷基化（如〇_甲基化、〇_乙基化）、〇_芳基化、S-烷基化（如S-甲基化、S-乙 基化）、S-芳基化和胺化（如-nh2)。糖残基中的此类变化可以按已知的方法实施（例 如，Sproat等人，Nucle. Acid. Res. 1991 19, 733-738 ;Cotton等人，Nucl. Acid. Res. 1991 19, 2629-2635 ;Hobbs等人，Biochemistry 1973 12, 5138-5145)。
[0155] 本发明的适配体还可以具有改变（如通过化学取代）的核酸碱基（如嘌呤或嘧 啶）以增加结合活性。此类改变的实例可以是在5位上的嘧啶改变、在6-和/或8-位上 的嗓呤改变、具有环外胺（extracyclicamine)的改变、用4-硫尿苷的取代和用5-溴-尿 嘧啶或5-碘-尿嘧啶的取代。
[0156] 可以改变本发明的适配体中所包含的磷酸基团，以赋予对核酸酶和水解的抗性。 例如，P(0) 0基团可以被P(0)S(硫代酯（thioate))、P(S)S(二硫代酯）、P(0)NR2 (酰胺化 物）、P(0)R、R(0)OR'、C0 或CH2 (甲乙缩醛（formacetal))或 3' -胺（-NH-CH2CH2_)所取代 [其中，R或R'的各个单元独立地是H或者是取代的或未取代的烷基（如甲基、乙基）]。连 接基团是，例如-〇_、-N-或-S-，并且核苷酸可以经这些连接基团结合到相邻的核苷酸上。
[0157] 改变还可以包括这样的改变，如在3'和5'加帽。改变还可以通过进一 步向末端添加聚乙二醇、氨基酸、肽、反向dT、核酸、核苷、肉豆蔻、石胆酸-油烯基 (lithocolic-oleyl)、二十二酰基（docosanyl)、月桂酰、硬脂酰、棕榈酰、油酰、亚油酰 (linoleoyl)、其它脂质、类固醇、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光物质、抗癌剂、毒素、 酶、放射性物质、生物素等来进行。对于此类改变，参见例如美国专利号5, 660, 985和 5, 756, 703。
[0158] 此外，适配体被附着于脂质体或纳米颗粒的表面以将包封于脂质体或纳米颗粒中 的抗癌剂、毒素、肿瘤抑制基因和siRNA(小干扰RNA)递送到靶细胞中。
[0159] 在本发明中，用于抑制clecl4a(优选clecl4a_CTLD)的表达的材料，特别地，其活 性优选是特异性结合到clecl4a(优选clecl4a_CTLD)的抗体、肽、低分子量化合物或天然 提取物。
[0160] 可以特异性结合到clecl4a(优选clecl4a_CTLD)的抗体如上所阐明。
[0161] 可以通过本领域已知的典型方法获得特异性结合到clecl4a(优选 clecl4a_CTLD)以抑制其活性的肽，例如通过菌体展示（SmithGP,"Filamentousfusion phage:novelexpressionvectorsthatdisplayclonedantigensonthevirion surface".Science228 (4705):1315-1317 (1985);SmithGP,PetrenkoVA,"Phage display" ?Chem.Rev. 97 (2) : 391-410 (1997))。
[0162] 优选地，用于抑制血管生成的组合物可以通过抑制血管生成来治疗癌症。
[0163] 优选地，用于抑制血管生成的组合物可以通过抑制血管生成来治疗血管生成相关 疾病。
[0164] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于抑制血管生成的试剂盒，其包 括所述组合物，并且其中，所述组合物包含用于抑制clecl4a(优选Clecl4a-CTLD)的表达 的物质。
[0165] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于抑制血管生成的方法，其 包括向有需要的受试者施用组合物，并且其中，组合物包含用于抑制clecl4a(优选 Clecl4a-CTLD)的表达的材料。根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于治 疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用组合物，并且其中，组合物包含用于抑制 clecl4a(优选clecl4a_CTLD)的表达的材料。
[0166] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种抗体-药物偶联物，其包括附着到 药物上的如权利要求1至17任一项所述的抗体。药物可以是选自毒素、化疗剂、抗癌药、抗 生素、ADP-核糖基转移酶、放射性同位素和溶核中的任一个，但不限于此。
[0167] 优选地，抗体-药物偶联物能够被内化至细胞中。更优选地，细胞可以是癌细胞。 在本发明的一个实施方式中，clecl4a_CTLDIgG可以被内化至表达clecl4a的细胞如癌症 细胞中（图9a、9b)。
[0168] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗血管生成相关疾病的药 物组合物，其包括clecl4a的CTLD与Fc的融合蛋白。
[0169] 在本发明的一个实施方式中，hCTLD-Fc以浓度依赖的方式抑制血管的形成（图 11) 〇
【具体实施方式】
[0170]
[0171] 以下，参考实施例对本发明进行更详细地说明。对于本领域技术人员而言，显而易 见的是，这些实施例是说明性的目的，且不应被解释为限制本发明的范围。
[0172] 实施例1:细胞培养和转染
[0173] 在内皮生长培养基-2 (EGM-2)中维持人脐静脉内皮细胞 (HUVEC，Lonza，Baltimore,MD，美国）。在含有 10% (v/v)胎牛血清和 1% (v/v)青霉素 /链霉素的Dulbecco氏改良Eagle培养基中培养小鼠主动脉内皮细胞（MAEC)和C0S-7 细胞。将细胞维持于37°C和5 % 0)2的湿润的C02-受控培养箱中（Sanyo,Panasonic HealthcareCompany，Secaucus，NJ,美国）。于37°C和8%C02、在湿润的振荡孵育摇床 (InforsHT，Bottmingen,瑞士）中，将HEK293F细胞维持在补充有1% (v/v)青霉素/链 霉素的Freestyle?293表达培养基（Invitrogen)中。按制造商说明，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen,Carlsbad,CA,美国）将编码GFP、clecl4a_GFP(野生型clecl4a)或 clecl4aACTLD-GFP(clecl4aCTLD缺失突变体）的载体转染HUVEC和C0S-7 细胞。
[0174] 实施例2 :构建和制备人和小鼠的CTLDFc融合蛋白
[0175]使用引物 5' -TCGCGCGGCCGCTGCTCGGCCTCGGGGGCCTGC-3'（SEQIDN0 :1)和 5'-TC GCCTCGAGCTTGCACAGGTAGCCGITGG-3'（SEQIDN0:2)扩增编码hCTLD的氨基酸残基 31-172 的DNA。使用引物 5' -TCGCGGCCCAGGCGGCCTGITCGGCCTCGGGGGCTTG-3'（SEQIDN0 :3)和 5' -TCGCGGCCGGCCTGGCCCTTGCATAGGTAGCCATCGG-3'（SEQIDN0 :4)扩增编码mCTLD的相 同残基的DNA。用SfiI(NEB,Ipswich，MA,美国）酶切PCR片段（NEB，Ipswich，MA，美 国）并将其克隆到修饰的哺乳动物表达载体pCEP4(Invitrogen)中，其中pCEP4在克隆位 点的3'区域中编码人IgGl的铰链和CH2-CH3结构域（Dr.Chung馈赠，SeoulNational University,Seoul,南朝鲜）。将连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5a细胞中，并制备质 粒DNA。取 0? 75mg的各种DNA使用 1. 5mg聚乙稀亚胺（Polysciences,Inc.，Warrington, PA，美国）转染HEK293F细胞（6X108个细胞）。将转染的细胞维持在补充有1% (v/v)青 霉素/链霉素的Freestyle? 293表达培养基中。培养7天后，收集培养基并通过亲和层析 用蛋白ASepharose(RepliGen,Waltham,MA,美国）纯化融合蛋白。使用NanoDrop分光光 度计（Wilmington,DE，美国）对蛋白浓度进行定量。用PBS透析样品并用SDS-PAGE和考 马斯亮蓝染色分析样品。将最终的合并级分的等分试样储存于-80°C。
[0176]实施例3 :合成的人类scFv库的预清洗
[01 77]将合成的人类SCFV库再扩增（1^1^38〇?.?11386(118。137:3 13130四1：0^11^11皿1.ColdSpringHarbor,N.Y.:ColdSpringHarborLaboratoryPress;2001)。为了预清洗 Fc结合剂，将人类免疫球蛋白 _G(GreenCrossPharmaDerivativesCorp，Yong_in,韩国） 固定于蛋白质ASepharose上，并将抗体-蛋白质A复合物于37°C与文库孵育2小时。短 暂离心后，收集上清液并弃去沉淀。将此过程重复两次。通过噬菌体ELISA分析最终的上 清液，以评估清洗的程度。
[0178] 实施例4 :使用噬菌体展示来选择CTLD-特异性scFv
[0179]用免疫管（Immuno?tubemaxisorp,Nunc,Rochester,NY,美国）或包 被有4yg重组人（hCTLD-FC)或小鼠（mCTLD-Fc)融合蛋白的磁珠（Dynabeads M-270epoxy,Invitrogen)进行三轮生物淘洗，以选择具有跨物种反应性的克隆，如前所述 (BarbasCF.Phagedisplay:alaboratorymanual.ColdSpringHarbor,N.Y.:冷泉港实 验室出版社；2001;VestweberD.Lymphocytetraffickingthroughbloodandlymphatic vessels:morethanjustselectins,chemokinesandintegrins.EuropeanJournalof Immunology. 2003 ;33(5):1361-4)。从生长于输出板（outputplates)的克隆中随机选择 96个噬菌体克隆，并通过噬菌体酶免疫分析测试其对人类和小鼠CTLD的反应性。将最终的 scFv克隆的DNA进行测序，并将其归类至具有不同的互补决定区序列的4种scFv克隆中。
[0180]实施例 5 :clecl4a-CTLDIgG的制备
[0181]使用引物 5'-CGGGAATTCGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGCTGTCA GTAACTACAGGTGTCCTCTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTG-3'（SEQIDN0:5)和 5'-GGCGGGCCCTTG GTGGAGGCTGAGCTCACGGTGACCAGTGCCCTTGGCCCC-3'（SEQIDNO:6)扩增所选择的scFv克隆 (克隆 1-4)的重链可变区（VH)基因。使用引物 5'-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACACAITC TCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGAAGGACCAGTCTGTGCTGACTCAGCC-3'（SEQID N0:7)和 5'-GGCCGTACGTAGGACCGTCAGCTTGGTGCCTCCGCCTAAGACATAACCACC-3'（SEQIDNO: 8)扩增克隆的轻链可变区（VL)基因。设计Vg|物以在5'和3'末端添加EcoRI和Apal 限制性酶切位点。设计VL引物在末端添加Hindlll和BsiWI酶切位点。用合适的限制性 内切酶（NEB，Ipswich，MA，美国）酶切PCR片段并将其克隆到双顺反子哺乳动物表达载体 PCDNA3.l(Invitrogen)中，其中pCDNA3. 1在VH克隆位点的3'编码人类IgGl的铰链和 CH2-CH3 结构域（Dr.Hong馈赠，KangwonNationalUniversity,Chuncheon，Kangwon,南 卓月鲜）（SambrookJ,RussellDW.Molecularcloning:alaboratorymanual.第 3 版，冷 泉港；N.Y.:冷泉港实验室出版社；2001)。如前所述，制备并纯化Clecl4a-CTLDIgG(Kim HY,TsaiS,LoSC,WearDJ,IzadjooMJ.Productionandcharacterizatio nofchimeric monoclonalantibodiesagainstBurkholderiapseudomalleiandB.malleiusingthe DHFRexpressionsystem.PLoSONE[电子资源].6(5) :el9867)〇
[0182] 实施例6:伤口愈合和细胞迀移分析
[0183] 按制造商说明，使用CytoSelect?24孔伤口愈合分析试剂盒（CellBiolabs Inc,SanDiego,CA,美国）。简言之，通过仔细地向伤口愈合插件（insert)顶端的开口末 端插入枪头来向每个孔中加入转染了GFP、clecl4a_GFP或clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细 胞。当细胞生长至汇合时，将插件从孔中移除，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS)洗涤细胞两次。 在伤害后20小时获取图像。
[0184] 为了分析内皮细胞的迀移，在插件中培养HUVEC直至形成单层，并于37°C在没有 或存在20yg/ml的clecl4a-CTLDIgG或西妥昔单抗的情况下孵育9小时。用PBS洗涤 细胞两次，并用结晶紫（Sigma，St.Louis，M0,美国）染色。对于定量分析，在光学显微镜 (NikonTS100,Melville，NY，美国）下对每个板拍摄5个视野，并人工测量迀移距离。
[0185] 实施例7:免疫细胞化学
[0186]如前所述，进行免疫细胞化学（LeeS等人，Hydrogenperoxideincreaseshuman leukocyteadhesiontoporcineaorticendothelialcellsviaNFkappaB-dependent up-regulationofVCAM-l.IntImmunol. 2007Dec;19(12):1349-5926)。简言之，将在胶原 包被的盖玻片上生长1天的转染了GFP、clecl4a_GFP或clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细胞 和HUVEC，于37°C用4% (w/v)的低聚甲醛固定30分钟。用PBS洗涤细胞两次并于37°C在 含有5% (w/v)牛血清白蛋白（BSA)和0. 1%TX-100的PBS中孵育1小时以阻断反应。用 〇. 1单位/孔的罗丹明鬼笔环肽和2yg/ml的Hoechst孵育细胞1小时，并在荧光显微镜 (LeicaDM25〇0，Wetzlar，德国）下观察。
[0187]实施例 8:ELISA
[0188] 将PBS中的25nM的重组hCTLD-Fc、mCTLD-Fc或IgGl的Fc片段加入到96孔微量 滴定板中。于37°C孵育过夜后，用含有0.05% (v/v)吐温20的PBS(PBST)洗涤板三次，并 于37°C用含有3% (w/v)BSA的PBST孵育1小时。然后于37°C将板与在含有3% (w/v)BSA 的PBST中的67nM的clecl4a-CTLDIgG孵育3小时。用PBST洗涤板两次，并于37°C与在 含有3% (w/v)BSA的PBST中的辣根过氧化物酶（HRP)-缀合的抗-人X轻链抗体（Bethyl Laboratories,Montgomery,TX,美国，稀释 1 :1000)孵育 1 小时。
[0189] 为了测量CTLD-CTLD的相互作用，将转染了GFP、clecl4a_GFP或 clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细胞的裂解物（20yg)加入到96孔板的孔中，并于37°C用 在PBST中的3% (w/v)BSA孵育1小时，随后加入相同缓冲液中的0. 15yg的hCTLD-Fc或 Fc，并于37°C孵育2小时。为了分析与clecl4a-CTLDIgG的竞争，于37°C将hCTLD-Fc与 在含有3% (w/v)BSA的PBST中的增加浓度的clecl4a-CTLDIgG孵育2小时。然后将蛋 白质复合物加入到孔中并于37°C孵育2小时。在PBST中洗涤孔三次，并加入HRP-缀合的 驴抗-人FcIgG(1 :5000 ;JacksonImmunoresearchLaboratories,Inc. ,WestGrove,PA, 美国）并于37°C孵育1小时。在PBST中洗涤孔三次，并将100y1的TMB底物溶液（BD Biosciences，SanJose，CA，美国）加入到每个孔中。使用微量滴定板读数器（VICTOR? X4,PerkinElmer，Waltham，MA,美国）测量 450nm处的光密度。
[0190] 实施例9:流式细胞术
[0191] 将在6孔微量滴定板中生长的HUVEC(3X105)在没有或存在20ng/ml的 hTNFa(Millipore,Billerica,MA,美国）或 20yg/ml的clecl4a-CTLDIgG或西妥昔 单抗的情况下孵育24小时。收获细胞并于37°C与在流式细胞缓冲液中的20yg/ml的 抗-VCAM-1或ICAM-1多克隆抗体染色1小时。用流式细胞缓冲液洗涤细胞三次，lOOOXg离心10分钟并于37°C与在流式细胞缓冲液中的AlexaFluor488-标记的抗兔抗体（1: 1000;JacksonImmunoResearch)孵育 1 小时。
[0192] 用4% (w/v)的低聚甲醛固定在6孔微量滴定板中生长的HUVEC(3X105)。用PBS 洗涤固定和未固定的细胞两次，并于37°C在没有或存在20yg/ml的clecl4a-CTLDIgG的 情况下孵育2小时。于37°C用7. 5yg/ml的绵羊抗-clecl4a多克隆抗体染色细胞2小时。 用流式细胞缓冲液洗涤细胞三次，并与在流式细胞缓冲液中的NorthernLights?493荧光 染料（NL493)-标记的抗-绵羊抗体（1 :200 ;R&DSystems,Minneapolis,MN,美国）进行孵 育，并通过流式细胞仪进行分析（BDFACSCalibur,BDBioscience,Miami，FL,美国）。
[0193] 实施例10 :血管形成
[0194] 如前所述，进行血管形成的分析（RhoSS等人，Clecl4aisspecifically expressedinendothelialcellsandmediatescelltocelladhesion. Biochemical&BiophysicalResearchCommunications. 404 (1) : 103-8) 〇 简言之，将 250y1 的基质胶（BDBiosciences，Bedford，MA)加入到24孔板的孔中并于37°C聚合20分钟。收 获培养于EGM-2中的HUVEC，在EGM-2中重悬，并接种到基质胶（1X105细胞/孔）中。于 37°C将培养物在没有或存在clecl4a-CTLDIgG或西妥昔单抗的情况下孵育并在21小时时 拍照。人工计数血管。
[0195] 实施例11 :HUVEC细胞活力分析
[0196] 将HUVEC(104)接种于96孔微量滴定板中并于37°C与20yg/ml的clecl4a-CTLD IgG、西妥昔单抗或5-FU(Sigma)孵育2天。按制造商说明，使用CellCounting Kit-8(Dojindo，Kumamoto，日本）测量细胞活力。用VICTOR?X4分光光度计（Perkin Elmer)测定450nm处的吸光度。
[0197] 实施例12 :细胞-细胞接触的测量
[0198] 如前所述，进行细胞-细胞接触分析（RhoSS等人，Clecl4aisspecifically expressedinendothelialcellsandmediatescelltocelladhesion. Biochemical&BiophysicalResearchCommunications. 404(1) : 103-8)。简言之，用表达 GFP、Clecl4a-GFP和Clecl4aACTLD-GFP的质粒转染 1. 5X107的悬浮的HEK293F细胞，在 FreestyleTM293表达培养基中培养过夜，并接种于6孔板（5X105个细胞/孔）中。将细胞 在没有或存在20yg/ml的clecl4a-CTLDIgG或西妥昔单抗的情况下维持8小时。在至少 10个视野中对细胞团块（团块>4个细胞）进行计数并确定平均土标准偏差（SD)。
[0199] 实施例13 :免疫印迹分析
[0200] 如前所述，进行免疫印迹分析（VanMeterKE等人，Amonoclonal antibodythatinhibitstranslationinSf2lcel1lysatesisspecific forglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase.ArchivesofInsect Biochemistry&Physiology. 2008 ;69(3) : 107-17)D 简言之，通过 12%的聚丙稀酰胺凝胶电 泳分离转染了GFP-、clecl4a-GFP-或clecl4aACTLD-GFP的C0S-7 细胞的裂解物（20ug)。 使用湿式转印系统（GEHealthcareLifeSciences，Pittsburgh，PA，美国）将蛋白质转 移到硝酸纤维素膜上。于室温在含有5% (w/v)的脱脂奶粉的10mMTris/HCKpH7. 5)、 150mMNaCl和0. 05% (V/V)的吐温20(TTBS)中孵育膜1小时，随后于4°C与在相同溶液 中的抗_GFP单克隆抗体（1 :5000;SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA,美国）或 抗 肌动蛋白单克隆抗体（1 :5000;AppliedBiologicalMaterials,Richmond,BC,加 拿大）孵育过夜。用TTBS洗涤膜并于室温与在含有5% (w/v)脱脂奶粉的TTBS中的HRP-缀 合的AffiniPure山羊抗-小鼠IgG(l:5000;JacksonImmunoResearch，WestGrove,PA,美 国）孵育1小时。之后用TTBS洗涤数次，按制造商说明，使用SuperSignalWestPico化 学发光底物（Pierce,Rockford,IL,美国）将蛋白质条带可视化。
[0201] 实施例14 :细胞ELISA
[0202] 于 37°C将铺于 96 孔板中的HUVEC(104)与 20yg/ml的clecl4a-CTLDIgG或Fc 孵育0、10、30、60、120或180分钟。用冰冷的PBS洗涤细胞两次，于4°C用在PBS中的3% (w/v)BSA的封闭1小时，并于4°C与在封闭液中的绵羊抗_clecl4a多克隆抗体（1 :1000) 孵育2小时。用冰冷的PBS洗涤细胞三次，并于4°C与HRP-缀合的抗-绵羊IgG(l:5000 ; SantaCruzBiotechnology)孵育1小时。用PBS数次洗绦后，将100y1的TMB底物溶液 加入到各个孔中。使用微量滴定板读数器测量450nm处的光密度。
[0203] 实施例15 :用于表位定位的ELISA
[0204] 分别将在PBS中的10yg/ml的hCTLD-Fc、Fc或hCTLD-Fc的N-末端或C-末端 片段加入到96孔板中。于37°C将板孵育过夜，用含有0. 05% (v/v)吐温20的PBS(PBST) 洗涤三次，并于37°C用3% (w/v)BSA的PBST孵育1小时。于37°C在含有3% (w/v)BSA的 PBST中与10yg/ml的clecl4a-CTLDIgG孵育2小时。然后用PBST洗涤两次，于37°C与在 含有3% (w/v)BSA的PBST中的辣根过氧化物（HRP)缀合的抗-人A轻链抗体（1:1〇〇〇 ; Bethyl Laboratories, TX,美国）解育 1 小时。
[0205] 实施例16:在没有或存在hCTLD-Fc的情况下的血管形成分析
[0206] 将250y1的基质胶（BDBiosciences)加入到24孔板中并使其于37°C聚合20分 钟。收获培养于EGM-2中的HUVEC，并重悬于EGM-2中，并接种到基质胶上（1X105细胞/ 孔）。于37°C在没有或存在10和25yg/ml的hCTLDFc或Fc的情况下孵育培养物并在8 小时时拍照。
[0207] 实验实施例1 :Clecl4aCTLD在细胞迀移和外肉伪足形成中可能发挥了关键作用
[0208] 为了阐明CTLD在clecl4a介导的细胞迀移中的作用，用绿色荧光蛋白（GFP)、 融合了GFP的野生型clecl4a(clecl4a_GFP)或融合了GFP的clecl4aCTLD缺失突变体 (clecl4aACTLD-GFP)转染C0S-7细胞，并在伤口愈合分析中、在0和20小时时分析迀移。 表达野生型clecl4a的细胞的迀移程度是仅表达GFP的细胞的迀移程度的约1. 6倍，而 clecl4aACTLD缺失突变体的表达对迀移影响很小（图la和lb)。
[0209] 由于肌动蛋白细胞骨架重排特异性调节细胞迀移，使用免疫细胞化学来研宄表达 GFP、clecl4a-GFP或clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC)中的 肌动蛋白网络组织。在这两种细胞类型中，clecl4a-GFP的过表达急剧增加了外肉伪足的 形成，而GFP或clecl4aACTLD-GFP的影响最小（图2a和2b)。
[0210] 总而言之，这些结果表明，CTLD通过调节肌动蛋白细胞骨架重排在内皮细胞的迀 移中发挥了关键的作用。
[0211] 实验实施例2 :CTLD_特异性单链可变片段（scFv)的分离
[0212] 由于人类、小鼠或黑猩猩的clecl4a的CTLD(表1)是Fc融合蛋白，实施两个连续 的预清洗步骤以从合成的人类scFv文库中除去Fc结合剂；由噬菌体酶联免疫吸附分析验 证除去约90%。
[0213] [表 1]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217] 本发明中所使用的氨基酸序列上的氨基酸残基根据IUPAC-IUB命名法由缩写表 不〇
[0218] 丙氨酸：A 精氨酸：R
[0219] 天冬酰胺：N天冬氨酸：D
[0220] 半胱氨酸：C谷氨酸：E
[0221] 谷氨酰胺：Q甘氨酸：G
[0222] 组氨酸异亮氨酸：1
[0223] 亮氨酸：L赖氨酸：K
[0224] 甲硫氨酸：M苯丙氨酸：F
[0225] 脯氨酸：P丝氨酸：S
[0226] 苏氨酸：T色氨酸
[0227] 酪氨酸：Y缬氨酸：V
[0228] 然后用人（hCTLD-Fc)或小鼠（mCTLD-Fc)的CTLD融合蛋白、使用CTLD-Fc包被 的免疫管和磁性珠，交替地生物淘选文库，以分离具有跨物种CTLD反应性的克隆（图3a); 仅用磁珠鉴定出数个这样的克隆（图3b-3d)。随机选择96个噬菌体克隆，通过噬菌体酶 免疫分析挽救（rescue)。将克隆DNA测序，并选择四个同时识别人和小鼠的CTLD且具有 不同的互补决定区序列的克隆（克隆1-4)(表2至9)。同时，四个克隆可以特异性识别黑 猩猩的CTLD，具有交叉反应性，这是因为黑猩猩的clecl4a-凝集素的氨基酸序列与人类clecl4a-凝集素的氨基酸序列相同。
[0229] [表2]
[0230]
[0247] 同样，克隆1-4的核酸序列与下述表10至17是相同的。
[0248] [表 10]
[0249]
[0250]
[0263][表16]
[0264]
[0267]
[0268] 实验实施例3 :Clecl4a-CTLDIgG特异性识别人类和小鼠的clecl4a_CTLD
[0269] 将scFv克隆转化为IgG，表达于人胚胎肾293F(HEK293F)细胞中并纯化。通过十二 烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色，四个IgG克隆示出了大于 90%的纯度。ELISA表明，纯化的CTLD-特异性IgG(clecl4a-CTLDIgG)特异性结合人和小 鼠的CTLD-Fc，而不能仅是Fc。克隆1和2比克隆3和4示出了更大的亲和力（图4)。
[0270] 实验实施例4 :Clecl4a-CTLDIgG特异性抑制内皮细胞迀移和血管形成
[0271] 为了研宄clecl4a-CTLDIgG对内皮细胞迀移的抑制效果，在没有或存在 clecl4a-CTLDIgG的情况下用HUVEC进行伤口愈合分析。使用西妥昔单抗、抗-EGFR抗体 作为对照IgG。在所选择的clecl4a-CTLDIgG中，克隆1和2分别显著地抑制了约44% 和54%的HUVEC细胞迀移，而克隆3和4以及仅使用西妥昔单抗几乎没有效果。（图5a和 5b)〇
[0272] 为了确定clecl4a_CTLDIgG对血管形成的影响，在没有或存在clecl4a_CTLDIgG 和西妥昔单抗的情况下分析血管形成。如前述所报道的克隆1和2以及西妥昔单抗阻断了 HUVEC血管的形成，而其它克隆没有显著的效果（图5c和5d)。
[0273] 这些结果有力地表明，clecl4a_CTLDIgG特异性抑制肿瘤血管生成。
[0274] 实验实施例5 :Clecl4a-CTLDIgG对内皮细胞活力和活化的作用
[0275] 为了研宄clecl4a-CTLDIgG对内皮细胞活力的作用，在没有或存在clecl4a-CTLD IgG、西妥昔单抗或5-氟尿嘧啶（5-FU)、细胞凋亡诱导剂的情况下培养HUVEC两天，并使用 细胞计数试剂盒检测细胞活力。抗体对HUVEC活力几乎没有影响，而5-FU特异性降低了活 力（图6a)。
[0276] 为了确定clecl4a-CTLDIgG对内皮细胞活化的作用，在没有或存在clecl4a-CTLD IgG、西妥昔单抗或人肿瘤坏死因子a(hTNFa)的情况下培养HUVEC。基于血管细胞粘附 分子-l(VCAM-l)和细胞间粘附分子-l(ICAM-l)的表达（由流式细胞技术测定）来确定活 化。用hTNFa处理细胞，其诱导VCAM-1和ICAM-1的上调，并将其作为阳性对照。抗体和 西妥昔单抗对HUVEC活化没有效果（图6b)。
[0277] 综合考虑，这些结果表明，clecl4a-CTLDIgG对内皮细胞活力或活化几乎没有影 响。
[0278] 实验实施例6 :Clecl4a-CTLDIgG特异性抑制clecl4a介导的细胞-细胞接触
[0279] 为了阐明clecl4a_CTLDIgG在内皮细胞-细胞接触中的作用，测定细胞团块的 数量（其是clecl4a介导的细胞-细胞接触的指示剂），所述细胞团块由转染了GFP或 clecl4a-GFP并在没有或存在clecl4a-CTLDIgG或西妥昔单抗的情况下生长的HEK293F 细胞形成。表达clecl4a-GFP的细胞形成的细胞团块的数量比仅表达GFP的细胞高约4倍 (图7a和7b)。此外，克隆1和2显著地抑制了转染了clecl4a_GFP的细胞的成团，而其它 克隆和西妥昔单抗几乎没有效果。
[0280] 综合考虑，这些结果表明，clecl4a_CTLDIgG可能在肿瘤血管生成中的 clecl4a_介导的内皮细胞-细胞接触发挥了抑制作用。
[0281] 实验实施例7 :Clecl4a-CTLDIgG特异性阻断clecl4aCTLD-CTLD的相互作用
[0282] 使用免疫分析以确认转染的C0S-7细胞的裂解物中GFP、clecl4a-GFP和 clecl4aACTLD-GFP的表达（图8a)。然后将裂解物与hCTLD-Fc或Fc孵育以观察CTLD之 间的相互作用。虽然hCTLD-Fc可以与C0S-7细胞裂解物中的一些其它的蛋白质相互作用， 但其强烈地结合到clecl4a_GFP上但不结合到clecl4aACTLD-GFP上，这表明在内皮细胞 中存在特异性的CTLDCTLD相互作用（图8b)。
[0283] 为了确定clecl4a-CTLDIgG是否阻断CTLD-CTLD相互作用，用升高浓度的 clecl4a-CTLDIgG(克隆1)孵育hCTLD-Fc，并将蛋白质复合物与转染GFP或clecl4a-GFP 的细胞的裂解物一起孵育。竞争性ELISA表明，clecl4a-CTLDIgG以浓度依赖性方式特异 性抑制CTLD-CTLD的相互作用（图8c)，这表明clecl4a-CTLDIgG可以特异性阻断在内皮 细胞中的clecl4aCTLD-CTLD的相互作用。
[0284] 实验实施例8:与clecl4a_CTLDIgG的交联下调了HUVEC表面上的clecl4a
[0285] 为了研宄clecl4a-CTLDIgG在抑制前血管生成表型中可能的作用，使用流式细胞 技术以比较用clecl4a_CTLDIgG(克隆1)处理前后的HUVEC膜上的clecl4a表达水平。 IgG处理显著地降低了活细胞中的clecl4a，而不是多聚甲醛固定的细胞中的clecl4a(图 9a)〇
[0286] 为了确认clecl4a_CTLDIgG对HUVEC膜上的clecl4a的下调，用IgG(克隆1)或 Fc处理细胞并通过细胞ELISA测定膜clecl4a。Clecl4a_CTLDIgG以时间依赖性方式下调 HUVEC膜上的clecl4a(图 9b)。
[0287]这些结果有力地表明，clecl4a的clecl4a_CTLDIgG交联（cross-linking)特异 性下调了内皮细胞膜上的clecl4a。此外，这些结果表明，clecl4a_CTLDIgG能够被内化至 表达clecl4a的细胞如癌症细胞中。
[0288] 实验实施例9 :表位的精细定位
[0289]为了 精细定位表位，通过ELISA测试clecl4a_CTLD IgG对Clecl4a wtCTLD和 hCTLD-Fc的片段的特异性（图10a)。
[0290] 结果如图10b所示，克隆1和克隆2的clecl4a_CTLD IgG特异性结合hCTLD以及 wthCTLD的N-末端和C-末端。
[0291] 这些结果有力地表明，CTLD如克隆1和克隆2的clecl4a_CTLD IgG的N-末端或 C-末端区域特异性结合包含hCTLD中第1个氨基酸到第42个氨基酸的氨基酸片段的融合 蛋白、包含hCTLD中第1个氨基酸到第62个氨基酸的氨基酸片段的融合蛋白、包含hCTLD 中第82个氨基酸到第142个氨基酸的氨基酸片段的融合蛋白、包含hCTLD中第62个氨基 酸到第142个氨基酸的氨基酸片段的融合蛋白以及包含hCTLD中第122个氨基酸到第142 个氨基酸的氨基酸片段的融合蛋白，其可以被用作表位。
[0292] 实验实施例10:检测CTLD-Fc是否抑制血管形成的测试
[0293] 为了研宄hCTLD-Fc对血管生成的抑制作用，根据实施例16,在存在hCTLD-Fc或 Fc的情况下分析血管的形成。
[0294] 结果如图11所述，hCTLD-Fc以浓度依赖性方式抑制血管的形成。
[0295] 这些结果有力地表明，hCTLD-Fc特异性抑制肿瘤血管生成。
[0296] 工业实用性
[0297] 基于这一新的发现，即clecl4a的CTLD在细胞的迀移和外肉伪足的形成中发挥了 重要的作用，本发明鉴定了一种新的抗CTLD的抗体在抑制血管生成中的功能。因此，本发 明提供了一种可以用于抑制血管生成的新的靶结构域。此外，本发明的抗体可有效地用于 预防或治疗血管生成相关疾病或clecl4a介导的癌症。
[0298] 虽然本发明已参照具体特征进行了详细的描述，对于本领域技术人员而言，显而 易见的是，这些描述仅用于优选的实施方式，且并不限制本发明的范围。因此，本发明的实 质性的范围将由所附的权利要求及其等同物所限定。
[0299] 独立文本的序列表
[0300] 随附了电子文档。
【主权项】
1. 一种抗体，其特异性结合clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员A)。2. 如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性结合clecl4a的CTLD(C型凝集素样 结构域）。3. 如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性结合到clecl4a的CTLD的N末端或 C末端。4. 如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性结合到包含clecl4a的CTLD中的 第1个氨基酸至第42个氨基酸的氨基酸片段或clecl4a的CTLD中的第122个氨基酸至第 142个氨基酸的氨基酸片段的区域。5. 如权利要求2所述的抗体，其中所述抗体特异性结合具有交叉反应性的人、黑猩猩 和小鼠的clecl4a的CTLD。6. 如权利要求1所述的抗体，其抑制血管生成。7. 如权利要求2所述的抗体，其中CTLD是clel4a的氨基酸序列上横跨第31个氨基酸 至第172个氨基酸的区域的多肽。8. 如权利要求2所述的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含 由SEQIDNO:14的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDNO:16的氨基酸序列定义的重 链⑶R2和由SEQIDNO:18的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区包含由SEQIDNO: 42的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDNO:44的氨基酸序列定义的轻链⑶R2和由 SEQIDN0:46的氨基酸序列定义的轻链CDR3。9. 如权利要求2所述的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含 由SEQIDNO:21的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDNO:23的氨基酸序列定义的重 链⑶R2和由SEQIDNO:25的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区包含由SEQIDNO: 49的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDNO:51的氨基酸序列定义的轻链⑶R2和由 SEQIDNO:53的氨基酸序列定义的轻链⑶R3。10. 如权利要求2所述的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含 由SEQIDNO:28的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDNO:30的氨基酸序列定义的重 链⑶R2和由SEQIDNO:32的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区包含由SEQIDNO: 56的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDNO:58的氨基酸序列定义的轻链⑶R2和由 SEQIDNO:60的氨基酸序列定义的轻链⑶R3。11. 如权利要求2所述的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含 由SEQIDNO:35的氨基酸序列定义的重链⑶R1、由SEQIDNO:37的氨基酸序列定义的重 链⑶R2和由SEQIDNO:39的氨基酸序列定义的重链⑶R3,轻链可变区包含由SEQIDNO: 63的氨基酸序列定义的轻链⑶R1、由SEQIDNO:65的氨基酸序列定义的轻链⑶R2和由 SEQIDNO:67的氨基酸序列定义的轻链⑶R3。12. 如权利要求2所述的抗体，其中所述抗体选自：包含具有SEQIDNO: 125的氨基 酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO:129的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；包含具有 SEQIDNO: 126的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO: 130的氨基酸序列的轻链可 变区的抗体；包含具有SEQIDNO:127的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO:131 的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；包含具有SEQIDNO:128的氨基酸序列的重链可变区 和具有SEQIDNO:132的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。13. 如权利要求1所述的抗体，其功能在于抑制细胞的迀移。14. 如权利要求1所述的抗体，其功能在于抑制血管的形成。15. 如权利要求1所述的抗体，其功能在于抑制细胞与细胞的接触。16. 如权利要求1所述的抗体，其功能在于抑制clecl4aCTLD-CTLD复合物的形成。17. 如权利要求1所述的抗体，其功能在于诱导血管内皮细胞表面上的clecl4a的下 调。18. -种核酸，其编码权利要求1至17中任一项所述的抗体。19. 如权利要求18所述的核酸，其中编码抗体的核酸包含重链核酸序列和轻链核酸序 列，其中重链核酸序列包含示于SEQIDNO:70的重链⑶Rl核苷酸序列、示于SEQIDNO: 72的重链⑶R2核苷酸序列和示于SEQIDNO:74的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序列 包含示于SEQIDNO:77的轻链CDRl核苷酸序列、示于SEQIDNO:79的轻链CDR2核苷酸 序列和示于SEQIDNO:81的轻链⑶R3核苷酸序列。20. 如权利要求18所述的核酸，其中编码抗体的核酸包括重链核酸序列和轻链核酸序 列，其中重链核酸序列包含示于SEQIDNO:84的重链⑶Rl核苷酸序列、示于SEQIDNO: 86的重链⑶R2核苷酸序列和示于SEQIDNO:88的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序列 包含示于SEQIDNO:91的轻链CDRl核苷酸序列、示于SEQIDNO:93的轻链CDR2核苷酸 序列和示于SEQIDNO:95的轻链⑶R3核苷酸序列。21. 如权利要求18所述的核酸，其中编码抗体的核酸包括重链核酸序列和轻链核酸序 列，其中重链核酸序列包含示于SEQIDNO:98的重链⑶Rl核苷酸序列、示于SEQIDNO: 100的重链⑶R2核苷酸序列和示于SEQIDNO: 102的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序 列包含示于SEQIDNO: 105的轻链CDRl核苷酸序列、示于SEQIDNO: 107的轻链CDR2核 苷酸序列和示于SEQIDNO: 109的轻链⑶R3核苷酸序列。22. 如权利要求18所述的核酸，其中编码抗体的核酸包括重链核酸序列和轻链核酸序 列，其中重链核酸序列包含示于SEQIDNO:112的重链⑶Rl核苷酸序列、示于SEQIDNO: 114的重链⑶R2核苷酸序列和示于SEQIDNO: 116的重链⑶R3核苷酸序列，轻链核酸序 列包含示于SEQIDNO: 119的轻链CDRl核苷酸序列、示于SEQIDNO: 121的轻链CDR2核 苷酸序列和示于SEQIDNO: 123的轻链⑶R3核苷酸序列。23. 如权利要求18所述的核酸，其中编码抗体的核酸选自：包含作为重链可变区的SEQ IDNO:133的核苷酸序列和作为轻链可变区的SEQIDNO:134的核苷酸序列的核酸、包含 作为重链可变区的SEQIDNO:135的核苷酸序列和作为轻链可变区的SEQIDNO:136的核 苷酸序列的核酸、包含作为重链可变区的SEQIDNO:137的核苷酸序列和作为轻链可变区 的SEQIDNO:138的核苷酸序列的核酸和包含作为重链可变区的SEQIDNO:139的核苷酸 序列和作为轻链可变区的SEQIDNO:140的核苷酸序列的核酸。24. -种载体，其包含权利要求18至23中任一项所述的核酸。25. -种宿主细胞，其包含权利要求20所述的载体或权利要求18至23中任一项所述 的核酸。26. -种生产权利要求1至17中任一项所述的抗体的方法，其包含培养权利要求21所 述的宿主细胞，使得表达核酸以生产抗体。27. -种抗体-药物缀合物，其包括附着到药物上的权利要求1至17中任一项所述的 抗体。28. 如权利要求27所述的抗体-药物缀合物，其中所述药物选自下述任意一种：毒素、 化疗剂、抗癌药、抗生素、ADP-核糖基转移酶、放射性同位素和溶核酶。29. 如权利要求27所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物能够被内化 至细胞中。30. 如权利要求29所述的抗体-药物缀合物，其中所述细胞是癌症细胞。31. -种用于预防或治疗血管生成相关疾病的药物组合物，其包含权利要求1至17中 任一项所述的抗体。32. 如权利要求31所述的药物组合物，其中所述血管生成相关疾病选自：癌症、转移、 糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥、视网膜黄斑变性、新生血管性青光 目艮、皮肤红变、增殖性视网膜病变、银肩病、血友病性关节炎、动脉粥样硬化斑块中的毛细血 管形成、瘢痕瘤、伤口肉芽、血管粘附、类风湿关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩 病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、猫抓病、溃疡、肝硬化、肾炎、糖尿病性肾病、糖尿病、炎 性疾病和神经变性疾病。33. 如权利要求31所述的药物组合物，其中所述癌症选自：食道癌、胃癌、大肠癌、直肠 癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、结肠癌、乳癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸 癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、结缔组织癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、霍奇金 淋巴瘤、淋巴瘤和多发性骨髓血癌。34. -种用于治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求 1所述的抗体或权利要求31所述的药物组合物。35. -种用于抑制血管生成的组合物，其包括权利要求1至17中任一项所述的抗体。36. -种用于抑制血管生成的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求1所述的 抗体或权利要求31所述的药物组合物。37. -种用于血管生成相关疾病的诊断组合物，其包括权利要求1至17中任一项所述 的抗体。38. 如权利要求37所述的诊断组合物，其中所述血管生成相关疾病选自：癌症、转移、 糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥、视网膜黄斑变性、新生血管性青光 目艮、皮肤红变、增殖性视网膜病变、银肩病、血友病性关节炎、动脉粥样硬化斑块中的毛细血 管形成、瘢痕瘤、伤口肉芽、血管粘附、类风湿关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩 病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、猫抓病、溃疡、肝硬化、肾炎、糖尿病性肾病、糖尿病、炎 性疾病和神经变性疾病。39. 如权利要求38所述的诊断组合物，其中所述癌症的特征在于表达clecl4a。40. -种用于血管生成相关疾病的诊断试剂盒，其包括权利要求37所述的诊断组合 物。41. 一种用于诊断血管生成相关疾病的方法，其包括通过抗原-抗体复合物检测从疑 似患有血管生成相关疾病的受试者的分离的生物样品中的cIec14a。42. -种多肽，其包含分离的clecl4a的CTLD，其用作能够诱导生产抑制血管生成的抗 体的表位。43. -种多肽，其包含分离的clecl4a的CTLD的N-末端或C-末端，其用作能够诱导生 产抑制血管生成的抗体的表位。44. 一种多肽，其包含clecl4a的CTLD中的第1个氨基酸到第42个氨基酸的氨基酸片 段或clecl4a的CTLD中的第122个氨基酸到第142个氨基酸的氨基酸片段，其用作能够诱 导生产抑制血管生成的抗体的表位。45. -种用于制备特异性结合到clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员A)的抗体的 方法，其包括：使用权利要求42至44中任一项所述的多肽作为表位进行生物淘选。46. -种用于抑制血管生成的组合物，其包括用于抑制clecl4a表达的物质。47. 如权利要求46所述的组合物，其中所述物质是用于抑制clecl4a的CTLD的表达的 物质。48. 如权利要求46所述的组合物，其中所述物质选自：特异于clecl4a的反义寡核苷 酸、siRNA、适配体和抗体。49. 如权利要求46所述的组合物，其通过抑制血管生成来治疗血管生成相关疾病。50. -种用于抑制血管生成的试剂盒，其包括权利要求46至49中任一项所述的组合 物。51. -种用于抑制血管生成的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求46至49中 任一项所述的组合物。52. -种用于治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求 46至49中任一项所述的组合物。53. -种用于预防或治疗血管生成相关疾病的药物组合物，其包括clecl4a的CTLD与 Fc的融合蛋白。54. 如权利要求53所述的药物组合物，其中所述血管生成相关疾病选自：癌症、转移、 糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥、视网膜黄斑变性、新生血管性青光 目艮、皮肤红变、增殖性视网膜病变、银肩病、血友病性关节炎、动脉粥样硬化斑块中的毛细血 管形成、瘢痕瘤、伤口肉芽、血管粘附、类风湿关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩 病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、猫抓病、溃疡、肝硬化、肾炎、糖尿病性肾病、糖尿病、炎 性疾病和神经变性疾病。55. -种用于治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用clecl4a 的CTLD与Fe的融合蛋白或权利要求53所述的药物组合物。
【专利摘要】本发明涉及新的特异性结合clec14a(C型凝集素结构域家族14，成员A)的抗体及其用途。更具体地，本发明涉及特异性结合clec14a的CTLD(C型凝集素样结构域)的抗体，用于制备所述抗体的方法，包含所述抗体的用于抑制血管生成的组合物，通过施用抗体或组合物来抑制血管生成的方法，包含所述抗体的用于预防或治疗癌症的组合物，通过施用抗体或组合物来治疗癌症的方法，包括所述抗体的用于诊断癌症的组合物，包括所述组合物的用于诊断癌症的试剂盒，使用组合物来诊断癌症的方法，用于抑制血管生成的组合物，其包含用于抑制clec14a表达的材料，包含所述组合物的用于血管生成的试剂盒，使用所述组合物来抑制血管生成或治疗癌症的方法以及clec14a的CTLD作为抑制血管生成的抗体的表位的用途。所述抗体可有效抑制cle14a介导的癌症进展。
【IPC分类】C12N15/13, C07K16/28, A61K39/395, A61P35/00
【公开号】CN104903350
【申请号】CN201380043426
【发明人】李硕默, 奇珉庚, 郑美贤, 崔钟湁
【申请人】斯克里普斯抗体研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年6月14日
【公告号】EP2861623A1, EP2861623A4, US20150140001, WO2013187556A1, WO2013187724A1
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