扩链泊洛沙姆及由其形成的含生物材料的热可逆水凝胶和它的医学应用
扩链泊洛沙姆及由其形成的含生物材料的热可逆水凝胶和它的医学应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及扩链泊洛沙姆（chain-extendedpoloxamers)。尤其是，本发明涉及由这样的扩链泊洛沙姆制备的热可逆水凝胶。另外，本发明涉及含有生物材料的热可逆水凝胶和它的制备方法、医药应用的应用体系和体外在表面上制备组合物的方法。【
背景技术：
】[0002]术语"泊洛沙姆"指的是一类聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物（首次记载在US3,740,421中），还以商品名"piur〇nicK"或"Lutrol?"（BASFSE的商标）被公知。它们是由亲水的聚乙二醇外段和疏水的聚丙二醇内段组成的嵌段共聚物，即（聚（氧化乙烯）-聚(氧化丙稀）-聚（氧化乙稀））-三嵌段共聚物（(poly(ethyleneoxide)_poly(propyleneoxide)-poly(ethyleneoxide)-tri-blockcopolymers)，其可粗略地由以下结构所概括：[00031[0004]这些嵌段共聚物通过相分离在水中形成溶胶或凝胶。聚乙二醇段溶入水中，而聚丙二醇段则彼此相连。该过程就是所谓的胶束形成。所述胶束在较低温度下呈现相对混乱的状态（溶胶状态），当温度升高时会带来这些胶束的有序排列，这导致了液体的凝固（凝胶状态）（参见AlexandridisP.，HolzwarthJ.F.，HattonT.A.MicellizationofPoly(ethyleneoxide)-Poly(propyleneoxide)-Poly(ethyleneoxide)TriblockCopolymersinAqueousSolutions:ThermodynamicsofCopolymerAssociation(聚（氧化乙烯）_聚（氧化丙烯）_聚（氧化乙烯）三前段共聚物在水溶液中的胶束化：共聚交联的热动力学）.Macromolecules.1994;27(9):2414-25)。因此这样的凝胶也称为热可逆水凝月又（thermoreversiblehydrogels)〇[0005]基于泊洛沙姆的水凝胶已被知晓很长一段时间了（(Cf.J.，SwaffordW.B.:Pluronicsasasuppositorybase(普朗尼克作为检剂基质）.Am.J.Pharm.Sci.Support.PublicHealth.1960;132:301_303)。此外，还记载了泊洛沙姆407(Pluronic'1F127)和六甲撑二异氰酸醋（hexamethylenediisocyanate，HMDI)的扩链聚合物（cf.JiangJ.,MalalR.,LiC.,LinM.Y.,ColbyR.H.,GersappeD.,RafailovichM.H.,SokolovJ.C.,CohnD.:RheologyofThermoreversibleHydrogelsfromMultiblockAssociatingCopolymers(多嵌段交联共聚物的热可逆水凝胶的流变学）.Macromolecules2008;41:3646-3652)〇[0006]由于泊洛沙姆是生物学上惰性的，因此它们很快被用作了药物的栓剂，并且伴随着再生医学的出现，它们还可作为细胞载体（cf.KamilS.H.，EaveyR.D.，VacantiM.P.,VacantiC.A.,HartnickC.:Tissue-engineeredcartilageasagraftsourceforlaryngotrachealreconstruction-Apigmodel(组织工程软骨作为喉气管重建的移植源-猪模型）?Arch.Otolaryngol.2004;130(9):1048-1051)。[0007]这些水凝胶的特性在于所描述的温敏行为（thermo-sensitivebehaviour)。因此结合细胞（incorporatedcells)的微创（minimally-invasive)应用是可能的。后者可以轻易地变成液态。移植后，由于温度发生变化而形成凝胶，使得细胞可以保留在预定位置（cf.CohnD.，LandoG.，SosnikA.，GartyS.，LeviA.:PE〇-PP〇-PE〇-basedpoly(etheresterurethane)sasdegradablereversethermo-responsivemulti-blockcopolymers(基于PE0-PP0-PE0的聚（醚醋尿烧）作为可降解的热可逆多嵌段共聚物）?Biomaterials2006;27(9):1718-1727;NguyenM.K.,LeeD.S.Injectablebiodegradablehydrogels.Macromol.Biosci.2010；10(6):563-579)〇[0008]使用热可逆水凝胶在例如烧伤治疗中是有益的。水凝胶可允许经皮的或局部的活性物质给药并且可在皮肤表面保持较高的湿度，这防止了脱水。并且，水凝胶可相当大程度地附着到受损组织，且具有一定的弹性，因此可避免水凝胶分离以及同时吸收伤口产生的分泌物。通常，水凝胶可促进愈合，因为它们可迅速地在伤口位点变成凝胶状态并在伤口处保持潮湿。[0009]然而大多数的具有低聚合物浓度的泊洛沙姆仅能形成具有较差的机械性能的凝胶，而扩链泊洛沙姆则可获得更为稳定的凝胶。最初的扩链尝试是采用丙烯酸酯（acrylicacidesters)(丙稀酸醋（acrylates))进行的，这使得具有C=C双键的基团与泊洛沙姆相连。此后，进行化学加成反应以使得多个泊洛沙姆基团可以被连接。丙烯酸的衍生物在生理学上是无害的。如果采用二异氰酸酯进行扩链，单个泊洛沙姆通过尿烷基团（urethanemoieties)相连。聚氨醋（Polyurethanes)由于它们的组织相容性已在很长一段时间里用作医用植入体（medicalimplants)。至今存在的缺陷是该材料不能被细胞生物识别，因此直到现在细胞也不能附着该材料。[0010]因此，本发明的目的在于提供基于泊洛沙姆的扩链水凝胶，其既不具有现有技术中已知的缺陷，又适合于医学应用。本发明的另一个目的是提供能够释放生物活性试剂或活性物质的热可逆水凝胶。此外，本发明的目的在于提供含有生物材料和活细胞的热可逆水凝胶，其中，细胞粘附在生物材料上，以及它们的治疗应用。【
发明内容】[0011]上述目的可通过提供根据权利要求1-8的扩链泊洛沙姆、根据权利要求9-21的热可逆水凝胶、根据权利要求22-24的应用体系、根据权利要求25-34的热可逆水凝胶的医学应用和根据权利要求35-36的体外方法而实现。【附图说明】[0012]图la-le展示了测定的由泊洛沙姆制得的热可逆水凝胶的物理性质，该泊洛沙姆通过采用二异氰酸酯进行扩链，其中，泊洛沙姆403或PluronicP123(PMT001)通过采用六甲撑二异氰酸酯进行扩链、泊洛沙姆403(PMT002;BDI-hydr〇gel)通过采用二异氰酸丁酯进行扩链，泊洛沙姆403(PMT003)进通过采用亚甲基二环己基二异氰酸酯（methylenebiscyclohexyldiisocyanate)进行扩链。这些测定作为部分的合作计划在慕尼黑的路德维希马克西米利安大学（LudwigMaximilianUniversity)的药物研宄中心的Dr.W.Friess教授的实验室中完成。[0013]图la中给出了本文中相对浊度对聚合物浓度（wt.%)的绘图，图lb中给出了平均保质期模块对温度的绘图，图lc中给出了平均贯入阻力（meanpenetrationresistance)对温度的绘图，图Id中给出了凝胶强度对温度的绘图，以及图le给出了作为生物材料的蛋白质的平均释放比例对时间的绘图。[0014]图2a和2b示出了说明由经二异氰酸丁酯扩链的泊洛沙姆403组成的热可逆水凝胶（以下称作BDI-hydrogel)在不同聚合物浓度下（2,4%、5%和10%)的细胞存活率。在本文中不同的聚合物浓度，通过采用"存活/死亡-分析法（Live/Dead-Assay)"先按小时测量（在图la中的"Oh"-"5h"列），然后按天测量（在图2b中的"ld"、"2d"和"3d"列），以及最后在一周后测量（在图2b中的"7d"列）。[0015]图3展示了在本发明的热可逆BDI-hydrogel中存在10%、20%或者不存在胶原的情况下，每种情况在1、2、3和7天后的细胞形态。比例尺为200ym;所有图片是在同样的放大程度下获得的。[0016]图4展示的显微照片说明了7天后在本发明的热可逆BDI-hydrogel中存在或不存在胶原I的情况下的eGFP-SCPls的细胞存活率（MW±SD，r=3,n=3)。采用邓氏多项比较试验（multiplecomparisontestbyDunn)的Kruskal-Wallis-统计学提供了不存在胶原I(A)或存在胶原I(B和C)的本发明的热可逆凝胶之间的显著性差异。本文中，a=0.05,*p〈0.05,且林p〈0.01。采用碘化丙啶（PI)染色后的示例性的显微图（底部，10x放大）；比例尺为200ym。[0017]图5给出了eGFP-SCPls细胞在本发明的热可逆BDI-hydrogel中存在或者不存在20%胶原I的情况下7天后在共聚焦激光扫描显微镜下的显像。该图在10x放大（比例尺为200ym;图A)或63x放大（比例尺为500ym;图B)程度下测得。[0018]图6a给出了在存在0&02的BDI-hydrogel中在注射器中培养24h后的氧气饱和度(A)和细胞存活率（B)，"对照组"为不存在0&02的BDI-hydrogel(MW±SD，r=3,n=1)。[0019]图6b给出了在存在0.25mg/mL的Ca02和多种过氧化氢酶浓度的BDI-hydrogel中在注射器中培养24h后的氧气饱和度（A)和细胞存活率（B)(MW±SD，r=3,n=1)。[0020]图6c给出了在存在0.5mg/mL的CaOjPl100U/mL过氧化氢酶的BDI-hydrogel中或当前第1页1 2 3 4 5 者在存在〇. 25mg/mL的CaOjP100U/mL过氧化氢酶的BDI-hydrogel中在注射器中培养 72h后的氧气饱和度（A)和细胞存活率⑶（MW±SD，r= 3,n= 1)。
【具体实施方式】
[0021] 本发明提供了利用二异氰酸酯由泊洛沙姆制得的扩链泊洛沙姆。这些扩链泊洛沙 姆可转变为热可逆水凝胶，其可以在医学领域的多种方面应用。
[0022] 适用于本发明的，且可以在后续阶段转变为水凝胶的泊洛沙姆通常为分子量超 过4000Da的泊洛沙姆P。更优选地，聚丙烯段的分子量超过2350Da。在一种优选的实施 方式中，上述泊洛沙姆中，或者分别在上述那些泊洛沙姆中，聚氧乙烯基团（polyethylene oxidemoieties)的比例为20% -80%，更优选为20% -70%，特别优选为20% -60%。扩 链泊洛沙姆P*由至少一种泊洛沙姆P与二异氰酸酯反应制得，并且其包括两个聚氧乙烯 (polyoxyethylene)段PEG和一个聚氧丙稀（polyoxypropylene)段PPG，其中，P的聚氧丙 烯段的分子量大于2350Da，该扩链泊洛沙姆P*特别适用于本发明。如果存在多于一种泊洛 沙姆，例如两种不同的泊洛沙姆P和P'，每种泊洛沙姆都要满足上述要求。
[0023] 尤其是，为了获得根据本发明的扩链泊洛沙姆，在上面所指的情况中，泊洛沙姆P 的分子量至少为11，〇〇〇Da，且P的聚氧乙烯的比例超过60%，还采用了不同于前述的泊洛 沙姆的另一种泊洛沙姆。泊洛沙姆407(P|ur〇niCKF127)是分子量至少为ll，000Da且聚 氧乙烯的含量超过60%的泊洛沙姆的一个实例。因此，在本发明中，在采用泊洛沙姆407的 情况下，优选联合使用不同于泊洛沙姆407的至少一种泊洛沙姆。
[0024] 在另一种实施方式中，对于上述泊洛沙姆P的分子量至少为11，000Da且P中聚氧 乙稀的含量超过60%来说，所述二异氰酸酯选自由式0 =C=N-(CH2)n-N=C= 0表示的 二异氰酸醋，其中n= 4、5或者n>6,异佛尔酮二异氰酸醋（isophoronediisocyanate)、亚 甲基二（4, 4'-异氛酸）环己烧（methylenedi(4,4,-isocyanato)cyclohexane，H12_MDI)、 赖氨酸二异氰酸醋（lysinediisocyanate)和芳香二异氰酸醋，优选为二苯基甲烧二异氰 酸醋（diphenylmethanediisocyanate，MDI)所组成的组中。在一种优选的实施方式中，如 果采用泊洛沙姆407,后者是扩链的、并结合有选自前述的其他泊洛沙姆和二异氰酸酯（如 果必要的话）。
[0025] 优选地，至少一种泊洛沙姆P的至少三个重复单元进行反应。
[0026] 所述泊洛沙姆基团与二异氰酸酯反应以扩链。当本发明采用芳香二异氰酸酯时， 通常它们是本领域优选的由于它们的高反应性，存在的缺点是它们会降解成致癌的二胺 类。相反地，相应的脂肪二异氰酸酯的降解将得到例如二胺，如腐胺（putrescine)或尸胺 (cadaverine)，这在体内新陈代谢的发生程度较低。此外，脂肪类化合物还耐受于其他降解 反应，这也是为什么它们可用于需要避免发黄或类似的技术应用中。因此，本发明优选采用 脂肪的，尤其是线性的二异氰酸酯。
[0027] 可商购的泊洛沙姆（丨)丨111-011丨(：'1<或1^批0丨〔1<)在于氧化乙烯（ethyleneoxide)或 聚乙二醇-(PEG)基团a和聚氧丙烯或（PPG)-基团b的的比例，以及嵌段的长度上是不同 的。这导致了在水中的不同表现。
[0028] 如果上述的泊洛沙姆与二异氰酸酯反应，则本发明的扩链泊洛沙姆P*含有以下 结构单元，特别是当它以单一的泊洛沙姆为起始原料时：
[0029]
[0030] 其中，a和b各自为1-110的整数，且m彡3 ;a表示聚氧乙烯段PEG的重复单元数， b表示聚氧丙稀段PPG的重复单元数；由式0 =C=N-X-N=C= 0表示的二异氰酸酯制 备，其中X为所述二异氰酸酯的脂肪族基团或芳香族基团。如果采用两种不同的泊洛沙姆 (P和p'）作为起始原料，所述扩链泊洛沙姆P*同样具有下式表示的结构单元：
[0031] 式
[0032] l
->rn,
[0033] 和/或式
[0034]
[0035] 其中，a、b、m和X如上所定义的，而在第二种泊洛沙姆P'中，分别地，c表示聚氧 乙烯段PEG的重复单元数，d表示聚氧丙烯段PPG的重复单元数，c和d各自为1-110的整 数，m'彡3〇
[0036] 在一种优选的实施方式中，扩链泊洛沙姆P选自泊洛沙姆272、278、331、333、334、 335、338、401、402、403和407(商品牌号：？|11丨*〇丨1丨(^或1」.财〇丨_:1!1^92、？98、1101、？103、 P104、P105、F108、L121、L122、P123和F127)中的一种或多种。所述泊洛沙姆407优 选与一种或多种其他的泊洛沙姆联合使用。在另一种优选的实施方式中，所述泊洛沙姆407 结合其他的泊洛沙姆一起，或者甚至单独与由〇 =C=N-(CH2)n-N=C= 0表示的线性的 二异氰酸酯进行反应，其中n= 4、5或者n>6,或者与脂肪二异氰酸酯进行反应，如异佛尔 酮二异氰酸醋、亚甲基二（4, 4'-异氰酸）环己烧（H12-MDI)或赖氨酸二异氰酸醋（lysine diisocyanate)，或者芳香二异氰酸醋，优选为二苯基甲烧二异氰酸醋（MDI)。
[0037] 本发明的泊洛沙姆通常可以为液体、膏体或固体形式。例如，在常规条件下，泊洛 沙姆272、331、401和402 (或者标记为"L"的Pluronic型）为液体，泊洛沙姆333、334、335 和403 (或者标记为"P"的Pluronic型）为膏体，以及泊洛沙姆278、668和407 (或者标记 为"F"的Pluronic型）为固体。
[0038] 本发明特别优选为基于泊洛沙姆403、407和338的热可逆水凝胶。
[0039] 至今，医疗和药物目的的水凝胶中主要采用泊洛沙姆407或"Pluronic^F 127〃（根据上述通式，其中a= 100，b= 65;即[PEG]65[PPG]1QQ[PEG]65)。
[0040] 根据本发明，还可能将多种泊洛沙姆P结合来制备扩链泊洛沙姆P*。在该情况下， 扩链泊洛沙姆P*由两种或三种不同的泊洛沙姆组成。
[0041] 根据本发明，所述扩链泊洛沙姆P*可以进行反应得到热可逆水凝胶。本发明的热 可逆水凝胶优选为这样的热可逆水凝胶：
[0042] (a)含有上述扩链泊洛沙姆P*以及
[0043] (b)含有选自由抗菌的、抗微生物的（antimicrobial)或抗真菌的（antifungal) 活性物质，蛋白质，葡糖胺聚糖（glucosaminoglycans)，溶菌酶（lysozyme)和聚氨基酸所 组成的组中的生物材料。
[0044] 本发明的热可逆水凝胶可由以下过程制得：
[0045] (a)制备上述扩链泊洛沙姆P*，以及
[0046] (b)将所述扩链泊洛沙姆与生物材料混合，所述生物材料选自由抗菌的、抗微生物 的或抗真菌的活性物质，蛋白质，葡糖胺聚糖，溶菌酶和聚氨基酸所组成的组中。
[0047] 作为优选的二异氰酸酯的芳香族的和脂肪族的，尤其是线性的二异氰酸酯已证实 特别利于作为扩链剂（chainextenders)。
[0048] 如上所述，材料不能被细胞生物识别是现有技术中存在的缺陷，因为所述细胞至 今都不能附着该材料。更特别地，本发明基于的这样典型的想法，即将基于扩链泊洛沙姆上 的水凝胶与作为生物材料的胶原反应，从而发现，由此意外地制得了具有优良性质的热可 逆水凝胶。根据一种优选的实施方式，例如细磨的（finelyground)或可溶性胶原可用作 生物材料。实验室试验显示具有一定耐受范围的细胞展示出膨胀的细胞形态，表明附着于 胶原上。
[0049] 根据本发明，还发现，例如，甚至由低浓度的相对疏水的泊洛沙姆403 (P|uronicK F123)可以制得具有合适物理性质的通用的热可逆水凝胶，特别是，当如上所述的，它们 是被线性的或脂肪族的二异氰酸酯扩链的。已证明这些水凝胶特别适于用作细胞和高分 子量蛋白质的应用体系（applicationsystem)。与基于公知的扩链泊洛沙姆的水凝胶 相比，根据本发明的水凝胶呈现出非常显著改善的性能。因此，相比于仅仅基于泊洛沙姆 407 (P|uronicKiF127)，基于泊洛沙姆403的所述热可逆水凝胶的独特优势在于它们在体 内更为稳定。
[0050] 为了获得整合细胞（integratedcells)的更长的细胞存活率和生物功能性，根据 本发明，所述水凝胶被生物材料所改性。为此，细胞可以获得通过整合素结合的方法附着的 附着点。这样的附着是细胞活性的先决条件（cf.PopovC.，RadieT.，HaastersF.，Prall ff.C. ,AszodiA. ,GullbergD.等：lntegrinsalpha2betalandalphallbetalregulate thesurvivalofmesenchymalstemcellsoncollagenI(整合素a2 0 1 和a11 0 1 调 节胶原I上的间充质干细胞的存活）.CellDeathDis. 2011 ;2:el86)。
[0051] 根据本发明，合适的生物材料选自由抗菌的、抗微生物的或抗真菌的活性物质， 蛋白质，葡糖胺聚糖，溶菌酶和聚氨基酸所组成的组中。所述抗菌的、抗微生物的或抗 真菌的活性物质优选选自由0 -内酰胺抗生素类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类、 抗病毒药类（antivirals)、稀丙胺类（allylamines)、抗真菌的抗生素类（antimycotic antibiotics)、咪挫类和它们的衍生物所组成的组中。所述聚氨基酸优选选自天然的和合 成的聚氨基酸。
[0052] 在一种优选的实施方式中，所述生物材料选自蛋白质类。
[0053] 根据本发明，所述蛋白质优选选自由抑制或刺激细胞生长和细胞分化的蛋白质 所组成的组中；或选自由纤维蛋白、胶质（gelatine)、胶原（collagens)和骨形态发生 蛋白（bone-morphogeneti cproteins，BMP)所组成的组中。所述蛋白质可以更进一步 为生长因子，并且优选选自由胰岛素样生长因子（IGF)、转移生长因子（transforming growthfactor，TGF)、血小板源生长因子（platelet-derivedgrowthfactor，roGF)、 表皮生长因子（EGF)、纤维母细胞生长因子（FGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，GMCSF)、if[I胃内 因f (VEGF)、肝细胞生长因子（HGF)、白细胞介素-IB(IL-IB)、白细胞介素-8 (IL-8)、神经生长 因子（NGF)和如红细胞生成素和集落刺激因子（colony-stimulatingfactors)(如G-CSF) 的造血生长因子所组成的组中。
[0054] 在一种优选的实施方式中，所述生物材料选自0-内酰胺抗生素类、四环素类、 氨基糖苷类、大环内酯类、抗病毒药类、烯丙胺类、抗真菌的抗生素类、咪唑类和它们的衍 生物，表皮生长因子（EGF)、TGF-0-(转移生长因子0)-超家族（TGF-0-(transforming growthfactorbeta)_superfamily)，优选BMP(骨形态发生蛋白，bonemorphogenetic protein)-和GDF(生长分化因子，growthdifferentiationfactor)-家族，更优选BMP2、 BMP7 和⑶F-5〇
[0055] 在一种优选的实施方式中，所述生物材料由可溶性胶原、细磨胶原、胶质、人血、动 物血、人血或动物血中的成分组成。
[0056] 在一种优选的实施方式中，所述生物材料由胶原I、II或III型组成。
[0057] 在一种优选的实施方式中，所述生物材料或蛋白质为激素或酶，更优选为卵泡抑 素（follistatin)或肌生成抑制素（myostatin)。
[0058] 所述蛋白质还可以为免疫球蛋白或抗体，优选选自由IgA、IgD、IgE、IgM、IgG、IgY 和IgW所组成的组中。
[0059] 此外，如果所述生物材料为葡糖胺聚糖，可以采用透明质酸（hyaluronan或 hyaluronicacid)〇
[0060] 本发明的热可逆水凝胶还可以含有活细胞。
[0061] 前述细胞优选选自由单核细胞，特别是间充质干细胞和其祖细胞（progenitor cells)和由其分化而得的细胞，例如成骨细胞（osteoblasts)、脂肪细胞、软骨细胞、纤维 母细胞、上皮细胞、成肌细胞（myoblasts)、肌腱细胞（tendocytes)，或者单核造血干细 胞和其祖细胞以及由其分化而得的细胞，例如免疫细胞，或者多核细胞如巨细胞、巨细胞 (giantcells)和破骨细胞（osteoclasts)所组成的组中。
[0062] 在进一步优选的实施方式中，在所述凝胶中，所述细胞是改性的或转基因的。
[0063] 在一种优选的实施方式中，所述热可逆水凝胶还可以含有示踪剂。在本文中，由放 射性物质制得的示踪剂优选经PET或SPECT可视。这样的示踪剂的实例为如氚、14C、18F、32P、 35S、mIn和1231的放射性同位素。
[0064] 出人意料地，目前发现在本发明的热可逆水凝胶中，由于与生物材料连接，
[0065] -整合细胞表现出膨胀的细胞形态，由此表明结合生物材料（如胶原）的整合素的 形成，并且同时
[0066] -所述热可逆水凝胶的良好的机械性能几乎没有改变。
[0067] 本发明的热可逆水凝胶可以在医学领域具有较宽的应用。因此，本发明提供了热 可逆水凝胶的医学应用，所述医学应用为给药递送或生物医学应用。
[0068] 在一种优选的实施方式中，本发明提供了一种应用体系，其含有上述热可逆水凝 胶。在该实施方式中，前述应用体系优选还含有刺激或抑制细胞/组织生长或杀死细胞的 治疗剂。
[0069] 通过采用本发明的热可逆水凝胶可引入多种治疗剂。治疗剂的实例包括上面描 述的用于生物材料的试剂，以及通常合成的无机和有机化合物、蛋白质和肽类、多糖和其他 糖、脂质、神经节苷脂（gangliosides)和具有治疗、预防或诊断活性的核酸序列。核酸序列 包括基因、通过结合到互补DNA而抑制转录的反义分子，和核糖酶。引入的治疗剂可以具有 多种生物活性，例如血管活性试剂、神经活性试剂、激素、抗凝剂、免疫调节剂、细胞毒性试 剂、抗生素、抗病毒试剂、反义试剂（antisenseagents)、抗原和抗体。包括抗体或抗原、模 拟抗体（anticalins)的蛋白质或类似的能够结合抗原的人工蛋白质同样可以被引入。将 蛋白质定义为由1〇〇个以上的氨基酸残基组成；肽类为少于1〇〇个氨基酸残基。除非其他的 说明，术语"蛋白质"既指蛋白质又指肽类。实例包括胰岛素、甲状旁激素（parathormone)、 甲状旁腺激素片段、鸢尾素、肌生成抑制素、卵泡抑素和其他激素。
[0070] 具体的治疗剂包括抗生素、抗病毒试剂、留体和非留体抗炎药，抗肿瘤药，镇痉剂， 包括通道阻滞剂（channelblockers)，包括细胞生长抑制剂和抗粘附分子的胞内/胞外 基质作用调节剂，酶和酶抑制剂，抗凝血剂和/或抗凝血酶试剂，生长因子，DNA，RNA，DNA、 RNA或蛋白合成的抑制剂，调节细胞增殖和/或生长的化合物，血管舒张剂（vasodilation agents)和其他的常用于治疗组织损伤的药用物质。这些化合物的实例包括血管紧张素 转换酶抑制剂、前列环素、肝素、水杨酸盐类（salicylates)、硝酸盐类（nitrates)、钙通道 阻滞剂、链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂（tissueplasminogenactivator，TPA) 和茴香酰纤溶酶原激活剂（anisoylatedplasminogenactivator，TPA)和茴香酰化纤 溶酶原 _ 链激酶激活剂复合物（anisoylatedplasminogen-streptokinase-activator complex，APSAC)，秋水仙素和烷基化试剂以及适配子（aptamers)。胞间作用的调节剂的具 体实例包括白介素、血小板源生长因子、酸性的和碱性的纤维母细胞生长因子（FGF)、转移 生长因子0 (TGF0)、表皮生长因子（EGF)、胰岛素样生长因子和它们的抗体。核酸的具体 实例包括编码蛋白质的基因和cDNAs、表达载体、反义子和其他寡核苷酸，例如用于调节或 阻止基因表达的核糖酶。其他生物活性试剂的具体实例包括胞外基质或其受体的改性组分 和脂质和胆固醇隔离剂（sequestrationagents)。
[0071] 作为治疗剂的蛋白质的实例还包括细胞因子（cyctokines)，如干扰素和白介素， 蛋白质和集落刺激因子。作为治疗剂的糖类包括唾液酸化路易斯x(SialylLewisx)，对于 该糖已经显示出其可选择性地结合受体又可抑制炎症。可以采用"可递送的生长因子等价 物"(deliverablegrowthfactorequivalent，缩写为DGFE)，一种用于细胞或组织的生长 因子，其可以大范围的被构建，以包括生长因子、细胞因子、干扰素、白介素、蛋白质、集落刺 激因子、赤霉素（gibberellins)、生长素和维生素；还包括肽片段或上述的其他活性片段； 还包括载体（vectors)，即，无论是通过转化还是瞬时表达，能够在靶细胞内合成这种因子 的核酸构建体；以及还包括刺激或抑制组织中合成这种因子的效应子（effectors)，该情 况下，这些效应子包括自然信号分子、反义子和三重螺旋的核酸（triplehelicalnucleic acids)和类似物。DGFEs的实例为血管内皮生长因子（VEGF)、内皮细胞生长因子（ECGF)、 碱性的纤维母细胞生长因子（bFGF)、骨生长蛋白（BMP)和血小板源生长因子（PDGF)以及编 码它们的DNAs。结块溶解剂（clot-dissolvingagents)的实例为组织纤溶酶原激活剂、链 激酶、尿激酶和肝素。
[0072] 还可以提供具有抗氧化活性的药物（即消灭活性氧或阻止它的形成）在本发明的 热可逆水凝胶用作治疗剂，例如其有利于阻止附着。实例包括超氧化物歧化酶或其他蛋白 药物，包括过氧化氢酶、过氧化物酶和常规的氧化酶或如细胞色素P450、谷胱甘肽过氧化物 酶和其他天然或变性血蛋白的氧化酶。
[0073] 哺乳动物应激蛋白或如热休克蛋白70 (hsp70)和hsp90的热休克蛋白或者如黄铜 类的抑制或降低应激蛋白或热休克蛋白表达的刺激物，也可以提供在所述水凝胶中用作治 疗剂。
[0074] 在进一步优选的实施方式中，基于本发明的热可逆水凝胶的前述的应用体系还包 括释放氧气的物质（oxygen-releasingsubstance)。本文中，所述释放氧气的物质优选与 酶结合存在。这样的酶的实例包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶以及常规的氧 化酶或如细胞色素P450、谷胱甘肽过氧化物酶和其他天然的或变性的血蛋白的氧化酶。
[0075] 含有释放氧气的物质的本发明的应用体系在以下实施例8中有所描述。
[0076] 向凝胶中加入释放氧气的物质的目的在于在较大程度上阻止因缺氧导致的细胞 死亡，直到可供给细胞的新生血管形成。通过扩散运行的方式进行供给最多穿过几毫米。 如果仅将过氧化物和细胞加入到根据本发明的热可逆水凝胶中，细胞会由于产生的过氧化 氢产生的作用而死亡。然而，如果加入如过氧化氢酶的过氧化物降解酶，可以可阻止细胞死 亡。
[0077] 本发明的还提供了上述热可逆水凝胶在制备用于治疗身体状况（medical condition)的药物的应用，所述药物用于在体内组织上施用所述热可逆水凝胶的水溶液。
[0078] 在一种优选的实施方式中，前述水溶液含有生物活性材料的溶液或悬浮液。
[0079] 在一种优选的实施方式中，前述身体状况为皮肤灼伤或擦伤。
[0080] 在另一种优选的实施方式中，前述身体状况为被外科手术损伤的组织。在一种 优选的实施方式中，前述外科手术为椎体成形术（vertebroplasty)或椎体后凸成形术 (kyphoplasty) 〇
[0081] 本发明的热可逆水凝胶的应用还可以通过使用公知技术而实现（effected)，例如 腹腔镜检查（laparoscopy)和内窥镜检查（endoscopy)。也可以采用公知的导管 系统，例如 US专利5, 328, 471或5, 213, 580中所描述的。
[0082] 在一种优选的实施方式中，前述医学应用的特征在于所述外科手术是通过套管针 的插管（cannulaofatrocar)进行操作的。
[0083] 在一种优选的实施方式中，对于前述医学应用来说，所述热可逆水凝胶在药学上 可接受的载体中给药到组织。生理盐水或磷酸盐缓冲盐水是这样的载体的实例。
[0084] 在一种优选的实施方式中，对于前述医学应用来说，将所述热可逆水凝胶提供于 药学上可接受的载体中以用于胃肠外给药。
[0085] 在一种优选的实施方式中，对于前述医学应用来说，将所述热可逆水凝胶定位在 生物组织表面上；或者用于医疗设备的表面上。此外，可将所述热可逆水凝胶定位在相对的 表面之间，从而产生所述表面相互粘附的趋势。
[0086] 在一种优选的实施方式中，对于前述医学应用来说，所述生物组织为器官。在前述 的实施方式中，对于前述医学应用来说，所述器官优选选自皮肤，内脏器官，优选骨、软骨、 结缔组织（优选肌腱和脂肪组织）的肌肉骨骼系统的组织。
[0087] 最后，本发明提供一种在表面上制备组合物的体外方法，该方法包括在所述表面 上施用上述热可逆水凝胶的水溶液或它的混合物，或者前述医学应用体系。
[0088] 优选地，所述体外方法包括施用上述含有活细胞的热可逆水凝胶的水溶液。
[0089] 更优选地，所述体外方法通过采用前述应用体系进行操作，尤其是含有活细胞和 释放氧气的物质以及酶的应用体系。在本文中，优选将过氧化钙用作所述释放氧气的物质。 例如过氧化氢酶优选作为所述酶。
[0090] 在上述体外方法的一种特别优选的实施方式中，本发明的所述热可逆水凝胶由泊 洛沙姆403( PluronV P 123)制得。
[0091] 以下实施例将说明根据本发明的扩链泊洛沙姆或由其获得的热可逆水凝胶的制 备和性能。
[0092] 实施例
[0093] 实施例1:用六甲撑二异氰酸酯扩链的泊洛沙姆的制备
[0094] 在连接有回流冷凝器的玻璃烧瓶中，采用干燥的甲苯将17.4g的泊洛沙姆 4〇3(Plur〇nicK'P123 ;3mmol)调制到80g。在45°C下用电磁搅拌棒搅拌至得到澄清溶 液。蒸馏掉20mL的甲苯以除去水的痕迹。随后，采用注射器在每例中（ineachcase)加 入0. 49g的六甲撑二异氰酸酯（HDI，2, 92mmol)和溶解在2mL的甲苯中的120yL的1，8-二 氮杂双环[5.4.0]i^一碳-7-烯（DBU)的溶液。升温至55°C。2小时后，用旋转蒸发仪除 去甲苯。然后，在良好的真空条件下于45°C(水浴）进行干燥直至重量恒定。
[0095] 实施例2 :用二异氰酸丁酯扩链的泊洛沙姆的制备
[0096] 在连接有回流冷凝器的玻璃烧瓶中，采用干燥的甲苯将17.4g的泊洛沙姆 403(3mmol)调制到80g。在45°C下用电磁搅拌棒搅拌至得到澄清溶液。蒸馏掉20mL的甲苯 以除去水的痕迹。随后，采用注射器在每例中加入〇.373g的二异氰酸丁酯（BDI，2,92mmol) 和溶解在2mL的甲苯中的120yL的1，8-二氮杂双环[5.4. 0] ^碳_7_烯（DBU)的溶液。 升温至55°C。2小时后，用旋转蒸发仪除去甲苯。然后，在良好的真空条件下于45°C(水 浴）进行干燥直至重量恒定。
[0097] 实施例3:用二苯基甲烷二异氰酸酯扩链的泊洛沙姆的制备
[0098]称量17.4g的泊洛沙姆403 (3mmol)，加入到连接有回流冷凝器的玻璃烧瓶中，并 加入63g的干燥的甲苯。在45°C下搅拌至得到澄清溶液。蒸馏掉20mL的甲苯以除水的痕 迹。随后，采用注射器在每例中加入0.738g的二苯基甲烷二异氰酸酯（MDI，2,92mmol)和 溶解在2mL的甲苯中的120yL的1，8-二氮杂双环[5. 4. 0] ^碳_7_烯（DBU)的溶液。 升温至45°C。2小时后，用旋转蒸发仪除去甲苯。然后，在良好的真空条件下于45°C(水 浴）进行干燥直至重量恒定。
[0099] 实施例4:用六甲撑二异氰酸酯对三种不同的泊洛沙姆扩链的泊洛沙姆的制备
[0100]称量11. 6g的泊洛沙姆403(Pluronic"P 123 ;2mmol)、12. 5g的泊洛沙姆 4〇7( Pluronic&F-127 和14. 6g的泊洛沙姆338( Pluronk^'F-108, 1mm)，加入到 连接有回流冷凝器的玻璃烧瓶中，然后采用干燥的甲苯调制到90g。在45°C下用电磁搅拌 棒搅拌至得到澄清溶液。蒸馏掉20mL的甲苯以除去水的痕迹。随后，采用注射器，在每例 中加入0. 665g的六甲撑二异氰酸酯（HMDI，3. 95mmol)和溶解在5mL的甲苯中的120yL的 1，8-二氮杂双环[5. 4. 0]i^一碳-7-烯（DBU)的溶液。升温至55°C。2小时后，用旋转蒸 发仪除去甲苯。然后，在良好的真空条件下于45°C(水浴）进行干燥直至重量恒定。得到 了相当的固体聚合物，在低于l〇°C下其能够很好地溶于水中。
[0101] 即便是10%的所得聚合物的溶液加热至35°c也会固化，并得到透明的凝胶。
[0102] 相对于仅由泊洛沙姆403 (P|uronicRP123)制得的扩链泊洛沙姆来说，实施例4 中由三种不同的泊洛沙姆制得的扩链泊洛沙姆具有在较低浓度下固化且透明的优势。相比 于仅采用泊洛沙姆407 (piuronifF-127)制得的扩链泊洛沙姆来说，需要强调的是，即便 是在37°C下数天后，新材料都不能溶解在培养基上层清液中。
[0103] 实施例5:由扩链泊洛沙姆制备的热可逆水凝胶的性能
[0104] 所述材料在15°C和35°C之间的温度范围内呈现出两种特征性变化。当从4°C开始 加热起，先前透明的液体（溶胶）在15°和25°C之间首先发生浑浊。图la中给出了 10% 的由六甲撑二异氰酸酯扩链的泊洛沙姆403的热可逆水凝胶的表现。
[0105] 在22°和35°C之间，粘度随之以若干个数量级上升。以图lb为例，其分别展示了 由六甲撑二异氰酸酯扩链的泊洛沙姆403 (被称为PMT0001)、由二异氰酸丁酯扩链的泊洛 沙姆403(PMT0002)和由亚甲基二环己基二异氰酸酯扩链的泊洛沙姆403(PMT0003)的10% 的溶液。后者具有较少的重复单元。
[0106] 图lc显示了在30。和35°C之间，相同的热可逆水凝胶PMT0001至PMT0003的贯 入阻力具有相似的具有明显的峰的图案。
[0107] 图Id显示了如所预计的，随着浓度的增加，凝胶（25% )的强度也随之增加。
[0108] 图le显示了在数周内所述凝胶合适地均匀地释放蛋白质。测试显示，由六甲撑二 异氰酸酯扩链的泊洛沙姆403分别在20%和25%的浓度下使用。
[0109] 实施例6:凝胶浓度的影响
[0110] 在无菌条件下，称取预定量的扩链泊洛沙姆（聚合物），并与适量的细胞培养基混 合。两种都在注射器中4°C下储存数天并不断地搅拌。这将引起均匀的溶液的形成，该溶液 在25_30°C时形成胶体。在约15°C下，加入100, 000个永生干细胞每毫升（immortalised stemcellspermillilitre)。米用Neubauer计数器测定细胞数，在离心管（Falcontube) 中将细胞离心为沉淀物，然后加到混合物中。通过采用"存活/死亡-分析法"先按小时， 然后按天，最后在一周后检测不同的聚合物浓度（2. 5%、5%和10% )。在样品的底部和内 部进行微观研宄。本文中，10%的聚合物浓度的细胞存活率稍微低于更低浓度的。另一方 面，凝胶的强度却相对更高。
[0111] 结果见图2和3所示。
[0112] 实施例7 :采用胶原的例子的生物材料的影响
[0113] 为了证明具有生物材料的热可逆水凝胶的高生物活性，进行了一系列的试验，其 中，在10%的根据本发明的水凝胶中存在不同可溶性胶原浓度（0%、10%和20% )下培养 100, 000个永生干细胞每毫升。该培养在37°C下在5%的二氧化碳和95%的空气的潮湿气 氛中进行。7天后（over7days)采用"存活/死亡-分析法"测量生命力。此外，通过共聚 焦激光扫描显微镜检测细胞形态。结果如图4和图5所示。
[0114] 1、按照如上所述的，制备在细胞培养基中的由1，4-二异氰酸丁酯扩链的泊洛沙 姆403聚合物的10%的溶液。将100, 000个eGFP-SCPl细胞分散在lml的该溶液中。采 用Neubauer计数器测定细胞数，在离心管中将细胞离心为沉淀物，然后转移到凝胶中。在 1、2、3和7天后研宄样品。7天后细胞存活率（图4,左手边）是可接受的达到了 45%，但 是细胞表现为圆形并未表明出增加的细胞附着，因为后者只能从膨胀的细胞形态上推断得 到。
[0115] 2、采用如上步骤，不同的是，向溶液（图4,中间）中加入来自鼠尾部的10%的可 溶性胶原（"I型-鼠尾胶原"，Merck)。在该情况下，7天后细胞存活还是可观的，达到约 70%。仅3天后细胞典型的拉长的形态变得明显。
[0116] 3、采用2中的步骤，但是这次向混合物中（图4,右手边）引入20%的胶原。细胞 存活率非常好达到了 80%。细胞展现出更为明显的拉长的形态。
[0117] 图4显示了各自的显微照片，说明了 7天后在本发明的热可逆水凝胶中存在或不 存在胶原I的情况下的eGFP-SCPls的细胞存活率。不存在或存在胶原I的本发明的热可 逆水凝胶之间的显著差异变得明显。采用碘化丙啶染色后的示例性的显微图（l〇x放大） 在底部；比例尺（刻度线）为200ym。
[0118] 图5给出了eGFP-SCPls细胞在7天后在本发明的热可逆水凝胶（即指图中的 BDI-hydrogel)中存在或者不存在20%胶原I的情况下在共聚焦激光扫描显微镜下的显 像。该图在l〇x放大（左边）或63x放大（右边）程度下测得。
[0119] 实施例8 :在应用体系中氧气对细胞存活率的影响
[0120] a)具有不同浓度的释放氧气的物质（Ca02)且没有酶的应用体系。
[0121] 在含有由泊洛沙姆403和二异氰酸丁酯制得的热可逆水凝胶的注射器中培养 hTERT-永生人骨髓间充质干细胞，过氧化钙（Ca02)的浓度为lmg/ml 、0. 5mg/ml、0. 25mg/ml 和0.1mg/ml，以及按小时间隔测量氧气饱和度。采用生命力分析测定细胞存活率。结果如 图6a中所示。
[0122] b)具有不同浓度的释放氧气的物质（Ca02)且具有不同浓度的酶的应用体系
[0123] 重复实施例8a)，不同的是，加入100U/ml或200U/ml或不加入过氧化氢酶（对照 组）作为酶。结果如图6b中所示，可以看出100U/ml或200U/ml的过氧化氢酶浓度在细胞 存活率上具有有益作用。
[0124] c)在恒定的酶浓度下的具有不同浓度的释放氧气的物质的应用体系
[0125] 同实施例8b)，在注射器中在含有0. 5mg/mlCaOjP100U/ml过氧化氢酶的 BDI-hydrogel中或者在含有 0? 25mg/mlCaOjPl100U/ml过氧化氛酶的BDI-hydrogel中培 养72h后测量氧气饱和度（A)和细胞存活率（B)。结果如图6c中所示，可以看出在0. 25mg/ mlCa02浓度和100U/ml过氧化氢酶浓度下的细胞存活率，甚至在72小时后，数据仍然约为 70%，这相比于对照组（表示为〃BDI-hydrogel")来说有所改进。
【主权项】
1. 一种扩链泊洛沙姆P*，所述扩链泊洛沙姆P*由至少一种泊洛沙姆P与二异氰酸酯 反应制备，每种泊洛沙姆包括两个聚氧乙烯段PEG和一个聚氧丙烯段PPG，并且P的聚氧丙 烯段的分子量大于2350Da，其中，泊洛沙姆P的分子量Mw为11000以上，P中的聚氧乙烯的 比例超过了 60%，并且至少两种不同的泊洛沙姆进行反应。2. 根据权利要求1所述的扩链泊洛沙姆P*，其中，两种不同的泊洛沙姆进行反应。3. 根据权利要求1所述的扩链泊洛沙姆P*，其中，三种不同的泊洛沙姆进行反应。4. 根据权利要求1所述的扩链泊洛沙姆P*，其中，所述扩链泊洛沙姆具有下式所示的 结构单元：其中，a和b各自为1-110的整数，且m彡3 ;a表示聚氧乙烯段PEG的重复单元数，b表 示聚氧丙稀段PPG的重复单元数；所述二异氰酸酯由式O = C = N-X-N = C = O表示，并且 X表示所述二异氰酸酯的脂肪族基团或芳香族基团； 以及其中，当采用两种不同的泊洛沙姆P和P'时，所述扩链泊洛沙姆还具有下式所示 的结构单元：其中，a、b、m和X如上所定义的，在第二种泊洛沙姆P'中，分别地，c表示聚氧乙烯段 PEG的重复单元数，d表示聚氧丙烯段PPG的重复单元数，其中，c和d各自为1-110的整数， 且 m' ^ 3。5. 根据权利要求1-3中任意一项所述的扩链泊洛沙姆P*，其中，所述二异氰酸酯选自 由脂肪族二异氰酸酯和芳香族二异氰酸酯所组成的组中。6. 根据权利要求5所述的扩链泊洛沙姆P*，其中，所述二异氰酸酯选自由线性二异氰 酸酯O = C = N-(CH2)n-N = C = 0、二异氰酸丁酯、六甲撑二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸 酯、亚甲基二环己基二异氰酸酯（H12-MDI)、赖氨酸二异氰酸酯（LDI)和二苯基甲烷二异氰 酸酯（MDI)所组成的组中，其中，η为4-12。7. 根据权利要求1-6中任意一项所述的扩链泊洛沙姆Ρ*，其中，所述泊洛沙姆选自泊 洛沙姆272、333、334、335、402、403和407中的一种或多种。8. 根据权利要求1-7中任意一项所述的扩链泊洛沙姆P*，其中，所述扩链泊洛沙姆P* 是在制备聚氨酯用的合适的催化剂的存在下，通过将所述泊洛沙姆和0. 8-1. 2当量的所述 二异氰酸酯在40°C -60°C下反应制得的。9. 热可逆水凝胶，其含有： (a) 根据权利要求1-8中任意一项所述的扩链泊洛沙姆P*，以及 (b) 选自由抗菌的、抗微生物的或抗真菌的活性物质，蛋白质，葡糖胺聚糖，溶菌酶和天 然的或合成的聚氨基酸所组成的组中的生物材料。10. 热可逆水凝胶，其由以下过程制得： (a) 制备根据权利要求1-8中任意一项所述的扩链泊洛沙姆P*，以及 (b) 将所述扩链泊洛沙姆与生物材料混合，所述生物材料选自由抗菌的、抗微生物的 或抗真菌的活性物质，蛋白质，葡糖胺聚糖，溶菌酶和天然的或合成的聚氨基酸所组成的组 中。11. 根据权利要求9或10所述的热可逆水凝胶，其中，P选自根据权利要求7中所述的 泊洛沙姆。12. 根据权利要求10或11所述的热可逆水凝胶，其中，所述热可逆水凝胶还含有活细 胞。13. 根据权利要求12所述的热可逆水凝胶，其中，所述活细胞选自由单核细胞、间充质 干细胞和其祖细胞及由其分化而得的细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、纤维母细胞、上 皮细胞、成肌细胞、肌腱细胞、单核造血干细胞和其祖细胞以及由其分化而得的细胞、免疫 细胞、多核细胞、巨细胞、巨噬细胞和破骨细胞所组成的组中。14. 根据权利要求12所述的热可逆水凝胶，其中，在所述凝胶中，所述细胞是改性的或 转基的。15. 根据权利要求9-14中任意一项所述的热可逆水凝胶，其中，所述生物材料为合成 的聚氨基酸，或者为抗菌的、抗微生物的或抗真菌的活性物质，和/或抑制或刺激细胞生长 和细胞分化的蛋白质；和/或，其中，所述生物材料为选自由纤维蛋白、胶质、胶原和骨形态 发生蛋白（BMP)所组成的组中的蛋白； 和/或，其中， 所述蛋白质为选自由胰岛素样生长因子（IGF)、转移生长因子（TGF)、血小板源生长因 子（PDGF)、表皮生长因子（EGF)、纤维母细胞生长因子（FGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因 子（GMCSF)、血管内皮生长因子（VEGF)、肝细胞生长因子（HGF)、白细胞介素 -IB (IL-IB)、白 细胞介素-8 (IL-8)、神经生长因子（NGF)以及如红细胞生成素和如G-CSF的集落刺激因子 的造血生长因子所组成的组中的生长因子；和/或，其中，所述蛋白质为激素或酶，优选为 卵泡抑素或肌生成抑制素； 和/或， 其中，所述生物材料为红细胞生成素、G-CSF、卵泡抑素或肌生成抑制素；和/或， 其中，所述蛋白质为抗体或选自由IgA、IgD、IgE、IgM、IgG、IgY和IgW所组成的组中的 免疫球蛋白；或者 其中，所述葡糖胺聚糖为透明质酸。16. 根据权利要求14所述的热可逆水凝胶，其中，所述生物材料选自由β -内酰胺抗 生素、四环素、氨基糖苷、大环内酯、抗病毒药、烯丙胺、抗真菌的抗生素、咪唑和它们的衍生 物，表皮生长因子（EGF)、TGF-f3-(转移生长因子β)_超家族：优选BMP(骨形态发生蛋 白）-和GDF(生长分化因子）-家族，更优选BMP2、BMP7和GDF-5,可溶性胶原、细磨胶原、 胶质、人血、动物血、人血或动物血中的成分和胶原I型、II型或III型所组成的组中。17. 根据权利要求9-16中任意一项所述的热可逆水凝胶，其中，所述扩链泊洛沙姆通 过采用线性脂肪族二异氰酸酯或环形芳香族二异氰酸酯制备。18. 根据权利要求9-16中任意一项所述的热可逆水凝胶，其中，所述述水凝胶还含有 示踪剂。19. 根据权利要求9-17中任意一项所述的热可逆水凝胶，其中，所述示踪剂选自放射 性物质，其通过PET或SPECT可视。20. 根据权利要求9-18中任意一项所述的热可逆水凝胶的医学应用。21. 根据权利要求20所述的热可逆水凝胶的医学应用，其中，所述医学应用为药物递 送或生物医学应用。22. 含有根据权利要求9-20中任意一项所述的热可逆水凝胶的应用体系。23. 根据权利要求22所述的应用体系，其中，该体系还含有刺激或抑制细胞/组织生长 或杀死细胞的治疗剂。24. 根据权利要求22或23所述的应用体系，其中，该体系还含有释放氧气的物质或结 合有酶的释放氧气的物质。25. 根据权利要求9-20中任意一项所述的热可逆水凝胶在制备用于治疗身体状况的 药物中的应用，其中，所述药物用于在体内组织上施用所述热可逆水凝胶的水溶液。26. 根据权利要求25所述的应用，其中，所述水溶液含有生物活性材料的溶液或悬浮 液。27. 根据权利要求25所述的应用，其中，所述身体状况为皮肤灼伤或擦伤。28. 根据权利要求25所述的应用，其中，所述身体状况为被外科手术损伤的组织。29. 根据权利要求28所述的应用，其中，所述外科手术为椎体成形术或椎体后凸成形 术。30. 根据权利要求28或29所述的应用，其中，所述外科手术通过套管针的插管进行操 作。31. 根据权利要求25所述的应用，其中，所述热可逆水凝胶在药学上可接受的载体中 给药到组织。32. 根据权利要求25所述的应用，其中，将所述热可逆水凝胶提供于药学上可接受的 载体中以用于胃肠外给药。33. 根据权利要求25所述的应用，其中，将所述热可逆水凝胶定位在生物组织表面；或 者 其中，将所述热可逆水凝胶定位在医疗设备的表面；或者 其中，将所述热可逆水凝胶定位在相对的表面上，由此产生所述表面相互粘附的倾向。34. 根据权利要求33所述的应用，其中，所述生物组织为器官，和/或 其中，所述器官选自皮肤，内脏器官，肌肉骨骼系统的组织，优选骨、软骨，结缔组织，优 选肌腱组织和脂肪组织。35. -种在表面上制备组合物的体外方法，该方法包括在所述表面上施用根据权利要 求9-21所述的热可逆水凝胶的水溶液或它的混合物，或者施用根据权利要求22、23或24 所述的医学应用体系。36. 根据权利要求35所述的体外方法，其中，该方法包括施用根据权利要求13所述的 含有活细胞的热可逆水凝胶的水溶液；和/或 其中，所述热可逆水凝胶是由经二异氰酸丁酯扩链的泊洛沙姆403,和/或释放氧气的 物质CaO2制备。
【专利摘要】根据本发明，提供了热可逆水凝胶，该热可逆水凝胶是由扩链的泊洛沙姆制得，且具有优异的性能。此外，本发明还提供了含有生物材料的热可逆水凝胶，以及制备该热可逆水凝胶的方法，含有活细胞的热可逆水凝胶，用于药物应用的应用体系，以及在表面上制备组合物的体外方法。
【IPC分类】C08L89/06, C08G18/48, C08J3/075, C08G81/00, A61K47/42, C08G18/73, C08L75/08, A61K47/34, C08G65/30, C08G18/76, A61K47/10
【公开号】CN104903373
【申请号】CN201380066266
【发明人】M·世克尔, H·威斯, U·莫尔
【申请人】M·世克尔
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年12月17日
【公告号】CA2895437A1, DE102012223416A1, DE102012223416A8, EP2931775A1, US20150335749, WO2014095915A1
技术领域：
】[0001]本发明涉及扩链泊洛沙姆（chain-extendedpoloxamers)。尤其是，本发明涉及由这样的扩链泊洛沙姆制备的热可逆水凝胶。另外，本发明涉及含有生物材料的热可逆水凝胶和它的制备方法、医药应用的应用体系和体外在表面上制备组合物的方法。【
背景技术：
】[0002]术语"泊洛沙姆"指的是一类聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物（首次记载在US3,740,421中），还以商品名"piur〇nicK"或"Lutrol?"（BASFSE的商标）被公知。它们是由亲水的聚乙二醇外段和疏水的聚丙二醇内段组成的嵌段共聚物，即（聚（氧化乙烯）-聚(氧化丙稀）-聚（氧化乙稀））-三嵌段共聚物（(poly(ethyleneoxide)_poly(propyleneoxide)-poly(ethyleneoxide)-tri-blockcopolymers)，其可粗略地由以下结构所概括：[00031[0004]这些嵌段共聚物通过相分离在水中形成溶胶或凝胶。聚乙二醇段溶入水中，而聚丙二醇段则彼此相连。该过程就是所谓的胶束形成。所述胶束在较低温度下呈现相对混乱的状态（溶胶状态），当温度升高时会带来这些胶束的有序排列，这导致了液体的凝固（凝胶状态）（参见AlexandridisP.，HolzwarthJ.F.，HattonT.A.MicellizationofPoly(ethyleneoxide)-Poly(propyleneoxide)-Poly(ethyleneoxide)TriblockCopolymersinAqueousSolutions:ThermodynamicsofCopolymerAssociation(聚（氧化乙烯）_聚（氧化丙烯）_聚（氧化乙烯）三前段共聚物在水溶液中的胶束化：共聚交联的热动力学）.Macromolecules.1994;27(9):2414-25)。因此这样的凝胶也称为热可逆水凝月又（thermoreversiblehydrogels)〇[0005]基于泊洛沙姆的水凝胶已被知晓很长一段时间了（(Cf.J.，SwaffordW.B.:Pluronicsasasuppositorybase(普朗尼克作为检剂基质）.Am.J.Pharm.Sci.Support.PublicHealth.1960;132:301_303)。此外，还记载了泊洛沙姆407(Pluronic'1F127)和六甲撑二异氰酸醋（hexamethylenediisocyanate，HMDI)的扩链聚合物（cf.JiangJ.,MalalR.,LiC.,LinM.Y.,ColbyR.H.,GersappeD.,RafailovichM.H.,SokolovJ.C.,CohnD.:RheologyofThermoreversibleHydrogelsfromMultiblockAssociatingCopolymers(多嵌段交联共聚物的热可逆水凝胶的流变学）.Macromolecules2008;41:3646-3652)〇[0006]由于泊洛沙姆是生物学上惰性的，因此它们很快被用作了药物的栓剂，并且伴随着再生医学的出现，它们还可作为细胞载体（cf.KamilS.H.，EaveyR.D.，VacantiM.P.,VacantiC.A.,HartnickC.:Tissue-engineeredcartilageasagraftsourceforlaryngotrachealreconstruction-Apigmodel(组织工程软骨作为喉气管重建的移植源-猪模型）?Arch.Otolaryngol.2004;130(9):1048-1051)。[0007]这些水凝胶的特性在于所描述的温敏行为（thermo-sensitivebehaviour)。因此结合细胞（incorporatedcells)的微创（minimally-invasive)应用是可能的。后者可以轻易地变成液态。移植后，由于温度发生变化而形成凝胶，使得细胞可以保留在预定位置（cf.CohnD.，LandoG.，SosnikA.，GartyS.，LeviA.:PE〇-PP〇-PE〇-basedpoly(etheresterurethane)sasdegradablereversethermo-responsivemulti-blockcopolymers(基于PE0-PP0-PE0的聚（醚醋尿烧）作为可降解的热可逆多嵌段共聚物）?Biomaterials2006;27(9):1718-1727;NguyenM.K.,LeeD.S.Injectablebiodegradablehydrogels.Macromol.Biosci.2010；10(6):563-579)〇[0008]使用热可逆水凝胶在例如烧伤治疗中是有益的。水凝胶可允许经皮的或局部的活性物质给药并且可在皮肤表面保持较高的湿度，这防止了脱水。并且，水凝胶可相当大程度地附着到受损组织，且具有一定的弹性，因此可避免水凝胶分离以及同时吸收伤口产生的分泌物。通常，水凝胶可促进愈合，因为它们可迅速地在伤口位点变成凝胶状态并在伤口处保持潮湿。[0009]然而大多数的具有低聚合物浓度的泊洛沙姆仅能形成具有较差的机械性能的凝胶，而扩链泊洛沙姆则可获得更为稳定的凝胶。最初的扩链尝试是采用丙烯酸酯（acrylicacidesters)(丙稀酸醋（acrylates))进行的，这使得具有C=C双键的基团与泊洛沙姆相连。此后，进行化学加成反应以使得多个泊洛沙姆基团可以被连接。丙烯酸的衍生物在生理学上是无害的。如果采用二异氰酸酯进行扩链，单个泊洛沙姆通过尿烷基团（urethanemoieties)相连。聚氨醋（Polyurethanes)由于它们的组织相容性已在很长一段时间里用作医用植入体（medicalimplants)。至今存在的缺陷是该材料不能被细胞生物识别，因此直到现在细胞也不能附着该材料。[0010]因此，本发明的目的在于提供基于泊洛沙姆的扩链水凝胶，其既不具有现有技术中已知的缺陷，又适合于医学应用。本发明的另一个目的是提供能够释放生物活性试剂或活性物质的热可逆水凝胶。此外，本发明的目的在于提供含有生物材料和活细胞的热可逆水凝胶，其中，细胞粘附在生物材料上，以及它们的治疗应用。【
发明内容】[0011]上述目的可通过提供根据权利要求1-8的扩链泊洛沙姆、根据权利要求9-21的热可逆水凝胶、根据权利要求22-24的应用体系、根据权利要求25-34的热可逆水凝胶的医学应用和根据权利要求35-36的体外方法而实现。【附图说明】[0012]图la-le展示了测定的由泊洛沙姆制得的热可逆水凝胶的物理性质，该泊洛沙姆通过采用二异氰酸酯进行扩链，其中，泊洛沙姆403或PluronicP123(PMT001)通过采用六甲撑二异氰酸酯进行扩链、泊洛沙姆403(PMT002;BDI-hydr〇gel)通过采用二异氰酸丁酯进行扩链，泊洛沙姆403(PMT003)进通过采用亚甲基二环己基二异氰酸酯（methylenebiscyclohexyldiisocyanate)进行扩链。这些测定作为部分的合作计划在慕尼黑的路德维希马克西米利安大学（LudwigMaximilianUniversity)的药物研宄中心的Dr.W.Friess教授的实验室中完成。[0013]图la中给出了本文中相对浊度对聚合物浓度（wt.%)的绘图，图lb中给出了平均保质期模块对温度的绘图，图lc中给出了平均贯入阻力（meanpenetrationresistance)对温度的绘图，图Id中给出了凝胶强度对温度的绘图，以及图le给出了作为生物材料的蛋白质的平均释放比例对时间的绘图。[0014]图2a和2b示出了说明由经二异氰酸丁酯扩链的泊洛沙姆403组成的热可逆水凝胶（以下称作BDI-hydrogel)在不同聚合物浓度下（2,4%、5%和10%)的细胞存活率。在本文中不同的聚合物浓度，通过采用"存活/死亡-分析法（Live/Dead-Assay)"先按小时测量（在图la中的"Oh"-"5h"列），然后按天测量（在图2b中的"ld"、"2d"和"3d"列），以及最后在一周后测量（在图2b中的"7d"列）。[0015]图3展示了在本发明的热可逆BDI-hydrogel中存在10%、20%或者不存在胶原的情况下，每种情况在1、2、3和7天后的细胞形态。比例尺为200ym;所有图片是在同样的放大程度下获得的。[0016]图4展示的显微照片说明了7天后在本发明的热可逆BDI-hydrogel中存在或不存在胶原I的情况下的eGFP-SCPls的细胞存活率（MW±SD，r=3,n=3)。采用邓氏多项比较试验（multiplecomparisontestbyDunn)的Kruskal-Wallis-统计学提供了不存在胶原I(A)或存在胶原I(B和C)的本发明的热可逆凝胶之间的显著性差异。本文中，a=0.05,*p〈0.05,且林p〈0.01。采用碘化丙啶（PI)染色后的示例性的显微图（底部，10x放大）；比例尺为200ym。[0017]图5给出了eGFP-SCPls细胞在本发明的热可逆BDI-hydrogel中存在或者不存在20%胶原I的情况下7天后在共聚焦激光扫描显微镜下的显像。该图在10x放大（比例尺为200ym;图A)或63x放大（比例尺为500ym;图B)程度下测得。[0018]图6a给出了在存在0&02的BDI-hydrogel中在注射器中培养24h后的氧气饱和度(A)和细胞存活率（B)，"对照组"为不存在0&02的BDI-hydrogel(MW±SD，r=3,n=1)。[0019]图6b给出了在存在0.25mg/mL的Ca02和多种过氧化氢酶浓度的BDI-hydrogel中在注射器中培养24h后的氧气饱和度（A)和细胞存活率（B)(MW±SD，r=3,n=1)。[0020]图6c给出了在存在0.5mg/mL的CaOjPl100U/mL过氧化氢酶的BDI-hydrogel中或当前第1页1 2 3 4 5 者在存在〇. 25mg/mL的CaOjP100U/mL过氧化氢酶的BDI-hydrogel中在注射器中培养 72h后的氧气饱和度（A)和细胞存活率⑶（MW±SD，r= 3,n= 1)。
【具体实施方式】
[0021] 本发明提供了利用二异氰酸酯由泊洛沙姆制得的扩链泊洛沙姆。这些扩链泊洛沙 姆可转变为热可逆水凝胶，其可以在医学领域的多种方面应用。
[0022] 适用于本发明的，且可以在后续阶段转变为水凝胶的泊洛沙姆通常为分子量超 过4000Da的泊洛沙姆P。更优选地，聚丙烯段的分子量超过2350Da。在一种优选的实施 方式中，上述泊洛沙姆中，或者分别在上述那些泊洛沙姆中，聚氧乙烯基团（polyethylene oxidemoieties)的比例为20% -80%，更优选为20% -70%，特别优选为20% -60%。扩 链泊洛沙姆P*由至少一种泊洛沙姆P与二异氰酸酯反应制得，并且其包括两个聚氧乙烯 (polyoxyethylene)段PEG和一个聚氧丙稀（polyoxypropylene)段PPG，其中，P的聚氧丙 烯段的分子量大于2350Da，该扩链泊洛沙姆P*特别适用于本发明。如果存在多于一种泊洛 沙姆，例如两种不同的泊洛沙姆P和P'，每种泊洛沙姆都要满足上述要求。
[0023] 尤其是，为了获得根据本发明的扩链泊洛沙姆，在上面所指的情况中，泊洛沙姆P 的分子量至少为11，〇〇〇Da，且P的聚氧乙烯的比例超过60%，还采用了不同于前述的泊洛 沙姆的另一种泊洛沙姆。泊洛沙姆407(P|ur〇niCKF127)是分子量至少为ll，000Da且聚 氧乙烯的含量超过60%的泊洛沙姆的一个实例。因此，在本发明中，在采用泊洛沙姆407的 情况下，优选联合使用不同于泊洛沙姆407的至少一种泊洛沙姆。
[0024] 在另一种实施方式中，对于上述泊洛沙姆P的分子量至少为11，000Da且P中聚氧 乙稀的含量超过60%来说，所述二异氰酸酯选自由式0 =C=N-(CH2)n-N=C= 0表示的 二异氰酸醋，其中n= 4、5或者n>6,异佛尔酮二异氰酸醋（isophoronediisocyanate)、亚 甲基二（4, 4'-异氛酸）环己烧（methylenedi(4,4,-isocyanato)cyclohexane，H12_MDI)、 赖氨酸二异氰酸醋（lysinediisocyanate)和芳香二异氰酸醋，优选为二苯基甲烧二异氰 酸醋（diphenylmethanediisocyanate，MDI)所组成的组中。在一种优选的实施方式中，如 果采用泊洛沙姆407,后者是扩链的、并结合有选自前述的其他泊洛沙姆和二异氰酸酯（如 果必要的话）。
[0025] 优选地，至少一种泊洛沙姆P的至少三个重复单元进行反应。
[0026] 所述泊洛沙姆基团与二异氰酸酯反应以扩链。当本发明采用芳香二异氰酸酯时， 通常它们是本领域优选的由于它们的高反应性，存在的缺点是它们会降解成致癌的二胺 类。相反地，相应的脂肪二异氰酸酯的降解将得到例如二胺，如腐胺（putrescine)或尸胺 (cadaverine)，这在体内新陈代谢的发生程度较低。此外，脂肪类化合物还耐受于其他降解 反应，这也是为什么它们可用于需要避免发黄或类似的技术应用中。因此，本发明优选采用 脂肪的，尤其是线性的二异氰酸酯。
[0027] 可商购的泊洛沙姆（丨)丨111-011丨(：'1<或1^批0丨〔1<)在于氧化乙烯（ethyleneoxide)或 聚乙二醇-(PEG)基团a和聚氧丙烯或（PPG)-基团b的的比例，以及嵌段的长度上是不同 的。这导致了在水中的不同表现。
[0028] 如果上述的泊洛沙姆与二异氰酸酯反应，则本发明的扩链泊洛沙姆P*含有以下 结构单元，特别是当它以单一的泊洛沙姆为起始原料时：
[0029]
[0030] 其中，a和b各自为1-110的整数，且m彡3 ;a表示聚氧乙烯段PEG的重复单元数， b表示聚氧丙稀段PPG的重复单元数；由式0 =C=N-X-N=C= 0表示的二异氰酸酯制 备，其中X为所述二异氰酸酯的脂肪族基团或芳香族基团。如果采用两种不同的泊洛沙姆 (P和p'）作为起始原料，所述扩链泊洛沙姆P*同样具有下式表示的结构单元：
[0031] 式
[0032] l
->rn,
[0033] 和/或式
[0034]
[0035] 其中，a、b、m和X如上所定义的，而在第二种泊洛沙姆P'中，分别地，c表示聚氧 乙烯段PEG的重复单元数，d表示聚氧丙烯段PPG的重复单元数，c和d各自为1-110的整 数，m'彡3〇
[0036] 在一种优选的实施方式中，扩链泊洛沙姆P选自泊洛沙姆272、278、331、333、334、 335、338、401、402、403和407(商品牌号：？|11丨*〇丨1丨(^或1」.财〇丨_:1!1^92、？98、1101、？103、 P104、P105、F108、L121、L122、P123和F127)中的一种或多种。所述泊洛沙姆407优 选与一种或多种其他的泊洛沙姆联合使用。在另一种优选的实施方式中，所述泊洛沙姆407 结合其他的泊洛沙姆一起，或者甚至单独与由〇 =C=N-(CH2)n-N=C= 0表示的线性的 二异氰酸酯进行反应，其中n= 4、5或者n>6,或者与脂肪二异氰酸酯进行反应，如异佛尔 酮二异氰酸醋、亚甲基二（4, 4'-异氰酸）环己烧（H12-MDI)或赖氨酸二异氰酸醋（lysine diisocyanate)，或者芳香二异氰酸醋，优选为二苯基甲烧二异氰酸醋（MDI)。
[0037] 本发明的泊洛沙姆通常可以为液体、膏体或固体形式。例如，在常规条件下，泊洛 沙姆272、331、401和402 (或者标记为"L"的Pluronic型）为液体，泊洛沙姆333、334、335 和403 (或者标记为"P"的Pluronic型）为膏体，以及泊洛沙姆278、668和407 (或者标记 为"F"的Pluronic型）为固体。
[0038] 本发明特别优选为基于泊洛沙姆403、407和338的热可逆水凝胶。
[0039] 至今，医疗和药物目的的水凝胶中主要采用泊洛沙姆407或"Pluronic^F 127〃（根据上述通式，其中a= 100，b= 65;即[PEG]65[PPG]1QQ[PEG]65)。
[0040] 根据本发明，还可能将多种泊洛沙姆P结合来制备扩链泊洛沙姆P*。在该情况下， 扩链泊洛沙姆P*由两种或三种不同的泊洛沙姆组成。
[0041] 根据本发明，所述扩链泊洛沙姆P*可以进行反应得到热可逆水凝胶。本发明的热 可逆水凝胶优选为这样的热可逆水凝胶：
[0042] (a)含有上述扩链泊洛沙姆P*以及
[0043] (b)含有选自由抗菌的、抗微生物的（antimicrobial)或抗真菌的（antifungal) 活性物质，蛋白质，葡糖胺聚糖（glucosaminoglycans)，溶菌酶（lysozyme)和聚氨基酸所 组成的组中的生物材料。
[0044] 本发明的热可逆水凝胶可由以下过程制得：
[0045] (a)制备上述扩链泊洛沙姆P*，以及
[0046] (b)将所述扩链泊洛沙姆与生物材料混合，所述生物材料选自由抗菌的、抗微生物 的或抗真菌的活性物质，蛋白质，葡糖胺聚糖，溶菌酶和聚氨基酸所组成的组中。
[0047] 作为优选的二异氰酸酯的芳香族的和脂肪族的，尤其是线性的二异氰酸酯已证实 特别利于作为扩链剂（chainextenders)。
[0048] 如上所述，材料不能被细胞生物识别是现有技术中存在的缺陷，因为所述细胞至 今都不能附着该材料。更特别地，本发明基于的这样典型的想法，即将基于扩链泊洛沙姆上 的水凝胶与作为生物材料的胶原反应，从而发现，由此意外地制得了具有优良性质的热可 逆水凝胶。根据一种优选的实施方式，例如细磨的（finelyground)或可溶性胶原可用作 生物材料。实验室试验显示具有一定耐受范围的细胞展示出膨胀的细胞形态，表明附着于 胶原上。
[0049] 根据本发明，还发现，例如，甚至由低浓度的相对疏水的泊洛沙姆403 (P|uronicK F123)可以制得具有合适物理性质的通用的热可逆水凝胶，特别是，当如上所述的，它们 是被线性的或脂肪族的二异氰酸酯扩链的。已证明这些水凝胶特别适于用作细胞和高分 子量蛋白质的应用体系（applicationsystem)。与基于公知的扩链泊洛沙姆的水凝胶 相比，根据本发明的水凝胶呈现出非常显著改善的性能。因此，相比于仅仅基于泊洛沙姆 407 (P|uronicKiF127)，基于泊洛沙姆403的所述热可逆水凝胶的独特优势在于它们在体 内更为稳定。
[0050] 为了获得整合细胞（integratedcells)的更长的细胞存活率和生物功能性，根据 本发明，所述水凝胶被生物材料所改性。为此，细胞可以获得通过整合素结合的方法附着的 附着点。这样的附着是细胞活性的先决条件（cf.PopovC.，RadieT.，HaastersF.，Prall ff.C. ,AszodiA. ,GullbergD.等：lntegrinsalpha2betalandalphallbetalregulate thesurvivalofmesenchymalstemcellsoncollagenI(整合素a2 0 1 和a11 0 1 调 节胶原I上的间充质干细胞的存活）.CellDeathDis. 2011 ;2:el86)。
[0051] 根据本发明，合适的生物材料选自由抗菌的、抗微生物的或抗真菌的活性物质， 蛋白质，葡糖胺聚糖，溶菌酶和聚氨基酸所组成的组中。所述抗菌的、抗微生物的或抗 真菌的活性物质优选选自由0 -内酰胺抗生素类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类、 抗病毒药类（antivirals)、稀丙胺类（allylamines)、抗真菌的抗生素类（antimycotic antibiotics)、咪挫类和它们的衍生物所组成的组中。所述聚氨基酸优选选自天然的和合 成的聚氨基酸。
[0052] 在一种优选的实施方式中，所述生物材料选自蛋白质类。
[0053] 根据本发明，所述蛋白质优选选自由抑制或刺激细胞生长和细胞分化的蛋白质 所组成的组中；或选自由纤维蛋白、胶质（gelatine)、胶原（collagens)和骨形态发生 蛋白（bone-morphogeneti cproteins，BMP)所组成的组中。所述蛋白质可以更进一步 为生长因子，并且优选选自由胰岛素样生长因子（IGF)、转移生长因子（transforming growthfactor，TGF)、血小板源生长因子（platelet-derivedgrowthfactor，roGF)、 表皮生长因子（EGF)、纤维母细胞生长因子（FGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，GMCSF)、if[I胃内 因f (VEGF)、肝细胞生长因子（HGF)、白细胞介素-IB(IL-IB)、白细胞介素-8 (IL-8)、神经生长 因子（NGF)和如红细胞生成素和集落刺激因子（colony-stimulatingfactors)(如G-CSF) 的造血生长因子所组成的组中。
[0054] 在一种优选的实施方式中，所述生物材料选自0-内酰胺抗生素类、四环素类、 氨基糖苷类、大环内酯类、抗病毒药类、烯丙胺类、抗真菌的抗生素类、咪唑类和它们的衍 生物，表皮生长因子（EGF)、TGF-0-(转移生长因子0)-超家族（TGF-0-(transforming growthfactorbeta)_superfamily)，优选BMP(骨形态发生蛋白，bonemorphogenetic protein)-和GDF(生长分化因子，growthdifferentiationfactor)-家族，更优选BMP2、 BMP7 和⑶F-5〇
[0055] 在一种优选的实施方式中，所述生物材料由可溶性胶原、细磨胶原、胶质、人血、动 物血、人血或动物血中的成分组成。
[0056] 在一种优选的实施方式中，所述生物材料由胶原I、II或III型组成。
[0057] 在一种优选的实施方式中，所述生物材料或蛋白质为激素或酶，更优选为卵泡抑 素（follistatin)或肌生成抑制素（myostatin)。
[0058] 所述蛋白质还可以为免疫球蛋白或抗体，优选选自由IgA、IgD、IgE、IgM、IgG、IgY 和IgW所组成的组中。
[0059] 此外，如果所述生物材料为葡糖胺聚糖，可以采用透明质酸（hyaluronan或 hyaluronicacid)〇
[0060] 本发明的热可逆水凝胶还可以含有活细胞。
[0061] 前述细胞优选选自由单核细胞，特别是间充质干细胞和其祖细胞（progenitor cells)和由其分化而得的细胞，例如成骨细胞（osteoblasts)、脂肪细胞、软骨细胞、纤维 母细胞、上皮细胞、成肌细胞（myoblasts)、肌腱细胞（tendocytes)，或者单核造血干细 胞和其祖细胞以及由其分化而得的细胞，例如免疫细胞，或者多核细胞如巨细胞、巨细胞 (giantcells)和破骨细胞（osteoclasts)所组成的组中。
[0062] 在进一步优选的实施方式中，在所述凝胶中，所述细胞是改性的或转基因的。
[0063] 在一种优选的实施方式中，所述热可逆水凝胶还可以含有示踪剂。在本文中，由放 射性物质制得的示踪剂优选经PET或SPECT可视。这样的示踪剂的实例为如氚、14C、18F、32P、 35S、mIn和1231的放射性同位素。
[0064] 出人意料地，目前发现在本发明的热可逆水凝胶中，由于与生物材料连接，
[0065] -整合细胞表现出膨胀的细胞形态，由此表明结合生物材料（如胶原）的整合素的 形成，并且同时
[0066] -所述热可逆水凝胶的良好的机械性能几乎没有改变。
[0067] 本发明的热可逆水凝胶可以在医学领域具有较宽的应用。因此，本发明提供了热 可逆水凝胶的医学应用，所述医学应用为给药递送或生物医学应用。
[0068] 在一种优选的实施方式中，本发明提供了一种应用体系，其含有上述热可逆水凝 胶。在该实施方式中，前述应用体系优选还含有刺激或抑制细胞/组织生长或杀死细胞的 治疗剂。
[0069] 通过采用本发明的热可逆水凝胶可引入多种治疗剂。治疗剂的实例包括上面描 述的用于生物材料的试剂，以及通常合成的无机和有机化合物、蛋白质和肽类、多糖和其他 糖、脂质、神经节苷脂（gangliosides)和具有治疗、预防或诊断活性的核酸序列。核酸序列 包括基因、通过结合到互补DNA而抑制转录的反义分子，和核糖酶。引入的治疗剂可以具有 多种生物活性，例如血管活性试剂、神经活性试剂、激素、抗凝剂、免疫调节剂、细胞毒性试 剂、抗生素、抗病毒试剂、反义试剂（antisenseagents)、抗原和抗体。包括抗体或抗原、模 拟抗体（anticalins)的蛋白质或类似的能够结合抗原的人工蛋白质同样可以被引入。将 蛋白质定义为由1〇〇个以上的氨基酸残基组成；肽类为少于1〇〇个氨基酸残基。除非其他的 说明，术语"蛋白质"既指蛋白质又指肽类。实例包括胰岛素、甲状旁激素（parathormone)、 甲状旁腺激素片段、鸢尾素、肌生成抑制素、卵泡抑素和其他激素。
[0070] 具体的治疗剂包括抗生素、抗病毒试剂、留体和非留体抗炎药，抗肿瘤药，镇痉剂， 包括通道阻滞剂（channelblockers)，包括细胞生长抑制剂和抗粘附分子的胞内/胞外 基质作用调节剂，酶和酶抑制剂，抗凝血剂和/或抗凝血酶试剂，生长因子，DNA，RNA，DNA、 RNA或蛋白合成的抑制剂，调节细胞增殖和/或生长的化合物，血管舒张剂（vasodilation agents)和其他的常用于治疗组织损伤的药用物质。这些化合物的实例包括血管紧张素 转换酶抑制剂、前列环素、肝素、水杨酸盐类（salicylates)、硝酸盐类（nitrates)、钙通道 阻滞剂、链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂（tissueplasminogenactivator，TPA) 和茴香酰纤溶酶原激活剂（anisoylatedplasminogenactivator，TPA)和茴香酰化纤 溶酶原 _ 链激酶激活剂复合物（anisoylatedplasminogen-streptokinase-activator complex，APSAC)，秋水仙素和烷基化试剂以及适配子（aptamers)。胞间作用的调节剂的具 体实例包括白介素、血小板源生长因子、酸性的和碱性的纤维母细胞生长因子（FGF)、转移 生长因子0 (TGF0)、表皮生长因子（EGF)、胰岛素样生长因子和它们的抗体。核酸的具体 实例包括编码蛋白质的基因和cDNAs、表达载体、反义子和其他寡核苷酸，例如用于调节或 阻止基因表达的核糖酶。其他生物活性试剂的具体实例包括胞外基质或其受体的改性组分 和脂质和胆固醇隔离剂（sequestrationagents)。
[0071] 作为治疗剂的蛋白质的实例还包括细胞因子（cyctokines)，如干扰素和白介素， 蛋白质和集落刺激因子。作为治疗剂的糖类包括唾液酸化路易斯x(SialylLewisx)，对于 该糖已经显示出其可选择性地结合受体又可抑制炎症。可以采用"可递送的生长因子等价 物"(deliverablegrowthfactorequivalent，缩写为DGFE)，一种用于细胞或组织的生长 因子，其可以大范围的被构建，以包括生长因子、细胞因子、干扰素、白介素、蛋白质、集落刺 激因子、赤霉素（gibberellins)、生长素和维生素；还包括肽片段或上述的其他活性片段； 还包括载体（vectors)，即，无论是通过转化还是瞬时表达，能够在靶细胞内合成这种因子 的核酸构建体；以及还包括刺激或抑制组织中合成这种因子的效应子（effectors)，该情 况下，这些效应子包括自然信号分子、反义子和三重螺旋的核酸（triplehelicalnucleic acids)和类似物。DGFEs的实例为血管内皮生长因子（VEGF)、内皮细胞生长因子（ECGF)、 碱性的纤维母细胞生长因子（bFGF)、骨生长蛋白（BMP)和血小板源生长因子（PDGF)以及编 码它们的DNAs。结块溶解剂（clot-dissolvingagents)的实例为组织纤溶酶原激活剂、链 激酶、尿激酶和肝素。
[0072] 还可以提供具有抗氧化活性的药物（即消灭活性氧或阻止它的形成）在本发明的 热可逆水凝胶用作治疗剂，例如其有利于阻止附着。实例包括超氧化物歧化酶或其他蛋白 药物，包括过氧化氢酶、过氧化物酶和常规的氧化酶或如细胞色素P450、谷胱甘肽过氧化物 酶和其他天然或变性血蛋白的氧化酶。
[0073] 哺乳动物应激蛋白或如热休克蛋白70 (hsp70)和hsp90的热休克蛋白或者如黄铜 类的抑制或降低应激蛋白或热休克蛋白表达的刺激物，也可以提供在所述水凝胶中用作治 疗剂。
[0074] 在进一步优选的实施方式中，基于本发明的热可逆水凝胶的前述的应用体系还包 括释放氧气的物质（oxygen-releasingsubstance)。本文中，所述释放氧气的物质优选与 酶结合存在。这样的酶的实例包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶以及常规的氧 化酶或如细胞色素P450、谷胱甘肽过氧化物酶和其他天然的或变性的血蛋白的氧化酶。
[0075] 含有释放氧气的物质的本发明的应用体系在以下实施例8中有所描述。
[0076] 向凝胶中加入释放氧气的物质的目的在于在较大程度上阻止因缺氧导致的细胞 死亡，直到可供给细胞的新生血管形成。通过扩散运行的方式进行供给最多穿过几毫米。 如果仅将过氧化物和细胞加入到根据本发明的热可逆水凝胶中，细胞会由于产生的过氧化 氢产生的作用而死亡。然而，如果加入如过氧化氢酶的过氧化物降解酶，可以可阻止细胞死 亡。
[0077] 本发明的还提供了上述热可逆水凝胶在制备用于治疗身体状况（medical condition)的药物的应用，所述药物用于在体内组织上施用所述热可逆水凝胶的水溶液。
[0078] 在一种优选的实施方式中，前述水溶液含有生物活性材料的溶液或悬浮液。
[0079] 在一种优选的实施方式中，前述身体状况为皮肤灼伤或擦伤。
[0080] 在另一种优选的实施方式中，前述身体状况为被外科手术损伤的组织。在一种 优选的实施方式中，前述外科手术为椎体成形术（vertebroplasty)或椎体后凸成形术 (kyphoplasty) 〇
[0081] 本发明的热可逆水凝胶的应用还可以通过使用公知技术而实现（effected)，例如 腹腔镜检查（laparoscopy)和内窥镜检查（endoscopy)。也可以采用公知的导管 系统，例如 US专利5, 328, 471或5, 213, 580中所描述的。
[0082] 在一种优选的实施方式中，前述医学应用的特征在于所述外科手术是通过套管针 的插管（cannulaofatrocar)进行操作的。
[0083] 在一种优选的实施方式中，对于前述医学应用来说，所述热可逆水凝胶在药学上 可接受的载体中给药到组织。生理盐水或磷酸盐缓冲盐水是这样的载体的实例。
[0084] 在一种优选的实施方式中，对于前述医学应用来说，将所述热可逆水凝胶提供于 药学上可接受的载体中以用于胃肠外给药。
[0085] 在一种优选的实施方式中，对于前述医学应用来说，将所述热可逆水凝胶定位在 生物组织表面上；或者用于医疗设备的表面上。此外，可将所述热可逆水凝胶定位在相对的 表面之间，从而产生所述表面相互粘附的趋势。
[0086] 在一种优选的实施方式中，对于前述医学应用来说，所述生物组织为器官。在前述 的实施方式中，对于前述医学应用来说，所述器官优选选自皮肤，内脏器官，优选骨、软骨、 结缔组织（优选肌腱和脂肪组织）的肌肉骨骼系统的组织。
[0087] 最后，本发明提供一种在表面上制备组合物的体外方法，该方法包括在所述表面 上施用上述热可逆水凝胶的水溶液或它的混合物，或者前述医学应用体系。
[0088] 优选地，所述体外方法包括施用上述含有活细胞的热可逆水凝胶的水溶液。
[0089] 更优选地，所述体外方法通过采用前述应用体系进行操作，尤其是含有活细胞和 释放氧气的物质以及酶的应用体系。在本文中，优选将过氧化钙用作所述释放氧气的物质。 例如过氧化氢酶优选作为所述酶。
[0090] 在上述体外方法的一种特别优选的实施方式中，本发明的所述热可逆水凝胶由泊 洛沙姆403( PluronV P 123)制得。
[0091] 以下实施例将说明根据本发明的扩链泊洛沙姆或由其获得的热可逆水凝胶的制 备和性能。
[0092] 实施例
[0093] 实施例1:用六甲撑二异氰酸酯扩链的泊洛沙姆的制备
[0094] 在连接有回流冷凝器的玻璃烧瓶中，采用干燥的甲苯将17.4g的泊洛沙姆 4〇3(Plur〇nicK'P123 ;3mmol)调制到80g。在45°C下用电磁搅拌棒搅拌至得到澄清溶 液。蒸馏掉20mL的甲苯以除去水的痕迹。随后，采用注射器在每例中（ineachcase)加 入0. 49g的六甲撑二异氰酸酯（HDI，2, 92mmol)和溶解在2mL的甲苯中的120yL的1，8-二 氮杂双环[5.4.0]i^一碳-7-烯（DBU)的溶液。升温至55°C。2小时后，用旋转蒸发仪除 去甲苯。然后，在良好的真空条件下于45°C(水浴）进行干燥直至重量恒定。
[0095] 实施例2 :用二异氰酸丁酯扩链的泊洛沙姆的制备
[0096] 在连接有回流冷凝器的玻璃烧瓶中，采用干燥的甲苯将17.4g的泊洛沙姆 403(3mmol)调制到80g。在45°C下用电磁搅拌棒搅拌至得到澄清溶液。蒸馏掉20mL的甲苯 以除去水的痕迹。随后，采用注射器在每例中加入〇.373g的二异氰酸丁酯（BDI，2,92mmol) 和溶解在2mL的甲苯中的120yL的1，8-二氮杂双环[5.4. 0] ^碳_7_烯（DBU)的溶液。 升温至55°C。2小时后，用旋转蒸发仪除去甲苯。然后，在良好的真空条件下于45°C(水 浴）进行干燥直至重量恒定。
[0097] 实施例3:用二苯基甲烷二异氰酸酯扩链的泊洛沙姆的制备
[0098]称量17.4g的泊洛沙姆403 (3mmol)，加入到连接有回流冷凝器的玻璃烧瓶中，并 加入63g的干燥的甲苯。在45°C下搅拌至得到澄清溶液。蒸馏掉20mL的甲苯以除水的痕 迹。随后，采用注射器在每例中加入0.738g的二苯基甲烷二异氰酸酯（MDI，2,92mmol)和 溶解在2mL的甲苯中的120yL的1，8-二氮杂双环[5. 4. 0] ^碳_7_烯（DBU)的溶液。 升温至45°C。2小时后，用旋转蒸发仪除去甲苯。然后，在良好的真空条件下于45°C(水 浴）进行干燥直至重量恒定。
[0099] 实施例4:用六甲撑二异氰酸酯对三种不同的泊洛沙姆扩链的泊洛沙姆的制备
[0100]称量11. 6g的泊洛沙姆403(Pluronic"P 123 ;2mmol)、12. 5g的泊洛沙姆 4〇7( Pluronic&F-127 和14. 6g的泊洛沙姆338( Pluronk^'F-108, 1mm)，加入到 连接有回流冷凝器的玻璃烧瓶中，然后采用干燥的甲苯调制到90g。在45°C下用电磁搅拌 棒搅拌至得到澄清溶液。蒸馏掉20mL的甲苯以除去水的痕迹。随后，采用注射器，在每例 中加入0. 665g的六甲撑二异氰酸酯（HMDI，3. 95mmol)和溶解在5mL的甲苯中的120yL的 1，8-二氮杂双环[5. 4. 0]i^一碳-7-烯（DBU)的溶液。升温至55°C。2小时后，用旋转蒸 发仪除去甲苯。然后，在良好的真空条件下于45°C(水浴）进行干燥直至重量恒定。得到 了相当的固体聚合物，在低于l〇°C下其能够很好地溶于水中。
[0101] 即便是10%的所得聚合物的溶液加热至35°c也会固化，并得到透明的凝胶。
[0102] 相对于仅由泊洛沙姆403 (P|uronicRP123)制得的扩链泊洛沙姆来说，实施例4 中由三种不同的泊洛沙姆制得的扩链泊洛沙姆具有在较低浓度下固化且透明的优势。相比 于仅采用泊洛沙姆407 (piuronifF-127)制得的扩链泊洛沙姆来说，需要强调的是，即便 是在37°C下数天后，新材料都不能溶解在培养基上层清液中。
[0103] 实施例5:由扩链泊洛沙姆制备的热可逆水凝胶的性能
[0104] 所述材料在15°C和35°C之间的温度范围内呈现出两种特征性变化。当从4°C开始 加热起，先前透明的液体（溶胶）在15°和25°C之间首先发生浑浊。图la中给出了 10% 的由六甲撑二异氰酸酯扩链的泊洛沙姆403的热可逆水凝胶的表现。
[0105] 在22°和35°C之间，粘度随之以若干个数量级上升。以图lb为例，其分别展示了 由六甲撑二异氰酸酯扩链的泊洛沙姆403 (被称为PMT0001)、由二异氰酸丁酯扩链的泊洛 沙姆403(PMT0002)和由亚甲基二环己基二异氰酸酯扩链的泊洛沙姆403(PMT0003)的10% 的溶液。后者具有较少的重复单元。
[0106] 图lc显示了在30。和35°C之间，相同的热可逆水凝胶PMT0001至PMT0003的贯 入阻力具有相似的具有明显的峰的图案。
[0107] 图Id显示了如所预计的，随着浓度的增加，凝胶（25% )的强度也随之增加。
[0108] 图le显示了在数周内所述凝胶合适地均匀地释放蛋白质。测试显示，由六甲撑二 异氰酸酯扩链的泊洛沙姆403分别在20%和25%的浓度下使用。
[0109] 实施例6:凝胶浓度的影响
[0110] 在无菌条件下，称取预定量的扩链泊洛沙姆（聚合物），并与适量的细胞培养基混 合。两种都在注射器中4°C下储存数天并不断地搅拌。这将引起均匀的溶液的形成，该溶液 在25_30°C时形成胶体。在约15°C下，加入100, 000个永生干细胞每毫升（immortalised stemcellspermillilitre)。米用Neubauer计数器测定细胞数，在离心管（Falcontube) 中将细胞离心为沉淀物，然后加到混合物中。通过采用"存活/死亡-分析法"先按小时， 然后按天，最后在一周后检测不同的聚合物浓度（2. 5%、5%和10% )。在样品的底部和内 部进行微观研宄。本文中，10%的聚合物浓度的细胞存活率稍微低于更低浓度的。另一方 面，凝胶的强度却相对更高。
[0111] 结果见图2和3所示。
[0112] 实施例7 :采用胶原的例子的生物材料的影响
[0113] 为了证明具有生物材料的热可逆水凝胶的高生物活性，进行了一系列的试验，其 中，在10%的根据本发明的水凝胶中存在不同可溶性胶原浓度（0%、10%和20% )下培养 100, 000个永生干细胞每毫升。该培养在37°C下在5%的二氧化碳和95%的空气的潮湿气 氛中进行。7天后（over7days)采用"存活/死亡-分析法"测量生命力。此外，通过共聚 焦激光扫描显微镜检测细胞形态。结果如图4和图5所示。
[0114] 1、按照如上所述的，制备在细胞培养基中的由1，4-二异氰酸丁酯扩链的泊洛沙 姆403聚合物的10%的溶液。将100, 000个eGFP-SCPl细胞分散在lml的该溶液中。采 用Neubauer计数器测定细胞数，在离心管中将细胞离心为沉淀物，然后转移到凝胶中。在 1、2、3和7天后研宄样品。7天后细胞存活率（图4,左手边）是可接受的达到了 45%，但 是细胞表现为圆形并未表明出增加的细胞附着，因为后者只能从膨胀的细胞形态上推断得 到。
[0115] 2、采用如上步骤，不同的是，向溶液（图4,中间）中加入来自鼠尾部的10%的可 溶性胶原（"I型-鼠尾胶原"，Merck)。在该情况下，7天后细胞存活还是可观的，达到约 70%。仅3天后细胞典型的拉长的形态变得明显。
[0116] 3、采用2中的步骤，但是这次向混合物中（图4,右手边）引入20%的胶原。细胞 存活率非常好达到了 80%。细胞展现出更为明显的拉长的形态。
[0117] 图4显示了各自的显微照片，说明了 7天后在本发明的热可逆水凝胶中存在或不 存在胶原I的情况下的eGFP-SCPls的细胞存活率。不存在或存在胶原I的本发明的热可 逆水凝胶之间的显著差异变得明显。采用碘化丙啶染色后的示例性的显微图（l〇x放大） 在底部；比例尺（刻度线）为200ym。
[0118] 图5给出了eGFP-SCPls细胞在7天后在本发明的热可逆水凝胶（即指图中的 BDI-hydrogel)中存在或者不存在20%胶原I的情况下在共聚焦激光扫描显微镜下的显 像。该图在l〇x放大（左边）或63x放大（右边）程度下测得。
[0119] 实施例8 :在应用体系中氧气对细胞存活率的影响
[0120] a)具有不同浓度的释放氧气的物质（Ca02)且没有酶的应用体系。
[0121] 在含有由泊洛沙姆403和二异氰酸丁酯制得的热可逆水凝胶的注射器中培养 hTERT-永生人骨髓间充质干细胞，过氧化钙（Ca02)的浓度为lmg/ml 、0. 5mg/ml、0. 25mg/ml 和0.1mg/ml，以及按小时间隔测量氧气饱和度。采用生命力分析测定细胞存活率。结果如 图6a中所示。
[0122] b)具有不同浓度的释放氧气的物质（Ca02)且具有不同浓度的酶的应用体系
[0123] 重复实施例8a)，不同的是，加入100U/ml或200U/ml或不加入过氧化氢酶（对照 组）作为酶。结果如图6b中所示，可以看出100U/ml或200U/ml的过氧化氢酶浓度在细胞 存活率上具有有益作用。
[0124] c)在恒定的酶浓度下的具有不同浓度的释放氧气的物质的应用体系
[0125] 同实施例8b)，在注射器中在含有0. 5mg/mlCaOjP100U/ml过氧化氢酶的 BDI-hydrogel中或者在含有 0? 25mg/mlCaOjPl100U/ml过氧化氛酶的BDI-hydrogel中培 养72h后测量氧气饱和度（A)和细胞存活率（B)。结果如图6c中所示，可以看出在0. 25mg/ mlCa02浓度和100U/ml过氧化氢酶浓度下的细胞存活率，甚至在72小时后，数据仍然约为 70%，这相比于对照组（表示为〃BDI-hydrogel")来说有所改进。
【主权项】
1. 一种扩链泊洛沙姆P*，所述扩链泊洛沙姆P*由至少一种泊洛沙姆P与二异氰酸酯 反应制备，每种泊洛沙姆包括两个聚氧乙烯段PEG和一个聚氧丙烯段PPG，并且P的聚氧丙 烯段的分子量大于2350Da，其中，泊洛沙姆P的分子量Mw为11000以上，P中的聚氧乙烯的 比例超过了 60%，并且至少两种不同的泊洛沙姆进行反应。2. 根据权利要求1所述的扩链泊洛沙姆P*，其中，两种不同的泊洛沙姆进行反应。3. 根据权利要求1所述的扩链泊洛沙姆P*，其中，三种不同的泊洛沙姆进行反应。4. 根据权利要求1所述的扩链泊洛沙姆P*，其中，所述扩链泊洛沙姆具有下式所示的 结构单元：其中，a和b各自为1-110的整数，且m彡3 ;a表示聚氧乙烯段PEG的重复单元数，b表 示聚氧丙稀段PPG的重复单元数；所述二异氰酸酯由式O = C = N-X-N = C = O表示，并且 X表示所述二异氰酸酯的脂肪族基团或芳香族基团； 以及其中，当采用两种不同的泊洛沙姆P和P'时，所述扩链泊洛沙姆还具有下式所示 的结构单元：其中，a、b、m和X如上所定义的，在第二种泊洛沙姆P'中，分别地，c表示聚氧乙烯段 PEG的重复单元数，d表示聚氧丙烯段PPG的重复单元数，其中，c和d各自为1-110的整数， 且 m' ^ 3。5. 根据权利要求1-3中任意一项所述的扩链泊洛沙姆P*，其中，所述二异氰酸酯选自 由脂肪族二异氰酸酯和芳香族二异氰酸酯所组成的组中。6. 根据权利要求5所述的扩链泊洛沙姆P*，其中，所述二异氰酸酯选自由线性二异氰 酸酯O = C = N-(CH2)n-N = C = 0、二异氰酸丁酯、六甲撑二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸 酯、亚甲基二环己基二异氰酸酯（H12-MDI)、赖氨酸二异氰酸酯（LDI)和二苯基甲烷二异氰 酸酯（MDI)所组成的组中，其中，η为4-12。7. 根据权利要求1-6中任意一项所述的扩链泊洛沙姆Ρ*，其中，所述泊洛沙姆选自泊 洛沙姆272、333、334、335、402、403和407中的一种或多种。8. 根据权利要求1-7中任意一项所述的扩链泊洛沙姆P*，其中，所述扩链泊洛沙姆P* 是在制备聚氨酯用的合适的催化剂的存在下，通过将所述泊洛沙姆和0. 8-1. 2当量的所述 二异氰酸酯在40°C -60°C下反应制得的。9. 热可逆水凝胶，其含有： (a) 根据权利要求1-8中任意一项所述的扩链泊洛沙姆P*，以及 (b) 选自由抗菌的、抗微生物的或抗真菌的活性物质，蛋白质，葡糖胺聚糖，溶菌酶和天 然的或合成的聚氨基酸所组成的组中的生物材料。10. 热可逆水凝胶，其由以下过程制得： (a) 制备根据权利要求1-8中任意一项所述的扩链泊洛沙姆P*，以及 (b) 将所述扩链泊洛沙姆与生物材料混合，所述生物材料选自由抗菌的、抗微生物的 或抗真菌的活性物质，蛋白质，葡糖胺聚糖，溶菌酶和天然的或合成的聚氨基酸所组成的组 中。11. 根据权利要求9或10所述的热可逆水凝胶，其中，P选自根据权利要求7中所述的 泊洛沙姆。12. 根据权利要求10或11所述的热可逆水凝胶，其中，所述热可逆水凝胶还含有活细 胞。13. 根据权利要求12所述的热可逆水凝胶，其中，所述活细胞选自由单核细胞、间充质 干细胞和其祖细胞及由其分化而得的细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、纤维母细胞、上 皮细胞、成肌细胞、肌腱细胞、单核造血干细胞和其祖细胞以及由其分化而得的细胞、免疫 细胞、多核细胞、巨细胞、巨噬细胞和破骨细胞所组成的组中。14. 根据权利要求12所述的热可逆水凝胶，其中，在所述凝胶中，所述细胞是改性的或 转基的。15. 根据权利要求9-14中任意一项所述的热可逆水凝胶，其中，所述生物材料为合成 的聚氨基酸，或者为抗菌的、抗微生物的或抗真菌的活性物质，和/或抑制或刺激细胞生长 和细胞分化的蛋白质；和/或，其中，所述生物材料为选自由纤维蛋白、胶质、胶原和骨形态 发生蛋白（BMP)所组成的组中的蛋白； 和/或，其中， 所述蛋白质为选自由胰岛素样生长因子（IGF)、转移生长因子（TGF)、血小板源生长因 子（PDGF)、表皮生长因子（EGF)、纤维母细胞生长因子（FGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因 子（GMCSF)、血管内皮生长因子（VEGF)、肝细胞生长因子（HGF)、白细胞介素 -IB (IL-IB)、白 细胞介素-8 (IL-8)、神经生长因子（NGF)以及如红细胞生成素和如G-CSF的集落刺激因子 的造血生长因子所组成的组中的生长因子；和/或，其中，所述蛋白质为激素或酶，优选为 卵泡抑素或肌生成抑制素； 和/或， 其中，所述生物材料为红细胞生成素、G-CSF、卵泡抑素或肌生成抑制素；和/或， 其中，所述蛋白质为抗体或选自由IgA、IgD、IgE、IgM、IgG、IgY和IgW所组成的组中的 免疫球蛋白；或者 其中，所述葡糖胺聚糖为透明质酸。16. 根据权利要求14所述的热可逆水凝胶，其中，所述生物材料选自由β -内酰胺抗 生素、四环素、氨基糖苷、大环内酯、抗病毒药、烯丙胺、抗真菌的抗生素、咪唑和它们的衍生 物，表皮生长因子（EGF)、TGF-f3-(转移生长因子β)_超家族：优选BMP(骨形态发生蛋 白）-和GDF(生长分化因子）-家族，更优选BMP2、BMP7和GDF-5,可溶性胶原、细磨胶原、 胶质、人血、动物血、人血或动物血中的成分和胶原I型、II型或III型所组成的组中。17. 根据权利要求9-16中任意一项所述的热可逆水凝胶，其中，所述扩链泊洛沙姆通 过采用线性脂肪族二异氰酸酯或环形芳香族二异氰酸酯制备。18. 根据权利要求9-16中任意一项所述的热可逆水凝胶，其中，所述述水凝胶还含有 示踪剂。19. 根据权利要求9-17中任意一项所述的热可逆水凝胶，其中，所述示踪剂选自放射 性物质，其通过PET或SPECT可视。20. 根据权利要求9-18中任意一项所述的热可逆水凝胶的医学应用。21. 根据权利要求20所述的热可逆水凝胶的医学应用，其中，所述医学应用为药物递 送或生物医学应用。22. 含有根据权利要求9-20中任意一项所述的热可逆水凝胶的应用体系。23. 根据权利要求22所述的应用体系，其中，该体系还含有刺激或抑制细胞/组织生长 或杀死细胞的治疗剂。24. 根据权利要求22或23所述的应用体系，其中，该体系还含有释放氧气的物质或结 合有酶的释放氧气的物质。25. 根据权利要求9-20中任意一项所述的热可逆水凝胶在制备用于治疗身体状况的 药物中的应用，其中，所述药物用于在体内组织上施用所述热可逆水凝胶的水溶液。26. 根据权利要求25所述的应用，其中，所述水溶液含有生物活性材料的溶液或悬浮 液。27. 根据权利要求25所述的应用，其中，所述身体状况为皮肤灼伤或擦伤。28. 根据权利要求25所述的应用，其中，所述身体状况为被外科手术损伤的组织。29. 根据权利要求28所述的应用，其中，所述外科手术为椎体成形术或椎体后凸成形 术。30. 根据权利要求28或29所述的应用，其中，所述外科手术通过套管针的插管进行操 作。31. 根据权利要求25所述的应用，其中，所述热可逆水凝胶在药学上可接受的载体中 给药到组织。32. 根据权利要求25所述的应用，其中，将所述热可逆水凝胶提供于药学上可接受的 载体中以用于胃肠外给药。33. 根据权利要求25所述的应用，其中，将所述热可逆水凝胶定位在生物组织表面；或 者 其中，将所述热可逆水凝胶定位在医疗设备的表面；或者 其中，将所述热可逆水凝胶定位在相对的表面上，由此产生所述表面相互粘附的倾向。34. 根据权利要求33所述的应用，其中，所述生物组织为器官，和/或 其中，所述器官选自皮肤，内脏器官，肌肉骨骼系统的组织，优选骨、软骨，结缔组织，优 选肌腱组织和脂肪组织。35. -种在表面上制备组合物的体外方法，该方法包括在所述表面上施用根据权利要 求9-21所述的热可逆水凝胶的水溶液或它的混合物，或者施用根据权利要求22、23或24 所述的医学应用体系。36. 根据权利要求35所述的体外方法，其中，该方法包括施用根据权利要求13所述的 含有活细胞的热可逆水凝胶的水溶液；和/或 其中，所述热可逆水凝胶是由经二异氰酸丁酯扩链的泊洛沙姆403,和/或释放氧气的 物质CaO2制备。
【专利摘要】根据本发明，提供了热可逆水凝胶，该热可逆水凝胶是由扩链的泊洛沙姆制得，且具有优异的性能。此外，本发明还提供了含有生物材料的热可逆水凝胶，以及制备该热可逆水凝胶的方法，含有活细胞的热可逆水凝胶，用于药物应用的应用体系，以及在表面上制备组合物的体外方法。
【IPC分类】C08L89/06, C08G18/48, C08J3/075, C08G81/00, A61K47/42, C08G18/73, C08L75/08, A61K47/34, C08G65/30, C08G18/76, A61K47/10
【公开号】CN104903373
【申请号】CN201380066266
【发明人】M·世克尔, H·威斯, U·莫尔
【申请人】M·世克尔
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年12月17日
【公告号】CA2895437A1, DE102012223416A1, DE102012223416A8, EP2931775A1, US20150335749, WO2014095915A1
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