促进皮肤再生的小分子的制作方法
促进皮肤再生的小分子的制作方法
【专利说明】促进皮肤再生的小分子
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.§ 119 (e)要求2013年I月9日提交的美国序列号61/750,714的优先权，所述专利的全部内容以引用方式并入本文。
[0003]发明背景发明领域
[0004]本发明大体涉及皮肤再生和创伤愈合，并且更具体地说涉及皮肤人成纤维细胞增殖和蛋白质产生增加的小分子介导的诱导。
[0005]背景信息
[0006]皮肤是脊椎动物身体的最大器官，其由具有复杂神经和血液供给的表皮和真皮所构成。第三层为皮下组织，其主要由脂肪和一层疏松结缔组织构成。这三个层起到保护身体免于任何机械损伤如创伤的重要作用。
[0007]真皮位于表皮正下方，构成皮肤的主体并且由胶原蛋白与一些弹性蛋白和糖胺聚糖(GAG)构成。真皮中存在的主要细胞类型为成纤维细胞，所述成纤维细胞能够产生重塑酶，如蛋白酶和胶原蛋白酶，这些酶在创伤愈合过程中起到重要作用。
[0008]创伤愈合为一个连续机制，并且其更具体而言为一种事件驱动过程，籍此来自一个细胞类型的信号在其它细胞类型中引发级联反应，所述级联反应推进所述创伤进入愈合阶段。成人创伤愈合本质上为修复过程，其通常表现出疤痕。组织修复一开始是受伤部位处的血纤维蛋白凝块沉积，从而阻止受损血管出血。循环的血小板随后聚集在受伤部位，并且释放各种炎性介体，如H)GF、TGF-a和TGF-β、表皮生长因子(EGF)和FGF。还认为这些分子在创伤修复过程的下游起重要作用。
[0009]成人组织对创伤的炎性反应的特征在于早期流入嗜中性粒细胞，所述嗜中性粒细胞的数量稳定增加并且在创伤后24 - 48小时达到最大。随着嗜中性粒细胞数量开始减少，巨噬细胞接替并再填充创伤部位。同时还发生上皮再形成，并且角质细胞从真皮和伤口边缘的基底细胞内部深处迀移穿过肉芽组织。一旦角质细胞重新建立皮肤的阻透性，它们就在接触抑制时恢复基底细胞表型，并且分化成分层鳞状角质化表皮。
[0010]炎性反应和上皮形成的最后阶段与成纤维细胞和内皮细胞的迀移以及肉芽组织的形成重合。随后发生血管生成和纤维增生，并且成纤维细胞变成主导细胞类型，产生胶原蛋白和ECM。使用由成纤维细胞和巨噬细胞产生的基质金属蛋白酶进行胶原蛋白的重塑。
[0011]皮肤成纤维细胞需要极高浓度的成纤维细胞生长因子(FGF)以便进行细胞复制并负责生成ECM，所述ECM将表皮的分层鳞状上皮细胞组织成统一组织。此外，皮肤成纤维细胞生成结缔组织的长纤维带，所述长纤维带将皮肤锚固至身体的筋膜。无皮肤成纤维细胞的情况下，创伤部位不能再生细胞外基质，并且表皮皮肤细胞不能在创伤部位上增殖。因此，无皮肤成纤维细胞的情况下，皮肤不能从受伤中恰当恢复。
[0012]对人而言，皮肤占体重的约十分之一，并且对所述主要器官的一部分的损伤(如创伤、疾病、烧伤或手术)具有严重后果。将组织工程改造皮肤替代品用于防治急性和慢性皮肤创伤。组织工程改造旨在再生新生物材料以用于替换患病或受损的组织或器官。为了实现此目的，不仅需要细胞源，而且还需要可对细胞进行支撑的人工细胞外基质(ECM)。
[0013]已研宄将诸如胶原蛋白和纤连蛋白之类的天然生物聚合物用作细胞可附接的潜在生物材料来源。组织工程改造中所用的第一代可降解聚合物来自其它外科用途，并且在机械和降解性质方面存在缺点。这已导致开发合成可降解凝胶来主要用作原位递送细胞和/或分子的方式，即所谓智能基质技术。组织或器官修复通常伴有导致产生疤痕的纤维化反应。然而，某些哺乳动物组织具有完全再生而无疤痕产生的能力；较佳例子包括MRL/MpJ小鼠的胚胎或胎儿皮肤和耳部。这些模型系统的研宄表明，为了实现这种完全再生，需改变炎性反应以使得纤维化和疤痕化的程度减弱。
[0014]皮肤成纤维细胞为在ECM沉积、上皮-间质相互作用和创伤愈合中起关键作用的细胞的动态群体。成纤维细胞易于在实验室中培养，并且向组织工程改造皮肤替代品中掺入成纤维细胞已产生令人鼓舞的结果，包括症状性疼痛缓解、急性和慢性创伤的更快速愈合、更少疤痕形成以及更好的美容效果。然而，目前不存在完全复制未受伤皮肤的解剖学、生理学、生物稳定性或美观性质的生物工程改造皮肤。
[0015]各种组织工程改造皮肤产品需要在多中心临床试验中进行比较，因为这将允许识别用于具体临床应用的特定产品。这可能潜在地导致在增加使用所述特定产品之后产品成本下降。另外，组织工程改造皮肤替代品与细胞因子和生长因子的组合未来可能用于增强创伤愈合以及提供掺入防卫素以用于抗微生物效益的可能性。因此需要新颖的方法来生成皮肤替代物，所述方法的材料技术不仅基于智能设计，而且还基于涉及再生过程的分子。
[0016]发明概述
[0017]本发明是基于某些小分子诱导成纤维细胞增殖和/或增加蛋白质产生的重大发现。
[0018]本文提供一种诱导受试者的成纤维细胞增殖的方法。所述方法包括将有效量的诱导成纤维细胞增殖的小分子施用于受试者。在某些方面中，小分子为SL 327、ABT 702、非诺班(fenobam)、SX 011、毒扁豆喊半硫酸盐(physostigimine hemisulfate)或 NBQX。
[0019]本文还提供一种增加受试者的蛋白质分泌的方法。所述方法包括将有效量的增加蛋白质分泌的小分子施用于受试者。
[0020]在某些方面，生长因子为EGF、FGF7/KGF、TGFI3或胶原蛋白I。在其它方面中，所述小分子为 CY 208-243、CD 439、T 0156 盐酸盐、CD 1530、PSB 06126、前列腺素 E2、LY294002盐酸盐、KB-R7943甲磺酸盐、proxyfan草酸盐、m_3M3FBS、双嘧达莫、甲基牛扁亭柠檬酸盐、WIN 64338、克立马丁延胡索酸盐或西洛他唑。
[0021]在一个实施方案中，蛋白质为EGF，并且小分子选自由CY208-243、CD 439、T 0156盐酸盐、⑶1530和PSB 06126组成的组。在另一个实施方案中，蛋白质为FGF7/KGF，并且小分子为前列腺素E2。在另一个实施方案中，蛋白质为TGFI3并且小分子选自由LY294002盐酸盐、KB-R7943甲磺酸盐、proxyfan草酸盐和m_3M3FBS组成的组。在另一个实施方案中，蛋白质为胶原蛋白I并且小分子选自由双嘧达莫、甲基牛扁亭柠檬酸盐、WIN 64338、克立马丁延胡索酸盐和西洛他唑组成的组。
[0022]本文提供一种促进皮肤再生的方法。所述方法包括将有效量的诱导成纤维细胞增殖或增加蛋白质分泌的化合物施用于受试者。在某些方面，蛋白质为EGF、FGF7/KGF、TGF β或胶原蛋白I。在某些方面，诱导成纤维细胞增殖的小分子为SL 327, ABT 702、非诺班、SX011、毒扁豆碱半硫酸盐或NBQX。在其它方面中，增加蛋白质分泌的小分子为CY 208-243、CD 439、T 0156 盐酸盐、CD 1530、PSB 06126、前列腺素 E2、LY 294002 盐酸盐、KB-R7943 甲磺酸盐、proxyfan草酸盐、m_3M3FBS、双嘧达莫、甲基牛扁亭柠檬酸盐、WIN 64338、克立马丁延胡索酸盐或西洛他唑。
[0023]在某些实施方案中，受试者为人。在其它实施方案中，细胞处于体外细胞培养物中。这种细胞包括人皮肤成纤维细胞(hDF)。
[0024]附图简述
[0025]图1为高通量皮肤成纤维细胞测定筛选的示意图。
[0026]图2为诱导成纤维细胞增殖的小分子随剂量改变的图示。
[0027]图3为诱导EGF表达的小分子随剂量改变的图示。
[0028]图4为诱导FGF7/KGF表达的小分子随剂量改变的图示。
[0029]图5为诱导TGF β表达的小分子随剂量改变的图示。
[0030]图6为诱导胶原蛋白I表达的小分子随剂量改变的图示。
[0031]图7图解示出诱导的弹性蛋白表达。
[0032]图8为细胞毒性随二甲基亚砜改变的图示。
[0033]图9为代表随DMS0、视黄醇和小分子CGP71683改变的相对弹性蛋白表达的柱状图。
[0034]图10为代表随DMS0、视黄醇和小分子CGP71683改变的相对胶原蛋白Ia表达的柱状图。
[0035]发明详述
[0036]皮肤成纤维细胞为负责产生胶原蛋白的皮肤细胞，其有助于形成促进皮肤屏障完整性和创伤愈合的结缔组织纤维和生长因子。在正常创伤愈合中，成纤维细胞从周围完整组织中募集到肉芽组织中，以响应于创伤流体(wound fluid)中存在的各种因子而增殖并再生新皮肤层。在正常老化期间，皮肤成纤维细胞丧失增殖能力，以及分泌正常创伤愈合中所涉及到的生长因子(例如EGF、FGF7/KGF、TGFf3、胶原蛋白)的能力。本文描述一种高通量筛选，其设计来识别促进成纤维细胞增殖和增加蛋白质(例如EGF、FGF7/KGF、TGF β、胶原蛋白)分泌的小分子。
[0037]生长因子为能够刺激细胞生长、增殖和细胞分化的天然存在的物质。生长因子对调控各种细胞过程十分重要。生长因子通常充当细胞之间的信号传导分子。实例为细胞因子和激素，其结合至在其靶细胞的表面上的特异性受体。它们往往促进细胞分化和成熟，这在生长因子之间有所不同。例如，骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein)刺激骨细胞分化，而成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子刺激血管分化(血管生成)。生长因子和生长因子家族的实例包括但不限于:肾上腺髓质素(AM)、促血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)、脑源性神经营养因子(BDNF)、皮肤生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌源性生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促移行因子、肌肉生长抑制素(Myostatin)(⑶F_8)、神经生长因子(NGF)和其它神经营养蛋白、血小板衍生生长因子(roGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α (TGF-α)、转化生长因子β (TGF-β)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、Wnt信号传导通路、胎盘生长因子(PlGF)、胎牛生长激素(FBS)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、bFGF 和 VEGF。
[0038]成纤维细胞分泌可溶性因子，所述可溶性因子扩散至上覆表皮并以旁分泌方式影响角质细胞，并且释放具有自分泌和旁分泌效应的细胞因子和生长因子。自分泌活动包括转化生长因子(TGF)-e诱导的促进胶原蛋白合成和成纤维细胞增殖的结缔组织生长因子的合成和分泌。旁分泌活动影响角质细胞生长和分化，具体而言，通过成纤维细胞分泌角质细胞生长因子(KGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白介素(IL)-6和成纤维细胞生长因子(FGF)-1O来影响。作为响应，角质细胞合成IL-1和甲状旁 腺激素相关肽，它们转而又刺激成纤维细胞产生KGF，且因此存在双旁分泌环路。此外，单独培养的角质细胞的IL-1表达相对较弱，但当与成纤维细胞共同培养时，展示出IL-1和c-Jun的表达增加。因此，掺入皮肤底物中的成纤维细胞对产生ECM和刺激性生长因子起作用，从而提供最佳环境以支持表皮形成并有利于创伤愈合。
[0039]成纤维细胞密度是考虑正常表皮形态的发展和角质细胞分化的重要因素，并且最佳密度仍需建立。部分地通过产生IV型和VII型胶原蛋白、层粘连蛋白5和巢蛋白，而且还通过分泌刺激角质细胞产生基底膜组分的细胞因子，成纤维细胞还有助于基底膜形成。由成纤维细胞分泌的TGF-β诱导角质细胞合成IV型和VII型胶原蛋白。
[0040]新血管化和淋巴管生成也是用于维持正常皮肤体内平衡和创伤愈合的重要过程，成纤维细胞对此具有重要旁分泌作用。血管内皮生长因子(VEGF)家族的成员包括VEGF-A、VEGF-B, VEGF-C和VEGF-D，它们由正常人成纤维细胞产生，并且对通过特异性受体来调控血管和淋巴内皮细胞增殖而言十分重要。VEGF-A已知涉及活化能够进行血管发生的固有内皮细胞和内皮祖细胞；VEGF-B的促内皮细胞有丝分裂的能力较弱，而VEGF-C和VEGF-D具有相同受体特异性，结合至VEGF受体2(VEGF-R2)以介导血管生成并且结合至VEGF-R3以影响淋巴管生成。
[0041]FGF-1促进身体自身粘连组织发展并有效密封创面，从而阻碍感染和缓解疤痕形成。由于构成结缔组织的胶原蛋白的稳定性质，使用FGF来刺激成纤维细胞活性是密封组织的有效途径。为了将组织密封到一起，人身体使用胶原蛋白和弹性蛋白来获得优良剪切强度。I型胶原蛋白具有增加其结构完整性的独特三螺旋结构，所述I型胶原蛋白包括捆绑成强纤丝的胶原蛋白股束。
[0042]以下实施例旨在说明，而并不限制本发明。
[0043]实施例1
[0044]用于人皮肤成纤维细胞(hDF)增殖的高通量增殖筛选测定
[0045]对于所述增殖测定，将人皮肤成纤维细胞(hDF)在DMEM(Gibco) 15 %FBS (HyClone)中以I，000个细胞/孔，接种到96孔黑色/透明底组织培养物处理板(Corning)中。在第二天，用小分子文库(Torcris 1120B1logically Active Compounds)在2.5 μΜ最终浓度下处理细胞。处理3天之后，固定细胞，用DAPI染色，并且使用RocheCellavista高容量成像系统(参见图1)分析。
[0046]根据所述高通量增殖筛选测定，发现ΑΒΤ702 二盐酸盐(腺苷激酶拮抗剂)、非诺班(mGlu5受体拮抗剂)和SX Oil (p38MAPK拮抗剂)在200nM浓度下诱导hDF的最高增殖水平(参见图2)。
[0047]实施例2
[0048]用于FGF7产生的高通量筛选测定
[0049]对于FGF7 产生测定，将 hDF 在 DMEM(Gibco) IX N2/B27 补充物(Invitrogen)中以19，000个细胞/孔，接种到96孔透明组织培养物处理板(Falcon)中。在第二天，用小分子文库(Torcris 1120 B1logically Active Compounds)在 2.5 μ M 最终浓度下处理细胞。处理3天之后，收集上清液并且使用FGF7人ELISA试剂盒(Abcam)并且用B1Tek Synergy2多检测功能微板读数器(参见图1)分析FGF7含量。
[0050]根据用于FGF7产生测定的高通量筛选测定，发现25 μ M浓度的前列腺素&在hDF中诱导FGF7的最高产生水平(参见图3)。
[0051]实施例3
[0052]用于TGF β I产生的高通量筛选测定
[0053]对于TGF β I 产生测定，将 hDF 在 DMEM(Gibco) IX N2/B27 补充物(Invitrogen)中以19，000个细胞/孔，接种到96孔透明组织培养物处理板(Falcon)中。在第二天，用小分子文库(Torcris 1120 B1logically Active Compounds)在 2.5 μ M最终浓度下处理细胞。处理3天之后，收集上清液并且使用TGFI3 I人ELISA试剂盒(Abcam)并且用B1TekSynergy 2多检测功能微板读数器(参见图1)分析TGF β I含量。
[0054]根据用于TGF β I产生测定的高通量筛选测定，发现24ηΜ浓度的Proxyfan草酸盐(组胺H3受体信号传导激动剂)、24nM浓度的m-3M3FBS (磷脂酶C信号传导)、1.6 μ M浓度的KB-R7943甲磺酸盐和98ηΜ浓度的LY294002盐酸盐在hDF中诱导TGF β I的最高产生水平(参见图4)。
[0055]实施例4
[0056]用于EGF产生的高通量筛选测定
[0057]对于EGF 产生测定，将 hDF 在 DMEM(Gibco) IX N2/B27 补充物(Invitrogen)中以19，000个细胞/孔，接种到96孔透明组织培养物处理板(Falcon)中。在第二天，用小分子文库(Torcris 1120 B1logically Active Compounds)在 2.5 μ M 最终浓度下处理细胞。处理3天之后，收集上清液并且使用EGF人ELISA试剂盒(Abcam)并且用B1Tek Synergy2多检测功能微板读数器(参见图1)分析EGF含量。
[0058]根据用于EGF产生测定的高通量筛选测定，发现25 μ M和12，5 μ M浓度的⑶437和CD 1530 (类视黄醇RAR信号传导激动剂)、12.5 μ M浓度的CY 208-243 (多巴胺Dl受体激动剂)和12.5 μ M浓度的PSB 06126 (NTPDase 3拮抗剂)在hDF中诱导EGF的最高产生水平(参见图5)。
[0059]实施例5
[0060]用于I型胶原蛋白产生的高通量筛选测定
[0061]对于I型胶原蛋白产生测定，将hDF在DMEM(Gibco) IX N2补充物(Invitrogen)中以5，000个细胞/孔，接种到96孔透明组织培养物处理板(Falcon)。在第二天，用小分子文库(Torcris 1120 B1logically Active Compounds)在 2.5 μ M 最终浓度下处理细胞。处理3天之后，收集上清液并且使用IC型原胶原蛋白-肽EIA试剂盒(Takara)并且用B1Tek Synergy 2多检测功能微板读数器分析I型胶原蛋白含量(参见图1)。
[0062]根据用于I型胶原蛋白测定的高通量筛选测定，发现390nM浓度的双嘧达莫(腺苷转运抑制剂)、390nM浓度的甲基牛扁亭柠檬酸盐(α 7神经元烟碱酸受体拮抗剂)、
6.25 μ M浓度的西洛他唑(PDE3A拮抗剂)、780ηΜ浓度的克立马丁延胡索酸盐(Η4受体拮抗剂)和97.5ηΜ浓度的WIN 64338 (缓激肽Β2受体拮抗剂)在hDF中诱导最高产生水平(参见图1)。
[0063]虽然已参考上述实例描述了本发明，但应当理解修改和变型涵盖在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受以上权利要求书限制。
【主权项】
1.一种诱导受试者的体外或体内成纤维细胞增殖的方法，所述方法包括将有效量的诱导成纤维细胞增殖的小分子施用于受试者。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者为人。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞(hDF)。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述小分子选自由SL327、ABT 702、非诺班、SX011、毒扁豆碱半硫酸盐和NBQX组成的组。5.一种增加受试者的蛋白质分泌的方法，所述方法包括将有效量的增加蛋白质分泌的小分子施用于受试者。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述受试者为人。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞(hDF)。8.根据权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质选自由EGF、FGF7、KGF、TGFβ和胶原蛋白组成的组。9.根据权利要求5所述的方法，其中所述小分子选自由以下组成的组:CY208-243,CD439、T 0156 盐酸盐、CD 1530、PSB 06126、前列腺素 E2、LY 294002 盐酸盐、KB-R7943 甲磺酸盐、proxyfan草酸盐、m_3M3FBS、双嘧达莫、甲基牛扁亭柠檬酸盐、WIN 64338、克立马丁延胡索酸盐和西洛他唑。10.根据权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质为EGF并且所述小分子选自由CY208-243、CD 439、T 0156 盐酸盐、CD 1530 和 PSB 06126 组成的组。11.根据权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质为FGF7/KGF并且所述小分子为前列腺素E2。12.根据权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质为TGFI3并且所述小分子选自由LY294002盐酸盐、KB-R7943甲磺酸盐、proxyfan草酸盐和m_3M3FBS013.根据权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质为胶原蛋白I并且所述小分子选自由双嘧达莫、甲基牛扁亭柠檬酸盐、WIN 64338、克立马丁延胡索酸盐和西洛他唑组成的组。14.一种促进皮肤再生的方法，所述方法包括将有效量的诱导成纤维细胞增殖的化合物施用于受试者。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者为人。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述成纤维细胞为皮肤成纤维细胞(hDF)。17.根据权利要求14所述的方法，其中所述小分子选自由SL327、ABT702、非诺班、SX011、毒扁豆碱半硫酸盐和NBQX组成的组。18.—种促进皮肤再生的方法，所述方法包括将有效量的增加蛋白质分泌的化合物施用于受试者。19.根据权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质选自由EGF、FGF7/KGF、TGFβ和胶原蛋白组成的组。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质选自由以下组成的组:CY208-243、CD 439、T 0156 盐酸盐、CD 1530、PSB 06126、前列腺素 E2、LY 294002 盐酸盐、KB-R7943 甲磺酸盐、proxyfan草酸盐、m_3M3FBS、双嘧达莫、甲基牛扁亭柠檬酸盐、WIN 64338、克立马丁延胡索酸盐和西洛他唑。
【专利摘要】本文提供小分子，所述小分子用于诱导成纤维细胞增殖和蛋白质分泌或产生增加。本文所述的小分子可用于促进皮肤再生。本文还提供促进皮肤再生和创伤愈合的方法。本发明大体涉及皮肤再生和创伤愈合，并且更具体地说涉及皮肤人成纤维细胞增殖和蛋白质产生增加的小分子介导的诱导。
【IPC分类】C12N5/07
【公开号】CN104903439
【申请号】CN201480004046
【发明人】R·冈萨雷斯, M·帕斯特沃伊托夫, R·斯莫茨肯
【申请人】国际干细胞公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年1月8日
【公告号】EP2943564A2, US20140309195, WO2014110177A2, WO2014110177A3
【专利说明】促进皮肤再生的小分子
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.§ 119 (e)要求2013年I月9日提交的美国序列号61/750,714的优先权，所述专利的全部内容以引用方式并入本文。
[0003]发明背景发明领域
[0004]本发明大体涉及皮肤再生和创伤愈合，并且更具体地说涉及皮肤人成纤维细胞增殖和蛋白质产生增加的小分子介导的诱导。
[0005]背景信息
[0006]皮肤是脊椎动物身体的最大器官，其由具有复杂神经和血液供给的表皮和真皮所构成。第三层为皮下组织，其主要由脂肪和一层疏松结缔组织构成。这三个层起到保护身体免于任何机械损伤如创伤的重要作用。
[0007]真皮位于表皮正下方，构成皮肤的主体并且由胶原蛋白与一些弹性蛋白和糖胺聚糖(GAG)构成。真皮中存在的主要细胞类型为成纤维细胞，所述成纤维细胞能够产生重塑酶，如蛋白酶和胶原蛋白酶，这些酶在创伤愈合过程中起到重要作用。
[0008]创伤愈合为一个连续机制，并且其更具体而言为一种事件驱动过程，籍此来自一个细胞类型的信号在其它细胞类型中引发级联反应，所述级联反应推进所述创伤进入愈合阶段。成人创伤愈合本质上为修复过程，其通常表现出疤痕。组织修复一开始是受伤部位处的血纤维蛋白凝块沉积，从而阻止受损血管出血。循环的血小板随后聚集在受伤部位，并且释放各种炎性介体，如H)GF、TGF-a和TGF-β、表皮生长因子(EGF)和FGF。还认为这些分子在创伤修复过程的下游起重要作用。
[0009]成人组织对创伤的炎性反应的特征在于早期流入嗜中性粒细胞，所述嗜中性粒细胞的数量稳定增加并且在创伤后24 - 48小时达到最大。随着嗜中性粒细胞数量开始减少，巨噬细胞接替并再填充创伤部位。同时还发生上皮再形成，并且角质细胞从真皮和伤口边缘的基底细胞内部深处迀移穿过肉芽组织。一旦角质细胞重新建立皮肤的阻透性，它们就在接触抑制时恢复基底细胞表型，并且分化成分层鳞状角质化表皮。
[0010]炎性反应和上皮形成的最后阶段与成纤维细胞和内皮细胞的迀移以及肉芽组织的形成重合。随后发生血管生成和纤维增生，并且成纤维细胞变成主导细胞类型，产生胶原蛋白和ECM。使用由成纤维细胞和巨噬细胞产生的基质金属蛋白酶进行胶原蛋白的重塑。
[0011]皮肤成纤维细胞需要极高浓度的成纤维细胞生长因子(FGF)以便进行细胞复制并负责生成ECM，所述ECM将表皮的分层鳞状上皮细胞组织成统一组织。此外，皮肤成纤维细胞生成结缔组织的长纤维带，所述长纤维带将皮肤锚固至身体的筋膜。无皮肤成纤维细胞的情况下，创伤部位不能再生细胞外基质，并且表皮皮肤细胞不能在创伤部位上增殖。因此，无皮肤成纤维细胞的情况下，皮肤不能从受伤中恰当恢复。
[0012]对人而言，皮肤占体重的约十分之一，并且对所述主要器官的一部分的损伤(如创伤、疾病、烧伤或手术)具有严重后果。将组织工程改造皮肤替代品用于防治急性和慢性皮肤创伤。组织工程改造旨在再生新生物材料以用于替换患病或受损的组织或器官。为了实现此目的，不仅需要细胞源，而且还需要可对细胞进行支撑的人工细胞外基质(ECM)。
[0013]已研宄将诸如胶原蛋白和纤连蛋白之类的天然生物聚合物用作细胞可附接的潜在生物材料来源。组织工程改造中所用的第一代可降解聚合物来自其它外科用途，并且在机械和降解性质方面存在缺点。这已导致开发合成可降解凝胶来主要用作原位递送细胞和/或分子的方式，即所谓智能基质技术。组织或器官修复通常伴有导致产生疤痕的纤维化反应。然而，某些哺乳动物组织具有完全再生而无疤痕产生的能力；较佳例子包括MRL/MpJ小鼠的胚胎或胎儿皮肤和耳部。这些模型系统的研宄表明，为了实现这种完全再生，需改变炎性反应以使得纤维化和疤痕化的程度减弱。
[0014]皮肤成纤维细胞为在ECM沉积、上皮-间质相互作用和创伤愈合中起关键作用的细胞的动态群体。成纤维细胞易于在实验室中培养，并且向组织工程改造皮肤替代品中掺入成纤维细胞已产生令人鼓舞的结果，包括症状性疼痛缓解、急性和慢性创伤的更快速愈合、更少疤痕形成以及更好的美容效果。然而，目前不存在完全复制未受伤皮肤的解剖学、生理学、生物稳定性或美观性质的生物工程改造皮肤。
[0015]各种组织工程改造皮肤产品需要在多中心临床试验中进行比较，因为这将允许识别用于具体临床应用的特定产品。这可能潜在地导致在增加使用所述特定产品之后产品成本下降。另外，组织工程改造皮肤替代品与细胞因子和生长因子的组合未来可能用于增强创伤愈合以及提供掺入防卫素以用于抗微生物效益的可能性。因此需要新颖的方法来生成皮肤替代物，所述方法的材料技术不仅基于智能设计，而且还基于涉及再生过程的分子。
[0016]发明概述
[0017]本发明是基于某些小分子诱导成纤维细胞增殖和/或增加蛋白质产生的重大发现。
[0018]本文提供一种诱导受试者的成纤维细胞增殖的方法。所述方法包括将有效量的诱导成纤维细胞增殖的小分子施用于受试者。在某些方面中，小分子为SL 327、ABT 702、非诺班(fenobam)、SX 011、毒扁豆喊半硫酸盐(physostigimine hemisulfate)或 NBQX。
[0019]本文还提供一种增加受试者的蛋白质分泌的方法。所述方法包括将有效量的增加蛋白质分泌的小分子施用于受试者。
[0020]在某些方面，生长因子为EGF、FGF7/KGF、TGFI3或胶原蛋白I。在其它方面中，所述小分子为 CY 208-243、CD 439、T 0156 盐酸盐、CD 1530、PSB 06126、前列腺素 E2、LY294002盐酸盐、KB-R7943甲磺酸盐、proxyfan草酸盐、m_3M3FBS、双嘧达莫、甲基牛扁亭柠檬酸盐、WIN 64338、克立马丁延胡索酸盐或西洛他唑。
[0021]在一个实施方案中，蛋白质为EGF，并且小分子选自由CY208-243、CD 439、T 0156盐酸盐、⑶1530和PSB 06126组成的组。在另一个实施方案中，蛋白质为FGF7/KGF，并且小分子为前列腺素E2。在另一个实施方案中，蛋白质为TGFI3并且小分子选自由LY294002盐酸盐、KB-R7943甲磺酸盐、proxyfan草酸盐和m_3M3FBS组成的组。在另一个实施方案中，蛋白质为胶原蛋白I并且小分子选自由双嘧达莫、甲基牛扁亭柠檬酸盐、WIN 64338、克立马丁延胡索酸盐和西洛他唑组成的组。
[0022]本文提供一种促进皮肤再生的方法。所述方法包括将有效量的诱导成纤维细胞增殖或增加蛋白质分泌的化合物施用于受试者。在某些方面，蛋白质为EGF、FGF7/KGF、TGF β或胶原蛋白I。在某些方面，诱导成纤维细胞增殖的小分子为SL 327, ABT 702、非诺班、SX011、毒扁豆碱半硫酸盐或NBQX。在其它方面中，增加蛋白质分泌的小分子为CY 208-243、CD 439、T 0156 盐酸盐、CD 1530、PSB 06126、前列腺素 E2、LY 294002 盐酸盐、KB-R7943 甲磺酸盐、proxyfan草酸盐、m_3M3FBS、双嘧达莫、甲基牛扁亭柠檬酸盐、WIN 64338、克立马丁延胡索酸盐或西洛他唑。
[0023]在某些实施方案中，受试者为人。在其它实施方案中，细胞处于体外细胞培养物中。这种细胞包括人皮肤成纤维细胞(hDF)。
[0024]附图简述
[0025]图1为高通量皮肤成纤维细胞测定筛选的示意图。
[0026]图2为诱导成纤维细胞增殖的小分子随剂量改变的图示。
[0027]图3为诱导EGF表达的小分子随剂量改变的图示。
[0028]图4为诱导FGF7/KGF表达的小分子随剂量改变的图示。
[0029]图5为诱导TGF β表达的小分子随剂量改变的图示。
[0030]图6为诱导胶原蛋白I表达的小分子随剂量改变的图示。
[0031]图7图解示出诱导的弹性蛋白表达。
[0032]图8为细胞毒性随二甲基亚砜改变的图示。
[0033]图9为代表随DMS0、视黄醇和小分子CGP71683改变的相对弹性蛋白表达的柱状图。
[0034]图10为代表随DMS0、视黄醇和小分子CGP71683改变的相对胶原蛋白Ia表达的柱状图。
[0035]发明详述
[0036]皮肤成纤维细胞为负责产生胶原蛋白的皮肤细胞，其有助于形成促进皮肤屏障完整性和创伤愈合的结缔组织纤维和生长因子。在正常创伤愈合中，成纤维细胞从周围完整组织中募集到肉芽组织中，以响应于创伤流体(wound fluid)中存在的各种因子而增殖并再生新皮肤层。在正常老化期间，皮肤成纤维细胞丧失增殖能力，以及分泌正常创伤愈合中所涉及到的生长因子(例如EGF、FGF7/KGF、TGFf3、胶原蛋白)的能力。本文描述一种高通量筛选，其设计来识别促进成纤维细胞增殖和增加蛋白质(例如EGF、FGF7/KGF、TGF β、胶原蛋白)分泌的小分子。
[0037]生长因子为能够刺激细胞生长、增殖和细胞分化的天然存在的物质。生长因子对调控各种细胞过程十分重要。生长因子通常充当细胞之间的信号传导分子。实例为细胞因子和激素，其结合至在其靶细胞的表面上的特异性受体。它们往往促进细胞分化和成熟，这在生长因子之间有所不同。例如，骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein)刺激骨细胞分化，而成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子刺激血管分化(血管生成)。生长因子和生长因子家族的实例包括但不限于:肾上腺髓质素(AM)、促血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)、脑源性神经营养因子(BDNF)、皮肤生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌源性生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促移行因子、肌肉生长抑制素(Myostatin)(⑶F_8)、神经生长因子(NGF)和其它神经营养蛋白、血小板衍生生长因子(roGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α (TGF-α)、转化生长因子β (TGF-β)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、Wnt信号传导通路、胎盘生长因子(PlGF)、胎牛生长激素(FBS)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、bFGF 和 VEGF。
[0038]成纤维细胞分泌可溶性因子，所述可溶性因子扩散至上覆表皮并以旁分泌方式影响角质细胞，并且释放具有自分泌和旁分泌效应的细胞因子和生长因子。自分泌活动包括转化生长因子(TGF)-e诱导的促进胶原蛋白合成和成纤维细胞增殖的结缔组织生长因子的合成和分泌。旁分泌活动影响角质细胞生长和分化，具体而言，通过成纤维细胞分泌角质细胞生长因子(KGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白介素(IL)-6和成纤维细胞生长因子(FGF)-1O来影响。作为响应，角质细胞合成IL-1和甲状旁 腺激素相关肽，它们转而又刺激成纤维细胞产生KGF，且因此存在双旁分泌环路。此外，单独培养的角质细胞的IL-1表达相对较弱，但当与成纤维细胞共同培养时，展示出IL-1和c-Jun的表达增加。因此，掺入皮肤底物中的成纤维细胞对产生ECM和刺激性生长因子起作用，从而提供最佳环境以支持表皮形成并有利于创伤愈合。
[0039]成纤维细胞密度是考虑正常表皮形态的发展和角质细胞分化的重要因素，并且最佳密度仍需建立。部分地通过产生IV型和VII型胶原蛋白、层粘连蛋白5和巢蛋白，而且还通过分泌刺激角质细胞产生基底膜组分的细胞因子，成纤维细胞还有助于基底膜形成。由成纤维细胞分泌的TGF-β诱导角质细胞合成IV型和VII型胶原蛋白。
[0040]新血管化和淋巴管生成也是用于维持正常皮肤体内平衡和创伤愈合的重要过程，成纤维细胞对此具有重要旁分泌作用。血管内皮生长因子(VEGF)家族的成员包括VEGF-A、VEGF-B, VEGF-C和VEGF-D，它们由正常人成纤维细胞产生，并且对通过特异性受体来调控血管和淋巴内皮细胞增殖而言十分重要。VEGF-A已知涉及活化能够进行血管发生的固有内皮细胞和内皮祖细胞；VEGF-B的促内皮细胞有丝分裂的能力较弱，而VEGF-C和VEGF-D具有相同受体特异性，结合至VEGF受体2(VEGF-R2)以介导血管生成并且结合至VEGF-R3以影响淋巴管生成。
[0041]FGF-1促进身体自身粘连组织发展并有效密封创面，从而阻碍感染和缓解疤痕形成。由于构成结缔组织的胶原蛋白的稳定性质，使用FGF来刺激成纤维细胞活性是密封组织的有效途径。为了将组织密封到一起，人身体使用胶原蛋白和弹性蛋白来获得优良剪切强度。I型胶原蛋白具有增加其结构完整性的独特三螺旋结构，所述I型胶原蛋白包括捆绑成强纤丝的胶原蛋白股束。
[0042]以下实施例旨在说明，而并不限制本发明。
[0043]实施例1
[0044]用于人皮肤成纤维细胞(hDF)增殖的高通量增殖筛选测定
[0045]对于所述增殖测定，将人皮肤成纤维细胞(hDF)在DMEM(Gibco) 15 %FBS (HyClone)中以I，000个细胞/孔，接种到96孔黑色/透明底组织培养物处理板(Corning)中。在第二天，用小分子文库(Torcris 1120B1logically Active Compounds)在2.5 μΜ最终浓度下处理细胞。处理3天之后，固定细胞，用DAPI染色，并且使用RocheCellavista高容量成像系统(参见图1)分析。
[0046]根据所述高通量增殖筛选测定，发现ΑΒΤ702 二盐酸盐(腺苷激酶拮抗剂)、非诺班(mGlu5受体拮抗剂)和SX Oil (p38MAPK拮抗剂)在200nM浓度下诱导hDF的最高增殖水平(参见图2)。
[0047]实施例2
[0048]用于FGF7产生的高通量筛选测定
[0049]对于FGF7 产生测定，将 hDF 在 DMEM(Gibco) IX N2/B27 补充物(Invitrogen)中以19，000个细胞/孔，接种到96孔透明组织培养物处理板(Falcon)中。在第二天，用小分子文库(Torcris 1120 B1logically Active Compounds)在 2.5 μ M 最终浓度下处理细胞。处理3天之后，收集上清液并且使用FGF7人ELISA试剂盒(Abcam)并且用B1Tek Synergy2多检测功能微板读数器(参见图1)分析FGF7含量。
[0050]根据用于FGF7产生测定的高通量筛选测定，发现25 μ M浓度的前列腺素&在hDF中诱导FGF7的最高产生水平(参见图3)。
[0051]实施例3
[0052]用于TGF β I产生的高通量筛选测定
[0053]对于TGF β I 产生测定，将 hDF 在 DMEM(Gibco) IX N2/B27 补充物(Invitrogen)中以19，000个细胞/孔，接种到96孔透明组织培养物处理板(Falcon)中。在第二天，用小分子文库(Torcris 1120 B1logically Active Compounds)在 2.5 μ M最终浓度下处理细胞。处理3天之后，收集上清液并且使用TGFI3 I人ELISA试剂盒(Abcam)并且用B1TekSynergy 2多检测功能微板读数器(参见图1)分析TGF β I含量。
[0054]根据用于TGF β I产生测定的高通量筛选测定，发现24ηΜ浓度的Proxyfan草酸盐(组胺H3受体信号传导激动剂)、24nM浓度的m-3M3FBS (磷脂酶C信号传导)、1.6 μ M浓度的KB-R7943甲磺酸盐和98ηΜ浓度的LY294002盐酸盐在hDF中诱导TGF β I的最高产生水平(参见图4)。
[0055]实施例4
[0056]用于EGF产生的高通量筛选测定
[0057]对于EGF 产生测定，将 hDF 在 DMEM(Gibco) IX N2/B27 补充物(Invitrogen)中以19，000个细胞/孔，接种到96孔透明组织培养物处理板(Falcon)中。在第二天，用小分子文库(Torcris 1120 B1logically Active Compounds)在 2.5 μ M 最终浓度下处理细胞。处理3天之后，收集上清液并且使用EGF人ELISA试剂盒(Abcam)并且用B1Tek Synergy2多检测功能微板读数器(参见图1)分析EGF含量。
[0058]根据用于EGF产生测定的高通量筛选测定，发现25 μ M和12，5 μ M浓度的⑶437和CD 1530 (类视黄醇RAR信号传导激动剂)、12.5 μ M浓度的CY 208-243 (多巴胺Dl受体激动剂)和12.5 μ M浓度的PSB 06126 (NTPDase 3拮抗剂)在hDF中诱导EGF的最高产生水平(参见图5)。
[0059]实施例5
[0060]用于I型胶原蛋白产生的高通量筛选测定
[0061]对于I型胶原蛋白产生测定，将hDF在DMEM(Gibco) IX N2补充物(Invitrogen)中以5，000个细胞/孔，接种到96孔透明组织培养物处理板(Falcon)。在第二天，用小分子文库(Torcris 1120 B1logically Active Compounds)在 2.5 μ M 最终浓度下处理细胞。处理3天之后，收集上清液并且使用IC型原胶原蛋白-肽EIA试剂盒(Takara)并且用B1Tek Synergy 2多检测功能微板读数器分析I型胶原蛋白含量(参见图1)。
[0062]根据用于I型胶原蛋白测定的高通量筛选测定，发现390nM浓度的双嘧达莫(腺苷转运抑制剂)、390nM浓度的甲基牛扁亭柠檬酸盐(α 7神经元烟碱酸受体拮抗剂)、
6.25 μ M浓度的西洛他唑(PDE3A拮抗剂)、780ηΜ浓度的克立马丁延胡索酸盐(Η4受体拮抗剂)和97.5ηΜ浓度的WIN 64338 (缓激肽Β2受体拮抗剂)在hDF中诱导最高产生水平(参见图1)。
[0063]虽然已参考上述实例描述了本发明，但应当理解修改和变型涵盖在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受以上权利要求书限制。
【主权项】
1.一种诱导受试者的体外或体内成纤维细胞增殖的方法，所述方法包括将有效量的诱导成纤维细胞增殖的小分子施用于受试者。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者为人。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞(hDF)。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述小分子选自由SL327、ABT 702、非诺班、SX011、毒扁豆碱半硫酸盐和NBQX组成的组。5.一种增加受试者的蛋白质分泌的方法，所述方法包括将有效量的增加蛋白质分泌的小分子施用于受试者。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述受试者为人。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞(hDF)。8.根据权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质选自由EGF、FGF7、KGF、TGFβ和胶原蛋白组成的组。9.根据权利要求5所述的方法，其中所述小分子选自由以下组成的组:CY208-243,CD439、T 0156 盐酸盐、CD 1530、PSB 06126、前列腺素 E2、LY 294002 盐酸盐、KB-R7943 甲磺酸盐、proxyfan草酸盐、m_3M3FBS、双嘧达莫、甲基牛扁亭柠檬酸盐、WIN 64338、克立马丁延胡索酸盐和西洛他唑。10.根据权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质为EGF并且所述小分子选自由CY208-243、CD 439、T 0156 盐酸盐、CD 1530 和 PSB 06126 组成的组。11.根据权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质为FGF7/KGF并且所述小分子为前列腺素E2。12.根据权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质为TGFI3并且所述小分子选自由LY294002盐酸盐、KB-R7943甲磺酸盐、proxyfan草酸盐和m_3M3FBS013.根据权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质为胶原蛋白I并且所述小分子选自由双嘧达莫、甲基牛扁亭柠檬酸盐、WIN 64338、克立马丁延胡索酸盐和西洛他唑组成的组。14.一种促进皮肤再生的方法，所述方法包括将有效量的诱导成纤维细胞增殖的化合物施用于受试者。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者为人。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述成纤维细胞为皮肤成纤维细胞(hDF)。17.根据权利要求14所述的方法，其中所述小分子选自由SL327、ABT702、非诺班、SX011、毒扁豆碱半硫酸盐和NBQX组成的组。18.—种促进皮肤再生的方法，所述方法包括将有效量的增加蛋白质分泌的化合物施用于受试者。19.根据权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质选自由EGF、FGF7/KGF、TGFβ和胶原蛋白组成的组。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质选自由以下组成的组:CY208-243、CD 439、T 0156 盐酸盐、CD 1530、PSB 06126、前列腺素 E2、LY 294002 盐酸盐、KB-R7943 甲磺酸盐、proxyfan草酸盐、m_3M3FBS、双嘧达莫、甲基牛扁亭柠檬酸盐、WIN 64338、克立马丁延胡索酸盐和西洛他唑。
【专利摘要】本文提供小分子，所述小分子用于诱导成纤维细胞增殖和蛋白质分泌或产生增加。本文所述的小分子可用于促进皮肤再生。本文还提供促进皮肤再生和创伤愈合的方法。本发明大体涉及皮肤再生和创伤愈合，并且更具体地说涉及皮肤人成纤维细胞增殖和蛋白质产生增加的小分子介导的诱导。
【IPC分类】C12N5/07
【公开号】CN104903439
【申请号】CN201480004046
【发明人】R·冈萨雷斯, M·帕斯特沃伊托夫, R·斯莫茨肯
【申请人】国际干细胞公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年1月8日
【公告号】EP2943564A2, US20140309195, WO2014110177A2, WO2014110177A3
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