对植物赋予高产性的核酸、制备产量增加的转基因植物的方法、使植物的产量增大的方法
对植物赋予高产性的核酸、制备产量增加的转基因植物的方法、使植物的产量增大的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种对植物赋予高产性的核酸、特别是含有源自稻野生种长雄野生稻 的假应答调节因子的启动子和/或假应答调节因子的编码区域的核酸。并且，本发明涉及 一种使用上述核酸使产量增加的转基因植物的制备方法及使植物的产量增大的方法。
【背景技术】
[0002] 1.有关使植物的数量性状增加的基因的研宄
[0003] 为了培育农业上有益的新品种，进行了使植物彼此杂交而筛选后代的杂交育种法 或诱发植物突变的突变育种法等。另外，近年来，还培育有导入有用基因并表达其功能的基 因重组植物。为了培育这样的新品种，有效的方法是聚集赋予了优异性质的基因，但在期望 进一步提高作物的生产率的情况下，可利用的基因仍然较少，特别希望对控制高产性状等 数量性状的基因进行确定。
[0004] 近年来，随着分子生物学方法的发展，可使用DNA标记物进行数量性状的基因分 析。并且，还在积极地进行利用遗传图谱，并利用分子生物学方法来进行克隆农业上有用 基因的研宄。在构建有遗传图谱的生物中，进行有通过显示特定的表达型的性状和标记物 的连锁分析、以及随后的染色体步移等而尝试确定控制其性状的基因的物理位置并进行分 离基因（图谱克隆法）。但是，通常只能粗略确定含有控制数量性状的基因的部位，只能 理论上确定含有大量基因的DNA片段。而且，作为可进行克隆大小的片段或者可通过转化 导入植物大小的片段，不容易确定。另外，制备详细的基因图谱、以图谱信息为基础对要得 到的基因进行确定并对基因进行克隆的作业需要长时间和大量工作量。实际上，虽然有 若干通过图谱克隆法对使数量性状增大的基因进行克隆的例子（非专利文献1:Ashikari et.al. 2005、非专利文献2:Miuraet.al. 2010)，但其数量仍然非常有限。
[0005] 已知非洲野生的稻野生种长雄野生稻（0.longistaminata)虽然与作为栽培种的 栽培稻（O.sativaL.)具有相同的A基因组，但与栽培种相比，显示较大的生物质。本发明 人培育在稻栽培品种"Shiokari"中导入长雄野生稻的长花药的过程中，显示生长旺盛性的 BC7F6系统"No. 645"。然后，成功地利用图谱克隆将赋予生长旺盛性的区域缩小至第7染 色体最末端部约180kb。然后，对该区域的约82kb进彳丁喊基序列确定，对以其为基础制备的 转化体进行调查，但无法得到显示生长旺盛性的转化体（非专利文献3)。
[0006] 2?植物的钟相关基因
[0007] 关于植物的钟相关基因，在使用拟南芥（Arabidopsis:拟南芥属）的研宄中，发现 CIRCADIANCLOCKASS0CIATED1(CCA1),LATEELONGATEDHYP0C0TYL(LHY),TIMINGOFCAB EXPRESSION(T0C1)这样的3个基因。而且，已明确：构成植物的昼夜节律时钟的基础的机 制是这些基因表达的反馈环路。其中，T0C1基因作为假应答调节因子（Pseudoresponse regulator:PRR)之一而熟知。以下，将假应答调节因子记为PRR。作为拟南芥中所确定的 PRR基因，目前包含TOCl(PRRl)在内已知有PRR3、PRR5、PRR7、PRR9这5个。并且，发现按 照PRR9、PRR7、PRR5、PRR3、PRR1 (T0C1)的顺序，通过表达量上升/衰减而引起昼夜交替现 象（非专利文献 4:Matsushikaet.al. 2000)。
[0008]然后，在单子叶植物的稻中，确定了 5种与双子叶植物的拟南芥的PRR基因对应 的直系同源物，明确这些直系同源物与拟南芥同样地显示昼夜节律。并且，这些稻的直系 同源物、即OsPRRl、0sPRR37、0sPRR59、0sPRR73、0sPRR95分别定位于稻的基因组上的第 1染色体、第7染色体、第11染色体、第3染色体、第9染色体（非专利文献5:Murakami et.al. 2003)。另外，有向拟南芥的PRR7基因突变株导入以拟南芥PRR7的启动子对稻 0sPRR37cDNA的表达进行控制的构建体而显示功能互补的报告（非专利文献6:Murakami et.al. 2006) 〇
[0009]另外，在粳稻品种"日本晴"和籼稻"卡萨拉斯（kasalath) "之间，对OsPRR基 因的表达谱进行比较，结果非常相似，表明在粳稻和籼稻之间非常保守（非专利文献7 : MurakamiMet.al. 2005)。
[0010] 可是，关于PRR基因，报告有：通过将组成型启动子连接于该基因，植物的产量增 加。具体而言，已知有向稻导入将稻中组成型表达的启动子（G0S2启动子）连接于源自番 茄的PRR2结构基因而成的构建体，结果稻的产量增加的实例（专利文献1)，或者向稻导入 将组成型启动子（RICEACTIN启动子）连接于源自拟南芥的PRR5基因而成的构建体，结果 稻的茎数增加且高度伸长的实例（专利文献2)。但是，迄今为止不存在着眼于PRR的启动 子的例子。
[0011] 现有技术文献
[0012] 专利文献
[0013] 专利文献1 :美国专利申请公开2011/0145949
[0014]专利文献 2 :W02011/049243
[0015] 非专利文献
[0016] 非专利文献 1:AshikariM.，SakakibaraH.，LinS.，YamamotoT.，Takashi T. ,NishimuraA. ,AngelesER. ,QianQ. ,KitanoH. ,andMatsuokaM. (2005)Cytokinin oxidaseregulatesricegrainproductionScience309:741-745
[0017] 非专利文献 2:MiuraK. ,IkedaM. ,MatsubaraA. ,SongX.J. ,ItoM. ,Asano K.,MatsuokaM. ,KitanoH.andAshikariM. (2010)0sSPL14promotespaniclebranching andhighergrainproductivityinriceNatureGenetics42:545-549
[0018] 非专利文献3:前川雅彦、小森俊之"稻野生种长雄野生稻染色体部分导入系 统中的生长旺盛性所涉及的原因基因分离和功能冬野生種才y寸'?口y芊只夕s 于一夕染色体部分導入系統(乙朽汀§生育旺盛性(乙係打§原因遺伝子単離t機能解析， QT2002) 40-43 "研宄成果第473集"利用基因组育种的有效的品种育成技术的开发-QTL 基因分析的推进-(yyA育種CA3効率的品種育成技術?開発一QTL遺伝子解析?推 進一）"平成21年2月20日发行编辑发行农林水产省农林水产技术会议事务局
[0019]非专利文献 4:MatsushikaA.，MakinoS.，KojimaM.andMizunoT. (2000) CircadianWavesofExpressionoftheAPRR1/T0C1FamilyofPseudo-Response RegulatorsinArabidopsisthaliana:InsightintothePlantCircadianClockPlant CellPhysiol. 41:1002-1012
[0020] 非专利文献 5:MurakamiM.，AshikariM.，MiuraK.，YamashinoT.andMizuno T. (2003)TheEvolutionarilyConservedOsPRRQuintet:RicePseudo-Response RegulatorsImplicatedinCircadianRhythmPlantCellPhysiol.44:1229-1236
[0021] 非专利文献 6 :MURAKAMI，M.，Y.TAG0,etal. (2007)."Characterizationofthe RiceCircadianClock-AssociatedPseudo-ResponseRegulatorsinArabidopsis thaliana.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry71 (4):1107-1110.
[0022] 非专利文献 7:MurakamiM.，MatsushikaA.，AshikariM.，Yamashino T.andMizunoT. (2005)Circadian-associatedricepseudo-response regulators(OsPRRs):InsightintothecontroloffloweringtimeBiosci. Biotechnol.Biochem. 69:410-414
[0023]非专利文献 8 :Harushima，Y.，Yano,M.，Shomura，A.，Sato,M.，Shimano,T.，Ku boki,Y. ,Yamamoto,T. ,Lin,S.Y. ,Antonio,B.A. ,Parco,A. ,Kajiya,H. ,Huang,N. ,Yama moto,K. ,Nagamura,Y. ,Kurata,N. ,Khush,G.S. ,andSasaki,T. (1998)Ahigh-density ricegeneticlinkagemapwith2275markersusingasingleF2population. Genetics，148, 479-494.
[0024]非专利文献 9:Hieietal(1994)Efficienttransformationofrice(Oryza SativaL)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisofboundariesofthe T-DNAPlantJ. 6:271-282.
[0025]非专利文献 10:Komarietal(1996)VectorscarryingtwoseparateT-DNAs forco-transformationofhigherplantsmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens andsegregationoftransformantsfreefromselectionmarkers.PlantJ. 10, 165 -174.
[0026]非专利文献 11:Dittaetal(1980)BroadhostrangeDNAcloningsystem forgram-negativebacteria:constructionofagenebankofRhizobiummeliloti. ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica 77:7347-7351.
[0027]非专利文献 12:Ishidaetal. (2007)Agrobacterium-mediatedtransformation ofmaize.NatureProtocols2:1614-1621.
[0028]非特专利文献 13 :0gisoetal. (2010)TheroleofcaseinkinaseII infloweringtimeregulationhasdiversifiedduringevolution.Plant Physiology. 152:808-820
【发明内容】
[0029] 发明所要解决的问题
[0030] 如上所述，需要开发一种使植物的数量性状增加的方案。因此，本发明要解决的问 题在于，提供一种可对植物赋予高产性的核酸。并且，本发明提供一种使用这样的核酸使产 量增大的转基因植物及使植物的产量增大的方法。
[0031] 用于解决课题的技术方案
[0032] 本发明人等利用图谱克隆对位于长雄野生稻的第7染色体最末端部的赋予生长 旺盛性的区域进行研宄，缩小至第7染色体最末端部约180kb。确定了该区域的82kb的碱 基序列，5处存在lkbp以上的较大的缺失，在末端侧还存在约3kbp的插入。因此，虽然缩小 至约180kb，但由于该差异，难以进行进一步缩小。
[0033] 本发明人等也考虑"日本晴"的全长cDNA的位置，对该82kb区域设计并制制备了 7个构建体并进行了研宄。其结果，明确了：位于约82kb区域的PRR7基因同源物是赋予高 产性的原因基因。并且，本发明人等发现，令人吃惊的是，长雄野生稻的高产性不仅由基因 区域赋予，长雄野生稻的启动子区域贡献较大。
[0034] 基于以上见解，本发明提供一种含有长雄野生稻中假应答调节因子基因的启动子 的碱基序列的核酸及该启动子与假应答调节因子的结构基因可操作地连接而成的核酸。这 样的核酸可对植物赋予高产性。
[0035] 本发明优选通过以下记载的方案来进行，但并不限定于此。
[0036] [方案 1]
[0037] 一种核酸，其含有：
[0038] (1)序列号1的34845-35044所示的碱基序列、或
[0039] (2)与序列号1的34845-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性，且显不 促进植物基因转录的活性的碱基序列。
[0040] [方案2]
[0041] (1)序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或
[0042] (2)与序列号1的33045-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性，且显不 促进植物基因转录的活性的碱基序列。
[0043] [方案3]
[0044] 一种核酸，其含有：
[0045] (1)序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或
[0046] (2)与序列号1的26779-35044所不的喊基序列具有至少80 %的同一性，且显不 促进植物基因转录的活性的碱基序列。
[0047] [方案4]
[0048] 一种核酸，其是源自长雄野生稻的碱基序列，其至少包含由序列号1的 34845-35044所示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性。
[0049] [方案5]
[0050] 根据方案4所述的核酸，其含有由序列号1的33045-35044所示碱基序列构成的 核酸的片段。
[0051] [方案 6]
[0052] 根据方案4或5所述的核酸，其含有由序列号1的26779-35044所示碱基序列构 成的核酸的片段。
[0053] [方案 7]
[0054] -种核酸，其通过使下述核酸可操作地连接而成：
[0055] (1)方案1~6中任一项所述的核酸，以及
[0056] (2)编码（a)~（c)规定的蛋白质的核酸，其中，
[0057] (a)与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80%的同一 性的氨基酸序列；
[0058] (b)含有植物的假应答调节因子蛋白质中假受体结构域的氨基酸序列或与其具有 至少90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质中CCT基序的氨基酸 序列或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且
[0059] (c)具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCA1(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。
[0060][方案8]
[0061] 根据方案7所述的核酸，其能够增大植物的产量。
[0062][方案9]
[0063] 一种载体，其含有方案1~8中任一项所述的核酸。
[0064][方案10]
[0065] 一种转基因植物，其含有方案7或8所述的核酸。
[0066][方案11]
[0067] 根据方案10所述的转基因植物，其中，所述植物为单子叶植物。
[0068][方案12]
[0069] 根据方案11所述的转基因植物，其中，所述植物为稻或玉米。
[0070][方案13]
[0071] 一种制备产量增大的转基因植物的方法，其包括：将方案7或8所述的核酸或方案 9的载体导入植物的工序。
[0072][方案14]
[0073] 根据方案13所述的方法，其中，所述植物为单子叶植物。
[0074][方案15]
[0075] 根据方案14所述的方法，其中，所述植物为稻或玉米。
[0076][方案16]
[0077] -种使植物的产量增大的方法，其包括：将方案7或8所述的核酸导入植物。
[0078][方案17]
[0079] -种用于对产量增加的植物进行筛选的DNA标记物，其含有序列号1的 26779-35044所示碱基序列和/或序列号1的35825-46721所示碱基序列中的15~2000 个碱基。
[0080][方案18]
[0081] 一种方法，其包括：对植物中方案17所述的DNA标记物进行检测，并在检测出该 DNA标记物时将该植物判断为高产性。
[0082][方案19]
[0083] -种方法，其包括：使用含有序列号1的34845-35044所不碱基序列、或与序列号 1的34845-35044所不喊基序列具有至少90%的同一性的喊基序列的核酸来提尚植物基因 的转录活性。
[0084][方案20]
[0085] 一种方法，其包括：使用含有序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或与序列 号1的33045-35044所示的碱基序列具有至少90%的同一性的碱基序列的核酸来提高植物 基因的转录活性。
[0086] [方案 21]
[0087] -种使植物的产量增大的方法，其包括：将可操作地连接的下述（1)及（2)的核酸 导入植物，其中，
[0088] (1)包含下述（a)或（b)规定的碱基序列的核酸：
[0089] (a)序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或包含该碱基序列的一部分构成且 显示促进植物基因转录的活性的片段；或
[0090] (b)与上述（a)所示的碱基序列具有至少90%的同一性且显示促进植物基因转录 的活性的喊基序列；
[0091] (2)编码下述（c)~（e)规定的蛋白质的核酸：
[0092] (c)与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80%的同一 性的氨基酸序列；
[0093] (d)含有植物的假应答调节因子蛋白质中假受体结构域的氨基酸序列或与其具有 至少90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质中CCT基序的氨基酸 序列或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且
[0094] (e)具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCA1(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。
[0095] [方案 22]
[0096] -种核酸，其编码具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质。
[0097] [方案 23]
[0098] -种蛋白质，其具有序列号3所示氨基酸序列。
[0099] [方案 24]
[0100] 一种核酸，其由下述（1)及（2)的核酸可操作地连接而成，其中，
[0101] ⑴包含下述（a)或（b)规定的碱基序列的核酸：
[0102] (a)序列号19所示碱基序列；或
[0103] (b)与序列号19所示的碱基序列具有至少80%的同一性且显示促进植物基因转 录的活性的碱基序列，
[0104] (2)对由下述（c)~（e)规定的蛋白质进行编码的核酸：
[0105] (c)序列号17所示氨基酸序列、或与序列号Y所示氨基酸序列具有至少80%的同 一性的氨基酸序列；
[0106] (d)含有植物的假应答调节因子蛋白质中假受体结构域的氨基酸序列或与其具有 至少90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质中CCT基序的氨基 酸 序列或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且
[0107] (e)具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCA1(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。
[0108] 发明的效果
[0109] 通过将发明的可操作地连接本启动子和PRR7的结构基因而成的构建体导入植 物，可对植物赋予高产性。
【附图说明】
[0110] 图1为表示稻野生种长雄野生稻的染色体部分导入系统"No. 645"的基因型的图。 图1中涂抹的区域为源自长雄野生稻的染色体部分。
[0111] 图2为表示在第7染色体末端部发生重组且最末端以"No. 645"型或"Shiokari" 型固定的7个个体的基因型的图。
[0112] 图3为生长旺盛性基因周边的物理谱图。4个Fosmid克隆和实施例2中制备的7 个构建体（Frl至Fr7)的关系示于该图。
[0113] 图4为表示将Fr4片段导入稻品种"Shiokari"中形成的转化体（Fr4-4)的穗的 照片。图4的左面表示不具有Fr4片段的基因缺失个体，右面表示具有Fr4片段的基因持 有个体。
[0114] 图5为表示导入了以泛素启动子控制的含有源自长雄野生稻的PRR基因的编码区 域的构建体的转化体的穗（左）、和导入了仅含有对照的选择标记物基因的构建体的转化 体的穗（右）的图。左面由于未成熟，因此稻皮是绿色的，右面由于已成熟，因此，稻皮发黄。 另外，左面还可见大幅开颖的未闭颖的颖花（箭头）。
[0115] 图6为表示利用分离的日本晴来源、长雄野生稻来源、高粱来源、及拟南芥来源的 PRR7基因的翻译区域所编码的氨基酸序列的序列对比的图。假受体结构域（红括号）和 CCT基序（蓝括号）参考Takataetal.，（2010)BMCEvolutionaryBiology10:126。
[0116] 图7为表示利用分离的日本晴来源、长雄野生稻来源、高粱来源、及拟南芥 来源的PRR7基因的翻译区域所编码的氨基酸序列的同一性（identity) %和相似性 (similarity) %的值的图。使用基因分析软件Genetyx(注册商标）网络版ver. 11. 0. 4(株 式会社Genetyx)以默认设定（将Unitsizetocompare设定为2)实行Proteinvs ProteinGlobalHomology，由此求出同一性（identity) %和相似性（similarity) %。
[0117] 图8为将制备⑴含有源自长雄野生稻的PRR基因的构建体和（2)含有源自日本 晴的PRR基因的构建体的策略图解的图。
[0118] 图9中，图9A表示源自长雄野生稻的PRR基因的PCR产物被HpyCH4V切断。图 9B表示使用将"日本晴"、长雄野生稻的PRR基因通过杂交导入了 "Shiokari"的取代系统 "No. 240"及使用"日本晴"和"No. 240"的F1并利用PCR分析PRR基因的表达而得到的结 果。
[0119] 图10表示导入了源自长雄野生稻的Fr4片段的玉米转化体的T1系统No. 4的穗 的照片。图10的上列表示不具有Fr4片段的基因缺失个体，图10的下列表示具有Fr4片 段的基因持有个体。
[0120] 图11表示导入了含有长雄野生稻的PRR启动子和长雄野生稻的PRR基因的构建 体的玉米转化体T1系统No. 11的穗的照片。图11的R表示潮霉素抗性的基因缺陷个体， S表示潮霉素敏感性的基因保持个体。
[0121] 图12表示评价长雄野生稻的PRR启动子对GUS基因的转录活性带来的效果的实 验中使用的GUS基因表达载体的结构的图。
[0122] 图13为以长雄野生稻的PRR启动子区域的200碱基（P200)或2000碱基（P2000) 的核酸和GUS基因编码区域的连接构建体进行了转化的稻中，对GUS基因的转录活性促进 进行了评价的、RT-PCR分析的照片。G表示基因组DNA，-表示没有逆转录反应，+表示有逆 转录反应，P表示质粒DNA。
[0123] 图14为表示光周期开始后0小时和6小时长雄野生稻的PRR基因的相对表达量 的图。
【具体实施方式】
[0124] 以下，对本发明的构成具体地进行说明。
[0125] (1)源自长雄野生稻的PRR7基因的启动子
[0126] 本发明人等如下述实施例所示从长雄野生稻的Fosmid文库中选择位于有关高产 性的（长雄野生稻的）第7染色体末端部的4个Fosmid克隆（Fosl、Fos2、FoslO、Fosl2)， 通过引物步移解码该编码的碱基序列。将得到的碱基序列示于序列号1。
[0127] 使用上述4个Fosmid克隆制备了 7个互补性试验用构建体，将利用Smal及PstI 对FoslO进行处理而得到的最大的片段与利用PstI及SacI对Fosl进行处理而得到的第 4大的片段连接而成的片段为片段（Fr) 4。Fr4为与高产性有关的基因组片段，含有序列号 1的第26779位的碱基至第49155位的碱基。
[0128] 源自作为稻野生种的长雄野生稻的PRR7基因的启动子（以下，称为"本发明的启 动子"）为含有序列号1的34845-35044所不的碱基序列的核酸，优选为含有序列号1的 33045-35044所示的碱基序列的核酸，进一步优选为含有序列号1的26779-35044所示的碱 基序列的核酸。
[0129] 在本申请说明书中，"启动子"是指：具有对相邻下游存在的任意植物的结构基因 的转录进行活化的功能的核酸。本申请说明书中的"启动子"是以广义的含义进行解释的 启动子，并不限定于转录因子结合并具有引导正确的转录开始作用的核心启动子区域等狭 义的含义。本发明的启动子并不仅限于PRR基因的编码区域，具有促进各种植物的任意结 构基因的转录活性的作用。即，本发明含有在植物的任意结构基因上可操作地连接了本发 明的启动子的核酸。该核酸优选不是天然来源的基因组片段。
[0130]另外，本申请说明书中促进结构基因的转录活性的作用包含通过光等刺激诱导而 促进结构基因的转录活性，由此调节或控制该活性的实施方式。在此，启动子通过光的刺激 而被诱导，从而促进结构基因的转录活性是指：在光存在的光周期，启动子促进结构基因的 转录活性，但在其以外的时期启动子不会促进结构基因的转录活性。
[0131] 本发明的启动子为含有序列号1的34845-35044所示的碱基序列的核酸，优选 为含有序列号1的33045-35044所示的碱基序列的核酸，进一步优选为含有序列号1的 26779-35044所示的碱基序列的核酸。另外，本发明的启动子并不限定于这些核酸，还包含 与这些核酸具有一定以上序列同一性的核酸及这些核酸的片段，下面对其进行叙述。
[0132] 通过将该启动子与PRR7基因可操作地连接并导入植物，可对植物赋予高产性。 即，本发明的启动子优选在与编码具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质的核酸可操作地 连接时能够增大植物的产量。
[0133] 本申请说明书中的PRR7蛋白质的定义记载在下述（2)"本发明的启动子和PRR的 结构基因可操作地连接的核酸"中。
[0134] 在本申请说明书中，"高产性"是指植物的总重量、地上部分重量、产量、茎径、茎 数、杆长、叶面积、叶数、穗数、一穗粒数、穗长、总穗重、或种子产量等中的一部分或多种增 大，优选是指总穗重和/或种子产量增大，更优选是指成熟种子产量增加。在稻、玉米等谷 物中，成熟种子产量为非常重要的性状。作为增大的指标，例如可通过与对照植物（亲本植 物、非转化体等）比较而进行评价。另外，在本申请说明书中，"高产性"和"生长旺盛性"表 不相同的含义。
[0135] 在序列号1中，与26779-35044对应的序列为长雄野生稻的PRR7基因的启动子 区域，与35825-46721对应的序列为长雄野生稻的PRR7基因的编码区域，与46722-49157 对应的序列为长雄野生稻的PRR7基因的终止子区域。上述启动子区域中，序列号1的 34845-35044所示的碱基序列与转录起始点的上游区域200个碱基对应，序列号1的 33045-35044所示的碱基序列与转录起始点的上游区域2000个碱基对应。
[0136] 本发明的启动子的碱基序列并不限定于序列号1的34845-35044所示的序列、序 列号1的33045-35044所示的序列、或者序列号1的26779-35044所示的序列，还包含含有 与这些碱基序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%、99%、或者99. 5%的同一性，且显 示促进植物的编码区域的转录的活性的碱基序列的核酸。
[0137] 在其它方面，本发明的启动子为源自长雄野生稻的碱基序列，含有至少由序列号1 的34845-35044表示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性的核酸。在这样的核酸 中，优选含有由序列号1的33045-35044所示的碱基序列构成的核酸的片段，进一步含有由 序列号1的26779-35044所示的碱基序列构成的核酸的片段。在此，核酸的片段是指通过 序列号1的上述特定的碱基编号规定范围的碱基序列的一部分的核酸。虽然没有限定，但 具体而言包含由序列号1的26779-35044得到的更短的序列、即与转录起始点的上游区域 6000个碱基对应的序列、与5000个碱基对应的序列、与4000个碱基对应的序列、与3000个 碱基对应的序列、与2000个碱基或者1000个碱基对应的序列等。
[0138] 2个核酸序列的同一性％可通过视觉检查和数学计算确定，或更优选该比较通过 使用计算机程序对序列信息进行比较来进行。代表的优选计算机程序为遗传学计算机小组 (GCG;麦迪逊，威斯康星州）的威斯康星.软件包10.0程序"GAP"(theGeneticsComputer Program(GCG；Madison,ffis.)WisconsinPackageVersion10. 0Program,GAP)(Devereux 等，1984,Nucl.AcidsRes.，12:387)。通过使用该"GAP"程序，除了对2个核酸序列进行 比较之外，还可以进行2个氨基酸序列的比较、核酸序列和氨基酸序列之间的比较。在此， "GAP"程序的优选默认参数可以使用：（1)对核苷酸的（包括对于同一物为1，对于非同一 物为〇的值）一元（unary)比较矩阵的GCG运行、和如khwartz和Dayhoff修订"多肽的 序列和结构图谱（AtlasofPolypeptideSequenceandStructure)"国立生物医学研宄财 团，353-358 页，1979 年所记载的Gribskov和Burgess，Nucl.AcidsRes.，14 卷：6745 页， 1986年的加权氨基酸比较矩阵；或其它可比较的比较矩阵；（2)对氨基酸各缺口的30个罚 分和对各空位中的各记号追加的1个罚分；或对核苷酸序列的各缺口的50个罚分和对各空 位中的各记号追加的3个罚分；(3)对末端缺口无罚分；及（4)对长缺口无最大罚分。在本 领域技术人员所使用的其它序列比较程序中，可以使用例如可以通过美国国立医学图书馆 的网站：
[0139]http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html使用的BLASTN程序、 版本2. 2. 7、或UW-BLAST2. 0算法。对UW-BLAST2. 0的标准默认常数的设定在以下互联网 网址：http://blaSt.wustl.edu记载。并且，BLAST算法使用带有BL0SUM62氨基酸评分 的矩阵，可以使用的选择参数如下所述：(A)包括用于掩码下述片段的滤波器：具有低组 成复杂性的查询序列的片段（根据Wootton和及Federhen的SEG程序（Computersand Chemistry，1993年）进行确定；也可参考Wootton及Federhen，1996年"序列数据库中 的组分偏移区域的分析（Analysisofcompositionallybiasedregionsinsequence datebases)〃MethodsEnzymo1.，266卷：544_571页。）、或含有短周期性的内部重复构成 的片段（根据Claverie和States(ComputersandChemistry,I"3)的XNU程序进行确 定）；及⑶用于报告对碱基序列的匹配的统计学显著性的阈值，或E-评分（按照（Karlin 和AltSchul，1990年）的统计学模型，单纯通过偶然发现的匹配的期待确率；当起因于某 个匹配的统计学显著差异比E-评分阈值大时，不报告该匹配），优选E-评分阈值的数值 为 0. 5,或按照优选程度递增的顺序为 0. 25、0. 1、0. 05、0. 01、0. 001、0. 0001、le-5、le-10、 le-15、le-20、le-25、le-30、le-40、le-50、le-75、或Ie-100〇
[0140] 本发明的启动子的突变体也可以为含有在严谨条件下与序列号1的34845-35044 所示的碱基序列、优选序列号1的33045-35044所示的碱基序列、进一步优选序列号1的 26779-35044所示的碱基序列的互补链杂交的碱基序列而成的核酸，即具有启动子活性的 核酸。
[0141] 在此，"严谨条件下"是指在中度或高度的严谨条件下进行杂交。具体而言，关于 中度严谨条件，基于例如DNA长度，掌握常规技术的该领域技术人员能够容易地确定。基本 条件如Sambrook等，分子克隆：实验室指南（MolecularCloning:ALaboratoryManual), 第3版，第6章，冷泉港实验室出版社（ColdSpringHarborLaboratoryPress), 2001中 所示，例如包括下述条件的使用：5XSSC、0. 5%SDS、1.0mMEDTA(pH8. 0)的预清洗溶液、约 42°C下的约 50% 的甲酰胺、2XSSC~6XSSC优选 5XSSC~6XSSC、0. 5%SDS(或约 42°C 下的约50%甲酰胺中的、Stark's溶液等其它同样的杂交溶液）的杂交条件，及例如在约 50°C-68°C、0. 1XSSC~6XSSC、0. 1%SDS的清洗条件。优选中度严谨条件包括约50°C、 6XSSC、0.5%SDS(及清洗条件）。
[0142] 关于高度严谨条件，基于例如DNA长度，本领域技术人员也能够容易地确定。通 常，这样的条件包括比中度严谨条件更高温度和/或更低盐浓度的杂交（例如含有〇. 5% 左右的SDS、约65°C，6XSSC~0? 2XSSC，优选6XSSC、更优选2XSSC、更优选0? 2XSSC 或者0.IXSSC的杂交）和/或清洗，例如可定义为如上所述的杂交条件及伴随约65°C~ 68°C、0. 2XSSC~0. 1XSSC、0. 1%SDS的清洗。关于杂交及清洗的缓冲液，可以使用 SSPE(1XSSPE为0.15MNaCl、10mMNaH2P04以及1.25mMEDTA，pH7.4)代替SSC(1XSSC 为0. 15MNaCl及15mM柠檬酸钠），在杂交结束后15分钟~1小时左右进行清洗。
[0143]另外，也可使用探针中未使用放射性物质的市售杂交试剂盒。具体而言，可以举 出：使用ECLdirectlabeling&detectionsystem(Amersham株式会社制造）进行的杂交 等。作为严谨的杂交，例如可以举出：向试剂盒的杂交缓冲液中加入5% (w/v)的封闭试剂， 使NaCl达到0. 5M，在42°C进行4小时杂交，清洗在0. 4%SDS、0. 5XSSC中以55°C清洗两 次，每次20分钟，在2XSSC中，室温条件下，清洗一次5分钟。
[0144] (2)本发明的启动子和PRR7结构基因可操作地连接而成的核酸
[0145] 本发明为含有本发明的启动子与编码植物的PRR7蛋白质的碱基序列的核酸（即 PRR7结构基因）可操作地连接而成的核酸。在此所谓的本发明的启动子为在上述（1)源 自"长雄野生稻的PRR7基因的启动子"项中记载的启动子。通过将本发明的启动子与PRR7 的结构基因可操作地连接而成的上述核酸导入植物，可对植物赋予高产性。在下述实施例 中，实际上显示通过导入由序列号1的26779-35044所示的碱基序列构成的本发明的启动 子与PRR7的结构基因可操作地连接而成的核酸，植物变为高产性。适宜选择由序列号1的 26779-35044得到的更短的序列、即与转录起始点的上游区域6000个碱基对应的序列、与 5000个碱基对应的序列、与4000个碱基对应的序列、与3000个碱基对应的序列、与2000个 碱基或者1000个碱基对应的序列等作为启动子，而使用其对植物赋予高产性为可由本领 域技术人员基于本申请说明书中所公开的见解容易地进行的事项。即，本领域从业人员基 于本申请说明书的记载，使这样的序列与编码具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质的核 酸可操作地连接，并对导入其的植物的产量进行确认，由此可容易地选择。如上所述可对植 物赋予高产性的核酸优选为使本发明的启动子和PRR7的结构基因结合而成的核酸，本发 明的启动子具有下述活性：通过利用光等刺激诱导而促进结构基因转录的活性，由此对该 活性进行调节或控制。
[0146] 本申请说明书中"可操作地连接"是指：本发明的启动子的核酸与PRR7的结构基 因的核酸以使启动子能够发挥促进结构基因的转录活性这样的启动子活性的功能的方式 进行结合。
[0147] 本申请说明书中"PRR7蛋白质"是指满足以下条件的蛋白质。
[0148] (a)具有序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列的蛋白质
[0149] 本说明书中的PRR7蛋白质为具有序列号3所不氣基酸序列或序列号5所不氣基 酸序列的蛋白质。源自长雄野生稻的PRR7蛋白质由序列号3所示的740个氨基酸构成，由 序列号2所示的碱基序列的核酸进行编码。源自日本晴的PRR7蛋白质由序列表的序列号 5所示的742个氨基酸构成，由序列号4所示的碱基序列的核酸进行编码。
[0150] 本说明书中的PRR7蛋白质并不限定于含有序列号3或序列号5所示氨基酸序列 的蛋白质，包含具有下述氨基酸序列的蛋白质：与序列号3或序列号5所示氨基酸序列具有 至少 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、或者 99% 的同一性。
[0151] 另外，本说明书中的PRR7蛋白质包含具有下述氨基酸序列的蛋白质：与序列号3 或序列号5所示氨基酸序列具有至少90%、95%、97 %或者99 %的相似性。
[0152] 在本申请说明书中，氨基酸序列的相似性％是指：考虑了氨基酸的不同的蛋白质 间的相似性的程度。即，进行后述的氨基酸的保守取代等时，看作为相似的氨基酸而求出的 值为相似性％。
[0153] (b)含有PR结构域和CCT基序的蛋白质
[0154] 本申请说明书中的PRR7蛋白质为含有PR结构域和CCT基序的蛋白质。已知PRR 蛋白质与植物的昼夜节律时钟相关，普遍存在于植物中。PRR蛋白质含有高度保守的假受 体（pseudo_receiver:PR)结构域和CCT基序。已知PR结构域为PRR蛋白质的共同基序， 具有蛋白质的相互作用能力。另外，CCT基序富有碱性，认为参与蛋白质间的结合。PRR7蛋 白质为PRR蛋白质之一，含有PR结构域和CCT基序。
[0155]PR结构域在序列号3的氨基酸序列中相当于氨基酸编号62~176,在序列号5的 氨基酸序列中相当于氨基酸编号62~176。并且，CCT基序在序列号3的氨基酸序列中相 当于氨基酸编号676~722,在序列号5的氨基酸序列中相当于氨基酸编号678~724。因 此，在本申请说明书中，PR结构域是指相当于序列号3的氨基酸序列的氨基酸编号62~ 176的氨基酸序列。并且，在本申请说明书中，CCT基序是指相当于序列号3的氨基酸序列 的氨基酸编号676~722的氨基酸序列的氨基酸序列。但是，在本申请说明书中，PRR7蛋白 质的PR结构域和CCT基序的氨基酸序列并不限定于上述PR结构域和CCT基序，还包含与 这些氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%或者99%的同一性的氨基酸序列。
[0156]在PR结构域的氨基酸序列中，优选序列号3的氨基酸编号64的缬氨酸（Val)、66 的亮氨酸（Leu)、67的缬氨酸（Val)、70的天 冬酰胺酸（Asp)、71的天冬胺酸（Asp)、73的苏 氨酸（Thr)、74的精氨酸（Arg)、77的缬氨酸（Val)、79的丙氨酸（Ala)、80的亮氨酸（Leu)、 81的亮氨酸（Leu)、82的精氨酸（Arg)、84的半胱氨酸（Cys)、86的酪氨酸（Tyr)、87的谷氨 酸（Glu)、88的缬氨酸（Val)、91的丙氨酸（Ala)、93的天冬酰胺（Asn)、94的甘氨酸（Gly)、 97的丙氨酸（Ala)、98的色氨酸（Trp)、101的亮氨酸（Leu)、102的谷氨酸（Glu)、103的天冬 胺酸（Asp)、106的天冬酰胺（Asn)、108的异亮氨酸（lie)、109的天冬酰胺酸（Asp)、111的 缬氨酸（Val)、112的亮氨酸（Leu)、113的苏氨酸（Thr)、114的谷氨酸（Glu)、115的缬氨酸 (Val)、117的蛋氨酸（Met)、118的脯氨酸（Pro)、121的丝氨酸（Ser)、122的甘氨酸（Gly)、 123的异亮氨酸（lie)、125的亮氨酸（Leu)、126的亮氨酸（Leu)、129的异亮氨酸（lie)、 132的组氨酸（His)、138的异亮氨酸（lie)、139的脯氨酸（Pro)、140的缬氨酸（Val)、141 的异亮氨酸（lie)、142的蛋氨酸（Met)、143的蛋氨酸（Met)、144的丝氨酸（Ser)、145的丝 氨酸（Ser)、147的天冬胺酸（Asp)、149的蛋氨酸（Met)、152的缬氨酸（Val)、153的苯丙氨 酸（Phe)、154的赖氨酸（Lys)、155的半胱氨酸（Cys)、156的亮氨酸（Leu)、157的丝氨酸 (Ser)、158的赖氨酸（Lys)、159的甘氨酸（Gly)、160的丙氨酸（Ala)、161的缬氨酸（Val)、 162的天冬胺酸（Asp)、163的苯丙氨酸（Phe)、164的亮氨酸（Leu)、165的缬氨酸（Val)、 166的赖氨酸（Lys)、167的脯氨酸（Pro)、169的精氨酸（Arg)、170的赖氨酸（Lys)、171的 天冬酰胺（Asn)、172的谷氨酸（Glu)、173的亮氨酸（Leu)、174的赖氨酸（Lys)、176的亮氨 酸（Leu)的氨基酸残基未被取代而保存。在本申请说明书中，将这些氨基酸残基称为"假受 体（PR)结构域保守氨基酸"。
[0157] 在PR结构域的氨基酸序列中，进一步优选除上述的"假受体（PR)结构域保守氨 基酸"以外，序列号3的氨基酸编号68的谷氨酸（Glu)、72的丝氨酸（Ser)、75的谷酰胺 (Gin)、76的缬氨酸（Val)、78的丝氨酸（Ser)、89的异亮氨酸（lie)、90的脯氨酸（Pro)、92 的谷氨酸（Glu)、100的酪氨酸（Tyr)、105的谷酰胺（Gin)、110的亮氨酸（Leu)、127的丝氨 酸（Ser)、134的异亮氨酸（lie)、135的半胱氨酸（Cys)、136的赖氨酸（Lys)、146的天冬酰 胺（Asn)、175的天冬酰胺（Asn)的氨基酸残基也未被取代而保存。另外，关于氨基酸编号 68的谷氨酸（Glu)，也可以为序列号5的氨基酸编号68的天冬胺酸（Asp)。另外，在PR结 构域的氨基酸序列中，进一步优选除上述的"假受体（PR)结构域保守氨基酸"以外，序列号 3的氨基酸编号62的异亮氨酸（lie)、65的亮氨酸（Leu)、96的谷酰胺（Gin)、131的天冬酰 胺（Asn)、137的天冬酰胺（Asn)、150的甘氨酸（Gly)、168的异亮氨酸（lie)的氨基酸残基 也未被取代而保存。
[0158]在CCT基序的氨基酸序列中，优选序列号3的氨基酸编号676的谷酰胺（Gin)、 678的谷氨酸（Glu)、682的丙氨酸（Ala)、683的丙氨酸（Ala)、686的赖氨酸（Lys)、687的 苯丙氨酸（Phe)、688的精氨酸（Arg)、690的赖氨酸（Lys)、691的精氨酸（Arg)、692的赖 氨酸（Lys)、694的精氨酸（Arg)、696的苯丙氨酸（Phe)、698的赖氨酸（Lys)、699的赖氨酸 (Lys)、700的缬氨酸（Val)、701的精氨酸（Arg)、702的酪氨酸（Tyr)、703的谷酰胺（Gin)、 704的丝氨酸（Ser)、705的精氨酸（Arg)、706的赖氨酸（Lys)、708的亮氨酸（Leu)、709的 丙氨酸（Ala)、710的谷氨酸（Glu)、711的谷酰胺（Gin)、712的精氨酸（Arg)、713的脯氨酸 (Pro)、714的精氨酸（Arg)、715的缬氨酸（Val)、716的精氨酸（Arg)、717的甘氨酸（Gly)、 718的谷酰胺（Gln)、719的苯丙氨酸（Phe)、720的缬氨酸（Val)、721的精氨酸（Arg)的氨 基酸残基未被取代而保存。在本申请说明书中，将这些氨基酸残基称为"CCT基序保守氨基 酸"。
[0159] 另外，在CCT基序的氨基酸序列中，进一步优选除上述的"CCT基序保守氨基酸"以 外，序列号3的氨基酸编号677的谷酰胺（Gin)、氨基酸编号695的天冬氨酸（Asn)、697的 甘氨酸（Gly)、707的精氨酸（Arg)、722的谷酰胺（Gin)的氨基酸残基也未被取代而保存。 另外，关于氨基酸编号677的谷氨酸（Glu)，也可以为序列号5的氨基酸编号679的精氨酸 (Arg)。另外，在CCT基序的氨基酸序列中，进一步优选除上述的"CCT基序保守氨基酸"以 外，序列号3的氨基酸编号689的谷氨酰胺（Gin)、693的谷氨酸（Glu)的氨基酸残基也未 被取代而保存。
[0160] 本申请说明书中的与PR结构域具有同一性的氨基酸序列可以保持PR结构域保守 氨基酸，且在PR结构域的氨基酸序列中，未对PR结构域保守氨基酸以外的氨基酸进行修 饰。
[0161] 本申请说明书中的与CCT基序具有同一性的氨基酸序列可以保持CCT基序保守氨 基酸，且在CCT基序氨基酸序列中，未对CCT基序保守氨基酸以外的氨基酸进行修饰。
[0162] 这些氨基酸的修饰可以为氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加。另外，氨基酸的 取代也可以为保守取代，其对特定的氨基酸残基利用具有类似的物理化学特性的残基进行 取代。保守取代的非限定性的例子包含Ile、Val、Leu或Ala互相的取代这样的含有脂肪族 基团的氨基酸残基之间的取代、Lys及Arg、Glu及Asp、Gin及Asn相互的取代这样的极性 基团残基之间的取代等。
[0163] (c)具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCA1(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性
[0164] 本发明人等发现，位于长雄野生稻的第7染色体末端，且具有序列号2所示碱基序 列的PRR基因、及位于"日本晴"的第7染色体末端，且具有序列号4所示碱基序列的PRR 基因（0sPRR37)为与高产性有关的基因。这些PRR蛋白质被归类为PRR7,PRR7蛋白质具 有对LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCA1(CircadianClock-Associated1)基 因转录进行抑制的活性。即，在申请说明书中，PRR7蛋白质具有抑制LHY(LateElongated Hypocotyl)基因及CCA1(CircadianClock-Associated1)基因的转录的活性。
[0165] 如下述的实施例所示通过使由源自长雄野生稻的PRR7的启动子与源自日本晴的 PRR7结构基因可操作地连接而成的核酸导入植物，可增大植物的产量，即对该植物赋予高 产性。因此，在得到本发明的效果时，本发明的源自长雄野生稻的PRR7的启动子发挥重要 的作用。
[0166] 并且，本发明为如下得到的核酸：将与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨 基酸序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或者99%的同一性的氨 基酸序列、且编码在与源自长雄野生稻的PRR7基因的启动子可操作地连接时具有增大植 物产量的活性的蛋白质进的核酸与源自长雄野生稻的PRR7基因的启动子可操作地连接而 成。将该核酸导入植物也可对植物赋予高产性。在本发明的优选的实施方式中，这样的核 酸可以对含有PR结构域和CCT基序的蛋白质进行编码、和/或对具有对LHY基因及CCA1 基因的转录进行抑制的活性的蛋白质进行编码。另外，该核酸可用作下述（3)~（6)中记 载的本发明的核酸。
[0167] (3)载体，其含有本发明的启动子或者含有将本发明的启动子与PRR7结构基因可 操作地连接而成的核酸
[0168] 本发明为单独含有本发明的启动子的载体、或者含有本发明的启动子与含有编码 PRR7蛋白质的碱基序列的核酸（PRR7的结构基因）可操作地连接而成的核酸的载体。这样 的载体用于对植物赋予高产性。
[0169] 并且，本发明为下述载体在对植物赋予高产性的用途：含有本发明的启动子与含 有对PRR7蛋白质进行编码的碱基序列的核酸（PRR7的结构基因）可操作地连接而成的核 酸。
[0170] 载体可简单地通过利用常规方法将期望的基因连接于本领域中可获得的重组用 载体来制备。在使用本发明的核酸对植物赋予高产性的情况下，植物转化用载体特别有用。 本发明中所使用的载体只要用于在植物细胞中实现本发明的目标效果就没有特别限定，例 如可以使用pBI系的载体、pBluescript系的载体、pUC系的载体等。作为pBI系的载体， 例如可以举出：pBI121、pBIlOl、pBIlOl. 2、pBIlOl. 3、pBI221等。从能够经由土壤杆菌向 植物导入目标DNA的方面考虑，优选pBI系的载体等双元载体。另外，作为pBluescript 系的载体，例如可以举出：pBluescriptSK(+)、pBluescriptSK(-)、pBluescriptII KS(+)、pBluescriptIIKS(-)、pBluescriptIISK(+)、pBluescriptIISK(-)等。作 为pUC系的载体，可以举出：pUC19、pUC119等。从能够向植物直接导入DNA的方面考虑， 优选pBluescript系的载体、pUC系载体。并且，也可优选使用pGreen系列（www.pgreen. ac.uk)、pCAMBIA系列（www.cambia.org)等双元载体或pSBll(Komarietal, 1996,Plant J，10:165-174)、pSB200(Komorietal, 2004,PlantJ, 37:315-325)等超级双元载体。
[0171]另外，上述载体优选包含含有转录产物的稳定化所需的多聚腺苷酸化位点的转录 终止子序列。该领域从业人员可适当地选择转录终止子序列。
[0172] 转录终止子序列只要具有作为转录终止部位的功能就没有特别限定，也可以为公 知的序列。例如可优选使用胭脂碱合成酶基因的转录终止区域（Nos终止子）、花椰菜花叶 病毒35S的转录终止区域（CaMV35S终止子）等。在上述重组表达载体中，通过将转录终止 子序列配置于适当的位置，可以在导入于植物细胞后对不必要地合成较长转录物的现象等 的发生进行防止。
[0173] 另外，上述重组表达载体中也可以进一步含有其它的DNA片段。该其它的DNA片 段没有特别限定，可以举出：转化体筛选标记物、增强子、用于提高翻译效率的碱基序列等。 另外，上述重组表达载体也可以进一步具有T-DNA区域。特别是在使用土壤杆菌将上述重 组表达载体导入植物体的情况下，T-DNA区域可提高基因导入的效率。
[0174] 作为转化体筛选标记物，例如可以使用药物抗性基因。作为这种药物抗性基因的 一个具体例子，例如可以举出：针对潮霉素、博来霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等的药 物抗性基因（对抗生素卡那霉素或庆大霉素为抗性的新霉素磷酸转移酶基因、对潮霉素为 抗性的潮霉素磷酸转移酶基因）。另外，也可利用对除草剂膦丝菌素为抗性的草铵膦乙酰转 移酶基因等。由此，通过对在含有上述抗生素或除草剂的培养基中生长的植物体进行选择， 可容易地筛选进行了转化的植物体。
[0175] 作为用于提高翻译效率的碱基序列，例如可以举出：源自烟草花叶病毒的omega 序列。通过将该omega序列配置于启动子的非翻译区域（5'UTR)，可提高上述融合基因的 翻译效率。
[0176] 另外，作为增强子，可以举出含有CaMV35S启动子内的上游侧的序列的增强子区 域。如上所述，在上述重组表达载体中，可以根据其目的而含有各种DNA片段。
[0177] 关于重组表达载体的构建方法也没有特别限定，只要在适宜选择的作为母体的载 体中以指定顺序导入本发明的启动子、PRR7的结构基因、及终止子序列、以及根据需要的上 述其它DNA片段即可。为了将上述基因插入作为母体的载体，可使用依据常规方法将提纯 的基因的DNA以适当的限制酶切断，并插入于适当的载体DNA的限制酶部位或多克隆位点 的方法等（例如，分子克隆（MolecularCloning) ,5. 61-5. 63)〇
[0178] 对本领域从业人员而言，可通过一般的基因工程技术适宜制备具有期望基因的载 体。通常，可通过利用市售的各种载体来容易地制备。
[0179] (4)导入了本发明的启动子和PRR7的结构基因的转基因植物
[0180] 并且，本发明为一种将含有本发明的启动子与含有编码PRR7蛋白质的碱基序列 的核酸（PRR7的结构基因）可操作地连接而成的核酸导入植物的转基因植物。上述核酸通 常被插入于适当的载体，导入于作为转化对象的植物细胞中。即，本发明提供一种持有上 述核酸或重组表达载体的植物细胞（转基因植物）。上述植物细胞包含各种形态的植物细 胞、例如悬浮培养细胞、原生质体、植物体中的细胞。另外，作为本发明的转化体，不仅包含 植物细胞，还包含植物体整体、植物器官（例如根、茎、叶、花瓣、种子、果实、成熟胚、未成熟 胚、胚珠、子房、苗端、花药、花粉等）、植物组织（例如表皮、韧皮部、软组织、木质部、维管束 等）、它们的切片、愈伤组织、芽原基、多芽体、毛状根及培养根等中的任一者。
[0181] 作为在宿主细胞内使上述基因表达的方法，可以举出：将上述基因导入适当的 载体，例如通过聚乙二醇法、土壤杆菌法、脂质体法、阳离子脂质体法、磷酸钙沉淀法、电 脉冲穿孔法（电穿孔）（CurrentprotocolsinMolecularBiologyedit.Ausubelet &1.(1987)?油11811.了〇111111167&5〇118.56(^1〇119.1-9.9)、脂质体介导法（6180)-8虬株式 会社制造）、微注射法、基因枪法等本领域从业人员公知的方法导入生物体内的方法。在本 发明中，可优选使用土壤杆菌法。在向植物体内导入本发明的基因的情况下，基因也可使用 微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法等直接导入植物细胞，但也可以组入用于向植物导入基因 的质粒并将其作为载体，经由具有植物感染能力的病毒或者细菌，间接地导入植物细胞。作 为这种病毒，例如作为代表性的病毒，可以举出：花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、双生病毒 群等，作为细菌，可以举出土壤杆菌等。在通过土壤杆菌法进行向植物的基因导入的情况 下，可以使用市售的质粒。
[0182] 另外，本发明不仅包含直接导入了上述核酸或载体的植物细胞，还包含使植物细 胞生长而成的植物体、该植物的后代、子孙或克隆的植物以及繁殖材料（例如种子、果实、 切穗、块茎、块根、植株、愈伤组织、原生质体等）。原子转基因植物细胞的植物体的再生可以 根据植物细胞的种类使用本领域从业人员公知的方法来进行。上述技术已经确立，并广泛 应用于本发明的技术领域，在本发明中，可优选使用上述方法。
[0183] 对转化的植物细胞进行再分化而再生植物体的方法根据植物细胞的种类而不 同，例如，若为稻，则可以举出：Fujimura等（PlantTissueCultureLett.2:74(1995)) 的方法，若为玉米，贝丨」可以举出：Shillito等（Bio/Technology7:581(1989))的方法和 Gorden-Kamm等（PlantCell2:603(1990))的方法。通过上述方法再生，且栽培的转基因 植物体中所导入的外来基因的存在可通过如下操作进行确认：通过公知的PCR法或DNA杂 交法对植物体中的DNA的碱基序列进行分析。此时，DNA自转基因植物体的提取可依据公 知的J.Sambrook等的方法（分子克隆（MolecularCloning)、第2版、冷泉港实验室出版社 (ColdSpringHarborLaboratoryPress)，1989)实施。
[0184]例如，在使用PCR法对在再生的植物体中存在的本发明的基因进行分析的情况 下，以如上所述从再生植物体中提取的DNA作为模板进行扩增反应。另外，也可以使用具有 依据本发明的基因或者经修饰的基因的碱基序列而进行了适当选择的碱基序列而合成的 寡核苷酸作为引物，在混合了它们的反应液中进行扩增反应。在扩增反应中，若反复进行几 十次DNA的改性、退火、延伸反应，则可得到含有本发明的基因的碱基序列的DNA片段的扩 增产物。若将含有扩增产物的反应液供于例如琼脂糖电泳，则可使所扩增的各种DNA片段 分级，并对该DNA片段与本发明的基因对应情况进行确认。
[0185] 若一旦得到在基因组内导入有本发明的基因的转基因植物体，则可由该植物体通 过有性繁殖或无性繁殖得到子代。另外，也可以由该植物体或其子代或者克隆得到繁殖材 料，并以它们为基础批量生产该植物体。本发明中包含导入有本发明的基因或重组表达载 体的植物细胞、含有该细胞的植物体、该植物体的子代及克隆以及该植物体、其子代、及克 隆的繁殖材料。即，本发明中包含作为实施了转化处理的再分化一代的"T0代"、作为T0代 的植物的自体受精种子的"n代"等后代植物、及以它们作为一个亲本进行杂交而得到的杂 种植物或其后代植物。
[0186] 如上制备的植物体与通常的植物相比，可期待具有高产性这样的有利的特性。用 作本发明中进行转化的对象植物没有特别限定，可通过本发明的方法制备具有高产性的各 种转基因植物。
[0187] 在本发明的优选的实施方式中转化的植物为被子植物，优选为单子叶植物，进一 步优选为稻、玉米、高粱，最优选为稻和玉米。另外，本发明的优选实施方式中进行了转化的 植物为短日照植物。
[0188] 在下述的实施例中，示出制备导入了本发明的启动子和源自长雄野生稻的PRR结 构基因的转化玉米。
[0189] (5)制备使用本发明的启动子和PRR7的结构基因使产量增大的转基因植物的方 法
[0190] 并且，本发明为一种制备使产量增大的转基因植物的方法，其包括：将下述核酸导 入植物的工序：所述核酸是将本发明的启动子和含有编码PRR7蛋白质的碱基序列的核酸 (PRR7的结构基因）可操作地连接而成的。更具体而言，制备本发明的启动子序列和编码 PRR7蛋白质的的核酸（PRR7的结构基因）可操作地连接而成的核酸，并将所述核酸导入植 物细胞，由导入有核酸的上述植物细胞再生植物体，由此可制备使产量增大的转基因植物。 作为用于导入核酸的植物材料，例如可以举出：根、茎、叶、种子、成熟胚、未成熟胚、胚珠、子 房、苗端、花药、花粉等植物组织或其切片、细胞、愈伤组织、对其进行酶处理而除去了细胞 壁的原生质体等植物细胞，可优选使用成熟胚或未成熟胚。制备本发明的转基因植物的方 法没有特别限定，可以使用本技术领域中一般使用的各种植物的转化方法。例如可适宜使 用上述（4)中记载的转化方法。
[0191] 在本发明的优选实施方式中转化的植物为被子植物，优选为单子叶植物，进一步 优选为稻、玉米、高粱，最优选为稻和玉米。另外，本发明的优选的实施方式中转化的植物为 短日照植物。在下述的实施例中，示出通过将本发明的启动子和源自长雄野生稻的PRR结 构基因导入玉米，可对玉米赋予高产性。
[0192] (6)使植物的产量增大的方法
[0193] 并且，本发明为一种使植物的产量增大的方法，其包括：使核酸导入植物，所述核 酸通过使含有本发明的启动子序列和编码PRR7蛋白质的碱基序列的核酸（PRR7的结构基 因）可操作地连接而成。通过上述（2)中叙述的核酸导入植物，可增大植物的产量。本方法 中使用的PRR7蛋白质满足上述（2)中所规定的PRR7蛋白质的定义。即为与序列号3所示 氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 97 %、或者99 %的同一性的氨基酸序 列，含有PR结构域和CCT基序，且具有抑制LHY基因及 CCA1基因转录的活性的蛋白质。与PR结构域具有同一性的氨基酸序列可以保持PR结构域 的保守氨基酸，且在PR结构域的氨基酸序列中，未对PR结构域保守氨基酸以外的氨基酸进 行修饰。与CCT基序具有同一性的氨基酸序列可以保持CCT基序保守氨基酸，且在CCT基 序氨基酸序列中，未对CCT基序保守氨基酸以外的氨基酸进行修饰。
[0194] 与编码PRR7蛋白质的碱基序列可操作地连接的启动子优选为由序列号1的 34845-35044所示的碱基序列、序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或者序列号1的 26779-35044所示的碱基序列构成的核酸。本方法中所使用的启动子并不限定于这些核酸， 还包含由序列号1的34845-35044所不的碱基序列的一部分、序列号1的33045-35044所不 的碱基序列的一部分、或者序列号1的26779-35044所不的碱基序列的一部分构成的片段， 即含有显示促进植物基因转录的活性的碱基序列的核酸。并且，本方法中所使用的启动子 含有下述核酸：其与序列号1的34845-35044所示的碱基序列、序列号1的33045-35044所 示的碱基序列、或者序列号1的26779-35044所示的碱基序列具有80%、85%、90%、95%、 97%、99%或者99. 5%的同一性，且显示促进植物基因转录的活性的碱基序列。并且，本发 明中所使用的启动子包含下述核酸：其是源自长雄野生稻的碱基序列，即至少含有由序列 号1的34845-35044表示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性。
[0195] (7)本发明的启动子和源自长雄野生稻的PRR7结构基因作为DNA标记物的应用
[0196] 本发明的启动子和源自长雄野生稻的PRR7结构基因的整体或部分序列用作植物 高产性的DNA标记物。在植物中检测出本发明的启动子的序列或者源自长雄野生稻的PRR7 结构基因的序列时，可期待该植物显示长雄野生稻样的高产性的性状。作为这样的标记物， 更优选源自本发明的启动子的碱基序列。
[0197] 在这样的目的下，使用的本发明的DNA标记物优选含有序列号1的26779-35044 所示的碱基序列和/或序列号1的35825-46721所示的碱基序列的15~2000个碱基，进 一步优选含有序列号1的26779-35044所示的碱基序列和/或序列号1的35825-46721所 示的碱基序列的20~500个碱基，进一步优选含有序列号1的26779-35044所示的碱基序 列和/或序列号1的35825-46721所示的碱基序列的30~100个碱基。但是，本发明的高 产性的DNA标记物并不限定于此。
[0198] 作为优选的1实施方式，对本发明的启动子的碱基序列或长雄野生稻的PRR结构 基因的碱基序列与日本晴的对应部分的碱基序列进行比较，选择相当于两者之间发现差异 的区域的长雄野生稻部分序列作为上述叙述的DNA标记物。
[0199] 在植物中检测本发明的DNA标记物，且存在该DNA标记物时，可以判定该植物为高 产性。例如，关于通过将日本晴和长雄野生稻杂交而得到的植物，在选择高产性的稻品种 时，可以使用如上所述的相当于在长雄野生稻和日本晴间存在差异的区域的长雄野生稻部 分序列作为DNA标记物。
[0200] 本发明的DNA标记物的检测方法没有特别限定，可以使用PCR、RFLP或者碱基序列 解码等本技术领域中已知的各种方法。并且，本发明的DNA标记物的检测也可在通过杂交 而得到的植物成长的任一阶段进行。关于通过杂交而得到的植物，在幼苗的阶段进行DNA 标记物的检测在本发明中较为合适，由此，可以在交配的植物生长之前判定该植物是否为 高产性。
[0201] (8)使用本发明的启动子提高植物基因的转录活性的方法
[0202] 本发明提供一种使用本发明的启动子提高植物基因的转录活性的方法。即，本发 明为一种方法，其包括：使用含有序列号1的34845-35044所示的碱基序列、或使用含有与 序列号1的34845-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性的喊基序列的核酸来提尚 植物基因的转录活性。并且，本发明为一种方法，其包括：使用含有序列号1的33045-35044 所示的碱基序列、或含有与序列号1的33045-35044所示的碱基序列具有至少90%的同一 性的碱基序列的核酸来提高植物基因的转录活性。另外，本发明为一种方法，其包括：使用 含有下述核酸来提高植物基因的转录活性：所述核酸是源自长雄野生稻的碱基序列，至少 含有由序列号1的34845-35044表示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性。在这 样的核酸中，优选含有由序列号1的33045-35044所不的碱基序列构成的核酸的片段，进一 步优选含有由序列号1的26779-35044所示的碱基序列构成的核酸的片段。在下述的实施 例中，实际上确认到含有序列号1的34845-35044和相当于序列号1的33045-35044的碱 基序列的核酸具有促进GUS基因转录的活性。
[0203] (9)源自长雄野生稻的PRR7蛋白质和编码其的核酸
[0204] 并且，本发明提供一种源自长雄野生稻的PRR7蛋白质和编码其的核酸。如上所 述，源自长雄野生稻的PRR7蛋白质由序列号3所示氨基酸构成，由序列号2所示的碱基序 列的核酸进行编码。因此，本发明涉及具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质和编码该蛋 白质的核酸。本发明还涉及具有序列号2所示碱基序列的核酸。在下述的实施例中，与向 源自长雄野生稻的PRR7启动子导入结合有编码源自日本晴的PRR7蛋白质的基因的构建体 的情况相比，向相同的启动子导入结合有编码源自长雄野生稻的PRR7蛋白质的基因的构 建体的情况显示更明显的高产性赋予效果。即，在与源自长雄野生稻的PRR7启动子可操作 地连接而表达的情况下，与对源自其它植物的PRR7蛋白质进行编码的核酸相比，对源自长 雄野生稻的PRR7蛋白质进行编码的核酸具有可对植物赋予更好的高产性的特性。因此，在 对植物赋予高产性时，对源自长雄野生稻的PRR7蛋白质进行编码的核酸与源自长雄野生 稻的PRR7启动子一起使用，在本发明中较为合适。并且，本发明鉴于这样的编码源自长雄 野生稻的PRR7蛋白质的核酸的特征，提供一种对具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质进 行编码的核酸在植物赋予高产性中的应用；提供一种使植物的产量增大的方法，其将对具 有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质进行编码的核酸导入植物中；以及提供一种产量增大 的转基因植物的制备方法，其将对具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质进行编码的核酸 导入植物中。
[0205] (10)源自高粱的PRR7启动子与高粱PRR7结构基因可操作地连接而成的核酸
[0206]并且，本发明为一种源自高粱的PRR7启动子与高粱PRR7结构基因可操作地连接 而成的核酸。源自高粱的PRR7启动子为含有示于序列号19的9049个碱基序列所示的碱基 序列的核酸。本说明书中的源自高粱的PRR7启动子的碱基序列并不限定于示于序列号19 的碱基序列，也包含含有与这些碱基序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%、99%、或者 99. 5%的同一性，且显示促进植物的编码区域的转录的活性的碱基序列的核酸。
[0207] 源自高粱的PRR7蛋白质由序列号17所示的765个氨基酸构成，由序列号16所示 的碱基序列的核酸进行编码。本申请说明书中的源自高粱的PRR7蛋白质并不限定于此， 包含与序列号17所示氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、97%、或者99%的相似性的氨基酸序列的蛋白质。并且，本申请说明书中的源自 高粱的PRR7蛋白质与上述（2)中源自长雄野生稻的PRR7蛋白质相关叙述的蛋白质同样地 含有PR结构域和CCT基序，且具有对LHY基因及CCA1基因转录进行抑制的活性。源自高 粱的PRR7蛋白质的PR结构域在序列号17的氨基酸序列中相当于氨基酸编号80~194， CCT基序相当于氨基酸编号709~752。但是，在本申请说明书中，源自高粱的PRR7蛋白质 的PR结构域和CCT基序的氨基酸序列并不限定于上述PR结构域和CCT基序，还含有与这 些氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或者99%的同一性的氨基 酸序列。
[0208] 使用源自高粱的PRR7启动子和高粱PRR7结构基因可操作地连接而成的核酸，可 使植物的产量增大。在下述的实施例中，显示通过将含有序列号19所示的碱基序列的核酸 和序列号16所示的碱基序列的核酸的构建体导入稻，确认到产量增加的效果。
[0209] 实施例
[0210] 实施例1 :具有稻野牛种长雄野牛稻所具有的高产件的稻栽培系统的制各和高产 件基闵厌域的确宙
[0211] 已知非洲野生的稻野生种长雄野生稻（0.longistaminata)虽然与作为栽培种的 栽培稻（O.sativaL.)具有相同的A基因组，但与栽培种相比，显示较大的生物质。本发 明者认为为了将长雄野生稻所具有的这样的优良性状导入栽培种，持续进行了稻栽培品种 "Shiokari"和长雄野生稻的杂交、选择，结果得到与"Shiokari"相比显示高产性的BC7F6 系统"No. 645"。该"No. 645"的大部分的农业性状超越"Shiokari"，特别是，特征为基杆直 径变粗（表1)。关于该高产性系统，使用覆盖全部12条染色体的80个DNA标记物研宄基 因型，结果可知，仅具有长雄野生稻的第3染色体末端部和第7染色体末端部（图1)。
[0212] 因此，本发明人为了明确与"No. 645"所具有的高产性相关的基因区域，使用将使 "No. 645"与回归亲本"Shiokari"杂交而成的F2的133个个体进行与产量相关性状有关的 QTL分析。其结果，在第7染色体末端部检测出与到出穗为止的天数、杆长、穗长、每穗颖花 数、基杆直径有关的QTL(表2)。接着，杂交后代F3个体中，选择第7染色体末端部为杂合 (hetero)，且其它第7染色体区域为"Shiokari"型的个体和"No. 645"型的个体，使用其后 代4313个个体和4944个个体对末端部的重组个体进行选择。其结果，可选择最末端固定为 "No. 645"型的3个个体（F4-No.l，No. 2，No. 3)和最末端固定为"Shiokari"型的4个个体 (F4-No. 4,No. 5,No. 6,No. 7)(图2)。最末端固定为"No. 645"型的个体的性状与"No. 645" 大致相同。另外，最末端固定为"Shiokari"型的个体的性状与"Shiokari"大致相同（表 3)。标记物CH15377-1由于距PAC克隆P0627E10的图2的右末端约180kb，因此，可推测长 雄野生稻所具有的高产性的基因区域可缩小至第7染色体末端部约180kb。
[0213][表1]
[0214]Shiokari和No. 645的产量相关性状的比较
[0215]
[0216][表 2]
[0217]Shiokari和No. 645的杂交F2集团中农业性状的QTL分析
[0218]
[0219][表 3]
[0220] 在第7染色体末端部发生重组且最末端以"No. 645"型或"Shiokari"型固定的7 个体的生长特性
[0221]
[0222] 实施例2 :通讨长雄野牛稻的第7染色体末端部厌域的转化试骀讲行的互补件检 骀⑴
[0223] 通过实施例1的遗传学分析，可以将长雄野生稻所具有的高产性的基因区域缩小 至第7染色体末端部的约180kb。制备网罗了其中约82kb的区域的7个构建体，分别进行 转化至"Shiokari"而得到的转化体的性状评价。
[0224] 使用Fosmid载体PCC1F0S(EPICENTRE株式会社）制备"No. 645"的基因组文库。 通过实施例1的遗传学分析，显示与高产性有关的基因位于第7染色体的长臂末端部，因 此，使用作为该区域的DNA标记物的C213及C728(Harushimaetal，1998)筛选文库，选择 4个克隆（Fosl、2、10、12)。对各克隆的末端碱基序列进行解码，与日本晴基因组序列比较， 由此可明确互相的位置关系。并且，进行引物步移，对该编码的碱基序列进行解码。将所解 码的碱基序列示于序列号1。
[0225] 使用上述4个Fosmid克隆制备下述的7个互补性试验用构建体（图3)。
[0226] (l)Fr3 的制备
[0227] 使用QIAEXIIGelExtractionKit(QIAGEN株式会社），利用琼脂糖将对用Notl 处理Fos12而得到的最大的片段（包含序列号1的第15961号的碱基至第37129号的碱 基）进彳T提纯。
[0228] 将质粒载体pSB200(具有潮霉素抗性基因盒的中间载体）用Notl完全消化后，通 过乙醇沉淀回收DNA。将回收的DNA溶解于TE溶液后，通过CIAP(TAKARA-BI0株式会社） 进行脱磷酸化。将反应液利用琼脂糖凝胶进行电泳后，使用QIAEXIIGelExtractionKit 利用凝胶对载体片段进行提纯。
[0229] 对通过上述操作准备的2个片段进行测试，使用DNALigationKit"Mighty Mix"（TAKARA-BI0株式会社）进行连接反应。反应后，通过乙醇沉淀回收DNA。将回收的 DNA溶解于纯水（通过Millipore株式会社制造装置制备）后，与大肠杆菌DH5a混合，供 试于电穿孔。将电穿孔后的溶液在LB培养基中进行振荡培养（37°C、1小时）后，在含有壮 观霉素（50yg/ml)的LB板上扩展并保温（37°C、16小时）。对生成的菌落中的24个菌落 分离质粒，研宄限制酶切断长度模式及边界部碱基序列，由此选择期望的大肠杆菌。
[0230] (2)Frl的制备
[0231] 使用QIAEXIIGelExtractionKit，利用琼脂糖对用Notl处理Fosl2而得到的第 二大的片段（包含序列号1的第3号的碱基至第9746号的碱基）进行提纯。
[0232] 对该片段与（1)中使用的Notl-CIAP处理后的pSB200片段一起进行测试，使用 DNALigationKit"MightyMix"进行连接反应。然后，依据（1)中记载的方法选择期望的 大肠杆菌。
[0233] (3)Fr7 的制备
[0234] 使用QIAEXIIGelExtractionKit，利用琼脂糖对用Notl处理Fosl而得到的最 大的片段（包含序列号1的第58805号的碱基至第82355号的碱基）进行提纯。
[0235] 对该片段与（1)中使用的Notl-CIAP处理后的pSB200片段一起进行测试，使用 DNALigationKit"MightyMix"进行连接反应。然后，依据（1)中记载的方法选择期望的 大肠杆菌。
[0236] (4)Fr5 的制备
[0237] 使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用Notl处理Fosl而得到的第 二大的片段（包含序列号1的第42409号的碱基至第58808号的碱基）进行提纯。
[0238] 对该片段与（1)中使用的Notl-CIAP处理后的pSB200片段一起进行测试，使用 DNALigationKit"MightyMix"进行连接反应。然后，依据（1)中记载的方法选择期望的 大肠杆菌。
[0239] (5)Fr2 的制备
[0240] 使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用Notl处理Fosl而得到的第 二大的片段（包含序列号1的第6929号的碱基至第19723号的碱基）进行提纯。
[0241] 将该片段与（1)中使用的Notl-CIAP处理后的pSB200片段一起测试，使用DNA Ligation Kit "Mighty Mix"进行连接反应。然后，依据（1)中记载的方法选择期望的大肠 杆菌。
[0242] (6)Fr6 的制备
[0243] 使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用Notl处理Fosl而得到的第 二大的片段（包含序列号1的第51665号的碱基至第62366号的碱基）进行提纯。
[0244] 将该片段与（1)中使用的Notl-CIAP处理后的pSB200片段一起测试，使用DNA Ligation Kit "Mighty Mix"进行连接反应。然后，依据（1)中记载的方法选择期望的大肠 杆菌。
[0245] (7)Fr4 的制备
[0246]使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用Smal及PstI处理FoslO而 得到的最大的片段（包含序列号1的第26779号的碱基至第46059号的碱基）进行提纯。
[0247] 使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用PstI及SacI处理Fosl而得 到的第四大的片段（包含序列号1的第46056号的碱基至第49155号的碱基）进行提纯。
[0248] 将质粒载体pSB200用EcoRV及SacI完全消化后，通过乙醇沉淀回收DNA。将回收 的DNA通过（1)中记载的方法进行CIAP处理，提纯载体片段。
[0249] 测试这3个片段，使用DNALigationKit"MightyMix"进行连接反应。然后，依 据（1)中记载的方法选择期望的大肠杆菌。
[0250] 对通过（1)~（7)选择的7种大肠杆菌与根癌土壤杆菌（Agrobacterium 1：111116€3(^6118)菌株1^4404/^3131(1(〇11^1'16七31，1996)及辅助大肠杆菌1113101/ pRK2013(Dittaetal, 1980) 一起进行测试，依据Dittaetal(1980)的方法进行三亲株 的交配（triparentialmating)。在含有壮观霉素（50yg/ml)、四环素（15yg/ml)及潮霉 素（35yg/ml)的AB板上，使用进行了选择的土壤杆菌并依据Hieietal(1994)的方法进 行"Shiokari"的转化。转基因稻在驯化后，在温室下栽培。对各构建体培育约20个个体 独立的转化体，采种T1种子。
[0251]T1代对1个构建体测试2个系统、合计18个个体（1个系统为9个个体）。播种 在2007年6月25日进行，在7月9日向放入了水稻田土壤的3.5升的桶中各移植3个个体 (1个系统为3个桶，合计9个个体）。除对照的"Shiokari"以外，作为参考品种对将长雄野 生稻的第3染色体末端区域及第7染色体末端区域导入"Shiokari"而成的系统"No. 645" 进行栽培。栽培在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用 的封闭体系温室（14小时30分钟昼长的长昼条件）中，在无施肥条件下进行。收获在9月 21日进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、 每穗受精颖花重量（以下为每穗重）进行性状调查。
[0252] 将各构建体2系统的农业性状数据的平均值示于表4。供试的全部7构建体的每 穗粒数或每穗重与对照的"Shiokari"大致相同或为其以下，未发现超越"Shiokari"的构 建体。
[0253] [表 4]
[0254] 重组体的性状评价试验
[0255]
[0256] 实施例3 :通讨长雄野牛稻的第7染色体末端部厌域的转化试骀讲行的互补件检 骀⑵
[0257] 虽然在2007年进行了测试，但对于未得到显示生长旺盛性的结果的7个构建体， 使每个构建体的系统数（均源自独立的T0个体）增加至5系统（1个系统为12个个体。与 在2007年测试的系统不同。），再次进行试验。播种在2008年5月30日进行，在6月16 日向放入了水稻田土壤的3. 5升的桶中各移植4个个体（1个系统为3个桶，合计12个个 体）。栽培在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封 闭体系温室（14小时30分钟昼长的长昼条件）中在不施肥条件下进行。收获在9月8日 进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗 受精颖 花重量（以下为每穗重）进行性状调查。2008年除对照的"Shiokari"以外，对作为 参考品种的、仅将长雄野生稻的第7染色体末端区域导入"Shiokari"而成的系统"No. 240" 进行栽培。
[0258] 将各构建体5系统的农业性状数据的平均值示于表5。Fr4构建体与对照的 "Shiokari"相比，直到出穗为止的天数、杆长、穗长、每穗粒数、种子育性、每穗重、基杆直径 的7个性状大幅提高，与此相对，剩余的6个构建体在全部的性状中与"Shiokari"相同或 为其以下。
[0259][表 5]
[0260] 重组体的性状评价试验
[0261]
[0262] 接着，对于Fr4系统中其特性最显著地被显示的Fr4_4,对个体分别进行PCR，考察 导入基因的有无与性状测定值大小的关系。将其结果示于表6和图4。基因持有个体与缺 失个体相比，明确在长昼条件下（14小时30分钟），直到出穗为止的天数、杆长、穗长、每穗 粒数、每穗重、基杆直径方面提高。另外，基因持有个体与缺失个体相比，还明确了着粒密度 (每lcm穗的粒数）高。
[0263] 根据以上的结果，明显教导对"Shiokari"赋予高产性的基因组片段为Fr4片段。
[0264] [表6]
[0265] 系统Fr4_4中基因的有无和产量性状的关系
[0266]
[0267] 2009年将在2008年栽培的Fr4_4的基因持有个体及基因缺失个体的后代（T2代） 与对照的"Shiokari"、"No. 240" 一起栽培（1个系统12个个体），评价产量性状。播种在 2009年5月1日进行，在5月11日向放入了水稻田土壤的3. 5升的桶中各移植4个个体。 栽培在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封闭体系 温室（14小时30分钟昼长的长昼条件）中在无施肥条件下进行。收获在8月19日进行。 对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精颖 花重量（以下为每穗重）进行性状调查。
[0268] 将结果示于表7。基因持有个体的后代Fr4-4_1和Fr4-4_2与基因缺失个体的后 代Fr4-4-3相比，明确在天长条件下（14小时30分钟），直到出穗为止的天数、杆长、穗长、 每穗粒数、每穗重、基杆直径方面提高。另外，基因持有系统与缺失系统相比，还明确了着粒 密度（穗每lcm的粒数）高。另一方面，可知Fr4-4-3的总性状测定值与"Shiokari"大致 相同。
[0269] 根据以上的结果，得出了对"Shiokari"赋予多产的基因组片段为Fr4片段的 结论。若参照日本晴序列（AP005199)的注释信息，则Fr4片段中包含日本晴全长cDNA AK066112的等位基因，推测该基因赋予高产性。另外，K066112基因座在Murakamiet al. (2005)中记载为OsPRR37。因此，推测长雄野生稻所具有的PRR7基因为对"Shiokari" 赋予多产的原因基因。而且，认为该Fr4片段中含有对PRR7基因进行编码的区域及用于使 其表达的的区域。
[0270][表 7]
[0271] 系统Fr4_4的T2后代的评价试验
[0272]
[0273]实施例4 :长雄野牛稻PRR基闵的编码厌域的效果的确认
[0274] 根据实施例3的结果，认为长雄野生稻所具有的PRR7基因为赋予高产性的基因。 为了对其进行确认，调查长雄野生稻的PRR基因的编码区域对产量相关性状造成的影响。
[0275] 具体而言，如下制备构建体：使作为启动子的泛素启动子、作为终止子的长雄野生 稻的PRR基因的终止子区域与长雄野生稻的PRR7基因的编码区域连接而成。泛素启动子 为通常用于单子叶植物的组成型启动子，认为适合用于观察PRR基因的效果。将这些构建 体导入栽培稻"Yukihikari"而实施产量相关性状的评价。
[0276] 使用重叠延伸（overlapextension)PCR等常规方法来构建构建体：其用于使源 自长雄野生稻的PRR7基因的编码区域（序列号2)在泛素启动子的控制下进行表达。具体 而言，如下制备构建体：将含有PSB200的泛素启动子及泛素内含子的区域进行PCR扩增，并 在其相邻下游，将嵌合基因插入于PSB200的多克隆位点，所述嵌合基因通过对长雄野生稻 的翻译开始点上游区域（序列号1的第35045号碱基至第35824号碱基）、序列号2及长 雄野生稻的翻译终止点下游区域（序列号1的第46722号碱基至第49157号碱基）连接而 成。另外，使用仅持有选择标记基因（潮霉素抗性基因）的质粒作为对照。
[0277] 使用上述持有2种构建体的大肠杆菌，通过实施例2中记载的方法进行三亲交配 (triparentalmating)及向栽培稻"Yukihikari"的转化。转基因稻在驯化后，在封闭体 系温室中栽培。PRR7基因以及对照的构建体分别独立培育60个个体、20个个体的转化体。 供试60个个体中，观察到18个个体显示（1)植被高度较高、（2)茎粗、（3)直到出穗为止的 天数长这样的与高产性相关特性的个体。对于该18个体，对成熟期观察穗的性状进行观察 时，在全部个体中，观察到：（1)种子育性低（低于20% )、（2)穗未从止叶充分地抽出、（3) 颖花处于开颖而未闭颖等任一种状况。而且，最终的种子产量与对照相比，大幅降低（图 5)。另一方面，剩余的42个个体显示与对照的20个体大致相同的特性，未观察到上述的不 良性状。
[0278] 根据以上的结果，无法确认长雄野生稻所具有的PRR7基因的编码区域为赋予高 产性的基因。
[0279] 实施例5 :将源自长雄野牛稻的启动子和各种PRR基闵编码厌域连接而成的构律 体的效果
[0280] 根据实施例4的结果，无法得出长雄野生稻所具有的PRR7基因的编码区域为赋予 高产性的基因的结论。因此，发明人等进行了潜心研宄，结果考虑长雄野生稻的PRR7基因 的启动子区域对于长雄野生稻的PRR7基因的表达是否是必须的，制备构建体并导入至栽 培稻，实施产量相关性状的评价，所述构建体使作为启动子的长雄野生稻的PRR7基因的启 动子区域、作为终止子的长雄野生稻的PRR7基因的终止子区域与长雄野生稻的PRR7基因 的编码区域连接而成。另外，作为用于对长雄野生稻PRR7基因的效果进行评价的对照，制 备构建体进行实验，所述构建体使通常的栽培稻"日本晴"的PRR7基因的编码区域与上述 启动子及终止子连接而成。
[0281] 长雄野牛稻PRR基闵及栽培稻"日本晴"PRR基闵的分离
[0282] 使用RNeasyPlantMiniKit(QIAGEN)，从长雄野生稻染色体片段导入系统 "No. 645"及"日本晴"的幼苗中提取总RNA。按照试剂盒的手册进行了操作，但未使用添加 于RLT缓冲液的巯基乙醇，而添加了DTT使其最终浓度为40mM来代替。利用附属的RNase 1^66￥3七61'(40~50 1^1)使总謝4溶出后，进行0似86处理（1'111?130 0嫩-；1^'66 1(；[1：，41]113；[011)。 将处理后的RNA溶液利用琼脂糖凝胶电泳检查浓度及纯度，然后，通过QuantiTectRev. Transcriptionkit(QIAGEN)进行cDNA合成。为了以得到的cDNA溶液作为模板分离PRR 基因的编码区域，使用以下的2种引物进行RT-PCR。下述的longi-PRR2F与序列号1的 35847-35869所示的碱基序列对应，longi-PRR2R与序列号1的46713-46735所示的碱基 序列对应。
[0283] longi-PRR2F:ACCAAACCGCCGGCTCTGCCCTC(序列号6)
[0284] longi-PRR2R:GGTAGGTAGGTAGGTCATCTGTC(序列号7)
[0285] 使用该结果得到的碱基序列确定"No. 645"持有的源自长雄野生稻的PRR7结构基 因的碱基序列（序列号2)。推测该碱基序列为对由740个氨基酸构成的蛋白质（序列号3) 进行编码的碱基序列。在序列号3中，相当于氨基酸编号62~176的区域为PR结构域，相 当于氨基酸编号676~722的区域为CCT基序。另外，日本晴的PRR7结构基因的碱基序列 (序列号4)也使用同样的方法进行确定，推测该碱基序列为对由742个氨基酸构成的蛋白 质（序列号5)进行编码的碱基序列。在序列号5中，相当于氨基酸编号62~176的区域 为PR结构域，相当于氨基酸编号678~724的区域为CCT基序。
[0286] 将由分离的日本晴来源、长雄野生稻来源及拟南芥来源的PRR基因的翻译区域所 编码的氨基酸序列的序列对比示于图6。并且，将由分离的日本晴来源、长雄野生稻来源及 拟南芥来源的PRR基因的翻译区域所编码的氨基酸序列的同一,性（identity) %和相似性 (similarity) %的值示于图7。
[0287] 含有各PRR基闵的构律体的制各
[0288] 通过以下的步骤制备下述构建体：其将分离的cDNA插入于源自长雄野 生稻的PRR7基因的启动子区域和终止子区域之间而成。PCR使用PrimeSTARMAX DNAPolymerase(TAKARA-BI0 株式会社），连接使用DNALigationKit"Mighty Mix"（TAKARA-BI0株式会社）。另外，将下述构建体的制备策略图解并示于图8。
[0289] (1)包含源自长雄野生稻的PRR7基因的编码区域的构建体（以下为longi构建 体）
[0290] 以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用以下的2种引物进行PCR。下述的 longi-PRR1F与序列号1的34019-34044所示的碱基序列对应，longi-PRR1R与序列号1 的35838-35861所示的碱基序列对应。
[0291]longi-PRR1F:CGCTTCGAAGATATCATCATCATTCATGTATGAG(序列号 8)
[0292]longi-PRR1R:AGCCGGCGGTTTGGTTGTGATGAG(序列号 9)
[0293] 接着，对得到的PCR产物和上述源自"No. 645 "的RT-PCR产物进行测试，使用 longi-PRR1F及longi-PRR2R进行重叠延伸PCR。使用Ex-Taq(TAKARA-BI0 株式会社） 对得到的PCR产物添加A-Tai1后，克隆于pCR-XL-T0P0 (Invitrogen株式会社），然后，为了 破坏PCR-XL-T0P0上原本存在的PstI部位，在EcoRV处理后，进行自我连接。自我连接后， 进行利用SacI及PstI的消化以及利用CIAP(TAKARA-B10株式会社）的脱磷酸化。利用琼 脂糖对反应液进行电泳，回收载体片段（包含图8的片段1)。
[0294]另外，以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用以下的2种引物进行PCR。 下述的longi-PRR3F与序列号1的46721-46744所示的碱基序列对应，longi-PRR3R与 序列号1的49137-49157所示的碱基序列对应。
[0295]longi-PRR3F:ACCTACCTACCTACCTACGCAATG(序列号 10)
[0296] longi-PRR3R:GCTAGAATTCGAGCTCTCCAGGGAGCAGGGA(序列号11)
[0297] 对得到的PCR产物和上述源自"No. 645"的RT-PCR产物进行测试，使用longi-PRR 2F及longi-PRR3R进行重叠延伸PCR。将得到的PCR产物利用SacI及PstI消化后，利用 琼脂糖对反应液进行电泳，回收2. 6kb片段（图8的片段2)用于插入。该2. 6kb片段与序 列号1的4605649156所示的碱基序列对应（其中，46108-46595为内含子，因此受到剪接而 成为46056-46107和46596-49156串联结合而成的序列）。
[0298] 使用上述2种回收片段进行连接。将得到的质粒利用SacI及Notl消化后，利 用琼脂糖对反应液进行电泳，回收6. 5kb片段（图8的片段3)。使回收的片段3克隆于 PSB200 (利用SacI及Notl进行消化后，进行CIAP处理）。对得到的质粒进行测试，利用 Notl及EcoRV进行消化以及利用CIAP进行脱磷酸化。利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收 载体片段（包含片段3)。另一方面，利用Notl及EcoRV对实施例2的Fr4构建体的质粒进 行消化，利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收7. 3kb片段（片段4)。该7. 3kb片段与序列号 1的26779-34022所示的碱基序列对应，使用两片段进行连接，得到目标质粒。
[0299] (2)含有源自日本晴的PRR7基因的编码区域的构建体（以下为日本晴构建体）
[0300] 以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用longi-PRR1F及longi-PRR1R 进行PCR。对得到的PCR产物和上述源自日本晴的RT-PCR产物进行测试，使用longi-PRR IF及longi-PRR2R进行重叠延伸PCR。使用Ex-Taq对得到的PCR产物添加A-Tail后，克 隆于PCR-XL-T0P0。利用PstI及Notl对得到的质粒进行消化后，利用琼脂糖反应液进行电 泳，回收3. 9kb片段（源自日本晴cDNA-图8的片段1)作为插入物。
[0301] 另外，以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用longi-PRR3F及longi-PRR 3R进行PCR。对得到的PCR产物和上述源自日本晴的RT-PCR产物进行测试，使用longi-PRR 2F及longi-PRR3R进行重叠延伸PCR。使用Ex-Taq对得到的PCR产物添加A-Tail后，克 隆于PCR-XL-T0P0。利用SacI及PstI对得到的质粒进行消化后，利用琼脂糖对反应液进行 电泳，回收2. 6kb片段（源自日本晴cDNA-图8的片段2)作为插入物。该2. 6kb片段与序 列号1的46056-49156所示的碱基序列对应（其中，46108-46595为内含子，因此受到剪接 而成为将46056-46107和46596-49156串联结合的序列）。
[0302] 将上述2种插入片段与pSB200 (利用SacI及Notl进行消化后，进行CIAP处理） 一起测试，进行连接。对得到的质粒进行测试，利用Notl及EcoRV进行消化以及利用CIAP 进行脱磷酸化。利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收载体片段（包含源自日本晴cDNA-图 8的片段3)。
[0303] 另一方面，利用Notl及EcoRV对实施例2的Fr4构建体的质粒进行消化，利用琼 脂糖对反应液进行电泳，回收7. 3kb片段（图8的片段4)。使用两片段进行连接，得到目标 质粒。该7. 3kb片段与序列号1的26779-34022所示的碱基序列对应。
[0304] 使用持有（1)及（2)中得到的目标质粒的大肠杆菌，通过实施例2中记载的方法 进行三亲交配及"Shiokari"的转化。转基因稻在进行驯化后，在封闭体系温室中栽培。对 各构建体独立培育60个体的转化体，采种T1种子。从各构建体中按照采种量从多到少的 顺序选择18个个体，供于T1的评价试验。
[0305] 就T1代而言，1个构建体测试18个系统（1个系统为12个个体）。播种在6月25 日进行。在移植前分别对个体切下叶，浸渍于潮霉素溶液，将对潮霉素显示抗性的个体（推 测为持有基因的个体）作为移植的对象。在7月12日，在放入有稻用育苗土的容量570ml 的聚乙烯制罐中各移植1个个体（1个系统为12个罐、合计12个个体）。对施肥而言，在每 个罐中，将N、P、K各设为0. 21g、0. 33g、0. 05g。作为对照，除"Shiokari"以外，将仅将长雄 野生稻的第7染色体末端区域导入"Shiokari"而成的系统"No. 240"作为参考品种进行栽 培。栽培在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封闭 体系温室（14小时30分钟昼长的长昼条件）中进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以 最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精颖花重量（以下为每穗重）进行性状 调查。
[0306] 将结果示于表8。首先，对于Longi构建体和日本晴构建体，分别观察全部18个 系统的平均值，与对照"Shiokari"相比，导入了两构建体的植物的直到出穗为止的天数、杆 长、穗长、每穗粒数、每穗重、基杆直径均明显提高。另外，导入了任一构建体的植物与对照 "Shiokari"相比，直到出穗为止的天数、杆长、穗长、每穗粒数、每穗重、基杆直径均显著提 高。并且，导入了Longi构建体的总18个系统、及导入了日本晴构建体的总18个系统的着 粒密度（穗每lcm的粒数）的平均值分别为5. 15粒/cm、4. 80粒/cm，明显比"Shiokari" 的着粒密度的平均值4. 40粒/cm高。
[0307] 以上，确认了PRR7基因是赋予高产性的原因基因。并且，若综合考虑实施例3和 实施例4的结果，则令人吃惊的是，可得到长雄野生稻的高产性与PRR7基因的编码区域相 比，启动子区域做出贡献的可能性较高这样的结果。
[0308] 此外，在表8中，若比较Longi构建体和日本晴构建体的植物的产量，则前者的效 果比后者的效果显著。因此，作为与启动子一起导入植物的结构基因，与日本晴PRR7基因 的结构区域相比，LongiPRR7基因的结构区域更合适。
[0309][表 8]
[0310] 野生稻长雄野生稻（0?longistaminata)及栽培稻日本晴的PRR基因的cDNA构建 体的产量相关性状的评价
[0311]
[0312] 实施例6 :长雄野牛稻和"日本晴"的PRR基闵表汰的分析
[0313] 根据实施例5的结果，推测PRR7基因的启动子区域对多产产生影响，因此，为了对 长雄野生稻的PRR7基因启动子和栽培稻"日本晴"的PRR7基因启动子的表达的不同进行 调查，使用"日本晴"和"No. 240"（通过杂交将长雄野生稻的PRR7基因导入"Shiokari"的 取代系统）的F1进行PRR7基因的表达分析。
[0314] 对"日本晴" (2个个体）、"No. 240" (2个个体）及"日本晴"和"No. 240"的F1 (4个 个体）进行测试，在播种3周后对最新的完全展开叶进行取样，通过实施例3中记载的方法 对总RNA进行提取及cDNA合成。另外，还准备未添加逆转录酶而进行调整的样品，用作阴性 对照。另外，使用在RNA提取时得到的DNase处理前的核酸溶液的一部分，准备总DNA溶液。 以得到的总DNA溶液及cDNA溶液作为模板，使用2种引物（CGAGGTACCATACACCTGTGGCTT(序 列号12)和GCATCTGAGTTTGACTTCATGTTG(序列号13))在以下的反应条件下进行PCR。
[0315]
[0316] 94°C 2 分钟
[0317] 94°C 30 秒钟
[0318] 60°C 30 秒钟
[0319](将94°C、30秒钟和60°C、30秒钟进行35个循环）
[0320]利用限制酶HpyCH4V(NewEnglandBiolabs株式会社）对PCR产物（130bp)在 37°C下处理一夜后，使用3%MetaphorAgarose(TAKARA-BI0株式会社）进行电泳。
[0321] 在将日本晴的总DNA溶液及cDNA溶液用作模板的情况下，PCR产物被HpyCH4V切 断，与此相对于，在将No. 240的总DNA溶液及cDNA溶液用作模板的情况下，PCR产物未被 HpyCH4V切断（图9A)。由上可以确认，通过本方法，可以识别来自日本晴等位基因的PCR 产物和来自长雄野生稻等位基因的PCR产物。
[0322] 因此，比较使用F1的样品进行HpyCH4V处理后的条带图案，结果显示，将cDNA溶 液用作模板的情况与将总DNA溶液用作模板的情况相比，未被HpyCH4V切断的PCR产物的 比率高。根据本结果，显示向日本晴导入了长雄野生稻基因的取代系统的F1与源自日本晴 的PRR7的等位基因表达量相比，源自长雄野生稻的PRR7的等位基因的表达量较多（图9B)
[0323] 实施例7 :长雄野牛稻的PRR启动子及PRR基闵在玉米中的效果
[0324] 将实施例2中制备的Fr4片段（包含长雄野生稻的PRR7启动子及PRR7结构基 因）转化于玉米品种，以T1代进行产量相关性状的评价。
[0325] 将大小约1. 2mm的玉米未成熟胚（品种：A188)从温室栽培的植物中无菌取出并 浸渍于土壤杆菌悬浮用液体培养基（LS-inf、Ishidaetal.2007)。在46°C下热处理3分 钟后，在相同液体培养基中将未生成熟胚清洗1次。接着，进行15, 000rpm、4°C、10分钟的离 心处理。将离心处理后的未熟胚浸渍于LS-inf-AS培养基（Ishidaetal.2007)中，所述 培养基中以约1X109cfu/ml悬浮具有实施例2中制备的Fr4构建体的土壤杆菌LBA4404。 搅拌30秒，在室温下静置5分钟后，着床于共培培养基（LS-AS、Ishidaetal. 2007)，在 25°C、黑暗下培养7天。
[0326] 将进行了共培培养后的未成熟胚着床于含有潮霉素的选择培养基（LSD1. 5A及 1^01.58、18111(1&6丨&1.2007)，在251：、黑暗下进行培养。将增殖的愈伤组织切成小片，着 床于潮霉素再分化培养基（LSZ、Ishidaetal.2007)，在25°C、照明下培养2周。将再分化 的植物着床于生根培养基（LSF、Ishidaet&1.2007)，在25°0、照明下培养2周。将生根的 植物移植于温室内的罐中进行栽培。
[0327] 抽出的雄穗在开花前拔出进行去雄。将从未转化的玉米（品种：A188)中采集的 花粉与从雌穗中充分长出的须进行交配。收获包被枯萎的雌穗，在30°C下干燥2周后，将种 子脱粒。可以从44个个体中采种。
[0328] 从T0个体受精的穗中按照从大到小的顺序选择11个个体，以T1代进行产量相关 性状的评价。试验分成3次（第1次：5个系统、第2次：3个系统、第3次：3个系统的合计 11个系统）进行。在容量360ml的聚乙烯制罐中，1个系统各播种1粒（第1次试验为16 粒、合计16罐、第2次及第3次试验为25粒、合计25罐）。播种约2周后，切取叶的一部 分，浸渍于潮霉素溶液，调查潮霉素的抗性/敏感性。使潮霉素抵抗性和敏感性的个体为一 对并调整个体数量使其能够评价产量性状，移植于容量5100CC的聚乙烯制罐中继续栽培。 植被高度在播种14天后至56天后每周进行测定。将抽出的雄穗在开花前拔除进行去雄。 记录须从雌穗中抽出的日期，并且将从未转化玉米（品种：A188)中采集的花粉与从雌穗中 充分抽出的须进行杂交。收获穗后，测定雌穗长、每列粒数、穗重。对各系统进行潮霉素抗性 个体（基因持有个体）和潮霉素敏感性个体（基因缺失个体）的产量相关性状的比较。其 结果，可知在全部11个系统中的2个系统（Tl-No. 4、Tl-No. 6)中，抗性个体与敏感性个体 相比，雌穗长、每列粒数、穗重这3个性状变大（表9、图10)。并且，系统Tl-No. 4在接种第 35天以后，抗性个体与敏感性个体相比，植被高度变高，表明从营养生长期开始生长旺盛。
[0329] 如上所述，可知：与长雄野生稻的PRR7启动子可操作地连接的PRR7基因不仅使稻 的产量增大，还使玉米的产量增大。另外，表明营养生长期的生长液旺盛。
[0330][表9]
[0331] 效果得到确认的2系统的产量相关性状的数据
[0332]
[0333]实施例8 :源自长雄野牛稻的PRR基闵的cDNA构律体在玉米中的效果
[0334] 将实施例5中制备的源自长雄野生稻的PRR7基因的cDNA构建体（以下为Longi 构建体）转化至玉米品种，以T1代进行产量相关性状的评价。
[0335] 依据实施例7中记载的方法，将Longi构建体转化至玉米品种。得到的转化体移植 于温室内的罐中进行栽培。T0植物的雄穗在开花前拔除进行去雄，将从未转化的玉米（品 种：A188)中采集的花粉与从雌穗中充分抽出的须进行杂交。收获包被枯萎的雌穗，在30°C 下干燥2周后，将种子脱粒。从TO个体受精的穗中选择可充分确保着粒数的18穗，以T1代 进行产量相关性状的评价。试验分成3次（每次6个系统）进行。在容量360ml的聚乙烯 制罐中各接种1系统、25粒。作为对照，未转化的玉米（品种：A188)也同样地进行播种。播 种约2周后，切取叶的一部分，浸渍于潮霉素溶液，调查潮霉素的抗性、敏感性。使潮霉素抵 抗性和敏感性的个体为一对并调整个体数量，使其能够评价产量性状，移植于容量5100CC 的聚乙烯制罐中继续栽培。植被高度在接种14天后至56天后每周进行测定。抽出的雄穗 在开花前拔除进行去雄。记录从雌穗中的须抽出日，并且将从未转化玉米（品种：A188)中 采集的花粉与从雌穗中充分抽出的须进行杂交。收获穗并干燥后，测定雌穗长、每列粒数、 穗重。对各系统进行潮霉素抗性个体（基因持有个体）和潮霉素敏感性个体（基因缺失个 体）的产量相关性状的比较。对潮霉素敏感性个体（基因缺失个体）未分离的系统进行与 非重组的A188的比较。
[0336] 其结果，显示在全部18个系统中的2个系统（Tl-cDNANo. 11、Tl-cDNANo. 13) 中，抗性个体与敏感性个体或非重组A188相比，雌穗长、每列粒数、穗重这3个性状分别变 大（表10、图11)。在图11中，R为潮霉素抗性个体（基因持有个体），S为潮霉素敏感性 个体（基因缺失个体）。
[0337] 如上所述，可知：与长雄野生稻的PRR7启动子连接相同基因的cDNA而成的导入基 因使玉米的产量增大。即，确认到：在长雄野生稻的PRR7基因中，通过导入不含内含子的 cDNA，可得到本发明的效果。
[0338][表 10]
[0339] 效果得到确认的玉米转化体2个系统的产量相关性状的数据
[0340]
[0341]实施例9 :将源自长雄野牛稻的启动子分别与拟南芥PRR基闵编码厌域、高粱PRR 基闵编码厌域连接而成的构律体的效果
[0342]使用RT-PCR从拟南芥（Columbia)中分离PRR7基因（注册号：NM120359)的编码 区域，按照实施例5中记载的方法，通过与实施例5中制备的构建体的长雄野生稻PRR基因 编码区域进行取代，制备目标构建体。将分离的拟南芥PRR基因碱基序列示于序列号14， 将编码的氨基酸序列示于序列号15。接着，对于连接高粱PRR基因编码区域而成的构建 体，也通过同样的方法制备。进行NCBIblastn检索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast,cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSea rch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_L0C=blasthome)，将与长雄野生稻PRR7 基因编码区域 (序列号4)同一性高的基因（注册号：XM_002465391)作为PRR基因进行分离。使用RT-PCR 从高粱（品种：Golds〇rgho、KANEK0种苗）中分离该基因的编码区域序列，通过与实施 例5中制备的构建体的长雄野生稻PRR基因编码区域发生取代，得到目标构建体（序列号 18)。分离的源自高粱的PRR基因编码区域与通过NCBIblastn检索而命中的序列（注册 号：XM_002465391) 100%-致，2295碱基（序列号16)中，编码了 765氨基酸残基（序列号 17)。这些PRR基因翻译区域的氨基酸序列的相同性及同一性如图7所示。
[0343] 对于这些构建体，通过实施例5中记载的方法进行三亲交配及稻品种 "Yukihikari"的转化。转基因稻在驯化后，在温室下栽培。对各构建体培育独立的60个个 体的转化体，采种T1种子。从各构建体中按照采种量从多到少的顺序选择18个个体，供于 T1的评价试验。
[0344]T1代对1个构建体测试18个系统（1个系统为12个个体）。播种在9月14日进 行。在移植前分别对个体切下叶，浸渍于潮霉素溶液，将对潮霉素显示抗性的个体（基因持 有个体）作为移植的对象。在9月28日，在放入有稻用育苗土的容量570ml的聚乙烯制罐 中各移植1个个体（1个系统为12个罐、合计12个个体）。对施肥而言，在每个罐中，将N、 P、K设为各0? 21g、0. 33g、0. 05g。作为对照，栽培"Yukihikari"。栽培在日本Tobacco产 业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封闭体系温室（14小时30分钟 昼长的长昼条件）中进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗 粒数、种子育性、每穗受精颖花重量（以下为每穗重）进行性状调查。
[0345]将结果示于表11。首先，对拟南芥构建体观察全部18个系统的平均值，与对照 "Yukihikari"相比，杆长、每穗粒数、每穗重、基杆直径降低，认为没有产量增大效果。接着， 对于高粱构建体，与对照"Yukihikari"相比，发现杆长、穗长、每穗粒数大致相同，但每穗 中、基杆直径降低，未确认到产量增大效果。
[0346][表11]
[0347] 结合了长雄野生稻PRR启动子的cDNA构建体的产量相关性状的评价
[0348]
[0349]实施例10 :源自长雄野牛稻的PRR启动子和GUS基因的连接构建体
[0350] 制备源自长雄野生稻的PRR7启动子和⑶S基因的嵌合构建体，并调查有无转录。 如图12所示，制备在长雄野生稻的PRR7启动子区域的相邻下游连接GUS基因而成的构建 体。长雄野生稻PRR7基因的启动子区域具体而言分别连接转录起始点上游区域200个碱 基（序列号1的第34845-35044号碱基）、2000个碱基（序列号1的第33045-35044号碱 基），制备构建体P200、构建体P2000。制备不具有PRR7基因启动子区域的构建体P0也作 为对照用。
[0351] 使用制备的构建体进行栽培稻"Yukihikari"的转化。从植被高度生长至约10cm 的转基因稻的幼苗中对各构建体提取4个个体的根，并分别进行取样。通过实施例5中记 载的方法进行总RNA提取及cDNA合成。以得到的cDNA溶液作为模板，通过PCR法调查⑶S 基因是否被转录。引物对设计于GUS基因编码区域内所导入的内含子序列（190碱基）的 两外侧。即，若存在受到转录的剪接机制作用的成熟mRNA，则检测为450碱基的PCR扩增产 物。其结果，确认到在P200和P2000的转化体中存在转录活性（图13)。另外，在对照的 P0中，无法确认到源自成熟mRNA的PCR扩增产物。由上显示，P200和P2000在植物体内均 具有启动子活性。
[0352]实施例11:长雄野牛稻PRR基闵的表汰分析
[0353] 将于"Shiokari"中仅导入了长雄野生稻的第7染色体末端区域而成的系统 "No. 240"在人工气象室中在光周期14小时30分钟（26°C)、暗期9小时30分钟（20°C)的 长昼条件下栽培4周。从4个个体中对光周期开始后0小时（Oh)和6小时（6h)的最新的 完全展开叶分别进行取样。通过实施例5中记载的方法进行总RNA提取及cDNA合成。以 得到的cDNA溶液作为模板，通过非专利文献13(0gisoetal.)中记载的方法进行实时荧 光定量PCR(real-timePCR)。PRR7基因表达量以相对于同一样品的肌动蛋白基因表达量 的相对值表示。其结果，在光周期开始后〇小时（〇h)，PRR7基因表达量在0. 21-0. 32 (平均 0. 27)的范围，与此相对，光周期开始后6小时（6h)，可得到13. 69-18. 43 (平均16. 31)这 样的值（图14)。因此，显示长雄野生稻PRR7基因启动子不是组合型，而是光诱导表达。
[0354]实施例12 :将源自高粱的PRR启动子和高粱PRR基闵编码厌域连接而成的构律体 的效果
[0355] 通过PCR从高粱（品种：Goldsorgho、KANEK0种苗）中对实施例9中分离的高粱 PRR基因的启动子区域中的DNA片段进行扩增。使用得到的DNA片段中的序列号19所示的 序列取代实施例9中得到的构建体（序列号18)的1-9046所示的序列，由此得到目标构建 体（以下为"高粱构建体"）。
[0356] 对于该高粱构建体，依据实施例5中记载的方法进行三亲交配及稻品种 "Yukihikari"的转化。转基因稻在驯化后，在温室下栽培。对得到的形状体（T0)培育60 个个体，采种T1种子。按照采种量从多到少的顺序选择18个个体，供于T1的评价试验。
[0357] 在T1代中，对18个系统（1个系统为12个个体）进行测试。接种在9月14日进 行。在移植前分别对个体切下叶，浸渍于潮霉素溶液，将对潮霉素显示抗性的个体（基因持 有个体）作为移植的对象。在9月28日，在放入有稻用育苗土的容量570ml的聚乙烯制 罐中各移植1个个体（1个系统为12个罐、合计12个个体）。对施肥而言，在每个罐中，将 N(氮）、P(磷）、K(钾）各设为 0. 21g、0. 33g、0. 05g。作为对照，栽培"Yukihikari"。栽培 在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封闭体系温室 (14小时30分钟昼长的长昼条件）中进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对 象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精颖花重量（以下为每穗重）进行性状调查。
[0358] 将结果示于表12。对高粱构建体而言，全部18个系统中的2个系统（系统No. 8、 系统No. 10)与对照"Yukihikari"相比，杆长、每穗粒数、每穗重均超出。因此，在高粱构建 体中也发现产量提高效果。
[0359][表12]
[0360] 连接高粱PRR启动子和高粱PRRcDNA而成的构建体的产量相关性状的评价
[0361]
【主权项】
1. 一种核酸，其含有： (1) 序列号1的34845-35044所示的碱基序列、或 (2) 与序列号1的34845-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性，且显不促进 植物基因转录的活性的碱基序列。2. -种核酸，其含有： (1) 序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或 (2) 与序列号1的33045-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性，且显不促进 植物基因转录的活性的碱基序列。3. -种核酸，其含有： (1) 序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或 (2) 与序列号1的26779-35044所不的喊基序列具有至少80%的同一性，且显不促进 植物基因转录的活性的碱基序列。4. 一种核酸，其是源自长雄野生稻的碱基序列，其至少包含由序列号1的34845-35044 表示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性。5. 根据权利要求4所述的核酸，其含有由序列号1的33045-35044所示碱基序列构成 的核酸的片段。6. 根据权利要求4或5所述的核酸，其含有由序列号1的26779-35044所示碱基序列 构成的核酸的片段。7. -种核酸，其通过使下述核酸可操作地连接而成： (1) 权利要求1~6中任一项所述的核酸，以及 (2) 编码（a)~（c)规定的蛋白质的核酸，其中， (a) 与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80%的同一性的 氨基酸序列； (b) 含有植物的假应答调节因子蛋白质的假受体结构域的氨基酸序列或与其具有至少 90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质的CCT基序的氨基酸序列 或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且 (c) 具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCAl(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。8. 根据权利要求7所述的核酸，其能够增大植物的产量。9. 一种载体，其含有权利要求1~8中任一项所述的核酸。10. -种转基因植物，其含有权利要求7或8所述的核酸。11. 根据权利要求10所述的转基因植物，其中，所述植物为单子叶植物。12. 根据权利要求11所述的转基因植物，其中，所述植物为稻或玉米。13. -种制备产量增大的转基因植物的方法，其包括：将权利要求7或8所述的核酸或 权利要求9的载体导入植物的工序。14. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述植物为单子叶植物。15. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述植物为稻或玉米。16. -种使植物的产量增大的方法，其包括：将权利要求7或8所述的核酸导入植物。17. -种用于对产量增加的植物进行筛选的DNA标记物，其含有序列号1的 26779-35044所示碱基序列和/或序列号1的35825-46721所示碱基序列中的15~2000 个碱基。18. -种方法，其包括：对植物中权利要求17所述的DNA标记物进行检测，并在检测出 该DNA标记物时将该植物判断为高产性。19. 一种方法，其包括：使用含有序列号1的34845-35044所不碱基序列、或与序列号 1的34845-35044所不喊基序列具有至少90%的同一性的喊基序列的核酸来提尚植物基因 的转录活性。20. -种方法，其包括：使用含有序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或与序列 号1的33045-35044所示的碱基序列具有至少90 %的同一性的碱基序列的核酸来提高植物 基因的转录活性。21. -种使植物的产量增大的方法，其包括：将可操作地连接的下述（1)及（2)的核酸 导入植物，其中， (1) 包含下述（a)或（b)规定的碱基序列的核酸： (a) 序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或包含该碱基序列的一部分且显示促进 植物基因转录的活性的片段；或者 (b) 与上述（a)所示的碱基序列具有至少90%的同一性且显示促进植物基因转录的活 性的喊基序列； (2) 编码下述（c)~（e)规定的蛋白质的核酸： (c) 与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80%的同一性的 氨基酸序列； (d) 含有植物的假应答调节因子蛋白质的假受体结构域的氨基酸序列或与其具有至少 90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质的CCT基序的氨基酸序列 或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且 (e) 具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCAl(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。22. -种核酸，其编码具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质。23. 一种蛋白质，其具有序列号3所不氣基酸序列。24. -种核酸，其由下述（1)及（2)的核酸可操作地连接而成，其中， (1) 包含下述（a)或（b)规定的碱基序列的核酸： (a) 序列号19所示碱基序列；或 (b) 与序列号19所示的碱基序列具有至少80%的同一性且显示促进植物基因转录的 活性的碱基序列， (2) 编码由下述（c)~（e)规定的蛋白质的核酸： (c) 序列号17所示氨基酸序列、或与序列号Y所示氨基酸序列具有至少80%的同一性 的氨基酸序列； (d) 含有植物的假应答调节因子蛋白质的假受体结构域的氨基酸序列或与其具有至少 90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质的CCT基序的氨基酸序列 或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且 (e) 具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCAl(Circadian
【专利摘要】本发明提供一种可对植物赋予高产性的核酸。并且，本发明还提供一种使用这样的核酸使产量增大的转基因植物和使植物的产量增大的方法。可通过将下述构建体导入植物来对该植物赋予高产性，所述构件体通过使结构基因长雄野生稻的假应答调节因子的启动子、和/或植物的假应答调节因子可操作地连接而成。
【IPC分类】C12N15/09, A01H5/00, C12Q1/68, A01H1/00
【公开号】CN104903444
【申请号】CN201380057268
【发明人】柏原正和, 小森俊之, 小鞠敏彦, 前川雅彦
【申请人】日本烟草产业株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月18日
【公告号】CA2886908A1, WO2014069339A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种对植物赋予高产性的核酸、特别是含有源自稻野生种长雄野生稻 的假应答调节因子的启动子和/或假应答调节因子的编码区域的核酸。并且，本发明涉及 一种使用上述核酸使产量增加的转基因植物的制备方法及使植物的产量增大的方法。
【背景技术】
[0002] 1.有关使植物的数量性状增加的基因的研宄
[0003] 为了培育农业上有益的新品种，进行了使植物彼此杂交而筛选后代的杂交育种法 或诱发植物突变的突变育种法等。另外，近年来，还培育有导入有用基因并表达其功能的基 因重组植物。为了培育这样的新品种，有效的方法是聚集赋予了优异性质的基因，但在期望 进一步提高作物的生产率的情况下，可利用的基因仍然较少，特别希望对控制高产性状等 数量性状的基因进行确定。
[0004] 近年来，随着分子生物学方法的发展，可使用DNA标记物进行数量性状的基因分 析。并且，还在积极地进行利用遗传图谱，并利用分子生物学方法来进行克隆农业上有用 基因的研宄。在构建有遗传图谱的生物中，进行有通过显示特定的表达型的性状和标记物 的连锁分析、以及随后的染色体步移等而尝试确定控制其性状的基因的物理位置并进行分 离基因（图谱克隆法）。但是，通常只能粗略确定含有控制数量性状的基因的部位，只能 理论上确定含有大量基因的DNA片段。而且，作为可进行克隆大小的片段或者可通过转化 导入植物大小的片段，不容易确定。另外，制备详细的基因图谱、以图谱信息为基础对要得 到的基因进行确定并对基因进行克隆的作业需要长时间和大量工作量。实际上，虽然有 若干通过图谱克隆法对使数量性状增大的基因进行克隆的例子（非专利文献1:Ashikari et.al. 2005、非专利文献2:Miuraet.al. 2010)，但其数量仍然非常有限。
[0005] 已知非洲野生的稻野生种长雄野生稻（0.longistaminata)虽然与作为栽培种的 栽培稻（O.sativaL.)具有相同的A基因组，但与栽培种相比，显示较大的生物质。本发明 人培育在稻栽培品种"Shiokari"中导入长雄野生稻的长花药的过程中，显示生长旺盛性的 BC7F6系统"No. 645"。然后，成功地利用图谱克隆将赋予生长旺盛性的区域缩小至第7染 色体最末端部约180kb。然后，对该区域的约82kb进彳丁喊基序列确定，对以其为基础制备的 转化体进行调查，但无法得到显示生长旺盛性的转化体（非专利文献3)。
[0006] 2?植物的钟相关基因
[0007] 关于植物的钟相关基因，在使用拟南芥（Arabidopsis:拟南芥属）的研宄中，发现 CIRCADIANCLOCKASS0CIATED1(CCA1),LATEELONGATEDHYP0C0TYL(LHY),TIMINGOFCAB EXPRESSION(T0C1)这样的3个基因。而且，已明确：构成植物的昼夜节律时钟的基础的机 制是这些基因表达的反馈环路。其中，T0C1基因作为假应答调节因子（Pseudoresponse regulator:PRR)之一而熟知。以下，将假应答调节因子记为PRR。作为拟南芥中所确定的 PRR基因，目前包含TOCl(PRRl)在内已知有PRR3、PRR5、PRR7、PRR9这5个。并且，发现按 照PRR9、PRR7、PRR5、PRR3、PRR1 (T0C1)的顺序，通过表达量上升/衰减而引起昼夜交替现 象（非专利文献 4:Matsushikaet.al. 2000)。
[0008]然后，在单子叶植物的稻中，确定了 5种与双子叶植物的拟南芥的PRR基因对应 的直系同源物，明确这些直系同源物与拟南芥同样地显示昼夜节律。并且，这些稻的直系 同源物、即OsPRRl、0sPRR37、0sPRR59、0sPRR73、0sPRR95分别定位于稻的基因组上的第 1染色体、第7染色体、第11染色体、第3染色体、第9染色体（非专利文献5:Murakami et.al. 2003)。另外，有向拟南芥的PRR7基因突变株导入以拟南芥PRR7的启动子对稻 0sPRR37cDNA的表达进行控制的构建体而显示功能互补的报告（非专利文献6:Murakami et.al. 2006) 〇
[0009]另外，在粳稻品种"日本晴"和籼稻"卡萨拉斯（kasalath) "之间，对OsPRR基 因的表达谱进行比较，结果非常相似，表明在粳稻和籼稻之间非常保守（非专利文献7 : MurakamiMet.al. 2005)。
[0010] 可是，关于PRR基因，报告有：通过将组成型启动子连接于该基因，植物的产量增 加。具体而言，已知有向稻导入将稻中组成型表达的启动子（G0S2启动子）连接于源自番 茄的PRR2结构基因而成的构建体，结果稻的产量增加的实例（专利文献1)，或者向稻导入 将组成型启动子（RICEACTIN启动子）连接于源自拟南芥的PRR5基因而成的构建体，结果 稻的茎数增加且高度伸长的实例（专利文献2)。但是，迄今为止不存在着眼于PRR的启动 子的例子。
[0011] 现有技术文献
[0012] 专利文献
[0013] 专利文献1 :美国专利申请公开2011/0145949
[0014]专利文献 2 :W02011/049243
[0015] 非专利文献
[0016] 非专利文献 1:AshikariM.，SakakibaraH.，LinS.，YamamotoT.，Takashi T. ,NishimuraA. ,AngelesER. ,QianQ. ,KitanoH. ,andMatsuokaM. (2005)Cytokinin oxidaseregulatesricegrainproductionScience309:741-745
[0017] 非专利文献 2:MiuraK. ,IkedaM. ,MatsubaraA. ,SongX.J. ,ItoM. ,Asano K.,MatsuokaM. ,KitanoH.andAshikariM. (2010)0sSPL14promotespaniclebranching andhighergrainproductivityinriceNatureGenetics42:545-549
[0018] 非专利文献3:前川雅彦、小森俊之"稻野生种长雄野生稻染色体部分导入系 统中的生长旺盛性所涉及的原因基因分离和功能冬野生種才y寸'?口y芊只夕s 于一夕染色体部分導入系統(乙朽汀§生育旺盛性(乙係打§原因遺伝子単離t機能解析， QT2002) 40-43 "研宄成果第473集"利用基因组育种的有效的品种育成技术的开发-QTL 基因分析的推进-(yyA育種CA3効率的品種育成技術?開発一QTL遺伝子解析?推 進一）"平成21年2月20日发行编辑发行农林水产省农林水产技术会议事务局
[0019]非专利文献 4:MatsushikaA.，MakinoS.，KojimaM.andMizunoT. (2000) CircadianWavesofExpressionoftheAPRR1/T0C1FamilyofPseudo-Response RegulatorsinArabidopsisthaliana:InsightintothePlantCircadianClockPlant CellPhysiol. 41:1002-1012
[0020] 非专利文献 5:MurakamiM.，AshikariM.，MiuraK.，YamashinoT.andMizuno T. (2003)TheEvolutionarilyConservedOsPRRQuintet:RicePseudo-Response RegulatorsImplicatedinCircadianRhythmPlantCellPhysiol.44:1229-1236
[0021] 非专利文献 6 :MURAKAMI，M.，Y.TAG0,etal. (2007)."Characterizationofthe RiceCircadianClock-AssociatedPseudo-ResponseRegulatorsinArabidopsis thaliana.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry71 (4):1107-1110.
[0022] 非专利文献 7:MurakamiM.，MatsushikaA.，AshikariM.，Yamashino T.andMizunoT. (2005)Circadian-associatedricepseudo-response regulators(OsPRRs):InsightintothecontroloffloweringtimeBiosci. Biotechnol.Biochem. 69:410-414
[0023]非专利文献 8 :Harushima，Y.，Yano,M.，Shomura，A.，Sato,M.，Shimano,T.，Ku boki,Y. ,Yamamoto,T. ,Lin,S.Y. ,Antonio,B.A. ,Parco,A. ,Kajiya,H. ,Huang,N. ,Yama moto,K. ,Nagamura,Y. ,Kurata,N. ,Khush,G.S. ,andSasaki,T. (1998)Ahigh-density ricegeneticlinkagemapwith2275markersusingasingleF2population. Genetics，148, 479-494.
[0024]非专利文献 9:Hieietal(1994)Efficienttransformationofrice(Oryza SativaL)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisofboundariesofthe T-DNAPlantJ. 6:271-282.
[0025]非专利文献 10:Komarietal(1996)VectorscarryingtwoseparateT-DNAs forco-transformationofhigherplantsmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens andsegregationoftransformantsfreefromselectionmarkers.PlantJ. 10, 165 -174.
[0026]非专利文献 11:Dittaetal(1980)BroadhostrangeDNAcloningsystem forgram-negativebacteria:constructionofagenebankofRhizobiummeliloti. ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica 77:7347-7351.
[0027]非专利文献 12:Ishidaetal. (2007)Agrobacterium-mediatedtransformation ofmaize.NatureProtocols2:1614-1621.
[0028]非特专利文献 13 :0gisoetal. (2010)TheroleofcaseinkinaseII infloweringtimeregulationhasdiversifiedduringevolution.Plant Physiology. 152:808-820
【发明内容】
[0029] 发明所要解决的问题
[0030] 如上所述，需要开发一种使植物的数量性状增加的方案。因此，本发明要解决的问 题在于，提供一种可对植物赋予高产性的核酸。并且，本发明提供一种使用这样的核酸使产 量增大的转基因植物及使植物的产量增大的方法。
[0031] 用于解决课题的技术方案
[0032] 本发明人等利用图谱克隆对位于长雄野生稻的第7染色体最末端部的赋予生长 旺盛性的区域进行研宄，缩小至第7染色体最末端部约180kb。确定了该区域的82kb的碱 基序列，5处存在lkbp以上的较大的缺失，在末端侧还存在约3kbp的插入。因此，虽然缩小 至约180kb，但由于该差异，难以进行进一步缩小。
[0033] 本发明人等也考虑"日本晴"的全长cDNA的位置，对该82kb区域设计并制制备了 7个构建体并进行了研宄。其结果，明确了：位于约82kb区域的PRR7基因同源物是赋予高 产性的原因基因。并且，本发明人等发现，令人吃惊的是，长雄野生稻的高产性不仅由基因 区域赋予，长雄野生稻的启动子区域贡献较大。
[0034] 基于以上见解，本发明提供一种含有长雄野生稻中假应答调节因子基因的启动子 的碱基序列的核酸及该启动子与假应答调节因子的结构基因可操作地连接而成的核酸。这 样的核酸可对植物赋予高产性。
[0035] 本发明优选通过以下记载的方案来进行，但并不限定于此。
[0036] [方案 1]
[0037] 一种核酸，其含有：
[0038] (1)序列号1的34845-35044所示的碱基序列、或
[0039] (2)与序列号1的34845-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性，且显不 促进植物基因转录的活性的碱基序列。
[0040] [方案2]
[0041] (1)序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或
[0042] (2)与序列号1的33045-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性，且显不 促进植物基因转录的活性的碱基序列。
[0043] [方案3]
[0044] 一种核酸，其含有：
[0045] (1)序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或
[0046] (2)与序列号1的26779-35044所不的喊基序列具有至少80 %的同一性，且显不 促进植物基因转录的活性的碱基序列。
[0047] [方案4]
[0048] 一种核酸，其是源自长雄野生稻的碱基序列，其至少包含由序列号1的 34845-35044所示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性。
[0049] [方案5]
[0050] 根据方案4所述的核酸，其含有由序列号1的33045-35044所示碱基序列构成的 核酸的片段。
[0051] [方案 6]
[0052] 根据方案4或5所述的核酸，其含有由序列号1的26779-35044所示碱基序列构 成的核酸的片段。
[0053] [方案 7]
[0054] -种核酸，其通过使下述核酸可操作地连接而成：
[0055] (1)方案1~6中任一项所述的核酸，以及
[0056] (2)编码（a)~（c)规定的蛋白质的核酸，其中，
[0057] (a)与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80%的同一 性的氨基酸序列；
[0058] (b)含有植物的假应答调节因子蛋白质中假受体结构域的氨基酸序列或与其具有 至少90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质中CCT基序的氨基酸 序列或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且
[0059] (c)具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCA1(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。
[0060][方案8]
[0061] 根据方案7所述的核酸，其能够增大植物的产量。
[0062][方案9]
[0063] 一种载体，其含有方案1~8中任一项所述的核酸。
[0064][方案10]
[0065] 一种转基因植物，其含有方案7或8所述的核酸。
[0066][方案11]
[0067] 根据方案10所述的转基因植物，其中，所述植物为单子叶植物。
[0068][方案12]
[0069] 根据方案11所述的转基因植物，其中，所述植物为稻或玉米。
[0070][方案13]
[0071] 一种制备产量增大的转基因植物的方法，其包括：将方案7或8所述的核酸或方案 9的载体导入植物的工序。
[0072][方案14]
[0073] 根据方案13所述的方法，其中，所述植物为单子叶植物。
[0074][方案15]
[0075] 根据方案14所述的方法，其中，所述植物为稻或玉米。
[0076][方案16]
[0077] -种使植物的产量增大的方法，其包括：将方案7或8所述的核酸导入植物。
[0078][方案17]
[0079] -种用于对产量增加的植物进行筛选的DNA标记物，其含有序列号1的 26779-35044所示碱基序列和/或序列号1的35825-46721所示碱基序列中的15~2000 个碱基。
[0080][方案18]
[0081] 一种方法，其包括：对植物中方案17所述的DNA标记物进行检测，并在检测出该 DNA标记物时将该植物判断为高产性。
[0082][方案19]
[0083] -种方法，其包括：使用含有序列号1的34845-35044所不碱基序列、或与序列号 1的34845-35044所不喊基序列具有至少90%的同一性的喊基序列的核酸来提尚植物基因 的转录活性。
[0084][方案20]
[0085] 一种方法，其包括：使用含有序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或与序列 号1的33045-35044所示的碱基序列具有至少90%的同一性的碱基序列的核酸来提高植物 基因的转录活性。
[0086] [方案 21]
[0087] -种使植物的产量增大的方法，其包括：将可操作地连接的下述（1)及（2)的核酸 导入植物，其中，
[0088] (1)包含下述（a)或（b)规定的碱基序列的核酸：
[0089] (a)序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或包含该碱基序列的一部分构成且 显示促进植物基因转录的活性的片段；或
[0090] (b)与上述（a)所示的碱基序列具有至少90%的同一性且显示促进植物基因转录 的活性的喊基序列；
[0091] (2)编码下述（c)~（e)规定的蛋白质的核酸：
[0092] (c)与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80%的同一 性的氨基酸序列；
[0093] (d)含有植物的假应答调节因子蛋白质中假受体结构域的氨基酸序列或与其具有 至少90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质中CCT基序的氨基酸 序列或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且
[0094] (e)具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCA1(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。
[0095] [方案 22]
[0096] -种核酸，其编码具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质。
[0097] [方案 23]
[0098] -种蛋白质，其具有序列号3所示氨基酸序列。
[0099] [方案 24]
[0100] 一种核酸，其由下述（1)及（2)的核酸可操作地连接而成，其中，
[0101] ⑴包含下述（a)或（b)规定的碱基序列的核酸：
[0102] (a)序列号19所示碱基序列；或
[0103] (b)与序列号19所示的碱基序列具有至少80%的同一性且显示促进植物基因转 录的活性的碱基序列，
[0104] (2)对由下述（c)~（e)规定的蛋白质进行编码的核酸：
[0105] (c)序列号17所示氨基酸序列、或与序列号Y所示氨基酸序列具有至少80%的同 一性的氨基酸序列；
[0106] (d)含有植物的假应答调节因子蛋白质中假受体结构域的氨基酸序列或与其具有 至少90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质中CCT基序的氨基 酸 序列或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且
[0107] (e)具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCA1(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。
[0108] 发明的效果
[0109] 通过将发明的可操作地连接本启动子和PRR7的结构基因而成的构建体导入植 物，可对植物赋予高产性。
【附图说明】
[0110] 图1为表示稻野生种长雄野生稻的染色体部分导入系统"No. 645"的基因型的图。 图1中涂抹的区域为源自长雄野生稻的染色体部分。
[0111] 图2为表示在第7染色体末端部发生重组且最末端以"No. 645"型或"Shiokari" 型固定的7个个体的基因型的图。
[0112] 图3为生长旺盛性基因周边的物理谱图。4个Fosmid克隆和实施例2中制备的7 个构建体（Frl至Fr7)的关系示于该图。
[0113] 图4为表示将Fr4片段导入稻品种"Shiokari"中形成的转化体（Fr4-4)的穗的 照片。图4的左面表示不具有Fr4片段的基因缺失个体，右面表示具有Fr4片段的基因持 有个体。
[0114] 图5为表示导入了以泛素启动子控制的含有源自长雄野生稻的PRR基因的编码区 域的构建体的转化体的穗（左）、和导入了仅含有对照的选择标记物基因的构建体的转化 体的穗（右）的图。左面由于未成熟，因此稻皮是绿色的，右面由于已成熟，因此，稻皮发黄。 另外，左面还可见大幅开颖的未闭颖的颖花（箭头）。
[0115] 图6为表示利用分离的日本晴来源、长雄野生稻来源、高粱来源、及拟南芥来源的 PRR7基因的翻译区域所编码的氨基酸序列的序列对比的图。假受体结构域（红括号）和 CCT基序（蓝括号）参考Takataetal.，（2010)BMCEvolutionaryBiology10:126。
[0116] 图7为表示利用分离的日本晴来源、长雄野生稻来源、高粱来源、及拟南芥 来源的PRR7基因的翻译区域所编码的氨基酸序列的同一性（identity) %和相似性 (similarity) %的值的图。使用基因分析软件Genetyx(注册商标）网络版ver. 11. 0. 4(株 式会社Genetyx)以默认设定（将Unitsizetocompare设定为2)实行Proteinvs ProteinGlobalHomology，由此求出同一性（identity) %和相似性（similarity) %。
[0117] 图8为将制备⑴含有源自长雄野生稻的PRR基因的构建体和（2)含有源自日本 晴的PRR基因的构建体的策略图解的图。
[0118] 图9中，图9A表示源自长雄野生稻的PRR基因的PCR产物被HpyCH4V切断。图 9B表示使用将"日本晴"、长雄野生稻的PRR基因通过杂交导入了 "Shiokari"的取代系统 "No. 240"及使用"日本晴"和"No. 240"的F1并利用PCR分析PRR基因的表达而得到的结 果。
[0119] 图10表示导入了源自长雄野生稻的Fr4片段的玉米转化体的T1系统No. 4的穗 的照片。图10的上列表示不具有Fr4片段的基因缺失个体，图10的下列表示具有Fr4片 段的基因持有个体。
[0120] 图11表示导入了含有长雄野生稻的PRR启动子和长雄野生稻的PRR基因的构建 体的玉米转化体T1系统No. 11的穗的照片。图11的R表示潮霉素抗性的基因缺陷个体， S表示潮霉素敏感性的基因保持个体。
[0121] 图12表示评价长雄野生稻的PRR启动子对GUS基因的转录活性带来的效果的实 验中使用的GUS基因表达载体的结构的图。
[0122] 图13为以长雄野生稻的PRR启动子区域的200碱基（P200)或2000碱基（P2000) 的核酸和GUS基因编码区域的连接构建体进行了转化的稻中，对GUS基因的转录活性促进 进行了评价的、RT-PCR分析的照片。G表示基因组DNA，-表示没有逆转录反应，+表示有逆 转录反应，P表示质粒DNA。
[0123] 图14为表示光周期开始后0小时和6小时长雄野生稻的PRR基因的相对表达量 的图。
【具体实施方式】
[0124] 以下，对本发明的构成具体地进行说明。
[0125] (1)源自长雄野生稻的PRR7基因的启动子
[0126] 本发明人等如下述实施例所示从长雄野生稻的Fosmid文库中选择位于有关高产 性的（长雄野生稻的）第7染色体末端部的4个Fosmid克隆（Fosl、Fos2、FoslO、Fosl2)， 通过引物步移解码该编码的碱基序列。将得到的碱基序列示于序列号1。
[0127] 使用上述4个Fosmid克隆制备了 7个互补性试验用构建体，将利用Smal及PstI 对FoslO进行处理而得到的最大的片段与利用PstI及SacI对Fosl进行处理而得到的第 4大的片段连接而成的片段为片段（Fr) 4。Fr4为与高产性有关的基因组片段，含有序列号 1的第26779位的碱基至第49155位的碱基。
[0128] 源自作为稻野生种的长雄野生稻的PRR7基因的启动子（以下，称为"本发明的启 动子"）为含有序列号1的34845-35044所不的碱基序列的核酸，优选为含有序列号1的 33045-35044所示的碱基序列的核酸，进一步优选为含有序列号1的26779-35044所示的碱 基序列的核酸。
[0129] 在本申请说明书中，"启动子"是指：具有对相邻下游存在的任意植物的结构基因 的转录进行活化的功能的核酸。本申请说明书中的"启动子"是以广义的含义进行解释的 启动子，并不限定于转录因子结合并具有引导正确的转录开始作用的核心启动子区域等狭 义的含义。本发明的启动子并不仅限于PRR基因的编码区域，具有促进各种植物的任意结 构基因的转录活性的作用。即，本发明含有在植物的任意结构基因上可操作地连接了本发 明的启动子的核酸。该核酸优选不是天然来源的基因组片段。
[0130]另外，本申请说明书中促进结构基因的转录活性的作用包含通过光等刺激诱导而 促进结构基因的转录活性，由此调节或控制该活性的实施方式。在此，启动子通过光的刺激 而被诱导，从而促进结构基因的转录活性是指：在光存在的光周期，启动子促进结构基因的 转录活性，但在其以外的时期启动子不会促进结构基因的转录活性。
[0131] 本发明的启动子为含有序列号1的34845-35044所示的碱基序列的核酸，优选 为含有序列号1的33045-35044所示的碱基序列的核酸，进一步优选为含有序列号1的 26779-35044所示的碱基序列的核酸。另外，本发明的启动子并不限定于这些核酸，还包含 与这些核酸具有一定以上序列同一性的核酸及这些核酸的片段，下面对其进行叙述。
[0132] 通过将该启动子与PRR7基因可操作地连接并导入植物，可对植物赋予高产性。 即，本发明的启动子优选在与编码具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质的核酸可操作地 连接时能够增大植物的产量。
[0133] 本申请说明书中的PRR7蛋白质的定义记载在下述（2)"本发明的启动子和PRR的 结构基因可操作地连接的核酸"中。
[0134] 在本申请说明书中，"高产性"是指植物的总重量、地上部分重量、产量、茎径、茎 数、杆长、叶面积、叶数、穗数、一穗粒数、穗长、总穗重、或种子产量等中的一部分或多种增 大，优选是指总穗重和/或种子产量增大，更优选是指成熟种子产量增加。在稻、玉米等谷 物中，成熟种子产量为非常重要的性状。作为增大的指标，例如可通过与对照植物（亲本植 物、非转化体等）比较而进行评价。另外，在本申请说明书中，"高产性"和"生长旺盛性"表 不相同的含义。
[0135] 在序列号1中，与26779-35044对应的序列为长雄野生稻的PRR7基因的启动子 区域，与35825-46721对应的序列为长雄野生稻的PRR7基因的编码区域，与46722-49157 对应的序列为长雄野生稻的PRR7基因的终止子区域。上述启动子区域中，序列号1的 34845-35044所示的碱基序列与转录起始点的上游区域200个碱基对应，序列号1的 33045-35044所示的碱基序列与转录起始点的上游区域2000个碱基对应。
[0136] 本发明的启动子的碱基序列并不限定于序列号1的34845-35044所示的序列、序 列号1的33045-35044所示的序列、或者序列号1的26779-35044所示的序列，还包含含有 与这些碱基序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%、99%、或者99. 5%的同一性，且显 示促进植物的编码区域的转录的活性的碱基序列的核酸。
[0137] 在其它方面，本发明的启动子为源自长雄野生稻的碱基序列，含有至少由序列号1 的34845-35044表示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性的核酸。在这样的核酸 中，优选含有由序列号1的33045-35044所示的碱基序列构成的核酸的片段，进一步含有由 序列号1的26779-35044所示的碱基序列构成的核酸的片段。在此，核酸的片段是指通过 序列号1的上述特定的碱基编号规定范围的碱基序列的一部分的核酸。虽然没有限定，但 具体而言包含由序列号1的26779-35044得到的更短的序列、即与转录起始点的上游区域 6000个碱基对应的序列、与5000个碱基对应的序列、与4000个碱基对应的序列、与3000个 碱基对应的序列、与2000个碱基或者1000个碱基对应的序列等。
[0138] 2个核酸序列的同一性％可通过视觉检查和数学计算确定，或更优选该比较通过 使用计算机程序对序列信息进行比较来进行。代表的优选计算机程序为遗传学计算机小组 (GCG;麦迪逊，威斯康星州）的威斯康星.软件包10.0程序"GAP"(theGeneticsComputer Program(GCG；Madison,ffis.)WisconsinPackageVersion10. 0Program,GAP)(Devereux 等，1984,Nucl.AcidsRes.，12:387)。通过使用该"GAP"程序，除了对2个核酸序列进行 比较之外，还可以进行2个氨基酸序列的比较、核酸序列和氨基酸序列之间的比较。在此， "GAP"程序的优选默认参数可以使用：（1)对核苷酸的（包括对于同一物为1，对于非同一 物为〇的值）一元（unary)比较矩阵的GCG运行、和如khwartz和Dayhoff修订"多肽的 序列和结构图谱（AtlasofPolypeptideSequenceandStructure)"国立生物医学研宄财 团，353-358 页，1979 年所记载的Gribskov和Burgess，Nucl.AcidsRes.，14 卷：6745 页， 1986年的加权氨基酸比较矩阵；或其它可比较的比较矩阵；（2)对氨基酸各缺口的30个罚 分和对各空位中的各记号追加的1个罚分；或对核苷酸序列的各缺口的50个罚分和对各空 位中的各记号追加的3个罚分；(3)对末端缺口无罚分；及（4)对长缺口无最大罚分。在本 领域技术人员所使用的其它序列比较程序中，可以使用例如可以通过美国国立医学图书馆 的网站：
[0139]http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html使用的BLASTN程序、 版本2. 2. 7、或UW-BLAST2. 0算法。对UW-BLAST2. 0的标准默认常数的设定在以下互联网 网址：http://blaSt.wustl.edu记载。并且，BLAST算法使用带有BL0SUM62氨基酸评分 的矩阵，可以使用的选择参数如下所述：(A)包括用于掩码下述片段的滤波器：具有低组 成复杂性的查询序列的片段（根据Wootton和及Federhen的SEG程序（Computersand Chemistry，1993年）进行确定；也可参考Wootton及Federhen，1996年"序列数据库中 的组分偏移区域的分析（Analysisofcompositionallybiasedregionsinsequence datebases)〃MethodsEnzymo1.，266卷：544_571页。）、或含有短周期性的内部重复构成 的片段（根据Claverie和States(ComputersandChemistry,I"3)的XNU程序进行确 定）；及⑶用于报告对碱基序列的匹配的统计学显著性的阈值，或E-评分（按照（Karlin 和AltSchul，1990年）的统计学模型，单纯通过偶然发现的匹配的期待确率；当起因于某 个匹配的统计学显著差异比E-评分阈值大时，不报告该匹配），优选E-评分阈值的数值 为 0. 5,或按照优选程度递增的顺序为 0. 25、0. 1、0. 05、0. 01、0. 001、0. 0001、le-5、le-10、 le-15、le-20、le-25、le-30、le-40、le-50、le-75、或Ie-100〇
[0140] 本发明的启动子的突变体也可以为含有在严谨条件下与序列号1的34845-35044 所示的碱基序列、优选序列号1的33045-35044所示的碱基序列、进一步优选序列号1的 26779-35044所示的碱基序列的互补链杂交的碱基序列而成的核酸，即具有启动子活性的 核酸。
[0141] 在此，"严谨条件下"是指在中度或高度的严谨条件下进行杂交。具体而言，关于 中度严谨条件，基于例如DNA长度，掌握常规技术的该领域技术人员能够容易地确定。基本 条件如Sambrook等，分子克隆：实验室指南（MolecularCloning:ALaboratoryManual), 第3版，第6章，冷泉港实验室出版社（ColdSpringHarborLaboratoryPress), 2001中 所示，例如包括下述条件的使用：5XSSC、0. 5%SDS、1.0mMEDTA(pH8. 0)的预清洗溶液、约 42°C下的约 50% 的甲酰胺、2XSSC~6XSSC优选 5XSSC~6XSSC、0. 5%SDS(或约 42°C 下的约50%甲酰胺中的、Stark's溶液等其它同样的杂交溶液）的杂交条件，及例如在约 50°C-68°C、0. 1XSSC~6XSSC、0. 1%SDS的清洗条件。优选中度严谨条件包括约50°C、 6XSSC、0.5%SDS(及清洗条件）。
[0142] 关于高度严谨条件，基于例如DNA长度，本领域技术人员也能够容易地确定。通 常，这样的条件包括比中度严谨条件更高温度和/或更低盐浓度的杂交（例如含有〇. 5% 左右的SDS、约65°C，6XSSC~0? 2XSSC，优选6XSSC、更优选2XSSC、更优选0? 2XSSC 或者0.IXSSC的杂交）和/或清洗，例如可定义为如上所述的杂交条件及伴随约65°C~ 68°C、0. 2XSSC~0. 1XSSC、0. 1%SDS的清洗。关于杂交及清洗的缓冲液，可以使用 SSPE(1XSSPE为0.15MNaCl、10mMNaH2P04以及1.25mMEDTA，pH7.4)代替SSC(1XSSC 为0. 15MNaCl及15mM柠檬酸钠），在杂交结束后15分钟~1小时左右进行清洗。
[0143]另外，也可使用探针中未使用放射性物质的市售杂交试剂盒。具体而言，可以举 出：使用ECLdirectlabeling&detectionsystem(Amersham株式会社制造）进行的杂交 等。作为严谨的杂交，例如可以举出：向试剂盒的杂交缓冲液中加入5% (w/v)的封闭试剂， 使NaCl达到0. 5M，在42°C进行4小时杂交，清洗在0. 4%SDS、0. 5XSSC中以55°C清洗两 次，每次20分钟，在2XSSC中，室温条件下，清洗一次5分钟。
[0144] (2)本发明的启动子和PRR7结构基因可操作地连接而成的核酸
[0145] 本发明为含有本发明的启动子与编码植物的PRR7蛋白质的碱基序列的核酸（即 PRR7结构基因）可操作地连接而成的核酸。在此所谓的本发明的启动子为在上述（1)源 自"长雄野生稻的PRR7基因的启动子"项中记载的启动子。通过将本发明的启动子与PRR7 的结构基因可操作地连接而成的上述核酸导入植物，可对植物赋予高产性。在下述实施例 中，实际上显示通过导入由序列号1的26779-35044所示的碱基序列构成的本发明的启动 子与PRR7的结构基因可操作地连接而成的核酸，植物变为高产性。适宜选择由序列号1的 26779-35044得到的更短的序列、即与转录起始点的上游区域6000个碱基对应的序列、与 5000个碱基对应的序列、与4000个碱基对应的序列、与3000个碱基对应的序列、与2000个 碱基或者1000个碱基对应的序列等作为启动子，而使用其对植物赋予高产性为可由本领 域技术人员基于本申请说明书中所公开的见解容易地进行的事项。即，本领域从业人员基 于本申请说明书的记载，使这样的序列与编码具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质的核 酸可操作地连接，并对导入其的植物的产量进行确认，由此可容易地选择。如上所述可对植 物赋予高产性的核酸优选为使本发明的启动子和PRR7的结构基因结合而成的核酸，本发 明的启动子具有下述活性：通过利用光等刺激诱导而促进结构基因转录的活性，由此对该 活性进行调节或控制。
[0146] 本申请说明书中"可操作地连接"是指：本发明的启动子的核酸与PRR7的结构基 因的核酸以使启动子能够发挥促进结构基因的转录活性这样的启动子活性的功能的方式 进行结合。
[0147] 本申请说明书中"PRR7蛋白质"是指满足以下条件的蛋白质。
[0148] (a)具有序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列的蛋白质
[0149] 本说明书中的PRR7蛋白质为具有序列号3所不氣基酸序列或序列号5所不氣基 酸序列的蛋白质。源自长雄野生稻的PRR7蛋白质由序列号3所示的740个氨基酸构成，由 序列号2所示的碱基序列的核酸进行编码。源自日本晴的PRR7蛋白质由序列表的序列号 5所示的742个氨基酸构成，由序列号4所示的碱基序列的核酸进行编码。
[0150] 本说明书中的PRR7蛋白质并不限定于含有序列号3或序列号5所示氨基酸序列 的蛋白质，包含具有下述氨基酸序列的蛋白质：与序列号3或序列号5所示氨基酸序列具有 至少 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、或者 99% 的同一性。
[0151] 另外，本说明书中的PRR7蛋白质包含具有下述氨基酸序列的蛋白质：与序列号3 或序列号5所示氨基酸序列具有至少90%、95%、97 %或者99 %的相似性。
[0152] 在本申请说明书中，氨基酸序列的相似性％是指：考虑了氨基酸的不同的蛋白质 间的相似性的程度。即，进行后述的氨基酸的保守取代等时，看作为相似的氨基酸而求出的 值为相似性％。
[0153] (b)含有PR结构域和CCT基序的蛋白质
[0154] 本申请说明书中的PRR7蛋白质为含有PR结构域和CCT基序的蛋白质。已知PRR 蛋白质与植物的昼夜节律时钟相关，普遍存在于植物中。PRR蛋白质含有高度保守的假受 体（pseudo_receiver:PR)结构域和CCT基序。已知PR结构域为PRR蛋白质的共同基序， 具有蛋白质的相互作用能力。另外，CCT基序富有碱性，认为参与蛋白质间的结合。PRR7蛋 白质为PRR蛋白质之一，含有PR结构域和CCT基序。
[0155]PR结构域在序列号3的氨基酸序列中相当于氨基酸编号62~176,在序列号5的 氨基酸序列中相当于氨基酸编号62~176。并且，CCT基序在序列号3的氨基酸序列中相 当于氨基酸编号676~722,在序列号5的氨基酸序列中相当于氨基酸编号678~724。因 此，在本申请说明书中，PR结构域是指相当于序列号3的氨基酸序列的氨基酸编号62~ 176的氨基酸序列。并且，在本申请说明书中，CCT基序是指相当于序列号3的氨基酸序列 的氨基酸编号676~722的氨基酸序列的氨基酸序列。但是，在本申请说明书中，PRR7蛋白 质的PR结构域和CCT基序的氨基酸序列并不限定于上述PR结构域和CCT基序，还包含与 这些氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%或者99%的同一性的氨基酸序列。
[0156]在PR结构域的氨基酸序列中，优选序列号3的氨基酸编号64的缬氨酸（Val)、66 的亮氨酸（Leu)、67的缬氨酸（Val)、70的天 冬酰胺酸（Asp)、71的天冬胺酸（Asp)、73的苏 氨酸（Thr)、74的精氨酸（Arg)、77的缬氨酸（Val)、79的丙氨酸（Ala)、80的亮氨酸（Leu)、 81的亮氨酸（Leu)、82的精氨酸（Arg)、84的半胱氨酸（Cys)、86的酪氨酸（Tyr)、87的谷氨 酸（Glu)、88的缬氨酸（Val)、91的丙氨酸（Ala)、93的天冬酰胺（Asn)、94的甘氨酸（Gly)、 97的丙氨酸（Ala)、98的色氨酸（Trp)、101的亮氨酸（Leu)、102的谷氨酸（Glu)、103的天冬 胺酸（Asp)、106的天冬酰胺（Asn)、108的异亮氨酸（lie)、109的天冬酰胺酸（Asp)、111的 缬氨酸（Val)、112的亮氨酸（Leu)、113的苏氨酸（Thr)、114的谷氨酸（Glu)、115的缬氨酸 (Val)、117的蛋氨酸（Met)、118的脯氨酸（Pro)、121的丝氨酸（Ser)、122的甘氨酸（Gly)、 123的异亮氨酸（lie)、125的亮氨酸（Leu)、126的亮氨酸（Leu)、129的异亮氨酸（lie)、 132的组氨酸（His)、138的异亮氨酸（lie)、139的脯氨酸（Pro)、140的缬氨酸（Val)、141 的异亮氨酸（lie)、142的蛋氨酸（Met)、143的蛋氨酸（Met)、144的丝氨酸（Ser)、145的丝 氨酸（Ser)、147的天冬胺酸（Asp)、149的蛋氨酸（Met)、152的缬氨酸（Val)、153的苯丙氨 酸（Phe)、154的赖氨酸（Lys)、155的半胱氨酸（Cys)、156的亮氨酸（Leu)、157的丝氨酸 (Ser)、158的赖氨酸（Lys)、159的甘氨酸（Gly)、160的丙氨酸（Ala)、161的缬氨酸（Val)、 162的天冬胺酸（Asp)、163的苯丙氨酸（Phe)、164的亮氨酸（Leu)、165的缬氨酸（Val)、 166的赖氨酸（Lys)、167的脯氨酸（Pro)、169的精氨酸（Arg)、170的赖氨酸（Lys)、171的 天冬酰胺（Asn)、172的谷氨酸（Glu)、173的亮氨酸（Leu)、174的赖氨酸（Lys)、176的亮氨 酸（Leu)的氨基酸残基未被取代而保存。在本申请说明书中，将这些氨基酸残基称为"假受 体（PR)结构域保守氨基酸"。
[0157] 在PR结构域的氨基酸序列中，进一步优选除上述的"假受体（PR)结构域保守氨 基酸"以外，序列号3的氨基酸编号68的谷氨酸（Glu)、72的丝氨酸（Ser)、75的谷酰胺 (Gin)、76的缬氨酸（Val)、78的丝氨酸（Ser)、89的异亮氨酸（lie)、90的脯氨酸（Pro)、92 的谷氨酸（Glu)、100的酪氨酸（Tyr)、105的谷酰胺（Gin)、110的亮氨酸（Leu)、127的丝氨 酸（Ser)、134的异亮氨酸（lie)、135的半胱氨酸（Cys)、136的赖氨酸（Lys)、146的天冬酰 胺（Asn)、175的天冬酰胺（Asn)的氨基酸残基也未被取代而保存。另外，关于氨基酸编号 68的谷氨酸（Glu)，也可以为序列号5的氨基酸编号68的天冬胺酸（Asp)。另外，在PR结 构域的氨基酸序列中，进一步优选除上述的"假受体（PR)结构域保守氨基酸"以外，序列号 3的氨基酸编号62的异亮氨酸（lie)、65的亮氨酸（Leu)、96的谷酰胺（Gin)、131的天冬酰 胺（Asn)、137的天冬酰胺（Asn)、150的甘氨酸（Gly)、168的异亮氨酸（lie)的氨基酸残基 也未被取代而保存。
[0158]在CCT基序的氨基酸序列中，优选序列号3的氨基酸编号676的谷酰胺（Gin)、 678的谷氨酸（Glu)、682的丙氨酸（Ala)、683的丙氨酸（Ala)、686的赖氨酸（Lys)、687的 苯丙氨酸（Phe)、688的精氨酸（Arg)、690的赖氨酸（Lys)、691的精氨酸（Arg)、692的赖 氨酸（Lys)、694的精氨酸（Arg)、696的苯丙氨酸（Phe)、698的赖氨酸（Lys)、699的赖氨酸 (Lys)、700的缬氨酸（Val)、701的精氨酸（Arg)、702的酪氨酸（Tyr)、703的谷酰胺（Gin)、 704的丝氨酸（Ser)、705的精氨酸（Arg)、706的赖氨酸（Lys)、708的亮氨酸（Leu)、709的 丙氨酸（Ala)、710的谷氨酸（Glu)、711的谷酰胺（Gin)、712的精氨酸（Arg)、713的脯氨酸 (Pro)、714的精氨酸（Arg)、715的缬氨酸（Val)、716的精氨酸（Arg)、717的甘氨酸（Gly)、 718的谷酰胺（Gln)、719的苯丙氨酸（Phe)、720的缬氨酸（Val)、721的精氨酸（Arg)的氨 基酸残基未被取代而保存。在本申请说明书中，将这些氨基酸残基称为"CCT基序保守氨基 酸"。
[0159] 另外，在CCT基序的氨基酸序列中，进一步优选除上述的"CCT基序保守氨基酸"以 外，序列号3的氨基酸编号677的谷酰胺（Gin)、氨基酸编号695的天冬氨酸（Asn)、697的 甘氨酸（Gly)、707的精氨酸（Arg)、722的谷酰胺（Gin)的氨基酸残基也未被取代而保存。 另外，关于氨基酸编号677的谷氨酸（Glu)，也可以为序列号5的氨基酸编号679的精氨酸 (Arg)。另外，在CCT基序的氨基酸序列中，进一步优选除上述的"CCT基序保守氨基酸"以 外，序列号3的氨基酸编号689的谷氨酰胺（Gin)、693的谷氨酸（Glu)的氨基酸残基也未 被取代而保存。
[0160] 本申请说明书中的与PR结构域具有同一性的氨基酸序列可以保持PR结构域保守 氨基酸，且在PR结构域的氨基酸序列中，未对PR结构域保守氨基酸以外的氨基酸进行修 饰。
[0161] 本申请说明书中的与CCT基序具有同一性的氨基酸序列可以保持CCT基序保守氨 基酸，且在CCT基序氨基酸序列中，未对CCT基序保守氨基酸以外的氨基酸进行修饰。
[0162] 这些氨基酸的修饰可以为氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加。另外，氨基酸的 取代也可以为保守取代，其对特定的氨基酸残基利用具有类似的物理化学特性的残基进行 取代。保守取代的非限定性的例子包含Ile、Val、Leu或Ala互相的取代这样的含有脂肪族 基团的氨基酸残基之间的取代、Lys及Arg、Glu及Asp、Gin及Asn相互的取代这样的极性 基团残基之间的取代等。
[0163] (c)具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCA1(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性
[0164] 本发明人等发现，位于长雄野生稻的第7染色体末端，且具有序列号2所示碱基序 列的PRR基因、及位于"日本晴"的第7染色体末端，且具有序列号4所示碱基序列的PRR 基因（0sPRR37)为与高产性有关的基因。这些PRR蛋白质被归类为PRR7,PRR7蛋白质具 有对LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCA1(CircadianClock-Associated1)基 因转录进行抑制的活性。即，在申请说明书中，PRR7蛋白质具有抑制LHY(LateElongated Hypocotyl)基因及CCA1(CircadianClock-Associated1)基因的转录的活性。
[0165] 如下述的实施例所示通过使由源自长雄野生稻的PRR7的启动子与源自日本晴的 PRR7结构基因可操作地连接而成的核酸导入植物，可增大植物的产量，即对该植物赋予高 产性。因此，在得到本发明的效果时，本发明的源自长雄野生稻的PRR7的启动子发挥重要 的作用。
[0166] 并且，本发明为如下得到的核酸：将与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨 基酸序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或者99%的同一性的氨 基酸序列、且编码在与源自长雄野生稻的PRR7基因的启动子可操作地连接时具有增大植 物产量的活性的蛋白质进的核酸与源自长雄野生稻的PRR7基因的启动子可操作地连接而 成。将该核酸导入植物也可对植物赋予高产性。在本发明的优选的实施方式中，这样的核 酸可以对含有PR结构域和CCT基序的蛋白质进行编码、和/或对具有对LHY基因及CCA1 基因的转录进行抑制的活性的蛋白质进行编码。另外，该核酸可用作下述（3)~（6)中记 载的本发明的核酸。
[0167] (3)载体，其含有本发明的启动子或者含有将本发明的启动子与PRR7结构基因可 操作地连接而成的核酸
[0168] 本发明为单独含有本发明的启动子的载体、或者含有本发明的启动子与含有编码 PRR7蛋白质的碱基序列的核酸（PRR7的结构基因）可操作地连接而成的核酸的载体。这样 的载体用于对植物赋予高产性。
[0169] 并且，本发明为下述载体在对植物赋予高产性的用途：含有本发明的启动子与含 有对PRR7蛋白质进行编码的碱基序列的核酸（PRR7的结构基因）可操作地连接而成的核 酸。
[0170] 载体可简单地通过利用常规方法将期望的基因连接于本领域中可获得的重组用 载体来制备。在使用本发明的核酸对植物赋予高产性的情况下，植物转化用载体特别有用。 本发明中所使用的载体只要用于在植物细胞中实现本发明的目标效果就没有特别限定，例 如可以使用pBI系的载体、pBluescript系的载体、pUC系的载体等。作为pBI系的载体， 例如可以举出：pBI121、pBIlOl、pBIlOl. 2、pBIlOl. 3、pBI221等。从能够经由土壤杆菌向 植物导入目标DNA的方面考虑，优选pBI系的载体等双元载体。另外，作为pBluescript 系的载体，例如可以举出：pBluescriptSK(+)、pBluescriptSK(-)、pBluescriptII KS(+)、pBluescriptIIKS(-)、pBluescriptIISK(+)、pBluescriptIISK(-)等。作 为pUC系的载体，可以举出：pUC19、pUC119等。从能够向植物直接导入DNA的方面考虑， 优选pBluescript系的载体、pUC系载体。并且，也可优选使用pGreen系列（www.pgreen. ac.uk)、pCAMBIA系列（www.cambia.org)等双元载体或pSBll(Komarietal, 1996,Plant J，10:165-174)、pSB200(Komorietal, 2004,PlantJ, 37:315-325)等超级双元载体。
[0171]另外，上述载体优选包含含有转录产物的稳定化所需的多聚腺苷酸化位点的转录 终止子序列。该领域从业人员可适当地选择转录终止子序列。
[0172] 转录终止子序列只要具有作为转录终止部位的功能就没有特别限定，也可以为公 知的序列。例如可优选使用胭脂碱合成酶基因的转录终止区域（Nos终止子）、花椰菜花叶 病毒35S的转录终止区域（CaMV35S终止子）等。在上述重组表达载体中，通过将转录终止 子序列配置于适当的位置，可以在导入于植物细胞后对不必要地合成较长转录物的现象等 的发生进行防止。
[0173] 另外，上述重组表达载体中也可以进一步含有其它的DNA片段。该其它的DNA片 段没有特别限定，可以举出：转化体筛选标记物、增强子、用于提高翻译效率的碱基序列等。 另外，上述重组表达载体也可以进一步具有T-DNA区域。特别是在使用土壤杆菌将上述重 组表达载体导入植物体的情况下，T-DNA区域可提高基因导入的效率。
[0174] 作为转化体筛选标记物，例如可以使用药物抗性基因。作为这种药物抗性基因的 一个具体例子，例如可以举出：针对潮霉素、博来霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等的药 物抗性基因（对抗生素卡那霉素或庆大霉素为抗性的新霉素磷酸转移酶基因、对潮霉素为 抗性的潮霉素磷酸转移酶基因）。另外，也可利用对除草剂膦丝菌素为抗性的草铵膦乙酰转 移酶基因等。由此，通过对在含有上述抗生素或除草剂的培养基中生长的植物体进行选择， 可容易地筛选进行了转化的植物体。
[0175] 作为用于提高翻译效率的碱基序列，例如可以举出：源自烟草花叶病毒的omega 序列。通过将该omega序列配置于启动子的非翻译区域（5'UTR)，可提高上述融合基因的 翻译效率。
[0176] 另外，作为增强子，可以举出含有CaMV35S启动子内的上游侧的序列的增强子区 域。如上所述，在上述重组表达载体中，可以根据其目的而含有各种DNA片段。
[0177] 关于重组表达载体的构建方法也没有特别限定，只要在适宜选择的作为母体的载 体中以指定顺序导入本发明的启动子、PRR7的结构基因、及终止子序列、以及根据需要的上 述其它DNA片段即可。为了将上述基因插入作为母体的载体，可使用依据常规方法将提纯 的基因的DNA以适当的限制酶切断，并插入于适当的载体DNA的限制酶部位或多克隆位点 的方法等（例如，分子克隆（MolecularCloning) ,5. 61-5. 63)〇
[0178] 对本领域从业人员而言，可通过一般的基因工程技术适宜制备具有期望基因的载 体。通常，可通过利用市售的各种载体来容易地制备。
[0179] (4)导入了本发明的启动子和PRR7的结构基因的转基因植物
[0180] 并且，本发明为一种将含有本发明的启动子与含有编码PRR7蛋白质的碱基序列 的核酸（PRR7的结构基因）可操作地连接而成的核酸导入植物的转基因植物。上述核酸通 常被插入于适当的载体，导入于作为转化对象的植物细胞中。即，本发明提供一种持有上 述核酸或重组表达载体的植物细胞（转基因植物）。上述植物细胞包含各种形态的植物细 胞、例如悬浮培养细胞、原生质体、植物体中的细胞。另外，作为本发明的转化体，不仅包含 植物细胞，还包含植物体整体、植物器官（例如根、茎、叶、花瓣、种子、果实、成熟胚、未成熟 胚、胚珠、子房、苗端、花药、花粉等）、植物组织（例如表皮、韧皮部、软组织、木质部、维管束 等）、它们的切片、愈伤组织、芽原基、多芽体、毛状根及培养根等中的任一者。
[0181] 作为在宿主细胞内使上述基因表达的方法，可以举出：将上述基因导入适当的 载体，例如通过聚乙二醇法、土壤杆菌法、脂质体法、阳离子脂质体法、磷酸钙沉淀法、电 脉冲穿孔法（电穿孔）（CurrentprotocolsinMolecularBiologyedit.Ausubelet &1.(1987)?油11811.了〇111111167&5〇118.56(^1〇119.1-9.9)、脂质体介导法（6180)-8虬株式 会社制造）、微注射法、基因枪法等本领域从业人员公知的方法导入生物体内的方法。在本 发明中，可优选使用土壤杆菌法。在向植物体内导入本发明的基因的情况下，基因也可使用 微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法等直接导入植物细胞，但也可以组入用于向植物导入基因 的质粒并将其作为载体，经由具有植物感染能力的病毒或者细菌，间接地导入植物细胞。作 为这种病毒，例如作为代表性的病毒，可以举出：花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、双生病毒 群等，作为细菌，可以举出土壤杆菌等。在通过土壤杆菌法进行向植物的基因导入的情况 下，可以使用市售的质粒。
[0182] 另外，本发明不仅包含直接导入了上述核酸或载体的植物细胞，还包含使植物细 胞生长而成的植物体、该植物的后代、子孙或克隆的植物以及繁殖材料（例如种子、果实、 切穗、块茎、块根、植株、愈伤组织、原生质体等）。原子转基因植物细胞的植物体的再生可以 根据植物细胞的种类使用本领域从业人员公知的方法来进行。上述技术已经确立，并广泛 应用于本发明的技术领域，在本发明中，可优选使用上述方法。
[0183] 对转化的植物细胞进行再分化而再生植物体的方法根据植物细胞的种类而不 同，例如，若为稻，则可以举出：Fujimura等（PlantTissueCultureLett.2:74(1995)) 的方法，若为玉米，贝丨」可以举出：Shillito等（Bio/Technology7:581(1989))的方法和 Gorden-Kamm等（PlantCell2:603(1990))的方法。通过上述方法再生，且栽培的转基因 植物体中所导入的外来基因的存在可通过如下操作进行确认：通过公知的PCR法或DNA杂 交法对植物体中的DNA的碱基序列进行分析。此时，DNA自转基因植物体的提取可依据公 知的J.Sambrook等的方法（分子克隆（MolecularCloning)、第2版、冷泉港实验室出版社 (ColdSpringHarborLaboratoryPress)，1989)实施。
[0184]例如，在使用PCR法对在再生的植物体中存在的本发明的基因进行分析的情况 下，以如上所述从再生植物体中提取的DNA作为模板进行扩增反应。另外，也可以使用具有 依据本发明的基因或者经修饰的基因的碱基序列而进行了适当选择的碱基序列而合成的 寡核苷酸作为引物，在混合了它们的反应液中进行扩增反应。在扩增反应中，若反复进行几 十次DNA的改性、退火、延伸反应，则可得到含有本发明的基因的碱基序列的DNA片段的扩 增产物。若将含有扩增产物的反应液供于例如琼脂糖电泳，则可使所扩增的各种DNA片段 分级，并对该DNA片段与本发明的基因对应情况进行确认。
[0185] 若一旦得到在基因组内导入有本发明的基因的转基因植物体，则可由该植物体通 过有性繁殖或无性繁殖得到子代。另外，也可以由该植物体或其子代或者克隆得到繁殖材 料，并以它们为基础批量生产该植物体。本发明中包含导入有本发明的基因或重组表达载 体的植物细胞、含有该细胞的植物体、该植物体的子代及克隆以及该植物体、其子代、及克 隆的繁殖材料。即，本发明中包含作为实施了转化处理的再分化一代的"T0代"、作为T0代 的植物的自体受精种子的"n代"等后代植物、及以它们作为一个亲本进行杂交而得到的杂 种植物或其后代植物。
[0186] 如上制备的植物体与通常的植物相比，可期待具有高产性这样的有利的特性。用 作本发明中进行转化的对象植物没有特别限定，可通过本发明的方法制备具有高产性的各 种转基因植物。
[0187] 在本发明的优选的实施方式中转化的植物为被子植物，优选为单子叶植物，进一 步优选为稻、玉米、高粱，最优选为稻和玉米。另外，本发明的优选实施方式中进行了转化的 植物为短日照植物。
[0188] 在下述的实施例中，示出制备导入了本发明的启动子和源自长雄野生稻的PRR结 构基因的转化玉米。
[0189] (5)制备使用本发明的启动子和PRR7的结构基因使产量增大的转基因植物的方 法
[0190] 并且，本发明为一种制备使产量增大的转基因植物的方法，其包括：将下述核酸导 入植物的工序：所述核酸是将本发明的启动子和含有编码PRR7蛋白质的碱基序列的核酸 (PRR7的结构基因）可操作地连接而成的。更具体而言，制备本发明的启动子序列和编码 PRR7蛋白质的的核酸（PRR7的结构基因）可操作地连接而成的核酸，并将所述核酸导入植 物细胞，由导入有核酸的上述植物细胞再生植物体，由此可制备使产量增大的转基因植物。 作为用于导入核酸的植物材料，例如可以举出：根、茎、叶、种子、成熟胚、未成熟胚、胚珠、子 房、苗端、花药、花粉等植物组织或其切片、细胞、愈伤组织、对其进行酶处理而除去了细胞 壁的原生质体等植物细胞，可优选使用成熟胚或未成熟胚。制备本发明的转基因植物的方 法没有特别限定，可以使用本技术领域中一般使用的各种植物的转化方法。例如可适宜使 用上述（4)中记载的转化方法。
[0191] 在本发明的优选实施方式中转化的植物为被子植物，优选为单子叶植物，进一步 优选为稻、玉米、高粱，最优选为稻和玉米。另外，本发明的优选的实施方式中转化的植物为 短日照植物。在下述的实施例中，示出通过将本发明的启动子和源自长雄野生稻的PRR结 构基因导入玉米，可对玉米赋予高产性。
[0192] (6)使植物的产量增大的方法
[0193] 并且，本发明为一种使植物的产量增大的方法，其包括：使核酸导入植物，所述核 酸通过使含有本发明的启动子序列和编码PRR7蛋白质的碱基序列的核酸（PRR7的结构基 因）可操作地连接而成。通过上述（2)中叙述的核酸导入植物，可增大植物的产量。本方法 中使用的PRR7蛋白质满足上述（2)中所规定的PRR7蛋白质的定义。即为与序列号3所示 氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 97 %、或者99 %的同一性的氨基酸序 列，含有PR结构域和CCT基序，且具有抑制LHY基因及 CCA1基因转录的活性的蛋白质。与PR结构域具有同一性的氨基酸序列可以保持PR结构域 的保守氨基酸，且在PR结构域的氨基酸序列中，未对PR结构域保守氨基酸以外的氨基酸进 行修饰。与CCT基序具有同一性的氨基酸序列可以保持CCT基序保守氨基酸，且在CCT基 序氨基酸序列中，未对CCT基序保守氨基酸以外的氨基酸进行修饰。
[0194] 与编码PRR7蛋白质的碱基序列可操作地连接的启动子优选为由序列号1的 34845-35044所示的碱基序列、序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或者序列号1的 26779-35044所示的碱基序列构成的核酸。本方法中所使用的启动子并不限定于这些核酸， 还包含由序列号1的34845-35044所不的碱基序列的一部分、序列号1的33045-35044所不 的碱基序列的一部分、或者序列号1的26779-35044所不的碱基序列的一部分构成的片段， 即含有显示促进植物基因转录的活性的碱基序列的核酸。并且，本方法中所使用的启动子 含有下述核酸：其与序列号1的34845-35044所示的碱基序列、序列号1的33045-35044所 示的碱基序列、或者序列号1的26779-35044所示的碱基序列具有80%、85%、90%、95%、 97%、99%或者99. 5%的同一性，且显示促进植物基因转录的活性的碱基序列。并且，本发 明中所使用的启动子包含下述核酸：其是源自长雄野生稻的碱基序列，即至少含有由序列 号1的34845-35044表示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性。
[0195] (7)本发明的启动子和源自长雄野生稻的PRR7结构基因作为DNA标记物的应用
[0196] 本发明的启动子和源自长雄野生稻的PRR7结构基因的整体或部分序列用作植物 高产性的DNA标记物。在植物中检测出本发明的启动子的序列或者源自长雄野生稻的PRR7 结构基因的序列时，可期待该植物显示长雄野生稻样的高产性的性状。作为这样的标记物， 更优选源自本发明的启动子的碱基序列。
[0197] 在这样的目的下，使用的本发明的DNA标记物优选含有序列号1的26779-35044 所示的碱基序列和/或序列号1的35825-46721所示的碱基序列的15~2000个碱基，进 一步优选含有序列号1的26779-35044所示的碱基序列和/或序列号1的35825-46721所 示的碱基序列的20~500个碱基，进一步优选含有序列号1的26779-35044所示的碱基序 列和/或序列号1的35825-46721所示的碱基序列的30~100个碱基。但是，本发明的高 产性的DNA标记物并不限定于此。
[0198] 作为优选的1实施方式，对本发明的启动子的碱基序列或长雄野生稻的PRR结构 基因的碱基序列与日本晴的对应部分的碱基序列进行比较，选择相当于两者之间发现差异 的区域的长雄野生稻部分序列作为上述叙述的DNA标记物。
[0199] 在植物中检测本发明的DNA标记物，且存在该DNA标记物时，可以判定该植物为高 产性。例如，关于通过将日本晴和长雄野生稻杂交而得到的植物，在选择高产性的稻品种 时，可以使用如上所述的相当于在长雄野生稻和日本晴间存在差异的区域的长雄野生稻部 分序列作为DNA标记物。
[0200] 本发明的DNA标记物的检测方法没有特别限定，可以使用PCR、RFLP或者碱基序列 解码等本技术领域中已知的各种方法。并且，本发明的DNA标记物的检测也可在通过杂交 而得到的植物成长的任一阶段进行。关于通过杂交而得到的植物，在幼苗的阶段进行DNA 标记物的检测在本发明中较为合适，由此，可以在交配的植物生长之前判定该植物是否为 高产性。
[0201] (8)使用本发明的启动子提高植物基因的转录活性的方法
[0202] 本发明提供一种使用本发明的启动子提高植物基因的转录活性的方法。即，本发 明为一种方法，其包括：使用含有序列号1的34845-35044所示的碱基序列、或使用含有与 序列号1的34845-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性的喊基序列的核酸来提尚 植物基因的转录活性。并且，本发明为一种方法，其包括：使用含有序列号1的33045-35044 所示的碱基序列、或含有与序列号1的33045-35044所示的碱基序列具有至少90%的同一 性的碱基序列的核酸来提高植物基因的转录活性。另外，本发明为一种方法，其包括：使用 含有下述核酸来提高植物基因的转录活性：所述核酸是源自长雄野生稻的碱基序列，至少 含有由序列号1的34845-35044表示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性。在这 样的核酸中，优选含有由序列号1的33045-35044所不的碱基序列构成的核酸的片段，进一 步优选含有由序列号1的26779-35044所示的碱基序列构成的核酸的片段。在下述的实施 例中，实际上确认到含有序列号1的34845-35044和相当于序列号1的33045-35044的碱 基序列的核酸具有促进GUS基因转录的活性。
[0203] (9)源自长雄野生稻的PRR7蛋白质和编码其的核酸
[0204] 并且，本发明提供一种源自长雄野生稻的PRR7蛋白质和编码其的核酸。如上所 述，源自长雄野生稻的PRR7蛋白质由序列号3所示氨基酸构成，由序列号2所示的碱基序 列的核酸进行编码。因此，本发明涉及具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质和编码该蛋 白质的核酸。本发明还涉及具有序列号2所示碱基序列的核酸。在下述的实施例中，与向 源自长雄野生稻的PRR7启动子导入结合有编码源自日本晴的PRR7蛋白质的基因的构建体 的情况相比，向相同的启动子导入结合有编码源自长雄野生稻的PRR7蛋白质的基因的构 建体的情况显示更明显的高产性赋予效果。即，在与源自长雄野生稻的PRR7启动子可操作 地连接而表达的情况下，与对源自其它植物的PRR7蛋白质进行编码的核酸相比，对源自长 雄野生稻的PRR7蛋白质进行编码的核酸具有可对植物赋予更好的高产性的特性。因此，在 对植物赋予高产性时，对源自长雄野生稻的PRR7蛋白质进行编码的核酸与源自长雄野生 稻的PRR7启动子一起使用，在本发明中较为合适。并且，本发明鉴于这样的编码源自长雄 野生稻的PRR7蛋白质的核酸的特征，提供一种对具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质进 行编码的核酸在植物赋予高产性中的应用；提供一种使植物的产量增大的方法，其将对具 有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质进行编码的核酸导入植物中；以及提供一种产量增大 的转基因植物的制备方法，其将对具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质进行编码的核酸 导入植物中。
[0205] (10)源自高粱的PRR7启动子与高粱PRR7结构基因可操作地连接而成的核酸
[0206]并且，本发明为一种源自高粱的PRR7启动子与高粱PRR7结构基因可操作地连接 而成的核酸。源自高粱的PRR7启动子为含有示于序列号19的9049个碱基序列所示的碱基 序列的核酸。本说明书中的源自高粱的PRR7启动子的碱基序列并不限定于示于序列号19 的碱基序列，也包含含有与这些碱基序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%、99%、或者 99. 5%的同一性，且显示促进植物的编码区域的转录的活性的碱基序列的核酸。
[0207] 源自高粱的PRR7蛋白质由序列号17所示的765个氨基酸构成，由序列号16所示 的碱基序列的核酸进行编码。本申请说明书中的源自高粱的PRR7蛋白质并不限定于此， 包含与序列号17所示氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、97%、或者99%的相似性的氨基酸序列的蛋白质。并且，本申请说明书中的源自 高粱的PRR7蛋白质与上述（2)中源自长雄野生稻的PRR7蛋白质相关叙述的蛋白质同样地 含有PR结构域和CCT基序，且具有对LHY基因及CCA1基因转录进行抑制的活性。源自高 粱的PRR7蛋白质的PR结构域在序列号17的氨基酸序列中相当于氨基酸编号80~194， CCT基序相当于氨基酸编号709~752。但是，在本申请说明书中，源自高粱的PRR7蛋白质 的PR结构域和CCT基序的氨基酸序列并不限定于上述PR结构域和CCT基序，还含有与这 些氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或者99%的同一性的氨基 酸序列。
[0208] 使用源自高粱的PRR7启动子和高粱PRR7结构基因可操作地连接而成的核酸，可 使植物的产量增大。在下述的实施例中，显示通过将含有序列号19所示的碱基序列的核酸 和序列号16所示的碱基序列的核酸的构建体导入稻，确认到产量增加的效果。
[0209] 实施例
[0210] 实施例1 :具有稻野牛种长雄野牛稻所具有的高产件的稻栽培系统的制各和高产 件基闵厌域的确宙
[0211] 已知非洲野生的稻野生种长雄野生稻（0.longistaminata)虽然与作为栽培种的 栽培稻（O.sativaL.)具有相同的A基因组，但与栽培种相比，显示较大的生物质。本发 明者认为为了将长雄野生稻所具有的这样的优良性状导入栽培种，持续进行了稻栽培品种 "Shiokari"和长雄野生稻的杂交、选择，结果得到与"Shiokari"相比显示高产性的BC7F6 系统"No. 645"。该"No. 645"的大部分的农业性状超越"Shiokari"，特别是，特征为基杆直 径变粗（表1)。关于该高产性系统，使用覆盖全部12条染色体的80个DNA标记物研宄基 因型，结果可知，仅具有长雄野生稻的第3染色体末端部和第7染色体末端部（图1)。
[0212] 因此，本发明人为了明确与"No. 645"所具有的高产性相关的基因区域，使用将使 "No. 645"与回归亲本"Shiokari"杂交而成的F2的133个个体进行与产量相关性状有关的 QTL分析。其结果，在第7染色体末端部检测出与到出穗为止的天数、杆长、穗长、每穗颖花 数、基杆直径有关的QTL(表2)。接着，杂交后代F3个体中，选择第7染色体末端部为杂合 (hetero)，且其它第7染色体区域为"Shiokari"型的个体和"No. 645"型的个体，使用其后 代4313个个体和4944个个体对末端部的重组个体进行选择。其结果，可选择最末端固定为 "No. 645"型的3个个体（F4-No.l，No. 2，No. 3)和最末端固定为"Shiokari"型的4个个体 (F4-No. 4,No. 5,No. 6,No. 7)(图2)。最末端固定为"No. 645"型的个体的性状与"No. 645" 大致相同。另外，最末端固定为"Shiokari"型的个体的性状与"Shiokari"大致相同（表 3)。标记物CH15377-1由于距PAC克隆P0627E10的图2的右末端约180kb，因此，可推测长 雄野生稻所具有的高产性的基因区域可缩小至第7染色体末端部约180kb。
[0213][表1]
[0214]Shiokari和No. 645的产量相关性状的比较
[0215]
[0216][表 2]
[0217]Shiokari和No. 645的杂交F2集团中农业性状的QTL分析
[0218]
[0219][表 3]
[0220] 在第7染色体末端部发生重组且最末端以"No. 645"型或"Shiokari"型固定的7 个体的生长特性
[0221]
[0222] 实施例2 :通讨长雄野牛稻的第7染色体末端部厌域的转化试骀讲行的互补件检 骀⑴
[0223] 通过实施例1的遗传学分析，可以将长雄野生稻所具有的高产性的基因区域缩小 至第7染色体末端部的约180kb。制备网罗了其中约82kb的区域的7个构建体，分别进行 转化至"Shiokari"而得到的转化体的性状评价。
[0224] 使用Fosmid载体PCC1F0S(EPICENTRE株式会社）制备"No. 645"的基因组文库。 通过实施例1的遗传学分析，显示与高产性有关的基因位于第7染色体的长臂末端部，因 此，使用作为该区域的DNA标记物的C213及C728(Harushimaetal，1998)筛选文库，选择 4个克隆（Fosl、2、10、12)。对各克隆的末端碱基序列进行解码，与日本晴基因组序列比较， 由此可明确互相的位置关系。并且，进行引物步移，对该编码的碱基序列进行解码。将所解 码的碱基序列示于序列号1。
[0225] 使用上述4个Fosmid克隆制备下述的7个互补性试验用构建体（图3)。
[0226] (l)Fr3 的制备
[0227] 使用QIAEXIIGelExtractionKit(QIAGEN株式会社），利用琼脂糖将对用Notl 处理Fos12而得到的最大的片段（包含序列号1的第15961号的碱基至第37129号的碱 基）进彳T提纯。
[0228] 将质粒载体pSB200(具有潮霉素抗性基因盒的中间载体）用Notl完全消化后，通 过乙醇沉淀回收DNA。将回收的DNA溶解于TE溶液后，通过CIAP(TAKARA-BI0株式会社） 进行脱磷酸化。将反应液利用琼脂糖凝胶进行电泳后，使用QIAEXIIGelExtractionKit 利用凝胶对载体片段进行提纯。
[0229] 对通过上述操作准备的2个片段进行测试，使用DNALigationKit"Mighty Mix"（TAKARA-BI0株式会社）进行连接反应。反应后，通过乙醇沉淀回收DNA。将回收的 DNA溶解于纯水（通过Millipore株式会社制造装置制备）后，与大肠杆菌DH5a混合，供 试于电穿孔。将电穿孔后的溶液在LB培养基中进行振荡培养（37°C、1小时）后，在含有壮 观霉素（50yg/ml)的LB板上扩展并保温（37°C、16小时）。对生成的菌落中的24个菌落 分离质粒，研宄限制酶切断长度模式及边界部碱基序列，由此选择期望的大肠杆菌。
[0230] (2)Frl的制备
[0231] 使用QIAEXIIGelExtractionKit，利用琼脂糖对用Notl处理Fosl2而得到的第 二大的片段（包含序列号1的第3号的碱基至第9746号的碱基）进行提纯。
[0232] 对该片段与（1)中使用的Notl-CIAP处理后的pSB200片段一起进行测试，使用 DNALigationKit"MightyMix"进行连接反应。然后，依据（1)中记载的方法选择期望的 大肠杆菌。
[0233] (3)Fr7 的制备
[0234] 使用QIAEXIIGelExtractionKit，利用琼脂糖对用Notl处理Fosl而得到的最 大的片段（包含序列号1的第58805号的碱基至第82355号的碱基）进行提纯。
[0235] 对该片段与（1)中使用的Notl-CIAP处理后的pSB200片段一起进行测试，使用 DNALigationKit"MightyMix"进行连接反应。然后，依据（1)中记载的方法选择期望的 大肠杆菌。
[0236] (4)Fr5 的制备
[0237] 使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用Notl处理Fosl而得到的第 二大的片段（包含序列号1的第42409号的碱基至第58808号的碱基）进行提纯。
[0238] 对该片段与（1)中使用的Notl-CIAP处理后的pSB200片段一起进行测试，使用 DNALigationKit"MightyMix"进行连接反应。然后，依据（1)中记载的方法选择期望的 大肠杆菌。
[0239] (5)Fr2 的制备
[0240] 使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用Notl处理Fosl而得到的第 二大的片段（包含序列号1的第6929号的碱基至第19723号的碱基）进行提纯。
[0241] 将该片段与（1)中使用的Notl-CIAP处理后的pSB200片段一起测试，使用DNA Ligation Kit "Mighty Mix"进行连接反应。然后，依据（1)中记载的方法选择期望的大肠 杆菌。
[0242] (6)Fr6 的制备
[0243] 使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用Notl处理Fosl而得到的第 二大的片段（包含序列号1的第51665号的碱基至第62366号的碱基）进行提纯。
[0244] 将该片段与（1)中使用的Notl-CIAP处理后的pSB200片段一起测试，使用DNA Ligation Kit "Mighty Mix"进行连接反应。然后，依据（1)中记载的方法选择期望的大肠 杆菌。
[0245] (7)Fr4 的制备
[0246]使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用Smal及PstI处理FoslO而 得到的最大的片段（包含序列号1的第26779号的碱基至第46059号的碱基）进行提纯。
[0247] 使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用PstI及SacI处理Fosl而得 到的第四大的片段（包含序列号1的第46056号的碱基至第49155号的碱基）进行提纯。
[0248] 将质粒载体pSB200用EcoRV及SacI完全消化后，通过乙醇沉淀回收DNA。将回收 的DNA通过（1)中记载的方法进行CIAP处理，提纯载体片段。
[0249] 测试这3个片段，使用DNALigationKit"MightyMix"进行连接反应。然后，依 据（1)中记载的方法选择期望的大肠杆菌。
[0250] 对通过（1)~（7)选择的7种大肠杆菌与根癌土壤杆菌（Agrobacterium 1：111116€3(^6118)菌株1^4404/^3131(1(〇11^1'16七31，1996)及辅助大肠杆菌1113101/ pRK2013(Dittaetal, 1980) 一起进行测试，依据Dittaetal(1980)的方法进行三亲株 的交配（triparentialmating)。在含有壮观霉素（50yg/ml)、四环素（15yg/ml)及潮霉 素（35yg/ml)的AB板上，使用进行了选择的土壤杆菌并依据Hieietal(1994)的方法进 行"Shiokari"的转化。转基因稻在驯化后，在温室下栽培。对各构建体培育约20个个体 独立的转化体，采种T1种子。
[0251]T1代对1个构建体测试2个系统、合计18个个体（1个系统为9个个体）。播种 在2007年6月25日进行，在7月9日向放入了水稻田土壤的3.5升的桶中各移植3个个体 (1个系统为3个桶，合计9个个体）。除对照的"Shiokari"以外，作为参考品种对将长雄野 生稻的第3染色体末端区域及第7染色体末端区域导入"Shiokari"而成的系统"No. 645" 进行栽培。栽培在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用 的封闭体系温室（14小时30分钟昼长的长昼条件）中，在无施肥条件下进行。收获在9月 21日进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、 每穗受精颖花重量（以下为每穗重）进行性状调查。
[0252] 将各构建体2系统的农业性状数据的平均值示于表4。供试的全部7构建体的每 穗粒数或每穗重与对照的"Shiokari"大致相同或为其以下，未发现超越"Shiokari"的构 建体。
[0253] [表 4]
[0254] 重组体的性状评价试验
[0255]
[0256] 实施例3 :通讨长雄野牛稻的第7染色体末端部厌域的转化试骀讲行的互补件检 骀⑵
[0257] 虽然在2007年进行了测试，但对于未得到显示生长旺盛性的结果的7个构建体， 使每个构建体的系统数（均源自独立的T0个体）增加至5系统（1个系统为12个个体。与 在2007年测试的系统不同。），再次进行试验。播种在2008年5月30日进行，在6月16 日向放入了水稻田土壤的3. 5升的桶中各移植4个个体（1个系统为3个桶，合计12个个 体）。栽培在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封 闭体系温室（14小时30分钟昼长的长昼条件）中在不施肥条件下进行。收获在9月8日 进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗 受精颖 花重量（以下为每穗重）进行性状调查。2008年除对照的"Shiokari"以外，对作为 参考品种的、仅将长雄野生稻的第7染色体末端区域导入"Shiokari"而成的系统"No. 240" 进行栽培。
[0258] 将各构建体5系统的农业性状数据的平均值示于表5。Fr4构建体与对照的 "Shiokari"相比，直到出穗为止的天数、杆长、穗长、每穗粒数、种子育性、每穗重、基杆直径 的7个性状大幅提高，与此相对，剩余的6个构建体在全部的性状中与"Shiokari"相同或 为其以下。
[0259][表 5]
[0260] 重组体的性状评价试验
[0261]
[0262] 接着，对于Fr4系统中其特性最显著地被显示的Fr4_4,对个体分别进行PCR，考察 导入基因的有无与性状测定值大小的关系。将其结果示于表6和图4。基因持有个体与缺 失个体相比，明确在长昼条件下（14小时30分钟），直到出穗为止的天数、杆长、穗长、每穗 粒数、每穗重、基杆直径方面提高。另外，基因持有个体与缺失个体相比，还明确了着粒密度 (每lcm穗的粒数）高。
[0263] 根据以上的结果，明显教导对"Shiokari"赋予高产性的基因组片段为Fr4片段。
[0264] [表6]
[0265] 系统Fr4_4中基因的有无和产量性状的关系
[0266]
[0267] 2009年将在2008年栽培的Fr4_4的基因持有个体及基因缺失个体的后代（T2代） 与对照的"Shiokari"、"No. 240" 一起栽培（1个系统12个个体），评价产量性状。播种在 2009年5月1日进行，在5月11日向放入了水稻田土壤的3. 5升的桶中各移植4个个体。 栽培在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封闭体系 温室（14小时30分钟昼长的长昼条件）中在无施肥条件下进行。收获在8月19日进行。 对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精颖 花重量（以下为每穗重）进行性状调查。
[0268] 将结果示于表7。基因持有个体的后代Fr4-4_1和Fr4-4_2与基因缺失个体的后 代Fr4-4-3相比，明确在天长条件下（14小时30分钟），直到出穗为止的天数、杆长、穗长、 每穗粒数、每穗重、基杆直径方面提高。另外，基因持有系统与缺失系统相比，还明确了着粒 密度（穗每lcm的粒数）高。另一方面，可知Fr4-4-3的总性状测定值与"Shiokari"大致 相同。
[0269] 根据以上的结果，得出了对"Shiokari"赋予多产的基因组片段为Fr4片段的 结论。若参照日本晴序列（AP005199)的注释信息，则Fr4片段中包含日本晴全长cDNA AK066112的等位基因，推测该基因赋予高产性。另外，K066112基因座在Murakamiet al. (2005)中记载为OsPRR37。因此，推测长雄野生稻所具有的PRR7基因为对"Shiokari" 赋予多产的原因基因。而且，认为该Fr4片段中含有对PRR7基因进行编码的区域及用于使 其表达的的区域。
[0270][表 7]
[0271] 系统Fr4_4的T2后代的评价试验
[0272]
[0273]实施例4 :长雄野牛稻PRR基闵的编码厌域的效果的确认
[0274] 根据实施例3的结果，认为长雄野生稻所具有的PRR7基因为赋予高产性的基因。 为了对其进行确认，调查长雄野生稻的PRR基因的编码区域对产量相关性状造成的影响。
[0275] 具体而言，如下制备构建体：使作为启动子的泛素启动子、作为终止子的长雄野生 稻的PRR基因的终止子区域与长雄野生稻的PRR7基因的编码区域连接而成。泛素启动子 为通常用于单子叶植物的组成型启动子，认为适合用于观察PRR基因的效果。将这些构建 体导入栽培稻"Yukihikari"而实施产量相关性状的评价。
[0276] 使用重叠延伸（overlapextension)PCR等常规方法来构建构建体：其用于使源 自长雄野生稻的PRR7基因的编码区域（序列号2)在泛素启动子的控制下进行表达。具体 而言，如下制备构建体：将含有PSB200的泛素启动子及泛素内含子的区域进行PCR扩增，并 在其相邻下游，将嵌合基因插入于PSB200的多克隆位点，所述嵌合基因通过对长雄野生稻 的翻译开始点上游区域（序列号1的第35045号碱基至第35824号碱基）、序列号2及长 雄野生稻的翻译终止点下游区域（序列号1的第46722号碱基至第49157号碱基）连接而 成。另外，使用仅持有选择标记基因（潮霉素抗性基因）的质粒作为对照。
[0277] 使用上述持有2种构建体的大肠杆菌，通过实施例2中记载的方法进行三亲交配 (triparentalmating)及向栽培稻"Yukihikari"的转化。转基因稻在驯化后，在封闭体 系温室中栽培。PRR7基因以及对照的构建体分别独立培育60个个体、20个个体的转化体。 供试60个个体中，观察到18个个体显示（1)植被高度较高、（2)茎粗、（3)直到出穗为止的 天数长这样的与高产性相关特性的个体。对于该18个体，对成熟期观察穗的性状进行观察 时，在全部个体中，观察到：（1)种子育性低（低于20% )、（2)穗未从止叶充分地抽出、（3) 颖花处于开颖而未闭颖等任一种状况。而且，最终的种子产量与对照相比，大幅降低（图 5)。另一方面，剩余的42个个体显示与对照的20个体大致相同的特性，未观察到上述的不 良性状。
[0278] 根据以上的结果，无法确认长雄野生稻所具有的PRR7基因的编码区域为赋予高 产性的基因。
[0279] 实施例5 :将源自长雄野牛稻的启动子和各种PRR基闵编码厌域连接而成的构律 体的效果
[0280] 根据实施例4的结果，无法得出长雄野生稻所具有的PRR7基因的编码区域为赋予 高产性的基因的结论。因此，发明人等进行了潜心研宄，结果考虑长雄野生稻的PRR7基因 的启动子区域对于长雄野生稻的PRR7基因的表达是否是必须的，制备构建体并导入至栽 培稻，实施产量相关性状的评价，所述构建体使作为启动子的长雄野生稻的PRR7基因的启 动子区域、作为终止子的长雄野生稻的PRR7基因的终止子区域与长雄野生稻的PRR7基因 的编码区域连接而成。另外，作为用于对长雄野生稻PRR7基因的效果进行评价的对照，制 备构建体进行实验，所述构建体使通常的栽培稻"日本晴"的PRR7基因的编码区域与上述 启动子及终止子连接而成。
[0281] 长雄野牛稻PRR基闵及栽培稻"日本晴"PRR基闵的分离
[0282] 使用RNeasyPlantMiniKit(QIAGEN)，从长雄野生稻染色体片段导入系统 "No. 645"及"日本晴"的幼苗中提取总RNA。按照试剂盒的手册进行了操作，但未使用添加 于RLT缓冲液的巯基乙醇，而添加了DTT使其最终浓度为40mM来代替。利用附属的RNase 1^66￥3七61'(40~50 1^1)使总謝4溶出后，进行0似86处理（1'111?130 0嫩-；1^'66 1(；[1：，41]113；[011)。 将处理后的RNA溶液利用琼脂糖凝胶电泳检查浓度及纯度，然后，通过QuantiTectRev. Transcriptionkit(QIAGEN)进行cDNA合成。为了以得到的cDNA溶液作为模板分离PRR 基因的编码区域，使用以下的2种引物进行RT-PCR。下述的longi-PRR2F与序列号1的 35847-35869所示的碱基序列对应，longi-PRR2R与序列号1的46713-46735所示的碱基 序列对应。
[0283] longi-PRR2F:ACCAAACCGCCGGCTCTGCCCTC(序列号6)
[0284] longi-PRR2R:GGTAGGTAGGTAGGTCATCTGTC(序列号7)
[0285] 使用该结果得到的碱基序列确定"No. 645"持有的源自长雄野生稻的PRR7结构基 因的碱基序列（序列号2)。推测该碱基序列为对由740个氨基酸构成的蛋白质（序列号3) 进行编码的碱基序列。在序列号3中，相当于氨基酸编号62~176的区域为PR结构域，相 当于氨基酸编号676~722的区域为CCT基序。另外，日本晴的PRR7结构基因的碱基序列 (序列号4)也使用同样的方法进行确定，推测该碱基序列为对由742个氨基酸构成的蛋白 质（序列号5)进行编码的碱基序列。在序列号5中，相当于氨基酸编号62~176的区域 为PR结构域，相当于氨基酸编号678~724的区域为CCT基序。
[0286] 将由分离的日本晴来源、长雄野生稻来源及拟南芥来源的PRR基因的翻译区域所 编码的氨基酸序列的序列对比示于图6。并且，将由分离的日本晴来源、长雄野生稻来源及 拟南芥来源的PRR基因的翻译区域所编码的氨基酸序列的同一,性（identity) %和相似性 (similarity) %的值示于图7。
[0287] 含有各PRR基闵的构律体的制各
[0288] 通过以下的步骤制备下述构建体：其将分离的cDNA插入于源自长雄野 生稻的PRR7基因的启动子区域和终止子区域之间而成。PCR使用PrimeSTARMAX DNAPolymerase(TAKARA-BI0 株式会社），连接使用DNALigationKit"Mighty Mix"（TAKARA-BI0株式会社）。另外，将下述构建体的制备策略图解并示于图8。
[0289] (1)包含源自长雄野生稻的PRR7基因的编码区域的构建体（以下为longi构建 体）
[0290] 以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用以下的2种引物进行PCR。下述的 longi-PRR1F与序列号1的34019-34044所示的碱基序列对应，longi-PRR1R与序列号1 的35838-35861所示的碱基序列对应。
[0291]longi-PRR1F:CGCTTCGAAGATATCATCATCATTCATGTATGAG(序列号 8)
[0292]longi-PRR1R:AGCCGGCGGTTTGGTTGTGATGAG(序列号 9)
[0293] 接着，对得到的PCR产物和上述源自"No. 645 "的RT-PCR产物进行测试，使用 longi-PRR1F及longi-PRR2R进行重叠延伸PCR。使用Ex-Taq(TAKARA-BI0 株式会社） 对得到的PCR产物添加A-Tai1后，克隆于pCR-XL-T0P0 (Invitrogen株式会社），然后，为了 破坏PCR-XL-T0P0上原本存在的PstI部位，在EcoRV处理后，进行自我连接。自我连接后， 进行利用SacI及PstI的消化以及利用CIAP(TAKARA-B10株式会社）的脱磷酸化。利用琼 脂糖对反应液进行电泳，回收载体片段（包含图8的片段1)。
[0294]另外，以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用以下的2种引物进行PCR。 下述的longi-PRR3F与序列号1的46721-46744所示的碱基序列对应，longi-PRR3R与 序列号1的49137-49157所示的碱基序列对应。
[0295]longi-PRR3F:ACCTACCTACCTACCTACGCAATG(序列号 10)
[0296] longi-PRR3R:GCTAGAATTCGAGCTCTCCAGGGAGCAGGGA(序列号11)
[0297] 对得到的PCR产物和上述源自"No. 645"的RT-PCR产物进行测试，使用longi-PRR 2F及longi-PRR3R进行重叠延伸PCR。将得到的PCR产物利用SacI及PstI消化后，利用 琼脂糖对反应液进行电泳，回收2. 6kb片段（图8的片段2)用于插入。该2. 6kb片段与序 列号1的4605649156所示的碱基序列对应（其中，46108-46595为内含子，因此受到剪接而 成为46056-46107和46596-49156串联结合而成的序列）。
[0298] 使用上述2种回收片段进行连接。将得到的质粒利用SacI及Notl消化后，利 用琼脂糖对反应液进行电泳，回收6. 5kb片段（图8的片段3)。使回收的片段3克隆于 PSB200 (利用SacI及Notl进行消化后，进行CIAP处理）。对得到的质粒进行测试，利用 Notl及EcoRV进行消化以及利用CIAP进行脱磷酸化。利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收 载体片段（包含片段3)。另一方面，利用Notl及EcoRV对实施例2的Fr4构建体的质粒进 行消化，利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收7. 3kb片段（片段4)。该7. 3kb片段与序列号 1的26779-34022所示的碱基序列对应，使用两片段进行连接，得到目标质粒。
[0299] (2)含有源自日本晴的PRR7基因的编码区域的构建体（以下为日本晴构建体）
[0300] 以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用longi-PRR1F及longi-PRR1R 进行PCR。对得到的PCR产物和上述源自日本晴的RT-PCR产物进行测试，使用longi-PRR IF及longi-PRR2R进行重叠延伸PCR。使用Ex-Taq对得到的PCR产物添加A-Tail后，克 隆于PCR-XL-T0P0。利用PstI及Notl对得到的质粒进行消化后，利用琼脂糖反应液进行电 泳，回收3. 9kb片段（源自日本晴cDNA-图8的片段1)作为插入物。
[0301] 另外，以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用longi-PRR3F及longi-PRR 3R进行PCR。对得到的PCR产物和上述源自日本晴的RT-PCR产物进行测试，使用longi-PRR 2F及longi-PRR3R进行重叠延伸PCR。使用Ex-Taq对得到的PCR产物添加A-Tail后，克 隆于PCR-XL-T0P0。利用SacI及PstI对得到的质粒进行消化后，利用琼脂糖对反应液进行 电泳，回收2. 6kb片段（源自日本晴cDNA-图8的片段2)作为插入物。该2. 6kb片段与序 列号1的46056-49156所示的碱基序列对应（其中，46108-46595为内含子，因此受到剪接 而成为将46056-46107和46596-49156串联结合的序列）。
[0302] 将上述2种插入片段与pSB200 (利用SacI及Notl进行消化后，进行CIAP处理） 一起测试，进行连接。对得到的质粒进行测试，利用Notl及EcoRV进行消化以及利用CIAP 进行脱磷酸化。利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收载体片段（包含源自日本晴cDNA-图 8的片段3)。
[0303] 另一方面，利用Notl及EcoRV对实施例2的Fr4构建体的质粒进行消化，利用琼 脂糖对反应液进行电泳，回收7. 3kb片段（图8的片段4)。使用两片段进行连接，得到目标 质粒。该7. 3kb片段与序列号1的26779-34022所示的碱基序列对应。
[0304] 使用持有（1)及（2)中得到的目标质粒的大肠杆菌，通过实施例2中记载的方法 进行三亲交配及"Shiokari"的转化。转基因稻在进行驯化后，在封闭体系温室中栽培。对 各构建体独立培育60个体的转化体，采种T1种子。从各构建体中按照采种量从多到少的 顺序选择18个个体，供于T1的评价试验。
[0305] 就T1代而言，1个构建体测试18个系统（1个系统为12个个体）。播种在6月25 日进行。在移植前分别对个体切下叶，浸渍于潮霉素溶液，将对潮霉素显示抗性的个体（推 测为持有基因的个体）作为移植的对象。在7月12日，在放入有稻用育苗土的容量570ml 的聚乙烯制罐中各移植1个个体（1个系统为12个罐、合计12个个体）。对施肥而言，在每 个罐中，将N、P、K各设为0. 21g、0. 33g、0. 05g。作为对照，除"Shiokari"以外，将仅将长雄 野生稻的第7染色体末端区域导入"Shiokari"而成的系统"No. 240"作为参考品种进行栽 培。栽培在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封闭 体系温室（14小时30分钟昼长的长昼条件）中进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以 最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精颖花重量（以下为每穗重）进行性状 调查。
[0306] 将结果示于表8。首先，对于Longi构建体和日本晴构建体，分别观察全部18个 系统的平均值，与对照"Shiokari"相比，导入了两构建体的植物的直到出穗为止的天数、杆 长、穗长、每穗粒数、每穗重、基杆直径均明显提高。另外，导入了任一构建体的植物与对照 "Shiokari"相比，直到出穗为止的天数、杆长、穗长、每穗粒数、每穗重、基杆直径均显著提 高。并且，导入了Longi构建体的总18个系统、及导入了日本晴构建体的总18个系统的着 粒密度（穗每lcm的粒数）的平均值分别为5. 15粒/cm、4. 80粒/cm，明显比"Shiokari" 的着粒密度的平均值4. 40粒/cm高。
[0307] 以上，确认了PRR7基因是赋予高产性的原因基因。并且，若综合考虑实施例3和 实施例4的结果，则令人吃惊的是，可得到长雄野生稻的高产性与PRR7基因的编码区域相 比，启动子区域做出贡献的可能性较高这样的结果。
[0308] 此外，在表8中，若比较Longi构建体和日本晴构建体的植物的产量，则前者的效 果比后者的效果显著。因此，作为与启动子一起导入植物的结构基因，与日本晴PRR7基因 的结构区域相比，LongiPRR7基因的结构区域更合适。
[0309][表 8]
[0310] 野生稻长雄野生稻（0?longistaminata)及栽培稻日本晴的PRR基因的cDNA构建 体的产量相关性状的评价
[0311]
[0312] 实施例6 :长雄野牛稻和"日本晴"的PRR基闵表汰的分析
[0313] 根据实施例5的结果，推测PRR7基因的启动子区域对多产产生影响，因此，为了对 长雄野生稻的PRR7基因启动子和栽培稻"日本晴"的PRR7基因启动子的表达的不同进行 调查，使用"日本晴"和"No. 240"（通过杂交将长雄野生稻的PRR7基因导入"Shiokari"的 取代系统）的F1进行PRR7基因的表达分析。
[0314] 对"日本晴" (2个个体）、"No. 240" (2个个体）及"日本晴"和"No. 240"的F1 (4个 个体）进行测试，在播种3周后对最新的完全展开叶进行取样，通过实施例3中记载的方法 对总RNA进行提取及cDNA合成。另外，还准备未添加逆转录酶而进行调整的样品，用作阴性 对照。另外，使用在RNA提取时得到的DNase处理前的核酸溶液的一部分，准备总DNA溶液。 以得到的总DNA溶液及cDNA溶液作为模板，使用2种引物（CGAGGTACCATACACCTGTGGCTT(序 列号12)和GCATCTGAGTTTGACTTCATGTTG(序列号13))在以下的反应条件下进行PCR。
[0315]
[0316] 94°C 2 分钟
[0317] 94°C 30 秒钟
[0318] 60°C 30 秒钟
[0319](将94°C、30秒钟和60°C、30秒钟进行35个循环）
[0320]利用限制酶HpyCH4V(NewEnglandBiolabs株式会社）对PCR产物（130bp)在 37°C下处理一夜后，使用3%MetaphorAgarose(TAKARA-BI0株式会社）进行电泳。
[0321] 在将日本晴的总DNA溶液及cDNA溶液用作模板的情况下，PCR产物被HpyCH4V切 断，与此相对于，在将No. 240的总DNA溶液及cDNA溶液用作模板的情况下，PCR产物未被 HpyCH4V切断（图9A)。由上可以确认，通过本方法，可以识别来自日本晴等位基因的PCR 产物和来自长雄野生稻等位基因的PCR产物。
[0322] 因此，比较使用F1的样品进行HpyCH4V处理后的条带图案，结果显示，将cDNA溶 液用作模板的情况与将总DNA溶液用作模板的情况相比，未被HpyCH4V切断的PCR产物的 比率高。根据本结果，显示向日本晴导入了长雄野生稻基因的取代系统的F1与源自日本晴 的PRR7的等位基因表达量相比，源自长雄野生稻的PRR7的等位基因的表达量较多（图9B)
[0323] 实施例7 :长雄野牛稻的PRR启动子及PRR基闵在玉米中的效果
[0324] 将实施例2中制备的Fr4片段（包含长雄野生稻的PRR7启动子及PRR7结构基 因）转化于玉米品种，以T1代进行产量相关性状的评价。
[0325] 将大小约1. 2mm的玉米未成熟胚（品种：A188)从温室栽培的植物中无菌取出并 浸渍于土壤杆菌悬浮用液体培养基（LS-inf、Ishidaetal.2007)。在46°C下热处理3分 钟后，在相同液体培养基中将未生成熟胚清洗1次。接着，进行15, 000rpm、4°C、10分钟的离 心处理。将离心处理后的未熟胚浸渍于LS-inf-AS培养基（Ishidaetal.2007)中，所述 培养基中以约1X109cfu/ml悬浮具有实施例2中制备的Fr4构建体的土壤杆菌LBA4404。 搅拌30秒，在室温下静置5分钟后，着床于共培培养基（LS-AS、Ishidaetal. 2007)，在 25°C、黑暗下培养7天。
[0326] 将进行了共培培养后的未成熟胚着床于含有潮霉素的选择培养基（LSD1. 5A及 1^01.58、18111(1&6丨&1.2007)，在251：、黑暗下进行培养。将增殖的愈伤组织切成小片，着 床于潮霉素再分化培养基（LSZ、Ishidaetal.2007)，在25°C、照明下培养2周。将再分化 的植物着床于生根培养基（LSF、Ishidaet&1.2007)，在25°0、照明下培养2周。将生根的 植物移植于温室内的罐中进行栽培。
[0327] 抽出的雄穗在开花前拔出进行去雄。将从未转化的玉米（品种：A188)中采集的 花粉与从雌穗中充分长出的须进行交配。收获包被枯萎的雌穗，在30°C下干燥2周后，将种 子脱粒。可以从44个个体中采种。
[0328] 从T0个体受精的穗中按照从大到小的顺序选择11个个体，以T1代进行产量相关 性状的评价。试验分成3次（第1次：5个系统、第2次：3个系统、第3次：3个系统的合计 11个系统）进行。在容量360ml的聚乙烯制罐中，1个系统各播种1粒（第1次试验为16 粒、合计16罐、第2次及第3次试验为25粒、合计25罐）。播种约2周后，切取叶的一部 分，浸渍于潮霉素溶液，调查潮霉素的抗性/敏感性。使潮霉素抵抗性和敏感性的个体为一 对并调整个体数量使其能够评价产量性状，移植于容量5100CC的聚乙烯制罐中继续栽培。 植被高度在播种14天后至56天后每周进行测定。将抽出的雄穗在开花前拔除进行去雄。 记录须从雌穗中抽出的日期，并且将从未转化玉米（品种：A188)中采集的花粉与从雌穗中 充分抽出的须进行杂交。收获穗后，测定雌穗长、每列粒数、穗重。对各系统进行潮霉素抗性 个体（基因持有个体）和潮霉素敏感性个体（基因缺失个体）的产量相关性状的比较。其 结果，可知在全部11个系统中的2个系统（Tl-No. 4、Tl-No. 6)中，抗性个体与敏感性个体 相比，雌穗长、每列粒数、穗重这3个性状变大（表9、图10)。并且，系统Tl-No. 4在接种第 35天以后，抗性个体与敏感性个体相比，植被高度变高，表明从营养生长期开始生长旺盛。
[0329] 如上所述，可知：与长雄野生稻的PRR7启动子可操作地连接的PRR7基因不仅使稻 的产量增大，还使玉米的产量增大。另外，表明营养生长期的生长液旺盛。
[0330][表9]
[0331] 效果得到确认的2系统的产量相关性状的数据
[0332]
[0333]实施例8 :源自长雄野牛稻的PRR基闵的cDNA构律体在玉米中的效果
[0334] 将实施例5中制备的源自长雄野生稻的PRR7基因的cDNA构建体（以下为Longi 构建体）转化至玉米品种，以T1代进行产量相关性状的评价。
[0335] 依据实施例7中记载的方法，将Longi构建体转化至玉米品种。得到的转化体移植 于温室内的罐中进行栽培。T0植物的雄穗在开花前拔除进行去雄，将从未转化的玉米（品 种：A188)中采集的花粉与从雌穗中充分抽出的须进行杂交。收获包被枯萎的雌穗，在30°C 下干燥2周后，将种子脱粒。从TO个体受精的穗中选择可充分确保着粒数的18穗，以T1代 进行产量相关性状的评价。试验分成3次（每次6个系统）进行。在容量360ml的聚乙烯 制罐中各接种1系统、25粒。作为对照，未转化的玉米（品种：A188)也同样地进行播种。播 种约2周后，切取叶的一部分，浸渍于潮霉素溶液，调查潮霉素的抗性、敏感性。使潮霉素抵 抗性和敏感性的个体为一对并调整个体数量，使其能够评价产量性状，移植于容量5100CC 的聚乙烯制罐中继续栽培。植被高度在接种14天后至56天后每周进行测定。抽出的雄穗 在开花前拔除进行去雄。记录从雌穗中的须抽出日，并且将从未转化玉米（品种：A188)中 采集的花粉与从雌穗中充分抽出的须进行杂交。收获穗并干燥后，测定雌穗长、每列粒数、 穗重。对各系统进行潮霉素抗性个体（基因持有个体）和潮霉素敏感性个体（基因缺失个 体）的产量相关性状的比较。对潮霉素敏感性个体（基因缺失个体）未分离的系统进行与 非重组的A188的比较。
[0336] 其结果，显示在全部18个系统中的2个系统（Tl-cDNANo. 11、Tl-cDNANo. 13) 中，抗性个体与敏感性个体或非重组A188相比，雌穗长、每列粒数、穗重这3个性状分别变 大（表10、图11)。在图11中，R为潮霉素抗性个体（基因持有个体），S为潮霉素敏感性 个体（基因缺失个体）。
[0337] 如上所述，可知：与长雄野生稻的PRR7启动子连接相同基因的cDNA而成的导入基 因使玉米的产量增大。即，确认到：在长雄野生稻的PRR7基因中，通过导入不含内含子的 cDNA，可得到本发明的效果。
[0338][表 10]
[0339] 效果得到确认的玉米转化体2个系统的产量相关性状的数据
[0340]
[0341]实施例9 :将源自长雄野牛稻的启动子分别与拟南芥PRR基闵编码厌域、高粱PRR 基闵编码厌域连接而成的构律体的效果
[0342]使用RT-PCR从拟南芥（Columbia)中分离PRR7基因（注册号：NM120359)的编码 区域，按照实施例5中记载的方法，通过与实施例5中制备的构建体的长雄野生稻PRR基因 编码区域进行取代，制备目标构建体。将分离的拟南芥PRR基因碱基序列示于序列号14， 将编码的氨基酸序列示于序列号15。接着，对于连接高粱PRR基因编码区域而成的构建 体，也通过同样的方法制备。进行NCBIblastn检索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast,cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSea rch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_L0C=blasthome)，将与长雄野生稻PRR7 基因编码区域 (序列号4)同一性高的基因（注册号：XM_002465391)作为PRR基因进行分离。使用RT-PCR 从高粱（品种：Golds〇rgho、KANEK0种苗）中分离该基因的编码区域序列，通过与实施 例5中制备的构建体的长雄野生稻PRR基因编码区域发生取代，得到目标构建体（序列号 18)。分离的源自高粱的PRR基因编码区域与通过NCBIblastn检索而命中的序列（注册 号：XM_002465391) 100%-致，2295碱基（序列号16)中，编码了 765氨基酸残基（序列号 17)。这些PRR基因翻译区域的氨基酸序列的相同性及同一性如图7所示。
[0343] 对于这些构建体，通过实施例5中记载的方法进行三亲交配及稻品种 "Yukihikari"的转化。转基因稻在驯化后，在温室下栽培。对各构建体培育独立的60个个 体的转化体，采种T1种子。从各构建体中按照采种量从多到少的顺序选择18个个体，供于 T1的评价试验。
[0344]T1代对1个构建体测试18个系统（1个系统为12个个体）。播种在9月14日进 行。在移植前分别对个体切下叶，浸渍于潮霉素溶液，将对潮霉素显示抗性的个体（基因持 有个体）作为移植的对象。在9月28日，在放入有稻用育苗土的容量570ml的聚乙烯制罐 中各移植1个个体（1个系统为12个罐、合计12个个体）。对施肥而言，在每个罐中，将N、 P、K设为各0? 21g、0. 33g、0. 05g。作为对照，栽培"Yukihikari"。栽培在日本Tobacco产 业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封闭体系温室（14小时30分钟 昼长的长昼条件）中进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗 粒数、种子育性、每穗受精颖花重量（以下为每穗重）进行性状调查。
[0345]将结果示于表11。首先，对拟南芥构建体观察全部18个系统的平均值，与对照 "Yukihikari"相比，杆长、每穗粒数、每穗重、基杆直径降低，认为没有产量增大效果。接着， 对于高粱构建体，与对照"Yukihikari"相比，发现杆长、穗长、每穗粒数大致相同，但每穗 中、基杆直径降低，未确认到产量增大效果。
[0346][表11]
[0347] 结合了长雄野生稻PRR启动子的cDNA构建体的产量相关性状的评价
[0348]
[0349]实施例10 :源自长雄野牛稻的PRR启动子和GUS基因的连接构建体
[0350] 制备源自长雄野生稻的PRR7启动子和⑶S基因的嵌合构建体，并调查有无转录。 如图12所示，制备在长雄野生稻的PRR7启动子区域的相邻下游连接GUS基因而成的构建 体。长雄野生稻PRR7基因的启动子区域具体而言分别连接转录起始点上游区域200个碱 基（序列号1的第34845-35044号碱基）、2000个碱基（序列号1的第33045-35044号碱 基），制备构建体P200、构建体P2000。制备不具有PRR7基因启动子区域的构建体P0也作 为对照用。
[0351] 使用制备的构建体进行栽培稻"Yukihikari"的转化。从植被高度生长至约10cm 的转基因稻的幼苗中对各构建体提取4个个体的根，并分别进行取样。通过实施例5中记 载的方法进行总RNA提取及cDNA合成。以得到的cDNA溶液作为模板，通过PCR法调查⑶S 基因是否被转录。引物对设计于GUS基因编码区域内所导入的内含子序列（190碱基）的 两外侧。即，若存在受到转录的剪接机制作用的成熟mRNA，则检测为450碱基的PCR扩增产 物。其结果，确认到在P200和P2000的转化体中存在转录活性（图13)。另外，在对照的 P0中，无法确认到源自成熟mRNA的PCR扩增产物。由上显示，P200和P2000在植物体内均 具有启动子活性。
[0352]实施例11:长雄野牛稻PRR基闵的表汰分析
[0353] 将于"Shiokari"中仅导入了长雄野生稻的第7染色体末端区域而成的系统 "No. 240"在人工气象室中在光周期14小时30分钟（26°C)、暗期9小时30分钟（20°C)的 长昼条件下栽培4周。从4个个体中对光周期开始后0小时（Oh)和6小时（6h)的最新的 完全展开叶分别进行取样。通过实施例5中记载的方法进行总RNA提取及cDNA合成。以 得到的cDNA溶液作为模板，通过非专利文献13(0gisoetal.)中记载的方法进行实时荧 光定量PCR(real-timePCR)。PRR7基因表达量以相对于同一样品的肌动蛋白基因表达量 的相对值表示。其结果，在光周期开始后〇小时（〇h)，PRR7基因表达量在0. 21-0. 32 (平均 0. 27)的范围，与此相对，光周期开始后6小时（6h)，可得到13. 69-18. 43 (平均16. 31)这 样的值（图14)。因此，显示长雄野生稻PRR7基因启动子不是组合型，而是光诱导表达。
[0354]实施例12 :将源自高粱的PRR启动子和高粱PRR基闵编码厌域连接而成的构律体 的效果
[0355] 通过PCR从高粱（品种：Goldsorgho、KANEK0种苗）中对实施例9中分离的高粱 PRR基因的启动子区域中的DNA片段进行扩增。使用得到的DNA片段中的序列号19所示的 序列取代实施例9中得到的构建体（序列号18)的1-9046所示的序列，由此得到目标构建 体（以下为"高粱构建体"）。
[0356] 对于该高粱构建体，依据实施例5中记载的方法进行三亲交配及稻品种 "Yukihikari"的转化。转基因稻在驯化后，在温室下栽培。对得到的形状体（T0)培育60 个个体，采种T1种子。按照采种量从多到少的顺序选择18个个体，供于T1的评价试验。
[0357] 在T1代中，对18个系统（1个系统为12个个体）进行测试。接种在9月14日进 行。在移植前分别对个体切下叶，浸渍于潮霉素溶液，将对潮霉素显示抗性的个体（基因持 有个体）作为移植的对象。在9月28日，在放入有稻用育苗土的容量570ml的聚乙烯制 罐中各移植1个个体（1个系统为12个罐、合计12个个体）。对施肥而言，在每个罐中，将 N(氮）、P(磷）、K(钾）各设为 0. 21g、0. 33g、0. 05g。作为对照，栽培"Yukihikari"。栽培 在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封闭体系温室 (14小时30分钟昼长的长昼条件）中进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对 象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精颖花重量（以下为每穗重）进行性状调查。
[0358] 将结果示于表12。对高粱构建体而言，全部18个系统中的2个系统（系统No. 8、 系统No. 10)与对照"Yukihikari"相比，杆长、每穗粒数、每穗重均超出。因此，在高粱构建 体中也发现产量提高效果。
[0359][表12]
[0360] 连接高粱PRR启动子和高粱PRRcDNA而成的构建体的产量相关性状的评价
[0361]
【主权项】
1. 一种核酸，其含有： (1) 序列号1的34845-35044所示的碱基序列、或 (2) 与序列号1的34845-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性，且显不促进 植物基因转录的活性的碱基序列。2. -种核酸，其含有： (1) 序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或 (2) 与序列号1的33045-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性，且显不促进 植物基因转录的活性的碱基序列。3. -种核酸，其含有： (1) 序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或 (2) 与序列号1的26779-35044所不的喊基序列具有至少80%的同一性，且显不促进 植物基因转录的活性的碱基序列。4. 一种核酸，其是源自长雄野生稻的碱基序列，其至少包含由序列号1的34845-35044 表示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性。5. 根据权利要求4所述的核酸，其含有由序列号1的33045-35044所示碱基序列构成 的核酸的片段。6. 根据权利要求4或5所述的核酸，其含有由序列号1的26779-35044所示碱基序列 构成的核酸的片段。7. -种核酸，其通过使下述核酸可操作地连接而成： (1) 权利要求1~6中任一项所述的核酸，以及 (2) 编码（a)~（c)规定的蛋白质的核酸，其中， (a) 与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80%的同一性的 氨基酸序列； (b) 含有植物的假应答调节因子蛋白质的假受体结构域的氨基酸序列或与其具有至少 90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质的CCT基序的氨基酸序列 或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且 (c) 具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCAl(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。8. 根据权利要求7所述的核酸，其能够增大植物的产量。9. 一种载体，其含有权利要求1~8中任一项所述的核酸。10. -种转基因植物，其含有权利要求7或8所述的核酸。11. 根据权利要求10所述的转基因植物，其中，所述植物为单子叶植物。12. 根据权利要求11所述的转基因植物，其中，所述植物为稻或玉米。13. -种制备产量增大的转基因植物的方法，其包括：将权利要求7或8所述的核酸或 权利要求9的载体导入植物的工序。14. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述植物为单子叶植物。15. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述植物为稻或玉米。16. -种使植物的产量增大的方法，其包括：将权利要求7或8所述的核酸导入植物。17. -种用于对产量增加的植物进行筛选的DNA标记物，其含有序列号1的 26779-35044所示碱基序列和/或序列号1的35825-46721所示碱基序列中的15~2000 个碱基。18. -种方法，其包括：对植物中权利要求17所述的DNA标记物进行检测，并在检测出 该DNA标记物时将该植物判断为高产性。19. 一种方法，其包括：使用含有序列号1的34845-35044所不碱基序列、或与序列号 1的34845-35044所不喊基序列具有至少90%的同一性的喊基序列的核酸来提尚植物基因 的转录活性。20. -种方法，其包括：使用含有序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或与序列 号1的33045-35044所示的碱基序列具有至少90 %的同一性的碱基序列的核酸来提高植物 基因的转录活性。21. -种使植物的产量增大的方法，其包括：将可操作地连接的下述（1)及（2)的核酸 导入植物，其中， (1) 包含下述（a)或（b)规定的碱基序列的核酸： (a) 序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或包含该碱基序列的一部分且显示促进 植物基因转录的活性的片段；或者 (b) 与上述（a)所示的碱基序列具有至少90%的同一性且显示促进植物基因转录的活 性的喊基序列； (2) 编码下述（c)~（e)规定的蛋白质的核酸： (c) 与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80%的同一性的 氨基酸序列； (d) 含有植物的假应答调节因子蛋白质的假受体结构域的氨基酸序列或与其具有至少 90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质的CCT基序的氨基酸序列 或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且 (e) 具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCAl(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。22. -种核酸，其编码具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质。23. 一种蛋白质，其具有序列号3所不氣基酸序列。24. -种核酸，其由下述（1)及（2)的核酸可操作地连接而成，其中， (1) 包含下述（a)或（b)规定的碱基序列的核酸： (a) 序列号19所示碱基序列；或 (b) 与序列号19所示的碱基序列具有至少80%的同一性且显示促进植物基因转录的 活性的碱基序列， (2) 编码由下述（c)~（e)规定的蛋白质的核酸： (c) 序列号17所示氨基酸序列、或与序列号Y所示氨基酸序列具有至少80%的同一性 的氨基酸序列； (d) 含有植物的假应答调节因子蛋白质的假受体结构域的氨基酸序列或与其具有至少 90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质的CCT基序的氨基酸序列 或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且 (e) 具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCAl(Circadian
【专利摘要】本发明提供一种可对植物赋予高产性的核酸。并且，本发明还提供一种使用这样的核酸使产量增大的转基因植物和使植物的产量增大的方法。可通过将下述构建体导入植物来对该植物赋予高产性，所述构件体通过使结构基因长雄野生稻的假应答调节因子的启动子、和/或植物的假应答调节因子可操作地连接而成。
【IPC分类】C12N15/09, A01H5/00, C12Q1/68, A01H1/00
【公开号】CN104903444
【申请号】CN201380057268
【发明人】柏原正和, 小森俊之, 小鞠敏彦, 前川雅彦
【申请人】日本烟草产业株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月18日
【公告号】CA2886908A1, WO2014069339A1
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