细菌设计的制作方法
细菌设计的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及设计（工程化，engineering)适用于生物技术应用，包括蛋白、次级 代谢产物（secondarymetabolite)和生物燃料的生产，生物催化，生物治理（生物修复， bioremediation)，生物转化，生物降解，生物学控制，药物开发，药物筛选，疫苗，益生菌，生 物传感器和药物递送载体（drugdeliveryvehicle)的细菌细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 细菌在生物技术的许多方面都找到了应用，包括用作生产异源蛋白和肽（包括酶 和治疗性抗体）的宿主，作为次级代谢产物或其衍生物的源，作为生物学控制，生物降解， 生物燃料生产，生物催化和生物治理的试剂和作为益生菌，疫苗组分和药物递送体系。
[0003] 天然细菌菌株对于生物技术用途并未优化。合成生物学这一新兴领域的目标之一 是设计（工程化，engineering)更易于处理和/或更有效的作为生物技术工具的新型生物。
[0004] -种方法可以称为"粉碎（ground-up) "方法（例如，见W02008/024129)。这涉及 到只包含那些生长必不可少的基因的最小化的人工细菌DNA基因组的合成。这然后用于 产生按照需要可以向其增加所需的生物合成路径，信号传导途径或分解代谢功能的裸"框 架"（bare"chassis"）。这种方法目前是不切实际的，因为基因产物和调控元件会协同和 串扰于整个细胞的环境中，其方式当前还不完全理解并因此不能作为正式模块进行处理。
[0005] 另一种方法称为"剥离（stripdown) "方法。目前这在链霉菌（Streptomyces spp.)有用的次级代谢产物的生产中找到了应用。此处，不是生长必需的基因和其它遗传 物质将被去除（"剥除（strippedout)"），而逐个重新引入用于选定的生物合成路径的那 些。例如，Komatsu等（Komatsuetal. (2010)PNAS107(6) :2646-2651)描述了用于编码 次级代谢产物生物合成的基因的异源表达的设计的（工程化，engineered)细菌的构建，这 涉及从工业微生物阿维链霉菌（Streptomycesavermitilis)基因组中系统地删除非必需 基因。
[0006] 所述"剥离"方法需要识别对于所选条件下存活和/或生长非必要的（和从而代 谢高成本性的以及因此不利的）基因的方法。
[0007] 此外，这种方法将受益于互补功能基因组分析还识别出有利于所提出的生物技术 应用的基因。在后一种情况下，"剥离（stripdown)/增产（rev-up)"方法随后能用于最小 化由非必要（不利的）基因所引起的代谢负担，同时放大直接或间接有助于所述生物技术 应用的基因（即，有利基因）的有益作用。
[0008]转座子定向插入位点测序（transposondirectedinsertion-sitesequencing) (TraDIS-见Langridgeetal. (2009)GenomeResearch19:2308-2316)最近已经被描述 并用于识别：（a)必需基因；(b)有利生长的（但非必需的）基因；（c)在特定条件下不利生 长的基因；和（d)参与对某些条件提供耐受性的基因（"壁龛特异性的（niche-specific)" 必需基因）。类似的技术已描述于例如，Gawronskietal. (2009)PNAS106:16422-16427; Goodmanetal. (2009)CellHostMicrobe6:279-289；vanOpijnenetal. (2009)Nat. Methods6:767-772和Gallagheretal. (2011)mBio2(1) :e00315-10,并且这种技术现在 统称为"Tn-seq"方法。
[0009] 现在本发明人已经发现，TraDIS能够适于为细菌生物设计（生物工程， bioengineering)目的明确地识别出不利的和有利的基因的问题提供非常巧妙的解决方 案。这通过使用活化转座子（TnA)而实现。这些转座子包括启动子从而使转座子在合适的 插入位点插入到细菌DNA中增加了插入位点处或接近基因的转录。因此采用1^的诱变产 生插入失活的突变体（其中所述！^破坏了基因表达，通常在插入到编码区中之后）以及 插入活化的突变体（通常在转座子已插入到基因的上游，从而使所述启动子驱动所述基因 高水平的转录（以及因此产生更高水平的表达）。
【发明内容】
[0010] 根据本发明，提供了生产在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突 变体细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
[0011] a)通过采用活化转座子（TnA)的转座子诱变生产突变体细菌集合，其中所述、包 含能够增加其插入位点或附近的基因转录的启动子；
[0012] b)由所述突变体集合在所选择的生长条件下和在一种或多种参照条件下生长细 菌以产生两种以上测试培养物；和
[0013] c)比较测试培养物之间的!^插入的分布以识别出在所选择的生长条件下不利于 生长和/或存活的第一类基因和在所选择的生长条件下有利于生长和/或存活的第二类基 因。
[0014] 通常情况下，与第一类的（不利的）基因相关的TnA插入发生于编码区（从而使 所述基因被!^插入失活）或所述编码区外部但是在所述编码序列的互补DNA链上（导致 反义RNA的产生或启动子活性破坏），然而与第二类的（有利的）基因相关的!^插入却定 向发生于所述编码区的上游，由此所述1^的启动子驱动所述基因的升高的转录（从而进 行表达）。
[0015] 这种方法可以进一步包括以下步骤：提供设计的（工程化的，engineered)突变体 细菌，其中至少一种所述不利基因被去除或破坏和/或至少一种所述有利基因过表达，从 而使所述突变体细菌表现出在所选择的生长条件下改善的存活和/或生长。在这些实施方 式中，多种所述不利基因可以去除或破坏同时多种有利基因过表达。
[0016] 按照这种方式，可以设计（工程化，engineer)或选择显著更好地适于所选生长条 件（从而适于所述生物技术用途）的突变体细菌。
[0017] 在这些实施方式中，所述方法可以进一步包括分离和培养所述设计的（工程化 的，engineered)突变体细菌并随后将其进行再一轮的诱变，培养和比较（如以上步骤(a)-(c)中定义），并可以可选地进一步包括以下步骤：提供第二轮设计的（工程化的， engineered)突变体细菌，其中至少一种所述另外的不利基因被去除或破坏和/或至少一 种所述另外的有利基因过表达，从而使所述突变体细菌在所选择的生长条件下相对于所述 第一轮诱变之后产生的所述设计的（工程化的，engineered)突变体细菌表现出进一步改 善的存活和/或生长。
[0018] 因此，本发明的方法优选是重复的，并还可以包括另外轮的诱变和重复实施步骤 (a)至（c)(如上所定义）以提供在所述环境挑战存在下相对于前一轮的设计的突变体细菌 表现出更进一步改善的存活和/或生长的第三，第四，第五（或更多）轮突变体细菌。
[0019] 在这些实施方式中，每一轮期间采用的选择的生长条件可以是相同或不同的。
[0020] 本发明的其它方面和优选实施方式定义和描述于以下陈述的其它权利要求中。
【具体实施方式】
[0021] 本文提及的所有出版物，专利，专利申请和其它参考文献出于所有目的以其全文 结合于本文中作为参考，就好像每个单独出版物，专利或专利申请专门地且各自地指出以 其全部引述的内容结合于本文中作为参考。
[0022] 宙义和一般优诜
[0023] 当在本文中使用时以及除非另外明确指出，否则以下术语预想具有以下含义（除 了所述术语在本领域内可能具有的任何更宽（或更窄）的含义之外）：
[0024] 除非上下文另有所需，本文中单数的使用应理解为包括复数，反之亦然。涉及实体 使用的术语"一个"或"一种"应该理解为是指一种或多种所述实体。同样，术语"一个"（或 "一种""一种或多种"，和"至少一种"在本文可互换使用。
[0025] 正如本文所用的，术语"包含"或其变体如"包括"或"包括了"，应该理解为是指 包含任何所述的整数（例如，特征，要素，特性，属性，方法/过程步骤或限制）或整数的组 (例如，特征，要素，特性，性质，方法/过程步骤或限制），但并不排除任何其它整数或整数 的组。因此，正如本文所用的，术语"包括"是包含性的或开放式的，并且并不排除另外的， 未列举的整数或方法/过程步骤。
[0026] 所述术语"基因"是描述由占据染色体或质粒中的特定位置并决定生物中具体特 性或特性的组的DNA序列构成的遗传单元的术语。基因可以通过指定构成蛋白或蛋白部分 (结构基因）的多肽链；或编码RNA分子；或通过指定构成影响或以任何方式调节其它基因 的操作或抑制这种操作（例如，通过以顺式作用）的结构实体的核酸决定生物特性；或通过 其它尚未定义的机理影响表型。
[0027] 所述术语"基因组DNA"是本文中用于定义染色体DNA有别于染色体外维持的质粒 DNA的本领域术语。
[0028] 所述术语"基因组"是本文中用于定义生物体整个遗传互补的本领域术语，因此包 括染色体，质粒，噬菌体和任何其它起到遗传物质作用的DNA或RNA。
[0029] 所述术语"革兰氏阳性细菌"是定义基于某些细胞壁染色特性一起分组的特定类 细菌的本领域术语。
[0030] 所述术语"低G+C革兰氏阳性细菌"是基于所述DNA中碱基的组成定义所述 革兰氏阳性中进化相关细菌的特定子类类型的本领域术语。所述子类包括链球菌属 (Streptococcusspp.)，葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)，李斯特菌属(Listeria spp.)，芽孢杆菌（Bacillusspp.)，梭状芽孢杆菌属（Clostridiumspp.)，肠球菌属 (Enterococcusspp.)和乳酸杆菌（Lactobacillusspp. ) 〇
[0031] 所述术语"高G+C革兰氏阳性细菌"是基于所述DNA中碱基的组成定义所述 革兰氏阳性中进化相关细菌的特定子类类型的本领域术语。所述子类包括放线菌纲 (actinomycetes)(放线菌类（actinobacteria))包括放线菌属（Actinomycesspp.)，节杆 菌属（Arthrobacterspp.)，棒状杆菌属（Corynebacteriumspp.)，弗兰克氏菌属（Frankia spp.)，微球菌属（Micrococcusspp.)，小单抱菌属（Micromonosporaspp.)，分支杆菌属 (Mycobacteriumspp.)，诺卡氏菌属（Nocardiaspp.)，丙酸杆菌属（Propionibactoria spp.)和链霉菌属（Streptomycesspp. ) 〇
[0032] 所述术语"革兰氏阴性细菌"是定义基于某些细胞壁染色特性一起分组的特定类 细菌的本领域术语。革兰氏阴性细菌属的实例包括克雷伯氏菌属（Klebsiella)，不动杆 菌属（Acinetobacter)，埃希氏菌属（Escherichia)，假单胞菌属（Pseudomona)，肠杆菌属 (Enterobacter)和奈瑟菌属（Neisseria)。
[0033] 牛长备件的诜择
[0034] 本发明的方法允许设计在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突 变体细菌，并涉及相对一种或多种参考条件，在选择的生长条件下检测TnA插入的分布和/ 或频率的差异。
[0035] 所述生长条件根据所述最终生产的设计细菌的所需生物技术应用进行选择：任何 条件都 是合适的，条件是所选定的生长条件和参考生长条件之间的差异驱动衍生自！^插 入突变体初始集合的测试培养物中的可回收TnA插入突变体的分布变化。
[0036] 在某些实施方式中，所述选择的生长条件特征在于存在一种或多种不存在（或在 参照条件下以不同的，例如较低或较高浓度存在）的选择性试剂。在这样的背景下，所述术 语"选择性试剂"广义上用于涵盖当用于本发明方法中时引起基因组TnA插入的分布和/或 频率变化的任何试剂（或试剂组合）。
[0037] 因此这种试剂包括但不限于：环境污染物；毒素；抗生素；碳源；氮源；能源；其它 微生物（例如，酵母，病毒，细菌和/或植物）；pH;压力；温度；盐浓度；杀虫剂；放射性材 料；烃；油残余物；工业废弃产品；医疗废弃产品；废水残余物等。
[0038] 以下列出了根据所述设计细菌的预想生物技术用途适用于提供本发明方法的选 择生长条件的示例性非限制性的选择性试剂：
[0039] 生物治理（生物修复，bioremediation)-砷，金属，例如重金属，特别是铅，采铀， 钯，铬和镉；多核芳烃，氯代溶剂，酚，油，杀虫剂和磷酸盐（酯）。
[0040] 微生物增强的米油（microbialenhancedoilrecovery)-原油和重油馈分
[0041] 污水处理-亚硝酸盐类，氨，磷酸盐类和类雌激素化合物
[0042] 食品生产-乳糖和醋酸。
[0043] 生物燃料的生产-二氧化碳，氢，阳光，氧，纤维素和半纤维素
[0044] 能量产生-废水，海洋沉积物，淡水沉积物，河流水，乙酸盐（酯），丙酸盐（酯）和 丁酸盐（酯）
[0045] 生物生产和疫苗-Luria-Bertani或LB肉汤，Terrific肉汤（TB)，2YT或化学定 义的培养基。
[0046] 生物消化/生物降解-秸杆组分，纤维素废弃物和塑料。
[0047] 益生菌-其它细菌，例如厚壁菌门（Firmicutesphylum)的成员。
[0048] 感染的治疗-病原细菌，植物，根瘤农杆菌，动物，金黄色葡萄球菌，人体组织和艰 难梭菌（Clostridiumdifficile)，人共生细菌或人互惠细菌。
[0049] 话用于本发_所沭方法的细菌
[0050] 本发明的方法可以应用于任何细菌的设计（工程化，engineering)。所选择的细 菌将尤其取决于所述预期的生物技术用途。
[0051] 因此，本发明的方法在以下细菌中抗生素靶的识别中找到了应用：(a)革兰氏阳 性，革兰氏阴性和/或革兰氏可变细菌；(b)产芽孢细菌；(c)无芽孢细菌；(d)丝状细菌； (e) 胞内细菌；（f)专性需氧菌；（g)专性厌氧菌；(h)兼性厌氧菌；（i)微需氧细菌和/或 (f) 条件致病细菌病原体。
[0052] 在某些实施方式中，本发明的方法应用于以下细菌属：不动杆菌属（例如，鲍曼 不动杆菌）；气单胞菌（例如，嗜水气单胞菌）；芽孢杆菌（例如，炭疽芽孢杆菌）；拟杆菌 类（例如，脆弱拟杆菌）；博德特氏菌（例如，百日咳博德特氏菌）；疏螺旋体（例如，伯氏 疏螺旋体）；布鲁氏囷属（例如，牛布鲁氏囷，犬布鲁氏囷，羊布鲁氏囷和猪布鲁氏囷）；伯 克霍尔德菌属（例如，洋葱伯克霍尔德菌复合体）；弯曲杆菌（例如，空肠弯曲杆菌）；衣原 体（例如，沙眼衣原体，猪型沙眼衣原体和鼠型沙眼衣原体）；嗜衣原体属（例如（例如， 肺炎嗜衣原体，家畜嗜衣原体（C.pecorum)，鹦鹉热嗜衣原体，牛嗜衣原体，猫嗜衣原体和豚 鼠嗜衣原体）；柠檬酸杆菌（例如，弗氏柠檬酸杆菌）；梭状芽胞杆菌（例如，肉毒梭菌，艰 难梭菌，产气荚膜梭菌和破伤风梭菌）；棒状杆菌属（例如，白喉棒状杆菌和谷氨酸棒状杆 菌）；肠杆菌（例如，阴沟肠杆菌和产气肠杆菌）；肠球菌（例如，粪肠球菌和屎肠球菌）； 埃希菌属（例如，大肠杆菌）；黄杆菌属（Flavobactoria);弗朗西斯氏菌（例如，土拉弗朗 西斯菌）；梭杆菌属（例如，坏死梭杆菌）；嗜血杆菌（例如，睡眠嗜血菌，流感嗜血菌和副 流感嗜血菌）；螺杆菌（例如，幽门螺杆菌）；克雷伯氏菌属（例如，产酸克雷伯氏菌和肺炎 克雷伯菌）；军团菌属（例如，嗜肺军团菌）；钩端螺旋体菌属（例如，问号钩端螺旋体）； 李斯特菌（例如，单核细胞增生性李斯特菌）；莫拉菌属（例如，卡他莫拉菌）；摩根氏菌 属（如摩氏摩根菌）；分支杆菌属（例如，麻风分支杆菌和结核分枝杆菌）；支原体（例如， 肺炎支原体）；奈瑟氏菌属（例如，淋病奈瑟氏菌和脑膜炎奈瑟氏菌）；巴氏杆菌（例如，多 杀性巴氏杆菌）；消化链球菌；普氏菌属；变形杆菌属（例如，奇异变形杆菌和普通变形杆 菌），假单胞菌属（例如，铜绿假单胞菌）；立克次体（例如，立克次氏立克次体）；沙门氏 菌属（例如，血清型，伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌）；沙雷氏菌属（例如，粘质沙雷氏 菌）；志贺氏菌属（例如，弗莱斯纳志贺氏菌（S.flexnaria)，痢疾志贺氏菌和宋内志贺氏菌 (S.sonnei));葡萄球菌（例如，金黄色葡萄球菌，溶血葡萄球菌，中间葡萄球菌，表皮葡萄 球菌和腐生葡萄球菌）；寡养单胞菌属（例如，嗜麦芽寡养单胞菌）；链球菌属（例如，无乳 链球菌，变形链球菌，肺炎链球菌和化脓链球菌）；密螺旋体（Treponema)(例如，苍白密螺 旋体（T.pallidum));弧菌属（例如，霍乱弧菌）和耶尔森氏菌属（例如，鼠疫耶尔森氏杆 菌）。
[0053] 以下列出了根据预想的生物技术用途适于本发明方法的示例性非限制性细菌：
[0054] 生物治理-不动杆菌，假单胞菌，产碱杆菌，鞘氨醇单胞菌，红球菌属，分支杆菌 属，地杆菌属，贪铜菌属和脱硫弧菌属。
[0055] 微生物增强采油-不动杆菌属，芽孢杆菌属，假单胞菌属，红球菌属，节杆菌属，克 雷伯氏菌属和梭菌。
[0056] 污水处理-不动杆菌，硝化细菌属，硝化球菌属和硝化螺旋菌属。
[0057] 食品生产-醋酸菌属。
[0058] 生物燃料生产-真养罗氏菌，产氢盐厌氧菌属（halanaerobium hydrogeniformans)，大肠杆菌，蓝细菌，丙酮丁醇梭菌，运动发酵单胞菌和极端嗜热厌氧纤 维素降角军菌（caldicellulosiruptorobsidiansis)〇
[0059]能源产生-地杆菌属（Geobacter)，脱硫单胞菌属，变形菌属，陶厄氏居泥杆菌 (PelobacterThauera)，芽孢杆菌和脱氯单胞菌属
[0060] 生物生产-大肠杆菌属，短芽孢杆菌属，巨大芽孢杆菌属，枯草芽孢杆菌属，新月 柄杆囷属，链霉囷属，
[0061] 生物消化/生物降解
[0062] 真养罗氏菌属，产氢盐厌氧菌属，大肠杆菌，蓝细菌属，丙酮丁醇梭菌，运动发酵单 胞菌属，极端嗜热厌氧纤维素降解菌（Caldicellulosiruptorobsidiansis)，
[0063] 疫苗
[0064] 新月柄杆菌属，大肠杆菌属，沙门氏菌属
[0065] 益生菌-双歧杆菌属，厚壁菌门、人类共生菌属和人类互惠菌属的成员。
[0066] 感染的治疗-竞争性"好"细菌（例如，人类共生菌属或人类互惠菌属），植物，土 壤杆菌（Agrobacterium)，人葡萄球菌和双歧杆菌的无毒菌株。
[0067] 基因组设计
[0068] 本发明的方法可以包括提供其中至少一种所述不利基因被去除或破坏和/或至 少一种所述有利基因过表达的设计的（工程化的，engineered)突变体细菌的步骤，从而使 所述突变体细菌表现出在所选择的生长条件下存活和/或生长改善。
[0069] 对于不利/非必需基因的去除或破坏，在细菌中染色体基因缺失/替换的各种实 验方案在本领域内是已知的，这些方案使靶向基因组序列能够采用携带所定义突变那些的 拷贝进行特异性替代。
[0070] 有两种方法是特别有用的：第一（"进-出（IN-0UT) "）方法是基于将质粒DNA整 合至所述细菌染色体中并随后解离该共合体（cointegrate)。第二（"线性片段"或重组设 计（recombineering))方法是基于在线性DNA分子末端通过短同源臂介导的同源重组。
[0071]这些方法综述于例如，Madyagoletal. (2011)FoliaMicrobiol56:253-263中， 其公开内容结合于本文中作为参考。
[0072] 这种方法可以用于缺失所述细菌基因组的较大片段（largetract)，并且如果用 于消除对所需生物技术应用非必需的所有（或基本上全部）基因（即，另外地对所述细菌 细胞施加代谢负担的所有非必需基因），则这种方法可以称为"基因组最小化"。
[0073] 在一些实施方式中，所述突变体细菌可以设计成具有比野生型基因组小10%， 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或大于 90% 的"最小化的"基因组。
[0074] 对于有利基因使所述突变体细菌表现出在所选择的生长条件下存活和/或生长 改善的过表达，广泛多样的已知技术中任何一种都可以使用，包括尤其是化学诱导的（或 u.v.诱导的）点突变的引入，强启动子的插入，核糖体结合位点，抑制物结合位点的去除和 密码子使用的优化。
[0075] 突夺体集合
[0076]本发明的方法涉及通过转座子诱变生产突变体细菌集合。所述突变体集合的大小 会影响所述方法的分辨率：随着所述集合尺寸增加，具有!^插入的越来越多的不同基因将 被表示（因此有效地被检测）。随着所述集合尺寸减小，所述方法分辨率会降低，基因检测 将不太有效，且越来越多的基因将根本不会被检测。
[0077] 理想的是，在本发明的方法中产生的突变体集合在以下意义上是全面的，即表示 插入每个基因中。为实现这一点所需的TnA插入突变体的数目（S卩，所述突变体集合大小） 取决于各种因素，包括：（a)所述细菌基因组的大小；(b)所述基因的平均大小；和（c)任何 1^插入位点偏差。
[0078] 对于后者，细菌基因组的某些区域（特别是富含GC的区域）吸引低频率的插入。 因此，优选插入频率和集合尺寸足够大以确保插入到难插入的区域。
[0079] 一般而言，需要1个转座子/25bp的最小插入率以获得全面的集合/文库，这通常 对于具有4~7Mb的基因组尺寸的细菌具有最小集合尺寸0. 5X105至1X105,例如5X105， 优选至少约1X106个突变体。在许多情况下，1X10 6个突变体将允许识别~300, 000个不 同的插入位点并对应于1个转座子插入/13~23bp(或约40~70个不同插入位点/基 因）。
[0080] 然而，本发明的方法不一定需要全面的突变体集合（按照以上定义的意义）以返 回有用信息。相反，可以使用小于理想的全面集合的集合尺寸，条件是分辨率降低（和随之 而来的不能检测某些基因）是可以容忍的。例如，当所述方法设计成反复执行直到所述靶 被识别时，情况可能就是这样：在这些实施方式中，所述有效的集合尺寸随着所述方法的每 次重复而增加。
[0081] 转座子诱夺
[0082]转座子，有时也称为可转座元件（transposableelement)，是能够将其自身拷贝 插入到其它多核苷酸中的多核苷酸。术语转座子对于本领域技术人员是公知的并且包括能 够基于序列组织，例如在各端的短的反向重复；在所述端部直接重复的长末端重复（LTR); 和在RNA转录本的3'端的polyA(5'端经常短截）加以区分的转座子种类。
[0083] 转座体（Transposome)是转座酶-转座子复合物，其中所述转座子不编码转座酶 活性。因此，一旦插入，所述转座子是稳定的。优选为了确保突变体集合稳定性，所述转座 子不编码转座酶而以转座体（即，作为 与转座酶的复合物）的形式提供，正如以下所述。
[0084] 正如本文中所用术语"活化的转座子"（下文缩写为"TnA"）定义包含启动子使 得转座子插入增加所述插入位点或其附近的基因转录的转座子。这种转座子的实例描述 于Troescheletal. (2010)MethodsMolBiol. 668:117-39 和Kimetal. (2008)Curr Microbiol. 57(4) : 391-394 中。
[0085] 所述活化的转座子/转座体能够通过广泛多样的本领域技术人员公知的标准方 法中任一种引入到所述细菌基因组（包括染色体和/或质粒DNA)中。例如，Tn#座体能 够通过电穿孔（或任何其它合适的转化方法）引入。
[0086] 优选这种转化方法产生1X103~5X10 3个转化体/ngDNA，且这种转化效率一般 可使用电穿孔实现。
[0087] 可替代的，使用1^的转座子诱变可以体外进行且重组分子转化/转染到细菌细 胞中。在这些实施方式中，转座体可以通过将市售转座酶与所述转座子DNA片段混合根据 标准方案进行制备。所得转座体随后与感兴趣的质粒的质粒DNA混合以允许转位，然后使 用电转化将所述DNA引入到宿主细菌菌株中，从而产生质粒转座子突变体集合。
[0088] 在诱变体外实施的实施方式中，有可能将转座体与基因组DNA体外混合随后将所 述诱变的DNA(可选地，在片段化和/或环化之后）引入宿主细菌菌株（例如，通过电穿孔）， 由此内源性重组机器将其结合至所述基因组中。这种方法可以尤其适用于细菌是天然感受 态的（naturallycompetent)(例如，不动杆菌属）和/或能够通过同源交叉（例如，双重 交叉）重组事件结合DNA的情况。
[0089] 话用于本发明方法的活化转座子
[0090] 任何合适的活化转座子可以用于本发明的方法。合适的转座子包括基于Tn3和类 Tn3(II类）转座子的那些，包括yS(TnlOOO)，Tn501，Tn2501，Tn21，Tn917 及其相关物。 此外还有TnlO,Tn5,TnphoA，Tn903,噬菌体Mu和相关的可转座噬菌体。多种合适的转座子 也可以商购获得，包括例如所述EZ-Tn5?〈R6Kyori/KAN-2>转座子。
[0091] 优选的转座子是携带抗生素抗性基因的那些（其能够用于识别携带转座子的突 变体），包括Tn5,TnlO和TnphoA。例如，TnlO在其IS元件之间携带四环素抗性基因而Tn5 携带编码提供卡那霉素，链霉素和博来霉素抗性的多肽的基因。其它合适的抗性基因包括 包含氯霉素乙酰转移酶（提供氯霉素抗性）的那些。
[0092] 当然，有可能在转座子中的抗生素抗性基因的编码区或别处通过在IS元件之间 插入抗生素抗性基因的不同组合，或通过在转座子嵌合末端（mosaicend)(优选的）之间 插入抗生素抗性基因的组合，或通过改变所述转座子的多核苷酸序列，例如通过进行冗余 碱基取代或不影响所述转座子的转位或抗生素抗性特性的任何其它类型的碱基置换，而产 生新的转座子。这种转座子都包括在本发明的范围之内。
[0093] 在许多实施方式中，单个转座子用于产生所述突变体集合。然而，如以上的解释， 获得全面集合或文库所需的Tn插入突变体的数量（S卩，所述突变体集合尺寸），尤其取决于 任何Tn插入位点偏差。因此，在所述转座子插入位点偏差发生的情况下，可以使用两种以 上不同的转座子以减少或消除插入位点偏差。例如，可以采用基于Tn5和TnlO的两种不同 转座子的组合。
[0094] 话用于活化转座子的启动子
[0095] 在所述TnA中存在的启动子的性质依赖于所述转座子和最终细菌宿主的性 质。通常，要选择驱动所述插入位点附近或邻近DNA的高水平转录的高效向外定向 (outward-oriented)的启动子。
[0096] 所述启动子可包括：（a)普里布诺盒（Pribnowbox) (-10个元件）；(b)_35元件和 /或（c)UP元件。
[0097] 例如，所述lac启动子能够与EZ-Tn5?〈R6Kyori/KAN-2>转座子一起使用，且这 种构建体（construct)适用于检测例如大肠杆菌，肠杆菌属和肠杆菌科家族的其它成员， 如克雷伯氏菌属。其它合适的启动子包括：rplj(大核糖体亚基蛋白；中等强度启动子）； tac(人工lac/trp杂合体；强启动子）和rrnB(核糖体RNA基因启动子；非常强的启动子）。
[0098]确宙Tm插入的分布
[0099] 转座子插入的分布优选通过所述TnA插入位点邻近或附近（5'和/或3'）细菌DNA 测序（例如，通过对包含TnA-基因组DNA连接头的DNA测序）进行测定。通常情况下，对 所述TnA-端或两端侧翼或邻近的细菌DNA进行测序。
[0100] 测序的邻近DNA长度不必是太长，优选相对较短（例如，小于200个碱基对）。
[0101] 多种方法能够用于使用DNA测序以测定所述！^插入分布：这样的方法最近已被 称为Tn-seq方法（vanOpijnenetal. (2009)Nat.Methods6:767-772)。例如，Tn-seq方 法包括扩增的Tn连接头的亲合纯化（Gawronskietal. (2009)PNAS106:16422-16427); 使用专用限制位点将适配子连接到所述转座子末端远端的基因组序列中（Goodmanet al. (2009)CellHostMicrobe6:279-289；vanOpijnenetal. (2009)Nat.Methods 6:767-772);选择性扩增（Langridgeetal. (2009)GenomeResearch19:2308-2316)和携 带Tn接头的单链DNA圆环的产生，其在通过核酸外切酶消化消除基因组DNA之后用作扩增 和测序的模板（Gallagheretal. (2011)mBio2(1) :e00315_10)。
[0102] 任何合适的高通量测序技术都可以使用，且有许多商用测序平台适用于本发明 的方法。基于边合成边测序（SBS)的测序平台（Sequencing-by-synthesis(SBS)-based sequencingplatform)尤其合适于本发明的方法：例如，Illumina?系统生成数百万相对 短的序列阅读（54, 75或100bp)，并且是特别优选的。
[0103] 其它合适的技术包括基于可逆染料终止子的方法。本文中，DNA分子首先附连至 载波片上的引物并进行扩增从而形成本地克隆菌落（桥扩增）。加入四种类型的ddNTP，并 冲洗掉非结合的核苷酸。与焦磷酸测序不一样，所述DNA每次只能延伸一个核苷酸。照相 机拍摄荧光标记的核苷酸的图像，然后从所述DNA中连同末端3'阻断剂一起化学去除所 述染料，允许进行下一循环。
[0104] 能够短序列阅读的其它系统包括SOLiD?和离子激流（IonTorrent)技术（二者 都由AppliedBiosystems?销售）。SOLiD?技术采用通过连接测序。本文中，固定长度的 所有可能的寡核苷酸的集合根据测序位置进行标记。寡核苷酸经过退火和连接；通过DNA 连接酶针对匹配序列优选连接导致在该位置产生所述核苷酸的信号信息。在测序之前，通 过乳液PCR扩增所述DNA。所得到的珠粒，各自仅含有相同DNA分子的拷贝，沉积于载玻片 上。所述结果是堪比Illumina测序的量和长度的序列。
[0105]IonTorrentSystemsInc.已经开发出了一种基于使用标准测序化学（但具有基 于新型半导体的检测系统）的系统。这种测序的方法，相对于其它测序系统中使用的光学 方法，是基于所述DNA聚合期间释放的氢离子的检测。包含有待测序的模板DNA链的微孔 充满单一类型的核苷酸。如果所引入的核苷酸互补于先导模板核苷酸，则它结合到生长的 互补链中。这导致触发过敏性离子传感器的氢离子的释放，这表明已发生反应。如果均聚 物重复存在于所述模板序列中，则在单个循环中可以结合多个核苷酸。这导致相应数量的 释放的氢和按比例地更高的电子信号。
[0106] 基因的功能1平价
[0107] 通过比较测试培养物之间！^插入的分布识别的基因可以进一步通过直接或间接 评价其功能的各种技术进行表征。按照这种方式，基本功能可以明确地指定于所述基因。
[0108] 合适的技术包括生物信息学，其中所述（全部或部分）推定的必需基因的序列用 于查询含有来自测试细菌和/或其它物种的信息的序列数据库，以识别出其基本生物化学 功能已经指定和/或已经证明是必需的基因（例如，其它物种中的直系同源基因）。
[0109] 合适的生物信息学程序对于本领域技术人员而言是公知的，并包括BasicLocal AlignmentSearchTool(BLAST)程序（Altschuletal. (1990)J.Mol.Biol. 215:403-410 和Altschuletal.(1997)Nucl.AcidsRes.25:3389-3402)。合适的数据库包括，例如， EMBL，GENBANK，TIGR，EBI，SWISS-PROT和trEMBL。
[0110] 可替代地，或另外地，所述（全部或部分）基因序列用于查询包含信息的序列 数据库，以识别先前使用现有技术中所述的传统Tn-seq方法（例如，正如Gawronskiet al. (2009)PNAS106:16422-16427；Goodmanetal. (2009)CellHostMicrobe6:279-289； vanOpijnenetal. (2009)Nat.Methods6:767-772；Langridgeetal. (2009)Genome Research19:2308-2316;Gallagheretal. (2011)mBio2(l):e00315-10中所述）和/或 TO01/07651所描述的技术（其内容结合于本文中作为参考）构建的必需基因。
[0111] 尽管启动子存在于插入序列中，许多！^插入将破坏基因/DNA的功能并允许识别 必需的/重要的DNA区域，如在标准Tn-seq(包括TraDIS)。然而，一些转座子将相对于特 异性DNA区域进行适当定位，由此由所述插入启动子驱动的那些特异性区域的转录，相对 于内源性转录显著地增强。通过在不同条件下生长所述突变体集合并重复所述测序，有可 能观察到阅读数的变化，这不仅指示哪个DNA区域有助于生长和/或存活，而且还指示相对 贡献。更高水平的特定抗生素靶转录（由转座子插入的启动子驱动）将有利于细菌存活并 将插入位点连接至DNA区域附近。
[0112] 所述插入启动子的位置能够相对于其对相关下游DNA序列的转录增加贡献进行 评价。这种技术数学/技术上直接的生物信息学组件允许识别插入的启动子序列对所推测 基因转录的贡献。例如，部分基因转录本可以仍然编码足够的信息，以允许翻译短截的但具 有功能的蛋白。生物信息学将允许在毗邻于有待考虑的插入转座子的基因下游的基因上实 施转录通读，其中那里没有定义的RNA转录终止序列。
[0113] 例如，基因A，B和C上游的转座子/启动子可以生成所有三个基因（A-C)的多顺 反子转录本，B上游是基因B和C的多顺反子转录本而C上游只有基因C。如果在抗生素中 前两个转座子的阅读较高而第三个较低，则所述抗生素靶将是基因B。
[0114] 本发_的设计的突夺体细菌的牛物抟术应用
[0115] 这些应用包括：生物治理；微生物增强采油；废水处理；污水处理；食品生产；能 量生产；生物生产；生物消化/生物降解；疫苗；生物传感器；益生菌；生物催化；生物学控 制；和药物递送载体。
[0116] Mffi
[0117] 本发明现在将参考具体实施例进行描述。这些仅仅是示例性的，且仅用于举例说 明的目的：它们并不旨在以任何方式限制要求保护的专利权或所描述的发明的范围。这些 实施例构成了目前考虑用于实施本发明的最佳模式。
[0118] 实施例1 :在磷霉素存在下表现出改善的存活和/或生长的突变体细菌的生产
[0119] ⑴活化转座子（TnA)的构建
[0120] 构建的质粒引入用作转座子的可扩增核苷酸序列。所述转座子的元件包括由 特异性转座酶识别的19bp的嵌合末端（mosaicend)，并限定转座子（用于选择由转位 (transposition)产生的转化体的一种抗生素-抗性基因），以及处于所述转座子的一端的 向外定向的启动子（outwardorientedpromoter)，以活化邻近所述转座子插入位点的革巴 基因的表达。
[0121] 可替代的质粒采用不同的向外定向的启动子由来自大肠杆菌，鲍曼不动杆菌 (Acinetobacter)，假单胞菌（Pseudomonas)或红假单胞菌（Rhodopseudomonas)的不同 基因进行构建。表1提供了所用的不同启动子的细节。此外，不同的宿主物种细菌需要 不同的抗生素抗性基因以选择转化体，例如，氯霉素抗性可以用于大肠杆菌中，不动杆菌 (Acinetobacterspp)中可以使用卡那霉素抗性而假单胞菌（Pseudomonasspp)中可以使 用庆大霉素抗性。所使用的不同抗性基因的详细情况列于表2中。
[0122] 图1是质粒pAMICSl-Cm-PrrnB的遗传图谱（基因图，geneticmap)。所述转座子 侧翼为嵌合末端（mosaicend)，ME，和所示的向外定向的rrnB启动子。所述转座子之外的 质粒的其它组件来自质粒载体pBluescript(Agilent)，lacZ，|3 -半乳糖苷酶亚单元；bla， 针对氨苄青霉素抗性编码的0 -内酰胺酶；rep，pBR322复制起点；cat，针对氯霉素抗性编 码的氯霉素乙酰转移酶。
[0123] 其它合适的质粒衍生物类似于pAMICSl-Cm-PrrnB，除了所述向外定向的rrnB启 动子取代了表1中所列出的启动子以及所述氯霉素抗性决定子代替了表2中列出的那些。
[0124] 表 1
[0125]
[0126] 表 2
[0127]
[0129] 转座子的制各
[0130] 适用于转座子诱变的转座子DNA片段使用特异性的寡聚物进行PCR扩增。为了 产生PCR模板，pAMICSl-Cm-P质粒用在嵌合末端的任一侧切割所述质粒的限制性核酸内切 酶SphI(获自NewEnglandBiolabs)进行消化，并且所产生的1.2kb转座子片段在使用 "MinElute凝胶提取试剂盒"（获自QIAGEN)通过1%琼脂糖的电泳之后分离出来。这个步 骤由于在转座子诱变过程中质粒模板的携带通过（carry-through)阻止了转化体的随后 产生，确保了所得到的转化体是转座子突变体而并不会由于转化体携带用作模板的质粒而 产生转座子片段。
[0131] 所述转座子片段的PCR扩增使用"PfuUltraIIFusion"DNA聚合酶进行实施，这 种聚合酶是"校对（proof-reading) "的DNA聚合酶（获自Agilent)。所述PCR扩增，脱盐 DNA片段，然后用多核苷酸激酶处理以磷酸化所述5'-DNA末端。转座体（transposome)然 后用所述纯化的转座子片段和重组Tn5转座酶进行制备。
[0132] 电感#杰大肠杆菌的制各
[0133] 用于转座子诱变的电转化感受态细胞通过将5mLLB-肉汤用从冷冻原液快速移出 (streak)的大肠杆菌（ST131)菌落接种而制备。这种培养物保温过夜并振荡以促进生长。 通常随后使用2mL接种400mL的预热2XYT肉汤并在37°C下培养所述培养物直到在600nm 波长下测定的光密度为〇. 2~0. 3。细胞通过离心收获并通过再悬浮于10%甘油中洗涤。 细胞通过离心取回，并再次悬浮于10%甘油中。重复此步骤，直到所述细胞已经洗涤至少 3次。最后，细胞用体积为所述2XYT培养物体积1/1000(例如，400yL)的10%甘油再悬 浮。
[0134] 大肠杆菌转座子突变体集合的产牛
[0135] 60yL前面步骤中描述的细胞悬浮液与0.2yL转座体混合，并用"GeneII Pulser"（BioRad)对混合物电穿孔。通常情况下，使用2mm电极间隙的电穿孔比色杯，电 穿孔设置为2. 5kV，25yF和200D。这些设置导致时间常数为4. 8~5ms。随后加入lmL S. 0.C.肉汤至所述比色杯中，在混合后，将所述细胞悬浮液转移至新管中并在37°C下温育 1小时30分钟。所述细胞悬浮液随后铺展于用合适浓度（例如，7. 5yL/mL)的氯霉素补充 的LB-琼脂平板上，以及所述琼脂平板于37°C下温育以允许由所述转座子转位到所述细菌 基因组中而得到的氯霉素抗性转化体菌落生长。
[0136] 然后，估算所获得的菌落数量，从而提供转座子突变体的近似数值。菌落然后从所 述琼脂平板通过使用细菌涂布器再悬浮于一定体积的LB-肉汤中进行收获。向这种细胞悬 浮液中加入甘油至15%的浓度，并将悬浮液分成等分部分在-80°C下贮存。
[0137] 由大肠杆菌转座子突夺体集合牛成基闵组DNA用于研究涉及所诜择的牛长备件 的基闵
[0138] 这一步骤检测了所述细菌基因组中每一个基因在任何选择的条件下对生长的贡 献。这容许根据对生长条件的相对贡献对每个基因排序，从显著贡献的基因开始，通过未提 供显著贡献的基因，直至在所选条件下对所述细菌细胞的生长不利的基因。
[0139] 在这个实施例中，所述选择的生长条件是存在抗生素磷霉素。
[0140] 所述转座子突变体细菌集合在抗生素存在下生长。通常情况下，这可以在来自所 述-80°C的冷冻原液等分部分的108个单独细菌转座子突变体加入其中的10mL肉汤培养 物中实施。可以包含数种培养物，各自具有不同浓度的抗生素。例如，可以实施的浓度有 1/2X最小抑制浓度（MIC)，1XMIC和2XMIC。采用转座子突变体集合包含具有不同启动 子（tac，rplj或rrnB)的转座子的实验可以在单个集合（pool)中实施，或如果所述不同突 变体集合要单独研宄时可以包括更多的培养物。
[0141] 在所述培养物在培养基Luria肉汤或用60yM或150yM磷霉素补充的肉汤中 37°C培养过夜之后，随后将0.lmL培养物转移至所研宄的用相同浓度的磷霉素补充的10mL 新鲜LB肉汤中，并且这种培养物温育至少6小时以容许所述细菌生长。细菌随后从所述 培养物中通过离心收获并使用"基因组DNA缓冲装置（GenomicDNAbufferset)"和"Tip 100/Gs"（获自QIAGEN)提取基因组DNA。最后，基因组DNA溶解于10mMTris(pH8)中。
[0142] 使用下一代测序（nextgenerationseauencing).肓接从车?庵子插入位点牛成序 列阁读（seauenceread)
[0143] 基因组DNA经过剪切产生约300~600bp范围内的相对短的片段，末端修复， 5' -腺苷酸化以允许T-A连接以及连接至splinkeretted适配子。
[0144] 为了富集转座子-边界DNA片段进行测序，随后采用一种转座子特异性寡核苷酸 和仅在其通过由转座子端引发的聚合进行复制之后与所述splinkeretted适配子杂交的 一种适配子特异性寡核苷酸进行PCR扩增。对于所述转座子的左边界（leftborder)和 右边界（rightborder)平行进行扩增。运行两轮PCR，采用嵌套引物组（nestedprimer set)的第二轮PCR用于提高特异性。为了抑制由splinkerette衍生的扩增，第二轮 PCR包括splinkerette的不可延长引物（"受限PCR"）。通过加入双脱氧核苷酸通过封 闭splinkerette-文库中所有DNA末端进一步减少由于通过重叠延伸-PCR剪接所致的 splinkerette不希望的"激活"。
[0145] 根据所使用的转座子，所述第一轮PCR的寡核苷酸引物的结合位点应该远离转座 子嵌合末端60~100bp，并且反应可以使用对"左"和"右"边界扩增特异性的不同寡核苷 酸进行实施。第一轮PCR利用100ng模板DNA，并运行14个温度循环。当完成时，所得的 反应的部分随后用核酸外切酶I处理以去除第一轮引物并用水按照1:5稀释。1yL所述 稀释的物质在第二轮（20yL)PCR中用作模板，第二轮PCR进行18个温度循环。用于第二 轮PCR的嵌套（nested)寡核苷酸引物之一应该与所述转座子末端杂交。第二轮PCR中所 用的两种寡核苷酸都在所述5'端拥有5个核苷酸的随机序列，当在IlluminaHiSEQ测序 机上实施测序时其有助于簇登记。
[0146] 测序适配子然后连接至所述DNA片段文库和为了使用针对100bp配对的末端测序 的标准Illumina测序方案测序所制备的DNA。
[0147] 针对参考基闵组的序列阅读绘图
[0148] 将来自两个Illumina测序仪fastq文件的读取记录过程同步，使所述程序能够检 查每个阅读对（readpair)中一个转座子序列和一个splinkerette序列的存在。所述转 座子和splinkerette序列从每个读取的前方剪切（clip)，且仅在一个阅读中具有转座子 而另一个中具有splinkerette的阅读对才指定为有效。随着所述记录进行处理，所有其它 序列对被去除。单个输出文件随后以fastq格式生成，仅含有剪切的转座子阅读。
[0149] 来自这个fastq文件的阅读针对参考基因组绘图从而产生包含所属阅读绘制到 其上的基因组位置的.mapview文件，以及它们是绘制到正向链上还是反向链上。这就提供 了关于所述转座子插入方向的重要信息。
[0150]所述程序tpnlnsertionSites.pi(SangerInstitute)读取?mapview文件并 基于所述.mapview文件中的绘图数据，生成含有针对正向和反向链的插入和阅读数据 的三个输出文件，以及含有针对两条链的组合的插入和阅读数据的单独文件。所述程序 normgeneCombinedFreq.pi从正向，反向和组合的插入位点文件阅读数据，并且计算每个基 因上游的插入和阅读数目，允许所述转座子插入定向。所述程序还计算基因中插入和阅读 计数，并将这输出到单独的文件中。数据采用ARTEMIS(SangerInstitute)进行分析。
[0151] 磷霍素存在下有利于牛长的基闵的识别
[0152] 针对大肠杆菌对照基因组的序列阅读（sequenceread)绘图指示出其上绘制非常 大量阅读的3个主要位点，指示出在这些位点采用转座子插入的显著数量的突变体存活， 因此，这些位点对于在磷霉素存在下突变体的存活是重要的。图2显示了指示出插入点和 活化剂转座子插入频率的大肠杆菌ST131的全基因组序列。这些位点是murA，phn操纵子 和uhpT。
[0153] 图3显示了phn和uhpT的插入图：显示了大肠杆菌ST131的特异性基因组区域， 还有uhpT(子图A)和phn操纵子（子图B)的基因插入点和活化剂转座子插入的频率。
[0154] 所述murA基因编码UDP-N-乙酰葡糖胺-1-羧乙烯基转化酶，这是一种细菌胞壁 质球囊（肽聚糖层）生物合成所需的必需基因和磷霉素作用的已知靶。由转座子插入产生 的序列阅读（sequenceread)绘制在murA的紧邻上游，导致yrbA基因（也称为ibaG，其参 与所述酸耐受性响应）破坏。< br>[0155] 所述phn操纵子编码所述碳-磷裂解酶复合物。非常大量的阅读绘图至编码磷酸 酯（盐）代谢转录调节子的phnF基因。在这个基因中的插入在编码碳-磷裂解酶复合物的 相同操纵子（phnA-P)中紧邻所述phnG基因和其它基因的上游。该复合物断裂碳-磷键， 其同样存在于磷霉素，而其断裂会导致磷霉素失活。大量的阅读也绘图至编码磷酸盐（酯） ABC-转运体底物结合蛋白的所述phnD基因的3' -半部分（3' -half)，以及紧邻编码磷酸酯 (盐）ABC转运体通透酶蛋白的phnE基因上游。
[0156] 所述uhpT基因编码磷酸己糖转运体（hexosephosphatetransporter)，一种主要 负责将磷霉素转运到所述细菌细胞内的基因产物。在这个基因中存在主要的插入点，其中 观察到了大量的转座子，这些转座子会造成基因破坏，阻碍有活力的转运体蛋白的生产。
[0157] 实施例2 :表现出在工业废弃物中牛长改善的突夺体沼泽红假单孢菌的牛产
[0158] 沼泽红假单孢菌是紫色光合作用细菌，其属于a_变形细菌。它具有非凡的代谢 多功能性，通过四种支撑生命的代谢模式中任何一种进行生长：光合自养和光合成（能量 来自光而碳来自二氧化碳），光合异养（能量来自光而碳来自有机化合物），化学异养（碳 和能量来自有机化合物）和化学自养（能量来自无机化合物而碳来自二氧化碳）。这种代 谢灵活性有助于这种细菌应用于生物技术应用中，包括工业废物的生物治理。
[0159] 电感#杰沼泽红假单孢菌的制各
[0160] 用于转座子诱变的电感受态细胞通过用从冷冻原液快速移出（streak)的沼泽红 假单孢菌菌落接种500mL酵母蛋白胨葡萄糖（YeastPeptoneDextrose) (YPD)肉汤而制 备。该培养物在光存在下轻轻振荡30°C温育过夜，以确保所述培养物保持分散。1LYH)用 10mL所述过夜培养物接种，并30°C培养，直至600nm波长下测得的光密度为0. 3。细胞通过 离心收获并再悬浮于10%甘油中。细胞通过离心取回并再次重新悬浮于10%甘油中。重 复此步骤，直到所述细胞已经总共洗涤五次。细胞用体积为所述起始培养物体积1/100的 甘油再悬浮。
[0161] 沼泽红假单孢菌转座子突夺体集合的牛成
[0162] 50yL电感受态细胞与lyL转座体混合，随后采用"GeneIIpulser"(Biorad)进 行电穿孔。按照常规，使用具有2mm电极间隙的电穿孔比色杯，电穿孔设置为2.OkV，25yF 和200D。随后向所述比色杯中加入lmLYPD，并在混合后，将所得到的细胞悬浮液转移至 新管中并在30°C下温育lh。所述细胞悬浮液随后涂布于YH)琼脂平板上（含有适当浓度 的庆大霉素），并将所述琼脂平板于30°C下温育以允许源于所述转座子转位到所述细菌基 因组中的庆大霉素抗性菌落生长。菌落然后从琼脂平板上通过重新悬浮于YH)肉汤中而收 获。随后加入甘油至15%的浓度，并将所述悬浮液分成等分部分在-80°C下贮存。
[0163] 生成使用表1中所示三种启动子的沼泽红假单胞菌转座子突变体集合用来研宄 在工业废弃物（污染的甘油）中在光存在和不存在下（分别为图中的子图A和B)的生长。 如图4中所示，产生的沼泽红假单胞菌突变体在清洁的和脏的甘油中，在化养和光养的代 谢模式下，都表现出生长改善。
[0164] 这些数据表明，显著更好地适应于工业废弃物（脏甘油）中生长的沼泽红假单胞 菌突变体形式通过本发明的方法可以很容易设计（工程化，engineered)和选择。
[0165] 等效物
[0166] 前面的描述详细介绍了本发明目前优选的实施方式。当考虑到这些描述时，预期 本领域技术人员就会想到其实践中的许多修改和变体。这些修改和变体预想都涵盖于所附 的权利要求之内。
【主权项】
1. 一种在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突变体细菌的生产方法， 所述方法包括以下步骤： (a) 通过采用活化转座子（TnA)的转座子诱变生产突变体细菌集合，其中所述1^包含 能够增加其插入位点处或附近基因转录的启动子； (b) 在所述选择的生长条件下和在一种或多种参照条件下由突变体集合生长细菌从而 产生两种以上测试培养物；和 (c) 比较测试培养物之间TnA插入的分布以识别出在所述选择的生长条件下不利于生 长和/或存活的第一类基因和在所述选择的生长条件下有利于生长和/或存活的第二类基 因。2. 根据权利要求1所述的方法，进一步包括提供其中至少一种所述不利基因被去除或 破坏和/或至少一种所述有利基因过表达的设计的突变体细菌的步骤，使得所述突变体细 菌在所述选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长。3. 根据权利要求2所述的方法，其中多种所述不利基因被去除或破坏。4. 根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中多种所述有利基因过表达。5. 根据权利要求2-4中任一项所述的方法，进一步包括培养所述设计的突变体细菌并 随后对所述设计的突变体细菌实施权利要求1的步骤（a)-(c)以识别出在所述选择的生长 条件下不利于生长和/或存活的另外的第一类基因和在所述选择的生长条件下有利于生 长和/或存活的另外的第二类基因。6. 根据权利要求5所述的方法，进一步包括提供其中至少一种所述另外的不利基因被 去除或破坏和/或至少一种所述另外的有利基因过表达的第二轮设计的突变体细菌的步 骤，从而相对于权利要求2所述的设计的突变体细菌在所述选择的生长条件下所述突变体 细菌表现出改善的存活和/或生长。7. 根据权利要求6所述的方法，包括一个或多个另外轮的诱变并重复实施权利要求1 所述的步骤（a)-(c)以提供相对于前一轮的设计的突变体细菌在所述环境挑战存在下表 现出改善的存活和/或生长的第三或更多轮突变体细菌。8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不利基因的去除和/或破坏包括 基因组最小化。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述基因组最小化包括将质粒DNA整合至细菌染 色体中并随后解离共合体。10. 根据权利要求8所述的方法，其中所述基因组最小化包括在线性DNA末端通过短同 源臂介导的同源重组。11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括将至少一种异源基因引入到 所述细菌中的步骤。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述异源基因有利于在所述选择的生长条件下 生长和/或存活。13. 根据权利要求11或权利要求12所述的方法，包括将异源基因簇引入到所述细菌中 的步骤。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述异源基因簇编码生物合成路径。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述生物合成路径产生次级代谢产物。16. 根据权利要求13所述的方法，其中所述异源基因簇编码生物降解路径。17. 根据权利要求11所述的方法，其中所述异源基因编码治疗性蛋白。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗性蛋白选自： (a) 酶； (b) 抗体； (c) 抗原； (d) 毒素； (e) 配体结合蛋白； (f) 抗生素； (g) 肽；和 (h) 细胞因子。19. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择的生长条件包括存在以下 各项： (a) 环境污染物； (b) 工业废弃产品； (c) 医疗废弃产品； (d) 药物或候选药物； (e) 选择的碳源，例如烃； (f) 一种或多种其它生物，例如微生物和病毒。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述一种或多种其它生物选自： (a) 人类病原体； (b) 动物病原体；和 (c) 植物病原体。21. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含至少 0. 5XIO5个突变体，例如至少IX10 5个突变体。22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含至少5X10 5个突变 体。23. 根据权利要求21所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含至少IX10 6个突变 体。24. 根据权利要求21所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含0. 5X106~2X106个 突变体。25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含约IX10 6个突变体。26. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/50个细菌DNA碱基对的插入率。27. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/30个细菌DNA碱基对的插入率。28. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/25个细菌DNA碱基对的插入率。29. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/15个细菌DNA碱基对的插入率。30. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/10个细菌DNA碱基对的插入率。31. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤（a)的所述细菌DNA是染色体 (基因组）DNA。32. 根据权利要求1~30中任一项所述的方法，其中步骤（a)的所述细菌DNA是质粒 DNA或染色体（基因组）DNA和质粒DNA的混合物。33. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤（a)的所述转座子诱变在体内 发生。34. 根据权利要求1~32中任一项所述的方法，其中步骤（a)的所述转座子诱变在体 外发生。35. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌是革兰氏阳性或革兰氏阴 性细菌，例如沼泽红假单抱菌（Rhodopseudomonaspalustris) 〇36. 根据权利要求1~35中任一项所述的方法，其中所述细菌是益生菌。37. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过由步骤（b)的突变体集合以 IO7~10 9,例如约108,cfu接种生长培养基，由所述突变体集合生长细菌。38. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过对邻近或接近TnA插入位点的 DNA测序比较测试培养物之间TnA插入的分布。39. 根据权利要求38所述的方法，其中邻近或接近所述TnA插入位点的DNA的所述测 序包含转座子-细菌DNA接合物的选择性扩增。40. 根据权利要求38或39所述的方法，其中所述测序包含边合成边测序（SBS)生物化 学。41. 根据权利要求38~40中任一项所述的方法，其中对邻近或接近所述Tn4插入位点 的DNA的约25、50、75、100或多于100个DNA碱基对进行测序。42. 根据权利要求38~41中任一项所述的方法，其中所述测序的DNA是5'和/或3' 至所述TnA插入位点。43. -种通过由根据前述权利要求中任一项中所定义的方法可获得的、或获得的突变 体细菌。
【专利摘要】描述了在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突变体细菌的生产方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过采用活化转座子(TnA)的转座子诱变生产突变体细菌集合，其中所述TnA包含能够增加其插入位点处或附近基因转录的启动子；(b)在所述选择的生长条件下和在一种或多种参照条件下由所述突变体集合生长细菌从而产生两种以上测试培养物；和(c)比较测试培养物之间的TnA插入的分布以识别出在所述选择的生长条件下不利于生长和/或存活的第一类基因和在所述选择的生长条件下有利于生长和/或存活的第二类基因。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN104903446
【申请号】CN201380057726
【发明人】戴维·休·威廉斯, 阿瑟·基思·特纳, 约翰·理查德·韦恩
【申请人】贝克特沃有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月5日
【公告号】CA2890104A1, EP2917346A1, US20150307873, WO2014072697A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及设计（工程化，engineering)适用于生物技术应用，包括蛋白、次级 代谢产物（secondarymetabolite)和生物燃料的生产，生物催化，生物治理（生物修复， bioremediation)，生物转化，生物降解，生物学控制，药物开发，药物筛选，疫苗，益生菌，生 物传感器和药物递送载体（drugdeliveryvehicle)的细菌细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 细菌在生物技术的许多方面都找到了应用，包括用作生产异源蛋白和肽（包括酶 和治疗性抗体）的宿主，作为次级代谢产物或其衍生物的源，作为生物学控制，生物降解， 生物燃料生产，生物催化和生物治理的试剂和作为益生菌，疫苗组分和药物递送体系。
[0003] 天然细菌菌株对于生物技术用途并未优化。合成生物学这一新兴领域的目标之一 是设计（工程化，engineering)更易于处理和/或更有效的作为生物技术工具的新型生物。
[0004] -种方法可以称为"粉碎（ground-up) "方法（例如，见W02008/024129)。这涉及 到只包含那些生长必不可少的基因的最小化的人工细菌DNA基因组的合成。这然后用于 产生按照需要可以向其增加所需的生物合成路径，信号传导途径或分解代谢功能的裸"框 架"（bare"chassis"）。这种方法目前是不切实际的，因为基因产物和调控元件会协同和 串扰于整个细胞的环境中，其方式当前还不完全理解并因此不能作为正式模块进行处理。
[0005] 另一种方法称为"剥离（stripdown) "方法。目前这在链霉菌（Streptomyces spp.)有用的次级代谢产物的生产中找到了应用。此处，不是生长必需的基因和其它遗传 物质将被去除（"剥除（strippedout)"），而逐个重新引入用于选定的生物合成路径的那 些。例如，Komatsu等（Komatsuetal. (2010)PNAS107(6) :2646-2651)描述了用于编码 次级代谢产物生物合成的基因的异源表达的设计的（工程化，engineered)细菌的构建，这 涉及从工业微生物阿维链霉菌（Streptomycesavermitilis)基因组中系统地删除非必需 基因。
[0006] 所述"剥离"方法需要识别对于所选条件下存活和/或生长非必要的（和从而代 谢高成本性的以及因此不利的）基因的方法。
[0007] 此外，这种方法将受益于互补功能基因组分析还识别出有利于所提出的生物技术 应用的基因。在后一种情况下，"剥离（stripdown)/增产（rev-up)"方法随后能用于最小 化由非必要（不利的）基因所引起的代谢负担，同时放大直接或间接有助于所述生物技术 应用的基因（即，有利基因）的有益作用。
[0008]转座子定向插入位点测序（transposondirectedinsertion-sitesequencing) (TraDIS-见Langridgeetal. (2009)GenomeResearch19:2308-2316)最近已经被描述 并用于识别：（a)必需基因；(b)有利生长的（但非必需的）基因；（c)在特定条件下不利生 长的基因；和（d)参与对某些条件提供耐受性的基因（"壁龛特异性的（niche-specific)" 必需基因）。类似的技术已描述于例如，Gawronskietal. (2009)PNAS106:16422-16427; Goodmanetal. (2009)CellHostMicrobe6:279-289；vanOpijnenetal. (2009)Nat. Methods6:767-772和Gallagheretal. (2011)mBio2(1) :e00315-10,并且这种技术现在 统称为"Tn-seq"方法。
[0009] 现在本发明人已经发现，TraDIS能够适于为细菌生物设计（生物工程， bioengineering)目的明确地识别出不利的和有利的基因的问题提供非常巧妙的解决方 案。这通过使用活化转座子（TnA)而实现。这些转座子包括启动子从而使转座子在合适的 插入位点插入到细菌DNA中增加了插入位点处或接近基因的转录。因此采用1^的诱变产 生插入失活的突变体（其中所述！^破坏了基因表达，通常在插入到编码区中之后）以及 插入活化的突变体（通常在转座子已插入到基因的上游，从而使所述启动子驱动所述基因 高水平的转录（以及因此产生更高水平的表达）。
【发明内容】
[0010] 根据本发明，提供了生产在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突 变体细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
[0011] a)通过采用活化转座子（TnA)的转座子诱变生产突变体细菌集合，其中所述、包 含能够增加其插入位点或附近的基因转录的启动子；
[0012] b)由所述突变体集合在所选择的生长条件下和在一种或多种参照条件下生长细 菌以产生两种以上测试培养物；和
[0013] c)比较测试培养物之间的!^插入的分布以识别出在所选择的生长条件下不利于 生长和/或存活的第一类基因和在所选择的生长条件下有利于生长和/或存活的第二类基 因。
[0014] 通常情况下，与第一类的（不利的）基因相关的TnA插入发生于编码区（从而使 所述基因被!^插入失活）或所述编码区外部但是在所述编码序列的互补DNA链上（导致 反义RNA的产生或启动子活性破坏），然而与第二类的（有利的）基因相关的!^插入却定 向发生于所述编码区的上游，由此所述1^的启动子驱动所述基因的升高的转录（从而进 行表达）。
[0015] 这种方法可以进一步包括以下步骤：提供设计的（工程化的，engineered)突变体 细菌，其中至少一种所述不利基因被去除或破坏和/或至少一种所述有利基因过表达，从 而使所述突变体细菌表现出在所选择的生长条件下改善的存活和/或生长。在这些实施方 式中，多种所述不利基因可以去除或破坏同时多种有利基因过表达。
[0016] 按照这种方式，可以设计（工程化，engineer)或选择显著更好地适于所选生长条 件（从而适于所述生物技术用途）的突变体细菌。
[0017] 在这些实施方式中，所述方法可以进一步包括分离和培养所述设计的（工程化 的，engineered)突变体细菌并随后将其进行再一轮的诱变，培养和比较（如以上步骤(a)-(c)中定义），并可以可选地进一步包括以下步骤：提供第二轮设计的（工程化的， engineered)突变体细菌，其中至少一种所述另外的不利基因被去除或破坏和/或至少一 种所述另外的有利基因过表达，从而使所述突变体细菌在所选择的生长条件下相对于所述 第一轮诱变之后产生的所述设计的（工程化的，engineered)突变体细菌表现出进一步改 善的存活和/或生长。
[0018] 因此，本发明的方法优选是重复的，并还可以包括另外轮的诱变和重复实施步骤 (a)至（c)(如上所定义）以提供在所述环境挑战存在下相对于前一轮的设计的突变体细菌 表现出更进一步改善的存活和/或生长的第三，第四，第五（或更多）轮突变体细菌。
[0019] 在这些实施方式中，每一轮期间采用的选择的生长条件可以是相同或不同的。
[0020] 本发明的其它方面和优选实施方式定义和描述于以下陈述的其它权利要求中。
【具体实施方式】
[0021] 本文提及的所有出版物，专利，专利申请和其它参考文献出于所有目的以其全文 结合于本文中作为参考，就好像每个单独出版物，专利或专利申请专门地且各自地指出以 其全部引述的内容结合于本文中作为参考。
[0022] 宙义和一般优诜
[0023] 当在本文中使用时以及除非另外明确指出，否则以下术语预想具有以下含义（除 了所述术语在本领域内可能具有的任何更宽（或更窄）的含义之外）：
[0024] 除非上下文另有所需，本文中单数的使用应理解为包括复数，反之亦然。涉及实体 使用的术语"一个"或"一种"应该理解为是指一种或多种所述实体。同样，术语"一个"（或 "一种""一种或多种"，和"至少一种"在本文可互换使用。
[0025] 正如本文所用的，术语"包含"或其变体如"包括"或"包括了"，应该理解为是指 包含任何所述的整数（例如，特征，要素，特性，属性，方法/过程步骤或限制）或整数的组 (例如，特征，要素，特性，性质，方法/过程步骤或限制），但并不排除任何其它整数或整数 的组。因此，正如本文所用的，术语"包括"是包含性的或开放式的，并且并不排除另外的， 未列举的整数或方法/过程步骤。
[0026] 所述术语"基因"是描述由占据染色体或质粒中的特定位置并决定生物中具体特 性或特性的组的DNA序列构成的遗传单元的术语。基因可以通过指定构成蛋白或蛋白部分 (结构基因）的多肽链；或编码RNA分子；或通过指定构成影响或以任何方式调节其它基因 的操作或抑制这种操作（例如，通过以顺式作用）的结构实体的核酸决定生物特性；或通过 其它尚未定义的机理影响表型。
[0027] 所述术语"基因组DNA"是本文中用于定义染色体DNA有别于染色体外维持的质粒 DNA的本领域术语。
[0028] 所述术语"基因组"是本文中用于定义生物体整个遗传互补的本领域术语，因此包 括染色体，质粒，噬菌体和任何其它起到遗传物质作用的DNA或RNA。
[0029] 所述术语"革兰氏阳性细菌"是定义基于某些细胞壁染色特性一起分组的特定类 细菌的本领域术语。
[0030] 所述术语"低G+C革兰氏阳性细菌"是基于所述DNA中碱基的组成定义所述 革兰氏阳性中进化相关细菌的特定子类类型的本领域术语。所述子类包括链球菌属 (Streptococcusspp.)，葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)，李斯特菌属(Listeria spp.)，芽孢杆菌（Bacillusspp.)，梭状芽孢杆菌属（Clostridiumspp.)，肠球菌属 (Enterococcusspp.)和乳酸杆菌（Lactobacillusspp. ) 〇
[0031] 所述术语"高G+C革兰氏阳性细菌"是基于所述DNA中碱基的组成定义所述 革兰氏阳性中进化相关细菌的特定子类类型的本领域术语。所述子类包括放线菌纲 (actinomycetes)(放线菌类（actinobacteria))包括放线菌属（Actinomycesspp.)，节杆 菌属（Arthrobacterspp.)，棒状杆菌属（Corynebacteriumspp.)，弗兰克氏菌属（Frankia spp.)，微球菌属（Micrococcusspp.)，小单抱菌属（Micromonosporaspp.)，分支杆菌属 (Mycobacteriumspp.)，诺卡氏菌属（Nocardiaspp.)，丙酸杆菌属（Propionibactoria spp.)和链霉菌属（Streptomycesspp. ) 〇
[0032] 所述术语"革兰氏阴性细菌"是定义基于某些细胞壁染色特性一起分组的特定类 细菌的本领域术语。革兰氏阴性细菌属的实例包括克雷伯氏菌属（Klebsiella)，不动杆 菌属（Acinetobacter)，埃希氏菌属（Escherichia)，假单胞菌属（Pseudomona)，肠杆菌属 (Enterobacter)和奈瑟菌属（Neisseria)。
[0033] 牛长备件的诜择
[0034] 本发明的方法允许设计在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突 变体细菌，并涉及相对一种或多种参考条件，在选择的生长条件下检测TnA插入的分布和/ 或频率的差异。
[0035] 所述生长条件根据所述最终生产的设计细菌的所需生物技术应用进行选择：任何 条件都 是合适的，条件是所选定的生长条件和参考生长条件之间的差异驱动衍生自！^插 入突变体初始集合的测试培养物中的可回收TnA插入突变体的分布变化。
[0036] 在某些实施方式中，所述选择的生长条件特征在于存在一种或多种不存在（或在 参照条件下以不同的，例如较低或较高浓度存在）的选择性试剂。在这样的背景下，所述术 语"选择性试剂"广义上用于涵盖当用于本发明方法中时引起基因组TnA插入的分布和/或 频率变化的任何试剂（或试剂组合）。
[0037] 因此这种试剂包括但不限于：环境污染物；毒素；抗生素；碳源；氮源；能源；其它 微生物（例如，酵母，病毒，细菌和/或植物）；pH;压力；温度；盐浓度；杀虫剂；放射性材 料；烃；油残余物；工业废弃产品；医疗废弃产品；废水残余物等。
[0038] 以下列出了根据所述设计细菌的预想生物技术用途适用于提供本发明方法的选 择生长条件的示例性非限制性的选择性试剂：
[0039] 生物治理（生物修复，bioremediation)-砷，金属，例如重金属，特别是铅，采铀， 钯，铬和镉；多核芳烃，氯代溶剂，酚，油，杀虫剂和磷酸盐（酯）。
[0040] 微生物增强的米油（microbialenhancedoilrecovery)-原油和重油馈分
[0041] 污水处理-亚硝酸盐类，氨，磷酸盐类和类雌激素化合物
[0042] 食品生产-乳糖和醋酸。
[0043] 生物燃料的生产-二氧化碳，氢，阳光，氧，纤维素和半纤维素
[0044] 能量产生-废水，海洋沉积物，淡水沉积物，河流水，乙酸盐（酯），丙酸盐（酯）和 丁酸盐（酯）
[0045] 生物生产和疫苗-Luria-Bertani或LB肉汤，Terrific肉汤（TB)，2YT或化学定 义的培养基。
[0046] 生物消化/生物降解-秸杆组分，纤维素废弃物和塑料。
[0047] 益生菌-其它细菌，例如厚壁菌门（Firmicutesphylum)的成员。
[0048] 感染的治疗-病原细菌，植物，根瘤农杆菌，动物，金黄色葡萄球菌，人体组织和艰 难梭菌（Clostridiumdifficile)，人共生细菌或人互惠细菌。
[0049] 话用于本发_所沭方法的细菌
[0050] 本发明的方法可以应用于任何细菌的设计（工程化，engineering)。所选择的细 菌将尤其取决于所述预期的生物技术用途。
[0051] 因此，本发明的方法在以下细菌中抗生素靶的识别中找到了应用：(a)革兰氏阳 性，革兰氏阴性和/或革兰氏可变细菌；(b)产芽孢细菌；(c)无芽孢细菌；(d)丝状细菌； (e) 胞内细菌；（f)专性需氧菌；（g)专性厌氧菌；(h)兼性厌氧菌；（i)微需氧细菌和/或 (f) 条件致病细菌病原体。
[0052] 在某些实施方式中，本发明的方法应用于以下细菌属：不动杆菌属（例如，鲍曼 不动杆菌）；气单胞菌（例如，嗜水气单胞菌）；芽孢杆菌（例如，炭疽芽孢杆菌）；拟杆菌 类（例如，脆弱拟杆菌）；博德特氏菌（例如，百日咳博德特氏菌）；疏螺旋体（例如，伯氏 疏螺旋体）；布鲁氏囷属（例如，牛布鲁氏囷，犬布鲁氏囷，羊布鲁氏囷和猪布鲁氏囷）；伯 克霍尔德菌属（例如，洋葱伯克霍尔德菌复合体）；弯曲杆菌（例如，空肠弯曲杆菌）；衣原 体（例如，沙眼衣原体，猪型沙眼衣原体和鼠型沙眼衣原体）；嗜衣原体属（例如（例如， 肺炎嗜衣原体，家畜嗜衣原体（C.pecorum)，鹦鹉热嗜衣原体，牛嗜衣原体，猫嗜衣原体和豚 鼠嗜衣原体）；柠檬酸杆菌（例如，弗氏柠檬酸杆菌）；梭状芽胞杆菌（例如，肉毒梭菌，艰 难梭菌，产气荚膜梭菌和破伤风梭菌）；棒状杆菌属（例如，白喉棒状杆菌和谷氨酸棒状杆 菌）；肠杆菌（例如，阴沟肠杆菌和产气肠杆菌）；肠球菌（例如，粪肠球菌和屎肠球菌）； 埃希菌属（例如，大肠杆菌）；黄杆菌属（Flavobactoria);弗朗西斯氏菌（例如，土拉弗朗 西斯菌）；梭杆菌属（例如，坏死梭杆菌）；嗜血杆菌（例如，睡眠嗜血菌，流感嗜血菌和副 流感嗜血菌）；螺杆菌（例如，幽门螺杆菌）；克雷伯氏菌属（例如，产酸克雷伯氏菌和肺炎 克雷伯菌）；军团菌属（例如，嗜肺军团菌）；钩端螺旋体菌属（例如，问号钩端螺旋体）； 李斯特菌（例如，单核细胞增生性李斯特菌）；莫拉菌属（例如，卡他莫拉菌）；摩根氏菌 属（如摩氏摩根菌）；分支杆菌属（例如，麻风分支杆菌和结核分枝杆菌）；支原体（例如， 肺炎支原体）；奈瑟氏菌属（例如，淋病奈瑟氏菌和脑膜炎奈瑟氏菌）；巴氏杆菌（例如，多 杀性巴氏杆菌）；消化链球菌；普氏菌属；变形杆菌属（例如，奇异变形杆菌和普通变形杆 菌），假单胞菌属（例如，铜绿假单胞菌）；立克次体（例如，立克次氏立克次体）；沙门氏 菌属（例如，血清型，伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌）；沙雷氏菌属（例如，粘质沙雷氏 菌）；志贺氏菌属（例如，弗莱斯纳志贺氏菌（S.flexnaria)，痢疾志贺氏菌和宋内志贺氏菌 (S.sonnei));葡萄球菌（例如，金黄色葡萄球菌，溶血葡萄球菌，中间葡萄球菌，表皮葡萄 球菌和腐生葡萄球菌）；寡养单胞菌属（例如，嗜麦芽寡养单胞菌）；链球菌属（例如，无乳 链球菌，变形链球菌，肺炎链球菌和化脓链球菌）；密螺旋体（Treponema)(例如，苍白密螺 旋体（T.pallidum));弧菌属（例如，霍乱弧菌）和耶尔森氏菌属（例如，鼠疫耶尔森氏杆 菌）。
[0053] 以下列出了根据预想的生物技术用途适于本发明方法的示例性非限制性细菌：
[0054] 生物治理-不动杆菌，假单胞菌，产碱杆菌，鞘氨醇单胞菌，红球菌属，分支杆菌 属，地杆菌属，贪铜菌属和脱硫弧菌属。
[0055] 微生物增强采油-不动杆菌属，芽孢杆菌属，假单胞菌属，红球菌属，节杆菌属，克 雷伯氏菌属和梭菌。
[0056] 污水处理-不动杆菌，硝化细菌属，硝化球菌属和硝化螺旋菌属。
[0057] 食品生产-醋酸菌属。
[0058] 生物燃料生产-真养罗氏菌，产氢盐厌氧菌属（halanaerobium hydrogeniformans)，大肠杆菌，蓝细菌，丙酮丁醇梭菌，运动发酵单胞菌和极端嗜热厌氧纤 维素降角军菌（caldicellulosiruptorobsidiansis)〇
[0059]能源产生-地杆菌属（Geobacter)，脱硫单胞菌属，变形菌属，陶厄氏居泥杆菌 (PelobacterThauera)，芽孢杆菌和脱氯单胞菌属
[0060] 生物生产-大肠杆菌属，短芽孢杆菌属，巨大芽孢杆菌属，枯草芽孢杆菌属，新月 柄杆囷属，链霉囷属，
[0061] 生物消化/生物降解
[0062] 真养罗氏菌属，产氢盐厌氧菌属，大肠杆菌，蓝细菌属，丙酮丁醇梭菌，运动发酵单 胞菌属，极端嗜热厌氧纤维素降解菌（Caldicellulosiruptorobsidiansis)，
[0063] 疫苗
[0064] 新月柄杆菌属，大肠杆菌属，沙门氏菌属
[0065] 益生菌-双歧杆菌属，厚壁菌门、人类共生菌属和人类互惠菌属的成员。
[0066] 感染的治疗-竞争性"好"细菌（例如，人类共生菌属或人类互惠菌属），植物，土 壤杆菌（Agrobacterium)，人葡萄球菌和双歧杆菌的无毒菌株。
[0067] 基因组设计
[0068] 本发明的方法可以包括提供其中至少一种所述不利基因被去除或破坏和/或至 少一种所述有利基因过表达的设计的（工程化的，engineered)突变体细菌的步骤，从而使 所述突变体细菌表现出在所选择的生长条件下存活和/或生长改善。
[0069] 对于不利/非必需基因的去除或破坏，在细菌中染色体基因缺失/替换的各种实 验方案在本领域内是已知的，这些方案使靶向基因组序列能够采用携带所定义突变那些的 拷贝进行特异性替代。
[0070] 有两种方法是特别有用的：第一（"进-出（IN-0UT) "）方法是基于将质粒DNA整 合至所述细菌染色体中并随后解离该共合体（cointegrate)。第二（"线性片段"或重组设 计（recombineering))方法是基于在线性DNA分子末端通过短同源臂介导的同源重组。
[0071]这些方法综述于例如，Madyagoletal. (2011)FoliaMicrobiol56:253-263中， 其公开内容结合于本文中作为参考。
[0072] 这种方法可以用于缺失所述细菌基因组的较大片段（largetract)，并且如果用 于消除对所需生物技术应用非必需的所有（或基本上全部）基因（即，另外地对所述细菌 细胞施加代谢负担的所有非必需基因），则这种方法可以称为"基因组最小化"。
[0073] 在一些实施方式中，所述突变体细菌可以设计成具有比野生型基因组小10%， 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或大于 90% 的"最小化的"基因组。
[0074] 对于有利基因使所述突变体细菌表现出在所选择的生长条件下存活和/或生长 改善的过表达，广泛多样的已知技术中任何一种都可以使用，包括尤其是化学诱导的（或 u.v.诱导的）点突变的引入，强启动子的插入，核糖体结合位点，抑制物结合位点的去除和 密码子使用的优化。
[0075] 突夺体集合
[0076]本发明的方法涉及通过转座子诱变生产突变体细菌集合。所述突变体集合的大小 会影响所述方法的分辨率：随着所述集合尺寸增加，具有!^插入的越来越多的不同基因将 被表示（因此有效地被检测）。随着所述集合尺寸减小，所述方法分辨率会降低，基因检测 将不太有效，且越来越多的基因将根本不会被检测。
[0077] 理想的是，在本发明的方法中产生的突变体集合在以下意义上是全面的，即表示 插入每个基因中。为实现这一点所需的TnA插入突变体的数目（S卩，所述突变体集合大小） 取决于各种因素，包括：（a)所述细菌基因组的大小；(b)所述基因的平均大小；和（c)任何 1^插入位点偏差。
[0078] 对于后者，细菌基因组的某些区域（特别是富含GC的区域）吸引低频率的插入。 因此，优选插入频率和集合尺寸足够大以确保插入到难插入的区域。
[0079] 一般而言，需要1个转座子/25bp的最小插入率以获得全面的集合/文库，这通常 对于具有4~7Mb的基因组尺寸的细菌具有最小集合尺寸0. 5X105至1X105,例如5X105， 优选至少约1X106个突变体。在许多情况下，1X10 6个突变体将允许识别~300, 000个不 同的插入位点并对应于1个转座子插入/13~23bp(或约40~70个不同插入位点/基 因）。
[0080] 然而，本发明的方法不一定需要全面的突变体集合（按照以上定义的意义）以返 回有用信息。相反，可以使用小于理想的全面集合的集合尺寸，条件是分辨率降低（和随之 而来的不能检测某些基因）是可以容忍的。例如，当所述方法设计成反复执行直到所述靶 被识别时，情况可能就是这样：在这些实施方式中，所述有效的集合尺寸随着所述方法的每 次重复而增加。
[0081] 转座子诱夺
[0082]转座子，有时也称为可转座元件（transposableelement)，是能够将其自身拷贝 插入到其它多核苷酸中的多核苷酸。术语转座子对于本领域技术人员是公知的并且包括能 够基于序列组织，例如在各端的短的反向重复；在所述端部直接重复的长末端重复（LTR); 和在RNA转录本的3'端的polyA(5'端经常短截）加以区分的转座子种类。
[0083] 转座体（Transposome)是转座酶-转座子复合物，其中所述转座子不编码转座酶 活性。因此，一旦插入，所述转座子是稳定的。优选为了确保突变体集合稳定性，所述转座 子不编码转座酶而以转座体（即，作为 与转座酶的复合物）的形式提供，正如以下所述。
[0084] 正如本文中所用术语"活化的转座子"（下文缩写为"TnA"）定义包含启动子使 得转座子插入增加所述插入位点或其附近的基因转录的转座子。这种转座子的实例描述 于Troescheletal. (2010)MethodsMolBiol. 668:117-39 和Kimetal. (2008)Curr Microbiol. 57(4) : 391-394 中。
[0085] 所述活化的转座子/转座体能够通过广泛多样的本领域技术人员公知的标准方 法中任一种引入到所述细菌基因组（包括染色体和/或质粒DNA)中。例如，Tn#座体能 够通过电穿孔（或任何其它合适的转化方法）引入。
[0086] 优选这种转化方法产生1X103~5X10 3个转化体/ngDNA，且这种转化效率一般 可使用电穿孔实现。
[0087] 可替代的，使用1^的转座子诱变可以体外进行且重组分子转化/转染到细菌细 胞中。在这些实施方式中，转座体可以通过将市售转座酶与所述转座子DNA片段混合根据 标准方案进行制备。所得转座体随后与感兴趣的质粒的质粒DNA混合以允许转位，然后使 用电转化将所述DNA引入到宿主细菌菌株中，从而产生质粒转座子突变体集合。
[0088] 在诱变体外实施的实施方式中，有可能将转座体与基因组DNA体外混合随后将所 述诱变的DNA(可选地，在片段化和/或环化之后）引入宿主细菌菌株（例如，通过电穿孔）， 由此内源性重组机器将其结合至所述基因组中。这种方法可以尤其适用于细菌是天然感受 态的（naturallycompetent)(例如，不动杆菌属）和/或能够通过同源交叉（例如，双重 交叉）重组事件结合DNA的情况。
[0089] 话用于本发明方法的活化转座子
[0090] 任何合适的活化转座子可以用于本发明的方法。合适的转座子包括基于Tn3和类 Tn3(II类）转座子的那些，包括yS(TnlOOO)，Tn501，Tn2501，Tn21，Tn917 及其相关物。 此外还有TnlO,Tn5,TnphoA，Tn903,噬菌体Mu和相关的可转座噬菌体。多种合适的转座子 也可以商购获得，包括例如所述EZ-Tn5?〈R6Kyori/KAN-2>转座子。
[0091] 优选的转座子是携带抗生素抗性基因的那些（其能够用于识别携带转座子的突 变体），包括Tn5,TnlO和TnphoA。例如，TnlO在其IS元件之间携带四环素抗性基因而Tn5 携带编码提供卡那霉素，链霉素和博来霉素抗性的多肽的基因。其它合适的抗性基因包括 包含氯霉素乙酰转移酶（提供氯霉素抗性）的那些。
[0092] 当然，有可能在转座子中的抗生素抗性基因的编码区或别处通过在IS元件之间 插入抗生素抗性基因的不同组合，或通过在转座子嵌合末端（mosaicend)(优选的）之间 插入抗生素抗性基因的组合，或通过改变所述转座子的多核苷酸序列，例如通过进行冗余 碱基取代或不影响所述转座子的转位或抗生素抗性特性的任何其它类型的碱基置换，而产 生新的转座子。这种转座子都包括在本发明的范围之内。
[0093] 在许多实施方式中，单个转座子用于产生所述突变体集合。然而，如以上的解释， 获得全面集合或文库所需的Tn插入突变体的数量（S卩，所述突变体集合尺寸），尤其取决于 任何Tn插入位点偏差。因此，在所述转座子插入位点偏差发生的情况下，可以使用两种以 上不同的转座子以减少或消除插入位点偏差。例如，可以采用基于Tn5和TnlO的两种不同 转座子的组合。
[0094] 话用于活化转座子的启动子
[0095] 在所述TnA中存在的启动子的性质依赖于所述转座子和最终细菌宿主的性 质。通常，要选择驱动所述插入位点附近或邻近DNA的高水平转录的高效向外定向 (outward-oriented)的启动子。
[0096] 所述启动子可包括：（a)普里布诺盒（Pribnowbox) (-10个元件）；(b)_35元件和 /或（c)UP元件。
[0097] 例如，所述lac启动子能够与EZ-Tn5?〈R6Kyori/KAN-2>转座子一起使用，且这 种构建体（construct)适用于检测例如大肠杆菌，肠杆菌属和肠杆菌科家族的其它成员， 如克雷伯氏菌属。其它合适的启动子包括：rplj(大核糖体亚基蛋白；中等强度启动子）； tac(人工lac/trp杂合体；强启动子）和rrnB(核糖体RNA基因启动子；非常强的启动子）。
[0098]确宙Tm插入的分布
[0099] 转座子插入的分布优选通过所述TnA插入位点邻近或附近（5'和/或3'）细菌DNA 测序（例如，通过对包含TnA-基因组DNA连接头的DNA测序）进行测定。通常情况下，对 所述TnA-端或两端侧翼或邻近的细菌DNA进行测序。
[0100] 测序的邻近DNA长度不必是太长，优选相对较短（例如，小于200个碱基对）。
[0101] 多种方法能够用于使用DNA测序以测定所述！^插入分布：这样的方法最近已被 称为Tn-seq方法（vanOpijnenetal. (2009)Nat.Methods6:767-772)。例如，Tn-seq方 法包括扩增的Tn连接头的亲合纯化（Gawronskietal. (2009)PNAS106:16422-16427); 使用专用限制位点将适配子连接到所述转座子末端远端的基因组序列中（Goodmanet al. (2009)CellHostMicrobe6:279-289；vanOpijnenetal. (2009)Nat.Methods 6:767-772);选择性扩增（Langridgeetal. (2009)GenomeResearch19:2308-2316)和携 带Tn接头的单链DNA圆环的产生，其在通过核酸外切酶消化消除基因组DNA之后用作扩增 和测序的模板（Gallagheretal. (2011)mBio2(1) :e00315_10)。
[0102] 任何合适的高通量测序技术都可以使用，且有许多商用测序平台适用于本发明 的方法。基于边合成边测序（SBS)的测序平台（Sequencing-by-synthesis(SBS)-based sequencingplatform)尤其合适于本发明的方法：例如，Illumina?系统生成数百万相对 短的序列阅读（54, 75或100bp)，并且是特别优选的。
[0103] 其它合适的技术包括基于可逆染料终止子的方法。本文中，DNA分子首先附连至 载波片上的引物并进行扩增从而形成本地克隆菌落（桥扩增）。加入四种类型的ddNTP，并 冲洗掉非结合的核苷酸。与焦磷酸测序不一样，所述DNA每次只能延伸一个核苷酸。照相 机拍摄荧光标记的核苷酸的图像，然后从所述DNA中连同末端3'阻断剂一起化学去除所 述染料，允许进行下一循环。
[0104] 能够短序列阅读的其它系统包括SOLiD?和离子激流（IonTorrent)技术（二者 都由AppliedBiosystems?销售）。SOLiD?技术采用通过连接测序。本文中，固定长度的 所有可能的寡核苷酸的集合根据测序位置进行标记。寡核苷酸经过退火和连接；通过DNA 连接酶针对匹配序列优选连接导致在该位置产生所述核苷酸的信号信息。在测序之前，通 过乳液PCR扩增所述DNA。所得到的珠粒，各自仅含有相同DNA分子的拷贝，沉积于载玻片 上。所述结果是堪比Illumina测序的量和长度的序列。
[0105]IonTorrentSystemsInc.已经开发出了一种基于使用标准测序化学（但具有基 于新型半导体的检测系统）的系统。这种测序的方法，相对于其它测序系统中使用的光学 方法，是基于所述DNA聚合期间释放的氢离子的检测。包含有待测序的模板DNA链的微孔 充满单一类型的核苷酸。如果所引入的核苷酸互补于先导模板核苷酸，则它结合到生长的 互补链中。这导致触发过敏性离子传感器的氢离子的释放，这表明已发生反应。如果均聚 物重复存在于所述模板序列中，则在单个循环中可以结合多个核苷酸。这导致相应数量的 释放的氢和按比例地更高的电子信号。
[0106] 基因的功能1平价
[0107] 通过比较测试培养物之间！^插入的分布识别的基因可以进一步通过直接或间接 评价其功能的各种技术进行表征。按照这种方式，基本功能可以明确地指定于所述基因。
[0108] 合适的技术包括生物信息学，其中所述（全部或部分）推定的必需基因的序列用 于查询含有来自测试细菌和/或其它物种的信息的序列数据库，以识别出其基本生物化学 功能已经指定和/或已经证明是必需的基因（例如，其它物种中的直系同源基因）。
[0109] 合适的生物信息学程序对于本领域技术人员而言是公知的，并包括BasicLocal AlignmentSearchTool(BLAST)程序（Altschuletal. (1990)J.Mol.Biol. 215:403-410 和Altschuletal.(1997)Nucl.AcidsRes.25:3389-3402)。合适的数据库包括，例如， EMBL，GENBANK，TIGR，EBI，SWISS-PROT和trEMBL。
[0110] 可替代地，或另外地，所述（全部或部分）基因序列用于查询包含信息的序列 数据库，以识别先前使用现有技术中所述的传统Tn-seq方法（例如，正如Gawronskiet al. (2009)PNAS106:16422-16427；Goodmanetal. (2009)CellHostMicrobe6:279-289； vanOpijnenetal. (2009)Nat.Methods6:767-772；Langridgeetal. (2009)Genome Research19:2308-2316;Gallagheretal. (2011)mBio2(l):e00315-10中所述）和/或 TO01/07651所描述的技术（其内容结合于本文中作为参考）构建的必需基因。
[0111] 尽管启动子存在于插入序列中，许多！^插入将破坏基因/DNA的功能并允许识别 必需的/重要的DNA区域，如在标准Tn-seq(包括TraDIS)。然而，一些转座子将相对于特 异性DNA区域进行适当定位，由此由所述插入启动子驱动的那些特异性区域的转录，相对 于内源性转录显著地增强。通过在不同条件下生长所述突变体集合并重复所述测序，有可 能观察到阅读数的变化，这不仅指示哪个DNA区域有助于生长和/或存活，而且还指示相对 贡献。更高水平的特定抗生素靶转录（由转座子插入的启动子驱动）将有利于细菌存活并 将插入位点连接至DNA区域附近。
[0112] 所述插入启动子的位置能够相对于其对相关下游DNA序列的转录增加贡献进行 评价。这种技术数学/技术上直接的生物信息学组件允许识别插入的启动子序列对所推测 基因转录的贡献。例如，部分基因转录本可以仍然编码足够的信息，以允许翻译短截的但具 有功能的蛋白。生物信息学将允许在毗邻于有待考虑的插入转座子的基因下游的基因上实 施转录通读，其中那里没有定义的RNA转录终止序列。
[0113] 例如，基因A，B和C上游的转座子/启动子可以生成所有三个基因（A-C)的多顺 反子转录本，B上游是基因B和C的多顺反子转录本而C上游只有基因C。如果在抗生素中 前两个转座子的阅读较高而第三个较低，则所述抗生素靶将是基因B。
[0114] 本发_的设计的突夺体细菌的牛物抟术应用
[0115] 这些应用包括：生物治理；微生物增强采油；废水处理；污水处理；食品生产；能 量生产；生物生产；生物消化/生物降解；疫苗；生物传感器；益生菌；生物催化；生物学控 制；和药物递送载体。
[0116] Mffi
[0117] 本发明现在将参考具体实施例进行描述。这些仅仅是示例性的，且仅用于举例说 明的目的：它们并不旨在以任何方式限制要求保护的专利权或所描述的发明的范围。这些 实施例构成了目前考虑用于实施本发明的最佳模式。
[0118] 实施例1 :在磷霉素存在下表现出改善的存活和/或生长的突变体细菌的生产
[0119] ⑴活化转座子（TnA)的构建
[0120] 构建的质粒引入用作转座子的可扩增核苷酸序列。所述转座子的元件包括由 特异性转座酶识别的19bp的嵌合末端（mosaicend)，并限定转座子（用于选择由转位 (transposition)产生的转化体的一种抗生素-抗性基因），以及处于所述转座子的一端的 向外定向的启动子（outwardorientedpromoter)，以活化邻近所述转座子插入位点的革巴 基因的表达。
[0121] 可替代的质粒采用不同的向外定向的启动子由来自大肠杆菌，鲍曼不动杆菌 (Acinetobacter)，假单胞菌（Pseudomonas)或红假单胞菌（Rhodopseudomonas)的不同 基因进行构建。表1提供了所用的不同启动子的细节。此外，不同的宿主物种细菌需要 不同的抗生素抗性基因以选择转化体，例如，氯霉素抗性可以用于大肠杆菌中，不动杆菌 (Acinetobacterspp)中可以使用卡那霉素抗性而假单胞菌（Pseudomonasspp)中可以使 用庆大霉素抗性。所使用的不同抗性基因的详细情况列于表2中。
[0122] 图1是质粒pAMICSl-Cm-PrrnB的遗传图谱（基因图，geneticmap)。所述转座子 侧翼为嵌合末端（mosaicend)，ME，和所示的向外定向的rrnB启动子。所述转座子之外的 质粒的其它组件来自质粒载体pBluescript(Agilent)，lacZ，|3 -半乳糖苷酶亚单元；bla， 针对氨苄青霉素抗性编码的0 -内酰胺酶；rep，pBR322复制起点；cat，针对氯霉素抗性编 码的氯霉素乙酰转移酶。
[0123] 其它合适的质粒衍生物类似于pAMICSl-Cm-PrrnB，除了所述向外定向的rrnB启 动子取代了表1中所列出的启动子以及所述氯霉素抗性决定子代替了表2中列出的那些。
[0124] 表 1
[0125]
[0126] 表 2
[0127]
[0129] 转座子的制各
[0130] 适用于转座子诱变的转座子DNA片段使用特异性的寡聚物进行PCR扩增。为了 产生PCR模板，pAMICSl-Cm-P质粒用在嵌合末端的任一侧切割所述质粒的限制性核酸内切 酶SphI(获自NewEnglandBiolabs)进行消化，并且所产生的1.2kb转座子片段在使用 "MinElute凝胶提取试剂盒"（获自QIAGEN)通过1%琼脂糖的电泳之后分离出来。这个步 骤由于在转座子诱变过程中质粒模板的携带通过（carry-through)阻止了转化体的随后 产生，确保了所得到的转化体是转座子突变体而并不会由于转化体携带用作模板的质粒而 产生转座子片段。
[0131] 所述转座子片段的PCR扩增使用"PfuUltraIIFusion"DNA聚合酶进行实施，这 种聚合酶是"校对（proof-reading) "的DNA聚合酶（获自Agilent)。所述PCR扩增，脱盐 DNA片段，然后用多核苷酸激酶处理以磷酸化所述5'-DNA末端。转座体（transposome)然 后用所述纯化的转座子片段和重组Tn5转座酶进行制备。
[0132] 电感#杰大肠杆菌的制各
[0133] 用于转座子诱变的电转化感受态细胞通过将5mLLB-肉汤用从冷冻原液快速移出 (streak)的大肠杆菌（ST131)菌落接种而制备。这种培养物保温过夜并振荡以促进生长。 通常随后使用2mL接种400mL的预热2XYT肉汤并在37°C下培养所述培养物直到在600nm 波长下测定的光密度为〇. 2~0. 3。细胞通过离心收获并通过再悬浮于10%甘油中洗涤。 细胞通过离心取回，并再次悬浮于10%甘油中。重复此步骤，直到所述细胞已经洗涤至少 3次。最后，细胞用体积为所述2XYT培养物体积1/1000(例如，400yL)的10%甘油再悬 浮。
[0134] 大肠杆菌转座子突变体集合的产牛
[0135] 60yL前面步骤中描述的细胞悬浮液与0.2yL转座体混合，并用"GeneII Pulser"（BioRad)对混合物电穿孔。通常情况下，使用2mm电极间隙的电穿孔比色杯，电 穿孔设置为2. 5kV，25yF和200D。这些设置导致时间常数为4. 8~5ms。随后加入lmL S. 0.C.肉汤至所述比色杯中，在混合后，将所述细胞悬浮液转移至新管中并在37°C下温育 1小时30分钟。所述细胞悬浮液随后铺展于用合适浓度（例如，7. 5yL/mL)的氯霉素补充 的LB-琼脂平板上，以及所述琼脂平板于37°C下温育以允许由所述转座子转位到所述细菌 基因组中而得到的氯霉素抗性转化体菌落生长。
[0136] 然后，估算所获得的菌落数量，从而提供转座子突变体的近似数值。菌落然后从所 述琼脂平板通过使用细菌涂布器再悬浮于一定体积的LB-肉汤中进行收获。向这种细胞悬 浮液中加入甘油至15%的浓度，并将悬浮液分成等分部分在-80°C下贮存。
[0137] 由大肠杆菌转座子突夺体集合牛成基闵组DNA用于研究涉及所诜择的牛长备件 的基闵
[0138] 这一步骤检测了所述细菌基因组中每一个基因在任何选择的条件下对生长的贡 献。这容许根据对生长条件的相对贡献对每个基因排序，从显著贡献的基因开始，通过未提 供显著贡献的基因，直至在所选条件下对所述细菌细胞的生长不利的基因。
[0139] 在这个实施例中，所述选择的生长条件是存在抗生素磷霉素。
[0140] 所述转座子突变体细菌集合在抗生素存在下生长。通常情况下，这可以在来自所 述-80°C的冷冻原液等分部分的108个单独细菌转座子突变体加入其中的10mL肉汤培养 物中实施。可以包含数种培养物，各自具有不同浓度的抗生素。例如，可以实施的浓度有 1/2X最小抑制浓度（MIC)，1XMIC和2XMIC。采用转座子突变体集合包含具有不同启动 子（tac，rplj或rrnB)的转座子的实验可以在单个集合（pool)中实施，或如果所述不同突 变体集合要单独研宄时可以包括更多的培养物。
[0141] 在所述培养物在培养基Luria肉汤或用60yM或150yM磷霉素补充的肉汤中 37°C培养过夜之后，随后将0.lmL培养物转移至所研宄的用相同浓度的磷霉素补充的10mL 新鲜LB肉汤中，并且这种培养物温育至少6小时以容许所述细菌生长。细菌随后从所述 培养物中通过离心收获并使用"基因组DNA缓冲装置（GenomicDNAbufferset)"和"Tip 100/Gs"（获自QIAGEN)提取基因组DNA。最后，基因组DNA溶解于10mMTris(pH8)中。
[0142] 使用下一代测序（nextgenerationseauencing).肓接从车?庵子插入位点牛成序 列阁读（seauenceread)
[0143] 基因组DNA经过剪切产生约300~600bp范围内的相对短的片段，末端修复， 5' -腺苷酸化以允许T-A连接以及连接至splinkeretted适配子。
[0144] 为了富集转座子-边界DNA片段进行测序，随后采用一种转座子特异性寡核苷酸 和仅在其通过由转座子端引发的聚合进行复制之后与所述splinkeretted适配子杂交的 一种适配子特异性寡核苷酸进行PCR扩增。对于所述转座子的左边界（leftborder)和 右边界（rightborder)平行进行扩增。运行两轮PCR，采用嵌套引物组（nestedprimer set)的第二轮PCR用于提高特异性。为了抑制由splinkerette衍生的扩增，第二轮 PCR包括splinkerette的不可延长引物（"受限PCR"）。通过加入双脱氧核苷酸通过封 闭splinkerette-文库中所有DNA末端进一步减少由于通过重叠延伸-PCR剪接所致的 splinkerette不希望的"激活"。
[0145] 根据所使用的转座子，所述第一轮PCR的寡核苷酸引物的结合位点应该远离转座 子嵌合末端60~100bp，并且反应可以使用对"左"和"右"边界扩增特异性的不同寡核苷 酸进行实施。第一轮PCR利用100ng模板DNA，并运行14个温度循环。当完成时，所得的 反应的部分随后用核酸外切酶I处理以去除第一轮引物并用水按照1:5稀释。1yL所述 稀释的物质在第二轮（20yL)PCR中用作模板，第二轮PCR进行18个温度循环。用于第二 轮PCR的嵌套（nested)寡核苷酸引物之一应该与所述转座子末端杂交。第二轮PCR中所 用的两种寡核苷酸都在所述5'端拥有5个核苷酸的随机序列，当在IlluminaHiSEQ测序 机上实施测序时其有助于簇登记。
[0146] 测序适配子然后连接至所述DNA片段文库和为了使用针对100bp配对的末端测序 的标准Illumina测序方案测序所制备的DNA。
[0147] 针对参考基闵组的序列阅读绘图
[0148] 将来自两个Illumina测序仪fastq文件的读取记录过程同步，使所述程序能够检 查每个阅读对（readpair)中一个转座子序列和一个splinkerette序列的存在。所述转 座子和splinkerette序列从每个读取的前方剪切（clip)，且仅在一个阅读中具有转座子 而另一个中具有splinkerette的阅读对才指定为有效。随着所述记录进行处理，所有其它 序列对被去除。单个输出文件随后以fastq格式生成，仅含有剪切的转座子阅读。
[0149] 来自这个fastq文件的阅读针对参考基因组绘图从而产生包含所属阅读绘制到 其上的基因组位置的.mapview文件，以及它们是绘制到正向链上还是反向链上。这就提供 了关于所述转座子插入方向的重要信息。
[0150]所述程序tpnlnsertionSites.pi(SangerInstitute)读取?mapview文件并 基于所述.mapview文件中的绘图数据，生成含有针对正向和反向链的插入和阅读数据 的三个输出文件，以及含有针对两条链的组合的插入和阅读数据的单独文件。所述程序 normgeneCombinedFreq.pi从正向，反向和组合的插入位点文件阅读数据，并且计算每个基 因上游的插入和阅读数目，允许所述转座子插入定向。所述程序还计算基因中插入和阅读 计数，并将这输出到单独的文件中。数据采用ARTEMIS(SangerInstitute)进行分析。
[0151] 磷霍素存在下有利于牛长的基闵的识别
[0152] 针对大肠杆菌对照基因组的序列阅读（sequenceread)绘图指示出其上绘制非常 大量阅读的3个主要位点，指示出在这些位点采用转座子插入的显著数量的突变体存活， 因此，这些位点对于在磷霉素存在下突变体的存活是重要的。图2显示了指示出插入点和 活化剂转座子插入频率的大肠杆菌ST131的全基因组序列。这些位点是murA，phn操纵子 和uhpT。
[0153] 图3显示了phn和uhpT的插入图：显示了大肠杆菌ST131的特异性基因组区域， 还有uhpT(子图A)和phn操纵子（子图B)的基因插入点和活化剂转座子插入的频率。
[0154] 所述murA基因编码UDP-N-乙酰葡糖胺-1-羧乙烯基转化酶，这是一种细菌胞壁 质球囊（肽聚糖层）生物合成所需的必需基因和磷霉素作用的已知靶。由转座子插入产生 的序列阅读（sequenceread)绘制在murA的紧邻上游，导致yrbA基因（也称为ibaG，其参 与所述酸耐受性响应）破坏。< br>[0155] 所述phn操纵子编码所述碳-磷裂解酶复合物。非常大量的阅读绘图至编码磷酸 酯（盐）代谢转录调节子的phnF基因。在这个基因中的插入在编码碳-磷裂解酶复合物的 相同操纵子（phnA-P)中紧邻所述phnG基因和其它基因的上游。该复合物断裂碳-磷键， 其同样存在于磷霉素，而其断裂会导致磷霉素失活。大量的阅读也绘图至编码磷酸盐（酯） ABC-转运体底物结合蛋白的所述phnD基因的3' -半部分（3' -half)，以及紧邻编码磷酸酯 (盐）ABC转运体通透酶蛋白的phnE基因上游。
[0156] 所述uhpT基因编码磷酸己糖转运体（hexosephosphatetransporter)，一种主要 负责将磷霉素转运到所述细菌细胞内的基因产物。在这个基因中存在主要的插入点，其中 观察到了大量的转座子，这些转座子会造成基因破坏，阻碍有活力的转运体蛋白的生产。
[0157] 实施例2 :表现出在工业废弃物中牛长改善的突夺体沼泽红假单孢菌的牛产
[0158] 沼泽红假单孢菌是紫色光合作用细菌，其属于a_变形细菌。它具有非凡的代谢 多功能性，通过四种支撑生命的代谢模式中任何一种进行生长：光合自养和光合成（能量 来自光而碳来自二氧化碳），光合异养（能量来自光而碳来自有机化合物），化学异养（碳 和能量来自有机化合物）和化学自养（能量来自无机化合物而碳来自二氧化碳）。这种代 谢灵活性有助于这种细菌应用于生物技术应用中，包括工业废物的生物治理。
[0159] 电感#杰沼泽红假单孢菌的制各
[0160] 用于转座子诱变的电感受态细胞通过用从冷冻原液快速移出（streak)的沼泽红 假单孢菌菌落接种500mL酵母蛋白胨葡萄糖（YeastPeptoneDextrose) (YPD)肉汤而制 备。该培养物在光存在下轻轻振荡30°C温育过夜，以确保所述培养物保持分散。1LYH)用 10mL所述过夜培养物接种，并30°C培养，直至600nm波长下测得的光密度为0. 3。细胞通过 离心收获并再悬浮于10%甘油中。细胞通过离心取回并再次重新悬浮于10%甘油中。重 复此步骤，直到所述细胞已经总共洗涤五次。细胞用体积为所述起始培养物体积1/100的 甘油再悬浮。
[0161] 沼泽红假单孢菌转座子突夺体集合的牛成
[0162] 50yL电感受态细胞与lyL转座体混合，随后采用"GeneIIpulser"(Biorad)进 行电穿孔。按照常规，使用具有2mm电极间隙的电穿孔比色杯，电穿孔设置为2.OkV，25yF 和200D。随后向所述比色杯中加入lmLYPD，并在混合后，将所得到的细胞悬浮液转移至 新管中并在30°C下温育lh。所述细胞悬浮液随后涂布于YH)琼脂平板上（含有适当浓度 的庆大霉素），并将所述琼脂平板于30°C下温育以允许源于所述转座子转位到所述细菌基 因组中的庆大霉素抗性菌落生长。菌落然后从琼脂平板上通过重新悬浮于YH)肉汤中而收 获。随后加入甘油至15%的浓度，并将所述悬浮液分成等分部分在-80°C下贮存。
[0163] 生成使用表1中所示三种启动子的沼泽红假单胞菌转座子突变体集合用来研宄 在工业废弃物（污染的甘油）中在光存在和不存在下（分别为图中的子图A和B)的生长。 如图4中所示，产生的沼泽红假单胞菌突变体在清洁的和脏的甘油中，在化养和光养的代 谢模式下，都表现出生长改善。
[0164] 这些数据表明，显著更好地适应于工业废弃物（脏甘油）中生长的沼泽红假单胞 菌突变体形式通过本发明的方法可以很容易设计（工程化，engineered)和选择。
[0165] 等效物
[0166] 前面的描述详细介绍了本发明目前优选的实施方式。当考虑到这些描述时，预期 本领域技术人员就会想到其实践中的许多修改和变体。这些修改和变体预想都涵盖于所附 的权利要求之内。
【主权项】
1. 一种在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突变体细菌的生产方法， 所述方法包括以下步骤： (a) 通过采用活化转座子（TnA)的转座子诱变生产突变体细菌集合，其中所述1^包含 能够增加其插入位点处或附近基因转录的启动子； (b) 在所述选择的生长条件下和在一种或多种参照条件下由突变体集合生长细菌从而 产生两种以上测试培养物；和 (c) 比较测试培养物之间TnA插入的分布以识别出在所述选择的生长条件下不利于生 长和/或存活的第一类基因和在所述选择的生长条件下有利于生长和/或存活的第二类基 因。2. 根据权利要求1所述的方法，进一步包括提供其中至少一种所述不利基因被去除或 破坏和/或至少一种所述有利基因过表达的设计的突变体细菌的步骤，使得所述突变体细 菌在所述选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长。3. 根据权利要求2所述的方法，其中多种所述不利基因被去除或破坏。4. 根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中多种所述有利基因过表达。5. 根据权利要求2-4中任一项所述的方法，进一步包括培养所述设计的突变体细菌并 随后对所述设计的突变体细菌实施权利要求1的步骤（a)-(c)以识别出在所述选择的生长 条件下不利于生长和/或存活的另外的第一类基因和在所述选择的生长条件下有利于生 长和/或存活的另外的第二类基因。6. 根据权利要求5所述的方法，进一步包括提供其中至少一种所述另外的不利基因被 去除或破坏和/或至少一种所述另外的有利基因过表达的第二轮设计的突变体细菌的步 骤，从而相对于权利要求2所述的设计的突变体细菌在所述选择的生长条件下所述突变体 细菌表现出改善的存活和/或生长。7. 根据权利要求6所述的方法，包括一个或多个另外轮的诱变并重复实施权利要求1 所述的步骤（a)-(c)以提供相对于前一轮的设计的突变体细菌在所述环境挑战存在下表 现出改善的存活和/或生长的第三或更多轮突变体细菌。8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不利基因的去除和/或破坏包括 基因组最小化。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述基因组最小化包括将质粒DNA整合至细菌染 色体中并随后解离共合体。10. 根据权利要求8所述的方法，其中所述基因组最小化包括在线性DNA末端通过短同 源臂介导的同源重组。11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括将至少一种异源基因引入到 所述细菌中的步骤。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述异源基因有利于在所述选择的生长条件下 生长和/或存活。13. 根据权利要求11或权利要求12所述的方法，包括将异源基因簇引入到所述细菌中 的步骤。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述异源基因簇编码生物合成路径。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述生物合成路径产生次级代谢产物。16. 根据权利要求13所述的方法，其中所述异源基因簇编码生物降解路径。17. 根据权利要求11所述的方法，其中所述异源基因编码治疗性蛋白。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗性蛋白选自： (a) 酶； (b) 抗体； (c) 抗原； (d) 毒素； (e) 配体结合蛋白； (f) 抗生素； (g) 肽；和 (h) 细胞因子。19. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择的生长条件包括存在以下 各项： (a) 环境污染物； (b) 工业废弃产品； (c) 医疗废弃产品； (d) 药物或候选药物； (e) 选择的碳源，例如烃； (f) 一种或多种其它生物，例如微生物和病毒。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述一种或多种其它生物选自： (a) 人类病原体； (b) 动物病原体；和 (c) 植物病原体。21. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含至少 0. 5XIO5个突变体，例如至少IX10 5个突变体。22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含至少5X10 5个突变 体。23. 根据权利要求21所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含至少IX10 6个突变 体。24. 根据权利要求21所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含0. 5X106~2X106个 突变体。25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含约IX10 6个突变体。26. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/50个细菌DNA碱基对的插入率。27. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/30个细菌DNA碱基对的插入率。28. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/25个细菌DNA碱基对的插入率。29. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/15个细菌DNA碱基对的插入率。30. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/10个细菌DNA碱基对的插入率。31. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤（a)的所述细菌DNA是染色体 (基因组）DNA。32. 根据权利要求1~30中任一项所述的方法，其中步骤（a)的所述细菌DNA是质粒 DNA或染色体（基因组）DNA和质粒DNA的混合物。33. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤（a)的所述转座子诱变在体内 发生。34. 根据权利要求1~32中任一项所述的方法，其中步骤（a)的所述转座子诱变在体 外发生。35. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌是革兰氏阳性或革兰氏阴 性细菌，例如沼泽红假单抱菌（Rhodopseudomonaspalustris) 〇36. 根据权利要求1~35中任一项所述的方法，其中所述细菌是益生菌。37. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过由步骤（b)的突变体集合以 IO7~10 9,例如约108,cfu接种生长培养基，由所述突变体集合生长细菌。38. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过对邻近或接近TnA插入位点的 DNA测序比较测试培养物之间TnA插入的分布。39. 根据权利要求38所述的方法，其中邻近或接近所述TnA插入位点的DNA的所述测 序包含转座子-细菌DNA接合物的选择性扩增。40. 根据权利要求38或39所述的方法，其中所述测序包含边合成边测序（SBS)生物化 学。41. 根据权利要求38~40中任一项所述的方法，其中对邻近或接近所述Tn4插入位点 的DNA的约25、50、75、100或多于100个DNA碱基对进行测序。42. 根据权利要求38~41中任一项所述的方法，其中所述测序的DNA是5'和/或3' 至所述TnA插入位点。43. -种通过由根据前述权利要求中任一项中所定义的方法可获得的、或获得的突变 体细菌。
【专利摘要】描述了在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突变体细菌的生产方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过采用活化转座子(TnA)的转座子诱变生产突变体细菌集合，其中所述TnA包含能够增加其插入位点处或附近基因转录的启动子；(b)在所述选择的生长条件下和在一种或多种参照条件下由所述突变体集合生长细菌从而产生两种以上测试培养物；和(c)比较测试培养物之间的TnA插入的分布以识别出在所述选择的生长条件下不利于生长和/或存活的第一类基因和在所述选择的生长条件下有利于生长和/或存活的第二类基因。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN104903446
【申请号】CN201380057726
【发明人】戴维·休·威廉斯, 阿瑟·基思·特纳, 约翰·理查德·韦恩
【申请人】贝克特沃有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月5日
【公告号】CA2890104A1, EP2917346A1, US20150307873, WO2014072697A1
最新回复(0)