模拟原核途径的植物自固氮的制作方法
模拟原核途径的植物自固氮的制作方法
【专利说明】
[0001] 与相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年7月25日提交的美国临时申请号61/858, 218和2012年12 月3日提交的美国临时申请号61/732, 490的优先权，所述每个临时申请以其全部内容通过 参考并入本文。
技术领域
[0003] 本公开涉及一种新的转基因植物，所述转基因植物通过靶向或表达细菌的 nif(固氮）基因以产生固氮酶的结构蛋白，并通过导入编码与固氮酶的结构蛋白同源的蛋 白质的合成DNA序列，来复制光合细菌例如蓝细菌或其他细菌的固氮机制，还涉及产生这 样的植物的方法。
【背景技术】
[0004] 植物是属于植物界的活生物体。所有高等植物具有维管组织木质部（主要运输水 和矿物质）和韧皮部（主要运输糖类和其他代谢物）。维管植物包括所有具种子的植物（裸 子植物和被子植物）和蕨类植物（包括羊齿类植物、石松类植物和木贼类植物），其也被称 为导管植物。它们是具有有组织的细胞结构的真核生物，所述细胞结构包括核（在大多数 细胞中）和具有在光合作用期间使用光例如日光作为能源进行碳固定的能力的叶绿体（或 其他类型的质体）。其他类型的植物包括例如藻类、苔藓和真菌。
[0005] 农业作物的作物生产率的总体限制因素是土壤和水中的氮含量。随着农业生产试 图与增长的人口的不断增加的需求和减少的可用耕地保持同步，这种元素的供应随时间减 少。氮是所有生命形式、包括植物必需的重要营养物之一。然而，氮必须首先被转变成植物 可以利用的形式。生物固氮（BNF)现象是使用固氮酶将大气中的氮（N2)转变成氨（NH3)。 BNF通常由下列化学反应式表示：N2+8H++8ell6ATP?>2NH3+H2+16ADP+16Pi，或者说在8个 质子和8个电子存在下并消耗16个ATP分子（三磷酸腺苷一一细胞的能量分子），将氮气 分子还原成两个氨分子。由于队含有叁键，这个反应消耗大量能量。氮气分子中的键能约 为225kcal/mol。在自然界中，很少有BNF作为构成"固氮酶复合体"的植物与几个细菌物 种之间的共生关系的结果而进行。固氮酶复合体由两种蛋白构成：Fe蛋白（被称为Nif-H 的酶）和Mo-Fe蛋白（被称为Nif-D-K的a和0亚基）。固氮酶复合体由与同二聚体 (至少两个相同单元）的Fe(铁辅因子）蛋白暂时结合的异四聚体（不是相同单元）的 MoFe(铁-钼辅因子）蛋白构成。
[0006]Nif-H基因编码铁蛋白，Nif-D和K基因编码钼铁蛋白。因此，Nif-D和Nif-K基 因在它们的最终活性形式中需要Mo和Fe作为辅因子。Nif-D编码Nif-D蛋白，也被称为 a亚基，Nif-K编码Nif-K的蛋白被称为0亚基。换句话说，Nif-H是具有两个相同亚基 的二聚体酶（总共2个蛋白），而Nif-D-K是2a20二聚体（总共4个蛋白）。所有6个 亚基对于其功能来说是必需和必要的。在自然界中，Nif-H具有大量变种，并对生物多样性 有贡献。存在大量类型的Nif-H这一事实，提供了适应各种不同自然条件的能力。
[0007] 产生固氮酶复合体的细菌物种包括固氮生物例如蓝细菌、固氮菌科 (azotobacteraceae)、根瘤菌（rhizobia)和弗兰克氏菌（frankia)。例如，在蓝细菌中， Mo-Fe蛋白（Nif-D-K)结合大气中的氮（N2)，然后Fe-蛋白（Nif-H)通过由铁氧化还原蛋白 贡献的电子将它还原。铁氧化还原蛋白是在光合作用电子传递链中起到电子载体作用的蛋 白质，其类似于高等植物叶绿体的Fe2S2铁氧化还原蛋白，但不完全一致。被还原的Fe-蛋 白使用ATP将（被还原的）电子传递到Mo-Fe蛋白，后者然后将电子贡献给N2 (固氮酶还 原酶）。通过将这个过程重复几次，将N^N的所有三个共价键还原成2NH3。
[0008] 然而，仅有几种植物物种可以与固氮生物以共生关系生活。例如，来自于豆科植物 的豌豆植物与来自于根瘤菌科的细菌共生生活。具体来说，根瘤菌细菌穿透豌豆植物的根， 产生含有固定氮（成为氨）的细菌的根瘤，而植物贡献碳（糖）。因此，改进共生或扩展宿 主范围对于植物存活来说是有益的，但实现这一目标包括许多挑战，包括过程的复杂性和 基础知识的欠缺。
[0009] 也可以使用人工方法将氮化学固定。这种固氮方法最通常通过被称为Harber过 程的热反应来生产。这个过程对于相对简单的反应来说需要高的压力和温度。最近一百年 来，对氮肥的需求稳定地增长到每年超过2亿公吨。这种消耗量可能增加。
[0010] 非共生生物（例如与任何固氮微生物没有确立的共生关系的自由生活的生物）， 如果各自包含核心酶固氮酶，可以实现自生物固氮（SBNF)。能够自固氮的非细菌生物例如 作物和藻类以及其他植物的存在，对于几种目的来说是有用的，例如降低施肥需求，降低施 肥污染，提供经济友好的作物生产，提高作物产量，提高植物中的油含量，提高植物中的蛋 白质含量，降低水的氮污染，以及相对于氮提高碳含量和相对于土壤的有机相提高碳。然 而，出于几个原因，没有已知的能够实现这些结果的植物，其中一个原因是固氮酶的特殊酶 复合体，其包括几种用于固氮的蛋白质和基因。
[0011] 用于大气氮固定的几乎所有的核心酶都对氧非常敏感。这一特征使得几乎不可能 在植物中固氮，因为植物在光合作用反应期间从水产生氧。蓝细菌被认为是叶绿体的进化 祖先（基础）。尽管叶绿体在进化期间已失去许多其原始的基因，但蓝细菌维持了许多叶 绿体丢失的基因。作为光合生物，蓝细菌栖息在地球上几乎所有光照环境中。它们在由超 过20个固氮（NIF)基因促进的生物固氮（BNF)过程中发挥关键作用。这些基因中只有三 个（Nif-D、Nif-K和Nif-H)是NIF酶类（固氮酶）。其余的NIF基因参与复合体组装、辅 因子加工和表达的控制。
[0012] 豆科作物例如大豆、菜豆或豌豆以它们发育出被根瘤菌（Rhizobiumsp.)共生细 菌占据的根瘤的独特能力广为人知。这些细菌能够BNF并向植物提供氨。大多数作物不具 有这种能力，并且根瘤菌（Rhizobiumsp.)不能与它们相互作用。进行了几次未发表的尝 试以扩展根瘤菌的"宿主"范围，但所有这些尝试都失败了。
[0013] 因此，需要一种系统和方法，其包含能够以使系统可持续并且在商业上可行的显 著速率进行细胞固氮以生产氨的转基因植物。下面的部分描述这样的系统。
[0014] 发明概述
[0015] 本公开涉及被转化以便能够进行自行/自我固氮过程，产生它们自己可用的氮 源，由此降低对作为氮源的含氮肥料的依赖性的转基因植物（遗传修饰生物体或（GM0))。 本公开还涉及包含转化这些植物以使它们能够进行自行/自身固氮的基因的植物细胞、组 织、植物部分或植物株系。
[0016] 在某些实施方式中，根据本公开的原理，提供了一种表现出改良的自身/自行固 氮情况的植物，其通过包括下列步骤的方法来产生：将编码可操作连接到启动子序列和终 止子序列的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的重组核酸序列导入一个或多个植物细胞；从所述 植物细胞再生一株或多株植物，并选择从所述植物细胞培养并表现出增强的固氮的一株或 多株植物，使得一株或多株植物包含编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重组核酸序列。 在某些实施方式中，编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重组核酸序列从单一生物体获 得。在某些实施方式中，编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重组核酸序列从不同生物 体获得。例如，在某些实施方式中，编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因中的至少一个的重组核 酸序列从第一生物体获得，并且编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因中的至少一个的重组核酸 序列从不同于所述第一物种的第二生物体获得。在某些实施方式中，编码Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因的所述重组核酸序列在自然界中存在。在某些实施方式中，编码Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因的所述重组核酸序列是合成的并且在自然界中没有被发现。
[0017] 在某些实施方式中，根据本公开的原理，提供了一种表现出改良的自身/自行固 氮情况的植物，其通过包括下列步骤的方法来产生：将植物细胞与编码SEQ.ID.N0. 1、SEQ.ID.NO. 2和SEQ.ID.NO. 3之一的重组核酸序列相接触；从所述植物细胞再生一株或多株植 物；以及选择从所述植物细胞培养的一株或多株植物，其中所选的植物各自表现出增强的 固氮，其中所选的一株或多株植物各自包含编码SEQ.ID.No. 1、SEQ.ID.No. 2、SEQ.ID.N0. 3、 SEQ.ID.NO. 46、SEQ.ID.NO. 47、SEQ.ID.NO. 48 或SEQ.ID.NO49 的重组核酸序列。
[0018] 在某些实施方式中，根据本公开的原理，提供了一种表现出增强的固氮的植物， 其通过包括下列步骤的方法来产生：将植物细胞与编码SEQ.ID.N0. 1、SEQ.ID.N0. 2、SEQ. ID.NO. 3、SEQ.ID.NO46、SEQ.ID.NO47、SEQ.ID.NO48 或SEQ.ID.NO. 49 之一的重组核 酸序列相接触；将所述植物细胞与被优化以用于番茄叶绿体表达的至少一种合成的编码 DNA序列（sCDS)相接触；从所述植物细胞再生一株或多株植物；以及选择从所述植物细 胞培养并表现出增强的固氮的一株或多株植物，其中所述一株或多株植物包含编码SEQ. ID.N0. 1、SEQ.ID.N0. 2、SEQ.ID.N0. 3、SEQ.ID.N0 46、、SEQ.ID.N0 47、SEQ.ID.N0 48 或 SEQ.ID.NO. 49的所述重组核酸序列和所述s⑶S。
[0019] 在某些实施方式中，根据本公开的原理，提供了一种表现出增强的固氮的植物，其 通过包括下列步骤的方法来产生：将一个或多个植物细胞与编码可操作连接到第一启动 子的作为Nif-H基因的带有植物转运肽或叶绿体（质体）积累信号的嵌合Nif基因的重 组核酸序列相接触；将所述植物细胞与编码可操作连接到第二启动子的Nif-D基因的重组 核酸序列相接触；将所述植物细胞与编码可操作连接到第三启动子的Nif-K基因的重组核 酸序列相接触；从所述植物细胞再生一株或多株植物；以及选择从所述植物细胞培养的一 株或多株植物，其中所选植物各自表现出增强的固氮，其中所选植物各自包含编码Nif-H 基因的重组核酸序列、编码Nif-D基因的重组核酸序列和编码Nif-K基因的重组核酸序 列。在某些实施方式中，所述Nif-H基因选自基本上由SEQID.N0. 29、SEQID.N0. 32、SEQ ID.NO. 35和SEQID.NO. 38构成的组。在某些实施方式中，所述Nif-D基因选自基本上由 SEQID.N0. 30、SEQID.N0. 33、SEQID.N0. 36 和SEQID.N0. 39 构成的组。在某些实施方 式中，所述Nif-K基因选自基本上由SEQID.NO. 31、SEQID.NO. 34、SEQID.NO. 37 和SEQ ID.NO. 40构成的组。在某些实施方式中，所述第一、第二和第三启动子选自基本上由SEQ.ID.NO. 41-45构成的组。
[0020] 本公开还涉及转基因植物来源的商业化产品，其源自于按照本公开中描述的方法 产生的转基因植物。
[0021] 还描述了一种按照本公开的原理降低土壤中的总氮浓度的方法。所述方法包括将 本公开中描述的至少一种转基因植物放置成与将要降低氮水平的土壤相接触；以及允许所 述植物生长并固定从所述土壤获得的氮，它们的代谢引起所述土壤中总氮浓度的降低。这 些以及其他原理使用附图并在详细描述中进一步描述。
[0022] 附图简述
[0023] 图1示出了固氮酶复合体的示意结构。
[0024]图2示出了用于在番茄叶绿体转化期间插入到质体中的构建质粒的产生步骤的 示意图。
[0025] 图3示出了用于番茄叶绿体转化和Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的表达的质粒（PGE 011)的产生步骤的示意图。
[0026] 图4示出了作为单一操纵子被克隆并插入到莱茵衣藻（C.reinhardtii)叶绿体中 的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因。
[0027] 图5不出了在萌发后三周时番前植株的发育。
[0028] 图6示出了Nif-H在植物质粒中的积累。
[0029] 图7示出了植物转化质粒的示意结构。
[0030] 详细描述
[0031] 本公开涉及能够固氮的转基因植物、从这样的植物生产的产品、产生所述转基因 植物的方法和使用所述转基因植物降低土壤或水 中的氮的方法。
[0032] 通过结合构成本公开的一部分的附图来参考下面本公开的详细描述，可以更容易 地理解本公开。应该理解，本公开不限于本文中描述和/或示出的具体的组合物、装置、方 法、条件或参数，并且本文中使用的术语是出于仅仅举例描述特定实施方式的目的，而不打 算限制所宣称的公开内容。此外，当在本说明书包括随附的权利要求书中使用时，单数形式 包括复数，并且对特定数值的指称至少包括该特定值，除非上下文明确表明不是如此。在本 文中，范围可以表述为从"约"或"近似" 一个特定值和/或到"约"或"近似"另一个特定 值。当表述这样的范围时，另一种实施方式包括从所述一个特定值和/或到所述另一个特 定值。同样地，当使用先行词"约"将值表述成近似值时，应该理解所述特定值形成另一种 实施方式。
[0033] 出于本说明书和随附的权利要求书的目的，除非另有指明，否则表述材料的成分、 百分率或比例、反应条件的所有数字以及本说明书和权利要求书中使用的其他数值，应该 被理解为在所有情况下被术语"约"修饰。因此，除非指明与其相反，否则在下面的说明书 和随附的权利要求书中提出的数值参数是近似值，其可能随着本公开试图获得的所需性质 而变。至少，并且不试图限制等同性原则在权利要求书范围中的应用，每个数值参数应该至 少根据所报告的有效数字的数量并使用常规的舍入技术来解释。
[0034] 尽管本文中提出的数值范围和参数、本公开的广阔范围是近似值，但在具体实例 中提出的数值被尽可能精确地报道。然而，任何数值固有地含有由它们相应的试验测量中 存在的标准偏差所必然带来的某些误差。此外，本文中公开的所有范围应该被理解为涵盖 其中包含的任何和所有子范围。例如，"1至10"的范围包括最小值1和最大值10之间（并 包括1和10)的任何和所有子范围，也就是说，具有等于或大于1的最小值和等于或小于10 的最大值的任何和所有子范围，例如5. 5至10。
[0035] 本申请中的标题不意味以任何方式限制本公开；在任一标题下的实施方式可以与 任何其他标题下的实施方式联合使用。
[0036] 应该指出，当在本说明书和随附的权利要求书中使用时，单数形式包括复数指称 物，除非明显且明确地限于一个指称物。因此，例如，对"椎间盘植入物"的指称包括一个、 两个、三个或更多个椎间盘植入物。
[0037] 下面的讨论包括对转化植物以使它们自己能够固氮所必需的组合物、遗传步骤、 相关转基因细胞和得到的转基因植物，以及根据本公开的原理使用转基因植物（遗传修饰 生物体（GM0))以降低对氮肥的需要或需求的方法的描述。还公开了可替选实施方式。现 在将详细参考本公开的某些实施方式，其实例在附图中示出并在实施例中讨论。尽管本公 开将结合说明性实施方式进行描述，但应该理解，它们不打算将本公开限于那些实施方式。 相反，本公开打算覆盖可以包括在本公开之内的所有可替选方案、改良和等同物，正如随附 的权利要求书所定义的。
[0038] 现在转向本公开的组合物和方法，本文中提供的组合物和方法是为了通过异源固 氮酶的活性在植物中生产有机氮，使得植物可以产生氨。
[0039] 根据本公开，在某些实施方式中，将目标植物用含有来自于蓝细菌的具有Nif-H、 Nif-D和/或Nif-K的基因序列（SEQ.ID.NO. 1-3和/或29-40)的DNA进行遗传转化。在 可替选方式中，可以将目标植物用来自于其他细菌的在特定条件下表达在植物质体中的类 似基因（启动子和翻译起始序列，以及异源重组序列）进行遗传转化。这不限于质体（叶 绿体）。图3和图4示出了在质体转化中使用的质粒。
[0040]目标植物是指将具有导入到其中的一个或多个新基因的植物细胞或组织，将用 "新的'T)NA进行遗传转化，所述新的DNA含有来自于蓝细菌（即CyanobacteriumAnabaena PCC7120 (SEQ.ID.No. 1-2)或其他蓝细菌（SEQ.ID.NO. 29-40))或其他细菌（仅仅在特定条 件下，当在质体中存在Nif蛋白、"酶"的积累时）的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因序列。被 转化成具有这些遗传特点的植物，具有作为自身或自行固氮机制起作用的能力。自身或自 行固氮是指细胞（植物细胞）、植物或植物的部分如根或叶能够将氮固定成氨。这不是通过 与其他生物体例如根瘤菌的共生。可替选的序列可以用于目标植物。例如，Nif-D可以用 每个其他Nif-D的编码序列代替，同样的角色分别适用于Nif-K和Nif-H。
[0041] 一旦将植物如本文中所述进行遗传修饰后，它能够自生物固氮，并且可以被用于 在植物中产生固氮。新的工程化改造的植物将产生可用于植物使用或动物使用的形式的 氮。
[0042] 任何植物都可以使用本发明，如番前植物（lycopersicumsp.)或烟草植物 (Nicotanatabacom)。它们可用作商业化产品，作为农业传播，作为农业初生主根（使用嫁 接技术）或作为用于植物研宄的模型植物生物体。
[0043] 在某些实施方式中，Nif基因的来源（被称为编码序列或mRNA、RNA或DNA)可以 是细菌载体。Nif基因存在于独特的光合细菌如蓝细菌中。Nif-H基因在植物细胞中、在质 体或叶绿体中的表达允许Nif-H蛋白有时间组装成有活性的酶，其可以在功能上用作Nif D-K复合体的专性电子供体。这种表达允许Nif-H作为固氮酶还原酶起作用。在某些实施 方式中，Nif基因通过合成产生，并且不存在于自然界中。参见例如SEQ.ID.NO. 29-40。
[0044]Nif-D基因和Nif-K基因在植物细胞中或叶绿体中的表达允许积累Nif-D-K蛋白。 上述基因在植物细胞和/或质体内的表达被称为固氮酶Mo-Fe蛋白，并起到亚基固氮酶的 作用。上述操作的组合产生能够固定/提供一些或所有其氮需求的植物。能够固氮的植物 将更加强壮，因为它不需依赖于共生细菌，它也不依赖于化学或有机氮源。Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因在植物细胞中的使用，模拟了细菌或原核生物在固氮中的核心途径的功能。
[0045] 以Nif-H、Nif-K和Nif-D的任何组合积累Nif蛋白的植物细胞，将氮固定成可消 耗的形式之一（氨（NH3))，然后转变成铵（NH4)。从核表达一种或所有上述蛋白，可以将它 靶向到植物质体，以允许更好地控制有功能的Nif复合体（Nif-H和Nif-D-K)的时间和积 累，如图6所示。
[0046] 提供了一种用于产生具有改进的自身/自行固氮情况的转基因植物的方法，其中 所述转基因植物在其基因组中或其质体基因组中包含Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的组合， 以便允许所述植物模拟细菌或原核生物用于固氮的核心途径。所述方法包括通过将重组的 Nif-H、Nif-D和Nif-K基因插入到宿主植物的基因组中来转化宿主植物，其中Nif-H、Nif-D 和Nif-K基因分别被可操作连接到启动子序列、终止子序列和任选的编码靶向信号或转运 肽的DNA序列，所有这些序列在所述宿主植物中有活性。在某些实施方式中，重组的Nif-H、 Nif-D和Nif-K基因包含在SEQID.N0.1中。在某些实施方式中，重组的Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因包含在SEQID.NO. 2中。在某些实施方式中，重组的Nif-H、Nif-D和Nif-K基 因包含在SEQID.NO. 3中。正如本领域普通技术人员将会认识到的，由于SEQID.NO. 1和 2各自包含由SEQID.NO. 4A指定的启动子，因此当使用SEQ.ID.NO. 1或SEQ.ID.NO. 2时不 需将另外的启动子转化到宿主植物中。同样地，由于SEQID.NO. 3包含由SEQID.NO. 4B指 定的启动子，因此当使用SEQ.ID.NO. 3时不需将另外的启动子转化到宿主植物中。或者，可 以通过添加转运肽将序列转化到核中，并且产物将积累在质体中。
[0047]在某些实施方式中，根据本公开的原理，提供了一种产生具有改进的自身/自行 固氮情况的转基因植物的方法，所述转基因植物在其基因组（质体基因组）中包含Nif-H、 Nif-D和Nif-K基因的组合，以便允许所述植物模拟细菌或原核生物用于固氮的核心途 径，其中所述方法包括下列步骤：将一个或多个植物细胞与编码可操作连接到启动子例如 rrnl6启动子的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的重组核酸序列相接触；从所述植物细胞再生 一株或多株植物；以及选择从所述植物细胞培养的一株或多株植物，其中所选的植物各自 表现出增强的固氮，其中所选的植物各自包含编码所述可操作连接到rrnl6启动子的重组 核酸序列的重组核酸序列。这种方法示出在图7的部分B中。在一种实施方式中，编码 Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的重组核酸序列被可操作连接到单一启动子例如rrnl6启动子。 在某些实施方式中，所述重组核酸序列包括SEQ.ID.N0. 1-3和SEQ.ID.N0. 49中的至少一个 的至少一部分。
[0048]在某些实施方式中，根据本公开的原理，提供了一种产生具有改进的自身/自行 固氮情况的转基因植物的方法，所述转基因植物在其基因组中包含Nif-H、Nif-D和Nif-K 基因的组合，以便允许所述植物模拟细菌或原核生物用于固氮的核心途径，其中所述方法 包括下列步骤：将一个或多个植物细胞与编码可操作连接到启动子的NifH基因的重组核 酸序列相接触；将所述植物细胞与编码可操作连接到启动子的Nif-D基因的重组核酸序 列相接触；将所述植物细胞与编码可操作连接到启动子的Nif-K基因的重组核酸序列相 接触；从所述植物细胞再生一株或多株植物；以及选择从所述植物细胞培养的一株或多株 植物，其中所选的植物各自表现出增强的固氮，其中所选的植物各自包含编码Nif-H基因、 Nif-D基因和Nif-K基因的重组核酸序列，其中编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的核酸序 列各自可操作连接到启动子。这种方法示出在图7的部分A中。
[0049] 在某些实施方式中，编码Nif基因（Nif-H、Nif-D、Nif-K)的重组核酸序列包括基 本上由SEQ.ID.N0. 29-40构成的组中的至少三个序列。在某些实施方式中，编码Nif-H基 因的重组核酸序列选自基本上由SEQ.ID.N0. 29、32、35和38构成的组。在某些实施方式中， 编码Nif-D基因的重组核酸序列选自基本上由SEQ.ID.N0. 30、33、36和39构成的组。在某 些实施方式中，编码Nif-K基因的重组核酸序列选自基本上由SEQ.ID.N0. 31、34、37和40 构成的组。在某些实施方式中，启动子选自基本上由SEQ.ID.N0. 41-45构成的组。在某些 实施方式中，分别编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的核酸序列存在于自然界中发现的单一 生物体中。在某些实施方式中，分别编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的核酸序列存在于自 然界中发现的不同生物体中。在某些实施方式中，编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的每个 核酸序列是合成的，并且在自然界中没有被发现。在某些实施方式中，至少一个编码Nif-H、 Nif-D和Nif-K基因之一的核酸序列存在于自然界中，并且至少一个编码Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因之一的核酸序列是合成的，并且在自然界中没有被发现。在某些实施方式中，每 个编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因之一的核酸序列包含终止子。在某些实施方式中，Nif-H、 Nif-D和Nif-K基因中的至少一个连接到与Nif-H、Nif-D和Nif-K基因中的另一个不同的 启动子。在某些实施方式中，启动子包含SEQ.ID.N0. 4和/或SEQ.ID.N0. 28。在某些实施 方式中，每个Nif-H、Nif-D和Nif-K基因被连接到相同类型的启动子，例如rrnll6启动子。
[0050] 在某些实施方式中，在前面任一段中讨论的方法包括至少一个下列步骤：鉴定目 标生物体；确定所述目标生物体是否更好地适合于核转化或质体转化；鉴定包含Nif?基因 的供体生物体的蛋白序列；使用通用遗传密码子将所述蛋白序列反向翻译成DNA;为目标 生物体（即番茄植物）优化编码DNA序列（CDS);合成合成的CDS;添加启动子和终止子； 将所述CDS转化到用于稳定或瞬时转化的植物中；以及通过一种或多种下列测定法测定固 氮酶活性:ARA，15N稳定同位素掺入，或在剥夺氮的培养基上生长的能力。在某些实施方式 中，Nif-H、Nif-D和Nif-K基因全部都连接到相同启动子作为一个操纵子，例如rrnll6启 动子。
[0051] 在某些实施方式中，供体生物体包括行光合作用并具有固氮能力的单细胞蓝细 菌。在某些实施方式中，供体生物体的Nif基因通过blastN或通过查阅文献来鉴定。在某 些实施方式中，鉴定 到的Nif基因包括Nif-H、Nif-D和Nif-K基因。在某些实施方式中，用 于目标生物体的编码DNA序列使用核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco)的特别 密码子用法来优化，以便不忽略使用频率较低的密码子，这与仅使用最频繁的密码子并忽 略所有其他密码子的常用密码子用法优化程序不同（SeqID.N0. 35-37)。在某些实施方式 中，用于目标生物体的编码DNA序列使用标准密码子优化程序和核酮糖-1，5-二磷酸羧化 酶/加氧酶的大多数用法来优化，SEQID.N0. 29-36。在某些实施方式中，用于目标生物体 的编码DNA序列使用全部叶绿体已知的用法密码子来优化，SEQNO. 38-40。
[0052] 根据本公开的原理，提供了一种转基因植物，其具有改良的固氮生产情况，并在其 基因组中包含可操作连接到启动子序列和终止子序列的重组Nif-H、Nif-D和Nif-K基因。
[0053] 图1示出了固氮酶复合体的示意结构。它由两个Nif-H蛋白和4个作为辅因子的 铁原子形成（同二聚体）。Nif-K蛋白与两个Nif-D亚基形成异二聚体，并且Nif-K的两个 亚基使用钼作为辅因子。
[0054] 在本公开的另一方面，提供了自身或自主生物固氮（BNF)的作物。例如，番茄植物 (lycopersiconsp.)可以携带固氮酶还原酶（Nif-H和NifD-K)的表达的基因，以使它可以 模拟细菌的途径。固氮酶还原酶（Nif-H和NifD-K)的核酸序列作为SEQ.ID.NO. 1和2被 提供，如图6中所示，SEQ.ID.N0. 29。
[0055] 在另一种实施方式中，根据本公开的原理，在作物和/或任何其他植物中提供了 自身或自主BNF，其中使用密码子替换原始的细菌序列，对目标植物细胞器（质体）中的 Nif基因编码序列进行了优化。例如，番前植物（lycopersiconsp.)可以携带固氮酶还原 酶、即Nif-H和NifD-K的表达的基因，以使它可以模拟细菌的途径。
[0056] 图2和3示出了用于番茄叶绿体转化的质粒（PGE003)的生产步骤的示意图。使 用聚合酶链反应（PCR)，通过特异性引物或寡核苷酸（表1)扩增DNA，然后用限制性酶消化 并连接到质粒的上部。在经过4个步骤后，产物含有2个被称为tRNA-FM和t-RNA-G的叶 绿体同源位点，带有几个独一无二的克隆位点，随后是PsbA终止子。
[0057] 图3示出了用于番茄叶绿体的转化以及番茄植物转化所必需的Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因的表达的质粒的生产步骤的示意图。使用聚合酶链反应（PCR)，通过特异性引物 或寡核苷酸（表1)扩增DNA，然后用限制性酶消化并连接到质粒中。在1个或2个步骤后， 制成含有Nif基因和编码序列的质粒。通过使用切割工具例如限制性酶，将三个基因即Nif 基因、报告物基因和选择性标志物例如aadA作为一个簇进行克隆。
[0058] 图4示出了作为单一操纵子插入到莱茵衣藻（C.reinhardtii)的叶绿体或其他叶 绿体中的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因。叶绿体含有原核基因表达系统，允许所述操纵子表 达。由光合作用提供的电子和ATP允许固氮酶发挥作用，导致NH4的产生。藻类的铁氧化 还原蛋白（Fd)介导电子从光系统I(PSI)传递到固氮酶的Nif-H/Fe-蛋白。本公开提出， 由于其最初来源，所述Nif复合体对氧不太敏感，并且Fe-蛋白（Nif-H)能够将电子向前传 递到nif-K，以协助自行/自身固氮。
[0059] 设想了本发明的原理可以应用于任何植物例如水稻、玉米、马铃薯、南瓜、烟草、棉 花、拟南芥和树木例如苹果、樱桃、胡桃，也可应用于绿藻以及其他植物。例如，为了将所述 技术应用于衣藻（绿藻），通过具有SEQ.ID.No. 3的合成基因的合成来优化编码序列。
[0060] 本公开的另一种实施方式提供了使用转基因植物（遗传修饰生物体（GM0))来降 低对氮肥的需要或需求的方法。本公开的另一种实施方式提供了使用转基因植物（遗传修 饰生物体（GM0))来代替氮肥的方法（例如，GM0可以用作植物肥料）。
[0061] 下面提供的实施例描述了植物即番茄植物的遗传操作，以便获得自身固氮的能 力。
[0062] 实施例：产牛用于番前质体转化的质粒
[0063] 在本公开中，利用原核生物或细菌的固氮酶和BNF在植物中生产氨和/或铵。这些 转基因植物在用具有BNF编码的质粒转化后，具有产生其所有或部分氮需求的能力。适合 于人类消费的作物例如番茄、水稻或小麦，以及适合的园艺植物如花、草和树木，包括其他 植物和藻类，也可以被转化以自行/自身固氮。由于这些质粒在自然界中不存在，因此使用 合成生物学来产生能够使细胞/植物自行/自身固氮的人造质粒。所述人造质粒含有CDS 的修饰以及控制序列，以执行例如在植物中表达和积累固氮酶的新任务。
[0064] 实施例：遗传材料的分离
[0065] 植物DNA分离：使用3-4周的番前幼株，使用DNeasyPlantMiniKit(Qiagene Germany)来分离基因组（核）和质体DNA。纯DNA被用于完成目标DNA序列的PCR扩增。
[0066] 使用SEQ.ID.N0. 5、6、7和8(参见表1)，通过特异性PCR反应来扩增番茄DNA。这 产生番茄重组位点（SEQ.ID.N0. 5、6、7和8(参见表1))和PsbA终止信号（SEQ.ID.N0. 17 和18)。所有三个PCR产物来自于（番茄）质体DNA。
[0067]PsbA是D1蛋白（也称为PsbA)的基因，其形成光系统II反应中心的反应核心。 公知它是组成性表达的基因。
[0068] 然后将PCR扩增的DNA用于限制性酶消化，以在分别附连到每个PCR产物SEQ. ID. N0. 5、6、7、8、17和18的SacI-SacII、XhoI-KpnI和BamHI-AscI上产生粘端或粘性末端。[0069] 粘端或粘性末端是当限制性酶产生3'或5'悬端时所使用的术语。这些悬端在大 多数情况下是回文的（对称的）。每个粘性末端将被专有地连接到它的互补序列。连接的 或连接是指DNA分子的两个末端的共价连接反应，其通常由酶例如T4-DNA连接酶执行，但 不限于DNA或将DNA片段"胶粘"在一起的DNA连接酶。
[0070] 将限制性消化的PCRDNA，在图2中所示三状态反应中，通过在推荐的制造条件下 完成与T4-DNA连接酶（NEB.USA)的温育，克隆到pBluescript质粒中。
[0071] 为了为多克隆位点（MCS)添加非回文的独特限制性，通过PCR扩增pPZP-RCSII的 MCS，并如图2和图7中所示将其克隆到XhoI-SacI位点中。
[0072] 被命名为PGE003的新质粒，由AMP-R或BLA基因和pBluescript的0RI和番茄 叶绿体的用于同源重组的位点（图2中的TomChll和2)和来自于番茄的PsbA终止子，以 及pPZP-RCSII的MCS人工DNA序列构成。
[0073] 使用这一程序产生的PGE 003质粒具有独特的多克隆位点MCS-unique DNA，其具 有限制性位点，允许使用选自下列限制性酶的限制性酶进行克隆：XhoI，Pi-PspI，I-CeuI， I-Scel，I-Ppol和AscI，允许它依次并定向克隆目的基因。由于Pi-PspI、I-CeuI、I-Scel 和I-Ppol是非回文的，因此粘性末端不对称。因此连接将只在一个方向上发生。
[0074] 实施例：NIF基因的克隆和表达
[0075] 使用具有SEQ.ID.N0. 19和20的寡核苷酸，通过特异性PCR反应扩增番茄DNA，并 克隆到PSAT6-MCS的Agel-BamHI位点中，产生PGE006。这是在Pi-PspI位点之间具有目 的DNA的暂时质粒。通过这个克隆步骤，克隆了来自于番茄DNA的rrnl6基因的启动子。
[0076]pSAT载体是使用归巢内切核酸酶的一系列载体（质粒）。归巢内切核酸酶 是通常具有长的识别位点的限制性酶。这一特征使得它们成为"稀有切割工具"，因 为它们在任何随机选择的DNA中的切割频率是稀少的。例如，pSAT4具有I-Scel位 点AGTTACGCTAGGGATAACAGGGTAATATAGSEQ.ID.No. 25(可以作为GenbankSEQ.ID.No. DQ005466获得）的2个重复序列，并且它们是30个碱基，与此相比常规限制性酶为6-8个 喊基。
[0077] 使用具有SEQ.ID.No. 9和10的寡核苷酸（参见表1)的寡核苷酸，通过特异性PCR 反应对蓝细菌ATCC7120DNA进行PCR扩增，并克隆到（用于植物遗传工程的质粒）（PEG) 006 的（限制性位点）BglII-NotI位点中，产生PGE007,其是具有在rrnl6启动子控制之下的 Nif-H基因的质粒。
[0078]rrnl6启动子是指核糖体RNA16S的质体基因的5'DNA序列，其是质体中公知的表 达启动子并用于本公开中，然而其他可诱导的启动子也是可能的。也就是说，启动子被选择 成可以在希望使植物具有自行/自身氮生产和/或增强的氮摄入、同化或使用能力的任何 情况下可诱导。例如，适合的启动子可以包括但不限于通过使用氮源诱导的、胁迫诱导的、 创伤诱导的或通过使用其他化学物质诱导的启动子。含有本公开的遗传构建物的转基因植 物与对照植物相比表现出提高的农学特性。被提高的具体农学特性通常取决于启动子的本 性，并且可以包括提高的胁迫耐受性和/或更高效的氮摄入、储存或代谢，允许在使用很少 到没有氮肥投入的情况下并且在氮饥饿条件下培养本发明的植物，或允许在正常生长条件 下更快生长、更高的营养体生长和/或繁殖产率。
[0079] 使用具有SEQ.ID.No. 11和12的寡核苷酸（参见表1)，通过特异性PCR反应，对蓝 细菌ATCC7120DNA进行PCR扩增，并将其克隆到pSAT5-MCS的Agel-Xhol位点中，产生带有 Nif-D基因的质粒PGE008。
[0080] 使用具有SEQ.ID.No. 13和14的寡核苷酸（参见表1)，通过特异性PCR反应，对蓝 细菌ATCC7120DNA进行PCR扩增，并将其克隆到的PGE008的Xhol-Notl位点中，产生带有 Nif-D和Nif-K基因的质粒（图5上部中央）。使用具有SEQ.ID.No. 23和24的寡核苷酸 (参见表1)，通过特异性PCR反应，对pPZP-RCSIIDNA进行PCR扩增，并将其克隆到pSAT4 的Agel-Xhol位点中，其产生带有aadA基因的PGE005质粒（图4上部中央）。aadA是用 于植物转化的报告基因。这个基因编码氨基糖苷3'腺苷基转移酶，其通过腺苷化使壮观霉 素和链霉素失活，并阻止其结合于叶绿体核糖体，允许植物在含有所述抗生素的培养基上 生长。或者，在计算机上进行基础设计后，将完整核酸序列提交到商业化软件中，并通过合 成具有交叠和连续碱基的交叠寡核苷酸（寡核苷酸通常是短的DNA序列）序列并将其彼此 连接以产生完整序列，来产生合成的质粒。使用这种技术允许产生在细胞特异性优化中表 达的新序列。将具有SEQ.ID.N0. 9、11和13的质粒PGE分别用PI-PspI、I-CeuI和I-Scel 消化，并将目的基因例如Nif-H、Nif-D、Nif-K和aadA提供在具有SEQ.ID.NO. 7的同一位点 中，其中具有SEQ.ID.NO. 15的质粒被用于质体。
[0081] 然后将具有SEQ.ID.N0. 2的PGE结合于金粒，并轰击到番茄植株的叶组织中。
[0082] 番茄叶绿体转化允许基于番茄植物中植物质体DNA的已知位点（trnfM和tmG)之 间的同源重组而并入外来DNA。一般来说，每一侧几百碱基对（BP)使它能够将几千新BP转 移到其间（Nif基因）（参见图5)。使用携带这些目的基因的质粒DNA，1)将所述DNA维持 在细菌例如大肠杆菌（E.Coli)中；2)促进CDS的突变；以及3)将质粒DNA结合到金粒并 将它轰击到番茄植株的叶组织。添加选择性标志物如aadA并在含有链霉素或壮观霉素抗 生素的植物培养基上选择被转染的组织，将导致杀死不含"标志物"的细胞。几周后，存活 的细胞将含有转基因质体（叶绿体）同型质体，表明所有叶绿体是一致的并含有新基因，这 可以通过简单的位点特异性PCR试验来证明。取决于培养基中的激素浓度，植物的叶将发 育成新植株（再生）。
[0083] 转基因植物将表达Nif-H、Nif-D和Nif-K或这三个基因中的任两个的Nif操纵 子。术语"操纵子"是指以DNA序列的顺序组织并一起转录的几个基因。基因是指可以被 转 录成RNA分子和/或翻译成蛋白质或肽的DNA序列或一部分DNA序列。
[0084] 在将质粒DNA轰击到叶后，发生异源重组。作为植物细胞生命周期的正常部分，两 个分子（质粒DNA和质体DNA)将根据重组位点之间的相似性更换部分植物的DNA。结果， 将在质体DNA中引入额外的一段质粒DNA。
[0085] 当将植物组织暴露于抗生素时，只有能够避免抗生素伤害（对抗生素有抗性）的 质体将会存活，并且最终在几代后，只有转基因的质体存在于每个细胞中。此时，涉及的植 物、细胞或组织被认为是同型质体的。
[0086] 在Magenta箱（具有连接元件的双箱）中，从在MS培养基上萌发的表面除菌的种 子养育无菌番前植株（L.esculentumvar.IAC-SantaClara)。为了进行基因枪轰击，从在 茎切割中突出的腋生分生组织产生的3至4周龄植株（约15cm高）收获幼叶。将同型质体 转质体植物和野生型对照植物转移到土壤，并在植物生长箱中生长至成熟（16小时光照，8 小时黑暗，24°C)。对照植物在相同条件下生长。
[0087]使用DuPontPDSlOOOHe基因枪和 1，100p.s.i.防爆盘（BioRad Laboratories,Hercules,CA)，通过用质粒DNA包被的直径0. 6ym的金粒对番前的无菌幼 叶进行基因枪轰击，来实现番茄植物的质体转化。将轰击过的叶样品切成小片（3X3mm)，转 移到含有壮观霉素（300 - 500mg/L)的RM0P培养基，并在弱光（25yE;16h光照，8h黑暗） 下温育3至4个月。最初的壮观霉素抗性株系被鉴定为黄色或浅绿色的生长的愈合组织。 将愈合组织小片转移到相同培养基进行进一步繁殖，并分离同型质体转质体组织。为了进 行植株再生，将同型质体愈合组织转移到琼脂固化的含有0. 2mg/LIAA和3mg/LBAP的MS 培养基的表面上。或者，使用相同培养基，但用2mg/L玉米素代替BAP，获得幼苗诱导。为了 生根，将再生的幼苗转移到含有无植物激素的MS培养基的箱中。RN0P培养基是用生长激素 支持的MS:NAA0?lmg/L，BAPlmg/L，和维生素硫胺素lmg/L，肌醇100mg/l，30g鹿糖作为碳 源。
[0088] 可替选的基因或蛋白可用于本发明，例如在表2中提出的基因，这是由于微生物 如蓝细菌具有微生物多样性。由于一些基因不一致但相似并且功能几乎一致，因此可以使 用不同来源的Nif-D、Nif-H、Nif-K和CDS。
[0089]图5示出了在萌发后三周时番茄植株的发育。左侧盆在种植时提供了单剂肥料， 在右侧盆中没有向植物添加肥料。将它们一起保持在正常大田条件下，右侧的尺寸标志是 1英寸。
[0090] 图6示出了Nif-H在植物细胞中的定向和积累。具体来说，（A)来自于 Leptolyngbyanodulosa的非异形胞蓝细菌的NifH，起到用于Nif-H-GFP合成的模板的作 用。对于转运肽来说，在5'末端处添加编码番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶转运 肽的210个碱基。使用空载体作为对照。（B)示出了通过共聚焦显微术摄下的叶绿体自体 荧光和GFP。重叠的（合并的）图像证实了TP-NifH-GFP可以在叶的叶绿体处积累，并且 不能在细胞的其他部分和细胞器处检测到。
[0091] 可以使用的另一个实例是单细胞藻类莱茵衣藻（Chlamidomonasreinhardtii)， 其可以用作生物燃料或生物柴油生产的模型或作为绿色肥料，将它用含有来自于蓝细菌SEQNo. 1-3(或其他固氮细菌）的NifH和NifD和NifK的基因序列并具有允许在质体中表 达的特殊元件、即启动子和翻译起始序列以及同源重组序列的DNA进行遗传转化。
[0092] 得到的遗传修饰的莱茵衣藻（C.reinhardtii)将携带并表达固氮酶还原酶的基 因，模拟细菌用于固氮的途径。通过遗传工程改造的莱茵衣藻（C.reinhardtii)在植物中 利用BNF进行固氮，产生可用于植物或动物消费的有机形式的氮。许多藻类可以使用这种 技术，仅需要少量调整以获得商业化产品，产生更快的生长和环境友好的结果，其成本比传 统肥料低15-35%。当转化藻类时，Nif基因的来源是光合蓝细菌。使用这些Nif基因确保 了转化的藻类能够利用所述酶进行代谢。
[0093] 本公开描述了一种新的质粒，其允许将Nif?基因作为一个操纵子表达。这种独特 的构造避免了以前实验的复杂情况，即引起单个和分开的基因两者的表达。
[0094] 随着细菌基因组序列变成公开的知识，Nif基因的其他来源和Nif基因的 分离将变得完善。蓝细菌的Nif基因可以通过扩增特定靶基因来获得。例如，在念 珠藻Nostocsp.PCC7120登记号BA000019. 2 (NCBI)的基因组序列中，可以使用基 因的最前和最后24个碱基，始于ATGACTGACGAAAACATTAGACAG(SEQ.ID,No. 3)并止于 ATGACTGACGAAAACATTAGACAGA(SEQ.ID.No. 25)，通过PCR容易地扩增Nif-H。向每个引物 的开始部分添加限制性位点，允许人们将PCR产物克隆在编码序列内不存在的特异性位点 中，例如用于第一引物的Xhol位点：CTCGAG-ATGACTGACGAAAACATTAGACAG(SEQ.ID.N0. 26) 和用于第二引物的Xbal位点TCTAGA-ATGACTGACGAAAACATTAGACAGA(SEQ.ID,No. 27)。这使 人们能够将NifH基因克隆到Xhol-Xbal位点中。将大小为900bp的PCR产物连接到质粒 例如pBluescript中，然后在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择，允许验证序列。同样 的策略适用于克隆Nif-D和Nif-K基因。
[0095] 实施例：质体转化
[0096] 允许基于植物质体DNA的已知位点如trnfM和tmG之间的同源重组来并入外来 DNA的莱茵衣藻（C.reinhardtii)叶绿体转化，示出在图2-3中，并使用SEQID.N0. 1-3之 〇
[0097] 一般来说，每侧几百碱基对能够将几千个新的DNA碱基对（BP)转移到其间（Nif 基因）。携带这些基因的质粒DNA: 1)在细菌如大肠杆菌中维持DNA;2)允许编码DNA序列 (CDS)的测序和/或突变；以及3)可用于遗传转化。
[0098] 遗传转化（将质粒插入到质体中--参见图7B)包括下列步骤：1)将DNA例如编 码SEQ.ID.N0. 1、SEQ.ID.N0. 2或SEQ.ID.N0. 3的核酸序列吸附在金粒上，并将所述DNA轰 击在莱茵衣藻（C.reinhardtii)细胞上；2)添加选择性标志物例如aadA，并在含有抗生素 例如壮观霉素的藻类生长培养基上选择转化的细胞，以便除去不含转入基因的细胞；3)储 存含有转基因质体的细胞；以及4)使用简单的位点特异性PCR验证所述序列。
[0099] 在修饰后，通过例如乙炔还原来试验莱茵衣藻（C.reinhardtii)的固氮。这个 过程使用气相色谱仪测量作为氮源的乙炔的量，以便提供Nif?酶活性的直接证据。生长 被转化的细菌并将它与野生型进行比较证实了被转化的基因有活性，因此允许莱茵衣藻 (C.reinhardtii)固氮。
[0100] 实施例：核转化（参见图7A)
[0101]烟草棺株的准各:将烟草棺株在萌发后，在Majenta箱中，在MS培养基上，在22°C 下，在长昼生长室中生长3至4周。
[0102]土壤杆菌培养物的制各:通讨在3mlLB+抗生素（例如利福平*10mg/l和壮观霉 素100mg/ml) +质粒序列号PGE0048或PGE0066或PGE0088或PGE0148中将种子培养物生长 过夜（28°C，250rpm，来自于新鲜的重新划线的LB平板），来制备土壤杆菌培养物。将1或 2ml在不含抗生素的50mlLB中稀释并在28°C生长2至6小时，直至0D600 = 0. 6到1. 0。 [0103] 转化步骤:将细菌培养物倾倒在无菌皮氏培养皿中。将烟草植物的叶切成较小的 碎片例如圆盘或正方形，使得所述较小的碎片通常为约2cmx2cm的碎片。
[0104] 向皮氏培养皿中的细菌培养物添加烟草植物的碎片。将皮氏培养皿在22-25°C下 温育约20分钟。将烟草植物的碎片在无菌滤纸上干燥，以消除任何过量的液体。将烟草植 物的干燥碎片置于MR平板上（如果可能，将近轴一侧朝下）。用石蜡封口膜密封平板。
[0105] 或者，可以用0D0. 1的细菌悬液注射烟草植物的一个或多个叶片。然后给予注射 过的叶片48-72小时进行恢复。分析注射过的叶片的Nif?基因的瞬时表达。48-72小时后， 将植物封闭在含有15N稳定同位素的仓室中96小时，然后通过质谱术分析15N在植物的氨 基酸和/或其他分子中的掺入。
[0106]共培养:将叶/碎片在牛长宰中，在22°C淵育3天（长昼）。3天后，通过在水中 含有100mg/l特美汀的无菌水中漂洗来洗涤叶/碎片。将叶/碎片置于MRTK上，其中将叶 /碎片彼此隔开以降低土壤杆菌重新生长的风险。将叶/碎片在生长室中，在22°C下放置 2-3周（长昼）。在叶/碎片的边缘上将出现愈合组织。当在愈合组织上出现小芽时，将它 们重新铺板在MSTK平板上，同时优选地移除周围的愈合组织和叶组织而不损伤小植株。在 约3周（有时更长时间）后，小植株将发育并且出现根，然后可以将小植株重新铺板在MST 平板上（在majenta箱中，在重新铺板在平板上之前切掉根）。然后每3-4周在MSmajenta 箱中重新铺板在平板上。
[0107]培养基组成
[0108]MR=MS培养基（1L)，MS粉 4. 4g，蔗糖 30g，MES0? 5gpH5. 8,琼脂 8.Og。在压热 灭菌后，加入BAPlml储用溶液（lmg/ml)和NAA0?lml储用溶液（lmg/ml)。
[0109] MRTK=与MR相同，但在压热灭菌后，添加特美汀至最终300mg/L(来自于过滤除菌 的储用溶液300mg/ml)和卡那霉素至最终50mg/L(来自于过滤除菌的储用溶液50mg/ml)。
[0110]MSTK=与MRTK相同，不含BAP和NAA，并含有最终300mg/L的特美汀和最终30mg/ L的卡那霉素。
[0111]MST=与MSTK相同，不含卡那霉素，其中特美汀可以被减少到100mg/L，并且在进 一步的重新铺板中完全移除）。
[0112] 序列IDNo. 1:
[0113] 番茄质体转化载体PGE11，完整序列
[0114]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119」
[0121
[0121]
[0122]
[0127] CN104903453A 说明书 24/81 页
[0128]
[0129]
[0130:
[0131」
[0132]
[013^
[0139]
[01刊」
[0141]
[0142]
[0143」
[01
//
[0145] 序列IDNo. 4:
[0146] rrnl6的启动子序列
[0147] 4A> 用于 16S核糖体rrnl6的莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)叶绿体
[0148] Gcctgccaactgcctatatttatatactgcgataaactttagtcccgaaggggtttacatatccgaagg aggaagcaggcagtggcggtaccacgccactggcgtcctaatataaatattgggcaagtaaacttagaataaaattt atttgctgcgttagcaggtttacatactcctaagtttacttgcccgaaggggaaggaggacgtcccctacgggaata taaatattagtggcagtggtacaataaataaattgtatgtaaaccccttcgggcaactaaagtttatcgcagtatta acatcctagtatataaatatcggcagttggcaggcaacaaatttatttattgtcccgtaaggggaaggggaaaacaa ttattattttactgcggagcagcttgttattagaaatttttattaaaaaaaaaataaaaatttgacaaaaaaaaata aaaaagttaaattaaaaacactg ggaatgttctaacaatcataaaaaaatcaaaagggtttaaaatcccgacaaaat ttaaactttaaagagt
[0149] 4B>用于16S核糖体rrnl6的番前Solanum lycopersicum叶绿体
[0150] _
[0151] cgtcgttcaatgagaatggataagaggctcgtgggattgacgtgagggggcagggatgactatatttct gggagcgaactccgggcgaatatgaagcgcatggatacaagttatgccttggaatgaaagacaattccgaatccgct ttgtctacgaacaaggaagctataagtaatgcaactatgaaggatct
[0152]表1
[0153]
[0154]表2:
[0155]
[0156]表3 - SEQ. ID. NO. 46
[0157]用于瞬时和稳定转化的植物核酸酶转化质粒Nptll TP Nif HDK42PGE#0088
[0158] 特征 定位/限定词
[0159]
[0160」
[0161]
[0162]
[0163」
[0164]
[0165」
[01 CN104903453A 说明书 49/81 页
[0IO/j
[01
[01
//
[0170]表 4 -SEQ.ID.NO. 47
[0171] 用于瞬时和稳定转化的植物核酸酶转化质粒NptllTPNifHDK101PGE#66
[0172]
[0173]
[017*r」 CN 104903453 A 1兄明书 54/81页
[0175]
[0176]
[0177.
[0178]
[0179」
[0180」
[0181」
[018_」
[0186」
[0187] CN104903453A 说明书 65/81 页
[018toj
[0189:
[0190]
[0191」
[0192:
//
[0193]表6 -SEQ.ID.NO. 49
[0194]
[0195]
[0196]
[0198」
[0199」
[0200]
[0201
[02G^j
[0203]
[02C
[0205] //
[0206] 应该理解，可以对本文中公开的程序和实施方式进行各种不同的修改。因此，上面 的描述不应被解释为限制，而是仅仅作为各种不同实施方式的示例。本领域技术人员将设 想在权利要求书的范围和精神之内的其他修改。
【主权项】
1. 一种表现出增强的固氮的转基因植物，其通过包含下列步骤的方法来产生： 将一个或多个植物细胞与编码可操作连接到启动子序列和终止子序列的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的重组核酸序列相接触； 从所述植物细胞再生一株或多株植物；以及 选择从所述植物细胞培养的、表现出增强的固氮的一株或多株植物，其中所述一株或 多株植物包含编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重组核酸序列。2. 权利要求1的转基因植物的种子、茎、叶或根，其中所述种子、茎、叶或根包含编码 Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重组核酸序列。3. 权利要求1中叙述的转基因植物，其中所述转基因植物选自油菜、玉米、水稻、烟草、 大豆、棉花、苜蓿、番茄、小麦、马铃薯和大麦。4. 权利要求3中叙述的转基因植物，其中所述转基因植物是番茄或烟草。5. 权利要求1的转基因植物的后代，其中所述后代包含编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基 因的所述重组核酸序列。6. 权利要求3的植物的后代，其中所述后代包含编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所 述重组核酸序列。7. 权利要求4的植物的后代，其中所述后代包含编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所 述重组核酸序列。8. 权利要求1中叙述的转基因植物，其中选择一株或多株植物的步骤包括在低氮输入 条件下生长所述一株或多株植物。9. 权利要求1中叙述的转基因植物，其中与一个或多个细胞相接触的编码Nif-H、 Nif-D和Nif-K基因的所述重组核酸序列，从选自蓝细菌、固氮菌科、根瘤菌和弗兰克氏菌 的来源获得。10. -种用于降低土壤中的总氮浓度的方法，所述方法包括： 将权利要求1的转基因植物放置成与所述土壤相接触，使得当所述转基因植物生长 时，来自于所述土壤的氮被利用，由此降低所述土壤中的总氮浓度。11. 一种表现出增强的固氮的转基因植物，其通过包含下列步骤的方法来产生： 将植物细胞与编码SEQ.ID.NO. 1、SEQ.ID.NO. 2和SEQ.ID.NO. 3之一的重组核酸序列相 接触，以产生转基因植物； 从所述植物细胞再生一株或多株转基因植物；以及 选择从所述植物细胞培养的一株或多株转基因植物，其中所选的转基因植物各自表现 出增强的固氮， 其中所选的一株或多株转基因植物各自包含编码SEQ.ID.No. 1、SEQ.ID.No. 2或SEQ.ID.NO. 3的所述重组核酸序列。12. 权利要求11的转基因植物的种子、茎、叶或根，其中所述种子、茎、叶或根包含编码 SEQ.ID.NO. 1、SEQ.ID.NO. 2 和SEQ.ID.NO. 3 之一的所述重组核酸序列。13. 权利要求11中叙述的转基因植物，其中所述转基因植物选自油菜、玉米、水稻、烟 草、大豆、棉花、苜蓿、番茄、小麦、马铃薯和大麦。14. 一种植物来源的商业化产品，其源自于按照权利要求11的方法产生的转基因植 物，其中所述转基因植物包含编码SEQ.ID.NO. 1、SEQ.ID.NO. 2和SEQ.ID.NO. 3之一的重组 核酸序列。15. 权利要求14中叙述的植物来源的商业化产品，其中所述商业化产品是纸浆、纸张、 纸制品、木材、香烟、雪茄、嚼烟、面包、面粉、谷物、燕麦餐或大米。16. -种用于降低土壤中的总氮浓度的方法，所述方法包括： 将权利要求11的转基因植物放置成与所述土壤相接触，使得当所述植物生长时，来自 于所述土壤的氮被利用，由此降低所述土壤中的总氮浓度。17. -种表现出增强的固氮的转基因植物，其通过包含下列步骤的方法来产生： 将植物细胞与编码SEQ.ID.NO. 1、SEQ.ID.NO. 2和SEQ.ID.NO. 3之一的重组核酸序列相 接触，以产生转基因植物； 将所述植物细胞与被优化用于番茄叶绿体表达的至少一种合成的编码DNA序列 (sCDS)相接触； 从所述植物细胞再生一株或多株转基因植物；以及 选择从所述植物细胞培养的、表现出增强的固氮的一株或多株转基因植物，其中所述 一株或多株植物包含编码SEQ.ID.NO. 1、SEQ.ID.NO. 2或SEQ.ID.NO. 3的所述重组核酸序列 和所述s⑶S。18. 权利要求17所叙述的转基因植物，其中所述转基因植物选自油菜、玉米、水稻、烟 草、大豆、棉花、苜蓿、番茄、小麦、马铃薯和大麦。19. 权利要求17中叙述的转基因植物，其中所述s⑶S包含基本上由SEQ.ID.NO. 29、 SEQ.ID.NO. 30、SEQ.ID.NO. 31、SEQ.ID.NO. 32、SEQ.ID.NO. 33、SEQ.ID.NO. 34、SEQ.ID.NO 35、SEQ.ID.NO. 36、SEQ.ID.NO. 37、SEQ.ID.NO. 38、SEQ.ID.NO. 39 和SEQ.ID.NO. 40 构成的组 中的一个。20. -种用于降低土壤中的总氮浓度的方法，所述方法包括： 将权利要求17的转基因植物放置成与所述土壤相接触，使得当所述植物生长时，来自 于所述土壤的氮被利用，由此降低所述土壤中的总氮浓度。21. -种用于提高土壤中的氮浓度的方法，所述方法包括： 将权利要求17的转基因植物放置成与土壤相接触，使得当所述植物腐败时，所述植物 将氮释放到所述土壤中。22. -种表现出增强的固氮的转基因植物，其通过包含下列步骤的方法来产生： 将植物细胞与编码SEQ.ID.NO. 46、SEQ.ID.NO. 47、SEQ.ID.NO. 48 和SEQ.ID.NO. 49 之一 的重组核酸序列相接触，以产生转基因植物； 从所述植物细胞再生一株或多株转基因植物；以及 选择从所述植物细胞培养的一株或多株转基因植物，其中所选的植物各自表现出增强 的固氮， 其中所选的一株或多株转基因植物各自包含编码SEQ.ID.NO. 46、SEQ.ID.NO. 47、SEQ.ID.NO. 48或SEQ.ID.NO. 49的所述重组核酸序列。23. 权利要求22的转基因植物的种子、茎、叶或根，其中所述种子、茎、叶或根包含编码 SEQ.ID.NO. 46、SEQ.ID.NO. 47、SEQ.ID.NO. 48 和SEQ.ID.NO. 49 之一的所述重组核酸序列。24. 权利要求22中叙述的转基因植物，其中所述转基因植物选自油菜、玉米、水稻、烟 草、大豆、棉花、苜蓿、番茄、小麦、马铃薯和大麦。25. -种转基因植物来源的商业化产品，其源自于按照权利要求22的方法产生的转 基因植物，其中所述转基因植物包含编码SEQ.ID.NO. 46、SEQ.ID.NO. 47、SEQ.ID.NO. 48和 SEQ.ID.NO. 49之一的重组核酸序列。26. 权利要求25中叙述的转基因植物来源的商业化产品，其中所述商业化产品是纸 浆、纸张、纸制品、木材、香烟、雪茄、嚼烟、面包、面粉、谷物、燕麦餐或大米。27. -种用于降低土壤中的总氮浓度的方法，所述方法包括： 将权利要求22的转基因植物放置成与所述土壤相接触，使得当所述植物生长时，来自 于所述土壤的氮被利用，由此降低所述土壤中的总氮浓度。28. -种表现出增强的固氮的转基因植物，其通过包含下列步骤的方法来产生： 将一个或多个转基因植物细胞与编码可操作连接到第一启动子的Nif-H基因的重组 核酸序列相接触； 将所述转基因植物细胞与编码可操作连接到第二启动子的Nif-D基因的重组核酸序 列相接触； 将所述转基因植物细胞与编码可操作连接到第三启动子的Nif-K基因的重组核酸序 列相接触； 从所述植物细胞再生一株或多株转基因植物；以及 选择从所述植物细胞培养的一株或多株转基因植物，其中所选的转基因植物各自表现 出增强的固氮， 其中所选的转基因植物各自包含编码Nif-H基因的重组核酸序列、编码Nif-D基因的 重组核酸序列和编码Nif-K基因的重组核酸序列。29. 权利要求28中叙述的转基因植物，其中所述编码Nif-H基因的重组核酸序列选自 基本上由SEQ.ID.NO. 29、32、35和38构成的组。30. 权利要求28中叙述的转基因植物，其中所述编码Nif-D基因的重组核酸序列选自 基本上由SEQ.ID.NO. 30、33、36和39构成的组。31. 权利要求28中叙述的转基因植物，其中所述编码Nif-K基因的重组核酸序列选自 基本上由SEQ.ID.NO. 31、34、37和40构成的组。32. 权利要求28中叙述的转基因植物，其中所述第一启动子选自基本上由SEQ. ID.NO. 41-45构成的组。33. 权利要求28中叙述的转基因植物，其中所述第二启动子选自基本上由SEQ. ID.NO. 41-45构成的组。34. 权利要求28中叙述的转基因植物，其中所述第三启动子选自基本上由SEQ. ID.NO. 41-45构成的组。 3 5.权利要求2 8中叙述的转基因植物，其中所述启动子中的至少一个包含SEQ.ID.NO. 4 或SEQ.ID.NO. 28。
【专利摘要】本发明提供了一种通过将细菌的nif(固氮)基因定向到植物质体或在植物质体中表达，来工程化复制光合细菌例如蓝细菌或其他细菌的固氮机制的转基因植物的方法。提供了一种使用复制光合细菌的固氮机制的植物来降低土壤中的总氮浓度的方法。还提供了复制光合细菌的固氮机制的植物的后代。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN104903453
【申请号】CN201380069376
【发明人】阿迪·查尔兹曼
【申请人】阿迪·查尔兹曼
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年12月2日
【公告号】CA2893136A1, EP2925870A2, US20140196178, WO2014088943A2, WO2014088943A3
【专利说明】
[0001] 与相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年7月25日提交的美国临时申请号61/858, 218和2012年12 月3日提交的美国临时申请号61/732, 490的优先权，所述每个临时申请以其全部内容通过 参考并入本文。
技术领域
[0003] 本公开涉及一种新的转基因植物，所述转基因植物通过靶向或表达细菌的 nif(固氮）基因以产生固氮酶的结构蛋白，并通过导入编码与固氮酶的结构蛋白同源的蛋 白质的合成DNA序列，来复制光合细菌例如蓝细菌或其他细菌的固氮机制，还涉及产生这 样的植物的方法。
【背景技术】
[0004] 植物是属于植物界的活生物体。所有高等植物具有维管组织木质部（主要运输水 和矿物质）和韧皮部（主要运输糖类和其他代谢物）。维管植物包括所有具种子的植物（裸 子植物和被子植物）和蕨类植物（包括羊齿类植物、石松类植物和木贼类植物），其也被称 为导管植物。它们是具有有组织的细胞结构的真核生物，所述细胞结构包括核（在大多数 细胞中）和具有在光合作用期间使用光例如日光作为能源进行碳固定的能力的叶绿体（或 其他类型的质体）。其他类型的植物包括例如藻类、苔藓和真菌。
[0005] 农业作物的作物生产率的总体限制因素是土壤和水中的氮含量。随着农业生产试 图与增长的人口的不断增加的需求和减少的可用耕地保持同步，这种元素的供应随时间减 少。氮是所有生命形式、包括植物必需的重要营养物之一。然而，氮必须首先被转变成植物 可以利用的形式。生物固氮（BNF)现象是使用固氮酶将大气中的氮（N2)转变成氨（NH3)。 BNF通常由下列化学反应式表示：N2+8H++8ell6ATP?>2NH3+H2+16ADP+16Pi，或者说在8个 质子和8个电子存在下并消耗16个ATP分子（三磷酸腺苷一一细胞的能量分子），将氮气 分子还原成两个氨分子。由于队含有叁键，这个反应消耗大量能量。氮气分子中的键能约 为225kcal/mol。在自然界中，很少有BNF作为构成"固氮酶复合体"的植物与几个细菌物 种之间的共生关系的结果而进行。固氮酶复合体由两种蛋白构成：Fe蛋白（被称为Nif-H 的酶）和Mo-Fe蛋白（被称为Nif-D-K的a和0亚基）。固氮酶复合体由与同二聚体 (至少两个相同单元）的Fe(铁辅因子）蛋白暂时结合的异四聚体（不是相同单元）的 MoFe(铁-钼辅因子）蛋白构成。
[0006]Nif-H基因编码铁蛋白，Nif-D和K基因编码钼铁蛋白。因此，Nif-D和Nif-K基 因在它们的最终活性形式中需要Mo和Fe作为辅因子。Nif-D编码Nif-D蛋白，也被称为 a亚基，Nif-K编码Nif-K的蛋白被称为0亚基。换句话说，Nif-H是具有两个相同亚基 的二聚体酶（总共2个蛋白），而Nif-D-K是2a20二聚体（总共4个蛋白）。所有6个 亚基对于其功能来说是必需和必要的。在自然界中，Nif-H具有大量变种，并对生物多样性 有贡献。存在大量类型的Nif-H这一事实，提供了适应各种不同自然条件的能力。
[0007] 产生固氮酶复合体的细菌物种包括固氮生物例如蓝细菌、固氮菌科 (azotobacteraceae)、根瘤菌（rhizobia)和弗兰克氏菌（frankia)。例如，在蓝细菌中， Mo-Fe蛋白（Nif-D-K)结合大气中的氮（N2)，然后Fe-蛋白（Nif-H)通过由铁氧化还原蛋白 贡献的电子将它还原。铁氧化还原蛋白是在光合作用电子传递链中起到电子载体作用的蛋 白质，其类似于高等植物叶绿体的Fe2S2铁氧化还原蛋白，但不完全一致。被还原的Fe-蛋 白使用ATP将（被还原的）电子传递到Mo-Fe蛋白，后者然后将电子贡献给N2 (固氮酶还 原酶）。通过将这个过程重复几次，将N^N的所有三个共价键还原成2NH3。
[0008] 然而，仅有几种植物物种可以与固氮生物以共生关系生活。例如，来自于豆科植物 的豌豆植物与来自于根瘤菌科的细菌共生生活。具体来说，根瘤菌细菌穿透豌豆植物的根， 产生含有固定氮（成为氨）的细菌的根瘤，而植物贡献碳（糖）。因此，改进共生或扩展宿 主范围对于植物存活来说是有益的，但实现这一目标包括许多挑战，包括过程的复杂性和 基础知识的欠缺。
[0009] 也可以使用人工方法将氮化学固定。这种固氮方法最通常通过被称为Harber过 程的热反应来生产。这个过程对于相对简单的反应来说需要高的压力和温度。最近一百年 来，对氮肥的需求稳定地增长到每年超过2亿公吨。这种消耗量可能增加。
[0010] 非共生生物（例如与任何固氮微生物没有确立的共生关系的自由生活的生物）， 如果各自包含核心酶固氮酶，可以实现自生物固氮（SBNF)。能够自固氮的非细菌生物例如 作物和藻类以及其他植物的存在，对于几种目的来说是有用的，例如降低施肥需求，降低施 肥污染，提供经济友好的作物生产，提高作物产量，提高植物中的油含量，提高植物中的蛋 白质含量，降低水的氮污染，以及相对于氮提高碳含量和相对于土壤的有机相提高碳。然 而，出于几个原因，没有已知的能够实现这些结果的植物，其中一个原因是固氮酶的特殊酶 复合体，其包括几种用于固氮的蛋白质和基因。
[0011] 用于大气氮固定的几乎所有的核心酶都对氧非常敏感。这一特征使得几乎不可能 在植物中固氮，因为植物在光合作用反应期间从水产生氧。蓝细菌被认为是叶绿体的进化 祖先（基础）。尽管叶绿体在进化期间已失去许多其原始的基因，但蓝细菌维持了许多叶 绿体丢失的基因。作为光合生物，蓝细菌栖息在地球上几乎所有光照环境中。它们在由超 过20个固氮（NIF)基因促进的生物固氮（BNF)过程中发挥关键作用。这些基因中只有三 个（Nif-D、Nif-K和Nif-H)是NIF酶类（固氮酶）。其余的NIF基因参与复合体组装、辅 因子加工和表达的控制。
[0012] 豆科作物例如大豆、菜豆或豌豆以它们发育出被根瘤菌（Rhizobiumsp.)共生细 菌占据的根瘤的独特能力广为人知。这些细菌能够BNF并向植物提供氨。大多数作物不具 有这种能力，并且根瘤菌（Rhizobiumsp.)不能与它们相互作用。进行了几次未发表的尝 试以扩展根瘤菌的"宿主"范围，但所有这些尝试都失败了。
[0013] 因此，需要一种系统和方法，其包含能够以使系统可持续并且在商业上可行的显 著速率进行细胞固氮以生产氨的转基因植物。下面的部分描述这样的系统。
[0014] 发明概述
[0015] 本公开涉及被转化以便能够进行自行/自我固氮过程，产生它们自己可用的氮 源，由此降低对作为氮源的含氮肥料的依赖性的转基因植物（遗传修饰生物体或（GM0))。 本公开还涉及包含转化这些植物以使它们能够进行自行/自身固氮的基因的植物细胞、组 织、植物部分或植物株系。
[0016] 在某些实施方式中，根据本公开的原理，提供了一种表现出改良的自身/自行固 氮情况的植物，其通过包括下列步骤的方法来产生：将编码可操作连接到启动子序列和终 止子序列的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的重组核酸序列导入一个或多个植物细胞；从所述 植物细胞再生一株或多株植物，并选择从所述植物细胞培养并表现出增强的固氮的一株或 多株植物，使得一株或多株植物包含编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重组核酸序列。 在某些实施方式中，编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重组核酸序列从单一生物体获 得。在某些实施方式中，编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重组核酸序列从不同生物 体获得。例如，在某些实施方式中，编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因中的至少一个的重组核 酸序列从第一生物体获得，并且编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因中的至少一个的重组核酸 序列从不同于所述第一物种的第二生物体获得。在某些实施方式中，编码Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因的所述重组核酸序列在自然界中存在。在某些实施方式中，编码Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因的所述重组核酸序列是合成的并且在自然界中没有被发现。
[0017] 在某些实施方式中，根据本公开的原理，提供了一种表现出改良的自身/自行固 氮情况的植物，其通过包括下列步骤的方法来产生：将植物细胞与编码SEQ.ID.N0. 1、SEQ.ID.NO. 2和SEQ.ID.NO. 3之一的重组核酸序列相接触；从所述植物细胞再生一株或多株植 物；以及选择从所述植物细胞培养的一株或多株植物，其中所选的植物各自表现出增强的 固氮，其中所选的一株或多株植物各自包含编码SEQ.ID.No. 1、SEQ.ID.No. 2、SEQ.ID.N0. 3、 SEQ.ID.NO. 46、SEQ.ID.NO. 47、SEQ.ID.NO. 48 或SEQ.ID.NO49 的重组核酸序列。
[0018] 在某些实施方式中，根据本公开的原理，提供了一种表现出增强的固氮的植物， 其通过包括下列步骤的方法来产生：将植物细胞与编码SEQ.ID.N0. 1、SEQ.ID.N0. 2、SEQ. ID.NO. 3、SEQ.ID.NO46、SEQ.ID.NO47、SEQ.ID.NO48 或SEQ.ID.NO. 49 之一的重组核 酸序列相接触；将所述植物细胞与被优化以用于番茄叶绿体表达的至少一种合成的编码 DNA序列（sCDS)相接触；从所述植物细胞再生一株或多株植物；以及选择从所述植物细 胞培养并表现出增强的固氮的一株或多株植物，其中所述一株或多株植物包含编码SEQ. ID.N0. 1、SEQ.ID.N0. 2、SEQ.ID.N0. 3、SEQ.ID.N0 46、、SEQ.ID.N0 47、SEQ.ID.N0 48 或 SEQ.ID.NO. 49的所述重组核酸序列和所述s⑶S。
[0019] 在某些实施方式中，根据本公开的原理，提供了一种表现出增强的固氮的植物，其 通过包括下列步骤的方法来产生：将一个或多个植物细胞与编码可操作连接到第一启动 子的作为Nif-H基因的带有植物转运肽或叶绿体（质体）积累信号的嵌合Nif基因的重 组核酸序列相接触；将所述植物细胞与编码可操作连接到第二启动子的Nif-D基因的重组 核酸序列相接触；将所述植物细胞与编码可操作连接到第三启动子的Nif-K基因的重组核 酸序列相接触；从所述植物细胞再生一株或多株植物；以及选择从所述植物细胞培养的一 株或多株植物，其中所选植物各自表现出增强的固氮，其中所选植物各自包含编码Nif-H 基因的重组核酸序列、编码Nif-D基因的重组核酸序列和编码Nif-K基因的重组核酸序 列。在某些实施方式中，所述Nif-H基因选自基本上由SEQID.N0. 29、SEQID.N0. 32、SEQ ID.NO. 35和SEQID.NO. 38构成的组。在某些实施方式中，所述Nif-D基因选自基本上由 SEQID.N0. 30、SEQID.N0. 33、SEQID.N0. 36 和SEQID.N0. 39 构成的组。在某些实施方 式中，所述Nif-K基因选自基本上由SEQID.NO. 31、SEQID.NO. 34、SEQID.NO. 37 和SEQ ID.NO. 40构成的组。在某些实施方式中，所述第一、第二和第三启动子选自基本上由SEQ.ID.NO. 41-45构成的组。
[0020] 本公开还涉及转基因植物来源的商业化产品，其源自于按照本公开中描述的方法 产生的转基因植物。
[0021] 还描述了一种按照本公开的原理降低土壤中的总氮浓度的方法。所述方法包括将 本公开中描述的至少一种转基因植物放置成与将要降低氮水平的土壤相接触；以及允许所 述植物生长并固定从所述土壤获得的氮，它们的代谢引起所述土壤中总氮浓度的降低。这 些以及其他原理使用附图并在详细描述中进一步描述。
[0022] 附图简述
[0023] 图1示出了固氮酶复合体的示意结构。
[0024]图2示出了用于在番茄叶绿体转化期间插入到质体中的构建质粒的产生步骤的 示意图。
[0025] 图3示出了用于番茄叶绿体转化和Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的表达的质粒（PGE 011)的产生步骤的示意图。
[0026] 图4示出了作为单一操纵子被克隆并插入到莱茵衣藻（C.reinhardtii)叶绿体中 的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因。
[0027] 图5不出了在萌发后三周时番前植株的发育。
[0028] 图6示出了Nif-H在植物质粒中的积累。
[0029] 图7示出了植物转化质粒的示意结构。
[0030] 详细描述
[0031] 本公开涉及能够固氮的转基因植物、从这样的植物生产的产品、产生所述转基因 植物的方法和使用所述转基因植物降低土壤或水 中的氮的方法。
[0032] 通过结合构成本公开的一部分的附图来参考下面本公开的详细描述，可以更容易 地理解本公开。应该理解，本公开不限于本文中描述和/或示出的具体的组合物、装置、方 法、条件或参数，并且本文中使用的术语是出于仅仅举例描述特定实施方式的目的，而不打 算限制所宣称的公开内容。此外，当在本说明书包括随附的权利要求书中使用时，单数形式 包括复数，并且对特定数值的指称至少包括该特定值，除非上下文明确表明不是如此。在本 文中，范围可以表述为从"约"或"近似" 一个特定值和/或到"约"或"近似"另一个特定 值。当表述这样的范围时，另一种实施方式包括从所述一个特定值和/或到所述另一个特 定值。同样地，当使用先行词"约"将值表述成近似值时，应该理解所述特定值形成另一种 实施方式。
[0033] 出于本说明书和随附的权利要求书的目的，除非另有指明，否则表述材料的成分、 百分率或比例、反应条件的所有数字以及本说明书和权利要求书中使用的其他数值，应该 被理解为在所有情况下被术语"约"修饰。因此，除非指明与其相反，否则在下面的说明书 和随附的权利要求书中提出的数值参数是近似值，其可能随着本公开试图获得的所需性质 而变。至少，并且不试图限制等同性原则在权利要求书范围中的应用，每个数值参数应该至 少根据所报告的有效数字的数量并使用常规的舍入技术来解释。
[0034] 尽管本文中提出的数值范围和参数、本公开的广阔范围是近似值，但在具体实例 中提出的数值被尽可能精确地报道。然而，任何数值固有地含有由它们相应的试验测量中 存在的标准偏差所必然带来的某些误差。此外，本文中公开的所有范围应该被理解为涵盖 其中包含的任何和所有子范围。例如，"1至10"的范围包括最小值1和最大值10之间（并 包括1和10)的任何和所有子范围，也就是说，具有等于或大于1的最小值和等于或小于10 的最大值的任何和所有子范围，例如5. 5至10。
[0035] 本申请中的标题不意味以任何方式限制本公开；在任一标题下的实施方式可以与 任何其他标题下的实施方式联合使用。
[0036] 应该指出，当在本说明书和随附的权利要求书中使用时，单数形式包括复数指称 物，除非明显且明确地限于一个指称物。因此，例如，对"椎间盘植入物"的指称包括一个、 两个、三个或更多个椎间盘植入物。
[0037] 下面的讨论包括对转化植物以使它们自己能够固氮所必需的组合物、遗传步骤、 相关转基因细胞和得到的转基因植物，以及根据本公开的原理使用转基因植物（遗传修饰 生物体（GM0))以降低对氮肥的需要或需求的方法的描述。还公开了可替选实施方式。现 在将详细参考本公开的某些实施方式，其实例在附图中示出并在实施例中讨论。尽管本公 开将结合说明性实施方式进行描述，但应该理解，它们不打算将本公开限于那些实施方式。 相反，本公开打算覆盖可以包括在本公开之内的所有可替选方案、改良和等同物，正如随附 的权利要求书所定义的。
[0038] 现在转向本公开的组合物和方法，本文中提供的组合物和方法是为了通过异源固 氮酶的活性在植物中生产有机氮，使得植物可以产生氨。
[0039] 根据本公开，在某些实施方式中，将目标植物用含有来自于蓝细菌的具有Nif-H、 Nif-D和/或Nif-K的基因序列（SEQ.ID.NO. 1-3和/或29-40)的DNA进行遗传转化。在 可替选方式中，可以将目标植物用来自于其他细菌的在特定条件下表达在植物质体中的类 似基因（启动子和翻译起始序列，以及异源重组序列）进行遗传转化。这不限于质体（叶 绿体）。图3和图4示出了在质体转化中使用的质粒。
[0040]目标植物是指将具有导入到其中的一个或多个新基因的植物细胞或组织，将用 "新的'T)NA进行遗传转化，所述新的DNA含有来自于蓝细菌（即CyanobacteriumAnabaena PCC7120 (SEQ.ID.No. 1-2)或其他蓝细菌（SEQ.ID.NO. 29-40))或其他细菌（仅仅在特定条 件下，当在质体中存在Nif蛋白、"酶"的积累时）的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因序列。被 转化成具有这些遗传特点的植物，具有作为自身或自行固氮机制起作用的能力。自身或自 行固氮是指细胞（植物细胞）、植物或植物的部分如根或叶能够将氮固定成氨。这不是通过 与其他生物体例如根瘤菌的共生。可替选的序列可以用于目标植物。例如，Nif-D可以用 每个其他Nif-D的编码序列代替，同样的角色分别适用于Nif-K和Nif-H。
[0041] 一旦将植物如本文中所述进行遗传修饰后，它能够自生物固氮，并且可以被用于 在植物中产生固氮。新的工程化改造的植物将产生可用于植物使用或动物使用的形式的 氮。
[0042] 任何植物都可以使用本发明，如番前植物（lycopersicumsp.)或烟草植物 (Nicotanatabacom)。它们可用作商业化产品，作为农业传播，作为农业初生主根（使用嫁 接技术）或作为用于植物研宄的模型植物生物体。
[0043] 在某些实施方式中，Nif基因的来源（被称为编码序列或mRNA、RNA或DNA)可以 是细菌载体。Nif基因存在于独特的光合细菌如蓝细菌中。Nif-H基因在植物细胞中、在质 体或叶绿体中的表达允许Nif-H蛋白有时间组装成有活性的酶，其可以在功能上用作Nif D-K复合体的专性电子供体。这种表达允许Nif-H作为固氮酶还原酶起作用。在某些实施 方式中，Nif基因通过合成产生，并且不存在于自然界中。参见例如SEQ.ID.NO. 29-40。
[0044]Nif-D基因和Nif-K基因在植物细胞中或叶绿体中的表达允许积累Nif-D-K蛋白。 上述基因在植物细胞和/或质体内的表达被称为固氮酶Mo-Fe蛋白，并起到亚基固氮酶的 作用。上述操作的组合产生能够固定/提供一些或所有其氮需求的植物。能够固氮的植物 将更加强壮，因为它不需依赖于共生细菌，它也不依赖于化学或有机氮源。Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因在植物细胞中的使用，模拟了细菌或原核生物在固氮中的核心途径的功能。
[0045] 以Nif-H、Nif-K和Nif-D的任何组合积累Nif蛋白的植物细胞，将氮固定成可消 耗的形式之一（氨（NH3))，然后转变成铵（NH4)。从核表达一种或所有上述蛋白，可以将它 靶向到植物质体，以允许更好地控制有功能的Nif复合体（Nif-H和Nif-D-K)的时间和积 累，如图6所示。
[0046] 提供了一种用于产生具有改进的自身/自行固氮情况的转基因植物的方法，其中 所述转基因植物在其基因组中或其质体基因组中包含Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的组合， 以便允许所述植物模拟细菌或原核生物用于固氮的核心途径。所述方法包括通过将重组的 Nif-H、Nif-D和Nif-K基因插入到宿主植物的基因组中来转化宿主植物，其中Nif-H、Nif-D 和Nif-K基因分别被可操作连接到启动子序列、终止子序列和任选的编码靶向信号或转运 肽的DNA序列，所有这些序列在所述宿主植物中有活性。在某些实施方式中，重组的Nif-H、 Nif-D和Nif-K基因包含在SEQID.N0.1中。在某些实施方式中，重组的Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因包含在SEQID.NO. 2中。在某些实施方式中，重组的Nif-H、Nif-D和Nif-K基 因包含在SEQID.NO. 3中。正如本领域普通技术人员将会认识到的，由于SEQID.NO. 1和 2各自包含由SEQID.NO. 4A指定的启动子，因此当使用SEQ.ID.NO. 1或SEQ.ID.NO. 2时不 需将另外的启动子转化到宿主植物中。同样地，由于SEQID.NO. 3包含由SEQID.NO. 4B指 定的启动子，因此当使用SEQ.ID.NO. 3时不需将另外的启动子转化到宿主植物中。或者，可 以通过添加转运肽将序列转化到核中，并且产物将积累在质体中。
[0047]在某些实施方式中，根据本公开的原理，提供了一种产生具有改进的自身/自行 固氮情况的转基因植物的方法，所述转基因植物在其基因组（质体基因组）中包含Nif-H、 Nif-D和Nif-K基因的组合，以便允许所述植物模拟细菌或原核生物用于固氮的核心途 径，其中所述方法包括下列步骤：将一个或多个植物细胞与编码可操作连接到启动子例如 rrnl6启动子的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的重组核酸序列相接触；从所述植物细胞再生 一株或多株植物；以及选择从所述植物细胞培养的一株或多株植物，其中所选的植物各自 表现出增强的固氮，其中所选的植物各自包含编码所述可操作连接到rrnl6启动子的重组 核酸序列的重组核酸序列。这种方法示出在图7的部分B中。在一种实施方式中，编码 Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的重组核酸序列被可操作连接到单一启动子例如rrnl6启动子。 在某些实施方式中，所述重组核酸序列包括SEQ.ID.N0. 1-3和SEQ.ID.N0. 49中的至少一个 的至少一部分。
[0048]在某些实施方式中，根据本公开的原理，提供了一种产生具有改进的自身/自行 固氮情况的转基因植物的方法，所述转基因植物在其基因组中包含Nif-H、Nif-D和Nif-K 基因的组合，以便允许所述植物模拟细菌或原核生物用于固氮的核心途径，其中所述方法 包括下列步骤：将一个或多个植物细胞与编码可操作连接到启动子的NifH基因的重组核 酸序列相接触；将所述植物细胞与编码可操作连接到启动子的Nif-D基因的重组核酸序 列相接触；将所述植物细胞与编码可操作连接到启动子的Nif-K基因的重组核酸序列相 接触；从所述植物细胞再生一株或多株植物；以及选择从所述植物细胞培养的一株或多株 植物，其中所选的植物各自表现出增强的固氮，其中所选的植物各自包含编码Nif-H基因、 Nif-D基因和Nif-K基因的重组核酸序列，其中编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的核酸序 列各自可操作连接到启动子。这种方法示出在图7的部分A中。
[0049] 在某些实施方式中，编码Nif基因（Nif-H、Nif-D、Nif-K)的重组核酸序列包括基 本上由SEQ.ID.N0. 29-40构成的组中的至少三个序列。在某些实施方式中，编码Nif-H基 因的重组核酸序列选自基本上由SEQ.ID.N0. 29、32、35和38构成的组。在某些实施方式中， 编码Nif-D基因的重组核酸序列选自基本上由SEQ.ID.N0. 30、33、36和39构成的组。在某 些实施方式中，编码Nif-K基因的重组核酸序列选自基本上由SEQ.ID.N0. 31、34、37和40 构成的组。在某些实施方式中，启动子选自基本上由SEQ.ID.N0. 41-45构成的组。在某些 实施方式中，分别编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的核酸序列存在于自然界中发现的单一 生物体中。在某些实施方式中，分别编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的核酸序列存在于自 然界中发现的不同生物体中。在某些实施方式中，编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的每个 核酸序列是合成的，并且在自然界中没有被发现。在某些实施方式中，至少一个编码Nif-H、 Nif-D和Nif-K基因之一的核酸序列存在于自然界中，并且至少一个编码Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因之一的核酸序列是合成的，并且在自然界中没有被发现。在某些实施方式中，每 个编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因之一的核酸序列包含终止子。在某些实施方式中，Nif-H、 Nif-D和Nif-K基因中的至少一个连接到与Nif-H、Nif-D和Nif-K基因中的另一个不同的 启动子。在某些实施方式中，启动子包含SEQ.ID.N0. 4和/或SEQ.ID.N0. 28。在某些实施 方式中，每个Nif-H、Nif-D和Nif-K基因被连接到相同类型的启动子，例如rrnll6启动子。
[0050] 在某些实施方式中，在前面任一段中讨论的方法包括至少一个下列步骤：鉴定目 标生物体；确定所述目标生物体是否更好地适合于核转化或质体转化；鉴定包含Nif?基因 的供体生物体的蛋白序列；使用通用遗传密码子将所述蛋白序列反向翻译成DNA;为目标 生物体（即番茄植物）优化编码DNA序列（CDS);合成合成的CDS;添加启动子和终止子； 将所述CDS转化到用于稳定或瞬时转化的植物中；以及通过一种或多种下列测定法测定固 氮酶活性:ARA，15N稳定同位素掺入，或在剥夺氮的培养基上生长的能力。在某些实施方式 中，Nif-H、Nif-D和Nif-K基因全部都连接到相同启动子作为一个操纵子，例如rrnll6启 动子。
[0051] 在某些实施方式中，供体生物体包括行光合作用并具有固氮能力的单细胞蓝细 菌。在某些实施方式中，供体生物体的Nif基因通过blastN或通过查阅文献来鉴定。在某 些实施方式中，鉴定 到的Nif基因包括Nif-H、Nif-D和Nif-K基因。在某些实施方式中，用 于目标生物体的编码DNA序列使用核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco)的特别 密码子用法来优化，以便不忽略使用频率较低的密码子，这与仅使用最频繁的密码子并忽 略所有其他密码子的常用密码子用法优化程序不同（SeqID.N0. 35-37)。在某些实施方式 中，用于目标生物体的编码DNA序列使用标准密码子优化程序和核酮糖-1，5-二磷酸羧化 酶/加氧酶的大多数用法来优化，SEQID.N0. 29-36。在某些实施方式中，用于目标生物体 的编码DNA序列使用全部叶绿体已知的用法密码子来优化，SEQNO. 38-40。
[0052] 根据本公开的原理，提供了一种转基因植物，其具有改良的固氮生产情况，并在其 基因组中包含可操作连接到启动子序列和终止子序列的重组Nif-H、Nif-D和Nif-K基因。
[0053] 图1示出了固氮酶复合体的示意结构。它由两个Nif-H蛋白和4个作为辅因子的 铁原子形成（同二聚体）。Nif-K蛋白与两个Nif-D亚基形成异二聚体，并且Nif-K的两个 亚基使用钼作为辅因子。
[0054] 在本公开的另一方面，提供了自身或自主生物固氮（BNF)的作物。例如，番茄植物 (lycopersiconsp.)可以携带固氮酶还原酶（Nif-H和NifD-K)的表达的基因，以使它可以 模拟细菌的途径。固氮酶还原酶（Nif-H和NifD-K)的核酸序列作为SEQ.ID.NO. 1和2被 提供，如图6中所示，SEQ.ID.N0. 29。
[0055] 在另一种实施方式中，根据本公开的原理，在作物和/或任何其他植物中提供了 自身或自主BNF，其中使用密码子替换原始的细菌序列，对目标植物细胞器（质体）中的 Nif基因编码序列进行了优化。例如，番前植物（lycopersiconsp.)可以携带固氮酶还原 酶、即Nif-H和NifD-K的表达的基因，以使它可以模拟细菌的途径。
[0056] 图2和3示出了用于番茄叶绿体转化的质粒（PGE003)的生产步骤的示意图。使 用聚合酶链反应（PCR)，通过特异性引物或寡核苷酸（表1)扩增DNA，然后用限制性酶消化 并连接到质粒的上部。在经过4个步骤后，产物含有2个被称为tRNA-FM和t-RNA-G的叶 绿体同源位点，带有几个独一无二的克隆位点，随后是PsbA终止子。
[0057] 图3示出了用于番茄叶绿体的转化以及番茄植物转化所必需的Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因的表达的质粒的生产步骤的示意图。使用聚合酶链反应（PCR)，通过特异性引物 或寡核苷酸（表1)扩增DNA，然后用限制性酶消化并连接到质粒中。在1个或2个步骤后， 制成含有Nif基因和编码序列的质粒。通过使用切割工具例如限制性酶，将三个基因即Nif 基因、报告物基因和选择性标志物例如aadA作为一个簇进行克隆。
[0058] 图4示出了作为单一操纵子插入到莱茵衣藻（C.reinhardtii)的叶绿体或其他叶 绿体中的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因。叶绿体含有原核基因表达系统，允许所述操纵子表 达。由光合作用提供的电子和ATP允许固氮酶发挥作用，导致NH4的产生。藻类的铁氧化 还原蛋白（Fd)介导电子从光系统I(PSI)传递到固氮酶的Nif-H/Fe-蛋白。本公开提出， 由于其最初来源，所述Nif复合体对氧不太敏感，并且Fe-蛋白（Nif-H)能够将电子向前传 递到nif-K，以协助自行/自身固氮。
[0059] 设想了本发明的原理可以应用于任何植物例如水稻、玉米、马铃薯、南瓜、烟草、棉 花、拟南芥和树木例如苹果、樱桃、胡桃，也可应用于绿藻以及其他植物。例如，为了将所述 技术应用于衣藻（绿藻），通过具有SEQ.ID.No. 3的合成基因的合成来优化编码序列。
[0060] 本公开的另一种实施方式提供了使用转基因植物（遗传修饰生物体（GM0))来降 低对氮肥的需要或需求的方法。本公开的另一种实施方式提供了使用转基因植物（遗传修 饰生物体（GM0))来代替氮肥的方法（例如，GM0可以用作植物肥料）。
[0061] 下面提供的实施例描述了植物即番茄植物的遗传操作，以便获得自身固氮的能 力。
[0062] 实施例：产牛用于番前质体转化的质粒
[0063] 在本公开中，利用原核生物或细菌的固氮酶和BNF在植物中生产氨和/或铵。这些 转基因植物在用具有BNF编码的质粒转化后，具有产生其所有或部分氮需求的能力。适合 于人类消费的作物例如番茄、水稻或小麦，以及适合的园艺植物如花、草和树木，包括其他 植物和藻类，也可以被转化以自行/自身固氮。由于这些质粒在自然界中不存在，因此使用 合成生物学来产生能够使细胞/植物自行/自身固氮的人造质粒。所述人造质粒含有CDS 的修饰以及控制序列，以执行例如在植物中表达和积累固氮酶的新任务。
[0064] 实施例：遗传材料的分离
[0065] 植物DNA分离：使用3-4周的番前幼株，使用DNeasyPlantMiniKit(Qiagene Germany)来分离基因组（核）和质体DNA。纯DNA被用于完成目标DNA序列的PCR扩增。
[0066] 使用SEQ.ID.N0. 5、6、7和8(参见表1)，通过特异性PCR反应来扩增番茄DNA。这 产生番茄重组位点（SEQ.ID.N0. 5、6、7和8(参见表1))和PsbA终止信号（SEQ.ID.N0. 17 和18)。所有三个PCR产物来自于（番茄）质体DNA。
[0067]PsbA是D1蛋白（也称为PsbA)的基因，其形成光系统II反应中心的反应核心。 公知它是组成性表达的基因。
[0068] 然后将PCR扩增的DNA用于限制性酶消化，以在分别附连到每个PCR产物SEQ. ID. N0. 5、6、7、8、17和18的SacI-SacII、XhoI-KpnI和BamHI-AscI上产生粘端或粘性末端。[0069] 粘端或粘性末端是当限制性酶产生3'或5'悬端时所使用的术语。这些悬端在大 多数情况下是回文的（对称的）。每个粘性末端将被专有地连接到它的互补序列。连接的 或连接是指DNA分子的两个末端的共价连接反应，其通常由酶例如T4-DNA连接酶执行，但 不限于DNA或将DNA片段"胶粘"在一起的DNA连接酶。
[0070] 将限制性消化的PCRDNA，在图2中所示三状态反应中，通过在推荐的制造条件下 完成与T4-DNA连接酶（NEB.USA)的温育，克隆到pBluescript质粒中。
[0071] 为了为多克隆位点（MCS)添加非回文的独特限制性，通过PCR扩增pPZP-RCSII的 MCS，并如图2和图7中所示将其克隆到XhoI-SacI位点中。
[0072] 被命名为PGE003的新质粒，由AMP-R或BLA基因和pBluescript的0RI和番茄 叶绿体的用于同源重组的位点（图2中的TomChll和2)和来自于番茄的PsbA终止子，以 及pPZP-RCSII的MCS人工DNA序列构成。
[0073] 使用这一程序产生的PGE 003质粒具有独特的多克隆位点MCS-unique DNA，其具 有限制性位点，允许使用选自下列限制性酶的限制性酶进行克隆：XhoI，Pi-PspI，I-CeuI， I-Scel，I-Ppol和AscI，允许它依次并定向克隆目的基因。由于Pi-PspI、I-CeuI、I-Scel 和I-Ppol是非回文的，因此粘性末端不对称。因此连接将只在一个方向上发生。
[0074] 实施例：NIF基因的克隆和表达
[0075] 使用具有SEQ.ID.N0. 19和20的寡核苷酸，通过特异性PCR反应扩增番茄DNA，并 克隆到PSAT6-MCS的Agel-BamHI位点中，产生PGE006。这是在Pi-PspI位点之间具有目 的DNA的暂时质粒。通过这个克隆步骤，克隆了来自于番茄DNA的rrnl6基因的启动子。
[0076]pSAT载体是使用归巢内切核酸酶的一系列载体（质粒）。归巢内切核酸酶 是通常具有长的识别位点的限制性酶。这一特征使得它们成为"稀有切割工具"，因 为它们在任何随机选择的DNA中的切割频率是稀少的。例如，pSAT4具有I-Scel位 点AGTTACGCTAGGGATAACAGGGTAATATAGSEQ.ID.No. 25(可以作为GenbankSEQ.ID.No. DQ005466获得）的2个重复序列，并且它们是30个碱基，与此相比常规限制性酶为6-8个 喊基。
[0077] 使用具有SEQ.ID.No. 9和10的寡核苷酸（参见表1)的寡核苷酸，通过特异性PCR 反应对蓝细菌ATCC7120DNA进行PCR扩增，并克隆到（用于植物遗传工程的质粒）（PEG) 006 的（限制性位点）BglII-NotI位点中，产生PGE007,其是具有在rrnl6启动子控制之下的 Nif-H基因的质粒。
[0078]rrnl6启动子是指核糖体RNA16S的质体基因的5'DNA序列，其是质体中公知的表 达启动子并用于本公开中，然而其他可诱导的启动子也是可能的。也就是说，启动子被选择 成可以在希望使植物具有自行/自身氮生产和/或增强的氮摄入、同化或使用能力的任何 情况下可诱导。例如，适合的启动子可以包括但不限于通过使用氮源诱导的、胁迫诱导的、 创伤诱导的或通过使用其他化学物质诱导的启动子。含有本公开的遗传构建物的转基因植 物与对照植物相比表现出提高的农学特性。被提高的具体农学特性通常取决于启动子的本 性，并且可以包括提高的胁迫耐受性和/或更高效的氮摄入、储存或代谢，允许在使用很少 到没有氮肥投入的情况下并且在氮饥饿条件下培养本发明的植物，或允许在正常生长条件 下更快生长、更高的营养体生长和/或繁殖产率。
[0079] 使用具有SEQ.ID.No. 11和12的寡核苷酸（参见表1)，通过特异性PCR反应，对蓝 细菌ATCC7120DNA进行PCR扩增，并将其克隆到pSAT5-MCS的Agel-Xhol位点中，产生带有 Nif-D基因的质粒PGE008。
[0080] 使用具有SEQ.ID.No. 13和14的寡核苷酸（参见表1)，通过特异性PCR反应，对蓝 细菌ATCC7120DNA进行PCR扩增，并将其克隆到的PGE008的Xhol-Notl位点中，产生带有 Nif-D和Nif-K基因的质粒（图5上部中央）。使用具有SEQ.ID.No. 23和24的寡核苷酸 (参见表1)，通过特异性PCR反应，对pPZP-RCSIIDNA进行PCR扩增，并将其克隆到pSAT4 的Agel-Xhol位点中，其产生带有aadA基因的PGE005质粒（图4上部中央）。aadA是用 于植物转化的报告基因。这个基因编码氨基糖苷3'腺苷基转移酶，其通过腺苷化使壮观霉 素和链霉素失活，并阻止其结合于叶绿体核糖体，允许植物在含有所述抗生素的培养基上 生长。或者，在计算机上进行基础设计后，将完整核酸序列提交到商业化软件中，并通过合 成具有交叠和连续碱基的交叠寡核苷酸（寡核苷酸通常是短的DNA序列）序列并将其彼此 连接以产生完整序列，来产生合成的质粒。使用这种技术允许产生在细胞特异性优化中表 达的新序列。将具有SEQ.ID.N0. 9、11和13的质粒PGE分别用PI-PspI、I-CeuI和I-Scel 消化，并将目的基因例如Nif-H、Nif-D、Nif-K和aadA提供在具有SEQ.ID.NO. 7的同一位点 中，其中具有SEQ.ID.NO. 15的质粒被用于质体。
[0081] 然后将具有SEQ.ID.N0. 2的PGE结合于金粒，并轰击到番茄植株的叶组织中。
[0082] 番茄叶绿体转化允许基于番茄植物中植物质体DNA的已知位点（trnfM和tmG)之 间的同源重组而并入外来DNA。一般来说，每一侧几百碱基对（BP)使它能够将几千新BP转 移到其间（Nif基因）（参见图5)。使用携带这些目的基因的质粒DNA，1)将所述DNA维持 在细菌例如大肠杆菌（E.Coli)中；2)促进CDS的突变；以及3)将质粒DNA结合到金粒并 将它轰击到番茄植株的叶组织。添加选择性标志物如aadA并在含有链霉素或壮观霉素抗 生素的植物培养基上选择被转染的组织，将导致杀死不含"标志物"的细胞。几周后，存活 的细胞将含有转基因质体（叶绿体）同型质体，表明所有叶绿体是一致的并含有新基因，这 可以通过简单的位点特异性PCR试验来证明。取决于培养基中的激素浓度，植物的叶将发 育成新植株（再生）。
[0083] 转基因植物将表达Nif-H、Nif-D和Nif-K或这三个基因中的任两个的Nif操纵 子。术语"操纵子"是指以DNA序列的顺序组织并一起转录的几个基因。基因是指可以被 转 录成RNA分子和/或翻译成蛋白质或肽的DNA序列或一部分DNA序列。
[0084] 在将质粒DNA轰击到叶后，发生异源重组。作为植物细胞生命周期的正常部分，两 个分子（质粒DNA和质体DNA)将根据重组位点之间的相似性更换部分植物的DNA。结果， 将在质体DNA中引入额外的一段质粒DNA。
[0085] 当将植物组织暴露于抗生素时，只有能够避免抗生素伤害（对抗生素有抗性）的 质体将会存活，并且最终在几代后，只有转基因的质体存在于每个细胞中。此时，涉及的植 物、细胞或组织被认为是同型质体的。
[0086] 在Magenta箱（具有连接元件的双箱）中，从在MS培养基上萌发的表面除菌的种 子养育无菌番前植株（L.esculentumvar.IAC-SantaClara)。为了进行基因枪轰击，从在 茎切割中突出的腋生分生组织产生的3至4周龄植株（约15cm高）收获幼叶。将同型质体 转质体植物和野生型对照植物转移到土壤，并在植物生长箱中生长至成熟（16小时光照，8 小时黑暗，24°C)。对照植物在相同条件下生长。
[0087]使用DuPontPDSlOOOHe基因枪和 1，100p.s.i.防爆盘（BioRad Laboratories,Hercules,CA)，通过用质粒DNA包被的直径0. 6ym的金粒对番前的无菌幼 叶进行基因枪轰击，来实现番茄植物的质体转化。将轰击过的叶样品切成小片（3X3mm)，转 移到含有壮观霉素（300 - 500mg/L)的RM0P培养基，并在弱光（25yE;16h光照，8h黑暗） 下温育3至4个月。最初的壮观霉素抗性株系被鉴定为黄色或浅绿色的生长的愈合组织。 将愈合组织小片转移到相同培养基进行进一步繁殖，并分离同型质体转质体组织。为了进 行植株再生，将同型质体愈合组织转移到琼脂固化的含有0. 2mg/LIAA和3mg/LBAP的MS 培养基的表面上。或者，使用相同培养基，但用2mg/L玉米素代替BAP，获得幼苗诱导。为了 生根，将再生的幼苗转移到含有无植物激素的MS培养基的箱中。RN0P培养基是用生长激素 支持的MS:NAA0?lmg/L，BAPlmg/L，和维生素硫胺素lmg/L，肌醇100mg/l，30g鹿糖作为碳 源。
[0088] 可替选的基因或蛋白可用于本发明，例如在表2中提出的基因，这是由于微生物 如蓝细菌具有微生物多样性。由于一些基因不一致但相似并且功能几乎一致，因此可以使 用不同来源的Nif-D、Nif-H、Nif-K和CDS。
[0089]图5示出了在萌发后三周时番茄植株的发育。左侧盆在种植时提供了单剂肥料， 在右侧盆中没有向植物添加肥料。将它们一起保持在正常大田条件下，右侧的尺寸标志是 1英寸。
[0090] 图6示出了Nif-H在植物细胞中的定向和积累。具体来说，（A)来自于 Leptolyngbyanodulosa的非异形胞蓝细菌的NifH，起到用于Nif-H-GFP合成的模板的作 用。对于转运肽来说，在5'末端处添加编码番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶转运 肽的210个碱基。使用空载体作为对照。（B)示出了通过共聚焦显微术摄下的叶绿体自体 荧光和GFP。重叠的（合并的）图像证实了TP-NifH-GFP可以在叶的叶绿体处积累，并且 不能在细胞的其他部分和细胞器处检测到。
[0091] 可以使用的另一个实例是单细胞藻类莱茵衣藻（Chlamidomonasreinhardtii)， 其可以用作生物燃料或生物柴油生产的模型或作为绿色肥料，将它用含有来自于蓝细菌SEQNo. 1-3(或其他固氮细菌）的NifH和NifD和NifK的基因序列并具有允许在质体中表 达的特殊元件、即启动子和翻译起始序列以及同源重组序列的DNA进行遗传转化。
[0092] 得到的遗传修饰的莱茵衣藻（C.reinhardtii)将携带并表达固氮酶还原酶的基 因，模拟细菌用于固氮的途径。通过遗传工程改造的莱茵衣藻（C.reinhardtii)在植物中 利用BNF进行固氮，产生可用于植物或动物消费的有机形式的氮。许多藻类可以使用这种 技术，仅需要少量调整以获得商业化产品，产生更快的生长和环境友好的结果，其成本比传 统肥料低15-35%。当转化藻类时，Nif基因的来源是光合蓝细菌。使用这些Nif基因确保 了转化的藻类能够利用所述酶进行代谢。
[0093] 本公开描述了一种新的质粒，其允许将Nif?基因作为一个操纵子表达。这种独特 的构造避免了以前实验的复杂情况，即引起单个和分开的基因两者的表达。
[0094] 随着细菌基因组序列变成公开的知识，Nif基因的其他来源和Nif基因的 分离将变得完善。蓝细菌的Nif基因可以通过扩增特定靶基因来获得。例如，在念 珠藻Nostocsp.PCC7120登记号BA000019. 2 (NCBI)的基因组序列中，可以使用基 因的最前和最后24个碱基，始于ATGACTGACGAAAACATTAGACAG(SEQ.ID,No. 3)并止于 ATGACTGACGAAAACATTAGACAGA(SEQ.ID.No. 25)，通过PCR容易地扩增Nif-H。向每个引物 的开始部分添加限制性位点，允许人们将PCR产物克隆在编码序列内不存在的特异性位点 中，例如用于第一引物的Xhol位点：CTCGAG-ATGACTGACGAAAACATTAGACAG(SEQ.ID.N0. 26) 和用于第二引物的Xbal位点TCTAGA-ATGACTGACGAAAACATTAGACAGA(SEQ.ID,No. 27)。这使 人们能够将NifH基因克隆到Xhol-Xbal位点中。将大小为900bp的PCR产物连接到质粒 例如pBluescript中，然后在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择，允许验证序列。同样 的策略适用于克隆Nif-D和Nif-K基因。
[0095] 实施例：质体转化
[0096] 允许基于植物质体DNA的已知位点如trnfM和tmG之间的同源重组来并入外来 DNA的莱茵衣藻（C.reinhardtii)叶绿体转化，示出在图2-3中，并使用SEQID.N0. 1-3之 〇
[0097] 一般来说，每侧几百碱基对能够将几千个新的DNA碱基对（BP)转移到其间（Nif 基因）。携带这些基因的质粒DNA: 1)在细菌如大肠杆菌中维持DNA;2)允许编码DNA序列 (CDS)的测序和/或突变；以及3)可用于遗传转化。
[0098] 遗传转化（将质粒插入到质体中--参见图7B)包括下列步骤：1)将DNA例如编 码SEQ.ID.N0. 1、SEQ.ID.N0. 2或SEQ.ID.N0. 3的核酸序列吸附在金粒上，并将所述DNA轰 击在莱茵衣藻（C.reinhardtii)细胞上；2)添加选择性标志物例如aadA，并在含有抗生素 例如壮观霉素的藻类生长培养基上选择转化的细胞，以便除去不含转入基因的细胞；3)储 存含有转基因质体的细胞；以及4)使用简单的位点特异性PCR验证所述序列。
[0099] 在修饰后，通过例如乙炔还原来试验莱茵衣藻（C.reinhardtii)的固氮。这个 过程使用气相色谱仪测量作为氮源的乙炔的量，以便提供Nif?酶活性的直接证据。生长 被转化的细菌并将它与野生型进行比较证实了被转化的基因有活性，因此允许莱茵衣藻 (C.reinhardtii)固氮。
[0100] 实施例：核转化（参见图7A)
[0101]烟草棺株的准各:将烟草棺株在萌发后，在Majenta箱中，在MS培养基上，在22°C 下，在长昼生长室中生长3至4周。
[0102]土壤杆菌培养物的制各:通讨在3mlLB+抗生素（例如利福平*10mg/l和壮观霉 素100mg/ml) +质粒序列号PGE0048或PGE0066或PGE0088或PGE0148中将种子培养物生长 过夜（28°C，250rpm，来自于新鲜的重新划线的LB平板），来制备土壤杆菌培养物。将1或 2ml在不含抗生素的50mlLB中稀释并在28°C生长2至6小时，直至0D600 = 0. 6到1. 0。 [0103] 转化步骤:将细菌培养物倾倒在无菌皮氏培养皿中。将烟草植物的叶切成较小的 碎片例如圆盘或正方形，使得所述较小的碎片通常为约2cmx2cm的碎片。
[0104] 向皮氏培养皿中的细菌培养物添加烟草植物的碎片。将皮氏培养皿在22-25°C下 温育约20分钟。将烟草植物的碎片在无菌滤纸上干燥，以消除任何过量的液体。将烟草植 物的干燥碎片置于MR平板上（如果可能，将近轴一侧朝下）。用石蜡封口膜密封平板。
[0105] 或者，可以用0D0. 1的细菌悬液注射烟草植物的一个或多个叶片。然后给予注射 过的叶片48-72小时进行恢复。分析注射过的叶片的Nif?基因的瞬时表达。48-72小时后， 将植物封闭在含有15N稳定同位素的仓室中96小时，然后通过质谱术分析15N在植物的氨 基酸和/或其他分子中的掺入。
[0106]共培养:将叶/碎片在牛长宰中，在22°C淵育3天（长昼）。3天后，通过在水中 含有100mg/l特美汀的无菌水中漂洗来洗涤叶/碎片。将叶/碎片置于MRTK上，其中将叶 /碎片彼此隔开以降低土壤杆菌重新生长的风险。将叶/碎片在生长室中，在22°C下放置 2-3周（长昼）。在叶/碎片的边缘上将出现愈合组织。当在愈合组织上出现小芽时，将它 们重新铺板在MSTK平板上，同时优选地移除周围的愈合组织和叶组织而不损伤小植株。在 约3周（有时更长时间）后，小植株将发育并且出现根，然后可以将小植株重新铺板在MST 平板上（在majenta箱中，在重新铺板在平板上之前切掉根）。然后每3-4周在MSmajenta 箱中重新铺板在平板上。
[0107]培养基组成
[0108]MR=MS培养基（1L)，MS粉 4. 4g，蔗糖 30g，MES0? 5gpH5. 8,琼脂 8.Og。在压热 灭菌后，加入BAPlml储用溶液（lmg/ml)和NAA0?lml储用溶液（lmg/ml)。
[0109] MRTK=与MR相同，但在压热灭菌后，添加特美汀至最终300mg/L(来自于过滤除菌 的储用溶液300mg/ml)和卡那霉素至最终50mg/L(来自于过滤除菌的储用溶液50mg/ml)。
[0110]MSTK=与MRTK相同，不含BAP和NAA，并含有最终300mg/L的特美汀和最终30mg/ L的卡那霉素。
[0111]MST=与MSTK相同，不含卡那霉素，其中特美汀可以被减少到100mg/L，并且在进 一步的重新铺板中完全移除）。
[0112] 序列IDNo. 1:
[0113] 番茄质体转化载体PGE11，完整序列
[0114]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119」
[0121
[0121]
[0122]
[0127] CN104903453A 说明书 24/81 页
[0128]
[0129]
[0130:
[0131」
[0132]
[013^
[0139]
[01刊」
[0141]
[0142]
[0143」
[01
//
[0145] 序列IDNo. 4:
[0146] rrnl6的启动子序列
[0147] 4A> 用于 16S核糖体rrnl6的莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)叶绿体
[0148] Gcctgccaactgcctatatttatatactgcgataaactttagtcccgaaggggtttacatatccgaagg aggaagcaggcagtggcggtaccacgccactggcgtcctaatataaatattgggcaagtaaacttagaataaaattt atttgctgcgttagcaggtttacatactcctaagtttacttgcccgaaggggaaggaggacgtcccctacgggaata taaatattagtggcagtggtacaataaataaattgtatgtaaaccccttcgggcaactaaagtttatcgcagtatta acatcctagtatataaatatcggcagttggcaggcaacaaatttatttattgtcccgtaaggggaaggggaaaacaa ttattattttactgcggagcagcttgttattagaaatttttattaaaaaaaaaataaaaatttgacaaaaaaaaata aaaaagttaaattaaaaacactg ggaatgttctaacaatcataaaaaaatcaaaagggtttaaaatcccgacaaaat ttaaactttaaagagt
[0149] 4B>用于16S核糖体rrnl6的番前Solanum lycopersicum叶绿体
[0150] _
[0151] cgtcgttcaatgagaatggataagaggctcgtgggattgacgtgagggggcagggatgactatatttct gggagcgaactccgggcgaatatgaagcgcatggatacaagttatgccttggaatgaaagacaattccgaatccgct ttgtctacgaacaaggaagctataagtaatgcaactatgaaggatct
[0152]表1
[0153]
[0154]表2:
[0155]
[0156]表3 - SEQ. ID. NO. 46
[0157]用于瞬时和稳定转化的植物核酸酶转化质粒Nptll TP Nif HDK42PGE#0088
[0158] 特征 定位/限定词
[0159]
[0160」
[0161]
[0162]
[0163」
[0164]
[0165」
[01 CN104903453A 说明书 49/81 页
[0IO/j
[01
[01
//
[0170]表 4 -SEQ.ID.NO. 47
[0171] 用于瞬时和稳定转化的植物核酸酶转化质粒NptllTPNifHDK101PGE#66
[0172]
[0173]
[017*r」 CN 104903453 A 1兄明书 54/81页
[0175]
[0176]
[0177.
[0178]
[0179」
[0180」
[0181」
[018_」
[0186」
[0187] CN104903453A 说明书 65/81 页
[018toj
[0189:
[0190]
[0191」
[0192:
//
[0193]表6 -SEQ.ID.NO. 49
[0194]
[0195]
[0196]
[0198」
[0199」
[0200]
[0201
[02G^j
[0203]
[02C
[0205] //
[0206] 应该理解，可以对本文中公开的程序和实施方式进行各种不同的修改。因此，上面 的描述不应被解释为限制，而是仅仅作为各种不同实施方式的示例。本领域技术人员将设 想在权利要求书的范围和精神之内的其他修改。
【主权项】
1. 一种表现出增强的固氮的转基因植物，其通过包含下列步骤的方法来产生： 将一个或多个植物细胞与编码可操作连接到启动子序列和终止子序列的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的重组核酸序列相接触； 从所述植物细胞再生一株或多株植物；以及 选择从所述植物细胞培养的、表现出增强的固氮的一株或多株植物，其中所述一株或 多株植物包含编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重组核酸序列。2. 权利要求1的转基因植物的种子、茎、叶或根，其中所述种子、茎、叶或根包含编码 Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重组核酸序列。3. 权利要求1中叙述的转基因植物，其中所述转基因植物选自油菜、玉米、水稻、烟草、 大豆、棉花、苜蓿、番茄、小麦、马铃薯和大麦。4. 权利要求3中叙述的转基因植物，其中所述转基因植物是番茄或烟草。5. 权利要求1的转基因植物的后代，其中所述后代包含编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基 因的所述重组核酸序列。6. 权利要求3的植物的后代，其中所述后代包含编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所 述重组核酸序列。7. 权利要求4的植物的后代，其中所述后代包含编码Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所 述重组核酸序列。8. 权利要求1中叙述的转基因植物，其中选择一株或多株植物的步骤包括在低氮输入 条件下生长所述一株或多株植物。9. 权利要求1中叙述的转基因植物，其中与一个或多个细胞相接触的编码Nif-H、 Nif-D和Nif-K基因的所述重组核酸序列，从选自蓝细菌、固氮菌科、根瘤菌和弗兰克氏菌 的来源获得。10. -种用于降低土壤中的总氮浓度的方法，所述方法包括： 将权利要求1的转基因植物放置成与所述土壤相接触，使得当所述转基因植物生长 时，来自于所述土壤的氮被利用，由此降低所述土壤中的总氮浓度。11. 一种表现出增强的固氮的转基因植物，其通过包含下列步骤的方法来产生： 将植物细胞与编码SEQ.ID.NO. 1、SEQ.ID.NO. 2和SEQ.ID.NO. 3之一的重组核酸序列相 接触，以产生转基因植物； 从所述植物细胞再生一株或多株转基因植物；以及 选择从所述植物细胞培养的一株或多株转基因植物，其中所选的转基因植物各自表现 出增强的固氮， 其中所选的一株或多株转基因植物各自包含编码SEQ.ID.No. 1、SEQ.ID.No. 2或SEQ.ID.NO. 3的所述重组核酸序列。12. 权利要求11的转基因植物的种子、茎、叶或根，其中所述种子、茎、叶或根包含编码 SEQ.ID.NO. 1、SEQ.ID.NO. 2 和SEQ.ID.NO. 3 之一的所述重组核酸序列。13. 权利要求11中叙述的转基因植物，其中所述转基因植物选自油菜、玉米、水稻、烟 草、大豆、棉花、苜蓿、番茄、小麦、马铃薯和大麦。14. 一种植物来源的商业化产品，其源自于按照权利要求11的方法产生的转基因植 物，其中所述转基因植物包含编码SEQ.ID.NO. 1、SEQ.ID.NO. 2和SEQ.ID.NO. 3之一的重组 核酸序列。15. 权利要求14中叙述的植物来源的商业化产品，其中所述商业化产品是纸浆、纸张、 纸制品、木材、香烟、雪茄、嚼烟、面包、面粉、谷物、燕麦餐或大米。16. -种用于降低土壤中的总氮浓度的方法，所述方法包括： 将权利要求11的转基因植物放置成与所述土壤相接触，使得当所述植物生长时，来自 于所述土壤的氮被利用，由此降低所述土壤中的总氮浓度。17. -种表现出增强的固氮的转基因植物，其通过包含下列步骤的方法来产生： 将植物细胞与编码SEQ.ID.NO. 1、SEQ.ID.NO. 2和SEQ.ID.NO. 3之一的重组核酸序列相 接触，以产生转基因植物； 将所述植物细胞与被优化用于番茄叶绿体表达的至少一种合成的编码DNA序列 (sCDS)相接触； 从所述植物细胞再生一株或多株转基因植物；以及 选择从所述植物细胞培养的、表现出增强的固氮的一株或多株转基因植物，其中所述 一株或多株植物包含编码SEQ.ID.NO. 1、SEQ.ID.NO. 2或SEQ.ID.NO. 3的所述重组核酸序列 和所述s⑶S。18. 权利要求17所叙述的转基因植物，其中所述转基因植物选自油菜、玉米、水稻、烟 草、大豆、棉花、苜蓿、番茄、小麦、马铃薯和大麦。19. 权利要求17中叙述的转基因植物，其中所述s⑶S包含基本上由SEQ.ID.NO. 29、 SEQ.ID.NO. 30、SEQ.ID.NO. 31、SEQ.ID.NO. 32、SEQ.ID.NO. 33、SEQ.ID.NO. 34、SEQ.ID.NO 35、SEQ.ID.NO. 36、SEQ.ID.NO. 37、SEQ.ID.NO. 38、SEQ.ID.NO. 39 和SEQ.ID.NO. 40 构成的组 中的一个。20. -种用于降低土壤中的总氮浓度的方法，所述方法包括： 将权利要求17的转基因植物放置成与所述土壤相接触，使得当所述植物生长时，来自 于所述土壤的氮被利用，由此降低所述土壤中的总氮浓度。21. -种用于提高土壤中的氮浓度的方法，所述方法包括： 将权利要求17的转基因植物放置成与土壤相接触，使得当所述植物腐败时，所述植物 将氮释放到所述土壤中。22. -种表现出增强的固氮的转基因植物，其通过包含下列步骤的方法来产生： 将植物细胞与编码SEQ.ID.NO. 46、SEQ.ID.NO. 47、SEQ.ID.NO. 48 和SEQ.ID.NO. 49 之一 的重组核酸序列相接触，以产生转基因植物； 从所述植物细胞再生一株或多株转基因植物；以及 选择从所述植物细胞培养的一株或多株转基因植物，其中所选的植物各自表现出增强 的固氮， 其中所选的一株或多株转基因植物各自包含编码SEQ.ID.NO. 46、SEQ.ID.NO. 47、SEQ.ID.NO. 48或SEQ.ID.NO. 49的所述重组核酸序列。23. 权利要求22的转基因植物的种子、茎、叶或根，其中所述种子、茎、叶或根包含编码 SEQ.ID.NO. 46、SEQ.ID.NO. 47、SEQ.ID.NO. 48 和SEQ.ID.NO. 49 之一的所述重组核酸序列。24. 权利要求22中叙述的转基因植物，其中所述转基因植物选自油菜、玉米、水稻、烟 草、大豆、棉花、苜蓿、番茄、小麦、马铃薯和大麦。25. -种转基因植物来源的商业化产品，其源自于按照权利要求22的方法产生的转 基因植物，其中所述转基因植物包含编码SEQ.ID.NO. 46、SEQ.ID.NO. 47、SEQ.ID.NO. 48和 SEQ.ID.NO. 49之一的重组核酸序列。26. 权利要求25中叙述的转基因植物来源的商业化产品，其中所述商业化产品是纸 浆、纸张、纸制品、木材、香烟、雪茄、嚼烟、面包、面粉、谷物、燕麦餐或大米。27. -种用于降低土壤中的总氮浓度的方法，所述方法包括： 将权利要求22的转基因植物放置成与所述土壤相接触，使得当所述植物生长时，来自 于所述土壤的氮被利用，由此降低所述土壤中的总氮浓度。28. -种表现出增强的固氮的转基因植物，其通过包含下列步骤的方法来产生： 将一个或多个转基因植物细胞与编码可操作连接到第一启动子的Nif-H基因的重组 核酸序列相接触； 将所述转基因植物细胞与编码可操作连接到第二启动子的Nif-D基因的重组核酸序 列相接触； 将所述转基因植物细胞与编码可操作连接到第三启动子的Nif-K基因的重组核酸序 列相接触； 从所述植物细胞再生一株或多株转基因植物；以及 选择从所述植物细胞培养的一株或多株转基因植物，其中所选的转基因植物各自表现 出增强的固氮， 其中所选的转基因植物各自包含编码Nif-H基因的重组核酸序列、编码Nif-D基因的 重组核酸序列和编码Nif-K基因的重组核酸序列。29. 权利要求28中叙述的转基因植物，其中所述编码Nif-H基因的重组核酸序列选自 基本上由SEQ.ID.NO. 29、32、35和38构成的组。30. 权利要求28中叙述的转基因植物，其中所述编码Nif-D基因的重组核酸序列选自 基本上由SEQ.ID.NO. 30、33、36和39构成的组。31. 权利要求28中叙述的转基因植物，其中所述编码Nif-K基因的重组核酸序列选自 基本上由SEQ.ID.NO. 31、34、37和40构成的组。32. 权利要求28中叙述的转基因植物，其中所述第一启动子选自基本上由SEQ. ID.NO. 41-45构成的组。33. 权利要求28中叙述的转基因植物，其中所述第二启动子选自基本上由SEQ. ID.NO. 41-45构成的组。34. 权利要求28中叙述的转基因植物，其中所述第三启动子选自基本上由SEQ. ID.NO. 41-45构成的组。 3 5.权利要求2 8中叙述的转基因植物，其中所述启动子中的至少一个包含SEQ.ID.NO. 4 或SEQ.ID.NO. 28。
【专利摘要】本发明提供了一种通过将细菌的nif(固氮)基因定向到植物质体或在植物质体中表达，来工程化复制光合细菌例如蓝细菌或其他细菌的固氮机制的转基因植物的方法。提供了一种使用复制光合细菌的固氮机制的植物来降低土壤中的总氮浓度的方法。还提供了复制光合细菌的固氮机制的植物的后代。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN104903453
【申请号】CN201380069376
【发明人】阿迪·查尔兹曼
【申请人】阿迪·查尔兹曼
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年12月2日
【公告号】CA2893136A1, EP2925870A2, US20140196178, WO2014088943A2, WO2014088943A3
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