大规模生产果实细胞的方法
大规模生产果实细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大规模生产果实细胞的方法。本发明的一个实施方案涉及大规模体外 生产果实细胞的方法，其包括初级和次生代谢物。
【背景技术】
[0002] 大规模方法为本领域已知且为工业化生产各种材料所必需。由于大规模方法不能 通过与小规模方法相同的方式进行，因此即使存在小规模生产方法，也必须设计大规模生 产材料的特定方法。
[0003] 营养保健品有时是使用合成方法制备的，提供希望的活性成分，如多酚，其是在果 实细胞中天然发现。然而，使用合成方法未与活性成分一起提供有时有助于配制物的效力 的天然成分。
[0004] 其它类型的营养保健品是从天然植物中制备的；然而，所有已知的从植物中制备 营养保健品的大规模生产方法包括从制备的植物细胞中提取，以获得希望的活性成分。然 而，当提取例如含有多酚的植物时，最终产物也许是苦味的。仅一部分植物可以被成功提 取，因为仅其含有希望量的活性成分。
[0005] 制备果实细胞的小规模方法为本领域已知；然而，大规模方法更难以设计，因为其 趋于扩大初级代谢物的生产，同时使次生代谢物的产生最小化。由于活性成分如多酚是次 生代谢物，因此其大规模生产是复杂的。
[0006] 已知源自含有多酚的果实的营养保健品的有益作用。红葡萄酒作为这些调节性 成分的来源的用途因为其较高的乙醇含量和糖分而受限。此外，已经显示葡萄酒和酿酒葡 萄的治疗性作用依赖于种类、位置、年份（年度气候）、加工等，及因此依赖红葡萄酒、葡萄 或葡萄种子作为这些调节性化合物的来源导致无法进行原材料的均一的或一致的供应。此 外，果实通常被残余的杀真菌剂、病原体、杀虫剂和污染物等污染。
[0007] 此外，来自红葡萄酒和果实提取物的多酚的胃肠道输送的潜在益处受限于其靶组 织和细胞的生物利用度。由于其通过肠道时的生物利用度的明显差异，在指定食物中某一 多酚的丰度与其作为体内活性化合物的浓度之间无相关性可描绘。例如小肠中类黄酮的吸 收范围为剂量的0-60%范围，消除半衰期为2-48小时。大多数多酚在肠道中经历广泛代 谢，主要以甲基葡糖苷酸或葡糖苷酸硫酸盐形式存在于血清和尿液中。在已知的多酚中， 在红葡萄、红葡萄酒及其它食物如不同种类的浆果和花生中发现的植物抗毒素白藜芦醇 (反式-3, 5, 4' -三羟基芪）（RES)已经引起众多关注。确信其是造成"法国悖论（French paradox) "的原因，这是与尽管高脂饮食但心血管疾病的低发生率相关的一个现象，是适度 引用红葡萄酒的结果。然而，RES的物理化学性质如低水溶性及其高肝脏摄取有损于其生物 利用度。此外，由于快速和广泛代谢随之形成各种代谢物，RES的口服生物利用度非常低。
[0008] 关于RES活性和作用的研宄主要依赖于白藜芦醇的三个来源，即纯合成的RES，天 然植物来源的RES(例如Poligonumcupcidatum提取物）产物，或者较低程度的完整红葡 萄或其产物（红葡萄酒、葡萄汁、葡萄提取物）。红葡萄细胞（RGC;FruituraBioscience Ltd,Israel)是一种天然的专利保护的培养细胞配制物，源自葡萄（VitisviniferaL.)栽 培品种的果实，包含多酚的全部基质，包括白藜芦醇及天然存在于红葡萄中的其它成分。
[0009]RES结构中的芳香基团使其可以作为抗氧化剂及防止在疾病过程中的重要反应， 如在动脉粥样硬化中发生的LDL氧化。RES也显示调节慢性疾病如癌症和糖尿病的炎性应 答。动物研宄已经显示RES参与减弱疼痛以及急性炎症。
[0010] 因此，需要从天然材料制备果实细胞的大规模方法，包括产生果实细胞的初级及 次生代谢物。需要可以在大规模生产方法中制备的天然（植物）组合物，其中活性成分的 量是一致及复现的（例如克隆制品），是高生物利用度的，及易于施用以治疗和预防各种疾 病和失调。
【发明内容】
[0011] 在本发明的实施方案中，提供了体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织 培养物的大规模方法，包括：将葡萄细胞在瓶中生长；将葡萄细胞从瓶接种到第一生物反 应器中；将葡萄细胞从第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中另一个生物反应 器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，及其中第一生物反应器和另一生物反应器 至少一个是一次性的；及从最后的生物反应器中收获葡萄细胞；其中将从最后的生物反应 器中收获的葡萄细胞干燥。
[0012] 在本发明的一些实施方案中，用于所述方法中的每个生物反应器的大小大于葡萄 细胞先前在其中生长的生物反应器的大小。
[0013] 在本发明的一些实施方案中，如果所述另一个生物反应器是中间生物反应器，则 进行将葡萄细胞接种于另一中间生物反应器或者接种于最后的生物反应器的额外步骤。
[0014] 在本发明的一些实施方案中，第一生物反应器或另一个生物反应器是4-10、 10-50、50-200、200-1000 或 1000-5000 升生物反应器。
[0015] 在本发明的一些实施方案中，葡萄细胞在Gamborg B5培养基中生长。
[0016] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基补充有（enrichedwith)镁、磷 酸盐或硝酸盐或者其组合。
[0017] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基补充有KN03、MgS04、MgN03或 NaH2P04或其组合。
[0018] 在本发明的一些实施方案中，一次性生物反应器是由一或多层聚乙烯制成的。
[0019] 在本发明的一些实施方案中，一次性生物反应器是由聚乙烯内层和外层及中间尼 龙层制成的。
[0020] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基不包含植物激素。
[0021] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基包含植物激素。
[0022] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基补充有2-4%的蔗糖。
[0023] 在本发明的一个实施方案中，提供粉末形式的组合物，其包含在大规模生产方法 中体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物，其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组 织培养物源自一或多个葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或无 种子栽培种的葡萄胚或者葡萄种皮；其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含白藜 芦醇的量为至少l〇〇〇mg/kg粉末。
【附图说明】
[0024] 本发明附图（仅作为示例）加以描述。具体关于附图的详细描述，需要强调的是 图中显示的事项只是为了举例及论述本发明优选的实施方案，及是为了提供确信最有效和 易于理解的本发明的原理描述和观点而呈现。在这方面，未尝试显示比基本理解本发明必 需的更详细的本发明的结构详情，结合附图的描述使得本领域技术人员了解可以实施的本 发明的一些形式。
[0025] 图1证实在角叉菜胶注射之前用RGC制备物、吲哚美辛和水（作为对照）处理的 大鼠中足水肿的测量（体积％ )，。使用重复测量的双向ANOVA，然后用Bonferroni事后检 定进行统计学分析。对照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小时显示统计学显著 差异（p〈0. 001)。对照组与RGC-制备物（3M)组的对比在2和4小时显示统计学显著差异 (p<0. 001) 〇
[0026] 图2显示在研宄期间通过热板（HotPlate)测量的每组的痛觉过敏作用分布（结 果以与时间成函数的"热板延时，自基线％ "表示）。使用重复测量的双向AN0VA，然后用 Bonferroni事后检定进行统计学分析。对照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小 时显示统计学显著差异（P〈〇. 05-0. 01)。对照组与RGC(3M)对比在4小时显示统计学显著 差异（P〈〇. 01)。
[0027] 图3显示通过热板测量的每组的痛觉过敏作用分布（结果以与时间成函数的"热 板延时8,基线-实际时间"表示）。使用重复测量的双向AN0VA，然后用Bonferroni事后 检定进行统计学分析。对照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小时显示统计学显 著差异（P〈〇. 05-0. 01)。对照组与RGC-处理的小鼠（3M)对比在4小时显示统计学显著差 异（p〈0. 01) 〇
[0028] 图4显示4个不同批次的在补充的GamborgB5培养基的大规模一次性生物反应 器中生长的红葡萄细胞的生长曲线。在20直至40天，细胞经历指数生长，产生500gr/l鲜 生物量。
[0029] 图5提供了白藜芦醇（RES)在水中的溶解性结果，比较RGC-RES、合成的RES和植 物RES的溶解性。
[0030] 图6A和6B显示在施用一剂RGCRES之后反式-RES的血浆含量，其中图9A显示 总反式-RES，图9B显示游离反式-RES。呈现的数值是平均数（n= 15)。
[0031] 发明详述
[0032] 在如下详细描述中，阐述了很多具体细节以充分理解本发明。然而，本领域技术人 员应理解本发明可以不用这些具体细节而实施。在其它情况中，未详细描述熟知的方法、程 序和成分免得使本发明模糊不清。
[0033] 本发明的实施方案涉及大规模体外生产果实细胞的方法。在本发明的一些实施 方案中，所述方法不包括果实细胞的提取。令人惊奇地，根据本文所述大规模方法产生的 果实细胞显示包含较高量的多酚，特别是次生代谢物白藜芦醇。本发明提供了独特的红葡 萄细胞（RGC)组合物，其是规模生产的结果，包括多酚的完全基质及红葡萄细胞中天然存 在的其它健康成分，与在新鲜葡萄中发现的浓度相比具有显著较高的葡萄白藜芦醇浓度 (40-800倍或更高）（见实验9和表9)。
[0034] 如本文所用，术语"多酚"是指天然存在的植物有机化合物，其具有一个以上的苯 酚基团。多酚可以是从简单分子如酚酸至大的高聚合的化合物如鞣酸。多酚的酚环通常与 各种糖分子、有机酸和/或脂质缀合。这种缀合的化学结构中的差异导致各种多酚化合物 的作用模式和健康性质中的化学分类和变化。举例的多酚包括但不限于花青素、生物类黄 酮（包括以下亚类：黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷醇和二氢黄酮）、原花青素、氧杂蒽酮、酚酸、 芪类和木脂素。白藜芦醇（3, 4, 5-三羟基芪）是一种类型的多酚，是以其单体形式、反式白 藜芦醇、顺式白藜芦醇、反式-葡糖苷和顺式-葡糖苷呈现的多酚芪。
[0035] 根据本发明的一个实施方案，果实是葡萄。葡萄可以是有色葡萄（例如红色、黑 色、紫色、蓝色及之间所有颜色变化）。或者，葡萄可以是无色葡萄（例如绿色或白色或者之 间的任何颜色）。
[0036] 本发明这个方面的果实可以是野生或栽培变种。举例的栽培种葡萄包括属于 葡萄属的那些葡萄。举例的葡萄属变种包括但不限于欧洲葡萄（Vitis vinifera，V. vinifera)、森林葡萄（V. silvestris)、V. muscadinia、圆叶葡萄（V. rotundifolia)、河 岸葡萄（V. riparia)、夏特沃氏葡萄（V. shuttleworthii)、V. lubrisca、V. daviddi、山葡 萄（V. amurensis)、V. romanelli、夏葡萄（V. aestivalis)、辛西安那葡萄（V. Cynthiana)、 V. cineria、V. palmate、V. munsoniana、霜葡萄（V. cordifolia)、Hybrid A23-7-71、 V. acerifolia、V. treleasei和桦叶葡萄（V. betulifolia)。
[0037] 根据一些实施方案，果实细胞源自有色或无色葡萄。如本文所述，根据一些实施方 案，果实细胞是从果实细胞培养物制备的。根据本发明的一些实施方案，果实细胞是从葡萄 浆果细胞培养物制备的。根据一些实施方案，葡萄浆果细胞的培养物源自一或多个葡萄浆 果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或无种子栽培株的葡萄胚或者葡萄 种皮。根据另一个实施方案，果实细胞培养物可以源自植物的任何部分，包括但不限于胚 乳、糊粉层、胚（或者其作为盾片和子叶的部分）、果皮、茎、叶、块茎、表皮毛（trichomes)和 根。
[0038] 根据本发明的一些实施方案，尽管物质包括多酚的量在果实中可以变化，但是使 用制备果实细胞培养物的培养方案确保制备物及其含量的再现性。因此，从相同培养物制 备的不同批次的果实细胞具有典型的HPLC指纹。根据一些实施方案，每个批次中不同物质 的浓度可以变化，但是如上所述如果从相同的培养物制备，则所有批次的HPLC指纹是一致 的。
[0039] 在本发明的一些实施方案中，提供了粉末形式的组合物，其包含所述大规模方法 中的体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物，其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤 组织培养物源自一或多个葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或 无种子栽培株的葡萄胚芽或者葡萄种皮；其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含 的白藜芦醇的量为至少l〇〇〇mg/kg粉末。在本发明的一些实施方案中，根据本发明所述大 规模方法的实施方案生产的葡萄细胞中至少90%的白藜芦醇是反式-葡糖苷白藜芦醇。
[0040] 根据一些实施方案，所制备的果实细胞中不同多酚的相对量与其在农业葡萄果实 中的相对量不同。这在实施例3、表9中清晰可见，其中将在根据本发明的实施方案大规模 生产的干燥的葡萄细胞培养物中总的白藜芦醇与葡萄中白藜芦醇的量比较。根据一些实施 方案，某些多酚的量在所制备的果实细胞与其在农业葡萄果实中的量相比增加。根据一些 实施方案，白藜芦醇的量在果实细胞中增加 。根据一些实施方案，果实细胞（可以是葡萄细 胞）在干燥为粉末之后其中白藜芦醇的量为1000-50000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于1000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于3000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于5000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于10000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于20000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于30000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于40000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于50000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于60000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于70000mg/kg。
[0041] 根据一些实施方案，所制备的果实细胞中各种成分的相对量与其在农业葡萄果实 中的相对量不同。根据一些实施方案，所述果实细胞中糖的相对量与农业葡萄果实中糖的 相对量相比降低。
[0042] 根据一些实施方案，根据本发明的大规模方法制备的果实细胞含有少于10%w/v 甜味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于5%w/v甜味糖。根据一些实施方案， 所述果实细胞含有少于3 %w/v甜味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于2% w/v甜味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于l%w/v甜味糖。根据一些实施方 案，所述果实细胞含有约l%w/v甜味糖。如本文所用，短语"甜味糖"是指提供甜味的糖， 如蔗糖、葡萄糖和果糖。
[0043] 根据一些实施方案，将果实细胞干燥，从而浓缩在其中发现的物质，包括糖。根据 一些实施方案，所述物质浓缩5倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩10倍。根据一些实施 方案，所述物质浓缩15倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩20倍。根据一些实施方案， 所述物质浓缩25倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩30倍。
[0044] 根据一个实施方案，干燥的果实细胞含有直至10%w/v甜味糖。根据本发明的一 些实施方案，干燥的果实细胞含有直至15%w/v甜味糖。根据一个实施方案，干燥的果实 细胞含有直至10-15%w/v甜味糖。根据一个实施方案，干燥的果实细胞含有直至15-20% w/v甜味糖。
[0045] 根据一个实施方案，干燥的果实细胞含有少于20% w/v甜味糖。根据一个实施方 案，干燥的果实细胞含有少于30%w/v甜味糖。
[0046] 根据一些实施方案，根据本发明的大规模方法制备的果实细胞是无味的；根据其 它的实施方案，根据本发明的大规模制备的果实细胞是有味的。
[0047] 在本发明的一个实施方案中，提供体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组 织培养物的大规模方法，所述方法包括：
[0048] 将葡萄细胞在瓶中生长；
[0049] 将葡萄细胞从瓶接种至第一生物反应器中；以及收获所产生的葡萄细胞。
[0050] 在本发明的一些实施方案中，提供了体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤 组织培养物的大规模方法，所述方法包括：
[0051] 将葡萄细胞在瓶中生长；
[0052] 将葡萄细胞从瓶接种至第一生物反应器中；将葡萄细胞从所述第一生物反应器接 种至另一个生物反应器，其中所述另一个生物反应器是最后的生物反应器或者是中间生物 反应器，及可以提供使用一或多个中间生物反应器的一些更多的步骤及其中所述第一生物 反应器和所述另一个生物反应器中的至少一个是一次性的；及
[0053] 从最后的生物反应器中收获葡萄细胞；
[0054] 其中将从最后的生物反应器收获的葡萄细胞干燥。
[0055] "一次性生物反应器"是指具有一次性包袋的生物反应器，其可以是代替培养容器 的一次性使用的包袋。所述一次性包袋通常是由三层或更多层塑料薄片制成。在本发明的 一些实施方案中，一层是由聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或LDPE制成，以提供机械稳定 性。第二层是使用尼龙、PVA或PVC制成，其作为气体屏障。最后，接触层由PVA或PP制成 或者是另一聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或LDPE层。对于医学应用，接触产物的一次性 使用的材料必须通过EuropeanMedicinesAgency或者其它地区的相似权威机构认证。
[0056] 根据本发明的一些实施方案，一次性生物反应器由一或多层的聚乙烯制成。在本 发明的一些实施方案中，一次性生物反应器是由聚乙烯内层和外层及中间尼龙层制成。
[0057] 通常地，有两种不同方法构建一次性使用的生物反应器，区别在于用于搅动培养 基的方式。
[0058] 一些一次性使用的生物反应器使用搅拌器，像常规生物反应器一样，但是搅拌器 整合在塑料包袋中。密闭的包袋和搅拌器提前灭菌。在使用中，将包袋安装在生物反应器 中，及将搅拌器与机械性或磁性驱动器连接。
[0059] 其它一次性使用的生物反应器是通过摇摆运动搅动的。其它一次性使用的生物反 应器是空气搅拌的（airlift)生物反应器，其中通过空气的导入搅动反应培养基及使其通 气。这种类型的生物反应器不需要在一次性使用包袋内部的任何机械性搅动器。
[0060] 根据一些实施方案，制备果实细胞的大规模方法包括许多随后的步骤。根据本发 明的一些实施方案，在每个步骤中制备的果实细胞的量大于或者不大于在先前步骤中制备 的量。进一步地，在每个步骤中制备的果实细胞接种或收获以用作大规模方法中下一步的 起始物。在大规模方法的最后步骤中，通常使果实细胞生长直至其达到生长曲线图的平台 期。
[0061] 使用本发明的大规模方法的优势在实施例章节中是清楚的并得到证实。如在实施 例2、实验2中可见，使用补充的GamborgB5培养基的红葡萄细胞（RGC)的生物量高于与在 非补充的GamborgB5培养基中获得的生物量。进一步地，甚至在大规模生物反应器中，使 用含有不同浓度的镁、硝酸盐和磷酸盐（KN03、MgS04、MgN03、NaH2P04)的GamborgB5培养基 导致所产生的细胞中的高水平白藜芦醇。
[0062] 表4和实施例2、实验3显示在大规模一次性生物反应器中在补充的培养基中生长 的葡萄细胞中总多酚及白藜芦醇水平高于在Erlenmeyer瓶中生长的葡萄细胞中获得的水 平，即分别为910mg/l和203mg/l。与其它人的观测结果不同，这是首次证实在大规模一次 性1000-5000升生物反应器中果实植物细胞系的成功生长，具有较高水平白藜芦醇和多酚 产生。
[0063] 根据一些实施方案，提供组合物，其包含多酚复合物，所述多酚包括白藜芦醇，其 中白藜芦醇与多酚的量比率高于1:20。在一些实施方案中，这个比率高于1:10。在一些实 施方案中，这个比率高于1:5。在一些实施方案中，这个比率高于1:3。在一些实施方案中， 这个比率高于1:2。根据一些实施方案，所述组合物源自天然来源。根据一些实施方案，所 述组合物源自天然来源。根据一些实施方案，所述组合物源自在大规模一次性生物反应器 中生长的葡萄细胞。根据一些实施方案，所述组合物源自根据本文所述的方法的大规模一 次性生物反应器中生长的葡萄细胞。
[0064] 表7和实施例2、实验7显示两种培养基頂1培养基和补充有镁、磷酸盐和硝酸盐 的GamborgB5对于由细胞产生的白藜芦醇的量的影响。在由无菌的一次性透明塑料容器 制成的20L生物反应器中评定该影响，并与在A.Decendit(1996)BiotechnologyLetters 中公开的数据进一步对比，其中细胞是生长在20L玻璃容器中的Ml培养基中。结果表明 在一次性生物反应器中頂1培养基中生长的红葡萄细胞产生93mg/l白藜芦醇（表7)，其比 在使用相同培养基Oecendit)的搅动的玻璃生物反应器中产生的水平的大约高3倍。此 外，当这些细胞在一次性生物反应器中在补充的GamborgB5培养基中生长时产生显著高水 平的白藜芦醇，即387mg/l。因此，这个实验显示使用一次性生物反应器和含有不同浓度镁、 硝酸盐和磷酸盐（KN03，MgS04，MgN03，NaH2P04)的GamborgB5培养基的优势以及使用一次性 生物反应器和补充的GamborgB5培养基组合的优势。
[0065] 根据一些实施方案，使果实细胞在生物反应器中生长。根据一些实施方案，设计生 物反应器以使得能够进行适当的混合及质量转移，同时使剪切力和流体动力压力强度最小 化。根据本发明的一些实施方案，至少一个生物反应器是一次性生物反应器。其可以是第一 生物反应器或者中间生物反应器或者最后的生物反应器或者其任意组合。根据本发明的一 些实施方案，一次性的生物反应器是最后的生物反应器，之后收获细胞并干燥以形成粉末。
[0066] 根据本发明一个举例的实施方案，第一步包括在瓶如Erlenmeyer或生物反应器 中制备果实细胞。根据一些实施方案，第一步包括制备直至1.0L的果实细胞培养物。根据 进一步的实施方案，第一步包括制备直至1. 5L的果实细胞培养物。根据进一步的实施方 案，第一步包括制备直至2. 0L的果实细胞培养物。
[0067] 根据一些实施方案，使用玻璃、金属或者塑料瓶进行第一步。根据一些实施方案， 该瓶是一次性的。根据进一步的实施方案，该瓶可以重新使用任何次数。根据一些实施方 案，该瓶在两次使用之间通过任何适当方式灭菌。
[0068] 根据一些实施方案，第一步包括使用任何合适的培养基以使得果实细胞生长。根 据一些实施方案，用于使果实细胞生长的培养基包括细胞生长培养基、盐、维生素、糖、激素 或者其任意组合。根据一些实施方案，细胞生长培养基是B5Gamborg(Gamborget al.，Exp. Cell Res. 50:151，1968)，或者其任何变型。根据一些实施方案，GamborgB5包含盐如镁、 磷酸盐、硝酸盐或其任何组合。根据本发明的一些实施方案，GamborgB5培养基包含KN03、 1%5044&11 2?04或者其任何组合。根据一些实施方案，培养基包含GamborgB5维生素或者其 任何组合。根据进一步的实施方案，培养基包含糖如蔗糖、GamborgB5或者其任何组合。
[0069] 在本发明的实施方案中，加入GamborgB5中的謂03的浓度为25mM-45mM。
[0070] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgSOj^浓度为
[0071] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的1%勵3的浓度为5mM-35mM。
[0072] 在本发明的实施方案中，加入GamborgB5中的謂03的浓度为15mM-60mM。
[0073] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgS04浓度为0. 5mM-25mM。
[0074] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgN03浓度为lmM-50mM。
[0075] 在本发明的实施方案中，加入GamborgB5中的KN03浓度为30mM-40mM。
[0076] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgS04浓度为5mM-10mM。
[0077] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgN03浓度为20mM-30mM。
[0078] 在本发明的实施方案中，将肌醇加入GamborgB5中。
[0079] 在本发明的实施方案中，将H3B03加入GamborgB5中。
[0080] 在本发明的实施方案中，将MnS04加入GamborgB5中。
[0081] 在本发明的实施方案中，将NaH2P04加入GamborgB5中。
[0082] 在本发明的实施方案中，将生物素加入GamborgB5中。
[0083] 在本发明的实施方案中，将D-泛酸钙加入GamborgB5中。
[0084] 在本发明的实施方案中，将大约0. 5mM肌醇加入GamborgB5中。
[0085] 在本发明的实施方案中，将大约0? 05mMH3B03加入GamborgB5中。
[0086] 在本发明的实施方案中，将大约0. 04mMMnS04加入GamborgB5中。
[0087] 在本发明的实施方案中，将大约ImMNaH2P04加入GamborgB5中。
[0088] 在本发明的实施方案中，将大约0. 004mM生物素加入GamborgB5中。
[0089] 在本发明的实施方案中，将大约0. 2mMD-泛酸钙加入GamborgB5中。
[0090] 在本发明的实施方案中，将大约 0? 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、 3、4、5、6、7、8、9、10mM肌醇加入GamborgB5 中。
[0091] 在本发明的实施方案中，将大约 0. 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、 0? 09、0.ImM1131303加入GamborgB5 中。
[0092] 在本发明的实施方案中，将大约 0. 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、 0? 09、0.ImMMnS〇J[]_AGambor gB5 中。
[0093] 在本发明的实施方案中，将 0? 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、3、4、 5、6、7、8、9、10mMNaH2P〇J[]_AGamborgB5 中。
[0094] 在本发明的实施方案中，将大约 0? 001、0. 002、0. 003、0. 004、0. 005、0. 006、0. 007、 0? 008、0. 009、0.OlmM生物素加入GamborgB5 中。
[0095] 在本发明的实施方案中，将大约 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、 3、4mMD_泛酸妈加入GamborgB5中。
[0096] 在本发明的实施方案中，加入GamborgB5中的蔗糖浓度为2-4%。在另一实施方 案中，浓度为大约3%
[0097] 根据进一步的实施方案，酪蛋白、酪蛋白水解物或者酪蛋白胨可以包含在细胞生 长培养基中。根据进一步的实施方案，生长激素可以包含在细胞生长培养基中。根据进一 步的实施方案，生长培养基包含激素。根据一些实施方案，果实细胞不用添加激素而生长。
[0098] 根据一些实施方案可以在所述方法的一或多个阶段使用的植物培养基的 例子包括但不限于：Anderson(Anderson,InVitro14:334，1978;Anderson,Act. Hort., 112:13, 1980),CheeandPool(Sci.Hort.32:85, 1987),CLC/Ipomoea(CP) (Cheeetal.,J.Am.Soc.Hort.Sci. 117:663, 1992),Chu(N.sub.6)(Chuet al.,ScientiaSinic. 18:659, 1975 ；Chu,Proc.Symp.PlantTiss.Cult.,Peking 43,1978), DCR (Gupta and Durzan,Plant Cell Rep. 4:177, 1985), DKW/Juglans(Driver and Kuniyuki, HortScience 19:507, 1984 ；McGranahan et al.,in:Bonga and Durzan,eds.,Cell and Tissue Culture in Forestry,MartinusNijhoff,D ordrecht, 1987),De Greef and Jacobs (De Greef and Jacobs,Plant Sc i. Lett.17:55,1979), Eriksson(ER)(Eriksson, Physiol. Plant. 18:976, 1965), Gresshoff and Doy(DBM2) (Gresshoff and Doy,Z Pflanzenphysiol.73:132, 1974),Heller 's (Heller, Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. 11th Ser. 14:1, 1953), Hoagland' s(Ho agland and Arnon, Circular 347,Calif.Agr.Exp. Stat. , Berkeley, 1950), Kao and Michayluk (Kao and Michayluk, Planta 126:105, 1975) , Linsmaier and Skoog(Linsmaier and Skoog,Physiol. Plant. 18:100,1965),Litvay's (LM)(Litvay et al. , Plant Cell Rep. 4:325, 1985), Nitsch and Nitsch(Nitsch and Nitsch, Science 163:85, 1969), Quoirin and Lepoivre(Quoirin et al. , C. R. Res. Sta. Cult.Fruit Mar. , Gembloux 93,1977), Schenk and Hildebrandt(Schenk and Hildebrandt, Can. J. Bo t.50:199,1972), White's(White, The Cultivation of Animal and Plant Cells, Ronald Press, NY, 1963)等。
[0099] 根据一些其它举例的实施方案，果实细胞和培养基在第一个步骤期间持续混合。 根据进一步的实施方案，果实细胞和培养基在第一个步骤期间间歇混合。根据一些实施方 案，第一个步骤期间的温度为20°C-30°C。根据一些实施方案，在第一个步骤期间的温度为 22°C_28°C。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长多于5天。根据一些实施方 案，果实细胞在第一个步骤生长多于7天。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长 多于5天但少于2周。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长多于5天以上但少 于12天。
[0100] 根据一些举例的实施方案，本发明方法中使用的生物反应器包括一个进口，在第 一个步骤果实细胞通过其进入，培养基和任何其它物质置于生物反应器中。根据进一步的 实施方案，本发明方法中使用的生物反应器包括排出任何希望的物质的出口。根据一些实 施方案，出口包括玻璃出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气 体出口是人工操作的。根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦瓶中的气 压（atmosphere)达到预定压力，贝气体从瓶中释出。根据一些实施方案，预定的压力直至 8PSI〇
[0101] 根据一些举例的实施方案，结束果实细胞生长的第一步之后，将果实细胞接种于 小规模生物反应器中，在此也称作第一生物反应器。对于大规模方法的第二步，根据一些 实施方案，小规模生物反应器是4L反应器。根据进一步的实施方案，小规模生物反应器是 3-5L反应器。根据进一步的实施方案，小规模生物反应器是3-10L反应器。根据进一步的 实施方案，小规模生物反应器是4-8L反应器。
[0102] 小规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类型 聚合物。根据一些实施方案，小规模生物反应器是一次性的。如果小规模生物反应器不是 一次性的，根据一些实施方案，在两次使用期间通过任何合适方式清洁和灭菌。
[0103]如上所述，已知当较大数量的果实细胞在生物反应器中生长时，次生代谢物包括 多酚如白藜芦醇的产生与在小规模生产如使用玻璃瓶如Erlenmeyers中相同代谢物相比 显著降低。然而，本文详细描述的大规模方法提供果实细胞，当在生物反应器中生长时其中 的次生代谢物的量不降低。进一步地，某些次生代谢物的产生甚至是扩大的。
[0104] 因此，根据本发明的实施方案，在小规模生物反应器中生长的果实细胞的次生代 谢物的相对量与其在第一步中的相对量相比不显著降低。根据一些实施方案，上述用于第 一步中生长培养基中的成分也可用于第二步。根据一些实施方案，小规模生物反应器中使 用的生长培养基与大规模生产方法的第一步中使用的培养基相同。根据一些实施方案，在 第二步生长培养基中发现的不同成分的相对量与第一步相同。根据其它的实施方案，在第 二步生长培养基中发现的不同成分的相对量与在第一步中使用的相对量不同。根据一些实 施方案，在第二步将另外的物质加入生长培养基中。
[0105] 根据一些实施方案，小规模生物反应器包括一个入口，果实细胞（来自第一步）、 空气、培养基及任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案，小规模生 物反应器包括一个出口，由此排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括一个气体 出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工操作的。 根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预定压力， 则气体从生物反应器中释出。根据一些实施方案，预定压力是8PSI。
[0106] 根据一些实施方案，果实细胞和培养基在第二步是持续混合的。根据进一步的实 施方案，果实细胞和培养基在第二步是间歇混合的。根据一些实施方案，第二步的温度是 20-30摄氏度。根据一些实施方案，果实细胞在第二步生长多于一周但少于两周。在本发明 的一些实施方案中果实细胞在接种于下一个生物反应器中之前生长9-16天。
[0107] 对于大规模方法的第三步，将收获的果实细胞置于大规模生物反应器中。根据一 些实施方案，大规模生物反应器是30-50L反应器。根据进一步的实施方案，大规模生物反 应器是40-60L反应器。根据进一步的实施方案，大规模生物反应器是30-70L反应器。根 据进一步的实施方案，大规模生物反应器是20-100L反应器。
[0108] 大规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类型 聚合物。根据一些实施方案，大的生物反应器是一次性的。如果大规模生物反应器不是一 次性的，根据一些实施方案，在两次使用期间通过任何合适方式清洁和灭菌。
[0109] 与小规模生物反应器相似，根据本发明的实施方案，在大规模生物反应器中生长 的果实细胞的次生代谢物与其在该方法的任何先前步骤中的相对量相比不显著降低。根据 一些实施方案，上述任何先前步骤中用于生长培养基中的成分也可以用于第三步。根据一 些实施方案，大规模生物反应器中使用的生长培养基与该方法的任何先前步骤中使用的培 养基相同。根据一些实施方案，第三步生长培养基中发现的不同成分的相对量与该方法任 何先前步骤中的量相同。根据其它的实施方案，第三步生长培养基中发现的不同成分的相 对量与该方法任何先前步骤中使用的相对量不同。根据一些实施方案，在第三步将另外的 物质加入生长培养基中。
[0110] 根据一些实施方案，大规模生物反应器包括一个入口，果实细胞（来自第二步）、 培养基、空气和任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案，大规模生 物反应器包括一个出口，以排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括一个气体出 口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工操作的。根 据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预定压力，则 气体从生物反应器中释出。根据一些实施方案，预定的压力为直至8PSI。
[0111] 根据一些举例的实施方案，果实细胞和培养基在第三步持续混合。根据进一步 的实施方案，果实细胞和培养基在第三步间歇混合。根据一些实施方案，第三步的温度是 20-30°C。根据一些实施方案，果实细胞在第三步生长大约2-3周。根据一些实施方案，果 实细胞在第三步生长大约3-5周。根据一些实施方案，果实细胞在第三步生长大约12-30 天。
[0112] 第三步果实细胞生长结束后，通常通过任何适当方式将果实细胞从中等规模生物 反应器接种。对于大规模生产方法的第四步，将收获的果实细胞置于更大规模生物反应器 中。根据一些实施方案，更大规模生物反应器是1000L反应器。根据进一步的实施方案，更 大规模生物反应器是200-500L反应器。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是 500-1000L反应器。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是1000-1500L反应器。 根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是500-1100L反应器。
[0113] 更大规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类 型聚合物。根据一些实施方案，大规模生物反应器是一次性的。如果大规模生物反应器不 是一次性的，根据一些实施方案，在两次使用之间通过任何合适方式清洁和灭菌。
[0114] 与小规模生物反应器相似，根据本发明的实施方案，在更大规模生物反应器中生 长的果实细胞的次生代谢物的量与其在该方法的先前步骤中的相对量相比不显著降低。根 据一些实施方案，上述在任何先前步骤中用于生长培养基中的成分也可用于该方法的第四 步。根据一些实施方案，在更大规模生物反应器中使用的生长培养基与在任何先前步骤中 使用的培养基相同。根据一些实施方案，在第四步中生长培养基中发现的不同成分的相对 量与先前任何步骤中的量相同。根据其它的实施方案，在第四步中生长培养基中发现的不 同成分的相对量与在任何先前步骤中使用的相对量不同。根据一些实施方案，在该方法的 第四步将其它物质加入生长培养基中。
[0115] 根据一些实施方案，更大规模生物反应器包括一个入口，果实细胞（来自第三或 第二步）、培养基、空气和任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案， 更大规模生物反应器包括一个出口，以排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括 一个气体出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工 操作的。根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预 定压力，则气体从生物反应器中释出。
[0116] 根据一些实施方案，果实细胞和培养基在第四步持续混合。根据进一步的实施方 案，果实细胞和培养基在第四步间歇混合。根据一些实施方案，第四步的温度是20-30°C。 根据一些实施方案，果实细胞在第三步或第四步生长直至达到细胞生物量为10% -70%。
[0117] 根据一些实施方案，在果实细胞在更大规模生物反应器中生长之后终止该大规模 生产方法。根据这种实施方案，果实细胞在更大规模生物反应器中生长直至达到细胞生物 量为10% -70%。细胞生物量达到10% -70 %后，通过任何合适方式从该大规模生物反应 器中收获果实细胞并进一步加工。根据一些实施方案，将果实细胞通过干燥、冻干、冷冻干 燥和 喷雾干燥等进一步加工。根据一些实施方案，果实细胞的加工不包括从中提取活性成 分。
[0118] 根据一些实施方案，大规模方法可包括将细胞从培养瓶中接种于可以是任何大小 的生物反应器并收获细胞的一个步骤。根据其它的实施方案，果实细胞可以接种于一系列 生物反应器中，其中每个生物反应器通常大于前一个使用的生物反应器。根据本发明大规 模方法进行任何数目的额外的步骤。额外的步骤包括可能的中间步骤，其中收获细胞或接 种及置于更大的生物反应器中及生长直至收获或接种并转移至更大的生物反应器。根据进 一步的实施方案，该方法包括使从大规模生物反应器中收获的果实细胞的额外步骤生长。
[0119] 在本发明的一个实施方案中，提供一种药物或营养组合物或者食物添加剂，其包 含在本发明的大规模方法中生产的葡萄细胞。所述药物或营养组合物或者食品添加剂可以 通过口服给对象施用。
[0120] 如本文所用，短语"药物组合物"是指果实细胞培养物的制备物，其可以是如上述 葡萄细胞培养物，有或没有其它化学成分如生理学合适的载体和赋形剂。
[0121] 在本发明的实施方案中，提供一种，通过给有需要的对象施用包含根据本发明实 施方案的大规模方法生产的葡萄细胞培养物的药物或营养组合物或者食品添加剂治疗炎 性失调的方法。
[0122] 如本文所用，术语"治疗"是指预防与炎性疾病、病症或失调相关的一些或所有症 状。术语"治疗"也是指减轻炎性疾病的症状或者潜在病因，延长患病患者的预期寿命，以 及从疾病中完全康复。
[0123] 如本文所用，短语"炎性失调"包括但不限于慢性炎性疾病和失调及急性炎症性疾 病和失调。这在实施例4中举例说明，其显示通过口服根据本文描述的大规模方法生产的 红葡萄细胞（RGC)而令人满意地减轻了在大鼠中与角叉菜胶诱导的后足炎症相关的足水 肿和行为痛觉过敏，表明在大规模方法中制备的RGC的抗炎作用。
[0124] 本发明的各个方面在如下实施例中更详细描述，这些代表本发明的实施方案，不 限制本发明的范围。 实施例
[0125] 实施例1 :生产-工业化水平规模
[0126] 1.材料和方法
[0127] 生产方法涵盖在具有五个阶段的逐步方法中增殖葡萄细胞。从在Erlenmeyer摇 瓶中增殖葡萄细胞开始，在小和大规模生物反应器中进一步增殖。关键因素是在不同的生 物反应器规模中的增殖期间维持细胞中次生代谢物白藜芦醇的高水平。在最后的大规模增 殖阶段结束时，在要求的生物量，收获细胞并干燥以产生精细的粉-紫色粉末，产生干燥细 胞（RGC)生物量，用于不同的医学应用。
[0128] 形成葡萄细胞系
[0129] 来自葡萄横切片的愈伤组织：从田间生长在开花后20-50天的葡萄植物中收 获4-8cm长的幼葡萄串，在流动的自来水中彻底冲洗。将无种子葡萄Vitis vinifera cv. "AVNIR 825〃(Agraman与Gamay red的杂交种）的绿色未成熟衆果在含有1.3%w/ v次氯酸钠和（0.l%v/v)Tween 20(作为增湿剂）的溶液中灭菌10分钟，。使用外科 手术刀将外植体切成2-3mm长度横切片，在补加过滤灭菌的1. 7mM抗坏血酸和0.8mM柠 檬酸、l〇〇mg/l DTT(二硫苏糖醇）和50mg/l乙酰半胱氨酸的半强度MS(Murashige and Skoog，1962, Physiol Plant 15:473-497)液态基本培养基中进行。将如下抗氧化剂加入 切割培养基中：PVP(0.5和lg/1)、L-半胱氨酸（150mg/l)、五倍子酸（1. 5mg/l)、DTT(70mg/ 1)、生物喋呤（15mg/l)，抗坏血酸（150mg/l)和柠檬酸（150mg/l)，以抑制细胞坏死 (necrogenesis)及使得可以回收绿色健康衆果片。
[0130] 将衆果片置于100个含有25ml高压灭菌的用0? 25%Gelrite固化Murashigeand Skoog，MS培养基的15mm培养平板中。在102kpa高压灭菌15分钟之前将pH调节为pH 5. 9。将每个均含有25个浆果片的30个平板用Parafilm密封及在26°C避光温育3天。将 培养物在25°C由冷白光荧光管提供15-30ymolnr2^辐照度的16小时光照期下温育。MS 盐和维生素培养基也补加250mg/l酪蛋白水解物、2%蔗糖和100mg/l肌醇。对于愈伤组织 诱导，还补加0. 2mg/l激动素和0.lmg/1NAA(a-萘基乙酸），培养基称作RD1。
[0131] 在培养开始3-4周后，沿着浆果片可见绿色和红色愈伤组织混合物。该愈伤组织 由易碎的延长的细胞组成，其中一些呈现出花青素深色着色。选择富集花青素的愈伤组织 部分并单独传代培养增殖。绿色愈伤组织部分单独培养。
[0132] 来自葡萄皮细胞的愈伤组织：从田间生长的葡萄植物在开花20-50天后收 获4-8cm长的幼葡萄串，在流动的自来水中彻底冲洗。将无种子葡萄Vitisvinifera cv.〃AVNIR825〃(Agraman与Gamayred的杂交种）的绿色不成熟衆果在含有1.3%w/v 次氯酸钠和（〇.l%v/v)Tween20(作为增湿剂）的溶液中灭菌10分钟。通过在衆果皮 做3-8mm切口并使用无菌镊子仅剥皮而分离浆果皮。果皮分离在补加过滤灭菌的1. 7mM 抗坏血酸和〇? 8mM柠檬酸、100mg/lDTT(二硫苏糖醇）和50mg/l乙酰半胱氨酸的半强度 MS(MurashigeandSkoog，1962)液态基本培养基中进行。
[0133] 将果皮置于RD-1培养基中。在大约10-14天后，在果皮切割表面上开始发育出细 胞丛。选择富集花青素的细胞并在新鲜培养基中传代培养以进一步增殖。
[0134] 来自葡萄种皮的愈伤组织：从田间生长的葡萄植物在开花20-50天后收获4-8cm 长的幼葡萄串，在流动的自来水中彻底冲洗。将无种子葡萄Vitisvinifera cv."AVNIR 825〃(Agraman与Gamay red的杂交种）的绿色不成熟衆果在含有1. 3% w/v次氯酸钠和 (0. 1% vAOTween 20(作为增湿剂）的溶液中灭菌10分钟。将浆果切开以显露幼绿色发 育中种子。切下未成熟种皮并置于培养基上。在补加过滤灭菌的1.7mM抗坏血酸和0.8mM 朽1檬酸、l〇〇mg/l DTT(二硫苏糖醇）和50mg/l乙酰半胱氨酸的半强度MS(Murashige and Skoog，1962)液态基本培养基中进行分离。
[0135] 将种皮切片置于RD-1培养基中。在大约12-20天后，种皮变成褐色，在种皮外植 体的顶部开始出现愈伤组织。选择富于红-褐色着色的细胞并在新鲜培养基中进一步传代 培养以进一步增殖。
[0136] 液态培养物的建立：液态培养物通过在50ml不同培养基（RD1-RD6,见下文）中加 l〇g愈伤组织而建立。在固体培养基上成功建立的所有细胞系在缺少胶凝剂的相同培养基 组合中呈现均匀细胞悬浮液。加入70mg/lDTT或者150mg/l抗坏血酸或柠檬酸改善浆果 来源的悬浮培养物的生长及抑制细胞necrogenesis。所有外植体类型均成功用于建立液态 培养物。每7-10天将培养物在新鲜生长培养基中常规传代培养。
[0137] 导入以建立浆果来源的愈伤组织细胞系的其它葡萄种属：使用上述方案培养如下 葡萄属物种：
[0138] 森林葡萄、V.muscadinia、圆叶葡萄、河岸葡萄、夏特沃氏葡萄、V.lubrisca、 V. daviddi、山葡萄、V. romanelli、夏葡萄、辛西安那葡萄、V. cineria、V. palmate、V. munsoniana、霜葡萄、Hybrid A23-7-71、V. acerifolia、V. treleasei和桦叶葡萄。
[0139] 欧洲葡萄横切片、葡萄皮和葡萄种子的愈伤组织产生的效力在下表1中例证。
[0140]表A
[0141]
[0142] 在这项研宄中使用的一些葡萄属物种的不同愈伤组织"类型"产生的效力在下表 2中概括显示。
[0143]表B
[0144]
[0145] (B-衆果片，SC-种皮，S-果皮）
[0146]阶段 1:Erlenmeyer，摇瓶
[0147] 将红葡萄细胞在持续荧光（lOOOlx)在25±5°C温度下在定轨摇床上的1L Erlenmeyer瓶中悬浮生长。生长培养基含有GamborgB5培养基和维生素，及补加250mg/ 1酪蛋白水解物、2-4%蔗糖、1001^/1肌醇、0.21^/1激动素和0.111^/1隱4(1-萘乙酸）、 25-45mMKN03、l-15mMMgS04或者 5-35mMMgN03&lmMNaH2P04(pH5.8)。每 6-11 天将细 胞传代培养。
[0148] 阶段2:小规模生物反应器
[0149] 通过将在阶段1的Erlenmeyer中生长7-16天的细胞悬浮液在25±5°C接种于 4-8L-次性生物反应器中。将细胞在持续荧光（lOOOlx)下在生长培养基中悬浮生长，所述 生长培养基含有补充的GamborgB5盐和维生素培养基，补加250mg/l酪蛋白水解物、2-4 % 蔗糖、100mg/l肌醇、25-45mMKN03、l-15mMMgS04或 5-35mMMgN03及ImMNaH2P04、0. 2mg/l 激动素和〇.lmg/1NAA(1-萘乙酸）（pH5. 4-5. 8)。每9-16天将细胞传代培养。
[0150] 阶段3:大规模生物反应器
[0151] 将在小规模生物反应器中生长的细胞悬浮液接种于30-50L-次性生物反应器 中。将细胞在持续荧光（lOOOlx)下在25±5°C悬浮生长。生长培养基含有补充的Gamborg 85盐和维生素培养基，补加25〇1^/1酪蛋白水解物、2-4%蔗糖、10〇11^/1肌醇、25-451111 KN03、l-15mMMgS04或 5-35mMMgNO3及ImMNaH2P04、0. 2mg/l激动素和 0?lmg/1NAA(1-萘 乙酸）（pH5. 4-5. 8)。每12-30天将细胞传代培养。
[0152] 阶段4:更大规模生物反应器
[0153] 将在小或大规模生物反应器中生长的细胞悬浮液接种于300-1000L-次性生物 反应器中。将细胞在持续荧光（lOOOlx)下在25±5°C悬浮生长。生长培养基含有补充的 GamborgB5盐和维生素培养基，补加250mg/l酪蛋白水解物、2-4%鹿糖、100mg/l肌醇、 25-45mMKN03、l-15mMMgS04或 5-35mMMgN03及ImMNaH2P04、0.2mg/l激动素和 0.1mg/l NAA(1-萘乙酸）（pH5. 4-5. 8)。
[0154] 阶段5:收获
[0155] 细胞达到10% -70% (w/v)细胞生物量后，收获细胞。将收获的细胞干燥以产生 精细的粉色-紫色粉末，具有典型成分、味道和气味。
[0156] 实施例2 :培养基成分和生物反应器设计对在大规模生物反应器中生长的红葡萄 细胞中白藜芦醇水平的影响
[0157] 2. 1培养基成分
[0158] 实验1:培养基成分对在Erlenmeyer摇瓶中生长的红葡萄细胞中白藜芦醇量的影 响
[0159] 将红葡萄细胞如实施例1阶段1所述在Erlenmeyer摇瓶中不同培养基成分中生 长：MS、WP、WP+酪蛋白水解物（酪蛋白胨）、GamborgB5。结果示于表1，表明在GamborgB5 培养基中生长的细胞与在MS、WP、WP+酪蛋白水解物（酪蛋白胨）培养基中生长的细胞相比 产生高大约4-15倍的白藜芦醇水平。
[0160]表1
[0161]
[0162] *数据是至少两个实验的平均数。
[0163]林MS-Murashige and Skoog培养基（Toshio Murashige and Folke K. Skoog in 1968)
[0164] *林WP-Woody植物培养基（WP) (Lloyd and McCown,1981)
[0165] 实验2 :培养基成分对生长及在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中 的白藜芦醇水平的影响
[0166] 将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器中如实施例1阶段3所述在不同培养基 成分中生长。
[0167] 将红葡萄细胞在两种类型培养基中生长：Gamborg B5培养基和补充的Gamborg B5。如下表2所示，补加的具有高水平镁、磷酸盐和硝酸盐或硫酸盐（KN03、MgS04、MgN03、 NaH2P04)B5培养基与在非补充的Gamborg B5培养基中生长相比获得较高的红 葡萄细胞生物量。
[0168] 表2 :在Gamborg B5和补充的Gamborg B5培养基中在大规模生物反应器中红葡 萄细胞的生长
[0169]
[0170]
[0171] *数据是三个实验的平均数。
[0172] 此外，检验培养基成分对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中白 藜芦醇和总多酚水平的影响。将细胞在WP培养基及在含有不同浓度镁、硝酸盐和磷酸盐 (相应的是謂03、]\^0 4、]\%勵3、謂03和似11孑04)的6&11113〇找85培养基中生长。表3表明这 些盐为生产高水平多酚和白藜芦醇所需要，特别是当加入补充的GamborgB5培养基中时。 在WP培养基中不同，其总多酚和白藜芦醇水平非常低。
[0173] 图4显示红葡萄 细胞在大规模一次性生物反应器在补充的GamborgB5培养基中 生长的生长曲线。细胞经历指数生长，在第20直至40天产生500gr/l新鲜生物量。这些 细胞持续生长及可达到更高生物量。
[0174] 表3 :在大规模生物反应器（50L)中具有不同水平盐的不同培养基中生长的RGC 中白藜芦醇和总多酚的水平
[0175]
[0176] 注意-部分数值以范围呈现。
[0177] *括号内的数字描述加入Gamborg B5中的矿物质的其它浓度
[0178] **数据是至少三个实验的平均数
[0179] ***数据是至少十个实验的平均数
[0180]林林McCown，sWoody植物培养基（LloydandMcCown,Proc.Int.PlantProp. Soc. 30:421, 1981
[0181] 实验3 :在从摇瓶中至大规模生物反应器中不同生长阶段生长的RGC中白藜芦醇 和总多酚水平的一致
[0182] 如实施例1阶段1-4所述将红葡萄细胞从Erlenmeyer摇瓶至大规模一次性生物 反应器中在存在补充的Gamborg B5中在不同规模阶段生长。
[0183] 表4中的结果显示红葡萄细胞在Erlenmeyer中生长良好及合成高数量的白藜芦 醇和总多酚。当细胞在50U300-100L规模在一次性生物反应器中生长时，与在Erlenmeyer 培养瓶中生长相比获得更高的生长速度，通过细胞的鲜重和干重揭示，见表4中数据所示。 在所有规格的大规模生物反应器中，鲜重大于230g/l(表4)，而在Erlenmeyer中为166g/ 1。此外，在大规模一次性生物反应器中在补充的培养基中总多酚以及白藜芦醇的水平高于 在Erlenmeyer培养瓶中获得的水平，分别为901mg/l和200mg/l(表4)。与由其它人观测 的结果不同，这是首次证实果实植物细胞在大规模一次性生物反应器中的成功生长，具有 高水平的白藜芦醇和多酚产生。
[0184] 表4:在摇瓶和不同规模阶段生长的RGC中白藜芦醇和总多酚水平*
[0185]
[0186] *数据是至少三个实验的平均数。
[0187] 实验4:加入酪蛋白水解物对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞 中白藜芦醇和总多酚水平的影响
[0188] 如实施例1阶段3所述将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器中在补充的 GamborgB5 中生长。
[0189] 如表5所示，当在一次性大规模生物反应器中在有或无酪蛋白水解物的补充的培 养基中生长时，红葡萄细胞中白藜芦醇和总多酚的水平相似。
[0190]表5
[0191]
[0192] *数据是三个实验的平均数。
[0193] 实验5 :加入植物激素对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中白 藜芦醇和总多酚水平的影响
[0194] 如实施例1阶段3所述将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器中在补充的 Gamborg B5中生长。如表6所示，当在有或没有0. 5mg/lNAA和0. 2mg/l激动素的一次性 大规模生物反应器中生长时，红葡萄细胞中产生的白藜芦醇和总多酚水平相似（表6)。
[0195]表6
[0196]
[0197] *数据是三个实验的平均数。
[0198] 实验6 :蔗糖浓度对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞的影响
[0199] 如实施例1阶段3所述将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器（50L)中在具有 不同鹿糖浓度的补充的GamborgB5培养基中生长。
[0200] 将红葡萄细胞在含有2、3、4和6%蔗糖的补充的培养基中生长。如下表6所示，当 细胞在2-4%蔗糖中生长时达到最佳细胞生长和生物量（143-260克/L)。较高的蔗糖浓度 如6 %蔗糖抑制细胞生长达10倍（24克/L)。
[0201] 表 6A
[0202]
[0203]
[0204] 实验7:生物反应器构造、设计和结构对于在大规模一次性生物反应器中生长的 红葡萄细胞中的白藜芦醇和总多酚的影响
[0205] 在由灭菌的一次性的透明塑料容器制成的20L生物反应器中评定两种培养 基-Ml培养基和补充有镁、磷酸盐和硝酸盐的GamborgB5培养基-对于由细胞产生的白 藜芦醇的量的影响，并与在A.Decendit(1996)BiotechnologyLetters中公开的数据进一 步对比，后者细胞在20L玻璃容器中在頂1培养基中生长。
[0206] 结果表明在一次性生物反应器中在頂1培养基中生长的红葡萄细胞产生93mg/l 白藜芦醇（表7)，其与使用相同培养基（Decendit)在搅动的玻璃生物反应器中产生的水平 高大约3倍。此外，当这些细胞在一次性生物反应器中在补充的GamborgB5中生长时，产 生显著高水平的白藜芦醇，为387mg/l(表7)。
[0207] 表7:生物反应器类型和培养基成分对红葡萄细胞产生的白藜芦醇水平的影响
[0208]
[0209] *IM1培养基-Ref?文章A. Decendit (1996) Biotechnology Letters
[0210] **数据是至少三个实验的平均数
[0211] 进一步地，含有补充的GamborgB5的特定培养基成分与设计一次性生物反应器的 组合诱导细胞产生比在頂1培养基和搅动玻璃生物反应器中产生的水平高10-12倍的白藜 芦醇，及在一次性生物反应器中在頂1培养基中生长的细胞高4倍（表7)。
[0212] 这些结果显示生物反应器类型和培养基成分均为维持在20L或更大生物反应器 中产生的RGC中白藜芦醇的高水平所必需。
[0213] 实施例3:成分
[0214] 红葡萄和紫葡萄均含有有效的多酚、抗氧化剂和白藜芦醇，其有助于防止动脉狭 窄和硬化。越来越多的研宄表明在红葡萄和紫葡萄中及最后在红葡萄酒中发现的白藜芦醇 影响机体的重要代谢途径及可有益于健康。然而，其确实具有非常高的糖含量，因此应适度 摄食。
[0215] 在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞的成分是独特的。
[0216] 除了糖和白藜芦醇水平之外，所述红葡萄细胞的化学成分与使用标准农业实践生 长的葡萄相当。
[0217] 实验8 :与在葡萄园中生长的红葡萄相比在大规模一次性生物反应器中生长的红 葡萄细胞中的总糖、葡萄糖和果糖水平较低
[0218] 如实施例1阶段3和4所述在大规模一次性生物反应器中在补充的GamborgB5 中生长的红葡萄细胞中的总糖、葡萄糖和果糖的量与通过农业方式生长的不同类型红葡萄 的这些糖的水平相比低25-50倍（表8)。
[0219] 表8A&8B:在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞与农业生产的红葡萄 细胞之间糖水平对比（鲜重）（gr/100gr)
[0220] A.
[0221]
[0224] 样品1-农业餐桌红葡萄（以色列）_用于食用的红葡萄
[0225] 样品2-酿酒红葡萄1(以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄
[0226] 样品3-酿酒红葡萄2(以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄
[0227] 样品4-酿酒红葡萄1(南非）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄
[0228] 实验9:在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄的总多酚和白藜芦醇成分的 水平
[0229] 除了白藜芦醇之外，所述红葡萄细胞中总多酚的水平与田间生长的红葡萄中的量 相似，前者比后者中白藜芦醇的水平高40-800倍（表9和10)。如实施例1阶段3和4 描述的大规模一次性生物反应器中生长的5个批次的红葡萄细胞中的白藜芦醇的范围是 726-916mg/kg鲜重，相比之下农业生产的红葡萄中为l-12mg/kg(表9A、9B)。在干燥之后 红葡萄细胞干粉中白藜芦醇水平为6000-31000mg/kg粉末（表10)。
[0230] 方法：使用HPLC结合在280、520和306nm的UV/VIS检测分析红葡萄细胞中多酚 和白藜芦醇的水平。
[0231] 表9A&9B:比较红葡萄细胞和农业生产红葡萄中酚含量成分
[0232] 9A.农业生产的红葡萄中酚含量成分（mg/kg鲜重）
[0233]
[0234] 1Cantos E,EpsinJC and Tomas-Barberan FA. Varietal Differences among the Polyphenol Profiles of Seven Table Grape Cultivars Studied by LC-DAD-MS-MS. J. Agric. Food Chem. 202, 50:5691-5696.
[0235] 2Katalinic V, Mozina SS, Skroza D, Generalic I, Abramovic H，Milos M, Ljubenkov I, Piskernik S, Pwzo I,Terpinc P，Boban M, (2010). Polyphenolic profile, antioxidant properties and antimicrobial activity of grape skin extract of 14VitisVinifera varieties grown in Dalmatia(Croatia). Food chemistry 119:715-723.
[0236]3Dell'Agli M，Busciala A，Bosisio E，（2004)?Vascular effects of wine polyphenols. Cardiovascular research 63:593-602.
[0237] 4. Mattivi F，Zulian C，Nicolini G and Valenti L (2002) ? Wine，Biodiversity， Technology, and Antioxidants. Ann N. Y. Acad. Sci. 957:37-56.
[0238] 9B.红葡萄细胞中酚含量成分（mg/kg鲜重）
[0239]
[0240]
[0241] 表10 :红葡萄细胞中白藜芦醇和总多酚化合物含量（gr/kg干粉）
[0242]
[0243] 实施例4 :培养的葡萄细胞在体内角叉菜胶诱导的足水肿大鼠模型中的作用
[0244] 本项研宄的目的在于评估根据本发明的大规模生产方法产生的RGC(红葡萄细 胞）在大鼠急性炎症模型中的体内抗炎活性，以证实根据本发明产生的细胞的效力。最广 泛用于研宄急性炎症的实验模型之一基于足底内施用角叉菜胶。
[0245]该研宄通过两种方法评定RGC的效力：
[0246] 1.足体积测量
[0247] 2.自由活动的大鼠中炎性疼痛
[0248] 材料和方法：
[0249] 根据实施例1制备的红葡萄细胞（RGC)
[0250] 在注射角叉菜胶之前2小时，将RGC作为在无菌饮用水中的悬浮液以400mg/kg体 重的剂量口服。剂量水平为40mg/ml。每个大鼠施用lml/100g体重的悬浮液。
[0251]RGC组合物：给每只大鼠注射的多酚和白藜芦醇的量分别为14和4. 8mg/体重。角 叉菜胶诱导的大鼠足水肿：将大鼠分为3组，每组8只大鼠。所有组的大鼠均在左后足足底 注射1%角叉菜胶（0.lmg/足）或无菌盐水（0. 9%NaCl)。
[0252] 进行如下检测：
[0253] 足体积测量
[0254] ?在注射角叉菜胶之前时间点0及在注射后1、2、4小时用测径器按小时测量足体 积。
[0255] ?以两个轴测量足直径并计算足体积。在这个模型中的足水肿是炎症严重度的指 征。
[0256] ?对于每个时间点，通过减去基线足体积或者与基线足体积的百分比计算足体积 的变化。
[0257] 在自由行动的大鼠中测量炎性疼痛的热板方法
[0258] 使用热板方法确定自由行动的大鼠中的炎性疼痛。在诱导水肿并用运载体、吲哚 美辛或RGC制备物处理后，将大鼠置于维持55±0. 5°C温度的热板上。轻拂或舔舐后足或者 从热板上跳起的延时与其基线对比，作为反应时间。反应时间标示为在注射后1、2和4小 时。在无反应的情况中，使用60秒截止值以防止组织损害。
[0259] 组分配：
[0260] 运载体对照组（1M):对照大鼠在注射角叉菜胶之前2小时接受无菌饮用水（运载 体）。
[0261] 阳性对照组（"2M"）：阳性对照组的大鼠在注射角叉菜胶之前2小时接受2mg/kg 体重的n引噪美辛。
[0262] 测试组（"3M"）：在注射角叉菜胶之前2小时给大鼠口服施用在无菌饮用水中的 悬浮液400mg/kg体重剂量的RGC(lml/40mgRGC每100gr体重）。
[0263] 结果
[0264] 足水肿：
[0265] 图1显示用RGC制备物、作为对照的吲哚美辛和水处理的大鼠的足水肿（体积％ ) 的结果。使用重复测量的双向AN0VA及随后的Bonferroni事后检定进行统计学分析。对 照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小时显示统计学显著差异（p〈0.001)。对照 组与RGC制 备物（3M)组的对比在2和4小时显示统计学显著差异（p〈0. 001)。
[0266] 如图1所示，当用RGC制备物处理大鼠时，在1或2小时后足水肿降低至少为阳性 对照的水平。此外，在4小时后，用RGC制备物处理的大鼠表明足水肿降低甚至比对照组还 低。
[0267] 炎性疼痛
[0268] 图2显示在用RGC制备物、用作对照的吲哚美辛和水处理后每组的痛觉过敏作用。 使用重复测量的双向AN0VA及随后事后检定进行统计学分析。对照组1M与阳性对照组2M 的对比在2和4小时显示统计学显著差异（p〈0. 05-0. 01)。对照组与RGC(3M)对比在4小 时显示统计学显著差异（P〈〇. 01)。
[0269] 如在图2中可见，在注射角叉菜胶2和4小时后，运载体处理的对照组（1M)(接受 无菌饮用水）显示对热刺激的反馈时间S(时间）显著增加。这通过这组中大鼠的足底热 刺激反应性降低表明。
[0270] 如在图3中可见，在注射角叉菜胶后2和4小时，与运载体对照组相比阳性对照组 (吲哚美辛处理的大鼠，2M)显示对热刺激的反应延时S显著降低。
[0271] RGC处理的大鼠（3M)显示在注射角叉菜胶4小时后对热刺激的反应延时S降低， 与运载体处理的对照组相比有统计学显著性。
[0272] 综上所述，这个实施例的结果表明与角叉菜胶诱导的大鼠后足炎症相关的足水肿 和行为痛觉过敏通过口服根据实施例1所述方法制备的RGC而显著减弱，表示甚至在大规 模方法中制备的RGC制备物的抗炎作用。
[0273] 实施例5 :RGC-RES的化学性质（与其它来源的RES相比）及RGC-RES的人体生物 利用度性质
[0274] 材料和方法
[0275] 红葡萄细胞（RGC)根据实施例1所述制备。RGC的白藜芦醇（RES)含量通过HPLC 在306nm针对合成的RES标定曲线确定。
[0276]RGC-RES的LC/MS分析
[0277] 将RGC粉末溶解于80%甲醇中。使用AccelaLC系统结合装备电喷射离子源的 LinearTrapQuadrupole(LTQ)OrbitrapDiscoveryhybridFT质谱仪（ThermoFisher ScientificInc.)对样品进行液态层析质谱分析（LC-MS)。质谱仪以负离子化模式运行， 质谱在m/z150-2000获得。
[0278] 溶解性测定
[0279] 将RGC、合成的白藜芦醇（S-RES;Sigma-Aldrich)及从植物虎杖（Polygonum capsidatum)中提取的白藜芦醇（植物-RES)溶解于80%甲醇中以实现100%溶解。然后， 将所有RES来源在pH2和pH7均溶解于水中，在水中的溶解百分比与在甲醇中的溶解百 分比对比。所有样品中的RES均在306nm基于其特征性吸光图谱监测，其浓度通过白藜芦 醇分析标准的标定曲线确定。
[0280] 结果
[0281] LC/MS
[0282]RGC粉末的负离子模式的质谱和代表性LC/MS层析图在图6A和6B中显示。针 对RGC中白藜芦醇（m/z-227. 0701-227. 0737的四种衍生物检测的LC-MS分析，均显示在 306nm的UV吸光度。这些衍生物中三种是反式-RES异构体的己糖苷，在4. 6、5. 3和6. 1分 钟的保留时间检测到。第四种衍生物是反式-RES，在6.9分钟的保留时间检测到（表12)。 证实四种衍生物的相同性，如通过ESI质谱显示（图7)。
[0283] 表11 :RGC中白藜芦醇衍生物的鉴定
[0284]
[0285] 溶解性
[0286] 将RGC-RES的溶解性与两种反式-RES产物对比：合成的RES和植物虎杖RES。所 有三种所检测的产物均完全溶解于80%甲醇溶液中。然而，当这三种RES产物溶解于模拟 胃pH条件的酸化水（pH= 2)以及在pH7. 0时，RGC-RES的溶解比两种其它RES的溶解高 6倍，RGC-RES为44%，两种其它RES为7% (图5)。
[0287] 人生物利用度研宄
[0288] 该研宄是单一剂量随机的交叉对比性药动学研宄。15个成人健康禁食男性对象接 受研宄产物RGC(口服剂量等价于50mg或150mg反式-RES)，间隔至少7天冲洗（washout) 期）。在给药后4小时提供标准饮食。遵循以色列卫生部（M0H)的所有规章制度及根据 ICHGCP指导进行研宄。该方案由SorokaUniversityMedicalCenterIRB许可，包括给每 个患者施用一次50或150mg剂量，随后7天冲洗，第二次施用，这次与第一次不同，由此开 始接受50mg的患者将接受150mg，反之亦然。在这项研宄中征募15个健康非吸烟男性志愿 者。志愿者资格标准包括年龄在18-55岁，BMI彡19及彡30。要求对象在第一次给药之前 7天及在整个研宄期间禁食含有RES的食物、营养补充剂或饮料，及禁食所有药物包括非处 方药。
[0289] 样品收集和处理
[0290] 将在施用前（切）和施用后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10和12小时的 静脉血样品收集在含有K2EDTA的试管中。将血液样品保持在冰浴中，并在黄光下立即处理。
[0291] 血浆中白藜芦醇含量分析
[0292] 由PRACSInstitute(Toronto,Canada)进行样品制备及血衆样品中游离和总RES 的LC-MS分析。血浆样品经液体-液体提取并用于LC-MS/MS系统进行分析。对于游离和 总RES的较低限度定量（LL0Q)分别为0. 5和20ng/mL。对于总RES分析，在LC-MS/MS分析 之前进行酶促水解和蛋白质沉淀提取。
[0293] 药代动力学分析
[0294] 使用未分区药代动力学方法针对游离RES和总RES(游离和缀合的）计算下列药 代动力学变量：最大血浆浓度（Cmax)和最大血浆浓度时间（Tmax)，在整个收集期间的平均 浓度，通过梯形法的从时间（0)至最后可计量浓度（Clast，高于L0Q)的血浆浓度对时间曲 线下面积（AUC)。
[0295] 结果
[0296] 人口统计学和安全性：15个健康男性志愿者参与这项研宄。对象年龄范围是 28-55岁（平均42. 1岁），BMI范围是21. 4-30 (平均25. 8)。所有对象在筛选和准入时均 检测对药物和乙醇是阴性的，关于实验室参数和生命体征测量无临床显著异常。在整个研 宄中无不利事件观测到或报道。
[0297] 游离和总白藜芦醇的血浆药代动力学：总RES和游离RES的平均反式-RGC-RES血 浆浓度与时间曲线在图9中显示。正如所见，在两个浓度的RGC图展示两个清晰的浓度峰， 第一个峰在1小时后，第二个峰（更高）在5小时后。
[0298]t-RES的平均药代动力学参数在表12A和12B中概括。
[0299] 表12A和12B:在补加RGC之后血浆药代动力学数值
[0300] A.总白藜芦醇
[0301]
[0302] B.游离白藜芦醇
[0303]
[0304] 在前两个测量时间点0.33和0. 67小时分析表明在接受RGC的对象血浆中RES的 可测量数量（表13)。此外，在0.33小时时间点期间，RGC组中所有对象（除了RGC150mg 组中的一个）均具有可测量的总RES浓度（表13和14)。
[0305] 表13 :在前两个测量时间点血浆中具有可检测量RES(总/游离）的对象
[0306]
[0307] 表14 :在施用后前三个测量时间点的总RES和游离RES的浓度（ng/mL)
[0308]
[0309] 结论
[0310] 源自RGC中的RES特征在于添加一个己糖部分。尽管己糖的提取类型及其精确 定位还未鉴定，但是很可能的是，RGCRES是云杉新甙-天然存在于红葡萄中的最常见类型 的RES。在游离和总体形式的RES中证实的两个峰的现象是独特的及在其它类型RES中未 观测到。可能RGCRES中糖苷基团的存在使其更可溶，这可以在溶解性检测中观测到，其中 RGC-RES与合成的和植物衍生的RES相比更溶于水。这种独特的两个浓度峰的模式也可归 因于RGC的独特成分及之间的协同，所述RGC含有完全的红葡萄基质和高水平的糖苷白藜 芦醇。发现这种性状在高浓度RES存在的情况下以高速率表现，快达施用后20分钟。
[0311] 如在浓度/时间曲线（图6A)中清晰可见的，RGC-RES在1和5小时出现两个非 常明显的浓度峰。
[0312] 重要地，合成的或酵母发酵来源的RES(Poulsen,MM.，Vestergaard,PF.，C1 asen,BF. ,Radko,Y. ,etal. ,High-doseresveratrolsupplementationinobese men:aninvestigator-initiated,randomized,placebo-controlledclinical trialofsubstratemetabolism,insulinsensitivity,andbodycomposition. Diabetes2013, 62, 1186-1195)以及植物来源的1?5(六1111(^，]\11，1?〇111161'，8.，〇3〇，1'. M. ,Fanciullino,R. ,etal. ,Optimizationoftrans-Resveratrolbioavailabilityfor humantherapy.Biochimie2013, 95, 1233-1238)的浓度时间曲线显示明显的单一浓度峰。 这显示一天补充一次RGC对于延长作用是足够的，而在其它产物中，可需要多于一次的补 充或者每天更高水平以达到相同作用。
[0313] 虽然本发明的某些特征在本文已经例证和描述，但是本领域技术人员对本发明可 以进行一些修改、取代、改变和等价处理。因此，应理解所附权利要求涵盖在本发明原理内 的所有这些修改和变化。
【主权项】
1. 体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物的大规模方法，包括： 使葡萄细胞在瓶中生长； 将葡萄细胞从所述瓶接种到第一生物反应器中； 将葡萄细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中该另一生物反应 器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，及其中所述第一生物反应器和另一个生物 反应器的至少一个是一次性的；及 从最后的生物反应器收获葡萄细胞； 其中使从最后的生物反应器收获的葡萄细胞干燥。2. 权利要求1的大规模方法，其中用于该方法中的每个生物反应器的大小大于葡萄细 胞先前在其中生长的生物反应器。3. 权利要求1的方法，其中如果所述另一个生物反应器是中间生物反应器，进行另外 的将葡萄细胞接种于另一个中间生物反应器或者最后的生物反应器的步骤。4. 权利要求1的方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是4-10升的生物 反应器。5. 权利要求1的方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是10-50升的生 物反应器。6. 权利要求1的方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是50-200升的生 物反应器。7. 权利要求1的方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是200-500升的 生物反应器。8. 权利要求1的方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是200-1000升的 生物反应器。9. 权利要求1的方法，其中葡萄细胞生长于GamborgB5培养基中。10. 权利要求9的方法，其中所述GamborgB5培养基补充有镁盐、磷酸盐或硝酸盐或者 其组合。11. 权利要求9的方法，其中所述GamborgB5培养基补充有KNO3、MgS04、MgNO^ NaH2PO4或者其组合。12. 权利要求1的方法，其中所述一次性生物反应器是由一或多层聚乙烯制成。13. 权利要求12的方法，其中所述一次性生物反应器是由聚乙烯内层和外层及中间的 尼龙层制成。14. 权利要求8的方法，其中所述GamborgB5培养基不包含植物激素。15. 权利要求8的方法，其中所述GamborgB5培养基包含植物激素。16. 权利要求9的方法，其中GamborgB5培养基补充有2-4%的蔗糖。17. 粉末形式的组合物，其包含在大规模方法中体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈 伤组织培养物，其中所述葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物源自一或多个葡萄浆果横 切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、葡萄有种子或无种子栽培种的胚或者葡萄种皮； 其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含白藜芦醇的量为至少l〇〇〇mg/kg粉末。18. 权利要求17的组合物，其特征在于在施用一次所述组合物后血浆中白藜芦醇的浓 度的两个峰。
【专利摘要】本发明涉及生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物的体外生产的大规模方法，涉及根据这种方法生产的产物及涉及包含多酚复合物的组合物，所述多酚包括白藜芦醇，其中白藜芦醇与多酚的比率高于天然生长的葡萄中的白藜芦醇与多酚的比率。
【IPC分类】C12P1/00
【公开号】CN104903454
【申请号】CN201380068719
【发明人】Y·哈加伊, Y·罗斯, M·阿扎希, R·亚图夫
【申请人】生物收获有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月28日
【公告号】EP2914732A1, US20150275169, WO2014068557A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大规模生产果实细胞的方法。本发明的一个实施方案涉及大规模体外 生产果实细胞的方法，其包括初级和次生代谢物。
【背景技术】
[0002] 大规模方法为本领域已知且为工业化生产各种材料所必需。由于大规模方法不能 通过与小规模方法相同的方式进行，因此即使存在小规模生产方法，也必须设计大规模生 产材料的特定方法。
[0003] 营养保健品有时是使用合成方法制备的，提供希望的活性成分，如多酚，其是在果 实细胞中天然发现。然而，使用合成方法未与活性成分一起提供有时有助于配制物的效力 的天然成分。
[0004] 其它类型的营养保健品是从天然植物中制备的；然而，所有已知的从植物中制备 营养保健品的大规模生产方法包括从制备的植物细胞中提取，以获得希望的活性成分。然 而，当提取例如含有多酚的植物时，最终产物也许是苦味的。仅一部分植物可以被成功提 取，因为仅其含有希望量的活性成分。
[0005] 制备果实细胞的小规模方法为本领域已知；然而，大规模方法更难以设计，因为其 趋于扩大初级代谢物的生产，同时使次生代谢物的产生最小化。由于活性成分如多酚是次 生代谢物，因此其大规模生产是复杂的。
[0006] 已知源自含有多酚的果实的营养保健品的有益作用。红葡萄酒作为这些调节性 成分的来源的用途因为其较高的乙醇含量和糖分而受限。此外，已经显示葡萄酒和酿酒葡 萄的治疗性作用依赖于种类、位置、年份（年度气候）、加工等，及因此依赖红葡萄酒、葡萄 或葡萄种子作为这些调节性化合物的来源导致无法进行原材料的均一的或一致的供应。此 外，果实通常被残余的杀真菌剂、病原体、杀虫剂和污染物等污染。
[0007] 此外，来自红葡萄酒和果实提取物的多酚的胃肠道输送的潜在益处受限于其靶组 织和细胞的生物利用度。由于其通过肠道时的生物利用度的明显差异，在指定食物中某一 多酚的丰度与其作为体内活性化合物的浓度之间无相关性可描绘。例如小肠中类黄酮的吸 收范围为剂量的0-60%范围，消除半衰期为2-48小时。大多数多酚在肠道中经历广泛代 谢，主要以甲基葡糖苷酸或葡糖苷酸硫酸盐形式存在于血清和尿液中。在已知的多酚中， 在红葡萄、红葡萄酒及其它食物如不同种类的浆果和花生中发现的植物抗毒素白藜芦醇 (反式-3, 5, 4' -三羟基芪）（RES)已经引起众多关注。确信其是造成"法国悖论（French paradox) "的原因，这是与尽管高脂饮食但心血管疾病的低发生率相关的一个现象，是适度 引用红葡萄酒的结果。然而，RES的物理化学性质如低水溶性及其高肝脏摄取有损于其生物 利用度。此外，由于快速和广泛代谢随之形成各种代谢物，RES的口服生物利用度非常低。
[0008] 关于RES活性和作用的研宄主要依赖于白藜芦醇的三个来源，即纯合成的RES，天 然植物来源的RES(例如Poligonumcupcidatum提取物）产物，或者较低程度的完整红葡 萄或其产物（红葡萄酒、葡萄汁、葡萄提取物）。红葡萄细胞（RGC;FruituraBioscience Ltd,Israel)是一种天然的专利保护的培养细胞配制物，源自葡萄（VitisviniferaL.)栽 培品种的果实，包含多酚的全部基质，包括白藜芦醇及天然存在于红葡萄中的其它成分。
[0009]RES结构中的芳香基团使其可以作为抗氧化剂及防止在疾病过程中的重要反应， 如在动脉粥样硬化中发生的LDL氧化。RES也显示调节慢性疾病如癌症和糖尿病的炎性应 答。动物研宄已经显示RES参与减弱疼痛以及急性炎症。
[0010] 因此，需要从天然材料制备果实细胞的大规模方法，包括产生果实细胞的初级及 次生代谢物。需要可以在大规模生产方法中制备的天然（植物）组合物，其中活性成分的 量是一致及复现的（例如克隆制品），是高生物利用度的，及易于施用以治疗和预防各种疾 病和失调。
【发明内容】
[0011] 在本发明的实施方案中，提供了体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织 培养物的大规模方法，包括：将葡萄细胞在瓶中生长；将葡萄细胞从瓶接种到第一生物反 应器中；将葡萄细胞从第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中另一个生物反应 器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，及其中第一生物反应器和另一生物反应器 至少一个是一次性的；及从最后的生物反应器中收获葡萄细胞；其中将从最后的生物反应 器中收获的葡萄细胞干燥。
[0012] 在本发明的一些实施方案中，用于所述方法中的每个生物反应器的大小大于葡萄 细胞先前在其中生长的生物反应器的大小。
[0013] 在本发明的一些实施方案中，如果所述另一个生物反应器是中间生物反应器，则 进行将葡萄细胞接种于另一中间生物反应器或者接种于最后的生物反应器的额外步骤。
[0014] 在本发明的一些实施方案中，第一生物反应器或另一个生物反应器是4-10、 10-50、50-200、200-1000 或 1000-5000 升生物反应器。
[0015] 在本发明的一些实施方案中，葡萄细胞在Gamborg B5培养基中生长。
[0016] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基补充有（enrichedwith)镁、磷 酸盐或硝酸盐或者其组合。
[0017] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基补充有KN03、MgS04、MgN03或 NaH2P04或其组合。
[0018] 在本发明的一些实施方案中，一次性生物反应器是由一或多层聚乙烯制成的。
[0019] 在本发明的一些实施方案中，一次性生物反应器是由聚乙烯内层和外层及中间尼 龙层制成的。
[0020] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基不包含植物激素。
[0021] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基包含植物激素。
[0022] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基补充有2-4%的蔗糖。
[0023] 在本发明的一个实施方案中，提供粉末形式的组合物，其包含在大规模生产方法 中体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物，其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组 织培养物源自一或多个葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或无 种子栽培种的葡萄胚或者葡萄种皮；其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含白藜 芦醇的量为至少l〇〇〇mg/kg粉末。
【附图说明】
[0024] 本发明附图（仅作为示例）加以描述。具体关于附图的详细描述，需要强调的是 图中显示的事项只是为了举例及论述本发明优选的实施方案，及是为了提供确信最有效和 易于理解的本发明的原理描述和观点而呈现。在这方面，未尝试显示比基本理解本发明必 需的更详细的本发明的结构详情，结合附图的描述使得本领域技术人员了解可以实施的本 发明的一些形式。
[0025] 图1证实在角叉菜胶注射之前用RGC制备物、吲哚美辛和水（作为对照）处理的 大鼠中足水肿的测量（体积％ )，。使用重复测量的双向ANOVA，然后用Bonferroni事后检 定进行统计学分析。对照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小时显示统计学显著 差异（p〈0. 001)。对照组与RGC-制备物（3M)组的对比在2和4小时显示统计学显著差异 (p<0. 001) 〇
[0026] 图2显示在研宄期间通过热板（HotPlate)测量的每组的痛觉过敏作用分布（结 果以与时间成函数的"热板延时，自基线％ "表示）。使用重复测量的双向AN0VA，然后用 Bonferroni事后检定进行统计学分析。对照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小 时显示统计学显著差异（P〈〇. 05-0. 01)。对照组与RGC(3M)对比在4小时显示统计学显著 差异（P〈〇. 01)。
[0027] 图3显示通过热板测量的每组的痛觉过敏作用分布（结果以与时间成函数的"热 板延时8,基线-实际时间"表示）。使用重复测量的双向AN0VA，然后用Bonferroni事后 检定进行统计学分析。对照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小时显示统计学显 著差异（P〈〇. 05-0. 01)。对照组与RGC-处理的小鼠（3M)对比在4小时显示统计学显著差 异（p〈0. 01) 〇
[0028] 图4显示4个不同批次的在补充的GamborgB5培养基的大规模一次性生物反应 器中生长的红葡萄细胞的生长曲线。在20直至40天，细胞经历指数生长，产生500gr/l鲜 生物量。
[0029] 图5提供了白藜芦醇（RES)在水中的溶解性结果，比较RGC-RES、合成的RES和植 物RES的溶解性。
[0030] 图6A和6B显示在施用一剂RGCRES之后反式-RES的血浆含量，其中图9A显示 总反式-RES，图9B显示游离反式-RES。呈现的数值是平均数（n= 15)。
[0031] 发明详述
[0032] 在如下详细描述中，阐述了很多具体细节以充分理解本发明。然而，本领域技术人 员应理解本发明可以不用这些具体细节而实施。在其它情况中，未详细描述熟知的方法、程 序和成分免得使本发明模糊不清。
[0033] 本发明的实施方案涉及大规模体外生产果实细胞的方法。在本发明的一些实施 方案中，所述方法不包括果实细胞的提取。令人惊奇地，根据本文所述大规模方法产生的 果实细胞显示包含较高量的多酚，特别是次生代谢物白藜芦醇。本发明提供了独特的红葡 萄细胞（RGC)组合物，其是规模生产的结果，包括多酚的完全基质及红葡萄细胞中天然存 在的其它健康成分，与在新鲜葡萄中发现的浓度相比具有显著较高的葡萄白藜芦醇浓度 (40-800倍或更高）（见实验9和表9)。
[0034] 如本文所用，术语"多酚"是指天然存在的植物有机化合物，其具有一个以上的苯 酚基团。多酚可以是从简单分子如酚酸至大的高聚合的化合物如鞣酸。多酚的酚环通常与 各种糖分子、有机酸和/或脂质缀合。这种缀合的化学结构中的差异导致各种多酚化合物 的作用模式和健康性质中的化学分类和变化。举例的多酚包括但不限于花青素、生物类黄 酮（包括以下亚类：黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷醇和二氢黄酮）、原花青素、氧杂蒽酮、酚酸、 芪类和木脂素。白藜芦醇（3, 4, 5-三羟基芪）是一种类型的多酚，是以其单体形式、反式白 藜芦醇、顺式白藜芦醇、反式-葡糖苷和顺式-葡糖苷呈现的多酚芪。
[0035] 根据本发明的一个实施方案，果实是葡萄。葡萄可以是有色葡萄（例如红色、黑 色、紫色、蓝色及之间所有颜色变化）。或者，葡萄可以是无色葡萄（例如绿色或白色或者之 间的任何颜色）。
[0036] 本发明这个方面的果实可以是野生或栽培变种。举例的栽培种葡萄包括属于 葡萄属的那些葡萄。举例的葡萄属变种包括但不限于欧洲葡萄（Vitis vinifera，V. vinifera)、森林葡萄（V. silvestris)、V. muscadinia、圆叶葡萄（V. rotundifolia)、河 岸葡萄（V. riparia)、夏特沃氏葡萄（V. shuttleworthii)、V. lubrisca、V. daviddi、山葡 萄（V. amurensis)、V. romanelli、夏葡萄（V. aestivalis)、辛西安那葡萄（V. Cynthiana)、 V. cineria、V. palmate、V. munsoniana、霜葡萄（V. cordifolia)、Hybrid A23-7-71、 V. acerifolia、V. treleasei和桦叶葡萄（V. betulifolia)。
[0037] 根据一些实施方案，果实细胞源自有色或无色葡萄。如本文所述，根据一些实施方 案，果实细胞是从果实细胞培养物制备的。根据本发明的一些实施方案，果实细胞是从葡萄 浆果细胞培养物制备的。根据一些实施方案，葡萄浆果细胞的培养物源自一或多个葡萄浆 果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或无种子栽培株的葡萄胚或者葡萄 种皮。根据另一个实施方案，果实细胞培养物可以源自植物的任何部分，包括但不限于胚 乳、糊粉层、胚（或者其作为盾片和子叶的部分）、果皮、茎、叶、块茎、表皮毛（trichomes)和 根。
[0038] 根据本发明的一些实施方案，尽管物质包括多酚的量在果实中可以变化，但是使 用制备果实细胞培养物的培养方案确保制备物及其含量的再现性。因此，从相同培养物制 备的不同批次的果实细胞具有典型的HPLC指纹。根据一些实施方案，每个批次中不同物质 的浓度可以变化，但是如上所述如果从相同的培养物制备，则所有批次的HPLC指纹是一致 的。
[0039] 在本发明的一些实施方案中，提供了粉末形式的组合物，其包含所述大规模方法 中的体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物，其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤 组织培养物源自一或多个葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或 无种子栽培株的葡萄胚芽或者葡萄种皮；其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含 的白藜芦醇的量为至少l〇〇〇mg/kg粉末。在本发明的一些实施方案中，根据本发明所述大 规模方法的实施方案生产的葡萄细胞中至少90%的白藜芦醇是反式-葡糖苷白藜芦醇。
[0040] 根据一些实施方案，所制备的果实细胞中不同多酚的相对量与其在农业葡萄果实 中的相对量不同。这在实施例3、表9中清晰可见，其中将在根据本发明的实施方案大规模 生产的干燥的葡萄细胞培养物中总的白藜芦醇与葡萄中白藜芦醇的量比较。根据一些实施 方案，某些多酚的量在所制备的果实细胞与其在农业葡萄果实中的量相比增加。根据一些 实施方案，白藜芦醇的量在果实细胞中增加 。根据一些实施方案，果实细胞（可以是葡萄细 胞）在干燥为粉末之后其中白藜芦醇的量为1000-50000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于1000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于3000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于5000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于10000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于20000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于30000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于40000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于50000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于60000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于70000mg/kg。
[0041] 根据一些实施方案，所制备的果实细胞中各种成分的相对量与其在农业葡萄果实 中的相对量不同。根据一些实施方案，所述果实细胞中糖的相对量与农业葡萄果实中糖的 相对量相比降低。
[0042] 根据一些实施方案，根据本发明的大规模方法制备的果实细胞含有少于10%w/v 甜味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于5%w/v甜味糖。根据一些实施方案， 所述果实细胞含有少于3 %w/v甜味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于2% w/v甜味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于l%w/v甜味糖。根据一些实施方 案，所述果实细胞含有约l%w/v甜味糖。如本文所用，短语"甜味糖"是指提供甜味的糖， 如蔗糖、葡萄糖和果糖。
[0043] 根据一些实施方案，将果实细胞干燥，从而浓缩在其中发现的物质，包括糖。根据 一些实施方案，所述物质浓缩5倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩10倍。根据一些实施 方案，所述物质浓缩15倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩20倍。根据一些实施方案， 所述物质浓缩25倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩30倍。
[0044] 根据一个实施方案，干燥的果实细胞含有直至10%w/v甜味糖。根据本发明的一 些实施方案，干燥的果实细胞含有直至15%w/v甜味糖。根据一个实施方案，干燥的果实 细胞含有直至10-15%w/v甜味糖。根据一个实施方案，干燥的果实细胞含有直至15-20% w/v甜味糖。
[0045] 根据一个实施方案，干燥的果实细胞含有少于20% w/v甜味糖。根据一个实施方 案，干燥的果实细胞含有少于30%w/v甜味糖。
[0046] 根据一些实施方案，根据本发明的大规模方法制备的果实细胞是无味的；根据其 它的实施方案，根据本发明的大规模制备的果实细胞是有味的。
[0047] 在本发明的一个实施方案中，提供体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组 织培养物的大规模方法，所述方法包括：
[0048] 将葡萄细胞在瓶中生长；
[0049] 将葡萄细胞从瓶接种至第一生物反应器中；以及收获所产生的葡萄细胞。
[0050] 在本发明的一些实施方案中，提供了体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤 组织培养物的大规模方法，所述方法包括：
[0051] 将葡萄细胞在瓶中生长；
[0052] 将葡萄细胞从瓶接种至第一生物反应器中；将葡萄细胞从所述第一生物反应器接 种至另一个生物反应器，其中所述另一个生物反应器是最后的生物反应器或者是中间生物 反应器，及可以提供使用一或多个中间生物反应器的一些更多的步骤及其中所述第一生物 反应器和所述另一个生物反应器中的至少一个是一次性的；及
[0053] 从最后的生物反应器中收获葡萄细胞；
[0054] 其中将从最后的生物反应器收获的葡萄细胞干燥。
[0055] "一次性生物反应器"是指具有一次性包袋的生物反应器，其可以是代替培养容器 的一次性使用的包袋。所述一次性包袋通常是由三层或更多层塑料薄片制成。在本发明的 一些实施方案中，一层是由聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或LDPE制成，以提供机械稳定 性。第二层是使用尼龙、PVA或PVC制成，其作为气体屏障。最后，接触层由PVA或PP制成 或者是另一聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或LDPE层。对于医学应用，接触产物的一次性 使用的材料必须通过EuropeanMedicinesAgency或者其它地区的相似权威机构认证。
[0056] 根据本发明的一些实施方案，一次性生物反应器由一或多层的聚乙烯制成。在本 发明的一些实施方案中，一次性生物反应器是由聚乙烯内层和外层及中间尼龙层制成。
[0057] 通常地，有两种不同方法构建一次性使用的生物反应器，区别在于用于搅动培养 基的方式。
[0058] 一些一次性使用的生物反应器使用搅拌器，像常规生物反应器一样，但是搅拌器 整合在塑料包袋中。密闭的包袋和搅拌器提前灭菌。在使用中，将包袋安装在生物反应器 中，及将搅拌器与机械性或磁性驱动器连接。
[0059] 其它一次性使用的生物反应器是通过摇摆运动搅动的。其它一次性使用的生物反 应器是空气搅拌的（airlift)生物反应器，其中通过空气的导入搅动反应培养基及使其通 气。这种类型的生物反应器不需要在一次性使用包袋内部的任何机械性搅动器。
[0060] 根据一些实施方案，制备果实细胞的大规模方法包括许多随后的步骤。根据本发 明的一些实施方案，在每个步骤中制备的果实细胞的量大于或者不大于在先前步骤中制备 的量。进一步地，在每个步骤中制备的果实细胞接种或收获以用作大规模方法中下一步的 起始物。在大规模方法的最后步骤中，通常使果实细胞生长直至其达到生长曲线图的平台 期。
[0061] 使用本发明的大规模方法的优势在实施例章节中是清楚的并得到证实。如在实施 例2、实验2中可见，使用补充的GamborgB5培养基的红葡萄细胞（RGC)的生物量高于与在 非补充的GamborgB5培养基中获得的生物量。进一步地，甚至在大规模生物反应器中，使 用含有不同浓度的镁、硝酸盐和磷酸盐（KN03、MgS04、MgN03、NaH2P04)的GamborgB5培养基 导致所产生的细胞中的高水平白藜芦醇。
[0062] 表4和实施例2、实验3显示在大规模一次性生物反应器中在补充的培养基中生长 的葡萄细胞中总多酚及白藜芦醇水平高于在Erlenmeyer瓶中生长的葡萄细胞中获得的水 平，即分别为910mg/l和203mg/l。与其它人的观测结果不同，这是首次证实在大规模一次 性1000-5000升生物反应器中果实植物细胞系的成功生长，具有较高水平白藜芦醇和多酚 产生。
[0063] 根据一些实施方案，提供组合物，其包含多酚复合物，所述多酚包括白藜芦醇，其 中白藜芦醇与多酚的量比率高于1:20。在一些实施方案中，这个比率高于1:10。在一些实 施方案中，这个比率高于1:5。在一些实施方案中，这个比率高于1:3。在一些实施方案中， 这个比率高于1:2。根据一些实施方案，所述组合物源自天然来源。根据一些实施方案，所 述组合物源自天然来源。根据一些实施方案，所述组合物源自在大规模一次性生物反应器 中生长的葡萄细胞。根据一些实施方案，所述组合物源自根据本文所述的方法的大规模一 次性生物反应器中生长的葡萄细胞。
[0064] 表7和实施例2、实验7显示两种培养基頂1培养基和补充有镁、磷酸盐和硝酸盐 的GamborgB5对于由细胞产生的白藜芦醇的量的影响。在由无菌的一次性透明塑料容器 制成的20L生物反应器中评定该影响，并与在A.Decendit(1996)BiotechnologyLetters 中公开的数据进一步对比，其中细胞是生长在20L玻璃容器中的Ml培养基中。结果表明 在一次性生物反应器中頂1培养基中生长的红葡萄细胞产生93mg/l白藜芦醇（表7)，其比 在使用相同培养基Oecendit)的搅动的玻璃生物反应器中产生的水平的大约高3倍。此 外，当这些细胞在一次性生物反应器中在补充的GamborgB5培养基中生长时产生显著高水 平的白藜芦醇，即387mg/l。因此，这个实验显示使用一次性生物反应器和含有不同浓度镁、 硝酸盐和磷酸盐（KN03，MgS04，MgN03，NaH2P04)的GamborgB5培养基的优势以及使用一次性 生物反应器和补充的GamborgB5培养基组合的优势。
[0065] 根据一些实施方案，使果实细胞在生物反应器中生长。根据一些实施方案，设计生 物反应器以使得能够进行适当的混合及质量转移，同时使剪切力和流体动力压力强度最小 化。根据本发明的一些实施方案，至少一个生物反应器是一次性生物反应器。其可以是第一 生物反应器或者中间生物反应器或者最后的生物反应器或者其任意组合。根据本发明的一 些实施方案，一次性的生物反应器是最后的生物反应器，之后收获细胞并干燥以形成粉末。
[0066] 根据本发明一个举例的实施方案，第一步包括在瓶如Erlenmeyer或生物反应器 中制备果实细胞。根据一些实施方案，第一步包括制备直至1.0L的果实细胞培养物。根据 进一步的实施方案，第一步包括制备直至1. 5L的果实细胞培养物。根据进一步的实施方 案，第一步包括制备直至2. 0L的果实细胞培养物。
[0067] 根据一些实施方案，使用玻璃、金属或者塑料瓶进行第一步。根据一些实施方案， 该瓶是一次性的。根据进一步的实施方案，该瓶可以重新使用任何次数。根据一些实施方 案，该瓶在两次使用之间通过任何适当方式灭菌。
[0068] 根据一些实施方案，第一步包括使用任何合适的培养基以使得果实细胞生长。根 据一些实施方案，用于使果实细胞生长的培养基包括细胞生长培养基、盐、维生素、糖、激素 或者其任意组合。根据一些实施方案，细胞生长培养基是B5Gamborg(Gamborget al.，Exp. Cell Res. 50:151，1968)，或者其任何变型。根据一些实施方案，GamborgB5包含盐如镁、 磷酸盐、硝酸盐或其任何组合。根据本发明的一些实施方案，GamborgB5培养基包含KN03、 1%5044&11 2?04或者其任何组合。根据一些实施方案，培养基包含GamborgB5维生素或者其 任何组合。根据进一步的实施方案，培养基包含糖如蔗糖、GamborgB5或者其任何组合。
[0069] 在本发明的实施方案中，加入GamborgB5中的謂03的浓度为25mM-45mM。
[0070] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgSOj^浓度为
[0071] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的1%勵3的浓度为5mM-35mM。
[0072] 在本发明的实施方案中，加入GamborgB5中的謂03的浓度为15mM-60mM。
[0073] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgS04浓度为0. 5mM-25mM。
[0074] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgN03浓度为lmM-50mM。
[0075] 在本发明的实施方案中，加入GamborgB5中的KN03浓度为30mM-40mM。
[0076] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgS04浓度为5mM-10mM。
[0077] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgN03浓度为20mM-30mM。
[0078] 在本发明的实施方案中，将肌醇加入GamborgB5中。
[0079] 在本发明的实施方案中，将H3B03加入GamborgB5中。
[0080] 在本发明的实施方案中，将MnS04加入GamborgB5中。
[0081] 在本发明的实施方案中，将NaH2P04加入GamborgB5中。
[0082] 在本发明的实施方案中，将生物素加入GamborgB5中。
[0083] 在本发明的实施方案中，将D-泛酸钙加入GamborgB5中。
[0084] 在本发明的实施方案中，将大约0. 5mM肌醇加入GamborgB5中。
[0085] 在本发明的实施方案中，将大约0? 05mMH3B03加入GamborgB5中。
[0086] 在本发明的实施方案中，将大约0. 04mMMnS04加入GamborgB5中。
[0087] 在本发明的实施方案中，将大约ImMNaH2P04加入GamborgB5中。
[0088] 在本发明的实施方案中，将大约0. 004mM生物素加入GamborgB5中。
[0089] 在本发明的实施方案中，将大约0. 2mMD-泛酸钙加入GamborgB5中。
[0090] 在本发明的实施方案中，将大约 0? 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、 3、4、5、6、7、8、9、10mM肌醇加入GamborgB5 中。
[0091] 在本发明的实施方案中，将大约 0. 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、 0? 09、0.ImM1131303加入GamborgB5 中。
[0092] 在本发明的实施方案中，将大约 0. 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、 0? 09、0.ImMMnS〇J[]_AGambor gB5 中。
[0093] 在本发明的实施方案中，将 0? 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、3、4、 5、6、7、8、9、10mMNaH2P〇J[]_AGamborgB5 中。
[0094] 在本发明的实施方案中，将大约 0? 001、0. 002、0. 003、0. 004、0. 005、0. 006、0. 007、 0? 008、0. 009、0.OlmM生物素加入GamborgB5 中。
[0095] 在本发明的实施方案中，将大约 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、 3、4mMD_泛酸妈加入GamborgB5中。
[0096] 在本发明的实施方案中，加入GamborgB5中的蔗糖浓度为2-4%。在另一实施方 案中，浓度为大约3%
[0097] 根据进一步的实施方案，酪蛋白、酪蛋白水解物或者酪蛋白胨可以包含在细胞生 长培养基中。根据进一步的实施方案，生长激素可以包含在细胞生长培养基中。根据进一 步的实施方案，生长培养基包含激素。根据一些实施方案，果实细胞不用添加激素而生长。
[0098] 根据一些实施方案可以在所述方法的一或多个阶段使用的植物培养基的 例子包括但不限于：Anderson(Anderson,InVitro14:334，1978;Anderson,Act. Hort., 112:13, 1980),CheeandPool(Sci.Hort.32:85, 1987),CLC/Ipomoea(CP) (Cheeetal.,J.Am.Soc.Hort.Sci. 117:663, 1992),Chu(N.sub.6)(Chuet al.,ScientiaSinic. 18:659, 1975 ；Chu,Proc.Symp.PlantTiss.Cult.,Peking 43,1978), DCR (Gupta and Durzan,Plant Cell Rep. 4:177, 1985), DKW/Juglans(Driver and Kuniyuki, HortScience 19:507, 1984 ；McGranahan et al.,in:Bonga and Durzan,eds.,Cell and Tissue Culture in Forestry,MartinusNijhoff,D ordrecht, 1987),De Greef and Jacobs (De Greef and Jacobs,Plant Sc i. Lett.17:55,1979), Eriksson(ER)(Eriksson, Physiol. Plant. 18:976, 1965), Gresshoff and Doy(DBM2) (Gresshoff and Doy,Z Pflanzenphysiol.73:132, 1974),Heller 's (Heller, Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. 11th Ser. 14:1, 1953), Hoagland' s(Ho agland and Arnon, Circular 347,Calif.Agr.Exp. Stat. , Berkeley, 1950), Kao and Michayluk (Kao and Michayluk, Planta 126:105, 1975) , Linsmaier and Skoog(Linsmaier and Skoog,Physiol. Plant. 18:100,1965),Litvay's (LM)(Litvay et al. , Plant Cell Rep. 4:325, 1985), Nitsch and Nitsch(Nitsch and Nitsch, Science 163:85, 1969), Quoirin and Lepoivre(Quoirin et al. , C. R. Res. Sta. Cult.Fruit Mar. , Gembloux 93,1977), Schenk and Hildebrandt(Schenk and Hildebrandt, Can. J. Bo t.50:199,1972), White's(White, The Cultivation of Animal and Plant Cells, Ronald Press, NY, 1963)等。
[0099] 根据一些其它举例的实施方案，果实细胞和培养基在第一个步骤期间持续混合。 根据进一步的实施方案，果实细胞和培养基在第一个步骤期间间歇混合。根据一些实施方 案，第一个步骤期间的温度为20°C-30°C。根据一些实施方案，在第一个步骤期间的温度为 22°C_28°C。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长多于5天。根据一些实施方 案，果实细胞在第一个步骤生长多于7天。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长 多于5天但少于2周。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长多于5天以上但少 于12天。
[0100] 根据一些举例的实施方案，本发明方法中使用的生物反应器包括一个进口，在第 一个步骤果实细胞通过其进入，培养基和任何其它物质置于生物反应器中。根据进一步的 实施方案，本发明方法中使用的生物反应器包括排出任何希望的物质的出口。根据一些实 施方案，出口包括玻璃出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气 体出口是人工操作的。根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦瓶中的气 压（atmosphere)达到预定压力，贝气体从瓶中释出。根据一些实施方案，预定的压力直至 8PSI〇
[0101] 根据一些举例的实施方案，结束果实细胞生长的第一步之后，将果实细胞接种于 小规模生物反应器中，在此也称作第一生物反应器。对于大规模方法的第二步，根据一些 实施方案，小规模生物反应器是4L反应器。根据进一步的实施方案，小规模生物反应器是 3-5L反应器。根据进一步的实施方案，小规模生物反应器是3-10L反应器。根据进一步的 实施方案，小规模生物反应器是4-8L反应器。
[0102] 小规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类型 聚合物。根据一些实施方案，小规模生物反应器是一次性的。如果小规模生物反应器不是 一次性的，根据一些实施方案，在两次使用期间通过任何合适方式清洁和灭菌。
[0103]如上所述，已知当较大数量的果实细胞在生物反应器中生长时，次生代谢物包括 多酚如白藜芦醇的产生与在小规模生产如使用玻璃瓶如Erlenmeyers中相同代谢物相比 显著降低。然而，本文详细描述的大规模方法提供果实细胞，当在生物反应器中生长时其中 的次生代谢物的量不降低。进一步地，某些次生代谢物的产生甚至是扩大的。
[0104] 因此，根据本发明的实施方案，在小规模生物反应器中生长的果实细胞的次生代 谢物的相对量与其在第一步中的相对量相比不显著降低。根据一些实施方案，上述用于第 一步中生长培养基中的成分也可用于第二步。根据一些实施方案，小规模生物反应器中使 用的生长培养基与大规模生产方法的第一步中使用的培养基相同。根据一些实施方案，在 第二步生长培养基中发现的不同成分的相对量与第一步相同。根据其它的实施方案，在第 二步生长培养基中发现的不同成分的相对量与在第一步中使用的相对量不同。根据一些实 施方案，在第二步将另外的物质加入生长培养基中。
[0105] 根据一些实施方案，小规模生物反应器包括一个入口，果实细胞（来自第一步）、 空气、培养基及任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案，小规模生 物反应器包括一个出口，由此排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括一个气体 出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工操作的。 根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预定压力， 则气体从生物反应器中释出。根据一些实施方案，预定压力是8PSI。
[0106] 根据一些实施方案，果实细胞和培养基在第二步是持续混合的。根据进一步的实 施方案，果实细胞和培养基在第二步是间歇混合的。根据一些实施方案，第二步的温度是 20-30摄氏度。根据一些实施方案，果实细胞在第二步生长多于一周但少于两周。在本发明 的一些实施方案中果实细胞在接种于下一个生物反应器中之前生长9-16天。
[0107] 对于大规模方法的第三步，将收获的果实细胞置于大规模生物反应器中。根据一 些实施方案，大规模生物反应器是30-50L反应器。根据进一步的实施方案，大规模生物反 应器是40-60L反应器。根据进一步的实施方案，大规模生物反应器是30-70L反应器。根 据进一步的实施方案，大规模生物反应器是20-100L反应器。
[0108] 大规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类型 聚合物。根据一些实施方案，大的生物反应器是一次性的。如果大规模生物反应器不是一 次性的，根据一些实施方案，在两次使用期间通过任何合适方式清洁和灭菌。
[0109] 与小规模生物反应器相似，根据本发明的实施方案，在大规模生物反应器中生长 的果实细胞的次生代谢物与其在该方法的任何先前步骤中的相对量相比不显著降低。根据 一些实施方案，上述任何先前步骤中用于生长培养基中的成分也可以用于第三步。根据一 些实施方案，大规模生物反应器中使用的生长培养基与该方法的任何先前步骤中使用的培 养基相同。根据一些实施方案，第三步生长培养基中发现的不同成分的相对量与该方法任 何先前步骤中的量相同。根据其它的实施方案，第三步生长培养基中发现的不同成分的相 对量与该方法任何先前步骤中使用的相对量不同。根据一些实施方案，在第三步将另外的 物质加入生长培养基中。
[0110] 根据一些实施方案，大规模生物反应器包括一个入口，果实细胞（来自第二步）、 培养基、空气和任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案，大规模生 物反应器包括一个出口，以排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括一个气体出 口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工操作的。根 据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预定压力，则 气体从生物反应器中释出。根据一些实施方案，预定的压力为直至8PSI。
[0111] 根据一些举例的实施方案，果实细胞和培养基在第三步持续混合。根据进一步 的实施方案，果实细胞和培养基在第三步间歇混合。根据一些实施方案，第三步的温度是 20-30°C。根据一些实施方案，果实细胞在第三步生长大约2-3周。根据一些实施方案，果 实细胞在第三步生长大约3-5周。根据一些实施方案，果实细胞在第三步生长大约12-30 天。
[0112] 第三步果实细胞生长结束后，通常通过任何适当方式将果实细胞从中等规模生物 反应器接种。对于大规模生产方法的第四步，将收获的果实细胞置于更大规模生物反应器 中。根据一些实施方案，更大规模生物反应器是1000L反应器。根据进一步的实施方案，更 大规模生物反应器是200-500L反应器。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是 500-1000L反应器。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是1000-1500L反应器。 根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是500-1100L反应器。
[0113] 更大规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类 型聚合物。根据一些实施方案，大规模生物反应器是一次性的。如果大规模生物反应器不 是一次性的，根据一些实施方案，在两次使用之间通过任何合适方式清洁和灭菌。
[0114] 与小规模生物反应器相似，根据本发明的实施方案，在更大规模生物反应器中生 长的果实细胞的次生代谢物的量与其在该方法的先前步骤中的相对量相比不显著降低。根 据一些实施方案，上述在任何先前步骤中用于生长培养基中的成分也可用于该方法的第四 步。根据一些实施方案，在更大规模生物反应器中使用的生长培养基与在任何先前步骤中 使用的培养基相同。根据一些实施方案，在第四步中生长培养基中发现的不同成分的相对 量与先前任何步骤中的量相同。根据其它的实施方案，在第四步中生长培养基中发现的不 同成分的相对量与在任何先前步骤中使用的相对量不同。根据一些实施方案，在该方法的 第四步将其它物质加入生长培养基中。
[0115] 根据一些实施方案，更大规模生物反应器包括一个入口，果实细胞（来自第三或 第二步）、培养基、空气和任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案， 更大规模生物反应器包括一个出口，以排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括 一个气体出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工 操作的。根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预 定压力，则气体从生物反应器中释出。
[0116] 根据一些实施方案，果实细胞和培养基在第四步持续混合。根据进一步的实施方 案，果实细胞和培养基在第四步间歇混合。根据一些实施方案，第四步的温度是20-30°C。 根据一些实施方案，果实细胞在第三步或第四步生长直至达到细胞生物量为10% -70%。
[0117] 根据一些实施方案，在果实细胞在更大规模生物反应器中生长之后终止该大规模 生产方法。根据这种实施方案，果实细胞在更大规模生物反应器中生长直至达到细胞生物 量为10% -70%。细胞生物量达到10% -70 %后，通过任何合适方式从该大规模生物反应 器中收获果实细胞并进一步加工。根据一些实施方案，将果实细胞通过干燥、冻干、冷冻干 燥和 喷雾干燥等进一步加工。根据一些实施方案，果实细胞的加工不包括从中提取活性成 分。
[0118] 根据一些实施方案，大规模方法可包括将细胞从培养瓶中接种于可以是任何大小 的生物反应器并收获细胞的一个步骤。根据其它的实施方案，果实细胞可以接种于一系列 生物反应器中，其中每个生物反应器通常大于前一个使用的生物反应器。根据本发明大规 模方法进行任何数目的额外的步骤。额外的步骤包括可能的中间步骤，其中收获细胞或接 种及置于更大的生物反应器中及生长直至收获或接种并转移至更大的生物反应器。根据进 一步的实施方案，该方法包括使从大规模生物反应器中收获的果实细胞的额外步骤生长。
[0119] 在本发明的一个实施方案中，提供一种药物或营养组合物或者食物添加剂，其包 含在本发明的大规模方法中生产的葡萄细胞。所述药物或营养组合物或者食品添加剂可以 通过口服给对象施用。
[0120] 如本文所用，短语"药物组合物"是指果实细胞培养物的制备物，其可以是如上述 葡萄细胞培养物，有或没有其它化学成分如生理学合适的载体和赋形剂。
[0121] 在本发明的实施方案中，提供一种，通过给有需要的对象施用包含根据本发明实 施方案的大规模方法生产的葡萄细胞培养物的药物或营养组合物或者食品添加剂治疗炎 性失调的方法。
[0122] 如本文所用，术语"治疗"是指预防与炎性疾病、病症或失调相关的一些或所有症 状。术语"治疗"也是指减轻炎性疾病的症状或者潜在病因，延长患病患者的预期寿命，以 及从疾病中完全康复。
[0123] 如本文所用，短语"炎性失调"包括但不限于慢性炎性疾病和失调及急性炎症性疾 病和失调。这在实施例4中举例说明，其显示通过口服根据本文描述的大规模方法生产的 红葡萄细胞（RGC)而令人满意地减轻了在大鼠中与角叉菜胶诱导的后足炎症相关的足水 肿和行为痛觉过敏，表明在大规模方法中制备的RGC的抗炎作用。
[0124] 本发明的各个方面在如下实施例中更详细描述，这些代表本发明的实施方案，不 限制本发明的范围。 实施例
[0125] 实施例1 :生产-工业化水平规模
[0126] 1.材料和方法
[0127] 生产方法涵盖在具有五个阶段的逐步方法中增殖葡萄细胞。从在Erlenmeyer摇 瓶中增殖葡萄细胞开始，在小和大规模生物反应器中进一步增殖。关键因素是在不同的生 物反应器规模中的增殖期间维持细胞中次生代谢物白藜芦醇的高水平。在最后的大规模增 殖阶段结束时，在要求的生物量，收获细胞并干燥以产生精细的粉-紫色粉末，产生干燥细 胞（RGC)生物量，用于不同的医学应用。
[0128] 形成葡萄细胞系
[0129] 来自葡萄横切片的愈伤组织：从田间生长在开花后20-50天的葡萄植物中收 获4-8cm长的幼葡萄串，在流动的自来水中彻底冲洗。将无种子葡萄Vitis vinifera cv. "AVNIR 825〃(Agraman与Gamay red的杂交种）的绿色未成熟衆果在含有1.3%w/ v次氯酸钠和（0.l%v/v)Tween 20(作为增湿剂）的溶液中灭菌10分钟，。使用外科 手术刀将外植体切成2-3mm长度横切片，在补加过滤灭菌的1. 7mM抗坏血酸和0.8mM柠 檬酸、l〇〇mg/l DTT(二硫苏糖醇）和50mg/l乙酰半胱氨酸的半强度MS(Murashige and Skoog，1962, Physiol Plant 15:473-497)液态基本培养基中进行。将如下抗氧化剂加入 切割培养基中：PVP(0.5和lg/1)、L-半胱氨酸（150mg/l)、五倍子酸（1. 5mg/l)、DTT(70mg/ 1)、生物喋呤（15mg/l)，抗坏血酸（150mg/l)和柠檬酸（150mg/l)，以抑制细胞坏死 (necrogenesis)及使得可以回收绿色健康衆果片。
[0130] 将衆果片置于100个含有25ml高压灭菌的用0? 25%Gelrite固化Murashigeand Skoog，MS培养基的15mm培养平板中。在102kpa高压灭菌15分钟之前将pH调节为pH 5. 9。将每个均含有25个浆果片的30个平板用Parafilm密封及在26°C避光温育3天。将 培养物在25°C由冷白光荧光管提供15-30ymolnr2^辐照度的16小时光照期下温育。MS 盐和维生素培养基也补加250mg/l酪蛋白水解物、2%蔗糖和100mg/l肌醇。对于愈伤组织 诱导，还补加0. 2mg/l激动素和0.lmg/1NAA(a-萘基乙酸），培养基称作RD1。
[0131] 在培养开始3-4周后，沿着浆果片可见绿色和红色愈伤组织混合物。该愈伤组织 由易碎的延长的细胞组成，其中一些呈现出花青素深色着色。选择富集花青素的愈伤组织 部分并单独传代培养增殖。绿色愈伤组织部分单独培养。
[0132] 来自葡萄皮细胞的愈伤组织：从田间生长的葡萄植物在开花20-50天后收 获4-8cm长的幼葡萄串，在流动的自来水中彻底冲洗。将无种子葡萄Vitisvinifera cv.〃AVNIR825〃(Agraman与Gamayred的杂交种）的绿色不成熟衆果在含有1.3%w/v 次氯酸钠和（〇.l%v/v)Tween20(作为增湿剂）的溶液中灭菌10分钟。通过在衆果皮 做3-8mm切口并使用无菌镊子仅剥皮而分离浆果皮。果皮分离在补加过滤灭菌的1. 7mM 抗坏血酸和〇? 8mM柠檬酸、100mg/lDTT(二硫苏糖醇）和50mg/l乙酰半胱氨酸的半强度 MS(MurashigeandSkoog，1962)液态基本培养基中进行。
[0133] 将果皮置于RD-1培养基中。在大约10-14天后，在果皮切割表面上开始发育出细 胞丛。选择富集花青素的细胞并在新鲜培养基中传代培养以进一步增殖。
[0134] 来自葡萄种皮的愈伤组织：从田间生长的葡萄植物在开花20-50天后收获4-8cm 长的幼葡萄串，在流动的自来水中彻底冲洗。将无种子葡萄Vitisvinifera cv."AVNIR 825〃(Agraman与Gamay red的杂交种）的绿色不成熟衆果在含有1. 3% w/v次氯酸钠和 (0. 1% vAOTween 20(作为增湿剂）的溶液中灭菌10分钟。将浆果切开以显露幼绿色发 育中种子。切下未成熟种皮并置于培养基上。在补加过滤灭菌的1.7mM抗坏血酸和0.8mM 朽1檬酸、l〇〇mg/l DTT(二硫苏糖醇）和50mg/l乙酰半胱氨酸的半强度MS(Murashige and Skoog，1962)液态基本培养基中进行分离。
[0135] 将种皮切片置于RD-1培养基中。在大约12-20天后，种皮变成褐色，在种皮外植 体的顶部开始出现愈伤组织。选择富于红-褐色着色的细胞并在新鲜培养基中进一步传代 培养以进一步增殖。
[0136] 液态培养物的建立：液态培养物通过在50ml不同培养基（RD1-RD6,见下文）中加 l〇g愈伤组织而建立。在固体培养基上成功建立的所有细胞系在缺少胶凝剂的相同培养基 组合中呈现均匀细胞悬浮液。加入70mg/lDTT或者150mg/l抗坏血酸或柠檬酸改善浆果 来源的悬浮培养物的生长及抑制细胞necrogenesis。所有外植体类型均成功用于建立液态 培养物。每7-10天将培养物在新鲜生长培养基中常规传代培养。
[0137] 导入以建立浆果来源的愈伤组织细胞系的其它葡萄种属：使用上述方案培养如下 葡萄属物种：
[0138] 森林葡萄、V.muscadinia、圆叶葡萄、河岸葡萄、夏特沃氏葡萄、V.lubrisca、 V. daviddi、山葡萄、V. romanelli、夏葡萄、辛西安那葡萄、V. cineria、V. palmate、V. munsoniana、霜葡萄、Hybrid A23-7-71、V. acerifolia、V. treleasei和桦叶葡萄。
[0139] 欧洲葡萄横切片、葡萄皮和葡萄种子的愈伤组织产生的效力在下表1中例证。
[0140]表A
[0141]
[0142] 在这项研宄中使用的一些葡萄属物种的不同愈伤组织"类型"产生的效力在下表 2中概括显示。
[0143]表B
[0144]
[0145] (B-衆果片，SC-种皮，S-果皮）
[0146]阶段 1:Erlenmeyer，摇瓶
[0147] 将红葡萄细胞在持续荧光（lOOOlx)在25±5°C温度下在定轨摇床上的1L Erlenmeyer瓶中悬浮生长。生长培养基含有GamborgB5培养基和维生素，及补加250mg/ 1酪蛋白水解物、2-4%蔗糖、1001^/1肌醇、0.21^/1激动素和0.111^/1隱4(1-萘乙酸）、 25-45mMKN03、l-15mMMgS04或者 5-35mMMgN03&lmMNaH2P04(pH5.8)。每 6-11 天将细 胞传代培养。
[0148] 阶段2:小规模生物反应器
[0149] 通过将在阶段1的Erlenmeyer中生长7-16天的细胞悬浮液在25±5°C接种于 4-8L-次性生物反应器中。将细胞在持续荧光（lOOOlx)下在生长培养基中悬浮生长，所述 生长培养基含有补充的GamborgB5盐和维生素培养基，补加250mg/l酪蛋白水解物、2-4 % 蔗糖、100mg/l肌醇、25-45mMKN03、l-15mMMgS04或 5-35mMMgN03及ImMNaH2P04、0. 2mg/l 激动素和〇.lmg/1NAA(1-萘乙酸）（pH5. 4-5. 8)。每9-16天将细胞传代培养。
[0150] 阶段3:大规模生物反应器
[0151] 将在小规模生物反应器中生长的细胞悬浮液接种于30-50L-次性生物反应器 中。将细胞在持续荧光（lOOOlx)下在25±5°C悬浮生长。生长培养基含有补充的Gamborg 85盐和维生素培养基，补加25〇1^/1酪蛋白水解物、2-4%蔗糖、10〇11^/1肌醇、25-451111 KN03、l-15mMMgS04或 5-35mMMgNO3及ImMNaH2P04、0. 2mg/l激动素和 0?lmg/1NAA(1-萘 乙酸）（pH5. 4-5. 8)。每12-30天将细胞传代培养。
[0152] 阶段4:更大规模生物反应器
[0153] 将在小或大规模生物反应器中生长的细胞悬浮液接种于300-1000L-次性生物 反应器中。将细胞在持续荧光（lOOOlx)下在25±5°C悬浮生长。生长培养基含有补充的 GamborgB5盐和维生素培养基，补加250mg/l酪蛋白水解物、2-4%鹿糖、100mg/l肌醇、 25-45mMKN03、l-15mMMgS04或 5-35mMMgN03及ImMNaH2P04、0.2mg/l激动素和 0.1mg/l NAA(1-萘乙酸）（pH5. 4-5. 8)。
[0154] 阶段5:收获
[0155] 细胞达到10% -70% (w/v)细胞生物量后，收获细胞。将收获的细胞干燥以产生 精细的粉色-紫色粉末，具有典型成分、味道和气味。
[0156] 实施例2 :培养基成分和生物反应器设计对在大规模生物反应器中生长的红葡萄 细胞中白藜芦醇水平的影响
[0157] 2. 1培养基成分
[0158] 实验1:培养基成分对在Erlenmeyer摇瓶中生长的红葡萄细胞中白藜芦醇量的影 响
[0159] 将红葡萄细胞如实施例1阶段1所述在Erlenmeyer摇瓶中不同培养基成分中生 长：MS、WP、WP+酪蛋白水解物（酪蛋白胨）、GamborgB5。结果示于表1，表明在GamborgB5 培养基中生长的细胞与在MS、WP、WP+酪蛋白水解物（酪蛋白胨）培养基中生长的细胞相比 产生高大约4-15倍的白藜芦醇水平。
[0160]表1
[0161]
[0162] *数据是至少两个实验的平均数。
[0163]林MS-Murashige and Skoog培养基（Toshio Murashige and Folke K. Skoog in 1968)
[0164] *林WP-Woody植物培养基（WP) (Lloyd and McCown,1981)
[0165] 实验2 :培养基成分对生长及在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中 的白藜芦醇水平的影响
[0166] 将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器中如实施例1阶段3所述在不同培养基 成分中生长。
[0167] 将红葡萄细胞在两种类型培养基中生长：Gamborg B5培养基和补充的Gamborg B5。如下表2所示，补加的具有高水平镁、磷酸盐和硝酸盐或硫酸盐（KN03、MgS04、MgN03、 NaH2P04)B5培养基与在非补充的Gamborg B5培养基中生长相比获得较高的红 葡萄细胞生物量。
[0168] 表2 :在Gamborg B5和补充的Gamborg B5培养基中在大规模生物反应器中红葡 萄细胞的生长
[0169]
[0170]
[0171] *数据是三个实验的平均数。
[0172] 此外，检验培养基成分对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中白 藜芦醇和总多酚水平的影响。将细胞在WP培养基及在含有不同浓度镁、硝酸盐和磷酸盐 (相应的是謂03、]\^0 4、]\%勵3、謂03和似11孑04)的6&11113〇找85培养基中生长。表3表明这 些盐为生产高水平多酚和白藜芦醇所需要，特别是当加入补充的GamborgB5培养基中时。 在WP培养基中不同，其总多酚和白藜芦醇水平非常低。
[0173] 图4显示红葡萄 细胞在大规模一次性生物反应器在补充的GamborgB5培养基中 生长的生长曲线。细胞经历指数生长，在第20直至40天产生500gr/l新鲜生物量。这些 细胞持续生长及可达到更高生物量。
[0174] 表3 :在大规模生物反应器（50L)中具有不同水平盐的不同培养基中生长的RGC 中白藜芦醇和总多酚的水平
[0175]
[0176] 注意-部分数值以范围呈现。
[0177] *括号内的数字描述加入Gamborg B5中的矿物质的其它浓度
[0178] **数据是至少三个实验的平均数
[0179] ***数据是至少十个实验的平均数
[0180]林林McCown，sWoody植物培养基（LloydandMcCown,Proc.Int.PlantProp. Soc. 30:421, 1981
[0181] 实验3 :在从摇瓶中至大规模生物反应器中不同生长阶段生长的RGC中白藜芦醇 和总多酚水平的一致
[0182] 如实施例1阶段1-4所述将红葡萄细胞从Erlenmeyer摇瓶至大规模一次性生物 反应器中在存在补充的Gamborg B5中在不同规模阶段生长。
[0183] 表4中的结果显示红葡萄细胞在Erlenmeyer中生长良好及合成高数量的白藜芦 醇和总多酚。当细胞在50U300-100L规模在一次性生物反应器中生长时，与在Erlenmeyer 培养瓶中生长相比获得更高的生长速度，通过细胞的鲜重和干重揭示，见表4中数据所示。 在所有规格的大规模生物反应器中，鲜重大于230g/l(表4)，而在Erlenmeyer中为166g/ 1。此外，在大规模一次性生物反应器中在补充的培养基中总多酚以及白藜芦醇的水平高于 在Erlenmeyer培养瓶中获得的水平，分别为901mg/l和200mg/l(表4)。与由其它人观测 的结果不同，这是首次证实果实植物细胞在大规模一次性生物反应器中的成功生长，具有 高水平的白藜芦醇和多酚产生。
[0184] 表4:在摇瓶和不同规模阶段生长的RGC中白藜芦醇和总多酚水平*
[0185]
[0186] *数据是至少三个实验的平均数。
[0187] 实验4:加入酪蛋白水解物对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞 中白藜芦醇和总多酚水平的影响
[0188] 如实施例1阶段3所述将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器中在补充的 GamborgB5 中生长。
[0189] 如表5所示，当在一次性大规模生物反应器中在有或无酪蛋白水解物的补充的培 养基中生长时，红葡萄细胞中白藜芦醇和总多酚的水平相似。
[0190]表5
[0191]
[0192] *数据是三个实验的平均数。
[0193] 实验5 :加入植物激素对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中白 藜芦醇和总多酚水平的影响
[0194] 如实施例1阶段3所述将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器中在补充的 Gamborg B5中生长。如表6所示，当在有或没有0. 5mg/lNAA和0. 2mg/l激动素的一次性 大规模生物反应器中生长时，红葡萄细胞中产生的白藜芦醇和总多酚水平相似（表6)。
[0195]表6
[0196]
[0197] *数据是三个实验的平均数。
[0198] 实验6 :蔗糖浓度对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞的影响
[0199] 如实施例1阶段3所述将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器（50L)中在具有 不同鹿糖浓度的补充的GamborgB5培养基中生长。
[0200] 将红葡萄细胞在含有2、3、4和6%蔗糖的补充的培养基中生长。如下表6所示，当 细胞在2-4%蔗糖中生长时达到最佳细胞生长和生物量（143-260克/L)。较高的蔗糖浓度 如6 %蔗糖抑制细胞生长达10倍（24克/L)。
[0201] 表 6A
[0202]
[0203]
[0204] 实验7:生物反应器构造、设计和结构对于在大规模一次性生物反应器中生长的 红葡萄细胞中的白藜芦醇和总多酚的影响
[0205] 在由灭菌的一次性的透明塑料容器制成的20L生物反应器中评定两种培养 基-Ml培养基和补充有镁、磷酸盐和硝酸盐的GamborgB5培养基-对于由细胞产生的白 藜芦醇的量的影响，并与在A.Decendit(1996)BiotechnologyLetters中公开的数据进一 步对比，后者细胞在20L玻璃容器中在頂1培养基中生长。
[0206] 结果表明在一次性生物反应器中在頂1培养基中生长的红葡萄细胞产生93mg/l 白藜芦醇（表7)，其与使用相同培养基（Decendit)在搅动的玻璃生物反应器中产生的水平 高大约3倍。此外，当这些细胞在一次性生物反应器中在补充的GamborgB5中生长时，产 生显著高水平的白藜芦醇，为387mg/l(表7)。
[0207] 表7:生物反应器类型和培养基成分对红葡萄细胞产生的白藜芦醇水平的影响
[0208]
[0209] *IM1培养基-Ref?文章A. Decendit (1996) Biotechnology Letters
[0210] **数据是至少三个实验的平均数
[0211] 进一步地，含有补充的GamborgB5的特定培养基成分与设计一次性生物反应器的 组合诱导细胞产生比在頂1培养基和搅动玻璃生物反应器中产生的水平高10-12倍的白藜 芦醇，及在一次性生物反应器中在頂1培养基中生长的细胞高4倍（表7)。
[0212] 这些结果显示生物反应器类型和培养基成分均为维持在20L或更大生物反应器 中产生的RGC中白藜芦醇的高水平所必需。
[0213] 实施例3:成分
[0214] 红葡萄和紫葡萄均含有有效的多酚、抗氧化剂和白藜芦醇，其有助于防止动脉狭 窄和硬化。越来越多的研宄表明在红葡萄和紫葡萄中及最后在红葡萄酒中发现的白藜芦醇 影响机体的重要代谢途径及可有益于健康。然而，其确实具有非常高的糖含量，因此应适度 摄食。
[0215] 在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞的成分是独特的。
[0216] 除了糖和白藜芦醇水平之外，所述红葡萄细胞的化学成分与使用标准农业实践生 长的葡萄相当。
[0217] 实验8 :与在葡萄园中生长的红葡萄相比在大规模一次性生物反应器中生长的红 葡萄细胞中的总糖、葡萄糖和果糖水平较低
[0218] 如实施例1阶段3和4所述在大规模一次性生物反应器中在补充的GamborgB5 中生长的红葡萄细胞中的总糖、葡萄糖和果糖的量与通过农业方式生长的不同类型红葡萄 的这些糖的水平相比低25-50倍（表8)。
[0219] 表8A&8B:在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞与农业生产的红葡萄 细胞之间糖水平对比（鲜重）（gr/100gr)
[0220] A.
[0221]
[0224] 样品1-农业餐桌红葡萄（以色列）_用于食用的红葡萄
[0225] 样品2-酿酒红葡萄1(以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄
[0226] 样品3-酿酒红葡萄2(以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄
[0227] 样品4-酿酒红葡萄1(南非）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄
[0228] 实验9:在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄的总多酚和白藜芦醇成分的 水平
[0229] 除了白藜芦醇之外，所述红葡萄细胞中总多酚的水平与田间生长的红葡萄中的量 相似，前者比后者中白藜芦醇的水平高40-800倍（表9和10)。如实施例1阶段3和4 描述的大规模一次性生物反应器中生长的5个批次的红葡萄细胞中的白藜芦醇的范围是 726-916mg/kg鲜重，相比之下农业生产的红葡萄中为l-12mg/kg(表9A、9B)。在干燥之后 红葡萄细胞干粉中白藜芦醇水平为6000-31000mg/kg粉末（表10)。
[0230] 方法：使用HPLC结合在280、520和306nm的UV/VIS检测分析红葡萄细胞中多酚 和白藜芦醇的水平。
[0231] 表9A&9B:比较红葡萄细胞和农业生产红葡萄中酚含量成分
[0232] 9A.农业生产的红葡萄中酚含量成分（mg/kg鲜重）
[0233]
[0234] 1Cantos E,EpsinJC and Tomas-Barberan FA. Varietal Differences among the Polyphenol Profiles of Seven Table Grape Cultivars Studied by LC-DAD-MS-MS. J. Agric. Food Chem. 202, 50:5691-5696.
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[0236]3Dell'Agli M，Busciala A，Bosisio E，（2004)?Vascular effects of wine polyphenols. Cardiovascular research 63:593-602.
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[0238] 9B.红葡萄细胞中酚含量成分（mg/kg鲜重）
[0239]
[0240]
[0241] 表10 :红葡萄细胞中白藜芦醇和总多酚化合物含量（gr/kg干粉）
[0242]
[0243] 实施例4 :培养的葡萄细胞在体内角叉菜胶诱导的足水肿大鼠模型中的作用
[0244] 本项研宄的目的在于评估根据本发明的大规模生产方法产生的RGC(红葡萄细 胞）在大鼠急性炎症模型中的体内抗炎活性，以证实根据本发明产生的细胞的效力。最广 泛用于研宄急性炎症的实验模型之一基于足底内施用角叉菜胶。
[0245]该研宄通过两种方法评定RGC的效力：
[0246] 1.足体积测量
[0247] 2.自由活动的大鼠中炎性疼痛
[0248] 材料和方法：
[0249] 根据实施例1制备的红葡萄细胞（RGC)
[0250] 在注射角叉菜胶之前2小时，将RGC作为在无菌饮用水中的悬浮液以400mg/kg体 重的剂量口服。剂量水平为40mg/ml。每个大鼠施用lml/100g体重的悬浮液。
[0251]RGC组合物：给每只大鼠注射的多酚和白藜芦醇的量分别为14和4. 8mg/体重。角 叉菜胶诱导的大鼠足水肿：将大鼠分为3组，每组8只大鼠。所有组的大鼠均在左后足足底 注射1%角叉菜胶（0.lmg/足）或无菌盐水（0. 9%NaCl)。
[0252] 进行如下检测：
[0253] 足体积测量
[0254] ?在注射角叉菜胶之前时间点0及在注射后1、2、4小时用测径器按小时测量足体 积。
[0255] ?以两个轴测量足直径并计算足体积。在这个模型中的足水肿是炎症严重度的指 征。
[0256] ?对于每个时间点，通过减去基线足体积或者与基线足体积的百分比计算足体积 的变化。
[0257] 在自由行动的大鼠中测量炎性疼痛的热板方法
[0258] 使用热板方法确定自由行动的大鼠中的炎性疼痛。在诱导水肿并用运载体、吲哚 美辛或RGC制备物处理后，将大鼠置于维持55±0. 5°C温度的热板上。轻拂或舔舐后足或者 从热板上跳起的延时与其基线对比，作为反应时间。反应时间标示为在注射后1、2和4小 时。在无反应的情况中，使用60秒截止值以防止组织损害。
[0259] 组分配：
[0260] 运载体对照组（1M):对照大鼠在注射角叉菜胶之前2小时接受无菌饮用水（运载 体）。
[0261] 阳性对照组（"2M"）：阳性对照组的大鼠在注射角叉菜胶之前2小时接受2mg/kg 体重的n引噪美辛。
[0262] 测试组（"3M"）：在注射角叉菜胶之前2小时给大鼠口服施用在无菌饮用水中的 悬浮液400mg/kg体重剂量的RGC(lml/40mgRGC每100gr体重）。
[0263] 结果
[0264] 足水肿：
[0265] 图1显示用RGC制备物、作为对照的吲哚美辛和水处理的大鼠的足水肿（体积％ ) 的结果。使用重复测量的双向AN0VA及随后的Bonferroni事后检定进行统计学分析。对 照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小时显示统计学显著差异（p〈0.001)。对照 组与RGC制 备物（3M)组的对比在2和4小时显示统计学显著差异（p〈0. 001)。
[0266] 如图1所示，当用RGC制备物处理大鼠时，在1或2小时后足水肿降低至少为阳性 对照的水平。此外，在4小时后，用RGC制备物处理的大鼠表明足水肿降低甚至比对照组还 低。
[0267] 炎性疼痛
[0268] 图2显示在用RGC制备物、用作对照的吲哚美辛和水处理后每组的痛觉过敏作用。 使用重复测量的双向AN0VA及随后事后检定进行统计学分析。对照组1M与阳性对照组2M 的对比在2和4小时显示统计学显著差异（p〈0. 05-0. 01)。对照组与RGC(3M)对比在4小 时显示统计学显著差异（P〈〇. 01)。
[0269] 如在图2中可见，在注射角叉菜胶2和4小时后，运载体处理的对照组（1M)(接受 无菌饮用水）显示对热刺激的反馈时间S(时间）显著增加。这通过这组中大鼠的足底热 刺激反应性降低表明。
[0270] 如在图3中可见，在注射角叉菜胶后2和4小时，与运载体对照组相比阳性对照组 (吲哚美辛处理的大鼠，2M)显示对热刺激的反应延时S显著降低。
[0271] RGC处理的大鼠（3M)显示在注射角叉菜胶4小时后对热刺激的反应延时S降低， 与运载体处理的对照组相比有统计学显著性。
[0272] 综上所述，这个实施例的结果表明与角叉菜胶诱导的大鼠后足炎症相关的足水肿 和行为痛觉过敏通过口服根据实施例1所述方法制备的RGC而显著减弱，表示甚至在大规 模方法中制备的RGC制备物的抗炎作用。
[0273] 实施例5 :RGC-RES的化学性质（与其它来源的RES相比）及RGC-RES的人体生物 利用度性质
[0274] 材料和方法
[0275] 红葡萄细胞（RGC)根据实施例1所述制备。RGC的白藜芦醇（RES)含量通过HPLC 在306nm针对合成的RES标定曲线确定。
[0276]RGC-RES的LC/MS分析
[0277] 将RGC粉末溶解于80%甲醇中。使用AccelaLC系统结合装备电喷射离子源的 LinearTrapQuadrupole(LTQ)OrbitrapDiscoveryhybridFT质谱仪（ThermoFisher ScientificInc.)对样品进行液态层析质谱分析（LC-MS)。质谱仪以负离子化模式运行， 质谱在m/z150-2000获得。
[0278] 溶解性测定
[0279] 将RGC、合成的白藜芦醇（S-RES;Sigma-Aldrich)及从植物虎杖（Polygonum capsidatum)中提取的白藜芦醇（植物-RES)溶解于80%甲醇中以实现100%溶解。然后， 将所有RES来源在pH2和pH7均溶解于水中，在水中的溶解百分比与在甲醇中的溶解百 分比对比。所有样品中的RES均在306nm基于其特征性吸光图谱监测，其浓度通过白藜芦 醇分析标准的标定曲线确定。
[0280] 结果
[0281] LC/MS
[0282]RGC粉末的负离子模式的质谱和代表性LC/MS层析图在图6A和6B中显示。针 对RGC中白藜芦醇（m/z-227. 0701-227. 0737的四种衍生物检测的LC-MS分析，均显示在 306nm的UV吸光度。这些衍生物中三种是反式-RES异构体的己糖苷，在4. 6、5. 3和6. 1分 钟的保留时间检测到。第四种衍生物是反式-RES，在6.9分钟的保留时间检测到（表12)。 证实四种衍生物的相同性，如通过ESI质谱显示（图7)。
[0283] 表11 :RGC中白藜芦醇衍生物的鉴定
[0284]
[0285] 溶解性
[0286] 将RGC-RES的溶解性与两种反式-RES产物对比：合成的RES和植物虎杖RES。所 有三种所检测的产物均完全溶解于80%甲醇溶液中。然而，当这三种RES产物溶解于模拟 胃pH条件的酸化水（pH= 2)以及在pH7. 0时，RGC-RES的溶解比两种其它RES的溶解高 6倍，RGC-RES为44%，两种其它RES为7% (图5)。
[0287] 人生物利用度研宄
[0288] 该研宄是单一剂量随机的交叉对比性药动学研宄。15个成人健康禁食男性对象接 受研宄产物RGC(口服剂量等价于50mg或150mg反式-RES)，间隔至少7天冲洗（washout) 期）。在给药后4小时提供标准饮食。遵循以色列卫生部（M0H)的所有规章制度及根据 ICHGCP指导进行研宄。该方案由SorokaUniversityMedicalCenterIRB许可，包括给每 个患者施用一次50或150mg剂量，随后7天冲洗，第二次施用，这次与第一次不同，由此开 始接受50mg的患者将接受150mg，反之亦然。在这项研宄中征募15个健康非吸烟男性志愿 者。志愿者资格标准包括年龄在18-55岁，BMI彡19及彡30。要求对象在第一次给药之前 7天及在整个研宄期间禁食含有RES的食物、营养补充剂或饮料，及禁食所有药物包括非处 方药。
[0289] 样品收集和处理
[0290] 将在施用前（切）和施用后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10和12小时的 静脉血样品收集在含有K2EDTA的试管中。将血液样品保持在冰浴中，并在黄光下立即处理。
[0291] 血浆中白藜芦醇含量分析
[0292] 由PRACSInstitute(Toronto,Canada)进行样品制备及血衆样品中游离和总RES 的LC-MS分析。血浆样品经液体-液体提取并用于LC-MS/MS系统进行分析。对于游离和 总RES的较低限度定量（LL0Q)分别为0. 5和20ng/mL。对于总RES分析，在LC-MS/MS分析 之前进行酶促水解和蛋白质沉淀提取。
[0293] 药代动力学分析
[0294] 使用未分区药代动力学方法针对游离RES和总RES(游离和缀合的）计算下列药 代动力学变量：最大血浆浓度（Cmax)和最大血浆浓度时间（Tmax)，在整个收集期间的平均 浓度，通过梯形法的从时间（0)至最后可计量浓度（Clast，高于L0Q)的血浆浓度对时间曲 线下面积（AUC)。
[0295] 结果
[0296] 人口统计学和安全性：15个健康男性志愿者参与这项研宄。对象年龄范围是 28-55岁（平均42. 1岁），BMI范围是21. 4-30 (平均25. 8)。所有对象在筛选和准入时均 检测对药物和乙醇是阴性的，关于实验室参数和生命体征测量无临床显著异常。在整个研 宄中无不利事件观测到或报道。
[0297] 游离和总白藜芦醇的血浆药代动力学：总RES和游离RES的平均反式-RGC-RES血 浆浓度与时间曲线在图9中显示。正如所见，在两个浓度的RGC图展示两个清晰的浓度峰， 第一个峰在1小时后，第二个峰（更高）在5小时后。
[0298]t-RES的平均药代动力学参数在表12A和12B中概括。
[0299] 表12A和12B:在补加RGC之后血浆药代动力学数值
[0300] A.总白藜芦醇
[0301]
[0302] B.游离白藜芦醇
[0303]
[0304] 在前两个测量时间点0.33和0. 67小时分析表明在接受RGC的对象血浆中RES的 可测量数量（表13)。此外，在0.33小时时间点期间，RGC组中所有对象（除了RGC150mg 组中的一个）均具有可测量的总RES浓度（表13和14)。
[0305] 表13 :在前两个测量时间点血浆中具有可检测量RES(总/游离）的对象
[0306]
[0307] 表14 :在施用后前三个测量时间点的总RES和游离RES的浓度（ng/mL)
[0308]
[0309] 结论
[0310] 源自RGC中的RES特征在于添加一个己糖部分。尽管己糖的提取类型及其精确 定位还未鉴定，但是很可能的是，RGCRES是云杉新甙-天然存在于红葡萄中的最常见类型 的RES。在游离和总体形式的RES中证实的两个峰的现象是独特的及在其它类型RES中未 观测到。可能RGCRES中糖苷基团的存在使其更可溶，这可以在溶解性检测中观测到，其中 RGC-RES与合成的和植物衍生的RES相比更溶于水。这种独特的两个浓度峰的模式也可归 因于RGC的独特成分及之间的协同，所述RGC含有完全的红葡萄基质和高水平的糖苷白藜 芦醇。发现这种性状在高浓度RES存在的情况下以高速率表现，快达施用后20分钟。
[0311] 如在浓度/时间曲线（图6A)中清晰可见的，RGC-RES在1和5小时出现两个非 常明显的浓度峰。
[0312] 重要地，合成的或酵母发酵来源的RES(Poulsen,MM.，Vestergaard,PF.，C1 asen,BF. ,Radko,Y. ,etal. ,High-doseresveratrolsupplementationinobese men:aninvestigator-initiated,randomized,placebo-controlledclinical trialofsubstratemetabolism,insulinsensitivity,andbodycomposition. Diabetes2013, 62, 1186-1195)以及植物来源的1?5(六1111(^，]\11，1?〇111161'，8.，〇3〇，1'. M. ,Fanciullino,R. ,etal. ,Optimizationoftrans-Resveratrolbioavailabilityfor humantherapy.Biochimie2013, 95, 1233-1238)的浓度时间曲线显示明显的单一浓度峰。 这显示一天补充一次RGC对于延长作用是足够的，而在其它产物中，可需要多于一次的补 充或者每天更高水平以达到相同作用。
[0313] 虽然本发明的某些特征在本文已经例证和描述，但是本领域技术人员对本发明可 以进行一些修改、取代、改变和等价处理。因此，应理解所附权利要求涵盖在本发明原理内 的所有这些修改和变化。
【主权项】
1. 体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物的大规模方法，包括： 使葡萄细胞在瓶中生长； 将葡萄细胞从所述瓶接种到第一生物反应器中； 将葡萄细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中该另一生物反应 器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，及其中所述第一生物反应器和另一个生物 反应器的至少一个是一次性的；及 从最后的生物反应器收获葡萄细胞； 其中使从最后的生物反应器收获的葡萄细胞干燥。2. 权利要求1的大规模方法，其中用于该方法中的每个生物反应器的大小大于葡萄细 胞先前在其中生长的生物反应器。3. 权利要求1的方法，其中如果所述另一个生物反应器是中间生物反应器，进行另外 的将葡萄细胞接种于另一个中间生物反应器或者最后的生物反应器的步骤。4. 权利要求1的方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是4-10升的生物 反应器。5. 权利要求1的方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是10-50升的生 物反应器。6. 权利要求1的方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是50-200升的生 物反应器。7. 权利要求1的方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是200-500升的 生物反应器。8. 权利要求1的方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是200-1000升的 生物反应器。9. 权利要求1的方法，其中葡萄细胞生长于GamborgB5培养基中。10. 权利要求9的方法，其中所述GamborgB5培养基补充有镁盐、磷酸盐或硝酸盐或者 其组合。11. 权利要求9的方法，其中所述GamborgB5培养基补充有KNO3、MgS04、MgNO^ NaH2PO4或者其组合。12. 权利要求1的方法，其中所述一次性生物反应器是由一或多层聚乙烯制成。13. 权利要求12的方法，其中所述一次性生物反应器是由聚乙烯内层和外层及中间的 尼龙层制成。14. 权利要求8的方法，其中所述GamborgB5培养基不包含植物激素。15. 权利要求8的方法，其中所述GamborgB5培养基包含植物激素。16. 权利要求9的方法，其中GamborgB5培养基补充有2-4%的蔗糖。17. 粉末形式的组合物，其包含在大规模方法中体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈 伤组织培养物，其中所述葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物源自一或多个葡萄浆果横 切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、葡萄有种子或无种子栽培种的胚或者葡萄种皮； 其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含白藜芦醇的量为至少l〇〇〇mg/kg粉末。18. 权利要求17的组合物，其特征在于在施用一次所述组合物后血浆中白藜芦醇的浓 度的两个峰。
【专利摘要】本发明涉及生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物的体外生产的大规模方法，涉及根据这种方法生产的产物及涉及包含多酚复合物的组合物，所述多酚包括白藜芦醇，其中白藜芦醇与多酚的比率高于天然生长的葡萄中的白藜芦醇与多酚的比率。
【IPC分类】C12P1/00
【公开号】CN104903454
【申请号】CN201380068719
【发明人】Y·哈加伊, Y·罗斯, M·阿扎希, R·亚图夫
【申请人】生物收获有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月28日
【公告号】EP2914732A1, US20150275169, WO2014068557A1
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