用于异丁烯生物合成的方法
用于异丁烯生物合成的方法
【专利说明】用于异丁烯生物合成的方法 发明领域
[0001] 本申请涉及使用一种或多种分离的酶（如烯酰基-CoA脱水酶、2-羟酰基-CoA脱 水酶、异戊酰基-CoA/酰基-CoA脱氢酶、和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶）中的一种或多种，或使 用表达一种或多种此类酶的重组宿主细胞生物合成异丁烯的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 在生产燃料添加剂、丁基橡胶聚合物和抗氧化剂中，异丁烯是一种重要的单体 (Bianca等人，Appl.MicrobiolBiotechnol.，2012, 93, 1377-1387) 〇
[0004] 使用异丁烯作为给料来制造商品取决于很多基于石油的来源，包括（i)从丁二烯 分离的来自蒸汽裂化器（steamcracker)的C4流，（ii)来自催化性裂化器的丁烯-丁烷 级分和（iii)正丁烷（来自液态石油气），其被异构化成异丁烷并脱氢成异丁烯。
[0005] 考虑到对石油化工给料和能源密集工艺的依赖性，生物技术提供了通过生物催化 进行的备选方法。生物催化是使用生物催化剂（如酶或全细胞）来进行有机化合物的生物 化学转化。
[0006] 因此，针对这种背景，清楚的是需要产生中间体（特别是异丁烯）的承受得起的方 法，其中该方法是基于生物催化的。对于该生物催化方法，生物来源的给料和石油化工给料 均是可行的原料。
[0007] 在通过生物催化方法合成异丁烯中，将双键引入到短支链脂肪族碳底物中是一 个关键的考虑因素。在这个过程中（inthisvain)，来自小红酵母德克萨斯变种IF0 1102(Rhodotorulaminutavar.texensisIF0 1102)的细胞色素P450 通过异戊酸的脱羧 而形成异丁烯。并且，已经显示在生物合成异丁烯的过程中，油酸水合酶的变体接受异丁 醇，并且甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的变体接受3-羟基-3- 丁酸甲酯作为底物。因此，已经鉴 定了许多酶在异丁稀的合成中具有催化活性（(Bianca等人，Appl.MicrobiolBiotechn ol.，2012, 93, 1377-1387))。
[0008]然而，产生异丁烯合成接受的前体的鉴定生物化学途径是碳低效的，这通过碳上 的低最大理论产率得到反映。例如，鉴定的利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的催化活性的唯一 途径具有约0.2 [(g异丁烯）V(g葡萄糖）的最大理论产率（Bianca等人，2012,同上）。使 用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶作为最终的酶促步骤来经济地生产异丁烯受到碳产率限制考验。
[0009] 发明概述
[0010] 本文件至少部分地基于构建碳有效的生物化学途径以产生3-甲基-3-羟基-丁 酸酯，其可以通过甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化成异丁烯。在合成3-甲基-3-羟基-丁酸 酯中，此种途径可以依靠2-羟酰基-CoA脱水酶或异戊酰基CoA/酰基-CoA脱氢酶和烯酰 基-CoA水合酶（例如，（R)特异性烯酰基-CoA水合酶）。在本发明之前，不知道与烯酰 基-CoA水合酶组合的2-羟酰基-CoA脱水酶或异戊酰基-CoA脱氢酶可以用于生物学合成 3-甲基-3-羟基-丁酸酯，从而导致异丁烯的合成。并且，在本发明之前，不知道细菌来源 的烯酰基-CoA水合酶可以用于合成3-甲基-3-羟基-丁酸酯，从而导致异丁烯的合成。
[0011] 因此，本文件提供了可以将中心前体3-甲基-2-氧丁酸酯 (3-methyl-2_oxobutanoate)或 4_ 甲基 _2_ 氧戊酸醋（4-methyl-2_oxopentanoate)经由 共同的中间体 3_ 甲基 _3_ 羟基-丁 _2_ 稀酰基-CoA(3-methyl-3-hydroxy-but-2-enoyl_C 〇A)转化成异丁烯的途径和酶。如本文所用，术语"中心前体"用于表示在本文显示的导致 合成异丁烯的任意代谢途径中的任意代谢产物。术语"中心代谢产物"在本文中用于表示 在全部微生物中产生以支持生长的代谢产物。
[0012] 在一方面，本文件的特征在于用于合成异丁烯的方法。该方法包括（i)使3-甲 基-2-羟基-丁酰基-CoA脱水和使3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA水合，并且将得到的产物 转化成异丁條。2_轻醜基_CoA脱水酶可以使3_甲基_2_羟基-丁醜基_CoA脱水。2_轻 酰基-CoA脱水酶可以由基因产物HadI和HadBC编码，或者由基因产物HgdC和HgdAB编码。 2-羟酰基-CoA脱水酶可以与SEQIDNO. 5和6中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列 同一性，或者可以与SEQIDNO. 8和9中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。 (R)特异性烯酰基-CoA水合酶或（S)特异性烯酰基-CoA水合酶可以使3-甲基-丁-2-烯 酰基-CoA水合。（R)特异性烯酰基-CoA水合酶可以与在SEQIDNO. 1-3中给出的氨基酸 序列的任一种具有至少70%的序列同一性。（S)特异性烯酰基-CoA水合酶可以与在SEQ IDNO. 4中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0013] 本文件的特征还在于用于合成异丁烯的方法。该方法包括使3-甲基-丁酰基-CoA 脱氢和使3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA水合，并且将得到的产物转化成异丁烯。异戊酰 基-CoA或酰基-CoA脱氢酶可以使3-甲基-丁酰基-CoA脱氢。异戊酰基-CoA或酰基-CoA 脱氢酶可以与SEQIDNO. 11或12中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。（R) 特异性烯酰基-CoA水合酶或（S)特异性烯酰基-CoA水合酶可以使3-甲基-丁 -2-烯酰 基-CoA水合。（R)特异性烯酰基-CoA水合酶可以与在SEQIDNO. 1-3中给出的氨基酸序 列的任一种具有至少70%的序列同一性。（S)特异性烯酰基-CoA水合酶可以与在SEQID NO. 4中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0014] 本文描述的途径的反应可以在一种或多种细胞（例如，宿主细胞）株中进行，所 述细胞株（a)天然地表达一种或多种相关酶，（b)经遗传改造以表达一种或多种相关酶，或 (c)天然地表达一种或多种相关酶并且经遗传改造以表达一种或多种相关酶。备选地，相关 酶可以从上述类型的宿主细胞中的任一种提取并且以纯化的或者半纯化的形式使用。可以 任选地将提取的酶固定到固体基质如合适的反应容器的底部和/或壁。此外，此种提取物 包括可以用作相关酶来源的裂解物（例如，细胞裂解物）。在本文件提供的方法中，可以在 细胞（例如宿主细胞）中进行所有的步骤，可以使用提取的酶进行所有的步骤，或者在宿主 细胞中进行一些步骤而使用提取的酶进行其他的步骤。
[0015] 在本文描述的任何方法中，可以在重组宿主（例如，原核生物或真核生物）中 进行该方法。原核宿主可以来自埃希氏菌属（Escherichia)如大肠杆菌（Escherichia coli)，来自梭菌属（Clostridia)，如扬氏梭菌（Clostridiumljungdahlii)，自产乙 醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)或克氏梭菌（Clostridiumkluyveri);来 自棒杆菌属（Corynebacteria)，如谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum); 来自贪铜菌属（Cupriavidus)如钩虫贪铜菌（Cupriavidusnecator)或耐金属贪铜 菌（Cupriavidusmetallidurans);来自假单胞菌属（Pseudomonas)如焚光假单胞 菌（Pseudomonasfluorescens)，恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)或食油假单 胞菌（Pseudomonasoleavorans);来自食酸代尔夫特菌属（Delftiaacidovorans)， 来自芽孢杆菌属（Bacillus)，如枯草芽孢杆菌（Bacillussubtillis);来自乳杆菌 属（Lactobacillus)如德氏乳杆菌（Lactobacillusdelbrueckii);来自乳球菌属， 例如乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)或来自红球菌属（Rhodococcus)如马红球菌 (Rhodococcusequi)。真核宿主可来自曲霉属（Aspergillus)，例如黑曲霉（Aspergillus niger);来自酵母属（Saccharomyces)，如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae);来自 毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris);来自耶氏酵母属（Yarrowia)，如解 脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica)或来自伊萨酵母属（Issatchenkia)如东方伊萨酵 母（Issathenkiaorientalis)或来自德巴利酵母属（Debaryomyces)如汉逊德巴利酵母 (Debaryomyceshansenii)，或来自Arxula属如Arxulaadenoinivorans或来自克鲁维酵 母属（Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis)。
[0016] 在本文所述的任意方法中，可使用需要厌氧，微需氧或需氧培养的发酵策略。发酵 策略可需要营养物限制，例如氮、磷酸盐或氧限制。可以采用使用陶瓷中空纤维膜的细胞 保留策略以实现并维持发酵期间的高细胞密度。给发酵补料的主要碳源可以来源于生物 或非生物给料。生物原料可以是或来源于单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质 素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的蒸馏器可溶物（condensed distillers'solubles)或城市废物（municipalwaste)。非生物原料可以是或来源于天 然气、合成气、C02/H2、甲醇、乙醇或来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物（NVR)或碱洗废 物流（non-volatileresidue(NVR)oracausticwashwastestreamfromcyclohexane oxidationprocesses)〇
[0017] 在另一个方面，本文件的特征在于重组宿主，其包含编码2-羟酰基-CoA脱水酶和 烯酰基-CoA水合酶的外源核酸，该宿主产生异丁烯。宿主可进一步包含甲羟戊酸二磷酸脱 羧酶（mevalonatediphosphatedecarboxylase)。宿主还可以包含（i) 2_轻酰基脱氢酶， (ii)CoA转移酶或CoA连接酶，以及（iii)硫酯酶。
[0018] 在另一个方面，本文件的特征在于重组宿主，其包含编码异戊酰基-CoA/酰 基CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶的外源核酸，该宿主产生异丁烯。宿主可进一步包 含甲羟戊酸二磷酸脱羧酶。宿主可进一步包含4-甲基-2-氧代-戊酸脱氢酶复合体 (4-methyl_2-〇x〇-pentanoatedehydrogenasecomplex)和硫醋酶。宿主可进一步包 含口引噪丙酮酸脱羧酶、苯乙醛脱氢酶和CoA连接酶（indolepyruvatedecarboxylase,a phenylacetaldehydedehydrogenase,andaCoA-ligase)〇
[0019] 在任意的重组宿主中，烯酰基-CoA水合酶可以是与SEQIDNO: 1-3所示的氨基酸 序列中的任一种具有至少70%的序列同一性的（R)_特异性烯酰基-CoA水合酶或与SEQID N0:4所示的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性的（S)_特异性烯酰基-CoA水合酶。
[0020] 在任意重组宿主中，宿主可以天然积累聚羟基脂肪酸酯 (polyhydroxyalkanoates)并包含弱化的酶聚合物合酶（polymersynthase)。
[0021] 在任何重组宿主中，该宿主还可以包含下列弱化的酶中的一种或多种：磷酸转乙 酰酶、乙酸激酶、将丙酮酸降解成乳酸的酶、将磷酸稀醇式丙酮酸（phophoenolpyruvate) 降解成琥珀酸的酶、将乙酰基-CoA降解成乙醇的酶或最终支链氨基酸转氨酶。
[0022] 在任意重组宿主中，宿主还可以过表达编码下列一项或多项的基因：吡啶核苷酸 转氢酶、甘油醛-3P-脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶、果糖1，6二磷酸酶或乙 酰乳酸合酶的反馈抑制抗性突变体（puridinenucleotidetranshydrogenase,aglycera ldehyde-3P-dehydrogenase,amalicenzyme,aglucose-6-phosphatedehydrogenase,a fructose1,6diphosphatase,orafeedbackinhibitionresistantmutantofan acetolactatesynthase)，其中所述乙酰乳酸合酶具有对支链氨基酸的反馈抑制的抗性。 编码所述乙酰乳酸合酶的基因可以是使用不受分支氨基酸遗传阻遏的启动子表达的。
[0023] 在任意的重组宿主中，异丁烯穿过细胞膜的流出可以通过细胞膜的遗传工程而增 强 或放大或者随用于异丁烯的相关转运蛋白活性而增加。
[0024] 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人 员的通常理解具有相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可 以用于实施本发明，但是以下还是描述了合适的方法和材料。将本文提及的所有出版物、专 利申请、专利和其它参考文献以其整体并入本文作为参考。在存在冲突的情况下，以本说明 书（包括定义）为准。此外，材料，方法和实例仅是说明性的，并不意在进行限制。
[0025] 在附图和以下描述中给出了本发明的一个或多个实施方案的细节。本发明的其他 特征、目的和优点在说明书和附图，以及权利要求书中是显而易见的。根据专利法的标准实 践，在权利要求书中的词语"包含"可替换成"基本上由...组成"或"由...组成"。
[0026] 附图简述
[0027] 图1是使用3_甲基_2_氧代丁酸醋（3-methyl-2_oxobutanoate)作为中心前体 产生异丁烯的示例性生物化学途径的示意图。
[0028] 图2是使用4-甲基-2-氧代戊酸酯为中心前体产生异丁烯的示例性生物化学途 径的示意图。
[0029] 图3包含来自铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)(由Phajl基因编码） (GenBank登录号BAA92740，SEQIDNO: 1);斑点气单胞菌（Aeromonaspunctata)(GenBank 登录号BAA21816.1，SEQIDN0:2);和恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)(GenBank登 录号NP_746661，SEQIDN0:3)的（R)特异性烯酰基-C〇A水合酶；和来自枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)的（S)特异性烯酰基-CoA水合酶（GenBank登录号CAA99573. 1，SEQ IDNO:4)〇
[0030] 图4包含艰难梭菌（Clostridiumdifficile) 2-轻酰基-CoA脱水酶的氨基酸 序列（由HadBC基因编码）（见GenBank登录号AAV40819. 1和AAV40820. 1，分别是SEQ IDNO. 5和6)和艰难梭菌起始子（initiator)的氨基酸序列（由HadI编码）（GenBank 登录号AAV40818. 1，SEQIDN0:7)。图4还包含由HgdAB基因编码的发酵氨基酸球菌 (Acidaminococcusfermentans) 2-轻酰基-CoA脱水酶的氨基酸序列（参见GenBank登录 号CAA32465. 1和CAA32466. 1，分别为SEQIDNO:8和9)和由HdgC编码的发酵氨基酸球 菌起始子的氨基酸序列（见GenBank登录号CAA42196. 1，SEQIDNO:10)。
[0031] 图5包含由liuA基因编码的铜绿假单胞菌PA01异戊酰基-CoA脱氢酶的氨 基酸序列（GenBank登录号AAG05403. 1，SEQID勵：11)和由&〇(111基因编码的除虫链 霉菌（Streptomycesavermitilis)的酰基CoA脱氢酶的氨基酸序列（GenBank登录号 AAD44196. 1，SEQIDNO:12)。
[0032] 图6是在分光光度酶测定中，巴豆酰-CoA(底物）在由phaj编码的烯酰基-CoA 水合酶的正向（水合）方向随时间变化的吸光度单位的图。
[0033] 图7是在由phaj编码的烯酰基-CoA水合酶活性的反向（脱水）方向上，酶测定的 LC-MS分析结果的表。该结果指示烯酰基-CoA水合酶是可逆的，有利于正向的水合反应。
[0034] 图8是在由phaj编码的烯酰基-CoA水合酶的反向（脱水）方向上，酶测定的 LC-MS分析结果的表。该结果指示烯酰基-CoA水合酶接受3-甲基-3-羟基丁酰基-CoA 作为底物。考虑到酶反应的可逆性，烯酰基-CoA水合酶接受3-甲基-3-羟基丁 -2-烯酰 基-CoA作为底物。
[0035] 发明详述
[0036] 特别地，本文件提供了用于异丁烯合成的酶和重组宿主微生物，其可以形成支链 烯酰基-CoA底物3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA，并水合底物以形成3-甲基-3-羟基丁酰 基-CoA，其继而可以在一个或多个酶促步骤后通过甲羟戊酸磷酸脱羧酶被转化成异丁烯。 因此，本文中所描述的宿主微生物可以包括能够被操纵，使得可以生产异丁烯的途径。
[0037] 在内源途径中，宿主微生物天然地表达该途径中催化反应的所有酶。含有改造的 途径的宿主微生物并不天然地表达该途径中催化反应的所有酶，但经改造以便在该宿主中 表达该途径中的所有酶。在改造的途径中，酶可以是来自单一来源，即，来自一个物种，或者 可以多个来源，即来自不同的物种。
[0038] 编码本文描述的酶的核酸已经从多种生物体中鉴定，并且在公共数据库如 GenBank或EMBL容易获得。可用于异丁烯生产的本文所述的任意酶可具有与相应的野生 型酶的氨基酸序列至少70%的序列同一性（同源性）（例如，至少75%、80%、85%、90%、 95%、97%、98%、99%或100%)。例如，本文所述的烯酰基-(：(^水合酶（例如，（1〇特异 性烯酰基-CoA水合酶）可以具有与Phajl基因编码的铜绿假单胞菌烯酰基-CoA水合酶的 氨基酸序列（GenBankA登记号BAA92740，SEQIDN0:1)、斑点气单胞菌的烯酰基-CoA水合 酶的氨基酸序列（GenBank登录号BAA21816. 1，SEQIDN0:2)或恶臭假单胞菌的（R)特异 性烯酰基-CoA水合酶的氨基酸序列（GenBank登录号NP_746661，SEQIDN0:3)具有至少 70%的序列同一性（同源性）（例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或 100% )。参见图3。烯酰基-CoA水合酶还可以与枯草芽孢杆菌的（S)特异性烯酰基-CoA 水合酶的氨基酸序列（GenBank登录号CAA99573. 1，SEQIDN0:4)具有至少70%的序列同 一性（同源性）（例如，至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%)。
[0039] 例如，本文所述的2-羟酰基-CoA脱水酶可具有与由HadBC基因编码的艰难梭菌 2-羟酰基-CoA的氨基酸序列（见GenBank登录号AAV40819. 1和AAV40820. 1，分别是SEQID NO. 5和6)和由HadI编码的艰难梭菌起始子的氨基酸序列（GenBank登录号AAV40818. 1， 3￡〇10吣：7)至少70%的序列同一性（同源性）（例如至少75%、80%、85%、90%、95%、 97%、98%、99%、或100%)。他(18(：基因编码脱水酶的两个亚基。例如，本文所述的2-羟 酰基-CoA脱水酶可具有与由HgdAB基因编码的发酵氨基酸球菌的2-羟酰基-CoA脱水酶的 氨基酸序列（参见GenBank登录号CAA32465. 1和CAA32466. 1，分别为SEQIDNO:8和9) 和由HdgC编码的发酵氨基酸球菌的起始子的氨基酸序列（见GenBank登录号CAA42196. 1， 3￡〇10勵：10)至少70%的序列同一性（同源性）（例如至少75%、80%、85%、90%、95%、 97%、98%、99%、或100%)。取(^8基因编码脱水酶的两个亚基。参见图4。
[0040] 例如，本文所述的异戊酰基-CoA脱氢酶可具有与由liuA基因编码的铜绿假单胞 菌PA01异戊酰基-CoA脱氢酶的氨基酸序列（GenBank登录号AAG05403. 1，SEQIDN0:11) 至少70%的序列同一性（同源性）（例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、 99%、或 100% )。
[0041] 例如，本文所述的酰基CoA脱氢酶可具有与由acdH基因编码的除虫链霉菌的酰基 (：〇八脱氢酶的氨基酸序列（661^&吐登录号44044196.1，5￡0 10勵：12)至少70%的序列同 一性（同源性）（例如，至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、或100%)。参 见图5。
[0042] 两个氨基酸序列之间的百分比同一性（同源性）可如下确定。首先，使用来自含有 BLASTP版本2. 0. 14的BLASTZ单机版本的BLAST2序列（bl2seq)程序比对氨基酸序列。此 BLASTZ单机版本可获自Fish&Richardson的网站（例如，www.fr.com/blast/)或美国政府 的国家生物技术信息中心网站上（www.ncbi.nlm.nih.gov)。解释如何使用bl2seq程序的 说明书可以在BLASTZ附带的自述文件（readmefile)中找到。bl2seq使用BLASTP算法进 行两个氨基酸序列之间的比较。为了比较两个氨基酸序列，bl2seq的选项设置如下：将-i 设置为包含待比较的第一氨基酸序列的文件（例如，C:\seql.txt);将-j设置为包含待比 较的第二氨基酸序列的文件（例如，C:\seq2.txt);将-p设置为blastp;将-〇设置为任 何所需的文件名（如：C: \output.txt);并且所有其他选项保持其默认设置。例如，下面的 指令可以用来产生含有两个氨基酸序列之间的比较的输出文件：C:\B12Seq-ic:\seql. txt-jc:\seq2.txt-pblastp-〇c:\output.txt。如果所比较的两个序列共有同源性 (同一性），则指定的输出文件将以那些同源区域作为对齐的序列。如果比较的两个序列不 共享同源性（同一性），则指定的输出文件将不呈现对齐的序列。可以对核酸序列遵循类似 的规程，只是使用blastn。
[0043] -旦对齐，通过计算两个序列中呈现相同氨基酸残基的位置的数目确定匹配数。 百分比同一性（同源性）是通过以下来确定：将匹配数除以全长多肽氨基酸序列的长度，之 后将得到的值乘以1〇〇。应当指出，百分比同一性（同源性）的值被舍入到最接近的十分 之一。例如，78. 11、78. 12、78. 13 和 78. 14 向下四舍五入至 78. 1，而 78. 15、78. 16、78. 17、 78. 18和78. 19向上四舍五入至78. 2。还应注意，长度值总是整数。
[0044] 应当理解，许多核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是 本领域公知的；即，对于许多氨基酸，存在超过一个用作氨基酸密码子的核苷酸三联体。例 如，可以使用特定物种的合适的密码子偏倚表修饰给定酶的编码序列中的密码子，以便获 得在该物种（例如，细菌或真菌）中的最佳表达。
[0045] 本文所述的任意酶的功能性片段也可以用于本文件的方法中。如本文所用的术语 "功能片段"是指具有相应的成熟的全长野生型蛋白质的至少25% (例如，至少30%;40%; 50% ;60% ;70% ;75% ;80% ;85% ;90% ;95% ;98% ;99% ;100% ;或甚至大于 100% )的 活性的蛋白质的肽片段。功能片段通常可以但不总是由蛋白质的连续区域组成，其中该区 域具有功能活性。
[0046] 本文件还提供了⑴在本文件的方法中使用的酶的功能性变体和（ii)上述的功 能性片段的功能性变体。酶和功能性片段的功能性变体可以包含相对于相应的野生型序列 的添加、缺失或取代。具有取代的酶通常会具有不超过50 (例如，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、12、15、20、25、30、35、40或50)个氨基酸的取代（例如，保守取代）。这适用于本文所 述的任何酶和功能性片段。保守取代是用一个氨基酸取代具有相似特性的另一个。保守取 代包括下组中的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和 谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨 酸和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天 冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的（碱性）氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电荷 的（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。将上述极性，碱性或酸性组中的一个成员任意 取代成相同组的另一个成员可以认为是保守取代。与此相反，非保守取代是用一个氨基酸 取代具有不同特性的另一个。
[0047] 缺失变体可以缺少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12 个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸的区段（具有2个或更多个 氨基酸）或非连续的单个氨基酸。添加（添加变体）包括融合蛋白，其含有：(a)本文所述 的任意酶或其片段；及（b)内部或末端（C或N)无关的或异源的氨基酸序列。在这种融合蛋 白的背景下，术语"异源氨基酸序列"是不同于（a)的氨基酸序列。异源序列可以是例如用 于纯化重组蛋白的序列（例如，FLAG、多组氨酸（例如 六组氨酸）、凝聚素（hemagluttanin) (HA)、谷胱甘肽-S-转移酶（GST)或麦芽糖结合蛋白（MBP))。异源序列还可以是用作可检 测标记的蛋白质，例如，萤光素酶、绿色荧光蛋白（GFP)或氯霉素乙酰转移酶（CAT)。在一些 实施方案中，融合蛋白包含来自另一种蛋白质的信号序列。在某些宿主细胞（例如，酵母宿 主细胞）中，通过使用异源信号序列，可以增加靶蛋白的表达和/或分泌。在一些实施方案 中，融合蛋白可包含可用于例如引发免疫应答以生成抗体的载体（如KLH)或ER或高尔基 体保留信号。异源序列可以具有不同的长度，在某些情况下，可以是比异源序列所附接的全 长靶蛋白更长的序列。
[0048] 重组宿主可以天然地表达无一或一些（例如，一个以上、两个以上、三个以上、四 个以上、五个以上、或六个以上）本文所述途径的酶。还可以破坏重组宿主的内源性基因， 以防止不希望的代谢产物的形成或防止在该途径中通过作用于这些中间产物的其它酶导 致的中间产物的损失。重组宿主可以称为重组宿主细胞，改造的细胞（engineeredcell) 或改造的宿主。因此，如本文所述，重组宿主可以包括编码下列一种或多种的核酸：脱羧酶、 脱氢酶，水合酶，硫酯酶，辅酶A连接酶，或辅酶A转移酶，如下文更为详细描述的。
[0049] 例如，重组宿主可以包括外源核酸，其编码2-羟酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA 水合酶，或异戊酰基-CoA/酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶。此类宿主能产生异丁 烯并包括编码甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的核酸。宿主还可以包括（i) 2-羟基-酰基脱氢酶， (ii)CoA转移酶或CoA连接酶，和/或（iii)硫酯酶或CoA转移酶。在一些实施方式中，宿 主还可以包括（i)4-甲基-2-氧代-戊酸脱氢酶，（ii)吲哚丙酮酸脱羧酶，苯乙醛脱氢酶 和CoA连接酶和/或（iii)硫酯酶。
[0050] 当涉及核酸（或蛋白质）和宿主时，如本文所使用的术语"外源的"指的是这样的 核酸或由此类核酸编码的蛋白质，该核酸并不存在于天然发现该核酸的特定类型的细胞中 (并且不能获自该细胞）。因此，对于宿主来说，认为一旦在宿主中非天然存在的核酸是外 源的。重要的是，注意到非天然存在的核酸可以含有自然界中找到的核酸序列的核酸亚序 列或片段，只要核酸作为整体不存在于自然界中。例如，由于核酸分子作为一个整体（基因 组DNA加上载体DNA)在自然界中不存在，包含在表达载体内的基因组DNA序列的核酸分子 是非天然存在的核酸，因此一旦引入到宿主中，对于宿主细胞是外源的。因此，认为作为一 个整体并不存在于自然界中的任意载体、自主复制质粒或病毒（例如，逆转录病毒、腺病毒 或疱瘆病毒）是非天然存在的核酸。由此得出结论，通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生 的基因组DNA片段以及cDNA是非天然存在的核酸，这是因为它们作为自然界找不到的不同 分子存在。还得出结论含有在自然界中找不到的排列中的启动子序列和多肽编码序列（例 如，cDNA或基因组DNA)的任意核酸是非天然存在的核酸。对于特定的宿主微生物来说，天 然存在的核酸可能是外源的。例如，自酵母x的细胞分离的整条染色体在该染色体被导入 酵母y的细胞中后相对于酵母y的细胞而言是外源核酸。
[0051]与之相反，当涉及核酸（例如，基因）（或蛋白质）和宿主时，如本文所使用的术语 "内源的"指的是这样的核酸，该核酸的确存在于天然发现该核酸的特定的宿主中（并且能 获自该宿主）。此外，"内源性表达"核酸（或蛋白质）的细胞就像相同特定类型的宿主那 样表达该核酸（或蛋白质），就像其在自然界中被发现一样。此外，"内源性产生"核酸、蛋 白质或其他化合物的宿主就像相同特定类型的宿主那样表达该核酸，蛋白质或化合物，就 像其在自然界中被发现一样。
[0052] 此外，可以在体外使用本文所述的分离的酶，使用来自宿主微生物的裂解物（例 如，细胞裂解物）作为酶的来源，或使用来自不同宿主微生物的多种裂解物作为酶的来源 来进行异丁烯的生产。
[0053] 在一些实施方案中，通过分类在例如EC1. 3. 8. 4下的异戊酰基-CoA或酰 基-CoA脱氢酶（如liuA或acdH的基因产物）形成3-甲基-丁-2-烯酰基-CoA。来 自铜绿假单胞菌的liuA基因具有特异地针对异戊酰基-CoA的脱氢酶活性（参见，例如 Foster-Fromme和Jendrossek,FEMSMicrobiol.Lett.，2008, 286, 78 - 84)。来自除虫链霉 菌的acdH基因也具有针对异戊酰-CoA的脱氢酶活性（参见，例如，Zhang等人，Microbiol ogy, 1999, 145, 2323 - 2334) 〇
[0054] 在一些实施方案中，通过例如分类在EC4. 2. 1-下的2-羟酰基-CoA脱水酶（如 来自艰难梭菌的HadBC基因和其起始子HadI的产物（参见图4)或来自发酵氨基酸球菌 的HgdAB基因和其起始子HdgC的产物（参见图4))形成3-甲基-丁-2-烯酰基-CoA。 在一些实施方案中，2-羟酰基-CoA脱水酶是酶工程化的结果。从厌氧细菌分离的酶 2-羟酰基-CoA脱水酶具有在氨基酸降解途径中所采用的常见催化机制。例如，来自艰 难梭菌的HadBC/HadI的基因产物催化（R)_2_羟基异己酰基（hydroxylsocaproyl)-CoA 转化成isocaprenoyl-CoA。相似地，HgdAB/HdgC的基因产物催化2-轻戊二酰 基-CoA(2-hydroxyglutaryl-CoA)转化成戊稀二酰基-CoA(glutaconyl-CoA)(Kim等 人?，FEMSMicrobiol.Reviews, 2004, 28, 455 - 468)〇
[0055] 在一些实施方案中，通过例如分类在EC4. 2. 119下的R-特异性烯酰基-CoA水 合酶（如phaj或MaoC的基因产物）或例如分类在EC4. 2. 1. 17下的细菌（S)-特异性烯 酰基-CoA水合酶（如YsiB的基因产物）将3-羟基官能团引入到3-甲基-丁 -2-烯酰 基-CoA。在一些实施方案中，稀酰基-CoA水合酶是酶工程化的结果。在Galactomyces reessii的无细胞提取物中鉴定了用于将3-羟基官能团引入到3-甲基丁-2-烯酰 基-CoA(3-methylbuten-2-enoy1-CoA)的单个酶候选物，该无细胞提取物含有归类于 EC4. 2. 1. 17的烯酰基-CoA水合酶，其将3-甲基丁-2-烯酰基-CoA转化至3-羟基-3-甲 基丁酰基-CoA (Lee等人，Environ. Microbiol.，1997, 63 (11)，4191 - 4195)。到现在为止， 尚未鉴定来自细菌起源的等同烯酰基-CoA水合酶活性。
[0056] 在一些实施方案中，水合酶可以是酶工程化的结果，其使用phaj，EC4. 2. 1. 119和 EC4. 2. 1. 17的酶结构来告知合理的酶设计。
[0057] 在一些实施方案中（图1)，通过例如分类在EC1. 1. 1. 272、EC1. 1. 1. 345或EC 1. 1. 1. 28下的2-羟基-酰基脱氢酶将中心前体3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA，3-甲基-2-氧 代-丁酸酯转化成3-甲基-2-羟基-丁酸酯；之后通过例如分类在EC2. 8. 3.-下的CoA 转移酶（如GctAB的基因产物）或例如分类在EC6. 2. 1. 2下的CoA连接酶转化成3-甲 基-2-羟基丁酰基-CoA;之后通过2-羟基-酰基-CoA脱水酶（如HadBC和起始子HadI 或HgdAB和起始子HgdC的基因产物）转化成3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA;之后通过例如 分类在EC4. 2. 1. 119下（如phaj或MaoC的基因产物）或者例如分类在EC4. 2. 1. 17下 (如YsiB的基因产物）的烯酰基-CoA水合酶转化成3-甲基-3-羟基-丁酰基-CoA;之后 通过例如分类在EC3. 1. 2.-下（如tesAUesB或YciA的基因产物）的硫酯酶或例如分类 在EC2. 8. 3.-下的CoA转移酶（如GctAB的基因产物）转化成3-甲基-3羟基-丁酸酯； 之后通过例如分类在EC4. 1. 1. 33下的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化成异丁烯。通过YciA编 码的硫酯酶具有广泛的底物特异性，水解许多支链脂肪酸如异丁酰基-CoA、异戊酰基-CoA 以及 3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(Zhuang等人，Biochemistry, 2008, 47, 2789 - 2796)。
[0058] 在一些实施方案中，从丙酮酸合成3-甲基-2-氧代丁酸酯，其通过例如分类在 EC2. 2. 1. 6下的乙酰乳酸合酶（如ilvB或ilvN的基因产物）将丙酮酸转化为2-乙酰乳 酸；之后通过例如分类在EC1. 1. 1. 86下的二羟基异戊酸脱氢酶（如ilvC的基因产物）转 化成2, 3-二羟基异戊酸；之后通过例如分类在EC4. 2. 1. 9下的2, 3-二羟基异戊酸脱水酶 (如ilvD的基因产物）转化成3-甲基-2-氧代-丁酸酯。
[0059] 在一些实施方案中（图2)，通过例如分类在EC1.2. 1?-下（如pdhD，bfmBB，bfmBAA 和bfmBAB的基因产物），或分类在EC1. 2. 7. 7下的4-甲基-2-氧代-戊酸酯脱氢酶复合 体将中心前体3-甲基-2-丁-烯酰基-C〇A、4-甲基-2-氧代-戊酸酯转化为3-甲基丁 酸酯；之后通过例如分类在EC1. 3. 8. 4下的异戊酰基-CoA/酰基-CoA脱氢酶（如liuA或 acdH的基因产物）转化成3-甲基丁-2-烯酰基-CoA;之后通过例如分类在EC4. 2. 1. 119下 (如phaj或MaoC的基因产物）或分类在EC4.2. 1. 17下（如YsiB的基因产物）的（R)-特 异性烯酰基-CoA水合酶转化成3-甲基-3-羟基-丁酰基-CoA;之后通过例如分类在EC 3. 1. 2.-下的硫醋酶（如tesA、tesB或YciA的基因产物）转变成3-甲基-3羟基-丁酸 酯；之后通过分类EC4. 1. 1. 33下的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化成异丁烯。
[0060] 在一些实施方案中（图2)，通过例如分类在4. 1. 1. 74或EC4. 1. 1. 43下的吲哚 丙酮酸脱羧酶将3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA中心前体4-甲基-2-氧代-戊酸酯转化为 3-甲基正丁醛；之后通过例如分类在EC1. 2. 1. 5或EC1. 2. 1. 39下的苯乙醛脱氢酶（如padA 的基因产物）转化成3-甲基丁酸酯；之后通过例如分类在EC6. 2. 1. 2下的CoA连接酶转化 成3-甲基-丁酰基-CoA;之后通过例如分类在EC1. 3. 8. 4下的异戊酰基-CoA/酰基-CoA 脱氢酶（如liuA或acdH的基因产物）转化成3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA;之后通过例 如分类在EC4. 2. 1. 119下（如phaj或MaoC的基因产物）或例如分类在EC4. 2. 1. 17下 (如YsiB的基因产物）的（R)-特异性烯酰基-CoA水合酶转化成3-甲基-3-羟基-丁酰 基-CoA;之后通过例如分类在EC3. 1. 2.-下的硫酯酶（如tesA、tesB或YciA的基因产 物）转变成3-甲基-3-羟基-丁酸酯；之后通过分类在EC4. 1. 1. 33下的甲羟戊酸二磷酸 脱羧酶转化成异丁烯。
[0061] 在一些实施方案中，将编码图1或2中描述的途径的酶的核酸引入宿主微生物，其 是原核生物或真核生物。
[0062] 在一些实施方案中，宿主微生物是原核生物，其来自埃希氏菌属如大肠杆菌；梭菌 属，如扬氏梭菌，自产乙醇梭菌或克氏梭菌；棒杆菌属，如谷氨酸棒杆菌；贪铜菌属如钩虫 贪铜菌或耐金属贪铜菌；假单胞菌属如荧光假单胞菌，恶臭假单胞菌或食油假单胞菌；食 酸代尔夫特菌属，芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌；乳杆菌属如德氏乳杆菌；乳球菌属，例如 乳酸乳球菌或红球菌属如马红球菌。
[0063] 在一些实施方案中，宿主微生物是真核生物，其来自下组：曲霉属，例如黑曲 霉；酵母属如酿酒酵母；毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母；耶氏酵母属，如解脂耶氏酵母； 伊萨酵母属如东方伊萨酵母；德巴利酵母属如汉逊德巴利酵母；Arxula属如Arxula adenoinivorans;克鲁维酵母属，例如乳酸克鲁维酵母。
[0064] 在一些实施方案中，在重组宿主中使用发酵策略生物合成异丁烯，该发酵策略可 以包括厌氧、微需氧或需氧培养重组宿主。
[0065] 在一些实施方案中，在营养物限制条件下在重组宿主中生物合成异丁烯，所述营 养物限制条件如氮、磷酸盐或氧限制。
[0066] 在一些实施方案中，在重组宿主中使用发酵策略生物合成异丁烯，该发酵策略使 用氧的备选最终电子受体如硝酸盐。
[0067] 在一些实施方案中，在异丁烯合成中，可以采用使用例如陶瓷中空纤维膜的细胞 保留策略来实现并维持补料分批或连续发酵期间的高细胞密度。
[0068] 在一些实施方案中，生物给料可以是，可以包括或可以来源于单糖、 二糖、木质纤 维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸、甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩 的蒸馏器可溶物或城市废物。
[0069] 在几种微生物中已经证明有效分解代谢从生化柴油的生产中得到的粗制甘油， 该微生物如大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食油假单胞菌、恶臭假单胞菌和解脂耶氏酵母（Lee等 人，Appl.Biochem.Biotechnol.，2012, 166, 1801 - 1813;Yang等人，Biotechnologyfor Biofuels, 2012, 5:13;Meijnen等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2011，90, 885-893) 〇
[0070] 在通过前体丙酰基-CoA进行的3-羟基戊酸酯的合成中，已经证明几种微生物有 效分解代谢木质纤维素衍生的乙酰丙酸，该微生物如钩虫贪铜菌和恶臭假单胞菌（Jaremko 和Yu,JournalofBiotechnology, 2011，155, 2011，293 - 298;Martin和Prather,Journal ofBiotechnology, 2009, 139, 61 - 67)〇
[0071] 已经证明几种微生物如恶臭假单胞菌、钩虫贪铜菌有效分解代谢木质 素衍生的芳香族化合物如苯甲酸醋类似物（Bugg等人，CurrentOpinionin Biotechnology, 2011，22, 394 - 400 ;P6rez_Pantoja等人，FEMSMicrobiol. Rev.，2008, 32, 736 - 794)。
[0072] 已经证明几种微生物（包括解脂耶氏酵母）有效利用农业废物，如橄榄磨坊废水 (Papanikolaou等人，Bioresour.Technol.，2008, 99 (7)，2419-2428) 〇
[0073] 已经证明几种微生物有效利用可发酵糖如来自纤维素、半纤维素、甘 蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其他农业来源的单糖和二糖，该微生物如大肠杆 菌、谷氨酸棒杆菌、和德氏乳杆菌和乳酸乳球菌（参见、例如e.g.，Hermannet al，JournalofBiotechnology,2003， 104， 155-172;Wee等人，FoodTechnol. Biotechnol.，2006, 44 (2)，163 - 172 ;0hashi等人，JournalofBioscienceandBioengi neering, 1999, 87(5), 647-654) 〇
[0074] 已经证明钩虫贪铜菌有效利用来源于多种农业木质纤维素源的糠醛（Li等人，Bi odegradation, 2011, 22, 1215 - 1225) 〇
[0075] 在一些实施方案中，非生物给料可以是或来源于天然气、合成气、C02/H2、甲醇、乙 醇或来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物（NVR)或碱洗废物流。
[0076] 已经证明甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris)有效分解代谢甲 醇。
[0077] 已经证明克氏梭菌有效分解代谢乙醇（Seedorf等人，？1~〇(3.似1:1.六〇3(1.3(3；[. USA, 2008, 105(6)2128-2133)。
[0078] 已经证明钩虫贪铜菌有效分解代谢0)2和H2，它们可以来源于天然气以及其它化 学和石油化学来源（Prybylski等人，Energy,SustainabilityandSociety, 2012, 2:11)。
[0079] 已经证明多种微生物，如扬氏梭菌和自产乙醇梭菌有效分解代谢合成气（Kdpke 等人，AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 2011，77 (15)，5467 - 5475) 〇
[0080] 已经证明多种微生物，如食酸代尔夫特菌和钩虫贪铜菌有效分解代谢来自环己 烧过程的非挥发性残留物蒸汽（Ramsay等人，AppliedandEnvironmentalMicrobiolo gy，1986, 52(1)，152 - 156)。
[0081] 在一些实施方案中，提供了重组宿主微生物的基本上纯的培养物。如本文使用的， 重组宿主微生物的"基本上纯的培养物"是这样的微生物的培养物，其中在培养物中活细胞 的总数中少于约 40% (即，小于约 35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2%、1%、0. 5%、 0.25%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%或甚至更少）是不同于重组微生物的活细胞，例 如，细菌、真菌（包括酵母）、支原体或原生动物细胞。在上下文中术语"约"意指相关百分 比可以是高于或低于规定百分比的15%规定百分比。因此，例如，约20%可以是17%至 23%。重组微生物的这种培养物包括细胞和生长培养基，贮存培养基或转运培养基。培养 基可以是液体、半固体（例如，凝胶状培养基）或冻结的。培养物包括在液体培养基中或在 半固体培养基中/上生长的细胞或正在贮存或转运培养基（包括冷藏贮存或转运培养基） 中贮存或转运。培养物是在培养容器或贮存容器或基质（例如，培养皿、烧瓶、或管或贮存 管形瓶或管）中。
[0082] 代谢工程
[0083] 本文件提供这样的方法，其涉及少于全部的对所有上述途径描述的步骤。例如，此 种方法可以涉及此种步骤中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或 更多个步骤。在此种方法中包括少于全部步骤的情况中，第一步可以是所列的步骤中的任 何一个。
[0084] 此外，本文中所述的重组宿主可以包括上述酶的任何组合，使得可以在重组宿主 中进行此种步骤中的一个或多个，例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多个此类步 骤。
[0085] 此外，本文件认识到，在已经将酶描述为接受CoA活化的底物的情况中，存在与 [acp]结合底物相关的类似酶活性，其不一定在相同的酶类中。
[0086] 并且，本文件认识到，在已经将酶描述为接受底物的（R)-对映体的情况中，存在 与（S-对映体底物相关的类似酶活性，其不一定在相同的酶类中。
[0087] 该文件还认识到，在酶显示接受特定辅因子（如NADPH)或共底物（如乙酰 基-CoA)的情况中，许多酶在催化特定酶活性中就多种不同的辅因子或共底物而言是混杂 的。此外，本文件认识到在酶具有针对例如特定辅因子（如NADH)的高度特异性的情况中， 对辅因子NADPH具有高度特异性的具有相似或相同活性的酶可以是不同的酶类。
[0088] 在一些实施方案中，在本文中概述的途径中的酶可以是酶工程化的结果，其通过 非直接的或合理的酶设计方法以实现改进活性、提高特异性、减少反馈抑制、减少抑制、改 进酶溶解度、改变立体特异性或改变辅因子特异性为目标。
[0089] 在一些实施方案中，通过附加体或染色体整合的方法可以将本文中概述的途径中 的酶剂量分量（genedose)(即过表达）到得到的遗传修饰生物体中。
[0090] 在一些实施方案中，可以将基因组规模系统生物学技术如通量平衡分析（Flux BalanceAnalysis)用于设计用于将碳通量指向异丁烯的基因组规模弱化或敲除策略。
[0091] 弱化策略包括但不限于使用转座子，同源重组（双交换的方法），诱变，酶抑制剂 和RNAi干扰。
[0092]在一些实施方案中，可以将通量组学（fluxomic)、代谢组学（metabolomic)和转 录物组学数据（transcriptomaldata)用于告知或支持基因组规模系统生物学技术，从而 在将碳通量指向异丁烯中设计基因组规模弱化或敲除策略。
[0093] 在使用自然积累聚羟基脂肪酸酯的宿主的一些实施方案中，在宿主菌株中可弱化 酶聚合物合成酶。
[0094] 在需要乙酰基-CoA的胞内利用度合成异丁烯的一些实施方案中，可使用乙 酸合成途径中的一种或多种酶缺陷（例如活性的弱化水平）的宿主。例如，可以使 用磷酸转乙酰酶（由pta基因编码）缺陷的宿主（Shen等人，Appl.Environ.Microb io. , 2011, 77(9), 2905 - 2915) 〇
[0095] 在需要乙酰基-CoA或丙酮酸的胞内利用度合成异丁烯的一些实施方案中，可弱 化将丙酮酸降解成乳酸的酶（如ldhA的基因产物）（Shen等人，Appl.Environ.Microbi ol.，2011，77(9)，2905-2915)。
[0096] 在需要丙酮酸的胞内利用度合成异丁烯的一些实施方案中，可弱化将磷烯醇式丙 酮酸（phophoenolpyruvate)降解成琥泊酸的酶，如frdBC的基因产物（参见，例如，Shen 等人，2011，同上）。
[0097] 在需要丙酮酸的胞内利用度合成异丁烯的一些实施方案中，可弱化将乙酰基-CoA 降解成乙醇的酶，如adhE的基因产物（Shen等人，2011，同上）。
[0098] 在一些实施方案中，其中途径在异丁烯的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以 在宿主生物中过表达编码吡啶核苷酸转氢酶（puridinenucleotidetranshydrogenase) 的基因如UdhA(Brigham等人，AdvancedBiofuelsandBioproducts，2012，Chapter 39, 1065-1090)。
[0099] 在一些实施方案中，其中途径在异丁烯的合成中途径需要过量的NADPH辅因子， 可以在宿主生物中过表达编码甘油醛-3P-脱氢酶基因如GapN(Brigham等人，2012，同 上）。
[0100] 在一些实施方案中，其中途径在异丁烯的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以 在宿主生物中过表达苹果酸酶基因如maeA或maeB(Brigham等人，2012，同上）。
[0101] 在一些实施方案中，其中途径在异丁烯的合成中需要过量的NADPH辅因子， 可以在宿主生物中过表达葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶基因如zwf(Lim等人，Journalof BioscienceandBioengineering, 2002, 93(6), 543-549)〇
[0102] 在一些实施方案中，其中途径在异丁烯的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以 在宿主生物中过表达果糖1，6二磷酸酶基因如fbp(Becker等人，JournalofBiotechnol ogy，2007, 132, 99-109)。
[0103] 在一些实施方案中，可以在宿主中过表达分类在例如EC2. 2. 1.6下的乙酰乳酸合 酶的反馈抑制抗性的突变体，如ilvB和/或ilvN的突变体，其通过支链氨基酸抗反馈抑 制。
[0104] 在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶可以在启动子下表达，该启动子不受支链氨基 酸（例如，缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸）的遗传抑制。
[0105] 在一些实施方案中，弱化由ilvE编码的支链氨基酸转氨酶。
[0106] 在一些实施方案中，可以通过对细胞膜的遗传工程结构修饰或增加异丁烯的任何 相关转运蛋白的活性增强或放大异丁烯穿过细胞膜至胞外介质的流量。
[0107] 使用重组宿主生产异丁烯
[0108] 通常，通过提供宿主微生物并用含有如上所述的合适碳源的培养基培养所提 供的微生物产生异丁烯。在一般情况下，培养基和/或培养条件可以使得微生物生长 到足够的密度并有效地生产异丁烯。对于大规模的生产过程，可以使用任何方法，如在 别处描述的那些方法（ManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology, 2nd Edition,Editors:A.L.DemainandJ.E.Davies,ASMPress； 和Principlesof FermentationTechnology,P.F.StanburyandA.Whitaker,Pergamon) 〇 简而言之，用特定 微生物接种含有合适的培养基的大罐（例如，100加仑、200加仑500加仑或更大的罐）。接 种后，培养微生物以允许产生生物质。一旦达到所期望的生物量，可以将含有微生物的培养 基转移到第二个罐。此第二个罐可以是任何大小。例如，第二个罐可以是更大、更小或与第 一种罐大小相同。通常，第二个罐比第一个罐大，使得可以将额外的培养基添加到来自第一 种罐的培养基中。此外，第二个罐中的培养基可以与第一种罐中使用的培养基相同或不同。
[0109] 一旦转移，可以温育微生物，以允许产生异丁烯。一旦产生，可以使用任何方法来 分离异丁烯。例如，由于异丁烯的沸点为-6. 9°C，可以以挥发性产物的形式从发酵罐的废气 流中回收异丁烯。在通常大约30°C的发酵温度时，异丁烯从培养基中汽化出来，以穿过培养 基的气体流速剥离以从废气回收。可以将异丁烯选择性地吸附到例如吸附剂上并且与其他 废气组分分离。也可以采用膜分离技术将异丁烯与其它废气化合物分离。可以使用例如氮 气使异丁烯 从吸附剂上解吸并且使异丁烯在低温和高压下冷凝。 实施例
[0110] 接受3-甲基-3-羟基丁酰基-CoA作为底物的R-特异性烯酰基-CoA水合酶的酶 活性
[0111] 将来自斑点气单胞菌（Aeromonaspunctata)的C-末端His-标记的phaj基因克 隆到pE23a表达载体中在17启动子下，该phaj基因编码（R)特异性烯酰基-CoA水合酶 (SEQIDN0:2,参见图3)。将表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。在30°C下，在 含有100mL的LuriaBroth培养基的1L摇瓶中在以200rpm振荡的情况下培养得到的重组 大肠杆菌菌株。用ImMIPTG诱导培养物2小时。
[0112] 通过离心收获来自每一经诱导的摇瓶培养物的沉淀物。将每一沉淀物重悬于20mM HEPES(pH值=7. 2[-])、lmM的PMSF和29个单位benzonase中，并通过超声处理裂解。通 过离心分开细胞碎片与上清液，并用0. 2ym过滤器过滤。使用Ni亲和层析从上清液纯化 phaj酶并浓缩至1. 25mg/mL。
[0113] 在30°C，在缓冲液中进行了正向（水合）方向上的天然酶活性测定，该缓冲液由 10mM乙酸按（pH值=8)和ImM的巴豆酰基-CoA(也称为2-丁稀酰基-CoA) (Sigma-Aldrich 公司）组成。通过将0.4yM纯化的烯酰基-CoA水合酶加入到含有底物的测定缓冲液中起 始酶活性测定。在30°C通过分光光度法在263nm证实烯酰基-CoA水合酶接受巴豆酰-CoA 作为底物。如通过分光光度法在263nm测定的，仅底物对照显示巴豆酰基-CoA的最小自发 水合。参见图6。
[0114] 在缓冲液中进行了反向（脱水）方向上的天然酶活性测定，该缓冲液由10mM乙 酸铵（pH值=8)和ImM的外消旋3-羟基丁酰基-CoA组成。通过将5yM纯化的烯酰 基-CoA水合酶加入到含有底物的测定缓冲液中起始酶活性测定并且在30°C温育1小时。 通过LC-MS证实烯酰基-CoA水合酶接受3-羟基丁酰基-CoA作为底物。仅底物对照显示 3_羟基丁酰基-CoA的可忽略的自发脱水。如之前证实的（Lan和Liao,Proc.Natl.Acad. Sci.USA, 2012, 109 (16)，6018 - 6023)，尽管有利于正向（水合）方向，由phaj编码的烯酰 基-CoA水合酶是可逆的。参见图7。
[0115] 在缓冲液中进行了反向（脱水）方向上的非天然酶活性测定，该缓冲液由10mM乙 酸铵（pH值=8)和ImM的3-甲基-3-羟基丁酰基-CoA组成。通过将5yM纯化的烯酰 基-CoA水合酶加入到含有底物的测定缓冲液中起始酶活性测定并且在30°C温育1小时。 通过LC-MS证实phaj编码的酶接受3-甲基-3-羟基丁酰基-CoA作为底物。仅底物对照 显示3-甲基-3-羟基丁酰基-CoA无自发脱水。参见图8。
[0116] 来自斑点气单胞菌的phaj编码的烯酰基-CoA水合酶在脱水方向上接受3-甲 基-3-羟基丁酰基-CoA作为底物。考虑到酶反应的可逆性和有利的水合方向，来自斑点气 单胞菌的phaj编码的烯酰基-CoA水合酶接受3-甲基-丁基-2-烯酰基-CoA作为底物。
[0117] 其他实施方案
[0118] 应该理解的是，虽然本发明结合其详细描述进行了描述，但前面的描述意在说明 而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书限定。其他方面，优点和修改 落入所附权利要求书的范围之内。
【主权项】
1. 一种用于合成异丁烯的方法，所述方法包括（i)使3-甲基-2-羟基-丁酰基-CoA 脱水并使3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA水合，并且将得到的产物转化成异丁烯。2. 根据权利要求1的方法，其中2-羟酰基-CoA脱水酶使3-甲基-2-羟基-丁酰 基-CoA脱水。3. 权利要求2的方法，其中所述2-羟酰基-CoA脱水酶由基因产物HadI和HadBC编码 或者由基因产物HgdC和HgdAB编码。4. 权利要求2或3中任一项的方法，其中所述2-羟酰基-CoA脱水酶与SEQIDNO. 5 和6中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性，或者与SEQIDNO. 8和9中给出的 氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中（R)特异性烯酰基-CoA水合酶或（S)特异性烯 酰基-CoA水合酶使3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA水合。6. 权利要求5的方法，其中所述（R)特异性烯酰基-CoA水合酶与在SEQIDNO. 1-3中 给出的氨基酸序列的任一种具有至少70%的序列同一性。7. 权利要求5的方法，其中所述（S)特异性烯酰基-CoA水合酶与在SEQIDNO. 4中给 出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。8. -种用于合成异丁烯的方法，所述方法包括使3-甲基-丁酰基-CoA脱氢并使3-甲 基-丁 -2-烯酰基-CoA水合，并且将得到的产物转化成异丁烯。9. 权利要求8的方法，其中异戊酰基-CoA或酰基-CoA脱氢酶使3-甲基-丁酰基-CoA 脱氢。10. 权利要求9的方法，其中所述异戊酰基-CoA或酰基-CoA脱氢酶与SEQIDNO. 11 或12中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。11. 权利要求8-10中任一项的方法，其中（R)特异性烯酰基-CoA水合酶或⑶特异性 烯酰基-CoA水合酶使3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA水合。12. 权利要求11的方法，其中所述（R)特异性烯酰基-CoA水合酶与在SEQIDNO. 1-3 中给出的氨基酸序列的任一种具有至少70%的序列同一性。13. 权利要求11的方法，其中所述（S)特异性烯酰基-CoA水合酶与在SEQIDNO. 4中 给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。14. 前述权利要求中任一项的方法，其中使用分离的酶进行所述方法。15. 前述权利要求中任一项的方法，其中使用包含所述酶的细胞裂解物进行所述方法。16. 前述权利要求中任一项的方法，其中在重组宿主中进行所述方法。17. 权利要求16的方法，其中所述宿主是原核生物或真核生物。18. 根据权利要求17的方法，其中所述原核宿主来自埃希氏菌属（Escherichia)如 大肠杆菌（Escherichiacoli);来自梭菌属（Clostridia)，如扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)，自产乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)或克氏梭菌（Clostridium kluyveri);来自棒杆菌属（Corynebacteria)，如谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum);来自贪铜菌属（Cupriavidus)如钩虫贪铜菌（Cupriavidusnecator)或耐金 属贪铜菌（Cupriavidusmetallidurans);来自假单胞菌属如焚光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)，恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)或食油假单胞菌（Pseudomonas oleavorans);来自食酸代尔夫特菌属（Delftiaacidovorans)，来自芽孢杆菌属，如 枯草芽抱杆菌（Bacillussubtillis);来自乳杆菌属如德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii);来自乳球菌属，例如乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)或来自红球菌属 (Rhodococcus)如马红球菌（Rhodococcusequi)。19. 根据权利要求17的方法，其中所述真核宿主来自曲霉属如黑曲霉（Aspergillus niger);来自酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae);来自毕赤酵母属如巴斯德 毕赤酵母（Pichiapastoris);来自耶氏酵母属，如解脂耶氏酵母（YarrowiaIipolytica) 或来自伊萨酵母（Issathenkia)属如东方伊萨酵母（Issathenkiaorientalis)或来自德 巴利酵母（Debaryomyces)属如汉逊德巴利酵母（Debaryomyceshansenii)，或来自Arxula 属如Arxulaadenoinivorans或来自克鲁维酵母属（Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵 母（Kluyveromyceslactis)20. 根据权利要求16-19中任一项的方法，其中发酵策略需要厌氧、微需氧或需氧培 养。21. 根据权利要求16-20中任一项的方法，其中发酵策略需要营养物限制，如氮、磷酸 盐或氧限制。22. 根据权利要求16-21中任一项的方法，其中利用使用陶瓷中空纤维膜的细胞保留 策略来实现并维持发酵期间的高细胞密度。23. 根据权利要求16-22中任一项的方法，其中给发酵装置补料的主要碳源来源于生 物给料或非生物给料。24. 根据权利要求23的方法，其中所述生物给料是或来源于单糖、二糖、木质纤维素、 半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸（levulinicacid)和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农 业废物、浓缩的蒸馏器可溶物（condenseddistillers'soluble)或城市废物。25. 根据权利要求23的方法，其中所述非生物给料是或来源于天然气、合成气、CO2/H2、 甲醇、乙醇、或来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物（NVR)或碱洗废物流。26. -种包含编码2-羟酰基-CoA脱水酶和烯酰基-CoA水合酶的外源核酸的重组宿 主，所述宿主产生异丁烯。27. 权利要求26的宿主，所述宿主进一步包含甲轻戊酸二磷酸脱羧酶（mevalonate diphosphatedecarboxylase)〇28. 权利要求26或权利要求27的宿主，所述宿主进一步包含（i) 2-羟酰基脱氢酶， (ii)CoA转移酶或CoA连接酶，以及（iii)硫酯酶。29. -种包含编码异戊酰基-CoA/酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶的外源核酸 的重组宿主，所述宿主产生异丁烯。30. 权利要求29的宿主，所述宿主进一步包含甲羟戊酸二磷酸脱羧酶。31. 权利要求29或权利要求30的宿主，所述宿主进一步包含4-甲基-2-氧代-戊酸 脱氢酶复合体和硫酯酶。32. 权利要求28-31中任一项的宿主，所述宿主进一步包含吲哚丙酮酸脱羧酶 (indolepyruvatedecarboxylase)、苯乙酸脱氛酶（phenylacetaldehydedehydrogenase) 和CoA连接酶。33. 权利要求26-32中任一项的宿主，其中所述烯酰基-CoA水合酶是与SEQIDNO: 1-3 所示的氨基酸序列中的任一种具有至少70 %序列同一性的（R)-特异性烯酰基-CoA水合 酶。34. 权利要求26-32中任一项的宿主，其中所述烯酰基-CoA水合酶是与SEQIDNO:4 所示的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的（S)-特异性烯酰基-CoA水合酶。35. 权利要求26-34中任一项的宿主，其中所述宿主天然积累聚羟基脂肪酸酯 (polyhydroxyalkanoate)，并且包含弱化的酶聚合物合酶（polymersynthase)。36. 权利要求26-35中任一项的宿主，其中所述宿主进一步包含下列弱化的酶中的一 种或多种：磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、将丙酮酸降解成乳酸的酶、将磷酸烯醇式丙酮酸降解 成琥珀酸的酶、将乙酰基-CoA降解成乙醇的酶、或最终支链氨基酸转氨酶。37. 权利要求26-36中任一项的宿主，其中所述宿主进一步过表达以下基因中的一个 或多个，所述基因编码：吡啶核苷酸转氢酶（puridinenucleotidetranshydrogenase)、甘 油酸 _3P_ 脱氛酶（glyceraldehyde-3P_dehydrogenase)、苹果酸酶（malicenzyme)、葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶、果糖1，6二磷酸酶或乙酰乳酸合酶（acetolactatesynthase)的反馈 抑制抗性突变体，其中所述乙酰乳酸合酶对支链氨基酸的反馈抑制有抗性。38. 权利要求37的宿主，其中编码所述乙酰乳酸合酶的基因是使用不受分支氨基酸遗 传阻遏的启动子表达的。39. 权利要求26-32中任一项的宿主，其中异丁烯穿过细胞膜的流出通过细胞膜的遗 传工程而增强或放大或者随用于异丁烯的相关转运蛋白活性而增加。
【专利摘要】本文件提供了使用一种或多种分离的酶如烯酰基-CoA脱水酶、2-羟酰基-CoA脱水酶、异戊酰基-CoA/酰基-CoA脱氢酶和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶中的一种或多种，或使用表达一种或多种此类酶的重组宿主细胞生物合成异丁烯的方法。
【IPC分类】C12P5/02, C07C11/09
【公开号】CN104903455
【申请号】CN201380061760
【发明人】A.L.博泰斯, A.V.E.康拉迪
【申请人】英威达技术有限责任公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月27日
【公告号】EP2925871A1, US20140186913, WO2014085612A1
【专利说明】用于异丁烯生物合成的方法 发明领域
[0001] 本申请涉及使用一种或多种分离的酶（如烯酰基-CoA脱水酶、2-羟酰基-CoA脱 水酶、异戊酰基-CoA/酰基-CoA脱氢酶、和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶）中的一种或多种，或使 用表达一种或多种此类酶的重组宿主细胞生物合成异丁烯的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 在生产燃料添加剂、丁基橡胶聚合物和抗氧化剂中，异丁烯是一种重要的单体 (Bianca等人，Appl.MicrobiolBiotechnol.，2012, 93, 1377-1387) 〇
[0004] 使用异丁烯作为给料来制造商品取决于很多基于石油的来源，包括（i)从丁二烯 分离的来自蒸汽裂化器（steamcracker)的C4流，（ii)来自催化性裂化器的丁烯-丁烷 级分和（iii)正丁烷（来自液态石油气），其被异构化成异丁烷并脱氢成异丁烯。
[0005] 考虑到对石油化工给料和能源密集工艺的依赖性，生物技术提供了通过生物催化 进行的备选方法。生物催化是使用生物催化剂（如酶或全细胞）来进行有机化合物的生物 化学转化。
[0006] 因此，针对这种背景，清楚的是需要产生中间体（特别是异丁烯）的承受得起的方 法，其中该方法是基于生物催化的。对于该生物催化方法，生物来源的给料和石油化工给料 均是可行的原料。
[0007] 在通过生物催化方法合成异丁烯中，将双键引入到短支链脂肪族碳底物中是一 个关键的考虑因素。在这个过程中（inthisvain)，来自小红酵母德克萨斯变种IF0 1102(Rhodotorulaminutavar.texensisIF0 1102)的细胞色素P450 通过异戊酸的脱羧 而形成异丁烯。并且，已经显示在生物合成异丁烯的过程中，油酸水合酶的变体接受异丁 醇，并且甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的变体接受3-羟基-3- 丁酸甲酯作为底物。因此，已经鉴 定了许多酶在异丁稀的合成中具有催化活性（(Bianca等人，Appl.MicrobiolBiotechn ol.，2012, 93, 1377-1387))。
[0008]然而，产生异丁烯合成接受的前体的鉴定生物化学途径是碳低效的，这通过碳上 的低最大理论产率得到反映。例如，鉴定的利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的催化活性的唯一 途径具有约0.2 [(g异丁烯）V(g葡萄糖）的最大理论产率（Bianca等人，2012,同上）。使 用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶作为最终的酶促步骤来经济地生产异丁烯受到碳产率限制考验。
[0009] 发明概述
[0010] 本文件至少部分地基于构建碳有效的生物化学途径以产生3-甲基-3-羟基-丁 酸酯，其可以通过甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化成异丁烯。在合成3-甲基-3-羟基-丁酸 酯中，此种途径可以依靠2-羟酰基-CoA脱水酶或异戊酰基CoA/酰基-CoA脱氢酶和烯酰 基-CoA水合酶（例如，（R)特异性烯酰基-CoA水合酶）。在本发明之前，不知道与烯酰 基-CoA水合酶组合的2-羟酰基-CoA脱水酶或异戊酰基-CoA脱氢酶可以用于生物学合成 3-甲基-3-羟基-丁酸酯，从而导致异丁烯的合成。并且，在本发明之前，不知道细菌来源 的烯酰基-CoA水合酶可以用于合成3-甲基-3-羟基-丁酸酯，从而导致异丁烯的合成。
[0011] 因此，本文件提供了可以将中心前体3-甲基-2-氧丁酸酯 (3-methyl-2_oxobutanoate)或 4_ 甲基 _2_ 氧戊酸醋（4-methyl-2_oxopentanoate)经由 共同的中间体 3_ 甲基 _3_ 羟基-丁 _2_ 稀酰基-CoA(3-methyl-3-hydroxy-but-2-enoyl_C 〇A)转化成异丁烯的途径和酶。如本文所用，术语"中心前体"用于表示在本文显示的导致 合成异丁烯的任意代谢途径中的任意代谢产物。术语"中心代谢产物"在本文中用于表示 在全部微生物中产生以支持生长的代谢产物。
[0012] 在一方面，本文件的特征在于用于合成异丁烯的方法。该方法包括（i)使3-甲 基-2-羟基-丁酰基-CoA脱水和使3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA水合，并且将得到的产物 转化成异丁條。2_轻醜基_CoA脱水酶可以使3_甲基_2_羟基-丁醜基_CoA脱水。2_轻 酰基-CoA脱水酶可以由基因产物HadI和HadBC编码，或者由基因产物HgdC和HgdAB编码。 2-羟酰基-CoA脱水酶可以与SEQIDNO. 5和6中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列 同一性，或者可以与SEQIDNO. 8和9中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。 (R)特异性烯酰基-CoA水合酶或（S)特异性烯酰基-CoA水合酶可以使3-甲基-丁-2-烯 酰基-CoA水合。（R)特异性烯酰基-CoA水合酶可以与在SEQIDNO. 1-3中给出的氨基酸 序列的任一种具有至少70%的序列同一性。（S)特异性烯酰基-CoA水合酶可以与在SEQ IDNO. 4中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0013] 本文件的特征还在于用于合成异丁烯的方法。该方法包括使3-甲基-丁酰基-CoA 脱氢和使3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA水合，并且将得到的产物转化成异丁烯。异戊酰 基-CoA或酰基-CoA脱氢酶可以使3-甲基-丁酰基-CoA脱氢。异戊酰基-CoA或酰基-CoA 脱氢酶可以与SEQIDNO. 11或12中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。（R) 特异性烯酰基-CoA水合酶或（S)特异性烯酰基-CoA水合酶可以使3-甲基-丁 -2-烯酰 基-CoA水合。（R)特异性烯酰基-CoA水合酶可以与在SEQIDNO. 1-3中给出的氨基酸序 列的任一种具有至少70%的序列同一性。（S)特异性烯酰基-CoA水合酶可以与在SEQID NO. 4中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0014] 本文描述的途径的反应可以在一种或多种细胞（例如，宿主细胞）株中进行，所 述细胞株（a)天然地表达一种或多种相关酶，（b)经遗传改造以表达一种或多种相关酶，或 (c)天然地表达一种或多种相关酶并且经遗传改造以表达一种或多种相关酶。备选地，相关 酶可以从上述类型的宿主细胞中的任一种提取并且以纯化的或者半纯化的形式使用。可以 任选地将提取的酶固定到固体基质如合适的反应容器的底部和/或壁。此外，此种提取物 包括可以用作相关酶来源的裂解物（例如，细胞裂解物）。在本文件提供的方法中，可以在 细胞（例如宿主细胞）中进行所有的步骤，可以使用提取的酶进行所有的步骤，或者在宿主 细胞中进行一些步骤而使用提取的酶进行其他的步骤。
[0015] 在本文描述的任何方法中，可以在重组宿主（例如，原核生物或真核生物）中 进行该方法。原核宿主可以来自埃希氏菌属（Escherichia)如大肠杆菌（Escherichia coli)，来自梭菌属（Clostridia)，如扬氏梭菌（Clostridiumljungdahlii)，自产乙 醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)或克氏梭菌（Clostridiumkluyveri);来 自棒杆菌属（Corynebacteria)，如谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum); 来自贪铜菌属（Cupriavidus)如钩虫贪铜菌（Cupriavidusnecator)或耐金属贪铜 菌（Cupriavidusmetallidurans);来自假单胞菌属（Pseudomonas)如焚光假单胞 菌（Pseudomonasfluorescens)，恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)或食油假单 胞菌（Pseudomonasoleavorans);来自食酸代尔夫特菌属（Delftiaacidovorans)， 来自芽孢杆菌属（Bacillus)，如枯草芽孢杆菌（Bacillussubtillis);来自乳杆菌 属（Lactobacillus)如德氏乳杆菌（Lactobacillusdelbrueckii);来自乳球菌属， 例如乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)或来自红球菌属（Rhodococcus)如马红球菌 (Rhodococcusequi)。真核宿主可来自曲霉属（Aspergillus)，例如黑曲霉（Aspergillus niger);来自酵母属（Saccharomyces)，如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae);来自 毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris);来自耶氏酵母属（Yarrowia)，如解 脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica)或来自伊萨酵母属（Issatchenkia)如东方伊萨酵 母（Issathenkiaorientalis)或来自德巴利酵母属（Debaryomyces)如汉逊德巴利酵母 (Debaryomyceshansenii)，或来自Arxula属如Arxulaadenoinivorans或来自克鲁维酵 母属（Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis)。
[0016] 在本文所述的任意方法中，可使用需要厌氧，微需氧或需氧培养的发酵策略。发酵 策略可需要营养物限制，例如氮、磷酸盐或氧限制。可以采用使用陶瓷中空纤维膜的细胞 保留策略以实现并维持发酵期间的高细胞密度。给发酵补料的主要碳源可以来源于生物 或非生物给料。生物原料可以是或来源于单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质 素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的蒸馏器可溶物（condensed distillers'solubles)或城市废物（municipalwaste)。非生物原料可以是或来源于天 然气、合成气、C02/H2、甲醇、乙醇或来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物（NVR)或碱洗废 物流（non-volatileresidue(NVR)oracausticwashwastestreamfromcyclohexane oxidationprocesses)〇
[0017] 在另一个方面，本文件的特征在于重组宿主，其包含编码2-羟酰基-CoA脱水酶和 烯酰基-CoA水合酶的外源核酸，该宿主产生异丁烯。宿主可进一步包含甲羟戊酸二磷酸脱 羧酶（mevalonatediphosphatedecarboxylase)。宿主还可以包含（i) 2_轻酰基脱氢酶， (ii)CoA转移酶或CoA连接酶，以及（iii)硫酯酶。
[0018] 在另一个方面，本文件的特征在于重组宿主，其包含编码异戊酰基-CoA/酰 基CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶的外源核酸，该宿主产生异丁烯。宿主可进一步包 含甲羟戊酸二磷酸脱羧酶。宿主可进一步包含4-甲基-2-氧代-戊酸脱氢酶复合体 (4-methyl_2-〇x〇-pentanoatedehydrogenasecomplex)和硫醋酶。宿主可进一步包 含口引噪丙酮酸脱羧酶、苯乙醛脱氢酶和CoA连接酶（indolepyruvatedecarboxylase,a phenylacetaldehydedehydrogenase,andaCoA-ligase)〇
[0019] 在任意的重组宿主中，烯酰基-CoA水合酶可以是与SEQIDNO: 1-3所示的氨基酸 序列中的任一种具有至少70%的序列同一性的（R)_特异性烯酰基-CoA水合酶或与SEQID N0:4所示的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性的（S)_特异性烯酰基-CoA水合酶。
[0020] 在任意重组宿主中，宿主可以天然积累聚羟基脂肪酸酯 (polyhydroxyalkanoates)并包含弱化的酶聚合物合酶（polymersynthase)。
[0021] 在任何重组宿主中，该宿主还可以包含下列弱化的酶中的一种或多种：磷酸转乙 酰酶、乙酸激酶、将丙酮酸降解成乳酸的酶、将磷酸稀醇式丙酮酸（phophoenolpyruvate) 降解成琥珀酸的酶、将乙酰基-CoA降解成乙醇的酶或最终支链氨基酸转氨酶。
[0022] 在任意重组宿主中，宿主还可以过表达编码下列一项或多项的基因：吡啶核苷酸 转氢酶、甘油醛-3P-脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶、果糖1，6二磷酸酶或乙 酰乳酸合酶的反馈抑制抗性突变体（puridinenucleotidetranshydrogenase,aglycera ldehyde-3P-dehydrogenase,amalicenzyme,aglucose-6-phosphatedehydrogenase,a fructose1,6diphosphatase,orafeedbackinhibitionresistantmutantofan acetolactatesynthase)，其中所述乙酰乳酸合酶具有对支链氨基酸的反馈抑制的抗性。 编码所述乙酰乳酸合酶的基因可以是使用不受分支氨基酸遗传阻遏的启动子表达的。
[0023] 在任意的重组宿主中，异丁烯穿过细胞膜的流出可以通过细胞膜的遗传工程而增 强 或放大或者随用于异丁烯的相关转运蛋白活性而增加。
[0024] 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人 员的通常理解具有相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可 以用于实施本发明，但是以下还是描述了合适的方法和材料。将本文提及的所有出版物、专 利申请、专利和其它参考文献以其整体并入本文作为参考。在存在冲突的情况下，以本说明 书（包括定义）为准。此外，材料，方法和实例仅是说明性的，并不意在进行限制。
[0025] 在附图和以下描述中给出了本发明的一个或多个实施方案的细节。本发明的其他 特征、目的和优点在说明书和附图，以及权利要求书中是显而易见的。根据专利法的标准实 践，在权利要求书中的词语"包含"可替换成"基本上由...组成"或"由...组成"。
[0026] 附图简述
[0027] 图1是使用3_甲基_2_氧代丁酸醋（3-methyl-2_oxobutanoate)作为中心前体 产生异丁烯的示例性生物化学途径的示意图。
[0028] 图2是使用4-甲基-2-氧代戊酸酯为中心前体产生异丁烯的示例性生物化学途 径的示意图。
[0029] 图3包含来自铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)(由Phajl基因编码） (GenBank登录号BAA92740，SEQIDNO: 1);斑点气单胞菌（Aeromonaspunctata)(GenBank 登录号BAA21816.1，SEQIDN0:2);和恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)(GenBank登 录号NP_746661，SEQIDN0:3)的（R)特异性烯酰基-C〇A水合酶；和来自枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)的（S)特异性烯酰基-CoA水合酶（GenBank登录号CAA99573. 1，SEQ IDNO:4)〇
[0030] 图4包含艰难梭菌（Clostridiumdifficile) 2-轻酰基-CoA脱水酶的氨基酸 序列（由HadBC基因编码）（见GenBank登录号AAV40819. 1和AAV40820. 1，分别是SEQ IDNO. 5和6)和艰难梭菌起始子（initiator)的氨基酸序列（由HadI编码）（GenBank 登录号AAV40818. 1，SEQIDN0:7)。图4还包含由HgdAB基因编码的发酵氨基酸球菌 (Acidaminococcusfermentans) 2-轻酰基-CoA脱水酶的氨基酸序列（参见GenBank登录 号CAA32465. 1和CAA32466. 1，分别为SEQIDNO:8和9)和由HdgC编码的发酵氨基酸球 菌起始子的氨基酸序列（见GenBank登录号CAA42196. 1，SEQIDNO:10)。
[0031] 图5包含由liuA基因编码的铜绿假单胞菌PA01异戊酰基-CoA脱氢酶的氨 基酸序列（GenBank登录号AAG05403. 1，SEQID勵：11)和由&〇(111基因编码的除虫链 霉菌（Streptomycesavermitilis)的酰基CoA脱氢酶的氨基酸序列（GenBank登录号 AAD44196. 1，SEQIDNO:12)。
[0032] 图6是在分光光度酶测定中，巴豆酰-CoA(底物）在由phaj编码的烯酰基-CoA 水合酶的正向（水合）方向随时间变化的吸光度单位的图。
[0033] 图7是在由phaj编码的烯酰基-CoA水合酶活性的反向（脱水）方向上，酶测定的 LC-MS分析结果的表。该结果指示烯酰基-CoA水合酶是可逆的，有利于正向的水合反应。
[0034] 图8是在由phaj编码的烯酰基-CoA水合酶的反向（脱水）方向上，酶测定的 LC-MS分析结果的表。该结果指示烯酰基-CoA水合酶接受3-甲基-3-羟基丁酰基-CoA 作为底物。考虑到酶反应的可逆性，烯酰基-CoA水合酶接受3-甲基-3-羟基丁 -2-烯酰 基-CoA作为底物。
[0035] 发明详述
[0036] 特别地，本文件提供了用于异丁烯合成的酶和重组宿主微生物，其可以形成支链 烯酰基-CoA底物3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA，并水合底物以形成3-甲基-3-羟基丁酰 基-CoA，其继而可以在一个或多个酶促步骤后通过甲羟戊酸磷酸脱羧酶被转化成异丁烯。 因此，本文中所描述的宿主微生物可以包括能够被操纵，使得可以生产异丁烯的途径。
[0037] 在内源途径中，宿主微生物天然地表达该途径中催化反应的所有酶。含有改造的 途径的宿主微生物并不天然地表达该途径中催化反应的所有酶，但经改造以便在该宿主中 表达该途径中的所有酶。在改造的途径中，酶可以是来自单一来源，即，来自一个物种，或者 可以多个来源，即来自不同的物种。
[0038] 编码本文描述的酶的核酸已经从多种生物体中鉴定，并且在公共数据库如 GenBank或EMBL容易获得。可用于异丁烯生产的本文所述的任意酶可具有与相应的野生 型酶的氨基酸序列至少70%的序列同一性（同源性）（例如，至少75%、80%、85%、90%、 95%、97%、98%、99%或100%)。例如，本文所述的烯酰基-(：(^水合酶（例如，（1〇特异 性烯酰基-CoA水合酶）可以具有与Phajl基因编码的铜绿假单胞菌烯酰基-CoA水合酶的 氨基酸序列（GenBankA登记号BAA92740，SEQIDN0:1)、斑点气单胞菌的烯酰基-CoA水合 酶的氨基酸序列（GenBank登录号BAA21816. 1，SEQIDN0:2)或恶臭假单胞菌的（R)特异 性烯酰基-CoA水合酶的氨基酸序列（GenBank登录号NP_746661，SEQIDN0:3)具有至少 70%的序列同一性（同源性）（例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或 100% )。参见图3。烯酰基-CoA水合酶还可以与枯草芽孢杆菌的（S)特异性烯酰基-CoA 水合酶的氨基酸序列（GenBank登录号CAA99573. 1，SEQIDN0:4)具有至少70%的序列同 一性（同源性）（例如，至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%)。
[0039] 例如，本文所述的2-羟酰基-CoA脱水酶可具有与由HadBC基因编码的艰难梭菌 2-羟酰基-CoA的氨基酸序列（见GenBank登录号AAV40819. 1和AAV40820. 1，分别是SEQID NO. 5和6)和由HadI编码的艰难梭菌起始子的氨基酸序列（GenBank登录号AAV40818. 1， 3￡〇10吣：7)至少70%的序列同一性（同源性）（例如至少75%、80%、85%、90%、95%、 97%、98%、99%、或100%)。他(18(：基因编码脱水酶的两个亚基。例如，本文所述的2-羟 酰基-CoA脱水酶可具有与由HgdAB基因编码的发酵氨基酸球菌的2-羟酰基-CoA脱水酶的 氨基酸序列（参见GenBank登录号CAA32465. 1和CAA32466. 1，分别为SEQIDNO:8和9) 和由HdgC编码的发酵氨基酸球菌的起始子的氨基酸序列（见GenBank登录号CAA42196. 1， 3￡〇10勵：10)至少70%的序列同一性（同源性）（例如至少75%、80%、85%、90%、95%、 97%、98%、99%、或100%)。取(^8基因编码脱水酶的两个亚基。参见图4。
[0040] 例如，本文所述的异戊酰基-CoA脱氢酶可具有与由liuA基因编码的铜绿假单胞 菌PA01异戊酰基-CoA脱氢酶的氨基酸序列（GenBank登录号AAG05403. 1，SEQIDN0:11) 至少70%的序列同一性（同源性）（例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、 99%、或 100% )。
[0041] 例如，本文所述的酰基CoA脱氢酶可具有与由acdH基因编码的除虫链霉菌的酰基 (：〇八脱氢酶的氨基酸序列（661^&吐登录号44044196.1，5￡0 10勵：12)至少70%的序列同 一性（同源性）（例如，至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、或100%)。参 见图5。
[0042] 两个氨基酸序列之间的百分比同一性（同源性）可如下确定。首先，使用来自含有 BLASTP版本2. 0. 14的BLASTZ单机版本的BLAST2序列（bl2seq)程序比对氨基酸序列。此 BLASTZ单机版本可获自Fish&Richardson的网站（例如，www.fr.com/blast/)或美国政府 的国家生物技术信息中心网站上（www.ncbi.nlm.nih.gov)。解释如何使用bl2seq程序的 说明书可以在BLASTZ附带的自述文件（readmefile)中找到。bl2seq使用BLASTP算法进 行两个氨基酸序列之间的比较。为了比较两个氨基酸序列，bl2seq的选项设置如下：将-i 设置为包含待比较的第一氨基酸序列的文件（例如，C:\seql.txt);将-j设置为包含待比 较的第二氨基酸序列的文件（例如，C:\seq2.txt);将-p设置为blastp;将-〇设置为任 何所需的文件名（如：C: \output.txt);并且所有其他选项保持其默认设置。例如，下面的 指令可以用来产生含有两个氨基酸序列之间的比较的输出文件：C:\B12Seq-ic:\seql. txt-jc:\seq2.txt-pblastp-〇c:\output.txt。如果所比较的两个序列共有同源性 (同一性），则指定的输出文件将以那些同源区域作为对齐的序列。如果比较的两个序列不 共享同源性（同一性），则指定的输出文件将不呈现对齐的序列。可以对核酸序列遵循类似 的规程，只是使用blastn。
[0043] -旦对齐，通过计算两个序列中呈现相同氨基酸残基的位置的数目确定匹配数。 百分比同一性（同源性）是通过以下来确定：将匹配数除以全长多肽氨基酸序列的长度，之 后将得到的值乘以1〇〇。应当指出，百分比同一性（同源性）的值被舍入到最接近的十分 之一。例如，78. 11、78. 12、78. 13 和 78. 14 向下四舍五入至 78. 1，而 78. 15、78. 16、78. 17、 78. 18和78. 19向上四舍五入至78. 2。还应注意，长度值总是整数。
[0044] 应当理解，许多核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是 本领域公知的；即，对于许多氨基酸，存在超过一个用作氨基酸密码子的核苷酸三联体。例 如，可以使用特定物种的合适的密码子偏倚表修饰给定酶的编码序列中的密码子，以便获 得在该物种（例如，细菌或真菌）中的最佳表达。
[0045] 本文所述的任意酶的功能性片段也可以用于本文件的方法中。如本文所用的术语 "功能片段"是指具有相应的成熟的全长野生型蛋白质的至少25% (例如，至少30%;40%; 50% ;60% ;70% ;75% ;80% ;85% ;90% ;95% ;98% ;99% ;100% ;或甚至大于 100% )的 活性的蛋白质的肽片段。功能片段通常可以但不总是由蛋白质的连续区域组成，其中该区 域具有功能活性。
[0046] 本文件还提供了⑴在本文件的方法中使用的酶的功能性变体和（ii)上述的功 能性片段的功能性变体。酶和功能性片段的功能性变体可以包含相对于相应的野生型序列 的添加、缺失或取代。具有取代的酶通常会具有不超过50 (例如，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、12、15、20、25、30、35、40或50)个氨基酸的取代（例如，保守取代）。这适用于本文所 述的任何酶和功能性片段。保守取代是用一个氨基酸取代具有相似特性的另一个。保守取 代包括下组中的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和 谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨 酸和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天 冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的（碱性）氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电荷 的（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。将上述极性，碱性或酸性组中的一个成员任意 取代成相同组的另一个成员可以认为是保守取代。与此相反，非保守取代是用一个氨基酸 取代具有不同特性的另一个。
[0047] 缺失变体可以缺少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12 个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸的区段（具有2个或更多个 氨基酸）或非连续的单个氨基酸。添加（添加变体）包括融合蛋白，其含有：(a)本文所述 的任意酶或其片段；及（b)内部或末端（C或N)无关的或异源的氨基酸序列。在这种融合蛋 白的背景下，术语"异源氨基酸序列"是不同于（a)的氨基酸序列。异源序列可以是例如用 于纯化重组蛋白的序列（例如，FLAG、多组氨酸（例如 六组氨酸）、凝聚素（hemagluttanin) (HA)、谷胱甘肽-S-转移酶（GST)或麦芽糖结合蛋白（MBP))。异源序列还可以是用作可检 测标记的蛋白质，例如，萤光素酶、绿色荧光蛋白（GFP)或氯霉素乙酰转移酶（CAT)。在一些 实施方案中，融合蛋白包含来自另一种蛋白质的信号序列。在某些宿主细胞（例如，酵母宿 主细胞）中，通过使用异源信号序列，可以增加靶蛋白的表达和/或分泌。在一些实施方案 中，融合蛋白可包含可用于例如引发免疫应答以生成抗体的载体（如KLH)或ER或高尔基 体保留信号。异源序列可以具有不同的长度，在某些情况下，可以是比异源序列所附接的全 长靶蛋白更长的序列。
[0048] 重组宿主可以天然地表达无一或一些（例如，一个以上、两个以上、三个以上、四 个以上、五个以上、或六个以上）本文所述途径的酶。还可以破坏重组宿主的内源性基因， 以防止不希望的代谢产物的形成或防止在该途径中通过作用于这些中间产物的其它酶导 致的中间产物的损失。重组宿主可以称为重组宿主细胞，改造的细胞（engineeredcell) 或改造的宿主。因此，如本文所述，重组宿主可以包括编码下列一种或多种的核酸：脱羧酶、 脱氢酶，水合酶，硫酯酶，辅酶A连接酶，或辅酶A转移酶，如下文更为详细描述的。
[0049] 例如，重组宿主可以包括外源核酸，其编码2-羟酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA 水合酶，或异戊酰基-CoA/酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶。此类宿主能产生异丁 烯并包括编码甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的核酸。宿主还可以包括（i) 2-羟基-酰基脱氢酶， (ii)CoA转移酶或CoA连接酶，和/或（iii)硫酯酶或CoA转移酶。在一些实施方式中，宿 主还可以包括（i)4-甲基-2-氧代-戊酸脱氢酶，（ii)吲哚丙酮酸脱羧酶，苯乙醛脱氢酶 和CoA连接酶和/或（iii)硫酯酶。
[0050] 当涉及核酸（或蛋白质）和宿主时，如本文所使用的术语"外源的"指的是这样的 核酸或由此类核酸编码的蛋白质，该核酸并不存在于天然发现该核酸的特定类型的细胞中 (并且不能获自该细胞）。因此，对于宿主来说，认为一旦在宿主中非天然存在的核酸是外 源的。重要的是，注意到非天然存在的核酸可以含有自然界中找到的核酸序列的核酸亚序 列或片段，只要核酸作为整体不存在于自然界中。例如，由于核酸分子作为一个整体（基因 组DNA加上载体DNA)在自然界中不存在，包含在表达载体内的基因组DNA序列的核酸分子 是非天然存在的核酸，因此一旦引入到宿主中，对于宿主细胞是外源的。因此，认为作为一 个整体并不存在于自然界中的任意载体、自主复制质粒或病毒（例如，逆转录病毒、腺病毒 或疱瘆病毒）是非天然存在的核酸。由此得出结论，通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生 的基因组DNA片段以及cDNA是非天然存在的核酸，这是因为它们作为自然界找不到的不同 分子存在。还得出结论含有在自然界中找不到的排列中的启动子序列和多肽编码序列（例 如，cDNA或基因组DNA)的任意核酸是非天然存在的核酸。对于特定的宿主微生物来说，天 然存在的核酸可能是外源的。例如，自酵母x的细胞分离的整条染色体在该染色体被导入 酵母y的细胞中后相对于酵母y的细胞而言是外源核酸。
[0051]与之相反，当涉及核酸（例如，基因）（或蛋白质）和宿主时，如本文所使用的术语 "内源的"指的是这样的核酸，该核酸的确存在于天然发现该核酸的特定的宿主中（并且能 获自该宿主）。此外，"内源性表达"核酸（或蛋白质）的细胞就像相同特定类型的宿主那 样表达该核酸（或蛋白质），就像其在自然界中被发现一样。此外，"内源性产生"核酸、蛋 白质或其他化合物的宿主就像相同特定类型的宿主那样表达该核酸，蛋白质或化合物，就 像其在自然界中被发现一样。
[0052] 此外，可以在体外使用本文所述的分离的酶，使用来自宿主微生物的裂解物（例 如，细胞裂解物）作为酶的来源，或使用来自不同宿主微生物的多种裂解物作为酶的来源 来进行异丁烯的生产。
[0053] 在一些实施方案中，通过分类在例如EC1. 3. 8. 4下的异戊酰基-CoA或酰 基-CoA脱氢酶（如liuA或acdH的基因产物）形成3-甲基-丁-2-烯酰基-CoA。来 自铜绿假单胞菌的liuA基因具有特异地针对异戊酰基-CoA的脱氢酶活性（参见，例如 Foster-Fromme和Jendrossek,FEMSMicrobiol.Lett.，2008, 286, 78 - 84)。来自除虫链霉 菌的acdH基因也具有针对异戊酰-CoA的脱氢酶活性（参见，例如，Zhang等人，Microbiol ogy, 1999, 145, 2323 - 2334) 〇
[0054] 在一些实施方案中，通过例如分类在EC4. 2. 1-下的2-羟酰基-CoA脱水酶（如 来自艰难梭菌的HadBC基因和其起始子HadI的产物（参见图4)或来自发酵氨基酸球菌 的HgdAB基因和其起始子HdgC的产物（参见图4))形成3-甲基-丁-2-烯酰基-CoA。 在一些实施方案中，2-羟酰基-CoA脱水酶是酶工程化的结果。从厌氧细菌分离的酶 2-羟酰基-CoA脱水酶具有在氨基酸降解途径中所采用的常见催化机制。例如，来自艰 难梭菌的HadBC/HadI的基因产物催化（R)_2_羟基异己酰基（hydroxylsocaproyl)-CoA 转化成isocaprenoyl-CoA。相似地，HgdAB/HdgC的基因产物催化2-轻戊二酰 基-CoA(2-hydroxyglutaryl-CoA)转化成戊稀二酰基-CoA(glutaconyl-CoA)(Kim等 人?，FEMSMicrobiol.Reviews, 2004, 28, 455 - 468)〇
[0055] 在一些实施方案中，通过例如分类在EC4. 2. 119下的R-特异性烯酰基-CoA水 合酶（如phaj或MaoC的基因产物）或例如分类在EC4. 2. 1. 17下的细菌（S)-特异性烯 酰基-CoA水合酶（如YsiB的基因产物）将3-羟基官能团引入到3-甲基-丁 -2-烯酰 基-CoA。在一些实施方案中，稀酰基-CoA水合酶是酶工程化的结果。在Galactomyces reessii的无细胞提取物中鉴定了用于将3-羟基官能团引入到3-甲基丁-2-烯酰 基-CoA(3-methylbuten-2-enoy1-CoA)的单个酶候选物，该无细胞提取物含有归类于 EC4. 2. 1. 17的烯酰基-CoA水合酶，其将3-甲基丁-2-烯酰基-CoA转化至3-羟基-3-甲 基丁酰基-CoA (Lee等人，Environ. Microbiol.，1997, 63 (11)，4191 - 4195)。到现在为止， 尚未鉴定来自细菌起源的等同烯酰基-CoA水合酶活性。
[0056] 在一些实施方案中，水合酶可以是酶工程化的结果，其使用phaj，EC4. 2. 1. 119和 EC4. 2. 1. 17的酶结构来告知合理的酶设计。
[0057] 在一些实施方案中（图1)，通过例如分类在EC1. 1. 1. 272、EC1. 1. 1. 345或EC 1. 1. 1. 28下的2-羟基-酰基脱氢酶将中心前体3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA，3-甲基-2-氧 代-丁酸酯转化成3-甲基-2-羟基-丁酸酯；之后通过例如分类在EC2. 8. 3.-下的CoA 转移酶（如GctAB的基因产物）或例如分类在EC6. 2. 1. 2下的CoA连接酶转化成3-甲 基-2-羟基丁酰基-CoA;之后通过2-羟基-酰基-CoA脱水酶（如HadBC和起始子HadI 或HgdAB和起始子HgdC的基因产物）转化成3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA;之后通过例如 分类在EC4. 2. 1. 119下（如phaj或MaoC的基因产物）或者例如分类在EC4. 2. 1. 17下 (如YsiB的基因产物）的烯酰基-CoA水合酶转化成3-甲基-3-羟基-丁酰基-CoA;之后 通过例如分类在EC3. 1. 2.-下（如tesAUesB或YciA的基因产物）的硫酯酶或例如分类 在EC2. 8. 3.-下的CoA转移酶（如GctAB的基因产物）转化成3-甲基-3羟基-丁酸酯； 之后通过例如分类在EC4. 1. 1. 33下的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化成异丁烯。通过YciA编 码的硫酯酶具有广泛的底物特异性，水解许多支链脂肪酸如异丁酰基-CoA、异戊酰基-CoA 以及 3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(Zhuang等人，Biochemistry, 2008, 47, 2789 - 2796)。
[0058] 在一些实施方案中，从丙酮酸合成3-甲基-2-氧代丁酸酯，其通过例如分类在 EC2. 2. 1. 6下的乙酰乳酸合酶（如ilvB或ilvN的基因产物）将丙酮酸转化为2-乙酰乳 酸；之后通过例如分类在EC1. 1. 1. 86下的二羟基异戊酸脱氢酶（如ilvC的基因产物）转 化成2, 3-二羟基异戊酸；之后通过例如分类在EC4. 2. 1. 9下的2, 3-二羟基异戊酸脱水酶 (如ilvD的基因产物）转化成3-甲基-2-氧代-丁酸酯。
[0059] 在一些实施方案中（图2)，通过例如分类在EC1.2. 1?-下（如pdhD，bfmBB，bfmBAA 和bfmBAB的基因产物），或分类在EC1. 2. 7. 7下的4-甲基-2-氧代-戊酸酯脱氢酶复合 体将中心前体3-甲基-2-丁-烯酰基-C〇A、4-甲基-2-氧代-戊酸酯转化为3-甲基丁 酸酯；之后通过例如分类在EC1. 3. 8. 4下的异戊酰基-CoA/酰基-CoA脱氢酶（如liuA或 acdH的基因产物）转化成3-甲基丁-2-烯酰基-CoA;之后通过例如分类在EC4. 2. 1. 119下 (如phaj或MaoC的基因产物）或分类在EC4.2. 1. 17下（如YsiB的基因产物）的（R)-特 异性烯酰基-CoA水合酶转化成3-甲基-3-羟基-丁酰基-CoA;之后通过例如分类在EC 3. 1. 2.-下的硫醋酶（如tesA、tesB或YciA的基因产物）转变成3-甲基-3羟基-丁酸 酯；之后通过分类EC4. 1. 1. 33下的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化成异丁烯。
[0060] 在一些实施方案中（图2)，通过例如分类在4. 1. 1. 74或EC4. 1. 1. 43下的吲哚 丙酮酸脱羧酶将3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA中心前体4-甲基-2-氧代-戊酸酯转化为 3-甲基正丁醛；之后通过例如分类在EC1. 2. 1. 5或EC1. 2. 1. 39下的苯乙醛脱氢酶（如padA 的基因产物）转化成3-甲基丁酸酯；之后通过例如分类在EC6. 2. 1. 2下的CoA连接酶转化 成3-甲基-丁酰基-CoA;之后通过例如分类在EC1. 3. 8. 4下的异戊酰基-CoA/酰基-CoA 脱氢酶（如liuA或acdH的基因产物）转化成3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA;之后通过例 如分类在EC4. 2. 1. 119下（如phaj或MaoC的基因产物）或例如分类在EC4. 2. 1. 17下 (如YsiB的基因产物）的（R)-特异性烯酰基-CoA水合酶转化成3-甲基-3-羟基-丁酰 基-CoA;之后通过例如分类在EC3. 1. 2.-下的硫酯酶（如tesA、tesB或YciA的基因产 物）转变成3-甲基-3-羟基-丁酸酯；之后通过分类在EC4. 1. 1. 33下的甲羟戊酸二磷酸 脱羧酶转化成异丁烯。
[0061] 在一些实施方案中，将编码图1或2中描述的途径的酶的核酸引入宿主微生物，其 是原核生物或真核生物。
[0062] 在一些实施方案中，宿主微生物是原核生物，其来自埃希氏菌属如大肠杆菌；梭菌 属，如扬氏梭菌，自产乙醇梭菌或克氏梭菌；棒杆菌属，如谷氨酸棒杆菌；贪铜菌属如钩虫 贪铜菌或耐金属贪铜菌；假单胞菌属如荧光假单胞菌，恶臭假单胞菌或食油假单胞菌；食 酸代尔夫特菌属，芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌；乳杆菌属如德氏乳杆菌；乳球菌属，例如 乳酸乳球菌或红球菌属如马红球菌。
[0063] 在一些实施方案中，宿主微生物是真核生物，其来自下组：曲霉属，例如黑曲 霉；酵母属如酿酒酵母；毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母；耶氏酵母属，如解脂耶氏酵母； 伊萨酵母属如东方伊萨酵母；德巴利酵母属如汉逊德巴利酵母；Arxula属如Arxula adenoinivorans;克鲁维酵母属，例如乳酸克鲁维酵母。
[0064] 在一些实施方案中，在重组宿主中使用发酵策略生物合成异丁烯，该发酵策略可 以包括厌氧、微需氧或需氧培养重组宿主。
[0065] 在一些实施方案中，在营养物限制条件下在重组宿主中生物合成异丁烯，所述营 养物限制条件如氮、磷酸盐或氧限制。
[0066] 在一些实施方案中，在重组宿主中使用发酵策略生物合成异丁烯，该发酵策略使 用氧的备选最终电子受体如硝酸盐。
[0067] 在一些实施方案中，在异丁烯合成中，可以采用使用例如陶瓷中空纤维膜的细胞 保留策略来实现并维持补料分批或连续发酵期间的高细胞密度。
[0068] 在一些实施方案中，生物给料可以是，可以包括或可以来源于单糖、 二糖、木质纤 维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸、甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩 的蒸馏器可溶物或城市废物。
[0069] 在几种微生物中已经证明有效分解代谢从生化柴油的生产中得到的粗制甘油， 该微生物如大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食油假单胞菌、恶臭假单胞菌和解脂耶氏酵母（Lee等 人，Appl.Biochem.Biotechnol.，2012, 166, 1801 - 1813;Yang等人，Biotechnologyfor Biofuels, 2012, 5:13;Meijnen等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2011，90, 885-893) 〇
[0070] 在通过前体丙酰基-CoA进行的3-羟基戊酸酯的合成中，已经证明几种微生物有 效分解代谢木质纤维素衍生的乙酰丙酸，该微生物如钩虫贪铜菌和恶臭假单胞菌（Jaremko 和Yu,JournalofBiotechnology, 2011，155, 2011，293 - 298;Martin和Prather,Journal ofBiotechnology, 2009, 139, 61 - 67)〇
[0071] 已经证明几种微生物如恶臭假单胞菌、钩虫贪铜菌有效分解代谢木质 素衍生的芳香族化合物如苯甲酸醋类似物（Bugg等人，CurrentOpinionin Biotechnology, 2011，22, 394 - 400 ;P6rez_Pantoja等人，FEMSMicrobiol. Rev.，2008, 32, 736 - 794)。
[0072] 已经证明几种微生物（包括解脂耶氏酵母）有效利用农业废物，如橄榄磨坊废水 (Papanikolaou等人，Bioresour.Technol.，2008, 99 (7)，2419-2428) 〇
[0073] 已经证明几种微生物有效利用可发酵糖如来自纤维素、半纤维素、甘 蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其他农业来源的单糖和二糖，该微生物如大肠杆 菌、谷氨酸棒杆菌、和德氏乳杆菌和乳酸乳球菌（参见、例如e.g.，Hermannet al，JournalofBiotechnology,2003， 104， 155-172;Wee等人，FoodTechnol. Biotechnol.，2006, 44 (2)，163 - 172 ;0hashi等人，JournalofBioscienceandBioengi neering, 1999, 87(5), 647-654) 〇
[0074] 已经证明钩虫贪铜菌有效利用来源于多种农业木质纤维素源的糠醛（Li等人，Bi odegradation, 2011, 22, 1215 - 1225) 〇
[0075] 在一些实施方案中，非生物给料可以是或来源于天然气、合成气、C02/H2、甲醇、乙 醇或来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物（NVR)或碱洗废物流。
[0076] 已经证明甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris)有效分解代谢甲 醇。
[0077] 已经证明克氏梭菌有效分解代谢乙醇（Seedorf等人，？1~〇(3.似1:1.六〇3(1.3(3；[. USA, 2008, 105(6)2128-2133)。
[0078] 已经证明钩虫贪铜菌有效分解代谢0)2和H2，它们可以来源于天然气以及其它化 学和石油化学来源（Prybylski等人，Energy,SustainabilityandSociety, 2012, 2:11)。
[0079] 已经证明多种微生物，如扬氏梭菌和自产乙醇梭菌有效分解代谢合成气（Kdpke 等人，AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 2011，77 (15)，5467 - 5475) 〇
[0080] 已经证明多种微生物，如食酸代尔夫特菌和钩虫贪铜菌有效分解代谢来自环己 烧过程的非挥发性残留物蒸汽（Ramsay等人，AppliedandEnvironmentalMicrobiolo gy，1986, 52(1)，152 - 156)。
[0081] 在一些实施方案中，提供了重组宿主微生物的基本上纯的培养物。如本文使用的， 重组宿主微生物的"基本上纯的培养物"是这样的微生物的培养物，其中在培养物中活细胞 的总数中少于约 40% (即，小于约 35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2%、1%、0. 5%、 0.25%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%或甚至更少）是不同于重组微生物的活细胞，例 如，细菌、真菌（包括酵母）、支原体或原生动物细胞。在上下文中术语"约"意指相关百分 比可以是高于或低于规定百分比的15%规定百分比。因此，例如，约20%可以是17%至 23%。重组微生物的这种培养物包括细胞和生长培养基，贮存培养基或转运培养基。培养 基可以是液体、半固体（例如，凝胶状培养基）或冻结的。培养物包括在液体培养基中或在 半固体培养基中/上生长的细胞或正在贮存或转运培养基（包括冷藏贮存或转运培养基） 中贮存或转运。培养物是在培养容器或贮存容器或基质（例如，培养皿、烧瓶、或管或贮存 管形瓶或管）中。
[0082] 代谢工程
[0083] 本文件提供这样的方法，其涉及少于全部的对所有上述途径描述的步骤。例如，此 种方法可以涉及此种步骤中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或 更多个步骤。在此种方法中包括少于全部步骤的情况中，第一步可以是所列的步骤中的任 何一个。
[0084] 此外，本文中所述的重组宿主可以包括上述酶的任何组合，使得可以在重组宿主 中进行此种步骤中的一个或多个，例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多个此类步 骤。
[0085] 此外，本文件认识到，在已经将酶描述为接受CoA活化的底物的情况中，存在与 [acp]结合底物相关的类似酶活性，其不一定在相同的酶类中。
[0086] 并且，本文件认识到，在已经将酶描述为接受底物的（R)-对映体的情况中，存在 与（S-对映体底物相关的类似酶活性，其不一定在相同的酶类中。
[0087] 该文件还认识到，在酶显示接受特定辅因子（如NADPH)或共底物（如乙酰 基-CoA)的情况中，许多酶在催化特定酶活性中就多种不同的辅因子或共底物而言是混杂 的。此外，本文件认识到在酶具有针对例如特定辅因子（如NADH)的高度特异性的情况中， 对辅因子NADPH具有高度特异性的具有相似或相同活性的酶可以是不同的酶类。
[0088] 在一些实施方案中，在本文中概述的途径中的酶可以是酶工程化的结果，其通过 非直接的或合理的酶设计方法以实现改进活性、提高特异性、减少反馈抑制、减少抑制、改 进酶溶解度、改变立体特异性或改变辅因子特异性为目标。
[0089] 在一些实施方案中，通过附加体或染色体整合的方法可以将本文中概述的途径中 的酶剂量分量（genedose)(即过表达）到得到的遗传修饰生物体中。
[0090] 在一些实施方案中，可以将基因组规模系统生物学技术如通量平衡分析（Flux BalanceAnalysis)用于设计用于将碳通量指向异丁烯的基因组规模弱化或敲除策略。
[0091] 弱化策略包括但不限于使用转座子，同源重组（双交换的方法），诱变，酶抑制剂 和RNAi干扰。
[0092]在一些实施方案中，可以将通量组学（fluxomic)、代谢组学（metabolomic)和转 录物组学数据（transcriptomaldata)用于告知或支持基因组规模系统生物学技术，从而 在将碳通量指向异丁烯中设计基因组规模弱化或敲除策略。
[0093] 在使用自然积累聚羟基脂肪酸酯的宿主的一些实施方案中，在宿主菌株中可弱化 酶聚合物合成酶。
[0094] 在需要乙酰基-CoA的胞内利用度合成异丁烯的一些实施方案中，可使用乙 酸合成途径中的一种或多种酶缺陷（例如活性的弱化水平）的宿主。例如，可以使 用磷酸转乙酰酶（由pta基因编码）缺陷的宿主（Shen等人，Appl.Environ.Microb io. , 2011, 77(9), 2905 - 2915) 〇
[0095] 在需要乙酰基-CoA或丙酮酸的胞内利用度合成异丁烯的一些实施方案中，可弱 化将丙酮酸降解成乳酸的酶（如ldhA的基因产物）（Shen等人，Appl.Environ.Microbi ol.，2011，77(9)，2905-2915)。
[0096] 在需要丙酮酸的胞内利用度合成异丁烯的一些实施方案中，可弱化将磷烯醇式丙 酮酸（phophoenolpyruvate)降解成琥泊酸的酶，如frdBC的基因产物（参见，例如，Shen 等人，2011，同上）。
[0097] 在需要丙酮酸的胞内利用度合成异丁烯的一些实施方案中，可弱化将乙酰基-CoA 降解成乙醇的酶，如adhE的基因产物（Shen等人，2011，同上）。
[0098] 在一些实施方案中，其中途径在异丁烯的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以 在宿主生物中过表达编码吡啶核苷酸转氢酶（puridinenucleotidetranshydrogenase) 的基因如UdhA(Brigham等人，AdvancedBiofuelsandBioproducts，2012，Chapter 39, 1065-1090)。
[0099] 在一些实施方案中，其中途径在异丁烯的合成中途径需要过量的NADPH辅因子， 可以在宿主生物中过表达编码甘油醛-3P-脱氢酶基因如GapN(Brigham等人，2012，同 上）。
[0100] 在一些实施方案中，其中途径在异丁烯的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以 在宿主生物中过表达苹果酸酶基因如maeA或maeB(Brigham等人，2012，同上）。
[0101] 在一些实施方案中，其中途径在异丁烯的合成中需要过量的NADPH辅因子， 可以在宿主生物中过表达葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶基因如zwf(Lim等人，Journalof BioscienceandBioengineering, 2002, 93(6), 543-549)〇
[0102] 在一些实施方案中，其中途径在异丁烯的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以 在宿主生物中过表达果糖1，6二磷酸酶基因如fbp(Becker等人，JournalofBiotechnol ogy，2007, 132, 99-109)。
[0103] 在一些实施方案中，可以在宿主中过表达分类在例如EC2. 2. 1.6下的乙酰乳酸合 酶的反馈抑制抗性的突变体，如ilvB和/或ilvN的突变体，其通过支链氨基酸抗反馈抑 制。
[0104] 在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶可以在启动子下表达，该启动子不受支链氨基 酸（例如，缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸）的遗传抑制。
[0105] 在一些实施方案中，弱化由ilvE编码的支链氨基酸转氨酶。
[0106] 在一些实施方案中，可以通过对细胞膜的遗传工程结构修饰或增加异丁烯的任何 相关转运蛋白的活性增强或放大异丁烯穿过细胞膜至胞外介质的流量。
[0107] 使用重组宿主生产异丁烯
[0108] 通常，通过提供宿主微生物并用含有如上所述的合适碳源的培养基培养所提 供的微生物产生异丁烯。在一般情况下，培养基和/或培养条件可以使得微生物生长 到足够的密度并有效地生产异丁烯。对于大规模的生产过程，可以使用任何方法，如在 别处描述的那些方法（ManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology, 2nd Edition,Editors:A.L.DemainandJ.E.Davies,ASMPress； 和Principlesof FermentationTechnology,P.F.StanburyandA.Whitaker,Pergamon) 〇 简而言之，用特定 微生物接种含有合适的培养基的大罐（例如，100加仑、200加仑500加仑或更大的罐）。接 种后，培养微生物以允许产生生物质。一旦达到所期望的生物量，可以将含有微生物的培养 基转移到第二个罐。此第二个罐可以是任何大小。例如，第二个罐可以是更大、更小或与第 一种罐大小相同。通常，第二个罐比第一个罐大，使得可以将额外的培养基添加到来自第一 种罐的培养基中。此外，第二个罐中的培养基可以与第一种罐中使用的培养基相同或不同。
[0109] 一旦转移，可以温育微生物，以允许产生异丁烯。一旦产生，可以使用任何方法来 分离异丁烯。例如，由于异丁烯的沸点为-6. 9°C，可以以挥发性产物的形式从发酵罐的废气 流中回收异丁烯。在通常大约30°C的发酵温度时，异丁烯从培养基中汽化出来，以穿过培养 基的气体流速剥离以从废气回收。可以将异丁烯选择性地吸附到例如吸附剂上并且与其他 废气组分分离。也可以采用膜分离技术将异丁烯与其它废气化合物分离。可以使用例如氮 气使异丁烯 从吸附剂上解吸并且使异丁烯在低温和高压下冷凝。 实施例
[0110] 接受3-甲基-3-羟基丁酰基-CoA作为底物的R-特异性烯酰基-CoA水合酶的酶 活性
[0111] 将来自斑点气单胞菌（Aeromonaspunctata)的C-末端His-标记的phaj基因克 隆到pE23a表达载体中在17启动子下，该phaj基因编码（R)特异性烯酰基-CoA水合酶 (SEQIDN0:2,参见图3)。将表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。在30°C下，在 含有100mL的LuriaBroth培养基的1L摇瓶中在以200rpm振荡的情况下培养得到的重组 大肠杆菌菌株。用ImMIPTG诱导培养物2小时。
[0112] 通过离心收获来自每一经诱导的摇瓶培养物的沉淀物。将每一沉淀物重悬于20mM HEPES(pH值=7. 2[-])、lmM的PMSF和29个单位benzonase中，并通过超声处理裂解。通 过离心分开细胞碎片与上清液，并用0. 2ym过滤器过滤。使用Ni亲和层析从上清液纯化 phaj酶并浓缩至1. 25mg/mL。
[0113] 在30°C，在缓冲液中进行了正向（水合）方向上的天然酶活性测定，该缓冲液由 10mM乙酸按（pH值=8)和ImM的巴豆酰基-CoA(也称为2-丁稀酰基-CoA) (Sigma-Aldrich 公司）组成。通过将0.4yM纯化的烯酰基-CoA水合酶加入到含有底物的测定缓冲液中起 始酶活性测定。在30°C通过分光光度法在263nm证实烯酰基-CoA水合酶接受巴豆酰-CoA 作为底物。如通过分光光度法在263nm测定的，仅底物对照显示巴豆酰基-CoA的最小自发 水合。参见图6。
[0114] 在缓冲液中进行了反向（脱水）方向上的天然酶活性测定，该缓冲液由10mM乙 酸铵（pH值=8)和ImM的外消旋3-羟基丁酰基-CoA组成。通过将5yM纯化的烯酰 基-CoA水合酶加入到含有底物的测定缓冲液中起始酶活性测定并且在30°C温育1小时。 通过LC-MS证实烯酰基-CoA水合酶接受3-羟基丁酰基-CoA作为底物。仅底物对照显示 3_羟基丁酰基-CoA的可忽略的自发脱水。如之前证实的（Lan和Liao,Proc.Natl.Acad. Sci.USA, 2012, 109 (16)，6018 - 6023)，尽管有利于正向（水合）方向，由phaj编码的烯酰 基-CoA水合酶是可逆的。参见图7。
[0115] 在缓冲液中进行了反向（脱水）方向上的非天然酶活性测定，该缓冲液由10mM乙 酸铵（pH值=8)和ImM的3-甲基-3-羟基丁酰基-CoA组成。通过将5yM纯化的烯酰 基-CoA水合酶加入到含有底物的测定缓冲液中起始酶活性测定并且在30°C温育1小时。 通过LC-MS证实phaj编码的酶接受3-甲基-3-羟基丁酰基-CoA作为底物。仅底物对照 显示3-甲基-3-羟基丁酰基-CoA无自发脱水。参见图8。
[0116] 来自斑点气单胞菌的phaj编码的烯酰基-CoA水合酶在脱水方向上接受3-甲 基-3-羟基丁酰基-CoA作为底物。考虑到酶反应的可逆性和有利的水合方向，来自斑点气 单胞菌的phaj编码的烯酰基-CoA水合酶接受3-甲基-丁基-2-烯酰基-CoA作为底物。
[0117] 其他实施方案
[0118] 应该理解的是，虽然本发明结合其详细描述进行了描述，但前面的描述意在说明 而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书限定。其他方面，优点和修改 落入所附权利要求书的范围之内。
【主权项】
1. 一种用于合成异丁烯的方法，所述方法包括（i)使3-甲基-2-羟基-丁酰基-CoA 脱水并使3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA水合，并且将得到的产物转化成异丁烯。2. 根据权利要求1的方法，其中2-羟酰基-CoA脱水酶使3-甲基-2-羟基-丁酰 基-CoA脱水。3. 权利要求2的方法，其中所述2-羟酰基-CoA脱水酶由基因产物HadI和HadBC编码 或者由基因产物HgdC和HgdAB编码。4. 权利要求2或3中任一项的方法，其中所述2-羟酰基-CoA脱水酶与SEQIDNO. 5 和6中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性，或者与SEQIDNO. 8和9中给出的 氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中（R)特异性烯酰基-CoA水合酶或（S)特异性烯 酰基-CoA水合酶使3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA水合。6. 权利要求5的方法，其中所述（R)特异性烯酰基-CoA水合酶与在SEQIDNO. 1-3中 给出的氨基酸序列的任一种具有至少70%的序列同一性。7. 权利要求5的方法，其中所述（S)特异性烯酰基-CoA水合酶与在SEQIDNO. 4中给 出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。8. -种用于合成异丁烯的方法，所述方法包括使3-甲基-丁酰基-CoA脱氢并使3-甲 基-丁 -2-烯酰基-CoA水合，并且将得到的产物转化成异丁烯。9. 权利要求8的方法，其中异戊酰基-CoA或酰基-CoA脱氢酶使3-甲基-丁酰基-CoA 脱氢。10. 权利要求9的方法，其中所述异戊酰基-CoA或酰基-CoA脱氢酶与SEQIDNO. 11 或12中给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。11. 权利要求8-10中任一项的方法，其中（R)特异性烯酰基-CoA水合酶或⑶特异性 烯酰基-CoA水合酶使3-甲基-丁 -2-烯酰基-CoA水合。12. 权利要求11的方法，其中所述（R)特异性烯酰基-CoA水合酶与在SEQIDNO. 1-3 中给出的氨基酸序列的任一种具有至少70%的序列同一性。13. 权利要求11的方法，其中所述（S)特异性烯酰基-CoA水合酶与在SEQIDNO. 4中 给出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。14. 前述权利要求中任一项的方法，其中使用分离的酶进行所述方法。15. 前述权利要求中任一项的方法，其中使用包含所述酶的细胞裂解物进行所述方法。16. 前述权利要求中任一项的方法，其中在重组宿主中进行所述方法。17. 权利要求16的方法，其中所述宿主是原核生物或真核生物。18. 根据权利要求17的方法，其中所述原核宿主来自埃希氏菌属（Escherichia)如 大肠杆菌（Escherichiacoli);来自梭菌属（Clostridia)，如扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)，自产乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)或克氏梭菌（Clostridium kluyveri);来自棒杆菌属（Corynebacteria)，如谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum);来自贪铜菌属（Cupriavidus)如钩虫贪铜菌（Cupriavidusnecator)或耐金 属贪铜菌（Cupriavidusmetallidurans);来自假单胞菌属如焚光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)，恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)或食油假单胞菌（Pseudomonas oleavorans);来自食酸代尔夫特菌属（Delftiaacidovorans)，来自芽孢杆菌属，如 枯草芽抱杆菌（Bacillussubtillis);来自乳杆菌属如德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii);来自乳球菌属，例如乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)或来自红球菌属 (Rhodococcus)如马红球菌（Rhodococcusequi)。19. 根据权利要求17的方法，其中所述真核宿主来自曲霉属如黑曲霉（Aspergillus niger);来自酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae);来自毕赤酵母属如巴斯德 毕赤酵母（Pichiapastoris);来自耶氏酵母属，如解脂耶氏酵母（YarrowiaIipolytica) 或来自伊萨酵母（Issathenkia)属如东方伊萨酵母（Issathenkiaorientalis)或来自德 巴利酵母（Debaryomyces)属如汉逊德巴利酵母（Debaryomyceshansenii)，或来自Arxula 属如Arxulaadenoinivorans或来自克鲁维酵母属（Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵 母（Kluyveromyceslactis)20. 根据权利要求16-19中任一项的方法，其中发酵策略需要厌氧、微需氧或需氧培 养。21. 根据权利要求16-20中任一项的方法，其中发酵策略需要营养物限制，如氮、磷酸 盐或氧限制。22. 根据权利要求16-21中任一项的方法，其中利用使用陶瓷中空纤维膜的细胞保留 策略来实现并维持发酵期间的高细胞密度。23. 根据权利要求16-22中任一项的方法，其中给发酵装置补料的主要碳源来源于生 物给料或非生物给料。24. 根据权利要求23的方法，其中所述生物给料是或来源于单糖、二糖、木质纤维素、 半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸（levulinicacid)和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农 业废物、浓缩的蒸馏器可溶物（condenseddistillers'soluble)或城市废物。25. 根据权利要求23的方法，其中所述非生物给料是或来源于天然气、合成气、CO2/H2、 甲醇、乙醇、或来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物（NVR)或碱洗废物流。26. -种包含编码2-羟酰基-CoA脱水酶和烯酰基-CoA水合酶的外源核酸的重组宿 主，所述宿主产生异丁烯。27. 权利要求26的宿主，所述宿主进一步包含甲轻戊酸二磷酸脱羧酶（mevalonate diphosphatedecarboxylase)〇28. 权利要求26或权利要求27的宿主，所述宿主进一步包含（i) 2-羟酰基脱氢酶， (ii)CoA转移酶或CoA连接酶，以及（iii)硫酯酶。29. -种包含编码异戊酰基-CoA/酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶的外源核酸 的重组宿主，所述宿主产生异丁烯。30. 权利要求29的宿主，所述宿主进一步包含甲羟戊酸二磷酸脱羧酶。31. 权利要求29或权利要求30的宿主，所述宿主进一步包含4-甲基-2-氧代-戊酸 脱氢酶复合体和硫酯酶。32. 权利要求28-31中任一项的宿主，所述宿主进一步包含吲哚丙酮酸脱羧酶 (indolepyruvatedecarboxylase)、苯乙酸脱氛酶（phenylacetaldehydedehydrogenase) 和CoA连接酶。33. 权利要求26-32中任一项的宿主，其中所述烯酰基-CoA水合酶是与SEQIDNO: 1-3 所示的氨基酸序列中的任一种具有至少70 %序列同一性的（R)-特异性烯酰基-CoA水合 酶。34. 权利要求26-32中任一项的宿主，其中所述烯酰基-CoA水合酶是与SEQIDNO:4 所示的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的（S)-特异性烯酰基-CoA水合酶。35. 权利要求26-34中任一项的宿主，其中所述宿主天然积累聚羟基脂肪酸酯 (polyhydroxyalkanoate)，并且包含弱化的酶聚合物合酶（polymersynthase)。36. 权利要求26-35中任一项的宿主，其中所述宿主进一步包含下列弱化的酶中的一 种或多种：磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、将丙酮酸降解成乳酸的酶、将磷酸烯醇式丙酮酸降解 成琥珀酸的酶、将乙酰基-CoA降解成乙醇的酶、或最终支链氨基酸转氨酶。37. 权利要求26-36中任一项的宿主，其中所述宿主进一步过表达以下基因中的一个 或多个，所述基因编码：吡啶核苷酸转氢酶（puridinenucleotidetranshydrogenase)、甘 油酸 _3P_ 脱氛酶（glyceraldehyde-3P_dehydrogenase)、苹果酸酶（malicenzyme)、葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶、果糖1，6二磷酸酶或乙酰乳酸合酶（acetolactatesynthase)的反馈 抑制抗性突变体，其中所述乙酰乳酸合酶对支链氨基酸的反馈抑制有抗性。38. 权利要求37的宿主，其中编码所述乙酰乳酸合酶的基因是使用不受分支氨基酸遗 传阻遏的启动子表达的。39. 权利要求26-32中任一项的宿主，其中异丁烯穿过细胞膜的流出通过细胞膜的遗 传工程而增强或放大或者随用于异丁烯的相关转运蛋白活性而增加。
【专利摘要】本文件提供了使用一种或多种分离的酶如烯酰基-CoA脱水酶、2-羟酰基-CoA脱水酶、异戊酰基-CoA/酰基-CoA脱氢酶和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶中的一种或多种，或使用表达一种或多种此类酶的重组宿主细胞生物合成异丁烯的方法。
【IPC分类】C12P5/02, C07C11/09
【公开号】CN104903455
【申请号】CN201380061760
【发明人】A.L.博泰斯, A.V.E.康拉迪
【申请人】英威达技术有限责任公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月27日
【公告号】EP2925871A1, US20140186913, WO2014085612A1
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