3-差向异构酶的制作方法
3-差向异构酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白，以及一种编码所述蛋白的 核酸分子。本发明还涉及一种载体和一种含所述核酸分子的宿主细胞。本发明还涉及一种 用所述蛋白合成阿洛酮糖的方法，以及按这种方式制造的阿洛酮糖。
【背景技术】
[0002] 阿洛酮糖是一种"零热量"甜味剂，并有认为与葡萄糖类似的甜度。其还具有类似 于其他醣类的填充和褐变属性。阿洛酮糖的主要目标市场是食品和饮料制造商，在其产品 中，目前所用为葡萄糖、果糖或高果糖浆，而且正寻求显著减少热量却不显著改变糖成分所 赋予的其他属性，如：填充作用、褐变、质地和甜度。
[0003] 在美国，阿洛酮糖并非通常认为是安全（GRAS)的物质，但目前有一项待定的GRAS 通知（GRN400)。阿洛酮糖存在于加工甘蔗和甜菜糖蜜、经蒸汽处理的咖啡、小麦植物产品 和高果糖玉米糖浆。阿洛酮糖的典型日总摄入量估计为每天0.2克以上。D-阿洛酮糖是 D-果糖的C-3差向异构体，而阿洛酮糖和果糖结构的差异使得阿洛酮糖不能被人体代谢， 因而其热量为零。由于阿洛酮糖不含热量，因此，认为其是一种有前途的候选甜味填充剂， 而且，据称在具有甜味的同时还能保持与典型单糖相似的性质。
[0004] 酮糖-3-差向异构酶可使果糖和阿洛酮糖互相转化。号为8030035的美国专利和 公布号为W02011/040708的PCT公开了可将来自农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)并 具阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白与D-果糖反应，从而制造D-阿洛酮糖（阿洛酮糖 的另一名称）。
[0005][0006] 号为100832339的韩国专利公开了一种中华根瘤菌（Sinorhizobium)YB-58菌株， 该菌株能够将果糖转化成阿洛酮糖，并公开了一种用中华根瘤菌YB-58菌株的真菌体制造 阿洛酮糖的方法。
[0007] 号为1020090098938的韩国专利申请公开了一种用大肠杆菌制造阿洛酮糖的方 法，其中，大肠杆菌是表达一种编码阿洛酮糖-3异构酶的多核苷酸。
[0008] 本发明的目的是改进阿洛酮糖的现有制备技术。本发明的目的是提供一种酮 糖-3-差向异构酶，其在全细胞系统中的转化率和体积产率高于之前报导的。
【发明内容】
[0009] 本发明源于对三种酮糖-3-差向异构酶的鉴别及表征，其示例性氨基酸序列分别 示于编号2、4和6的序列。可用该酮糖-3-差向异构酶将果糖转化成阿洛酮糖。之前已将 这些蛋白确定为假想蛋白，或确定为具有塔格糖异构酶活性。然而，本发明人现惊奇地发现 这些酶有阿洛酮糖-3-差向异构酶活性。
[0010] 本发明的第一方面提供一种含多肽序列的蛋白，该序列与编号2的序列、编号4的 序列或编号6的序列有至少70%的序列同一性，其特征在于，所述蛋白具有酮糖-3-差向异 构酶活性。
[0011] 方便而言，该多肽序列与编号2的序列，编号4的序列或编号6的序列有至少 80%、90%、95%或99%的序列同一性，或有100%的序列同一性。
[0012] 优选地，该多肽序列含编号13的序列。
[0013] 优选地，该蛋白固定于固体基质。
[0014] 本发明的第二方面提供一种本发明第一方面的蛋白用于合成阿洛酮糖的用途。
[0015] 本发明的第三方面提供一种核酸分子，该核酸分子包含编码本发明第一方面所述 蛋白的多核苷酸序列。
[0016] 优选地，该核酸分子包含多核苷酸序列，其中：
[0017] i)该多核苷酸序列与编号5、编号1或编号3的序列有至少70%、80%、90%、95% 或99%的序列同一性，或是100%的序列同一性；或
[0018] ii)该多核苷酸序列在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有 与编号5、编号1或编号3所不序列互补的序列。
[0019] 本发明的第四方面提供一种载体，其特征在于载体包含本发明第三方面所述的核 酸分子。
[0020] 本发明的第五方面提供一种宿主细胞，其特征在于宿主细胞包含本发明第三方面 所述的重组核酸分子。
[0021] 方便而言，该宿主细胞是一种酵母、细菌或其他微生物，或一种哺乳动物、植物或 其他细胞的培养物。
[0022] 优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。
[0023] 本发明的第六方面提供一种由本发明第一方面所述蛋白制造的阿洛酮糖。
[0024] 本发明的第七方面提供一种制造阿洛酮糖的方法，包括：
[0025] i)提供本发明第一方面所述的蛋白；并
[0026] ii)在可将果糖基质转化为阿洛酮糖的条件下将蛋白与果糖基质接触。本发明亦 提供一种制造阿洛酮糖的方法，所述方法包括：在可将果糖基质转化为阿洛酮糖的条件下， 将本发明第一方面所述蛋白与果糖基质接触。
[0027] 优选地，所述蛋白存在于宿主细胞中。
[0028] 可选地，该蛋白呈分离形式。
[0029] 为方便起见，这些条件包括将蛋白与果糖基质保持在25°C至75°C之间，优选保持 在50°C至60°C之间，更优选保持在52°C至55°C之间，更优选为55°C。
[0030] 优选地，所述条件包括将蛋白和果糖基质保持在pH4至pH10之间。
[0031] 优选地，所述条件包括将果糖基质浓度保持在75%至95% (W/V)之间。
[0032] 本发明的第八方面提供一种含多核苷酸序列的核酸分子，其中：
[0033] i)所述多核苷酸序列与编号5、编号1或编号3的序列有至少70%的序列同一,性； 或
[0034]ii)所述多核苷酸序列在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，其具有与编号 5、编号1或编号3所示序列互补的序列。
[0035] 该核酸分子编码一种具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽。如本发明的一方面所 述，该核酸分子可呈分离形式。
[0036] 本发明的第九方面提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含重组核酸分子，所述核酸 分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽，其 中该多核苷酸序列的特征在于：
[0037] i)与编号5、编号1或编号3的序列有至少70%的序列同一性；或
[0038] ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1 或编号3所示序列互补的序列。
[0039] 本发明的第十方面提供一种载体，所述载体包含核酸分子，所述核酸分子包含多 核苷酸，所述多核苷酸编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽，其中该多核苷酸序列的 特征在于：
[0040] i)与编号5、编号1或编号3的序列有至少70%的序列同一,性；或
[0041] ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，所述多核苷酸具有与编号5、编号 1或编号3所示序列互补的序列。
[0042] 本发明的第十一方面提供一种制备阿洛酮糖的方法，该方法包括下列步骤：
[0043] i)提供一种包含核酸分子的载体，所述核酸分子具有多核苷酸序列，所述多核苷 酸序列编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白，其中该多核苷酸序列的特征在于：a)与 编号5、编号1或编号3的序列有至少70%的序列同一性，或b)在高度严谨条件下杂交得 到一种多核苷酸，所述多核苷酸具有与编号5、编号1或编号3所示序列互补的序列；
[0044] ii)合成具有酮糖-3-差向异构酶活性并被多核苷酸序列编码的蛋白；
[0045] iii)将果糖与具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白接触，并将果糖和蛋白保持在 可将果糖转化成阿洛酮糖的条件下；并
[0046] iv)至少对步骤iii)制造的阿洛酮糖进行部分纯化。
[0047] 在本文中，术语"多肽"、"肽"和"蛋白"可互换使用，用以指代氨基酸残基聚合物。 这些术语亦适用于一个或多个氨基酸残基经修饰或残基非天然存在的氨基酸聚合物，例如 天然存在氨基酸及天然存在氨基酸酸聚合物的相应人工化学模拟物。多肽未必呈"分离"形 式，即未必处于天然存在时其周围组分之外。
[0048] 本文所用术语"氨基酸"指天然存在和合成的氨基酸，以及具有与天然存在的氨基 酸功能类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸指由遗传密码编码的氨基 酸，以及在细胞中翻译后经修饰的氨基酸（例如：羟基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、0-磷酸丝氨 酸）。短语"氨基酸类似物"指与天然存在的氨基酸基本化学结构U碳与氢、羧基、氨基、 R基团结合）相同，但有一个经修饰的R基团或经修饰的骨干（如丝氨酸、亮氨酸、蛋氨酸亚 砜、蛋氨酸甲基锍）的化合物。短语"氨基酸模拟物"指一类与天然存在的氨基酸结构不同 但有类似功能的化合物。应当理解为：由于遗传密码的简并性，编码特定多肽的核酸分子可 能会具有一系列多核苷酸序列。例如：密码子GCA、GCC、GCG和GCT都编码丙氨酸这种氨基 酸。
[0049]使用BLASTP算法第 2.2.2 版（Altschul，StephenF.，ThomasL.Madden，AlejandroA.Schaffer,JinghuiZhang，ZhengZhang，WebbMiller，andDavid J.Lipman(1997)， "GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofprotein databasesearchprograms"，NucleicAcidsRes. 25:3389-3402)及默认参数，可确定两 个序列的百分比"同一性"。尤其是，可用URLhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/访问 互联网进行BLAST算法评价。
[0050] 本文所用术语"酮糖-3-差向异构酶活性"指一种能催化酮糖的立体化学转化，特 别是果糖向阿洛酮糖的转化的酶。例如，在一个实施例中，"酮糖-3-差向异构酶活性"指与 相同条件下不含酶的反应混合物相比，所加每毫克酶（〇. 1单位/毫克）使果糖与阿洛酮糖 的互变率增加至少10微摩尔/分钟的能力。在其他实施例中，认为使果糖与阿洛酮糖的互 变率增加至少〇. 05单位/毫克或0. 2单位/毫克即具有"酮糖-3-差向异构酶活性"。以下 提供了一种测定酶使D-果糖向阿洛酮糖转化的活性的适宜方法。将 含1毫升D-果糖（50 克/升）、Tris-HCL缓冲液（50mM，pH8. 0)，以及0. 5yM酶的反应混合物在55°C培养2分 钟。在10分钟后通过煮沸来停止反应。用高效液相色谱法（HPLC)测定所得D-阿洛酮糖 量。将一个酶活性单位定义为在pH8. 0及55°C条件下每分钟催化形成1ymolD-阿洛酮 糖的酶量（J.Agric.FoodChem. 2011，59, 7785-7792)。
[0051] 术语"基因"、"多核苷酸"和"核酸分子"在本文中可互换使用，用于指代多核苷酸 聚合物。核酸分子可能会含有天然存在的核酸（DNA或RNA)，或包含人工核酸，例如：肽核 酸、吗啉和锁核酸以及乙二醇核酸和苏糖核酸。
[0052] 本文所用术语"核苷酸"指天然存在的核苷酸，以及可被细胞酶识别的合成核苷酸 类似物。
[0053] 本文所用术语"载体"指含一种核酸分子的任何天然或人工构建，其中，核酸分子 可被细胞转录酶和/或翻译酶催化。示例载体包括：质粒、病毒（包括噬菌体）、粘粒、人工 染色体或转座子。
[0054] 本文所用术语"宿主细胞"指任何可在培养基中培养并用于表达重组基因的生物 细胞。这些宿主细胞可以是真核或原核细胞，也可以是微生物如细菌细胞，或者可以是来源 于一个细胞系的细胞（如哺乳动物永生细胞系）。
[0055] 本文所用术语"高度严谨的条件"在指杂交条件时，指：在65°C条件下至少约6倍 SSC和1%SDS，在约42°C用在0? 1倍SSC中配制的约20% (体积/体积）甲酰胺首次洗涤 10分钟，随后在65°C条件下用0. 2倍SSC和0. 1%SDS洗涤。在诸如本说明书所述的高度 严谨条件下，使用公知的核酸作为探针的杂交技术将识别结构相似的核酸，这是本领域的 公知技术。
[0056] 本文所用术语"阿洛酮糖"指具有式（I)所示结构的单糖。其亦称为"D-阿洛酮 糖"。
[0057]
[0058] 本文所用术语"果糖"指具有式（II)所示结构的单糖。果糖基质实例包括但不限 于结晶果糖和结晶果糖糖蜜。本文所用术语"结晶果糖糖蜜"指果糖从结晶母液的非结晶 部分结晶期间产生的工艺流体。
[0059]
[0060] 本文所用术语"重组"指位于非天然发生的环境，并经人工干预而制备的核酸分子 或多肽。重组多肽的例子包括，从其他多肽中分离的第一多肽，或是经肽键连结到第二多肽 序列的第一多肽，而其中所述第二多肽的氨基酸序列与第一多肽在自然界中相关联的任何 多肽不同。
【附图说明】
[0061] 图1所示为如本发明的实施例，由闪烁梭菌（Clostridiumscindens)所得酮 糖-3-差向异构酶的氨基酸序列（序列编号2)。
[0062] 图2所示为如本发明的另一实施例，由海氏梭菌（Clostridiumhylemonae)所得 酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列（序列编号4)。
[0063] 图3所示为如本发明的又一实施例，由Desmosporasp.所得酮糖-3-差向异构酶 的氨基酸序列（序列编号6)。
[0064] 图4所示为由解纤维素梭菌（Clostridiumcelluloyticum)所得的先前已知木糖 异构酶的氨基酸序列（序列编号8)。
[0065] 图5示出了由图1至图3所示的三个酮糖-3-差向异构酶和之前已知的三个酮 糖-3-差向异构酶的序列对比，并突出显示完整保留的残基。
[0066]图6所示为经转化的大肠杆菌使果糖转化为阿洛酮糖的转化率曲线，其中大肠杆 菌的转化为表达本发明实施例所述一种酶和一种对照。
[0067] 图7所示为编码图4所示氨基酸序列并经优化的基因序列（序列编号7)，以及经 优化序列与原始序列的比较。
[0068] 图8所示为编码图3所示氨基酸序列并经优化的基因序列（序列编号5)，以及经 优化序列与原始序列的比较。
[0069] 图9所示为编码图1所示氨基酸序列并经优化的基因序列（序列编号1)，以及经 优化序列与原始序列的比较。
[0070]图10所示为编码图2所示氨基酸序列并经优化的基因序列（序列编号3)，以及经 优化序列与原始序列的比较。
[0071] 图11所示为经转化的大肠杆菌使果糖基质转化为阿洛酮糖的转化制备图，大肠 杆菌的转化为以18升的规模表达本发明实施例所述一种酶（由Desmosporasp所得酮 糖_3_差向异构酶）。
[0072] 图12所示为以本发明实施例的酶（CHP3E、CSP3E和DSP3E)和一种已知酮 糖-3-差向异构酶（CCP3E)催化的阿洛酮糖转化率曲线图。
[0073] 图13所示为在填充A568树脂的30毫升固定床反应器中以DSP3E催化的阿洛酮 糖转化率曲线图。
[0074] 图14所示为在填充A568树脂的300毫升固定床反应器中以DSP3E催化的阿洛 酮糖转化率曲线图。
[0075] 图15所示为由Desmosporasp.所得的天然存在的酮糖-3-差向异构酶其一种人 工变体的氨基酸序列（序列编号13)。
[0076] 序列清单之简要说明
[0077] 序列编号1所示为编码由闪烁梭菌所得的酮糖-3-差向异构酶的基因序列（为在 大肠杆菌中表达而优化）。
[0078] 序列编号2所示为由编号1的基因序列所编码酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序 列。
[0079] 序列编号3所示为编码由海氏梭菌所得的酮糖-3-差向异构酶的基因序列（为在 大肠杆菌中表达而优化）。
[0080] 序列编号4所示为由编号3的基因序列所编码酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序 列。
[0081] 序列编号5所示为编码由Desmosporasp. 8437所得酮糖-3-差向异构酶的基因 序列（为在大肠杆菌中表达而优化）。
[0082] 序列编号6所示为由编号5的基因序列所编码酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序 列。
[0083] 序列编号7所示为编码由解纤维素梭菌所得酮糖-3-差向异构酶的基因序列（为 在大肠杆菌中表达而优化）。
[0084] 序列编号8所示为由编号7的基因序列所编码酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序 列。
[0085] 序列编号9所示为编码由闪烁梭菌所得酮糖-3-差向异构酶的天然存在基因序 列。
[0086] 序列编号10所不为编码由海氏梭菌所得酮糖-3-差向异构酶的天然存在基因序 列。
[0087] 序列编号11所示为编码由Desmosporasp. 8437所得酮糖-3-差向异构酶的天然 存在基因序列。
[0088] 序列编号12所示为编码由解纤维素梭菌所得酮糖-3-差向异构酶的天然存在基 因序列。
[0089] 序列编号13所示为Desmosporasp. 8437的酮糖-3-差向异构酶其人工变体的氨 基酸序列。
【具体实施方式】
[0090] 总体而言，本发明涉及一种包含多肽的蛋白，所述多肽具有序列编号2、4或6所示 的氨基酸序列。序列编号2、4、6的多肽的源生物如表1所示。
[0091] 表 1
[0092] L/1N丄 I n ^ 1/丄djy、
[0093] 然而，在其他实施例中，该多肽序列与序列编号2、4、6所示并不完全相同，但与其 有至少70 %的序列同一性。优选地，该多肽序列与序列编号2、4或6有至少80 %、90 %、 95%或99%的序列同一性，或100%的序列同一性。
[0094] 例如，在一个实施例中，多肽序列包括序列编号13的序列，其与编号6的序列有 89%的序列同一性。该多肽序列具有酮糖-3-差向异构酶活性。
[0095] 因此，在一些实施例中，将肽的一个或多个氨基酸删除，或是用不同氨基酸取代， 优选用相似的氨基酸取代。相似的氨基酸为侧链部分有相关属性的氨基酸，而天然存在的 氨基酸可分为下列基团。具有碱性侧链的基团：赖氨酸、精氨酸、组氨酸。具有酸性侧链至 基团：天门冬氨酸和谷氨酸。具有不带电荷极性侧链的基团：天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏 氨酸和酪氨酸。具有非极性侧链的基团：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸和半胱氨酸。因此，优选取代具有此等基团的氨基酸。
[0096] -般优选多肽与天然存在多肽（尽管其也可体外合成）的化学性质相符，但在其 他一些实施例中，多肽为拟肽类，也即以非自然发生的方式修饰的多肽。此等拟肽类包括用 合成的氨基酸取代天然存在的氨基酸和/或修饰多肽的主链。例如，在一些实施例中，肽键 为反向肽键所取代，以生成一个向后反转的拟肽（参见本文所含参考文件M6zi6re等人，J Immunol. 19970ct1;159(7):3230-7)。另外，氨基酸经共价键而非肽键相连，但形成聚合 物链的氨基酸残基保持其间距和取向。
[0097] 本发明中所有这类修饰及未修饰多肽都具有酮糖-3-差向异构酶的聚合酶活性。 也即经纯化或在宿主细胞中表达的蛋白能催化果糖向阿洛酮糖的转化。检验酮糖-3-差向 异构酶活性的适宜条件如实施例1所示。
[0098] 本发明的多肽可包含于一个完整细胞内，或为经分离的蛋白、经部分纯化的蛋白， 或经固定的蛋白。蛋白纯化可经标准的方法，如细胞破碎和过滤。其他标准方法亦为本技 术领域技术人员所知。
[0099] 本发明的实施例提供了一种包含多核苷酸序列的核酸分子，所述多核苷酸序列编 码一种蛋白，所述蛋白的氣基酸序列与序列编号2、4或6的序列有至少70%的序列同一性， 所述蛋白具有酮糖-3-差向异构酶活性。例如，在一个实施方案中，核酸分子所含序列编码 编号13的多肽序列。
[0100] 除特别编码本发明所述蛋白的序列外，核酸分子可包含其他序列，例如引物位点、 转录因子结合位点、载体的插入位点和抗溶核降解的序列（例如：多聚腺苷尾）。所述核酸 分子可为DNA或RNA，并可包括合成的核苷酸，前提是多核苷酸仍能被翻译用于合成本发明 的蛋白。
[0101] 如上所述，本发明的蛋白的氨基酸序列可以不同于本文所公开的特定序列。在优 选实施方案中，所述核酸分子包含具有序列编号1、3或5的序列的多核苷酸，所述多核苷酸 在大肠杆菌宿主细胞中表达而经优化。在其他实施例中，所述多核苷酸序列与编号1、3或5 之中任一序列有至少70%的序列同一性，并编码具有酮糖... -3-差向异构酶活性的蛋白。优 选地，该多肽序列与编号1、3或5之中一个序列有至少80%、90%、95%或99%的序列同一 性，或100 %的序列同一,性。在其他实施例中，核酸分子包含一种多核苷酸序列，所述多核苷 酸序列在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，其具有与编号1、3、5所示序列互补的序 列，并编码具有酮糖-3-异构酶活性的蛋白。在一些实施例中，提供了一种核酸分子，其所 包含具有编号9、10或11的序列的多核苷酸，所述多核苷酸是酶的天然存在的序列。
[0102] 在一些实施例中，所述核酸分子为载体（如质粒）的组成部分。除上述核酸序列 外，该质粒亦包含其他元素，例如原核覆制起点（例如大肠杆菌0R1复制起点）、自主复制序 列、着丝粒序列；位于核酸序列上游的启动子序列、位于核酸序列下游的终止子序列、抗生 素抗性基因和/或分泌信号序列。包含自主复制序列的载体亦为酵母人工染色体。
[0103] 在其他一些实施例中，载体为病毒，如噬菌体，而且除包括本发明的核酸序列外， 还包括用于噬菌体复制的核酸序列，如结构蛋白、启动子、转录启动子等。
[0104] 本发明的核酸分子可用于转染或转化宿主细胞，以便合成本发明的蛋白。适宜的 宿主细胞包括原核细胞如大肠杆菌，以及真核细胞如酵母细胞，或哺乳动物或植物细胞系。 宿主细胞的转染或转化是使用本领域的公知技术，如电穿孔、磷酸钙基方法、基因枪技术， 或使用病毒载体。
[0105] 本发明的核酸分子转染后，再根据需要转录和翻译。在一些实施例中，可将合成的 蛋白保持在宿主细胞中，随后可使用重组宿主细胞的培养物。在其他实施例中，例如由于载 体中存在分泌信号而将合成的蛋白从细胞中分泌出来，或裂解宿主细胞并纯化所得蛋白， 以这些方法将合成的蛋白从宿主细胞中提取出来。
[0106] 用本发明的蛋白催化果糖向阿洛酮糖的转化。在一些实施例中，该蛋白存在于宿 主细胞中，并以1至1000克/升的浓度在适当条件（如从25°c至75°C的培养温度，从4至 10的pH值）下，与果糖基质如用硼酸盐缓冲的果糖基质混合，以形成转化混合物。转化混 合物也可包含溶剂和其他可选共溶剂（除水外）例如乙醇、甲苯和甲醇。果糖基质也可包 含其他糖，如葡萄糖或蔗糖。所述蛋白可催化果糖基质向阿洛酮糖的转化。实际上，转化混 合物中所有果糖并非都转化为阿洛酮糖，因此通常随后有一个提取阿洛酮糖及经蒸发和结 晶而纯化的步骤。该混合物中剩余的果糖可经酵母发酵而去除。
[0107] 在其他实施例中，本发明的蛋白以经纯化的形式提供，并与果糖基质及适宜溶剂 一起混合，用于在体外完全转化。在一个实施例中，条件为pH4至10,温度30°C至70°C，果 糖浓度为10%至95% (重量/体积），溶剂为水。果糖的可选浓度范围包括但不限于20% 至95%、30%至95%、40%至95%、50%至95%、60%至95%、70%至95%、75%至95%。 特别优选的果糖基质浓度范围为70%至95%之间。在其他优选实施方案中，果糖浓度为 75%至 95%。
[0108] 酮糖的转化反应通常使用1%至60% (重量/体积），优选约5%至50%的基质浓 度。本发明的特别优点在于，可采用常规操作条件但高于以往的果糖浓度，将蛋白用于酮糖 转化反应。因此，用本发明的蛋白可能达到较大的体积产率。
[0109] 在一些实施例中，本发明的蛋白固定于固相基质。其优点在于，这种酶的使用寿命 更长，可填装到小固定床反应器中，而且对污染物及过程条件的波动有更大的耐受性。示 例的固体基质包括离子交换树脂和聚合物封装。在一些实施例中，本发明的蛋白固定于 DuoliteA568树脂。在一些实施例中，用弱碱性离子交换（即基于蛋白电荷与基质诸如树 脂电荷的静电相互作用）将本发明的蛋白固定于一种基质。在其他实施例中，将蛋白非特 异性结合至基质诸如树脂的多孔区域，从而将其固定。
[0110] 在另一个实施例中，本发明涉及一种制造阿洛酮糖的方法。该方法包括以下步骤。
[0111] 1)提供一种包含核酸分子的载体，所述核酸分子与编号1、编号3或编号5的序列 有至少70%的序列同一性。
[0112] 2)用所述载体转化感受态宿主细胞。
[0113] 3)可选地，培养所转化的宿主细胞。
[0114] 4)将所转化的细胞与果糖基质混合并保持在可将果糖转化为阿洛酮糖的条件下。
[0115] 5)用本领域的标准方法如蒸发和结晶，纯化所得阿洛酮糖。
[0116] 在其他实施例中省略了步骤4)。取而代之，将所述核酸分子编码的蛋白从经转化 的宿主细胞中分离出来，并可选地将其固定于基质。然后将所述蛋白与果糖基质混合并保 持在可将果糖转化为阿洛酮糖的条件下。然后执行步骤5)。在其他实施例中，省略了步骤 2)，并且蛋白亦由体外翻译而合成。接着将蛋白分离并与果糖基质混合。
[0117] 以本发明所述方法制造的阿洛酮糖可用于供人和/或动物消费的产品。在一些实 施例中，产品可能是食品、饮料、药品、营养产品、运动产品，或化妆品。例如，当该产品为食 品时，食品可选自糖果产品、甜食产品、谷类产品、焙烤食品、冷冻乳制品、肉类、乳制品、调 味品、点心棒、汤、酱、调配品、预制食品、婴儿食品、饮食制剂、糖楽?、食品涂料、干果、调料、 肉汁和果酱/果冻。在一些实施例中，所述食品会包含以本发明所述方法制造的阿洛酮糖， 作为产品表面的涂层或形成的粉霜。
[0118] 可选地，当该产品是一种饮料产品，该饮料产品可选自碳酸饮料、非碳酸饮料、水 果味饮料、果汁、茶、奶、咖啡和类似饮料。
[0119] 实施例
[0120]实施例1
[0121] 在本实施例中，宿主细胞经转化以表达三个假定酮糖-3-差向异构酶之一。将经 转化的宿主细胞与果糖基质共同培养，以测试其酮糖-3-差向异构酶活性。
[0122] 物赳
[0123] 1MpH8硼酸盐缓冲液：
[0124] i)将62克硼酸溶于1升去离子水
[0125] ii)用10M氢氧化钠溶液调到pH8
[0126] iii)保存在1升瓶中，再存放在4°C冰箱中
[0127] 用硼酸盐缓冲的果糖基质：
[0128] i)将970克液体果糖（77%DS)与50毫升pH8硼酸盐缓冲液混合
[0129] ii)加水至最终体积为1升
[0130] iii)用5M氢氧化钠溶液调节pH值至8
[0131] 表达培养基LB-4X2. 8升带挡板的摇瓶：
[0132] i)将10克胰胨、7克氯化钠和10克酵母溶于1升去离子水
[0133]ii)热压灭菌
[0134] 方法
[0135] 选择三种假定酮糖-3-差向异构酶基因序列和一种对照序列以通过Genscript USA合成构建。假定的酮糖-3-差向异构酶序列编码：
[0136] i)由闪烁梭菌ATCC 35704(登录号ZP_02432281)所得假定蛋白 CL0SCI_02526(序列编号2)
[0137] ii)由海氏梭菌DSM 15053(登录号ZP_03778576. 1)所得假定蛋白 CL0HYLEM_05645(序列编号4)
[0138] i i i)由Desmospora sp. 8437(登录号ZP_08466075)所得D-塔格糖3-异构酶（序 列编号6)。
[0139] 对照序列编码由解纤维素梭菌H10 (登录号YP_002505284)所得木糖异构酶蛋白 (序列编号8)。
[0140] 用为在大肠杆菌中表达而优化的序列（请参阅图7至图10)，对基因进行合成构 建，并将所得4个基因分别克隆到表达载体pET15b中。本领域技术人员所知微生物和表达 载体的其他组合预期同样表现出色。
[0141]用大肠杆菌BL21 (DE3)接种3毫升溶源性肉汤（LB)，并在37°C过夜使细菌增殖， 从而制备用于转化的感受态细胞。用这3毫升培养液接种300毫升LB，并在37°C振荡，使 细胞生长到0D(600)为0. 7至1. 0。用典型分光亮度计在600nm波长处测定1厘米比色皿 中的光密度（0D值）。将细胞放在冰上冷却10分钟，然后在4°C下以7500xg离心沉降15 分钟。倒出培养基，将细胞重新混悬于300毫升冷水。重复离心，再将细胞重新混悬于150 毫升冷水。再次重复离心，再将细胞混悬于约2毫升冷却的10%无菌甘油。如上述方法将 细胞离心沉降，再混悬于约2毫升冷却的10 %无菌甘油。将该混悬液按100y1等分分装到 无菌离心管中，并贮存在-80°C。
[0142] 随后，将Genscript供应的表达载体用于以电穿孔法转化感受态大肠杆菌 BL21 (DE3)，并在含氨苄西林的LB琼脂上选择阳性转化株。分别将1升LB倒入4个2. 8升 带挡板的烧瓶中并高压灭菌。冷却后，在无菌条件下向每个烧瓶中添加1毫升100毫克/ 升氨苄西林，再用2至3毫升上述制备的感受态细胞过夜培养物接种每个烧瓶（每个表达 菌株1个烧瓶）。使细胞在37°C200转/分条件下生长约3小时，以便0D达到0. 8至1. 5。 向每个烧瓶中添加1毫升新制1M异丙基--D-1-硫代半乳糖苷溶液中，将温度降至室温 (即25至30°C)，诱导反应继续进行约5小时。在4°C以约5000xg将细胞离心沉降30分 钟，倾出上清液。将细胞沉淀转移到已称重的50毫升离心管中，并记录细胞质量。将细胞 重新混悬于几毫升无菌甘油（10%重量/重量），并冷冻于_80°C。
[0143] 将全细胞与经硼酸盐缓冲的果糖基质混合，以DP1-4方法并使用钙2+色谱柱，用 高效液相色谱（HPLC)法进行分析，检查细胞的转化活性。将装有250毫升经硼酸盐缓冲的 果糖基质的4个烧瓶加热至55°C，并在室温下将冷冻细胞解冻。以6500xg对细胞进行离 心沉降，再重新混悬于去离子水。将2克（湿重）细胞与经硼酸盐缓冲的果糖基质混合，并 在55°C及90转/分搅拌条件下在1升带挡板的烧瓶中培养。在0、1、2和5小时采样进行 高效液相色谱分析。
[0144] 高效液相色谱分析包括将20微升0? 1 % (重量/体积）供试品注入色谱系统，用 水作为流动相，流速为〇. 1至1. 5毫升/分，固定相为粒径1至10微米的Ca2+形式的树脂， 柱温为80°C。以示差折光检测器对峰进行检测和定量，并基于已知标准品的保留时间进行 定 性归属。
[0145] 结果与讨论
[0146] 检出三种蛋白序列，测得均为酮糖-3-差向异构酶蛋白。这些蛋白的序列详见图 1至图3 (序列编号2、4、6)。用作对照者为由解纤维素梭菌H10所得木糖异构酶，先前已提 示该酶可用于由果糖制造阿洛酮糖。其氨基酸序列参见图4 (序列编号8)。
[0147] 将这些蛋白的氨基酸序列与其他已知酮糖-3-差向异构酶的序列对齐，对齐的序 列参见图5。突出显示完整保留的残基。这些序列之间仅有极少保守残基，相邻序列之间保 守残基不足65%。
[0148] 测定了编号2、4、6各序列与登录号NP_535228和BAA24429及序列编号8各序列 之间的序列同一性程度。结果示于表2。对于所选各蛋白序列，所得公知酮糖-3-差向异构 酶序列同一性为40%至63%。基于所有序列的序列比对，并没有整体较强的同源性。所选 蛋白具有经优化的基因，以便为综合构建并克隆于Genscript市售表达载体pET15b的大肠 杆菌所表达。对于每个构建，大肠杆菌BL21 (DE3)的转变取得了成功，并将各株的冷冻储备 物与表达载体一起保存。在1升规模进行了蛋白表达，并采收整个细胞作为粗催化剂。对 转化活性进行检查，并以图6提供了试验期间由4种不同试验株所制造的％DSB阿洛酮糖。
[0149]表 2
[0150]
[0151] 三个假定酮糖-3-差向异构酶均成功表达，而且全部都可将果糖成功转化为阿洛 酮糖，确认每个蛋白确实均为酮糖-3-差向异构酶。
[0152] 活性最强的蛋白为DS P3E(由Desmospora sp. 8437所得D-塔格糖3-差向异构 酶，序列编号6)，该蛋白能利用每升8克湿细胞重量在短短2小时内转化750克/升果糖溶 液的30%，体积产率为112克/升/小时。
[0153]实施例2
[0154] 在本实施例中，以18升规模采用了当前最佳细胞生长和转化条件，用以确定可放 大性，以及制造用于进一步感官和临床试验的阿洛酮糖。转化后，执行了一个初始的净化步 骤，用以去除果糖。本实施例旨在确定本过程的可放大性、放大的任何意外问题，以及可在 实验室中合理制造的阿洛酮糖量。
[0155]
[0156] 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)
[0157] 经过滤除菌的100毫克/毫升氨苄西林水溶液
[0158] 结晶果糖糖蜜
[0159]液体果糖（77 %DS)
[0160] 生长培养基：
[0161]i)将25克氯化钠、25克Staleydex'K 333、6克甘油、50克蛋白胨（Difco)、60克酵 母提取物（Difco)、8克磷酸氢二钾和8克磷酸二氢钾溶于6升去离子水
[0162]ii)用Tris碱（固体）调节pH值至~7. 8
[0163] iii)按每瓶1升装进6个带挡板的2. 8升烧瓶，瓶口包裹铝箔，再热压灭菌
[0164] 1MpH8Tris缓冲液：
[0165]iv)将121克溶于1升去离子水
[0166]iv)用盐酸调节pH值至8
[0167]iv)保存在1升瓶中，再存放在4°C冰箱中
[0168]方法
[0169] 分别按100微克/毫升向6份5毫升LB培养基中添加氨节西林，开始过夜培养， 进行细胞增殖。用大肠杆菌制造菌株（BL21-DE3pET15b-DS-P3E，表达序列编号6的蛋白） 接种培养物，并使其在37°C生长过夜（约16小时）。如上所述配制6升生长培养基并热压 灭菌，向每个烧瓶中添加5毫升过夜培养物，以190转/分在37°C下振荡4小时。新制1份 1M溶液，并按每升添加1毫升IPTG向每个烧瓶中添加ImMIPTG。降温至25°C，继续振荡 14至16小时。
[0170] 使用322型落地式离心机和1升瓶（灌装不超过800毫升培养基），以6000转/分 将培养物离心20分钟，以便收获细胞。将培养基倒入杀桶，再按体积比1 %添加漂白剂，静 置30分钟。对离心管称重，再按每克细胞3毫升向离心管中添加去离子水。使用抹刀和旋 涡振荡器将细胞重新混悬，直到形成均匀细胞浆料。将细胞悬液转移到40毫升离心管中， 并以6500xg重新离心沉降。将洗液倾析到杀桶中，将细胞重新混悬于相同体积的水中。
[0171] 用另外一批细胞重复细胞增殖和收获。
[0172] 将5加仑（18. 9升）桶装结晶果糖糖蜜加热至室温，并将16506克结晶果糖糖蜜加 入经消毒并带有18升校准刻度的5加仑（18. 9L)塑料桶中，配制结晶果糖糖蜜转化基质。 按如上所述配制900毫升1MpH8.OTris溶液，将其加入桶中，然后加水至18升校准标记， 再使用悬臂式搅拌器将其搅匀。将混合物和未使用的结晶果糖糖蜜退回冷藏室中贮存。
[0173] 在经消毒并带有18升校准标记的5加仑（18. 9升）塑料桶中，将17460克液体果 糖（77%DS)与500毫升1MpH8.OTris(如上制备）混合，制得液体果糖转化基质。加水 至18升校准标记，再使用悬臂式搅拌器将其搅匀。
[0174] 对于整个细胞转化，将所制造的18升结晶果糖糖蜜转化基质在水浴中加热至 55°C，再用悬臂式搅拌器以约150转/分轻轻搅拌。添加由细胞收获所得再混悬细胞糊，至 细胞湿重共100克。5小时后采样进行高效液相色谱分析。在4°C冷藏整个桶，以便将反应 停止。取一份样品进行大肠杆菌菌群和TPC微生物分析。
[0175] 用制造的18升液体果糖转化基质重复整个细胞转化过程。使用湿重为120克的 细胞，并在2小时和4小时采样进行高效液相色谱分析。
[0176] 以酵母发酵去除结晶果糖糖蜜转化基质中的果糖。用2倍体积水稀释结晶果糖糖 蜜转化产物，使54升总体积中阿洛酮糖和果糖值的合并最终浓度为~250克/升。将54 升稀释混合物分装到4个经消毒的5加仑（18.9升）桶中，每桶约装13升。将其中两个 桶保存在冰箱中。分别将其余两个桶设置为用悬臂式搅拌器剧烈搅拌，并用配备扩散器的 9升/分空气泵通气，以便得到约0. 3VVM的气流。向每个桶中添加120克面包活性干酵母 (Fleishman品牌），搅拌并通气2天（~36小时），不时采样进行DP1-4阿洛酮糖分析。将 桶转移到冷藏室过夜，使酵母沉降。然后取上清液，转移到两个新的洁净并经消毒的桶中， 将其余酵母部分转移到两个装有以上准备的冷藏结晶果糖糖蜜的桶中。重复搅拌及混合过 程中，然后去除酵母。在酵母发酵步骤之后，得到约45升上清液，并无菌过滤到3个清洁并 经消毒的桶中，然后贮存于4°C供后续处理。
[0177] 结果与讨论
[0178] 由12升培养物得到约220克此21(0￡3^￡1'-1513-03?3￡细胞，并分成2份用于上 述两个18升规模的生物转化。因此，对于结晶果糖糖蜜转化，全细胞生物催化剂总浓度为 5. 6克/升，对于液体果糖转化，为6. 7克/升。
[0179] 图11表明：这两种转化迅速达到~25%，以阿洛酮糖占阿洛酮糖+果糖的百分比 计。这略低于之前用这类细胞和类似转化介质在小规模达到的转化水平，但二者非常接近。 使用液体果糖基质时，短短2个小时后转化率就已达到22%。
[0180] 在各18升的转化规模，产出了约3. 3千克阿洛酮糖。两种基质之间似乎没有显著 差异。
[0181]从250毫升放大并未产生任何不可预见的问题，而且是按预期进行。
[0182] 微生物检查结果表明：没有活大肠杆菌，结果呈阴性，每克< 3个大肠菌群，总平 板计数为两个。因此，55°C的温度结合高DS比例的糖浆足以杀死全细胞生物催化剂。
[0183] 使用新发现的DSP3E酶，将果糖向阿洛酮糖的生物转化成功放大至18升。
[0184]实施例3
[0185] 采用pH控制进料分批培养方法及葡萄糖酵母提取物培养基，在发酵实验室中以 两个10升规模的发酵，制造了含新发现的DSP3E蛋白（编号6)的大肠杆菌菌株。发酵按 预期进行。
[0186] 在发酵批增长及补料分批阶段，细胞呈指数式增长，其倍增时间约为1小时。在约 5. 5小时中，葡萄糖浓度由约9克/升下降至< 1克/升（0D~28)。在产酶诱导期，0D继 续上升至约130,随后未观察到明显变化。经离心对发酵进行采收，得到4.5千克（10镑） 湿细胞糊，干细胞重约为1. 1千克（2. 5镑）。
[0187]用反渗透水将果糖基质（836千克，以DS(干固物）计）稀释至69%DS(920克/ 升），并加热到52°C，并将pH值调到7. 8。在整个反应过程中采用低速搅拌（约50转/分） 促进混合，并将整批4. 5千克（湿糊）以上所得表达全细胞加入反应，取1份0时样品。这 提供了 〇. 48克/升的生物催化剂负荷，与先前测试的实验室规模转化类似，然而，其基质浓 度较高，为920克/升。在4和16小时采样以高效液相色谱进行了分析。
[0188] 在反应期间未发现DS下降，而且没有生成生物制品。在16小时反应结束时，反应 进行到接近平衡，即约30%阿洛酮糖。在4小时时反应已经进行到转化18%。之前使用0. 5 克/升生物催化剂及750克/升基质（实施例1和实施例2)所得体积转化率是46克/升 *小时，或每单位生物催化剂92克/升*小时/克生物催化剂。在这里，采用较高的基质浓 度和略低的温度（52°C相对于55°C)，体积转化率为41克/升*小时或85克/升*小时/ 克生物催化剂（用4小时的数据点计算）。这表明异构酶反应具有相当大的灵活性。当在 16小时完成反应后，在28 : 72的阿洛酮糖：果糖混合物中有230千克阿洛酮糖。
[0189]实施例4
[0190] 在750克/升Tris缓冲的果糖基质上，对用4种不同酶（序列编号：2、4、6、8)进 行的果糖转化进行了比较。在16°C而不是25至30°C诱导细胞，而转化速率比以前的实验 慢。在500毫升带挡板的烧瓶中，向200毫升基质中添加湿重为2克的再混悬细胞，然后在 55°C及90转/分条件下培养。在2小时和3. 5小时米样进行高效液相色谱分析。结果参 见图12,其中，CCP3E对应于编号8的序列，CHP3E、CSP3E及DSP3E则分别对应于编号 4、2及6的序列。在该实验中，表达序列编号2、4、6或8所述蛋白的全部4株显不具有大致 相同的活性， 在3. 5小时将约5%基质转化为阿洛酮糖。
[0191]实施例5
[0192] 在本实施例中，使用固定化酶进行了制造阿洛酮糖的首次试验。本实施例的目的 在于提高酶利用率。
[0193] 物赳
[0194]Codexis制备的冻干酶粉末，批号：D13007或D13008
[0195] -Desmospora sp?阿洛酬糖_3_差向异构酶
[0196]DuoliteA568 (Doff)
[0197]AmberliteXAD2 (Sigma)
[0198] 1MTris缓冲液：
[0199]i)以1M的浓度溶于水而制备
[0200] ii)用盐酸将pH值调到8. 0
[0201] iii)使用前稀释至lOOmM
[0202] 结晶果糖糖蜜，80%干固物，其组成为：
[0203]i)90%DSB果糖
[0204]ii)7%DSB葡萄糖
[0205]iii)3%DP2+
[0206]iv)其他单糖
[0207]MnCl2 (Sigma)
[0208]方'法
[0209] 1)小规模固定化
[0210] 为了试验固定效率，在约30毫升容积（色谱柱尺寸为11毫米x300毫米）的夹 套柱中进行了小型固定床反应。用水对XAD2和A568树脂进行数次洗涤，以除去制造过程 的细小树脂颗粒（即树脂制备的副产物细树脂颗粒（即断裂/破碎颗粒））及任何残留物。 将2克冻干酶（即差向异构酶）溶于约50毫升水，并分成两等份。测定pH值，结果为6.5。 分别取各树脂约30毫升，在室温及轻微搅拌条件下与1份差向异构酶溶液一起培养约1小 时，然后将树脂填装到夹套柱中，再用蠕动泵经固定床将差向异构酶溶液循环2小时。然后 用10倍柱床体积的l〇〇mMpH8.OTris缓冲液洗涤柱子。在这个点，在A280进行分光亮度 法测定时，洗脱液澄清不含蛋白。用反渗透水将结晶果糖糖蜜稀释到60%DS，随后将pH调 至8. 0,然后添加28ppmMnClJPlOmMpH8.OTris缓冲液，以制备结晶果糖糖蜜进料。
[0211] 用循环水浴将夹套柱加热至57°C，并以8倍柱床体积/小时（BV/小时）的速率将 进料泵过30毫升固定床反应器。收集反应器洗脱液，用FT-IR进行分析，以便提供阿洛酮 糖和果糖的相对浓度。该过程共持续5天。在试生产过程中，将进料速率从8倍柱床体积 /小时调到6倍柱床体积/小时，以保持转化速率。
[0212] 2.放;.大.至300毫升固定床反.应器
[0213] 为了试验固定的放大效率，用约300毫升容积（色谱柱尺寸为25毫米x600毫米） 的夹套柱创建了较大的固定床反应器。用水对XAD2和A568树脂进行数次洗涤，以去除细 小颗粒和制造过程的任何残留物。将10克冻干差向异构酶溶于约100毫升水。将约300 毫升A568树脂填充于300毫升夹套柱，在室温下用蠕动泵经固定床将差向异构酶溶液循环 约2小时。然后，在室温下，用5倍柱床体积的100mMpH8.OTris缓冲液洗涤柱子。在这 个点，在A280进行分光亮度法测定时，洗脱液澄清不含蛋白。用反渗透水将结晶果糖糖蜜 稀释到60%DS，随后将pH调至8. 0,然后添加28ppmMnCljP10mMpH8.OTris缓冲液，以 制备结晶果糖糖蜜进料。用循环水浴将夹套柱加热至57°C，并以8倍柱床体积/小时（BV/ 小时）的速率将进料泵过30毫升固定床反应器。收集反应器洗脱液，用FT-IR进行分析， 以便提供阿洛酮糖和果糖的相对浓度。该过程共持续4天。在试生产过程中，将进料速率 从8倍柱床体积/小时调到2倍柱床体积/小时。另外，将该柱在室温下静置2周时间，然 后重新启动，以测定差向异构酶在柱贮存期间的稳定性。
[0214] 结果与讨论
[0215] 对于任何检查样品，30毫升柱及XAD2未出现显著转化，因此，未进行进一步分析。 然而，采用DowexA568则发现了显著转化。图13所示为30毫升固定床反应器及A568树 脂的反应时程。在仅含1克差向异构酶的120小时固定床转化期间，制造了超过4千克阿 洛酮糖。在120小时期间，百分转化逐渐降低，因此在72小时降低了经柱流量，用以补偿转 化率的降低。反应期间产生了近乎平衡的阿洛酮糖浓度。
[0216] 图14所示为使用A568树脂的300毫升反应过程。由于进料量受限（72小时内用 86升进料），在24小时降低了流量。在72小时内，由10克差向异构酶产生了超过20千克 阿洛酮糖。在72小时末，转化率仍然很高，虽然发现性能有所下降。
[0217] 先前已在烧瓶反应中确定差向异构酶在溶液中的稳定性。在53°C下8小时内损 失了超过90%的活性。在该实施例中，在57°C下进行了转化。较高温度的优势在于反应速 率、平衡比，以及微生物稳定性。在该实施例中，即使在120小时后，仍然保持了显著的差向 异构酶活性。
[0218] 在进料受限的大规模反应中，使用10克差向异构酶产出了20千克阿洛酮糖，所得 差向异构酶净投料比为0.05% (质量/质量）。在小规模反应中，使用1克差向异构酶产 出了 4. 8千克阿洛酮糖，所得差向异构酶净投料比为0.02% (质量/质量）。在标准果糖 制造中，尽管是在6至12个月的操作过程中，按0. 01 %至0. 005%的比例（质量/)使用了 固定化葡萄糖差向异构酶。
【主权项】
1. 一种包含多肽序列的蛋白，该多肽序列与编号6的序列、编号2的序列或编号4的序 列具有至少70%的序列同一性，其特征在于，该蛋白具有酮糖-3-差向异构酶活性。2. 根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，该多肽序列与编号6、编号2或编号4的 序列具有至少80%、90%、95%或99%的序列同一性，或100%的序列同一性。3. 根据权利要求1或2所述的蛋白，其特征在于，该多肽序列包含编号13的序列。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，其特征在于，该蛋白固定于固相基质。5. 如前述权利要求中任一项所述的蛋白用于合成阿洛酮糖的用途。6. -种核酸分子，所述核酸分子包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码权利要求1 至4中任一项所述的蛋白。7. 根据权利要求6所述的核酸分子，该核酸分子包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列 的特征在于： (i)与编号5、编号1或编号3的序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%的序列同 一性，或100 %的序列同一性；或 (ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1或 编号3所示序列互补的序列。8. -种载体，该载体包含根据权利要求6或7所述的核酸分子。9. 一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据权利要求6或7所述的重组核酸分子。10. 根据权利要求9所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种酵母、细菌或其他微生 物，或是哺乳动物、植物或其他细胞的培养物。11. 根据权利要求10所述的宿主细胞，其中该宿主细胞为大肠杆菌。12. 根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白制造的阿洛酮糖。13. -种制造阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括在可将果糖基质转化成阿洛酮糖的条 件下将根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白与果糖基质接触。14. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，该蛋白存在于宿主细胞中。15. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，该蛋白呈分离形式。16. 根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中该条件包括将蛋白和果糖基质保 持在25°C至75°C之间。17. 根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中该条件包括将蛋白和果糖基质保 持在pH4至pH10之间。18. 根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中该条件包括将果糖基质的浓度保 持在75%至95% (重量/体积）之间。19. 一种核酸分子，所述核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列的特征在于： (i)与编号5、编号1或编号3的序列具有至少70%的序列同一性；或 (ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，所述多核苷酸具有与编号5、编号1 或编号3所示序列互补的序列。20. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含重组核酸分子，该核酸分子包含多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽，该多核苷酸序列其特征在于： (i)与编号5、编号1或编号3的序列具有至少70%的序列同一性；或 (ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1或 编号3所示序列互补的序列。21. -种载体，所述载体包含核酸分子，该核酸分子包含多核苷酸，该多核苷酸编码具 有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽，其中该多核苷酸序列的特征在于： (i)与编号5、编号1或编号3的序列具有至少70%的序列同一性；或 (ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1或 编号3所示序列互补的序列。22. -种制造阿洛酮糖的方法，该方法包括以下步骤： (i)提供一种包含核酸分子的载体，该核酸分子具有多核苷酸序列，该多核苷酸序列 编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白，其中该多核苷酸序列的特征在于：(a)与编号5、 编号1或编号3的序列具有至少70%的序列同一性；或（b)在高度严谨条件下杂交得到多 核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1或编号3所示序列互补的序列； (ii)合成具有酮糖-3-差向异构酶活性并被多核苷酸序列编码的蛋白； (iii) 将果糖与具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白接触，并将果糖和蛋白保持在可将 果糖转化成阿洛酮糖的条件下；以及 (iv) 至少对步骤（iii)所制造的阿洛酮糖进行部分纯化。
【专利摘要】一种包含多肽序列的蛋白，该多肽序列与编号6、编号2或编号4的序列具有至少70％的序列同一性。该蛋白具有酮糖-3-差向异构酶活性。
【IPC分类】C12P19/02, C12P19/24, C12N9/90
【公开号】CN104903457
【申请号】CN201380050744
【发明人】R·D·伍德耶尔, R·W·阿门特劳特
【申请人】泰特&莱尔组分美国公司, 塔特和莱利技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年9月27日
【公告号】CA2886514A1, EP2900827A1, US20150210996, WO2014049373A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白，以及一种编码所述蛋白的 核酸分子。本发明还涉及一种载体和一种含所述核酸分子的宿主细胞。本发明还涉及一种 用所述蛋白合成阿洛酮糖的方法，以及按这种方式制造的阿洛酮糖。
【背景技术】
[0002] 阿洛酮糖是一种"零热量"甜味剂，并有认为与葡萄糖类似的甜度。其还具有类似 于其他醣类的填充和褐变属性。阿洛酮糖的主要目标市场是食品和饮料制造商，在其产品 中，目前所用为葡萄糖、果糖或高果糖浆，而且正寻求显著减少热量却不显著改变糖成分所 赋予的其他属性，如：填充作用、褐变、质地和甜度。
[0003] 在美国，阿洛酮糖并非通常认为是安全（GRAS)的物质，但目前有一项待定的GRAS 通知（GRN400)。阿洛酮糖存在于加工甘蔗和甜菜糖蜜、经蒸汽处理的咖啡、小麦植物产品 和高果糖玉米糖浆。阿洛酮糖的典型日总摄入量估计为每天0.2克以上。D-阿洛酮糖是 D-果糖的C-3差向异构体，而阿洛酮糖和果糖结构的差异使得阿洛酮糖不能被人体代谢， 因而其热量为零。由于阿洛酮糖不含热量，因此，认为其是一种有前途的候选甜味填充剂， 而且，据称在具有甜味的同时还能保持与典型单糖相似的性质。
[0004] 酮糖-3-差向异构酶可使果糖和阿洛酮糖互相转化。号为8030035的美国专利和 公布号为W02011/040708的PCT公开了可将来自农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)并 具阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白与D-果糖反应，从而制造D-阿洛酮糖（阿洛酮糖 的另一名称）。
[0005][0006] 号为100832339的韩国专利公开了一种中华根瘤菌（Sinorhizobium)YB-58菌株， 该菌株能够将果糖转化成阿洛酮糖，并公开了一种用中华根瘤菌YB-58菌株的真菌体制造 阿洛酮糖的方法。
[0007] 号为1020090098938的韩国专利申请公开了一种用大肠杆菌制造阿洛酮糖的方 法，其中，大肠杆菌是表达一种编码阿洛酮糖-3异构酶的多核苷酸。
[0008] 本发明的目的是改进阿洛酮糖的现有制备技术。本发明的目的是提供一种酮 糖-3-差向异构酶，其在全细胞系统中的转化率和体积产率高于之前报导的。
【发明内容】
[0009] 本发明源于对三种酮糖-3-差向异构酶的鉴别及表征，其示例性氨基酸序列分别 示于编号2、4和6的序列。可用该酮糖-3-差向异构酶将果糖转化成阿洛酮糖。之前已将 这些蛋白确定为假想蛋白，或确定为具有塔格糖异构酶活性。然而，本发明人现惊奇地发现 这些酶有阿洛酮糖-3-差向异构酶活性。
[0010] 本发明的第一方面提供一种含多肽序列的蛋白，该序列与编号2的序列、编号4的 序列或编号6的序列有至少70%的序列同一性，其特征在于，所述蛋白具有酮糖-3-差向异 构酶活性。
[0011] 方便而言，该多肽序列与编号2的序列，编号4的序列或编号6的序列有至少 80%、90%、95%或99%的序列同一性，或有100%的序列同一性。
[0012] 优选地，该多肽序列含编号13的序列。
[0013] 优选地，该蛋白固定于固体基质。
[0014] 本发明的第二方面提供一种本发明第一方面的蛋白用于合成阿洛酮糖的用途。
[0015] 本发明的第三方面提供一种核酸分子，该核酸分子包含编码本发明第一方面所述 蛋白的多核苷酸序列。
[0016] 优选地，该核酸分子包含多核苷酸序列，其中：
[0017] i)该多核苷酸序列与编号5、编号1或编号3的序列有至少70%、80%、90%、95% 或99%的序列同一性，或是100%的序列同一性；或
[0018] ii)该多核苷酸序列在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有 与编号5、编号1或编号3所不序列互补的序列。
[0019] 本发明的第四方面提供一种载体，其特征在于载体包含本发明第三方面所述的核 酸分子。
[0020] 本发明的第五方面提供一种宿主细胞，其特征在于宿主细胞包含本发明第三方面 所述的重组核酸分子。
[0021] 方便而言，该宿主细胞是一种酵母、细菌或其他微生物，或一种哺乳动物、植物或 其他细胞的培养物。
[0022] 优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。
[0023] 本发明的第六方面提供一种由本发明第一方面所述蛋白制造的阿洛酮糖。
[0024] 本发明的第七方面提供一种制造阿洛酮糖的方法，包括：
[0025] i)提供本发明第一方面所述的蛋白；并
[0026] ii)在可将果糖基质转化为阿洛酮糖的条件下将蛋白与果糖基质接触。本发明亦 提供一种制造阿洛酮糖的方法，所述方法包括：在可将果糖基质转化为阿洛酮糖的条件下， 将本发明第一方面所述蛋白与果糖基质接触。
[0027] 优选地，所述蛋白存在于宿主细胞中。
[0028] 可选地，该蛋白呈分离形式。
[0029] 为方便起见，这些条件包括将蛋白与果糖基质保持在25°C至75°C之间，优选保持 在50°C至60°C之间，更优选保持在52°C至55°C之间，更优选为55°C。
[0030] 优选地，所述条件包括将蛋白和果糖基质保持在pH4至pH10之间。
[0031] 优选地，所述条件包括将果糖基质浓度保持在75%至95% (W/V)之间。
[0032] 本发明的第八方面提供一种含多核苷酸序列的核酸分子，其中：
[0033] i)所述多核苷酸序列与编号5、编号1或编号3的序列有至少70%的序列同一,性； 或
[0034]ii)所述多核苷酸序列在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，其具有与编号 5、编号1或编号3所示序列互补的序列。
[0035] 该核酸分子编码一种具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽。如本发明的一方面所 述，该核酸分子可呈分离形式。
[0036] 本发明的第九方面提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含重组核酸分子，所述核酸 分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽，其 中该多核苷酸序列的特征在于：
[0037] i)与编号5、编号1或编号3的序列有至少70%的序列同一性；或
[0038] ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1 或编号3所示序列互补的序列。
[0039] 本发明的第十方面提供一种载体，所述载体包含核酸分子，所述核酸分子包含多 核苷酸，所述多核苷酸编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽，其中该多核苷酸序列的 特征在于：
[0040] i)与编号5、编号1或编号3的序列有至少70%的序列同一,性；或
[0041] ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，所述多核苷酸具有与编号5、编号 1或编号3所示序列互补的序列。
[0042] 本发明的第十一方面提供一种制备阿洛酮糖的方法，该方法包括下列步骤：
[0043] i)提供一种包含核酸分子的载体，所述核酸分子具有多核苷酸序列，所述多核苷 酸序列编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白，其中该多核苷酸序列的特征在于：a)与 编号5、编号1或编号3的序列有至少70%的序列同一性，或b)在高度严谨条件下杂交得 到一种多核苷酸，所述多核苷酸具有与编号5、编号1或编号3所示序列互补的序列；
[0044] ii)合成具有酮糖-3-差向异构酶活性并被多核苷酸序列编码的蛋白；
[0045] iii)将果糖与具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白接触，并将果糖和蛋白保持在 可将果糖转化成阿洛酮糖的条件下；并
[0046] iv)至少对步骤iii)制造的阿洛酮糖进行部分纯化。
[0047] 在本文中，术语"多肽"、"肽"和"蛋白"可互换使用，用以指代氨基酸残基聚合物。 这些术语亦适用于一个或多个氨基酸残基经修饰或残基非天然存在的氨基酸聚合物，例如 天然存在氨基酸及天然存在氨基酸酸聚合物的相应人工化学模拟物。多肽未必呈"分离"形 式，即未必处于天然存在时其周围组分之外。
[0048] 本文所用术语"氨基酸"指天然存在和合成的氨基酸，以及具有与天然存在的氨基 酸功能类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸指由遗传密码编码的氨基 酸，以及在细胞中翻译后经修饰的氨基酸（例如：羟基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、0-磷酸丝氨 酸）。短语"氨基酸类似物"指与天然存在的氨基酸基本化学结构U碳与氢、羧基、氨基、 R基团结合）相同，但有一个经修饰的R基团或经修饰的骨干（如丝氨酸、亮氨酸、蛋氨酸亚 砜、蛋氨酸甲基锍）的化合物。短语"氨基酸模拟物"指一类与天然存在的氨基酸结构不同 但有类似功能的化合物。应当理解为：由于遗传密码的简并性，编码特定多肽的核酸分子可 能会具有一系列多核苷酸序列。例如：密码子GCA、GCC、GCG和GCT都编码丙氨酸这种氨基 酸。
[0049]使用BLASTP算法第 2.2.2 版（Altschul，StephenF.，ThomasL.Madden，AlejandroA.Schaffer,JinghuiZhang，ZhengZhang，WebbMiller，andDavid J.Lipman(1997)， "GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofprotein databasesearchprograms"，NucleicAcidsRes. 25:3389-3402)及默认参数，可确定两 个序列的百分比"同一性"。尤其是，可用URLhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/访问 互联网进行BLAST算法评价。
[0050] 本文所用术语"酮糖-3-差向异构酶活性"指一种能催化酮糖的立体化学转化，特 别是果糖向阿洛酮糖的转化的酶。例如，在一个实施例中，"酮糖-3-差向异构酶活性"指与 相同条件下不含酶的反应混合物相比，所加每毫克酶（〇. 1单位/毫克）使果糖与阿洛酮糖 的互变率增加至少10微摩尔/分钟的能力。在其他实施例中，认为使果糖与阿洛酮糖的互 变率增加至少〇. 05单位/毫克或0. 2单位/毫克即具有"酮糖-3-差向异构酶活性"。以下 提供了一种测定酶使D-果糖向阿洛酮糖转化的活性的适宜方法。将 含1毫升D-果糖（50 克/升）、Tris-HCL缓冲液（50mM，pH8. 0)，以及0. 5yM酶的反应混合物在55°C培养2分 钟。在10分钟后通过煮沸来停止反应。用高效液相色谱法（HPLC)测定所得D-阿洛酮糖 量。将一个酶活性单位定义为在pH8. 0及55°C条件下每分钟催化形成1ymolD-阿洛酮 糖的酶量（J.Agric.FoodChem. 2011，59, 7785-7792)。
[0051] 术语"基因"、"多核苷酸"和"核酸分子"在本文中可互换使用，用于指代多核苷酸 聚合物。核酸分子可能会含有天然存在的核酸（DNA或RNA)，或包含人工核酸，例如：肽核 酸、吗啉和锁核酸以及乙二醇核酸和苏糖核酸。
[0052] 本文所用术语"核苷酸"指天然存在的核苷酸，以及可被细胞酶识别的合成核苷酸 类似物。
[0053] 本文所用术语"载体"指含一种核酸分子的任何天然或人工构建，其中，核酸分子 可被细胞转录酶和/或翻译酶催化。示例载体包括：质粒、病毒（包括噬菌体）、粘粒、人工 染色体或转座子。
[0054] 本文所用术语"宿主细胞"指任何可在培养基中培养并用于表达重组基因的生物 细胞。这些宿主细胞可以是真核或原核细胞，也可以是微生物如细菌细胞，或者可以是来源 于一个细胞系的细胞（如哺乳动物永生细胞系）。
[0055] 本文所用术语"高度严谨的条件"在指杂交条件时，指：在65°C条件下至少约6倍 SSC和1%SDS，在约42°C用在0? 1倍SSC中配制的约20% (体积/体积）甲酰胺首次洗涤 10分钟，随后在65°C条件下用0. 2倍SSC和0. 1%SDS洗涤。在诸如本说明书所述的高度 严谨条件下，使用公知的核酸作为探针的杂交技术将识别结构相似的核酸，这是本领域的 公知技术。
[0056] 本文所用术语"阿洛酮糖"指具有式（I)所示结构的单糖。其亦称为"D-阿洛酮 糖"。
[0057]
[0058] 本文所用术语"果糖"指具有式（II)所示结构的单糖。果糖基质实例包括但不限 于结晶果糖和结晶果糖糖蜜。本文所用术语"结晶果糖糖蜜"指果糖从结晶母液的非结晶 部分结晶期间产生的工艺流体。
[0059]
[0060] 本文所用术语"重组"指位于非天然发生的环境，并经人工干预而制备的核酸分子 或多肽。重组多肽的例子包括，从其他多肽中分离的第一多肽，或是经肽键连结到第二多肽 序列的第一多肽，而其中所述第二多肽的氨基酸序列与第一多肽在自然界中相关联的任何 多肽不同。
【附图说明】
[0061] 图1所示为如本发明的实施例，由闪烁梭菌（Clostridiumscindens)所得酮 糖-3-差向异构酶的氨基酸序列（序列编号2)。
[0062] 图2所示为如本发明的另一实施例，由海氏梭菌（Clostridiumhylemonae)所得 酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列（序列编号4)。
[0063] 图3所示为如本发明的又一实施例，由Desmosporasp.所得酮糖-3-差向异构酶 的氨基酸序列（序列编号6)。
[0064] 图4所示为由解纤维素梭菌（Clostridiumcelluloyticum)所得的先前已知木糖 异构酶的氨基酸序列（序列编号8)。
[0065] 图5示出了由图1至图3所示的三个酮糖-3-差向异构酶和之前已知的三个酮 糖-3-差向异构酶的序列对比，并突出显示完整保留的残基。
[0066]图6所示为经转化的大肠杆菌使果糖转化为阿洛酮糖的转化率曲线，其中大肠杆 菌的转化为表达本发明实施例所述一种酶和一种对照。
[0067] 图7所示为编码图4所示氨基酸序列并经优化的基因序列（序列编号7)，以及经 优化序列与原始序列的比较。
[0068] 图8所示为编码图3所示氨基酸序列并经优化的基因序列（序列编号5)，以及经 优化序列与原始序列的比较。
[0069] 图9所示为编码图1所示氨基酸序列并经优化的基因序列（序列编号1)，以及经 优化序列与原始序列的比较。
[0070]图10所示为编码图2所示氨基酸序列并经优化的基因序列（序列编号3)，以及经 优化序列与原始序列的比较。
[0071] 图11所示为经转化的大肠杆菌使果糖基质转化为阿洛酮糖的转化制备图，大肠 杆菌的转化为以18升的规模表达本发明实施例所述一种酶（由Desmosporasp所得酮 糖_3_差向异构酶）。
[0072] 图12所示为以本发明实施例的酶（CHP3E、CSP3E和DSP3E)和一种已知酮 糖-3-差向异构酶（CCP3E)催化的阿洛酮糖转化率曲线图。
[0073] 图13所示为在填充A568树脂的30毫升固定床反应器中以DSP3E催化的阿洛酮 糖转化率曲线图。
[0074] 图14所示为在填充A568树脂的300毫升固定床反应器中以DSP3E催化的阿洛 酮糖转化率曲线图。
[0075] 图15所示为由Desmosporasp.所得的天然存在的酮糖-3-差向异构酶其一种人 工变体的氨基酸序列（序列编号13)。
[0076] 序列清单之简要说明
[0077] 序列编号1所示为编码由闪烁梭菌所得的酮糖-3-差向异构酶的基因序列（为在 大肠杆菌中表达而优化）。
[0078] 序列编号2所示为由编号1的基因序列所编码酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序 列。
[0079] 序列编号3所示为编码由海氏梭菌所得的酮糖-3-差向异构酶的基因序列（为在 大肠杆菌中表达而优化）。
[0080] 序列编号4所示为由编号3的基因序列所编码酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序 列。
[0081] 序列编号5所示为编码由Desmosporasp. 8437所得酮糖-3-差向异构酶的基因 序列（为在大肠杆菌中表达而优化）。
[0082] 序列编号6所示为由编号5的基因序列所编码酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序 列。
[0083] 序列编号7所示为编码由解纤维素梭菌所得酮糖-3-差向异构酶的基因序列（为 在大肠杆菌中表达而优化）。
[0084] 序列编号8所示为由编号7的基因序列所编码酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序 列。
[0085] 序列编号9所示为编码由闪烁梭菌所得酮糖-3-差向异构酶的天然存在基因序 列。
[0086] 序列编号10所不为编码由海氏梭菌所得酮糖-3-差向异构酶的天然存在基因序 列。
[0087] 序列编号11所示为编码由Desmosporasp. 8437所得酮糖-3-差向异构酶的天然 存在基因序列。
[0088] 序列编号12所示为编码由解纤维素梭菌所得酮糖-3-差向异构酶的天然存在基 因序列。
[0089] 序列编号13所示为Desmosporasp. 8437的酮糖-3-差向异构酶其人工变体的氨 基酸序列。
【具体实施方式】
[0090] 总体而言，本发明涉及一种包含多肽的蛋白，所述多肽具有序列编号2、4或6所示 的氨基酸序列。序列编号2、4、6的多肽的源生物如表1所示。
[0091] 表 1
[0092] L/1N丄 I n ^ 1/丄djy、
[0093] 然而，在其他实施例中，该多肽序列与序列编号2、4、6所示并不完全相同，但与其 有至少70 %的序列同一性。优选地，该多肽序列与序列编号2、4或6有至少80 %、90 %、 95%或99%的序列同一性，或100%的序列同一性。
[0094] 例如，在一个实施例中，多肽序列包括序列编号13的序列，其与编号6的序列有 89%的序列同一性。该多肽序列具有酮糖-3-差向异构酶活性。
[0095] 因此，在一些实施例中，将肽的一个或多个氨基酸删除，或是用不同氨基酸取代， 优选用相似的氨基酸取代。相似的氨基酸为侧链部分有相关属性的氨基酸，而天然存在的 氨基酸可分为下列基团。具有碱性侧链的基团：赖氨酸、精氨酸、组氨酸。具有酸性侧链至 基团：天门冬氨酸和谷氨酸。具有不带电荷极性侧链的基团：天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏 氨酸和酪氨酸。具有非极性侧链的基团：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸和半胱氨酸。因此，优选取代具有此等基团的氨基酸。
[0096] -般优选多肽与天然存在多肽（尽管其也可体外合成）的化学性质相符，但在其 他一些实施例中，多肽为拟肽类，也即以非自然发生的方式修饰的多肽。此等拟肽类包括用 合成的氨基酸取代天然存在的氨基酸和/或修饰多肽的主链。例如，在一些实施例中，肽键 为反向肽键所取代，以生成一个向后反转的拟肽（参见本文所含参考文件M6zi6re等人，J Immunol. 19970ct1;159(7):3230-7)。另外，氨基酸经共价键而非肽键相连，但形成聚合 物链的氨基酸残基保持其间距和取向。
[0097] 本发明中所有这类修饰及未修饰多肽都具有酮糖-3-差向异构酶的聚合酶活性。 也即经纯化或在宿主细胞中表达的蛋白能催化果糖向阿洛酮糖的转化。检验酮糖-3-差向 异构酶活性的适宜条件如实施例1所示。
[0098] 本发明的多肽可包含于一个完整细胞内，或为经分离的蛋白、经部分纯化的蛋白， 或经固定的蛋白。蛋白纯化可经标准的方法，如细胞破碎和过滤。其他标准方法亦为本技 术领域技术人员所知。
[0099] 本发明的实施例提供了一种包含多核苷酸序列的核酸分子，所述多核苷酸序列编 码一种蛋白，所述蛋白的氣基酸序列与序列编号2、4或6的序列有至少70%的序列同一性， 所述蛋白具有酮糖-3-差向异构酶活性。例如，在一个实施方案中，核酸分子所含序列编码 编号13的多肽序列。
[0100] 除特别编码本发明所述蛋白的序列外，核酸分子可包含其他序列，例如引物位点、 转录因子结合位点、载体的插入位点和抗溶核降解的序列（例如：多聚腺苷尾）。所述核酸 分子可为DNA或RNA，并可包括合成的核苷酸，前提是多核苷酸仍能被翻译用于合成本发明 的蛋白。
[0101] 如上所述，本发明的蛋白的氨基酸序列可以不同于本文所公开的特定序列。在优 选实施方案中，所述核酸分子包含具有序列编号1、3或5的序列的多核苷酸，所述多核苷酸 在大肠杆菌宿主细胞中表达而经优化。在其他实施例中，所述多核苷酸序列与编号1、3或5 之中任一序列有至少70%的序列同一性，并编码具有酮糖... -3-差向异构酶活性的蛋白。优 选地，该多肽序列与编号1、3或5之中一个序列有至少80%、90%、95%或99%的序列同一 性，或100 %的序列同一,性。在其他实施例中，核酸分子包含一种多核苷酸序列，所述多核苷 酸序列在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，其具有与编号1、3、5所示序列互补的序 列，并编码具有酮糖-3-异构酶活性的蛋白。在一些实施例中，提供了一种核酸分子，其所 包含具有编号9、10或11的序列的多核苷酸，所述多核苷酸是酶的天然存在的序列。
[0102] 在一些实施例中，所述核酸分子为载体（如质粒）的组成部分。除上述核酸序列 外，该质粒亦包含其他元素，例如原核覆制起点（例如大肠杆菌0R1复制起点）、自主复制序 列、着丝粒序列；位于核酸序列上游的启动子序列、位于核酸序列下游的终止子序列、抗生 素抗性基因和/或分泌信号序列。包含自主复制序列的载体亦为酵母人工染色体。
[0103] 在其他一些实施例中，载体为病毒，如噬菌体，而且除包括本发明的核酸序列外， 还包括用于噬菌体复制的核酸序列，如结构蛋白、启动子、转录启动子等。
[0104] 本发明的核酸分子可用于转染或转化宿主细胞，以便合成本发明的蛋白。适宜的 宿主细胞包括原核细胞如大肠杆菌，以及真核细胞如酵母细胞，或哺乳动物或植物细胞系。 宿主细胞的转染或转化是使用本领域的公知技术，如电穿孔、磷酸钙基方法、基因枪技术， 或使用病毒载体。
[0105] 本发明的核酸分子转染后，再根据需要转录和翻译。在一些实施例中，可将合成的 蛋白保持在宿主细胞中，随后可使用重组宿主细胞的培养物。在其他实施例中，例如由于载 体中存在分泌信号而将合成的蛋白从细胞中分泌出来，或裂解宿主细胞并纯化所得蛋白， 以这些方法将合成的蛋白从宿主细胞中提取出来。
[0106] 用本发明的蛋白催化果糖向阿洛酮糖的转化。在一些实施例中，该蛋白存在于宿 主细胞中，并以1至1000克/升的浓度在适当条件（如从25°c至75°C的培养温度，从4至 10的pH值）下，与果糖基质如用硼酸盐缓冲的果糖基质混合，以形成转化混合物。转化混 合物也可包含溶剂和其他可选共溶剂（除水外）例如乙醇、甲苯和甲醇。果糖基质也可包 含其他糖，如葡萄糖或蔗糖。所述蛋白可催化果糖基质向阿洛酮糖的转化。实际上，转化混 合物中所有果糖并非都转化为阿洛酮糖，因此通常随后有一个提取阿洛酮糖及经蒸发和结 晶而纯化的步骤。该混合物中剩余的果糖可经酵母发酵而去除。
[0107] 在其他实施例中，本发明的蛋白以经纯化的形式提供，并与果糖基质及适宜溶剂 一起混合，用于在体外完全转化。在一个实施例中，条件为pH4至10,温度30°C至70°C，果 糖浓度为10%至95% (重量/体积），溶剂为水。果糖的可选浓度范围包括但不限于20% 至95%、30%至95%、40%至95%、50%至95%、60%至95%、70%至95%、75%至95%。 特别优选的果糖基质浓度范围为70%至95%之间。在其他优选实施方案中，果糖浓度为 75%至 95%。
[0108] 酮糖的转化反应通常使用1%至60% (重量/体积），优选约5%至50%的基质浓 度。本发明的特别优点在于，可采用常规操作条件但高于以往的果糖浓度，将蛋白用于酮糖 转化反应。因此，用本发明的蛋白可能达到较大的体积产率。
[0109] 在一些实施例中，本发明的蛋白固定于固相基质。其优点在于，这种酶的使用寿命 更长，可填装到小固定床反应器中，而且对污染物及过程条件的波动有更大的耐受性。示 例的固体基质包括离子交换树脂和聚合物封装。在一些实施例中，本发明的蛋白固定于 DuoliteA568树脂。在一些实施例中，用弱碱性离子交换（即基于蛋白电荷与基质诸如树 脂电荷的静电相互作用）将本发明的蛋白固定于一种基质。在其他实施例中，将蛋白非特 异性结合至基质诸如树脂的多孔区域，从而将其固定。
[0110] 在另一个实施例中，本发明涉及一种制造阿洛酮糖的方法。该方法包括以下步骤。
[0111] 1)提供一种包含核酸分子的载体，所述核酸分子与编号1、编号3或编号5的序列 有至少70%的序列同一性。
[0112] 2)用所述载体转化感受态宿主细胞。
[0113] 3)可选地，培养所转化的宿主细胞。
[0114] 4)将所转化的细胞与果糖基质混合并保持在可将果糖转化为阿洛酮糖的条件下。
[0115] 5)用本领域的标准方法如蒸发和结晶，纯化所得阿洛酮糖。
[0116] 在其他实施例中省略了步骤4)。取而代之，将所述核酸分子编码的蛋白从经转化 的宿主细胞中分离出来，并可选地将其固定于基质。然后将所述蛋白与果糖基质混合并保 持在可将果糖转化为阿洛酮糖的条件下。然后执行步骤5)。在其他实施例中，省略了步骤 2)，并且蛋白亦由体外翻译而合成。接着将蛋白分离并与果糖基质混合。
[0117] 以本发明所述方法制造的阿洛酮糖可用于供人和/或动物消费的产品。在一些实 施例中，产品可能是食品、饮料、药品、营养产品、运动产品，或化妆品。例如，当该产品为食 品时，食品可选自糖果产品、甜食产品、谷类产品、焙烤食品、冷冻乳制品、肉类、乳制品、调 味品、点心棒、汤、酱、调配品、预制食品、婴儿食品、饮食制剂、糖楽?、食品涂料、干果、调料、 肉汁和果酱/果冻。在一些实施例中，所述食品会包含以本发明所述方法制造的阿洛酮糖， 作为产品表面的涂层或形成的粉霜。
[0118] 可选地，当该产品是一种饮料产品，该饮料产品可选自碳酸饮料、非碳酸饮料、水 果味饮料、果汁、茶、奶、咖啡和类似饮料。
[0119] 实施例
[0120]实施例1
[0121] 在本实施例中，宿主细胞经转化以表达三个假定酮糖-3-差向异构酶之一。将经 转化的宿主细胞与果糖基质共同培养，以测试其酮糖-3-差向异构酶活性。
[0122] 物赳
[0123] 1MpH8硼酸盐缓冲液：
[0124] i)将62克硼酸溶于1升去离子水
[0125] ii)用10M氢氧化钠溶液调到pH8
[0126] iii)保存在1升瓶中，再存放在4°C冰箱中
[0127] 用硼酸盐缓冲的果糖基质：
[0128] i)将970克液体果糖（77%DS)与50毫升pH8硼酸盐缓冲液混合
[0129] ii)加水至最终体积为1升
[0130] iii)用5M氢氧化钠溶液调节pH值至8
[0131] 表达培养基LB-4X2. 8升带挡板的摇瓶：
[0132] i)将10克胰胨、7克氯化钠和10克酵母溶于1升去离子水
[0133]ii)热压灭菌
[0134] 方法
[0135] 选择三种假定酮糖-3-差向异构酶基因序列和一种对照序列以通过Genscript USA合成构建。假定的酮糖-3-差向异构酶序列编码：
[0136] i)由闪烁梭菌ATCC 35704(登录号ZP_02432281)所得假定蛋白 CL0SCI_02526(序列编号2)
[0137] ii)由海氏梭菌DSM 15053(登录号ZP_03778576. 1)所得假定蛋白 CL0HYLEM_05645(序列编号4)
[0138] i i i)由Desmospora sp. 8437(登录号ZP_08466075)所得D-塔格糖3-异构酶（序 列编号6)。
[0139] 对照序列编码由解纤维素梭菌H10 (登录号YP_002505284)所得木糖异构酶蛋白 (序列编号8)。
[0140] 用为在大肠杆菌中表达而优化的序列（请参阅图7至图10)，对基因进行合成构 建，并将所得4个基因分别克隆到表达载体pET15b中。本领域技术人员所知微生物和表达 载体的其他组合预期同样表现出色。
[0141]用大肠杆菌BL21 (DE3)接种3毫升溶源性肉汤（LB)，并在37°C过夜使细菌增殖， 从而制备用于转化的感受态细胞。用这3毫升培养液接种300毫升LB，并在37°C振荡，使 细胞生长到0D(600)为0. 7至1. 0。用典型分光亮度计在600nm波长处测定1厘米比色皿 中的光密度（0D值）。将细胞放在冰上冷却10分钟，然后在4°C下以7500xg离心沉降15 分钟。倒出培养基，将细胞重新混悬于300毫升冷水。重复离心，再将细胞重新混悬于150 毫升冷水。再次重复离心，再将细胞混悬于约2毫升冷却的10%无菌甘油。如上述方法将 细胞离心沉降，再混悬于约2毫升冷却的10 %无菌甘油。将该混悬液按100y1等分分装到 无菌离心管中，并贮存在-80°C。
[0142] 随后，将Genscript供应的表达载体用于以电穿孔法转化感受态大肠杆菌 BL21 (DE3)，并在含氨苄西林的LB琼脂上选择阳性转化株。分别将1升LB倒入4个2. 8升 带挡板的烧瓶中并高压灭菌。冷却后，在无菌条件下向每个烧瓶中添加1毫升100毫克/ 升氨苄西林，再用2至3毫升上述制备的感受态细胞过夜培养物接种每个烧瓶（每个表达 菌株1个烧瓶）。使细胞在37°C200转/分条件下生长约3小时，以便0D达到0. 8至1. 5。 向每个烧瓶中添加1毫升新制1M异丙基--D-1-硫代半乳糖苷溶液中，将温度降至室温 (即25至30°C)，诱导反应继续进行约5小时。在4°C以约5000xg将细胞离心沉降30分 钟，倾出上清液。将细胞沉淀转移到已称重的50毫升离心管中，并记录细胞质量。将细胞 重新混悬于几毫升无菌甘油（10%重量/重量），并冷冻于_80°C。
[0143] 将全细胞与经硼酸盐缓冲的果糖基质混合，以DP1-4方法并使用钙2+色谱柱，用 高效液相色谱（HPLC)法进行分析，检查细胞的转化活性。将装有250毫升经硼酸盐缓冲的 果糖基质的4个烧瓶加热至55°C，并在室温下将冷冻细胞解冻。以6500xg对细胞进行离 心沉降，再重新混悬于去离子水。将2克（湿重）细胞与经硼酸盐缓冲的果糖基质混合，并 在55°C及90转/分搅拌条件下在1升带挡板的烧瓶中培养。在0、1、2和5小时采样进行 高效液相色谱分析。
[0144] 高效液相色谱分析包括将20微升0? 1 % (重量/体积）供试品注入色谱系统，用 水作为流动相，流速为〇. 1至1. 5毫升/分，固定相为粒径1至10微米的Ca2+形式的树脂， 柱温为80°C。以示差折光检测器对峰进行检测和定量，并基于已知标准品的保留时间进行 定 性归属。
[0145] 结果与讨论
[0146] 检出三种蛋白序列，测得均为酮糖-3-差向异构酶蛋白。这些蛋白的序列详见图 1至图3 (序列编号2、4、6)。用作对照者为由解纤维素梭菌H10所得木糖异构酶，先前已提 示该酶可用于由果糖制造阿洛酮糖。其氨基酸序列参见图4 (序列编号8)。
[0147] 将这些蛋白的氨基酸序列与其他已知酮糖-3-差向异构酶的序列对齐，对齐的序 列参见图5。突出显示完整保留的残基。这些序列之间仅有极少保守残基，相邻序列之间保 守残基不足65%。
[0148] 测定了编号2、4、6各序列与登录号NP_535228和BAA24429及序列编号8各序列 之间的序列同一性程度。结果示于表2。对于所选各蛋白序列，所得公知酮糖-3-差向异构 酶序列同一性为40%至63%。基于所有序列的序列比对，并没有整体较强的同源性。所选 蛋白具有经优化的基因，以便为综合构建并克隆于Genscript市售表达载体pET15b的大肠 杆菌所表达。对于每个构建，大肠杆菌BL21 (DE3)的转变取得了成功，并将各株的冷冻储备 物与表达载体一起保存。在1升规模进行了蛋白表达，并采收整个细胞作为粗催化剂。对 转化活性进行检查，并以图6提供了试验期间由4种不同试验株所制造的％DSB阿洛酮糖。
[0149]表 2
[0150]
[0151] 三个假定酮糖-3-差向异构酶均成功表达，而且全部都可将果糖成功转化为阿洛 酮糖，确认每个蛋白确实均为酮糖-3-差向异构酶。
[0152] 活性最强的蛋白为DS P3E(由Desmospora sp. 8437所得D-塔格糖3-差向异构 酶，序列编号6)，该蛋白能利用每升8克湿细胞重量在短短2小时内转化750克/升果糖溶 液的30%，体积产率为112克/升/小时。
[0153]实施例2
[0154] 在本实施例中，以18升规模采用了当前最佳细胞生长和转化条件，用以确定可放 大性，以及制造用于进一步感官和临床试验的阿洛酮糖。转化后，执行了一个初始的净化步 骤，用以去除果糖。本实施例旨在确定本过程的可放大性、放大的任何意外问题，以及可在 实验室中合理制造的阿洛酮糖量。
[0155]
[0156] 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)
[0157] 经过滤除菌的100毫克/毫升氨苄西林水溶液
[0158] 结晶果糖糖蜜
[0159]液体果糖（77 %DS)
[0160] 生长培养基：
[0161]i)将25克氯化钠、25克Staleydex'K 333、6克甘油、50克蛋白胨（Difco)、60克酵 母提取物（Difco)、8克磷酸氢二钾和8克磷酸二氢钾溶于6升去离子水
[0162]ii)用Tris碱（固体）调节pH值至~7. 8
[0163] iii)按每瓶1升装进6个带挡板的2. 8升烧瓶，瓶口包裹铝箔，再热压灭菌
[0164] 1MpH8Tris缓冲液：
[0165]iv)将121克溶于1升去离子水
[0166]iv)用盐酸调节pH值至8
[0167]iv)保存在1升瓶中，再存放在4°C冰箱中
[0168]方法
[0169] 分别按100微克/毫升向6份5毫升LB培养基中添加氨节西林，开始过夜培养， 进行细胞增殖。用大肠杆菌制造菌株（BL21-DE3pET15b-DS-P3E，表达序列编号6的蛋白） 接种培养物，并使其在37°C生长过夜（约16小时）。如上所述配制6升生长培养基并热压 灭菌，向每个烧瓶中添加5毫升过夜培养物，以190转/分在37°C下振荡4小时。新制1份 1M溶液，并按每升添加1毫升IPTG向每个烧瓶中添加ImMIPTG。降温至25°C，继续振荡 14至16小时。
[0170] 使用322型落地式离心机和1升瓶（灌装不超过800毫升培养基），以6000转/分 将培养物离心20分钟，以便收获细胞。将培养基倒入杀桶，再按体积比1 %添加漂白剂，静 置30分钟。对离心管称重，再按每克细胞3毫升向离心管中添加去离子水。使用抹刀和旋 涡振荡器将细胞重新混悬，直到形成均匀细胞浆料。将细胞悬液转移到40毫升离心管中， 并以6500xg重新离心沉降。将洗液倾析到杀桶中，将细胞重新混悬于相同体积的水中。
[0171] 用另外一批细胞重复细胞增殖和收获。
[0172] 将5加仑（18. 9升）桶装结晶果糖糖蜜加热至室温，并将16506克结晶果糖糖蜜加 入经消毒并带有18升校准刻度的5加仑（18. 9L)塑料桶中，配制结晶果糖糖蜜转化基质。 按如上所述配制900毫升1MpH8.OTris溶液，将其加入桶中，然后加水至18升校准标记， 再使用悬臂式搅拌器将其搅匀。将混合物和未使用的结晶果糖糖蜜退回冷藏室中贮存。
[0173] 在经消毒并带有18升校准标记的5加仑（18. 9升）塑料桶中，将17460克液体果 糖（77%DS)与500毫升1MpH8.OTris(如上制备）混合，制得液体果糖转化基质。加水 至18升校准标记，再使用悬臂式搅拌器将其搅匀。
[0174] 对于整个细胞转化，将所制造的18升结晶果糖糖蜜转化基质在水浴中加热至 55°C，再用悬臂式搅拌器以约150转/分轻轻搅拌。添加由细胞收获所得再混悬细胞糊，至 细胞湿重共100克。5小时后采样进行高效液相色谱分析。在4°C冷藏整个桶，以便将反应 停止。取一份样品进行大肠杆菌菌群和TPC微生物分析。
[0175] 用制造的18升液体果糖转化基质重复整个细胞转化过程。使用湿重为120克的 细胞，并在2小时和4小时采样进行高效液相色谱分析。
[0176] 以酵母发酵去除结晶果糖糖蜜转化基质中的果糖。用2倍体积水稀释结晶果糖糖 蜜转化产物，使54升总体积中阿洛酮糖和果糖值的合并最终浓度为~250克/升。将54 升稀释混合物分装到4个经消毒的5加仑（18.9升）桶中，每桶约装13升。将其中两个 桶保存在冰箱中。分别将其余两个桶设置为用悬臂式搅拌器剧烈搅拌，并用配备扩散器的 9升/分空气泵通气，以便得到约0. 3VVM的气流。向每个桶中添加120克面包活性干酵母 (Fleishman品牌），搅拌并通气2天（~36小时），不时采样进行DP1-4阿洛酮糖分析。将 桶转移到冷藏室过夜，使酵母沉降。然后取上清液，转移到两个新的洁净并经消毒的桶中， 将其余酵母部分转移到两个装有以上准备的冷藏结晶果糖糖蜜的桶中。重复搅拌及混合过 程中，然后去除酵母。在酵母发酵步骤之后，得到约45升上清液，并无菌过滤到3个清洁并 经消毒的桶中，然后贮存于4°C供后续处理。
[0177] 结果与讨论
[0178] 由12升培养物得到约220克此21(0￡3^￡1'-1513-03?3￡细胞，并分成2份用于上 述两个18升规模的生物转化。因此，对于结晶果糖糖蜜转化，全细胞生物催化剂总浓度为 5. 6克/升，对于液体果糖转化，为6. 7克/升。
[0179] 图11表明：这两种转化迅速达到~25%，以阿洛酮糖占阿洛酮糖+果糖的百分比 计。这略低于之前用这类细胞和类似转化介质在小规模达到的转化水平，但二者非常接近。 使用液体果糖基质时，短短2个小时后转化率就已达到22%。
[0180] 在各18升的转化规模，产出了约3. 3千克阿洛酮糖。两种基质之间似乎没有显著 差异。
[0181]从250毫升放大并未产生任何不可预见的问题，而且是按预期进行。
[0182] 微生物检查结果表明：没有活大肠杆菌，结果呈阴性，每克< 3个大肠菌群，总平 板计数为两个。因此，55°C的温度结合高DS比例的糖浆足以杀死全细胞生物催化剂。
[0183] 使用新发现的DSP3E酶，将果糖向阿洛酮糖的生物转化成功放大至18升。
[0184]实施例3
[0185] 采用pH控制进料分批培养方法及葡萄糖酵母提取物培养基，在发酵实验室中以 两个10升规模的发酵，制造了含新发现的DSP3E蛋白（编号6)的大肠杆菌菌株。发酵按 预期进行。
[0186] 在发酵批增长及补料分批阶段，细胞呈指数式增长，其倍增时间约为1小时。在约 5. 5小时中，葡萄糖浓度由约9克/升下降至< 1克/升（0D~28)。在产酶诱导期，0D继 续上升至约130,随后未观察到明显变化。经离心对发酵进行采收，得到4.5千克（10镑） 湿细胞糊，干细胞重约为1. 1千克（2. 5镑）。
[0187]用反渗透水将果糖基质（836千克，以DS(干固物）计）稀释至69%DS(920克/ 升），并加热到52°C，并将pH值调到7. 8。在整个反应过程中采用低速搅拌（约50转/分） 促进混合，并将整批4. 5千克（湿糊）以上所得表达全细胞加入反应，取1份0时样品。这 提供了 〇. 48克/升的生物催化剂负荷，与先前测试的实验室规模转化类似，然而，其基质浓 度较高，为920克/升。在4和16小时采样以高效液相色谱进行了分析。
[0188] 在反应期间未发现DS下降，而且没有生成生物制品。在16小时反应结束时，反应 进行到接近平衡，即约30%阿洛酮糖。在4小时时反应已经进行到转化18%。之前使用0. 5 克/升生物催化剂及750克/升基质（实施例1和实施例2)所得体积转化率是46克/升 *小时，或每单位生物催化剂92克/升*小时/克生物催化剂。在这里，采用较高的基质浓 度和略低的温度（52°C相对于55°C)，体积转化率为41克/升*小时或85克/升*小时/ 克生物催化剂（用4小时的数据点计算）。这表明异构酶反应具有相当大的灵活性。当在 16小时完成反应后，在28 : 72的阿洛酮糖：果糖混合物中有230千克阿洛酮糖。
[0189]实施例4
[0190] 在750克/升Tris缓冲的果糖基质上，对用4种不同酶（序列编号：2、4、6、8)进 行的果糖转化进行了比较。在16°C而不是25至30°C诱导细胞，而转化速率比以前的实验 慢。在500毫升带挡板的烧瓶中，向200毫升基质中添加湿重为2克的再混悬细胞，然后在 55°C及90转/分条件下培养。在2小时和3. 5小时米样进行高效液相色谱分析。结果参 见图12,其中，CCP3E对应于编号8的序列，CHP3E、CSP3E及DSP3E则分别对应于编号 4、2及6的序列。在该实验中，表达序列编号2、4、6或8所述蛋白的全部4株显不具有大致 相同的活性， 在3. 5小时将约5%基质转化为阿洛酮糖。
[0191]实施例5
[0192] 在本实施例中，使用固定化酶进行了制造阿洛酮糖的首次试验。本实施例的目的 在于提高酶利用率。
[0193] 物赳
[0194]Codexis制备的冻干酶粉末，批号：D13007或D13008
[0195] -Desmospora sp?阿洛酬糖_3_差向异构酶
[0196]DuoliteA568 (Doff)
[0197]AmberliteXAD2 (Sigma)
[0198] 1MTris缓冲液：
[0199]i)以1M的浓度溶于水而制备
[0200] ii)用盐酸将pH值调到8. 0
[0201] iii)使用前稀释至lOOmM
[0202] 结晶果糖糖蜜，80%干固物，其组成为：
[0203]i)90%DSB果糖
[0204]ii)7%DSB葡萄糖
[0205]iii)3%DP2+
[0206]iv)其他单糖
[0207]MnCl2 (Sigma)
[0208]方'法
[0209] 1)小规模固定化
[0210] 为了试验固定效率，在约30毫升容积（色谱柱尺寸为11毫米x300毫米）的夹 套柱中进行了小型固定床反应。用水对XAD2和A568树脂进行数次洗涤，以除去制造过程 的细小树脂颗粒（即树脂制备的副产物细树脂颗粒（即断裂/破碎颗粒））及任何残留物。 将2克冻干酶（即差向异构酶）溶于约50毫升水，并分成两等份。测定pH值，结果为6.5。 分别取各树脂约30毫升，在室温及轻微搅拌条件下与1份差向异构酶溶液一起培养约1小 时，然后将树脂填装到夹套柱中，再用蠕动泵经固定床将差向异构酶溶液循环2小时。然后 用10倍柱床体积的l〇〇mMpH8.OTris缓冲液洗涤柱子。在这个点，在A280进行分光亮度 法测定时，洗脱液澄清不含蛋白。用反渗透水将结晶果糖糖蜜稀释到60%DS，随后将pH调 至8. 0,然后添加28ppmMnClJPlOmMpH8.OTris缓冲液，以制备结晶果糖糖蜜进料。
[0211] 用循环水浴将夹套柱加热至57°C，并以8倍柱床体积/小时（BV/小时）的速率将 进料泵过30毫升固定床反应器。收集反应器洗脱液，用FT-IR进行分析，以便提供阿洛酮 糖和果糖的相对浓度。该过程共持续5天。在试生产过程中，将进料速率从8倍柱床体积 /小时调到6倍柱床体积/小时，以保持转化速率。
[0212] 2.放;.大.至300毫升固定床反.应器
[0213] 为了试验固定的放大效率，用约300毫升容积（色谱柱尺寸为25毫米x600毫米） 的夹套柱创建了较大的固定床反应器。用水对XAD2和A568树脂进行数次洗涤，以去除细 小颗粒和制造过程的任何残留物。将10克冻干差向异构酶溶于约100毫升水。将约300 毫升A568树脂填充于300毫升夹套柱，在室温下用蠕动泵经固定床将差向异构酶溶液循环 约2小时。然后，在室温下，用5倍柱床体积的100mMpH8.OTris缓冲液洗涤柱子。在这 个点，在A280进行分光亮度法测定时，洗脱液澄清不含蛋白。用反渗透水将结晶果糖糖蜜 稀释到60%DS，随后将pH调至8. 0,然后添加28ppmMnCljP10mMpH8.OTris缓冲液，以 制备结晶果糖糖蜜进料。用循环水浴将夹套柱加热至57°C，并以8倍柱床体积/小时（BV/ 小时）的速率将进料泵过30毫升固定床反应器。收集反应器洗脱液，用FT-IR进行分析， 以便提供阿洛酮糖和果糖的相对浓度。该过程共持续4天。在试生产过程中，将进料速率 从8倍柱床体积/小时调到2倍柱床体积/小时。另外，将该柱在室温下静置2周时间，然 后重新启动，以测定差向异构酶在柱贮存期间的稳定性。
[0214] 结果与讨论
[0215] 对于任何检查样品，30毫升柱及XAD2未出现显著转化，因此，未进行进一步分析。 然而，采用DowexA568则发现了显著转化。图13所示为30毫升固定床反应器及A568树 脂的反应时程。在仅含1克差向异构酶的120小时固定床转化期间，制造了超过4千克阿 洛酮糖。在120小时期间，百分转化逐渐降低，因此在72小时降低了经柱流量，用以补偿转 化率的降低。反应期间产生了近乎平衡的阿洛酮糖浓度。
[0216] 图14所示为使用A568树脂的300毫升反应过程。由于进料量受限（72小时内用 86升进料），在24小时降低了流量。在72小时内，由10克差向异构酶产生了超过20千克 阿洛酮糖。在72小时末，转化率仍然很高，虽然发现性能有所下降。
[0217] 先前已在烧瓶反应中确定差向异构酶在溶液中的稳定性。在53°C下8小时内损 失了超过90%的活性。在该实施例中，在57°C下进行了转化。较高温度的优势在于反应速 率、平衡比，以及微生物稳定性。在该实施例中，即使在120小时后，仍然保持了显著的差向 异构酶活性。
[0218] 在进料受限的大规模反应中，使用10克差向异构酶产出了20千克阿洛酮糖，所得 差向异构酶净投料比为0.05% (质量/质量）。在小规模反应中，使用1克差向异构酶产 出了 4. 8千克阿洛酮糖，所得差向异构酶净投料比为0.02% (质量/质量）。在标准果糖 制造中，尽管是在6至12个月的操作过程中，按0. 01 %至0. 005%的比例（质量/)使用了 固定化葡萄糖差向异构酶。
【主权项】
1. 一种包含多肽序列的蛋白，该多肽序列与编号6的序列、编号2的序列或编号4的序 列具有至少70%的序列同一性，其特征在于，该蛋白具有酮糖-3-差向异构酶活性。2. 根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，该多肽序列与编号6、编号2或编号4的 序列具有至少80%、90%、95%或99%的序列同一性，或100%的序列同一性。3. 根据权利要求1或2所述的蛋白，其特征在于，该多肽序列包含编号13的序列。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，其特征在于，该蛋白固定于固相基质。5. 如前述权利要求中任一项所述的蛋白用于合成阿洛酮糖的用途。6. -种核酸分子，所述核酸分子包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码权利要求1 至4中任一项所述的蛋白。7. 根据权利要求6所述的核酸分子，该核酸分子包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列 的特征在于： (i)与编号5、编号1或编号3的序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%的序列同 一性，或100 %的序列同一性；或 (ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1或 编号3所示序列互补的序列。8. -种载体，该载体包含根据权利要求6或7所述的核酸分子。9. 一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据权利要求6或7所述的重组核酸分子。10. 根据权利要求9所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种酵母、细菌或其他微生 物，或是哺乳动物、植物或其他细胞的培养物。11. 根据权利要求10所述的宿主细胞，其中该宿主细胞为大肠杆菌。12. 根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白制造的阿洛酮糖。13. -种制造阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括在可将果糖基质转化成阿洛酮糖的条 件下将根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白与果糖基质接触。14. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，该蛋白存在于宿主细胞中。15. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，该蛋白呈分离形式。16. 根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中该条件包括将蛋白和果糖基质保 持在25°C至75°C之间。17. 根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中该条件包括将蛋白和果糖基质保 持在pH4至pH10之间。18. 根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中该条件包括将果糖基质的浓度保 持在75%至95% (重量/体积）之间。19. 一种核酸分子，所述核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列的特征在于： (i)与编号5、编号1或编号3的序列具有至少70%的序列同一性；或 (ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，所述多核苷酸具有与编号5、编号1 或编号3所示序列互补的序列。20. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含重组核酸分子，该核酸分子包含多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽，该多核苷酸序列其特征在于： (i)与编号5、编号1或编号3的序列具有至少70%的序列同一性；或 (ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1或 编号3所示序列互补的序列。21. -种载体，所述载体包含核酸分子，该核酸分子包含多核苷酸，该多核苷酸编码具 有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽，其中该多核苷酸序列的特征在于： (i)与编号5、编号1或编号3的序列具有至少70%的序列同一性；或 (ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1或 编号3所示序列互补的序列。22. -种制造阿洛酮糖的方法，该方法包括以下步骤： (i)提供一种包含核酸分子的载体，该核酸分子具有多核苷酸序列，该多核苷酸序列 编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白，其中该多核苷酸序列的特征在于：(a)与编号5、 编号1或编号3的序列具有至少70%的序列同一性；或（b)在高度严谨条件下杂交得到多 核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1或编号3所示序列互补的序列； (ii)合成具有酮糖-3-差向异构酶活性并被多核苷酸序列编码的蛋白； (iii) 将果糖与具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白接触，并将果糖和蛋白保持在可将 果糖转化成阿洛酮糖的条件下；以及 (iv) 至少对步骤（iii)所制造的阿洛酮糖进行部分纯化。
【专利摘要】一种包含多肽序列的蛋白，该多肽序列与编号6、编号2或编号4的序列具有至少70％的序列同一性。该蛋白具有酮糖-3-差向异构酶活性。
【IPC分类】C12P19/02, C12P19/24, C12N9/90
【公开号】CN104903457
【申请号】CN201380050744
【发明人】R·D·伍德耶尔, R·W·阿门特劳特
【申请人】泰特&莱尔组分美国公司, 塔特和莱利技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年9月27日
【公告号】CA2886514A1, EP2900827A1, US20150210996, WO2014049373A1
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