测序方法
测序方法
【专利说明】测序方法
[0001] 本发明涉及用于确定多核苷酸中的核苷酸碱基的序列的方法，所述多核苷酸例如 来源于天然存在的DNA或RNA。
[0002] 由于测序的单位成本下降并且越来越快的测序机器进入市场，遗传物质的下一代 测序已经对生物科学整体并且特别是对医学产生了显著的影响。例如，我们同时待审的 申请WO 2009/030953公开了一种新型快速测序仪，其中特别是单链或双链多核苷酸样品 (例如，天然存在的RNA或DNA)中的核苷酸碱基或碱基对的序列通过将其转运通过纳米孔 基底而被读取，所述纳米孔基底设置有在纳米孔的出口内或附近并置的等离子体纳米结构 (plasmonic nanostructures)。在这种装置中，所述等离子体纳米结构限定检测窗（基本 上是电磁场），在其中每个核苷酸碱基（任选被标记的）又通过与入射光相互作用以特有方 式被诱导产生荧光或拉曼散射质子。然后，在远端、多路检测这样产生的质子，并转换成数 据流，其信息内容表征与所述多核苷酸相关的核苷酸碱基序列。然后，利用编程到与其集成 在一起或在与其相连的辅助计算装置中的微处理器中的相应软件实施的计算算法，可以从 所述数据流恢复所述序列。
[0003] 用于快速测序多核苷酸的另一种装置例如记述在US 6627067, US 6267872和US 6746594中。以其最简单的形式，所述装置利用电极，而不是等离子体纳米结构，来定义穿过 基底或在纳米孔中或周围的检测窗。然后，电势差穿过电极施加，并且作为时间的函数检测 其间流动的离子介质的电特性的变化，所述变化由多核苷酸和结合的电解质通过纳米孔电 泳转运所致。在所述装置中，由于多个个体核苷酸碱基通过所述检测窗，它们连续地阻塞和 开启所述检测窗，引起'阻塞事件'，这产生电流或流阻率的特征性波动。然后，利用这些波 动来产生适当的数据流，用于上文所述的分析。
[0004] 稳定的小滴流（droplet stream)，尤其是微滴流（microdroplet stream)的产 生，是已经用于分子生物学的另一个技术发展领域。例如，US7708949公开了一种用于在 油中产生稳定的水滴的新型微流体方法，而例如US2011/0250597描述利用这一技术来产 生微滴，所述微滴含有核酸模板（典型地是多核苷酸DNA或RNA片段）和多个引物对，其 允许利用聚合酶链式反应扩增所述模板。涉及这种方法和这一领域的其他专利申请通 常包括 US 2010/184020, US2012/0164633, US2012/0122714, US2011/0000560, US2010/01 376163, US2010/0022414 和 US2008/0003142。J. Molecular Diagnostics (分子诊断杂 志)14 (3) 233-246 (2012)记述了该微滴PCR法在鉴定与先天性肌营养不良症（congenital muscular dystrophy)相关的基因突变中的应用。
[0005] W02007/120240 和 J. Anal. Chem.(分析化学杂志）盤 8439-8447 (2011)分别描述 了表征核酸的基于小滴的方法，其涉及焦磷酸测序。
[0006] 类似地，在分析分子生物学中广泛应用典型地包含少于1000个核苷酸长的已知 序列顺序的单链寡核苷酸的生物探针。当探针与靶标的核苷酸碱基之间存在充分的序列互 补性时，此类探针典型地通过将其本身与靶标（例如，来源于天然存在的病原体的DNA的靶 标）连接而起作用。典型地，所述探针的核苷酸用可检测元件如放射性或荧光标记物进行 标记，以致当将探针用于处理据信其中或其上已经捕获有靶标的分析物溶液或基底时，通 过寻找和检测所述检测元件的特征性检测特性来显示所述靶标的存在或不存在。
[0007] -类这样的探针由在本领域中被称为'分子指示标（molecular beacons) '的物质 所代表，例如，如在W002/06531或US8211644中所述的。这些探针由单链寡核苷酸组成，所 述单链寡核苷酸实际上已经向回折叠于其自身上从而产生充当探针的传感器的剩余的单 链环和短茎，在所述茎中，邻近两个末端的核苷酸通过互补核苷酸碱基配对彼此结合；由此 产生双链区域。这种布置是高度紧张的，所述布置可以连接到发夹上，其中单链环连接到名 义上双链的寡核苷酸的同一末端的互补链。所述寡核苷酸的游离的3'和5'端（现在彼此 邻近并且在茎的远端）分别连接荧光团和猝灭剂。然后其几何学上的彼此接近确保不产生 显著的荧光。使用时，靶标与单链环结合，产生另外的应变，以致当加热所述探针时引起茎 解链，这使所述荧光团和猝灭剂远离，并且允许前者发出荧光。
[0008] 我们现在已经开发了确定多核苷酸样品中的核苷酸碱基的序列的新方法，该方法 不同于上述那些方法，并且其中来源于样品的在流中的包含个体单核苷酸的小滴（其顺序 对应于样品的核苷酸碱基对序列）在用特定的标记的生物探针处理后被查询。典型地，该 处理的结果是在每个小滴中产生与其中的核苷酸相关联的特定核苷酸碱基所特有的一个 或多个可检测元件。该方法的一个特征是使用新的生物探针，其中可检测元件基本上是不 可检测的，除非被一系列生化/酶反应特异性激活，所述生化/酶反应从所述探针释放处于 可检测状态的所述可检测元件中的一个或级联。
[0009]因此，根据本发明，提供一种用于确定多核苷酸分析物中的核苷酸碱基的序列的 方法，所述方法特征在于下述步骤：
[0010] a.产生小滴流，所述小滴中的至少一些包含单核苷酸，并且其中在所述小滴流中 单核苷酸的顺序对应于所述分析物中核苷酸的序列；
[0011] b.向每个小滴引入多个生物探针类型，每个类型（i)包含处于不可检测状态的不 同的可检测元件，并且（ii)适于捕获组成所述分析物的不同的互补的单核苷酸；
[0012] c.使包含在所述小滴中的单核苷酸与其互补的探针结合，以产生占用的探针；并 且
[0013] d.使所述可检测元件以可检测的状态从占用的探针释放。
[0014]在本发明的一个优选的实施方案中，每种生物探针包含单链核苷酸区，其末端连 接两个不同的双链寡核苷酸区，其中所述寡核苷酸区中的至少一个包含具有特征性检测特 性的可检测元件，并且其中所述可检测元件被这样布置在所述寡核苷酸区上，以致所述可 检测特性的可检测性比在相同数量的可检测元件结合到相应数量的单核苷酸时低。
[0015] 在一个优选的实施方案中，所述可检测元件包含荧光团，并且所述探针本身在用 于检测荧光团的那些波长基本上不发荧光。因此，尽管荧光团可能在电磁谱的大部分上表 现出普遍的、低水平的背景荧光，但是典型地存在其中荧光强度处于最大值的一个或少量 的特定波长或波长范围（wavelength envelopes)。在特征性检测所述焚光团的这些最大值 中的一个或多个，基本上应当不产生荧光。在本发明的情形中，术语'基本上不发荧光'或 等价的词语意指连接到探针的全部荧光团在相关特征性波长或波长范围的荧光强度不到 等量的游离荧光团的相应的荧光强度的25% ;优选不到10% ;更优选不到1%，并且最优选 不到0. 1%。
[0016] 原则上，可以使用任何方法确保在探针的未使用状态，所述荧光团基本上 不发出 荧光。一种方法是另外将猝灭剂与其紧邻地连接。另一种方法是基于这样的观察：当多个 荧光团彼此紧邻地连接到同一个探针上时，它们倾向于彼此充分猝灭，使得可以在不需要 猝灭剂的条件下实现前段所述的标准。在本专利的这种情形中，什么构成荧光团之间或荧 光团与猝灭剂之间的'紧邻'将取决于所用的特定的荧光团和猝灭剂，并且可能取决于寡核 苷酸区的结构特征。由此，意欲根据所需的结果解释该术语，而不是将其解释为在探针上的 任意特定的结构布置。然而，并且仅是为了提供示例的目的，要指出的是，当邻近的荧光团 或邻近的荧光团与猝灭剂分开的距离对应于特征性F6rster距离（典型地小于5nm)时，将 实现充分的猝灭。
[0017] 优选地，包含探针的寡核苷酸中的至少一个被标记以多至20个、优选多至10个并 且最优选多至5个荧光团。为了获得的最大的优点，优选地，寡核苷酸区中的至少一个被标 记以至少2个、优选至少3个荧光团。由此，本文特别预期由这些最大值和最小值的任意 置换构建的范围。如果使用猝灭剂，类似地，优选的是，所述探针被标记以多至20个、优选 多至10个、并且最优选多至5个猝灭剂。尽管预期探针可以连接多于一种类型的荧光团， 例如，为了给予其特征性的指纹，但是，优选的是连接到给定探针的所有探针都是相同类型 的。在一个实施方案中，所述荧光团和猝灭剂位于寡核苷酸区的不同链上，或在它们通过折 叠单链寡核苷酸前体产生的情况下，彼此相对。
[0018] 关于荧光团本身，它们原则上可以选自任意本领域中常规使用的那些，包括但不 限于咕吨结构部分，例如，荧光素，罗丹明及其衍生物如荧光素异硫氰酸酯，罗丹明B等；香 豆素结构部分（例如，羟基_、甲基-和氨基香豆素）和青色素结构部分如Cy2, Cy3, Cy5和 Cy7。具体的实例包括来源于下述常用染料的荧光团：Alexa染料，青色素染料，Atto Tec染 料和罗丹明染料。实例还包括：Atto 633(AIT0-TEC GmbH)，Texas Red，Atto 740(AIT0-TEC GmbH)，Rose Bengal，Alexa Fluor? 750 C5-马来醜亚胺（Invitrogen)，Alexa Fluor? 532 C2_ 马来酰亚胺（Invitrogen)和 Rhodamine Red C2-马来酰亚胺和 Rhodamine Green 以及 亚磷酰胺（phosphoramadite)染料如Quasar 570。备选地，可以使用量子点或近红外染料， 诸如LI-COR Biosciences所供应的那些。典型地利用本领域已知的化学方法经由核苷酸 碱基将荧光团连接到寡核苷酸。
[0019] 适当的猝灭剂包括通过F6rster共振能量转移（FRET)机制起作用的那些。可以结 合上文提及的荧光团使用的可商购的猝灭剂的实例包括但不限于DDQ_l，Dabcyl，Eclipse， Iowa Black FQ 和 RQ，IR Dye - QC1，BHQ-1，-2 和-3 以及 QSY-7 和-21〇
[0020] 单链核苷酸区仅由一个核苷酸组成，这使得所述探针对于具有互补核苷酸碱基的 游离的核苷酸的检测极具有选择性。实践中，对于DNA，这意味着该核苷酸区适合结合特征 性核苷酸碱基选自鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶的核苷酸，或者在RNA的情形中，选 自鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶的核苷酸。然而，如果有此需要，可以使用与其他核苷 酸碱基相对应的其他核苷酸（例如，组成其他合成的多核苷酸的那些）。因此，在对DNA或 RNA进行测序时，典型地将使用四种不同的探针的混合物，所述探针各自对不同的互补核苷 酸碱基具有选择性，并且各自使用不同的可检测元件。在优选的实施方案中，每种探针将具 有不同的可检测元件，例如，被标记以在不同的特征性波长或波长范围发荧光的不同的荧 光团。因此，在检测到特征性荧光时，可以唯一地识别核苷酸。
[0021] 来看双链寡核苷酸区，优选地，它们来源于或者可来源于两个寡核苷酸前体（各 自优选是闭环的），或通过以下方式来源于共同的单链寡核苷酸前体：将后者的两个末端 向后折叠于其自身上从而产生两个闭环寡核苷酸区，而中间的缺口构成单链核苷酸区。在 所有情形中，效果是相同的；邻近单链核苷酸区的末端的将是在双链寡核苷酸区的另一条 链上的3'和5'游离端，其可以与靶标的相应的5'和3'端连接。由此，使用所述探针包括 以下过程：通过连接到所述3'和5'端将单链核苷酸区连接到靶标单核苷酸，以产生沿着其 全长都是双链的占用的探针。
[0022] 适当地，所述双链寡核苷酸区的长度为多至50个核苷酸对，优选多至45个核苷酸 对，更优选在5-40个核苷酸对的范围内，并且最优选在10-30个核苷酸的范围内。可以使 用更长的寡核苷酸区，但是通过缠绕使得单核苷酸靶标接近所述核苷酸区可能受限的潜在 的风险使得该实施方案的吸引力潜在地减少。
[0023] 优选地，与所述寡核苷酸结合的所述可检测元件的位置远离所述单链核苷酸区。 当使用两个不连续的寡核苷酸时，优选地，所述可检测元件位于或簇集在或朝向其远离所 述核苷酸区的末端中的一个或两者。最后，优选地，至少一个寡核苷酸包含至少一个限制酶 识别位点，所述识别位点优选地邻近所述可检测元件位于或簇集的区域。这样的限制酶识 别位点典型地包含2-8个核苷酸对的特定序列。在本发明一个实施方案中，所述限制酶识 别位点通过将所述单核苷酸与所述核苷酸区结合而产生。
[0024] 优选地，用于本发明的方法的生物探针原则上可以通过本领域已知的任何核苷酸 组装方法制备，包括H-膦酸酯法，磷酸二酯合成，磷酸三酯合成和亚磷酸三酯合成。优选的 是使用核苷酸亚磷酰胺结构单元的方法，这是由于其反应性。在这些方法中，通过在包括去 封闭、偶联、封端和氧化的循环的四步法中在5'位置向生长的核苷酸链连续添加所选的核 苷酸亚磷酰胺而进行合成。该方法的循环性质使其特别适合自动化，并且用于进行该方法 的机器可以在市场上容易地得到。当要引入猝灭剂和/或荧光团时，在需要的点使用适当 标记的核苷酸亚磷酰胺。在最优选的实施方案中，利用亚磷酰胺法制备单链寡核苷酸前体， 所述前体通过快速加热和缓慢冷却的循环折叠成具有所需特征的探针。
[0025] 在本发明的方法的步骤（a)中，产生小滴流，所述小滴中的至少一些包含单核苷 酸。为了测序目的，重要的是，小滴流中的单核苷酸的顺序与分析物中核苷酸的序列相对 应。适当地，通过将单核苷酸严格按顺序引入到相应的空小滴流中来产生此种有序的小滴 流。这可以例如通过使水流通过这样的方案实现，在所述方案中，单核苷酸从分析物释放， 然后所述流通过小孔流出，成为不混溶的载体液的流。为了避免给定的小滴包含超过一个 单核苷酸的风险，优选地，以这样的速率将单核苷酸释放到水流中，以致每个填充的小滴被 1-20个（优选2-10个）空的小滴隔开。然后，使在载体中的填充的小滴的流沿着流动路 径（适当地，微流体流动路径）流动，流动的速率和方式使得小滴保持不连续的状态，并且 没有机会彼此聚结。在一个特别适合的实施方案的实例中，所述载体包含氟碳油（如3M Fluorinert FOiO)和亲氟表面活性剂（如Sphere Fluidics Picosurf 1)的混合物，并且 水性小滴包含水、甘油、离子盐和探针反应所需要的其他添加剂的混合物。优选地，微流体 流动路径用涂层或 表面修饰处理，这使得其具有疏水特性，由此防止微滴与其相互作用或 粘附在其上。更优选地，该表面修饰还是亲油的，并且导致在流动路径上形成载体的涂层， 并进一步使水性小滴与通道壁分离。适当地，所用的小滴具有小于100微米，优选地小于50 微米（例如，小于20微米），更优选地小于10微米并且甚至更优选地小于5微米的直径。 最优选地，它们的所有直径都在2-20微米的范围内。典型地，所述单核苷酸是来源于天然 存在的多核苷酸分析物，优选天然存在的DNA或RNA的那些。
[0026] 在所述方法的步骤（b)中，将多种生物探针（优选地多种上文所述的那些探针） 引入到各小滴中。优选地，检测所有分析物不同核苷酸所需的所有探针的混合物被引入 到各小滴中。其中最优选地，这些探针将各自具有与其连接的处于不可检测状态的多个 可检测元件和至少一个限制酶识别位点或其前体。可以通过以下方式将探针引入到小滴 中：混合两种流，在小滴生成之前但是在核苷酸释放之后，通过注射到小滴中，或通过优选 地使小滴流与第二小滴流（其中的各小滴包含探针混合物）在一起，在来自两种流的小滴 彼此聚结的条件下，以连续的方式，从而产生包含单核苷酸和探针二者的更大的小滴的第 三流。同时，优选地，向各小滴中引入聚合酶和/或连接酶；但是，如果需要如此，这些项目 也可以分开引入。一旦该引入已经发生，在步骤（3)中，使小滴中的单核苷酸与在探针混 合物中的其互补探针在依靠其他的情况下结合。在优选的实施方案中，通过以下方式使这 种结合顺序发生：首先使用聚合酶将单核苷酸的5'端与寡核苷酸的3'端结合，然后使用 连接酶将所述单核苷酸和寡核苷酸或其他寡核苷酸的其余的游离端连接在一起。可以使 用多种聚合酶和连接酶，包括但不限于来源于容易得到的细菌来源的那些，如噬菌体T4， 大肠杆菌（Escherichia Coli)和水生栖热菌（Thermus Aquaticus)(Taq)。优选地，该步 骤在过量探针存在下在水性介质中发生，适当地，靶标与探针的摩尔比在1:1-1:2000,优 选1:1-1:200,更优选1:2-1:50的范围内，1:20-1:50是最优选的。备选地，可以使用在 1:5-1:20范围内的比率。
[0027] 接下来，在步骤（d)中处理步骤（c)的产物，即，现在含有与其互补探针结合的单 核苷酸（以下称为占用的探针）和其他未反应的探针的小滴，以使在占用的探针上的可检 测元件以可检测状态释放到小滴介质中。这允许它们之后使用常规技术检测到。例如，当 探针中和占用的探针中的可检测元件是不发荧光的荧光团时，步骤（d)使得其以使其开始 充分发荧光的形式从后者（而不是前者或小滴中的其他探针类型）释放。然后，可以用常 规的光学或分光镜技术检测并测量每个小滴中这样产生的荧光，以提供初始分析物序列特 有的输出数据组或数据流。适当地，步骤（d)通过向小滴中引入（例如，通过注射或优选 地上述类型的第二聚结）限制酶（限制性内切核酸酶）和外切核酸酶而发生。在这一实 例中，并且当可检测元件是荧光团时，荧光团的释放首先由限制酶引起，所述限制酶在上文 提及的限制酶识别位点在占用探针中进行双链切割。然后，这样产生的短片段进一步通过 外切核酸酶降解成单核苷酸，其中的一些将被标记以荧光团。当探针包含多个猝灭的荧光 团时，一个优选的实施方案，这导致释放的荧光团的级联，现在所述荧光团由于它们现在彼 此分离和/或同与其结合的猝灭剂分离，而可以自由地以正常方式发出荧光。优选地，使 用调节到所述荧光团的特征性荧光波长或波长范围的光检测器或等效的装置来检测所述 荧光。在一个实施方案的实例中，所述光检测器包括高灵敏性sCMOS照相机（Zyla 10-tap sCMOS，Andor Technology)，在其之上，使用物镜（UPLSAPO 60xW, Olympus)和标准消色差镜 筒透镜的组合形成小滴的图像。在该实施方案中，荧光发射的激发使用一组激光，所述激光 通过二色镜引入到光路中。外部扫描装置使激光束偏转穿过小滴。由该方法产生的荧光发 射使得光检测器产生电信号，所述电信号可以正常的方式处理和分析。如上文提及的，优选 地通过光学或分光镜方式检测所述可检测元件。
[0028] 典型地，步骤（d)也在水性介质中并且使用过量的酶进行。为了避免降解未使用 的生物探针，优选地，所述限制酶识别位点是通过将所述单核苷酸添加到单链核苷酸区形 成的，或者备选地，这样选择限制酶，以使其不与其中含有缺口的双链寡核苷酸反应。由此， 将考虑限制酶位点的特征来选择限制酶，并且如果探针要有最佳表现，则所述限制酶尤其 是这样的限制酶，其表现出针对所述位点的高保真性。适当的外切核酸酶包括DNA酶I (不 含RNA酶），外切核酸酶I或III(ex E. Coli)，外切核酸酶T，外且核酸酶V(RecBCD)，A外 切核酸酶，微球菌核酸酶（Micrococcal Nuclease)，绿核酸酶（Mung Bean Nuclease)，核 酸酶BAL-31，RecJf T5外切核酸酶和17外切核酸酶。
[0029] 典型地，小滴通过装置的流速在50至3000小滴/秒的范围内，优选在100-2000 小滴/秒的范围内。
[0030] 在一个适当的实施方案的实例中，利用包含两组试剂的共同流动的水流产生小 滴。通过在接近小滴产生位点处将两种流合并，反应混合物的组分可以分别保持达可能的 最长时间。
[0031] 现在将参考下述装置举例说明本发明的小滴测序方法，其中：
[0032] 图1示意性显示微流体单元，其中使各自包含单核苷酸的小滴与上述生物探针进 行反应。
[0033] 包含获得自来源于人DNA和Klenow片段聚合酶的100个核苷酸碱基多核苷酸分 析物的单核苷酸的水流1流过十微米直径的微流体管。小滴流中核苷酸的顺序对应于所述 分析物的序列。单核苷酸流可以通过降解位于管的内表面上的分析物的单链而产生。1从 小滴头2流出进入第一室3,在这里其与一个或多个轻硅油流4接触。选择这些流的速度 以避免湍流混合并且产生悬浮在油中的基本上水性的球状小滴5,其各自具有约8微米的 直径。然后，5的流沿着相同直径的第二微流体管以1000小滴/秒的速度被向前带至第二 室6,在该第二室6中，利用第二小滴头8进料5微米水性球状小滴7的第二流。小滴5和 7以连续方式聚结，从而形成直径约为9微米的变大的水性小滴9, 7中的每一个包含下文所 述的探针混合物、大肠杆菌（E.coli)DNA连接酶和四种限制酶，所述限制酶各自适于在通 过将相关的单核苷酸结合产生的唯一的识别位点处唯一地切割不同的占用的探针类型。在 该实例中，限制酶识别位点的长度是四个核苷酸碱基。在9中的每一个中，单核苷酸与每种 探针的摩尔比是1:20。
[0034] 接着以相同的速度推进9的流经由微流体管进入第三室10,在此处其与也是通过 小滴头12输入的5微米水性的球状小滴11的第三流接触。9中的每一个在各室间移动所 花费的时间是30分钟。
[0035] 使9和11在10中聚结，从而产生小滴13 (直径约为10微米）。每个11包含催 化量的A外切核酸酶。然后，推进小滴13的流到检测系统的入口中。然后，在该时间期间 并且在筒（cartridge)内，所述外切核酸酶降解由限制酶在释放单核苷酸的级联的过程中 产生的分解的寡核苷酸片段，其现在连接有未猝灭的荧光团。小滴的内容物一直 被缓冲在 7. 9-8范围内的pH。
[0036] 检测系统（未显示）典型地包含由通道或储蓄池组成的筒，其中13中的每个小滴 在确保其完整性的条件下被存储。所述筒设置有至少一个由透明塑料或类似材料制成的 面，这允许如此存储的每个小滴能够用来自显微镜/激光器/光检测器的入射光检测到。这 又使得在每个小滴中的释放的荧光团以其原始包含的单核苷酸特有的方式发出荧光（或 者，如果小滴原始是空的，则完全不发出荧光）。因此，当按顺序检测小滴时，实际上可以读 出原始多核苷酸中核苷酸碱基的序列。使用中，筒被装满，密封，并且在外切核酸酶完成释 放荧光团后（典型地，在1-2小时内），进行检测。如果需要，小滴载体液可以是或可以包含 有机或无机单体（例如，环氧化物），其聚合可以通过紫外光引发从而产生用于小滴的透明 的固体基质，这使得筒能够被容易地长时间保存（如果有此需要）。
[0037] 下述举例说明可以如何制备适用于上述装置的探针混合物。
[0038] 具有以下核苷酸碱基序列的103个核苷酸的单链寡核苷酸前体（ex. ATDBio):
[0039] (5，）GGCACGATGGXXAXXGCCCGCACTTCAGCGGGCAAYAACCATCGTGCCTGCAGGCTCGACCTTTA TTCG CGGCACTTCACCCGCGAATAAAGGTCGAGCCTGC(3' ）
[0040] 其中X是用Quasar 570 (荧光团）标记的T碱基，并且其中Y是用BHQ-2猝灭剂 标记的T碱基，通过将其水溶液加热至95°C然后以10分钟/°C的速率缓慢冷却回到室温而 围绕第49个核苷酸碱基折叠。在此时间的末尾，形成根据本发明的闭环探针，其中第49个 核苷酸碱基（此处为T)构成单链核苷酸区并且两个双链寡核苷酸（长度分别为24和27 个核苷酸碱基对）在其侧。
[0041] 接着，通过由三种类似的103个核苷酸碱基寡核苷酸起始制备另外三种适于捕获 另外三种核苷酸碱基的探针，其中，根据具体情况，在上述中的第49个碱基是A、G或C。在这 些情形中，X碱基包含分别用下述标记的T碱基：Fluorescein(517nm)，Texas Red(612nm) 和青色素-5 (667nm)。然后，通过等摩尔量混合这四种探针制备探针混合物。
【主权项】
1. 用于确定多核苷酸分析物中核苷酸碱基的序列的方法，其特征在于下述步骤： a. 产生小滴流，所述小滴中的至少一些包含单核苷酸，并且其中在所述小滴流中的单 核苷酸的顺序对应于所述分析物中的核苷酸的序列； b. 向每个小滴引入多个生物探针类型，每种类型（i)包含处于不可检测状态的不同的 可检测元件，并且（ii)适于捕获组成所述分析物的不同的互补的单核苷酸； c. 使包含在所述小滴中的单核苷酸与其互补探针结合，以产生占用的探针；并且 d. 使所述可检测元件以可检测状态从所述占用的探针释放。2. 权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物探针包含单链核苷酸区，所述单链核 苷酸区的末端连接两个不同的双链寡核苷酸区，其中所述寡核苷酸区中的至少一个包含具 有特征性检测特性的可检测元件，并且其中所述可检测元件被这样布置在所述寡核苷酸区 上，以致所述可检测特性的可检测性比在相同数量的可检测元件结合到相应数量的单核苷 酸时低。3. 权利要求2所述的方法，其特征在于，所述可检测元件包含荧光团，并且所述探针在 所述荧光团的检测波长或波长范围基本上不发荧光。4. 权利要求3所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸区包含通过所述单链核苷酸区 连接在一起的第一和第二双链寡核苷酸，并且其中所述双链寡核苷酸中的至少一个被标记 以彼此紧邻的多个荧光团。5. 权利要求3或权利要求4所述的方法，其特征在于，所述双链寡核苷酸中的至少一个 被标记以与所述荧光团紧邻的猝灭剂。6. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述单核苷酸由选自胸腺嘧啶、鸟 嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶中的一个的核苷酸碱基组成。7. 权利要求2-6中的一项所述的方法，其特征在于，每个双链寡核苷酸由10-30个核苷 酸对组成。8. 权利要求2-7中任一项所述的方法，其特征在于，双链寡核苷酸中多至10个核苷酸 对被标记以焚光团。9. 权利要求2-8中任一项所述的方法，其特征在于，双链寡核苷酸中多至10个核苷酸 对被标记以猝灭剂。10. 权利要求2-9中任一项所述的方法，其特征在于，使用两个不连续的双链寡核苷 酸，其各自包含远离所述单链核苷酸区的末端，所述末端是闭环的。11. 权利要求10所述的方法，其特征在于，所述双链寡核苷酸通过以下方式来源于单 链寡核苷酸前体：将末端向回折叠于其自身上，留下包含所述单链核苷酸区的缺口。12. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物探针包含至少一个限制 酶识别位点。13. 权利要求12所述的方法，其特征在于，所述限制酶识别位点通过将所述单核苷酸 连接到所述生物探针的单链核苷酸区产生。14. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述可检测元件是荧光团。15. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述占用的探针包含限制酶识别 位点，所述限制酶识别位点通过将所述单核苷酸连接到所述单链核苷酸区形成。16. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物探针中的每一种具有不 同的可检测元件。17. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤c在聚合酶和连接酶存在下 进行。18. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤d在限制酶和外切核酸酶存 在下进行。19. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述可检测元件通过光学或分光 镜方式检测。20. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述小滴流包含在油性载体中的 水性小滴流。21. 权利要求20所述的方法，其特征在于，所述小滴的直径小于50微米。22. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸分析物来源于天然 存在的DNA或RNA。
【专利摘要】本发明公开了用于测序多核苷酸分析物的方法，所述方法包括：a.产生含有单核苷酸的小滴流，其中在所述小滴流中的单核苷酸的顺序与所述分析物中核苷酸的序列对应；b.向每个小滴中引入多个生物探针类型，每个类型包含处于不可检测状态的不同的标记且适于捕获不同的单核苷酸；c.使包含在所述小滴中的单核苷酸与其互补探针结合；d.使所述标记以可检测状态从已经结合单核苷酸的探针释放。所述探针是哑铃形状的探针，其包含荧光供体和猝灭剂标记和单核苷酸缺口。在通过聚合酶和连接酶修复缺口后，通过限制酶切割限制酶识别位点，然后进行外切核酸酶消化，以释放所述标记。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104903463
【申请号】CN201380062971
【发明人】卡梅伦·亚历山大·弗雷林, 巴纳比·巴姆福思, 布鲁诺·弗拉维奥·诺盖拉·德·索萨·苏亚雷斯, 托马斯·亨利·艾萨克, 鲍里斯·布赖纳, 亚历山德拉·纳塔莱, 米歇尔·阿马西奥
【申请人】贝斯4创新公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月4日
【公告号】CA2887323A1, EP2904109A1, US20150247192, WO2014053854A1
【专利说明】测序方法
[0001] 本发明涉及用于确定多核苷酸中的核苷酸碱基的序列的方法，所述多核苷酸例如 来源于天然存在的DNA或RNA。
[0002] 由于测序的单位成本下降并且越来越快的测序机器进入市场，遗传物质的下一代 测序已经对生物科学整体并且特别是对医学产生了显著的影响。例如，我们同时待审的 申请WO 2009/030953公开了一种新型快速测序仪，其中特别是单链或双链多核苷酸样品 (例如，天然存在的RNA或DNA)中的核苷酸碱基或碱基对的序列通过将其转运通过纳米孔 基底而被读取，所述纳米孔基底设置有在纳米孔的出口内或附近并置的等离子体纳米结构 (plasmonic nanostructures)。在这种装置中，所述等离子体纳米结构限定检测窗（基本 上是电磁场），在其中每个核苷酸碱基（任选被标记的）又通过与入射光相互作用以特有方 式被诱导产生荧光或拉曼散射质子。然后，在远端、多路检测这样产生的质子，并转换成数 据流，其信息内容表征与所述多核苷酸相关的核苷酸碱基序列。然后，利用编程到与其集成 在一起或在与其相连的辅助计算装置中的微处理器中的相应软件实施的计算算法，可以从 所述数据流恢复所述序列。
[0003] 用于快速测序多核苷酸的另一种装置例如记述在US 6627067, US 6267872和US 6746594中。以其最简单的形式，所述装置利用电极，而不是等离子体纳米结构，来定义穿过 基底或在纳米孔中或周围的检测窗。然后，电势差穿过电极施加，并且作为时间的函数检测 其间流动的离子介质的电特性的变化，所述变化由多核苷酸和结合的电解质通过纳米孔电 泳转运所致。在所述装置中，由于多个个体核苷酸碱基通过所述检测窗，它们连续地阻塞和 开启所述检测窗，引起'阻塞事件'，这产生电流或流阻率的特征性波动。然后，利用这些波 动来产生适当的数据流，用于上文所述的分析。
[0004] 稳定的小滴流（droplet stream)，尤其是微滴流（microdroplet stream)的产 生，是已经用于分子生物学的另一个技术发展领域。例如，US7708949公开了一种用于在 油中产生稳定的水滴的新型微流体方法，而例如US2011/0250597描述利用这一技术来产 生微滴，所述微滴含有核酸模板（典型地是多核苷酸DNA或RNA片段）和多个引物对，其 允许利用聚合酶链式反应扩增所述模板。涉及这种方法和这一领域的其他专利申请通 常包括 US 2010/184020, US2012/0164633, US2012/0122714, US2011/0000560, US2010/01 376163, US2010/0022414 和 US2008/0003142。J. Molecular Diagnostics (分子诊断杂 志)14 (3) 233-246 (2012)记述了该微滴PCR法在鉴定与先天性肌营养不良症（congenital muscular dystrophy)相关的基因突变中的应用。
[0005] W02007/120240 和 J. Anal. Chem.(分析化学杂志）盤 8439-8447 (2011)分别描述 了表征核酸的基于小滴的方法，其涉及焦磷酸测序。
[0006] 类似地，在分析分子生物学中广泛应用典型地包含少于1000个核苷酸长的已知 序列顺序的单链寡核苷酸的生物探针。当探针与靶标的核苷酸碱基之间存在充分的序列互 补性时，此类探针典型地通过将其本身与靶标（例如，来源于天然存在的病原体的DNA的靶 标）连接而起作用。典型地，所述探针的核苷酸用可检测元件如放射性或荧光标记物进行 标记，以致当将探针用于处理据信其中或其上已经捕获有靶标的分析物溶液或基底时，通 过寻找和检测所述检测元件的特征性检测特性来显示所述靶标的存在或不存在。
[0007] -类这样的探针由在本领域中被称为'分子指示标（molecular beacons) '的物质 所代表，例如，如在W002/06531或US8211644中所述的。这些探针由单链寡核苷酸组成，所 述单链寡核苷酸实际上已经向回折叠于其自身上从而产生充当探针的传感器的剩余的单 链环和短茎，在所述茎中，邻近两个末端的核苷酸通过互补核苷酸碱基配对彼此结合；由此 产生双链区域。这种布置是高度紧张的，所述布置可以连接到发夹上，其中单链环连接到名 义上双链的寡核苷酸的同一末端的互补链。所述寡核苷酸的游离的3'和5'端（现在彼此 邻近并且在茎的远端）分别连接荧光团和猝灭剂。然后其几何学上的彼此接近确保不产生 显著的荧光。使用时，靶标与单链环结合，产生另外的应变，以致当加热所述探针时引起茎 解链，这使所述荧光团和猝灭剂远离，并且允许前者发出荧光。
[0008] 我们现在已经开发了确定多核苷酸样品中的核苷酸碱基的序列的新方法，该方法 不同于上述那些方法，并且其中来源于样品的在流中的包含个体单核苷酸的小滴（其顺序 对应于样品的核苷酸碱基对序列）在用特定的标记的生物探针处理后被查询。典型地，该 处理的结果是在每个小滴中产生与其中的核苷酸相关联的特定核苷酸碱基所特有的一个 或多个可检测元件。该方法的一个特征是使用新的生物探针，其中可检测元件基本上是不 可检测的，除非被一系列生化/酶反应特异性激活，所述生化/酶反应从所述探针释放处于 可检测状态的所述可检测元件中的一个或级联。
[0009]因此，根据本发明，提供一种用于确定多核苷酸分析物中的核苷酸碱基的序列的 方法，所述方法特征在于下述步骤：
[0010] a.产生小滴流，所述小滴中的至少一些包含单核苷酸，并且其中在所述小滴流中 单核苷酸的顺序对应于所述分析物中核苷酸的序列；
[0011] b.向每个小滴引入多个生物探针类型，每个类型（i)包含处于不可检测状态的不 同的可检测元件，并且（ii)适于捕获组成所述分析物的不同的互补的单核苷酸；
[0012] c.使包含在所述小滴中的单核苷酸与其互补的探针结合，以产生占用的探针；并 且
[0013] d.使所述可检测元件以可检测的状态从占用的探针释放。
[0014]在本发明的一个优选的实施方案中，每种生物探针包含单链核苷酸区，其末端连 接两个不同的双链寡核苷酸区，其中所述寡核苷酸区中的至少一个包含具有特征性检测特 性的可检测元件，并且其中所述可检测元件被这样布置在所述寡核苷酸区上，以致所述可 检测特性的可检测性比在相同数量的可检测元件结合到相应数量的单核苷酸时低。
[0015] 在一个优选的实施方案中，所述可检测元件包含荧光团，并且所述探针本身在用 于检测荧光团的那些波长基本上不发荧光。因此，尽管荧光团可能在电磁谱的大部分上表 现出普遍的、低水平的背景荧光，但是典型地存在其中荧光强度处于最大值的一个或少量 的特定波长或波长范围（wavelength envelopes)。在特征性检测所述焚光团的这些最大值 中的一个或多个，基本上应当不产生荧光。在本发明的情形中，术语'基本上不发荧光'或 等价的词语意指连接到探针的全部荧光团在相关特征性波长或波长范围的荧光强度不到 等量的游离荧光团的相应的荧光强度的25% ;优选不到10% ;更优选不到1%，并且最优选 不到0. 1%。
[0016] 原则上，可以使用任何方法确保在探针的未使用状态，所述荧光团基本上 不发出 荧光。一种方法是另外将猝灭剂与其紧邻地连接。另一种方法是基于这样的观察：当多个 荧光团彼此紧邻地连接到同一个探针上时，它们倾向于彼此充分猝灭，使得可以在不需要 猝灭剂的条件下实现前段所述的标准。在本专利的这种情形中，什么构成荧光团之间或荧 光团与猝灭剂之间的'紧邻'将取决于所用的特定的荧光团和猝灭剂，并且可能取决于寡核 苷酸区的结构特征。由此，意欲根据所需的结果解释该术语，而不是将其解释为在探针上的 任意特定的结构布置。然而，并且仅是为了提供示例的目的，要指出的是，当邻近的荧光团 或邻近的荧光团与猝灭剂分开的距离对应于特征性F6rster距离（典型地小于5nm)时，将 实现充分的猝灭。
[0017] 优选地，包含探针的寡核苷酸中的至少一个被标记以多至20个、优选多至10个并 且最优选多至5个荧光团。为了获得的最大的优点，优选地，寡核苷酸区中的至少一个被标 记以至少2个、优选至少3个荧光团。由此，本文特别预期由这些最大值和最小值的任意 置换构建的范围。如果使用猝灭剂，类似地，优选的是，所述探针被标记以多至20个、优选 多至10个、并且最优选多至5个猝灭剂。尽管预期探针可以连接多于一种类型的荧光团， 例如，为了给予其特征性的指纹，但是，优选的是连接到给定探针的所有探针都是相同类型 的。在一个实施方案中，所述荧光团和猝灭剂位于寡核苷酸区的不同链上，或在它们通过折 叠单链寡核苷酸前体产生的情况下，彼此相对。
[0018] 关于荧光团本身，它们原则上可以选自任意本领域中常规使用的那些，包括但不 限于咕吨结构部分，例如，荧光素，罗丹明及其衍生物如荧光素异硫氰酸酯，罗丹明B等；香 豆素结构部分（例如，羟基_、甲基-和氨基香豆素）和青色素结构部分如Cy2, Cy3, Cy5和 Cy7。具体的实例包括来源于下述常用染料的荧光团：Alexa染料，青色素染料，Atto Tec染 料和罗丹明染料。实例还包括：Atto 633(AIT0-TEC GmbH)，Texas Red，Atto 740(AIT0-TEC GmbH)，Rose Bengal，Alexa Fluor? 750 C5-马来醜亚胺（Invitrogen)，Alexa Fluor? 532 C2_ 马来酰亚胺（Invitrogen)和 Rhodamine Red C2-马来酰亚胺和 Rhodamine Green 以及 亚磷酰胺（phosphoramadite)染料如Quasar 570。备选地，可以使用量子点或近红外染料， 诸如LI-COR Biosciences所供应的那些。典型地利用本领域已知的化学方法经由核苷酸 碱基将荧光团连接到寡核苷酸。
[0019] 适当的猝灭剂包括通过F6rster共振能量转移（FRET)机制起作用的那些。可以结 合上文提及的荧光团使用的可商购的猝灭剂的实例包括但不限于DDQ_l，Dabcyl，Eclipse， Iowa Black FQ 和 RQ，IR Dye - QC1，BHQ-1，-2 和-3 以及 QSY-7 和-21〇
[0020] 单链核苷酸区仅由一个核苷酸组成，这使得所述探针对于具有互补核苷酸碱基的 游离的核苷酸的检测极具有选择性。实践中，对于DNA，这意味着该核苷酸区适合结合特征 性核苷酸碱基选自鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶的核苷酸，或者在RNA的情形中，选 自鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶的核苷酸。然而，如果有此需要，可以使用与其他核苷 酸碱基相对应的其他核苷酸（例如，组成其他合成的多核苷酸的那些）。因此，在对DNA或 RNA进行测序时，典型地将使用四种不同的探针的混合物，所述探针各自对不同的互补核苷 酸碱基具有选择性，并且各自使用不同的可检测元件。在优选的实施方案中，每种探针将具 有不同的可检测元件，例如，被标记以在不同的特征性波长或波长范围发荧光的不同的荧 光团。因此，在检测到特征性荧光时，可以唯一地识别核苷酸。
[0021] 来看双链寡核苷酸区，优选地，它们来源于或者可来源于两个寡核苷酸前体（各 自优选是闭环的），或通过以下方式来源于共同的单链寡核苷酸前体：将后者的两个末端 向后折叠于其自身上从而产生两个闭环寡核苷酸区，而中间的缺口构成单链核苷酸区。在 所有情形中，效果是相同的；邻近单链核苷酸区的末端的将是在双链寡核苷酸区的另一条 链上的3'和5'游离端，其可以与靶标的相应的5'和3'端连接。由此，使用所述探针包括 以下过程：通过连接到所述3'和5'端将单链核苷酸区连接到靶标单核苷酸，以产生沿着其 全长都是双链的占用的探针。
[0022] 适当地，所述双链寡核苷酸区的长度为多至50个核苷酸对，优选多至45个核苷酸 对，更优选在5-40个核苷酸对的范围内，并且最优选在10-30个核苷酸的范围内。可以使 用更长的寡核苷酸区，但是通过缠绕使得单核苷酸靶标接近所述核苷酸区可能受限的潜在 的风险使得该实施方案的吸引力潜在地减少。
[0023] 优选地，与所述寡核苷酸结合的所述可检测元件的位置远离所述单链核苷酸区。 当使用两个不连续的寡核苷酸时，优选地，所述可检测元件位于或簇集在或朝向其远离所 述核苷酸区的末端中的一个或两者。最后，优选地，至少一个寡核苷酸包含至少一个限制酶 识别位点，所述识别位点优选地邻近所述可检测元件位于或簇集的区域。这样的限制酶识 别位点典型地包含2-8个核苷酸对的特定序列。在本发明一个实施方案中，所述限制酶识 别位点通过将所述单核苷酸与所述核苷酸区结合而产生。
[0024] 优选地，用于本发明的方法的生物探针原则上可以通过本领域已知的任何核苷酸 组装方法制备，包括H-膦酸酯法，磷酸二酯合成，磷酸三酯合成和亚磷酸三酯合成。优选的 是使用核苷酸亚磷酰胺结构单元的方法，这是由于其反应性。在这些方法中，通过在包括去 封闭、偶联、封端和氧化的循环的四步法中在5'位置向生长的核苷酸链连续添加所选的核 苷酸亚磷酰胺而进行合成。该方法的循环性质使其特别适合自动化，并且用于进行该方法 的机器可以在市场上容易地得到。当要引入猝灭剂和/或荧光团时，在需要的点使用适当 标记的核苷酸亚磷酰胺。在最优选的实施方案中，利用亚磷酰胺法制备单链寡核苷酸前体， 所述前体通过快速加热和缓慢冷却的循环折叠成具有所需特征的探针。
[0025] 在本发明的方法的步骤（a)中，产生小滴流，所述小滴中的至少一些包含单核苷 酸。为了测序目的，重要的是，小滴流中的单核苷酸的顺序与分析物中核苷酸的序列相对 应。适当地，通过将单核苷酸严格按顺序引入到相应的空小滴流中来产生此种有序的小滴 流。这可以例如通过使水流通过这样的方案实现，在所述方案中，单核苷酸从分析物释放， 然后所述流通过小孔流出，成为不混溶的载体液的流。为了避免给定的小滴包含超过一个 单核苷酸的风险，优选地，以这样的速率将单核苷酸释放到水流中，以致每个填充的小滴被 1-20个（优选2-10个）空的小滴隔开。然后，使在载体中的填充的小滴的流沿着流动路 径（适当地，微流体流动路径）流动，流动的速率和方式使得小滴保持不连续的状态，并且 没有机会彼此聚结。在一个特别适合的实施方案的实例中，所述载体包含氟碳油（如3M Fluorinert FOiO)和亲氟表面活性剂（如Sphere Fluidics Picosurf 1)的混合物，并且 水性小滴包含水、甘油、离子盐和探针反应所需要的其他添加剂的混合物。优选地，微流体 流动路径用涂层或 表面修饰处理，这使得其具有疏水特性，由此防止微滴与其相互作用或 粘附在其上。更优选地，该表面修饰还是亲油的，并且导致在流动路径上形成载体的涂层， 并进一步使水性小滴与通道壁分离。适当地，所用的小滴具有小于100微米，优选地小于50 微米（例如，小于20微米），更优选地小于10微米并且甚至更优选地小于5微米的直径。 最优选地，它们的所有直径都在2-20微米的范围内。典型地，所述单核苷酸是来源于天然 存在的多核苷酸分析物，优选天然存在的DNA或RNA的那些。
[0026] 在所述方法的步骤（b)中，将多种生物探针（优选地多种上文所述的那些探针） 引入到各小滴中。优选地，检测所有分析物不同核苷酸所需的所有探针的混合物被引入 到各小滴中。其中最优选地，这些探针将各自具有与其连接的处于不可检测状态的多个 可检测元件和至少一个限制酶识别位点或其前体。可以通过以下方式将探针引入到小滴 中：混合两种流，在小滴生成之前但是在核苷酸释放之后，通过注射到小滴中，或通过优选 地使小滴流与第二小滴流（其中的各小滴包含探针混合物）在一起，在来自两种流的小滴 彼此聚结的条件下，以连续的方式，从而产生包含单核苷酸和探针二者的更大的小滴的第 三流。同时，优选地，向各小滴中引入聚合酶和/或连接酶；但是，如果需要如此，这些项目 也可以分开引入。一旦该引入已经发生，在步骤（3)中，使小滴中的单核苷酸与在探针混 合物中的其互补探针在依靠其他的情况下结合。在优选的实施方案中，通过以下方式使这 种结合顺序发生：首先使用聚合酶将单核苷酸的5'端与寡核苷酸的3'端结合，然后使用 连接酶将所述单核苷酸和寡核苷酸或其他寡核苷酸的其余的游离端连接在一起。可以使 用多种聚合酶和连接酶，包括但不限于来源于容易得到的细菌来源的那些，如噬菌体T4， 大肠杆菌（Escherichia Coli)和水生栖热菌（Thermus Aquaticus)(Taq)。优选地，该步 骤在过量探针存在下在水性介质中发生，适当地，靶标与探针的摩尔比在1:1-1:2000,优 选1:1-1:200,更优选1:2-1:50的范围内，1:20-1:50是最优选的。备选地，可以使用在 1:5-1:20范围内的比率。
[0027] 接下来，在步骤（d)中处理步骤（c)的产物，即，现在含有与其互补探针结合的单 核苷酸（以下称为占用的探针）和其他未反应的探针的小滴，以使在占用的探针上的可检 测元件以可检测状态释放到小滴介质中。这允许它们之后使用常规技术检测到。例如，当 探针中和占用的探针中的可检测元件是不发荧光的荧光团时，步骤（d)使得其以使其开始 充分发荧光的形式从后者（而不是前者或小滴中的其他探针类型）释放。然后，可以用常 规的光学或分光镜技术检测并测量每个小滴中这样产生的荧光，以提供初始分析物序列特 有的输出数据组或数据流。适当地，步骤（d)通过向小滴中引入（例如，通过注射或优选 地上述类型的第二聚结）限制酶（限制性内切核酸酶）和外切核酸酶而发生。在这一实 例中，并且当可检测元件是荧光团时，荧光团的释放首先由限制酶引起，所述限制酶在上文 提及的限制酶识别位点在占用探针中进行双链切割。然后，这样产生的短片段进一步通过 外切核酸酶降解成单核苷酸，其中的一些将被标记以荧光团。当探针包含多个猝灭的荧光 团时，一个优选的实施方案，这导致释放的荧光团的级联，现在所述荧光团由于它们现在彼 此分离和/或同与其结合的猝灭剂分离，而可以自由地以正常方式发出荧光。优选地，使 用调节到所述荧光团的特征性荧光波长或波长范围的光检测器或等效的装置来检测所述 荧光。在一个实施方案的实例中，所述光检测器包括高灵敏性sCMOS照相机（Zyla 10-tap sCMOS，Andor Technology)，在其之上，使用物镜（UPLSAPO 60xW, Olympus)和标准消色差镜 筒透镜的组合形成小滴的图像。在该实施方案中，荧光发射的激发使用一组激光，所述激光 通过二色镜引入到光路中。外部扫描装置使激光束偏转穿过小滴。由该方法产生的荧光发 射使得光检测器产生电信号，所述电信号可以正常的方式处理和分析。如上文提及的，优选 地通过光学或分光镜方式检测所述可检测元件。
[0028] 典型地，步骤（d)也在水性介质中并且使用过量的酶进行。为了避免降解未使用 的生物探针，优选地，所述限制酶识别位点是通过将所述单核苷酸添加到单链核苷酸区形 成的，或者备选地，这样选择限制酶，以使其不与其中含有缺口的双链寡核苷酸反应。由此， 将考虑限制酶位点的特征来选择限制酶，并且如果探针要有最佳表现，则所述限制酶尤其 是这样的限制酶，其表现出针对所述位点的高保真性。适当的外切核酸酶包括DNA酶I (不 含RNA酶），外切核酸酶I或III(ex E. Coli)，外切核酸酶T，外且核酸酶V(RecBCD)，A外 切核酸酶，微球菌核酸酶（Micrococcal Nuclease)，绿核酸酶（Mung Bean Nuclease)，核 酸酶BAL-31，RecJf T5外切核酸酶和17外切核酸酶。
[0029] 典型地，小滴通过装置的流速在50至3000小滴/秒的范围内，优选在100-2000 小滴/秒的范围内。
[0030] 在一个适当的实施方案的实例中，利用包含两组试剂的共同流动的水流产生小 滴。通过在接近小滴产生位点处将两种流合并，反应混合物的组分可以分别保持达可能的 最长时间。
[0031] 现在将参考下述装置举例说明本发明的小滴测序方法，其中：
[0032] 图1示意性显示微流体单元，其中使各自包含单核苷酸的小滴与上述生物探针进 行反应。
[0033] 包含获得自来源于人DNA和Klenow片段聚合酶的100个核苷酸碱基多核苷酸分 析物的单核苷酸的水流1流过十微米直径的微流体管。小滴流中核苷酸的顺序对应于所述 分析物的序列。单核苷酸流可以通过降解位于管的内表面上的分析物的单链而产生。1从 小滴头2流出进入第一室3,在这里其与一个或多个轻硅油流4接触。选择这些流的速度 以避免湍流混合并且产生悬浮在油中的基本上水性的球状小滴5,其各自具有约8微米的 直径。然后，5的流沿着相同直径的第二微流体管以1000小滴/秒的速度被向前带至第二 室6,在该第二室6中，利用第二小滴头8进料5微米水性球状小滴7的第二流。小滴5和 7以连续方式聚结，从而形成直径约为9微米的变大的水性小滴9, 7中的每一个包含下文所 述的探针混合物、大肠杆菌（E.coli)DNA连接酶和四种限制酶，所述限制酶各自适于在通 过将相关的单核苷酸结合产生的唯一的识别位点处唯一地切割不同的占用的探针类型。在 该实例中，限制酶识别位点的长度是四个核苷酸碱基。在9中的每一个中，单核苷酸与每种 探针的摩尔比是1:20。
[0034] 接着以相同的速度推进9的流经由微流体管进入第三室10,在此处其与也是通过 小滴头12输入的5微米水性的球状小滴11的第三流接触。9中的每一个在各室间移动所 花费的时间是30分钟。
[0035] 使9和11在10中聚结，从而产生小滴13 (直径约为10微米）。每个11包含催 化量的A外切核酸酶。然后，推进小滴13的流到检测系统的入口中。然后，在该时间期间 并且在筒（cartridge)内，所述外切核酸酶降解由限制酶在释放单核苷酸的级联的过程中 产生的分解的寡核苷酸片段，其现在连接有未猝灭的荧光团。小滴的内容物一直 被缓冲在 7. 9-8范围内的pH。
[0036] 检测系统（未显示）典型地包含由通道或储蓄池组成的筒，其中13中的每个小滴 在确保其完整性的条件下被存储。所述筒设置有至少一个由透明塑料或类似材料制成的 面，这允许如此存储的每个小滴能够用来自显微镜/激光器/光检测器的入射光检测到。这 又使得在每个小滴中的释放的荧光团以其原始包含的单核苷酸特有的方式发出荧光（或 者，如果小滴原始是空的，则完全不发出荧光）。因此，当按顺序检测小滴时，实际上可以读 出原始多核苷酸中核苷酸碱基的序列。使用中，筒被装满，密封，并且在外切核酸酶完成释 放荧光团后（典型地，在1-2小时内），进行检测。如果需要，小滴载体液可以是或可以包含 有机或无机单体（例如，环氧化物），其聚合可以通过紫外光引发从而产生用于小滴的透明 的固体基质，这使得筒能够被容易地长时间保存（如果有此需要）。
[0037] 下述举例说明可以如何制备适用于上述装置的探针混合物。
[0038] 具有以下核苷酸碱基序列的103个核苷酸的单链寡核苷酸前体（ex. ATDBio):
[0039] (5，）GGCACGATGGXXAXXGCCCGCACTTCAGCGGGCAAYAACCATCGTGCCTGCAGGCTCGACCTTTA TTCG CGGCACTTCACCCGCGAATAAAGGTCGAGCCTGC(3' ）
[0040] 其中X是用Quasar 570 (荧光团）标记的T碱基，并且其中Y是用BHQ-2猝灭剂 标记的T碱基，通过将其水溶液加热至95°C然后以10分钟/°C的速率缓慢冷却回到室温而 围绕第49个核苷酸碱基折叠。在此时间的末尾，形成根据本发明的闭环探针，其中第49个 核苷酸碱基（此处为T)构成单链核苷酸区并且两个双链寡核苷酸（长度分别为24和27 个核苷酸碱基对）在其侧。
[0041] 接着，通过由三种类似的103个核苷酸碱基寡核苷酸起始制备另外三种适于捕获 另外三种核苷酸碱基的探针，其中，根据具体情况，在上述中的第49个碱基是A、G或C。在这 些情形中，X碱基包含分别用下述标记的T碱基：Fluorescein(517nm)，Texas Red(612nm) 和青色素-5 (667nm)。然后，通过等摩尔量混合这四种探针制备探针混合物。
【主权项】
1. 用于确定多核苷酸分析物中核苷酸碱基的序列的方法，其特征在于下述步骤： a. 产生小滴流，所述小滴中的至少一些包含单核苷酸，并且其中在所述小滴流中的单 核苷酸的顺序对应于所述分析物中的核苷酸的序列； b. 向每个小滴引入多个生物探针类型，每种类型（i)包含处于不可检测状态的不同的 可检测元件，并且（ii)适于捕获组成所述分析物的不同的互补的单核苷酸； c. 使包含在所述小滴中的单核苷酸与其互补探针结合，以产生占用的探针；并且 d. 使所述可检测元件以可检测状态从所述占用的探针释放。2. 权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物探针包含单链核苷酸区，所述单链核 苷酸区的末端连接两个不同的双链寡核苷酸区，其中所述寡核苷酸区中的至少一个包含具 有特征性检测特性的可检测元件，并且其中所述可检测元件被这样布置在所述寡核苷酸区 上，以致所述可检测特性的可检测性比在相同数量的可检测元件结合到相应数量的单核苷 酸时低。3. 权利要求2所述的方法，其特征在于，所述可检测元件包含荧光团，并且所述探针在 所述荧光团的检测波长或波长范围基本上不发荧光。4. 权利要求3所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸区包含通过所述单链核苷酸区 连接在一起的第一和第二双链寡核苷酸，并且其中所述双链寡核苷酸中的至少一个被标记 以彼此紧邻的多个荧光团。5. 权利要求3或权利要求4所述的方法，其特征在于，所述双链寡核苷酸中的至少一个 被标记以与所述荧光团紧邻的猝灭剂。6. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述单核苷酸由选自胸腺嘧啶、鸟 嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶中的一个的核苷酸碱基组成。7. 权利要求2-6中的一项所述的方法，其特征在于，每个双链寡核苷酸由10-30个核苷 酸对组成。8. 权利要求2-7中任一项所述的方法，其特征在于，双链寡核苷酸中多至10个核苷酸 对被标记以焚光团。9. 权利要求2-8中任一项所述的方法，其特征在于，双链寡核苷酸中多至10个核苷酸 对被标记以猝灭剂。10. 权利要求2-9中任一项所述的方法，其特征在于，使用两个不连续的双链寡核苷 酸，其各自包含远离所述单链核苷酸区的末端，所述末端是闭环的。11. 权利要求10所述的方法，其特征在于，所述双链寡核苷酸通过以下方式来源于单 链寡核苷酸前体：将末端向回折叠于其自身上，留下包含所述单链核苷酸区的缺口。12. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物探针包含至少一个限制 酶识别位点。13. 权利要求12所述的方法，其特征在于，所述限制酶识别位点通过将所述单核苷酸 连接到所述生物探针的单链核苷酸区产生。14. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述可检测元件是荧光团。15. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述占用的探针包含限制酶识别 位点，所述限制酶识别位点通过将所述单核苷酸连接到所述单链核苷酸区形成。16. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物探针中的每一种具有不 同的可检测元件。17. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤c在聚合酶和连接酶存在下 进行。18. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤d在限制酶和外切核酸酶存 在下进行。19. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述可检测元件通过光学或分光 镜方式检测。20. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述小滴流包含在油性载体中的 水性小滴流。21. 权利要求20所述的方法，其特征在于，所述小滴的直径小于50微米。22. 前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸分析物来源于天然 存在的DNA或RNA。
【专利摘要】本发明公开了用于测序多核苷酸分析物的方法，所述方法包括：a.产生含有单核苷酸的小滴流，其中在所述小滴流中的单核苷酸的顺序与所述分析物中核苷酸的序列对应；b.向每个小滴中引入多个生物探针类型，每个类型包含处于不可检测状态的不同的标记且适于捕获不同的单核苷酸；c.使包含在所述小滴中的单核苷酸与其互补探针结合；d.使所述标记以可检测状态从已经结合单核苷酸的探针释放。所述探针是哑铃形状的探针，其包含荧光供体和猝灭剂标记和单核苷酸缺口。在通过聚合酶和连接酶修复缺口后，通过限制酶切割限制酶识别位点，然后进行外切核酸酶消化，以释放所述标记。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104903463
【申请号】CN201380062971
【发明人】卡梅伦·亚历山大·弗雷林, 巴纳比·巴姆福思, 布鲁诺·弗拉维奥·诺盖拉·德·索萨·苏亚雷斯, 托马斯·亨利·艾萨克, 鲍里斯·布赖纳, 亚历山德拉·纳塔莱, 米歇尔·阿马西奥
【申请人】贝斯4创新公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月4日
【公告号】CA2887323A1, EP2904109A1, US20150247192, WO2014053854A1
最新回复(0)