用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法
用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法，其中，对试样在测量区域中以发光阻抑光的具有局部最小处的强度分布加载，其中，对试样在测量区域中以发光激发光加载，所述发光激发光使发光体从电子基态出发被激发到发光状态，其中，记录从测量区域所发射的冷光，并且，将所记录的冷光对应于所述局部最小处在试样中的位置。
[0002]在这样的方法中，由测量区域所发射的冷光的强度是发光体在局部最小处在试样中的位置上的浓度的尺度。通过在局部最小处的每个位置上重复上述步骤来扫描具有局部最小处的试样，检测发光体在试样中的分布并且因此对具有发光体的结构成像。
[0003]在这里，用术语“发光体”是指这样的任意物质:当其处于被激发的发光态时，从该物质可获得作为测量信号的荧光。荧光染料尤其属于这样的物质。但是，该以基于冷光发射的过程不必是荧光。也可以涉及散射、例如Raman散射，在所述散射中，从被激发的过渡状态发射散射光，所述被激发的过渡状态被看作被激发的发光态。
[0004]试样的让人感兴趣的结构可以本身具有发光体，即为自动发光的。然而，试样的让人感兴趣的结构也可以以发光体人工标记。以发光体对结构的人工标记例如可以通过所谓的抗体染色、即通过发光体通过免疫反应连接，或者通过基因技术的改变来进行，所述基因技术的改变导致发光体与让人感兴趣的结构的共同表达。
[0005]如果在这里谈到一种状态、例如发光体的可激发的电子基态或者被激发的发光态，则涉及发光体的能发光的最小单元即分子、复合物、缺陷处、量子点或者诸如此类的电子状态。
[0006]如果在这里谈论的是光、例如发光阻抑光的强度分布的局部最小处，则以此尤其指的是强度分布的由干涉所产生的零位置。这样的零位置可以具有四个比它在光聚焦时由于衍射极限而可能的更小的尺寸。在此也能涉及真实的零位置，在该零位置中，光的强度实际上返回到零，或者涉及一种这样的零位置:在该零位置中，光的强度由于缺乏理想的光学情况而仅基本上返回到零。如果在这里谈到局部最小处的大小，则该大小尤其涉及体积的大小，在该体积中，相应的光造成通过该光所追求的效果、例如通过该光激发过渡未至饱和。
【背景技术】
[0007]一种已知的用于试样的具有发光体的结构在空间上高分辨率成像的方法作为GSD(基态耗竭，Ground State Deplet1n)网栅荧光显微镜已知，该方法以上述顺序包括独立权利要求1前序部分的步骤。在这种已知的方法中，以呈GSD光形式的发光阻抑光使发光体经过其电子被激发发光态、例如电子被激发单重态转为暗态、例如长寿命的三重态，发光体不被发光激发光从暗态激发到发光态。这发生在发光阻抑光的强度分布的局部最小处之外各处，直至饱和。即，在以发光阻抑光加载之后，只在发光阻抑光的强度分布的局部最小处中发光体还处于其电子基态，发光体被发光激发光从电子基态激发到发光态。因此，在以发光激发光激发之后，由发光体发射的冷光仅来自发光阻抑光的强度分布的局部最小处，因此对应于局部最小处在试样中的位置。
[0008]在以关键词GSD已知的方法中也存在发光体褪色的巨大风险，因为发光体不但在其被以发光阻抑光所转换到的长寿命的暗态中而且在其在转到其暗态中时中间占据的电子激发的发光态中以提高的程度例如倾向于与氧气化学反应和/或承受这样的风险:发光体被发光阻抑光或者发光激发光进一步电子激发，从而发生发光体的光化学褪色。
[0009]另一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法作为 RESOLFT(可逆饱和焚光过渡 Reversible Saturable Optical FluorescenceTransit1ns)网栅荧光显微镜的变型已知，该RESOLFT网栅荧光显微镜使用所谓可转换的发光体，该方法以上述顺序具有独立权利要求1前序部分的方法步骤。借助于呈关断光形式的发光阻抑光可将发光体从它在其中起发光体作用的第一构象状态转换到它在其中不起发光体作用的第二构象形态，即，在第二构象状态中，至少借助于在第一构象状态下适合于激发发光态的发光激发光不能将发光体激发到发光态，在发光态下，发光体发射被记录为测量信号的冷光。为了在发光阻抑光的强度分布的局部最小处之外各处促进这样的转换直至饱和，在第二构象状态的寿命足够长的情况下，仅需要相对小的光强度。此外不存在被转换到其另一构象状态中的发光体从该另一构象状态褪色出来的显著风险，因为发光体在该构象状态下对发光阻抑光和发光激发光不响应。然而，可转换的发光体借助于发光阻抑光向其第二构象状态的转换也经过被激发的电子态进行，该被激发的电子态在发光阻抑光的强度较高的情况下可以是用于发光体的光化学褪色的起点。由于该原因和其它原因，在有多个可转换的发光体时，两种构象状态之间的可用的转换过程的绝对数量是受限的，尤其当发光体根据需求主动地、即通过发光促进光从其不能发光的第二构象状态切换到其能发光的第一构象状态时。此外，即使在所述构象状态之间主动地来回切换，所述构象状态的已经提到的长寿命意味着:以关键词RESOLFT已知的用于试样的具有可转换的发光体的结构的空间高分辨率成像的方法也相对较慢。最后，商业上可用的适合于标记试样中的结构的可转换发光体的数量是有限的，尤其与大量原则上可用的发光体相比。而且开发新的稳定的可转换发光体是费事的。
[0010]一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率地成像的方法作为STED(受激辐射耗竭)网栅荧光显微镜已知，该方法以原则上与开头部分所列举的不同的顺序包括独立权利要求1前序部分的方法步骤。在这里，首先对试样在测量区域中以发光激发光加载，发光激发光将发光体从电子基态激发到发光态。然后对试样在测量区域中以呈STED光形式的发光阻抑光的具有局部最小处的强度分布加载，发光阻抑光使被激发的发光态通过受激发射再退激发到基态。当发光阻抑光使被激发的发光态在局部最小处之外各处通过受激发射又被退激发时，接着由测量区域发射的荧光只可能来自发光退激发光的强度分布的局部最小处，因此对应于局部最小处在试样中的位置。
[0011]在以关键词STED已知的方法中，在试样的具有发光体的结构的成像中实际也达到非常高的地点分辨率。然而在此，发光体显著承受光化学负荷并且因此强烈地倾向于褪色。原因在于，发光退激发光加载已经处于其被激发的发光状态下的发光体，该发光退激发光为了约束其强度分布的呈零位置形式的局部最小处而必须以高的绝对强度来施加。因此，除了所希望的使发光体返回其基态的受激发射外，其它过程、尤其发光体的在更大程度上并且导致褪色的电子激励也不是不可能的。对起先通过手激发射而被退激发的发光体的重新激发也可通过本来设置用于荧光退激发的光发生。
[0012]所有已知的、具有独立权利要求1前序部分的特征的、用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法基于:发光阻抑光使发光体或者在发光激发光射入之前从其能发光的基态经过被激发的电子态转换到暗态，或者从被激发的发光态返回到基态。即，在任何情况下，发光体被加载以高强度的、具有在发光体的吸收光谱中的波长的发光阻抑光，并且，与发光体的光化学褪色危险相关联的、被激发的电子态借助于发光阻抑光而参与到地点分辨率的提高中。而且，似乎在暗态寿命和必需的发光阻抑光强度之间产生关联，暗态寿命越长，该关联越少可能失效。
【发明内容】
[0013]本发明的任务是，提出一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法，在该方法中，发光体承受特别小的光化学褪色，但在扫描具有发光阻抑光的强度分布的最小处的试样时仍允许高的速度。
[0014]本发明的该任务通过具有独立权利要求1的特征的方法解决。在从属权利要求中定义根据本发明的方法的优选实施方式。
[0015]在用于试样的具有发光体的结构空间高分辨率成像的方法中，对试样在测量区域中以发光阻抑光的具有局部最小处的强度分布加载，其中，对试样在测量区域中以发光激发光加载，该发光激发光使发光体从电子基态出发被激发到发光态，其中，记录从测量区域所发射的冷光，将所记录的冷光对应于局部最小处在试样中的位置，在该方法中，以发光阻抑光这样干扰发光体的电子基态，使得发光体在被干扰的电子基态中具有用于发光激发光的减小至少50%的吸收横截面。在评估用于发光激发光的吸收横截面时的比较标准在这里为未被干扰的基态，在该未被干扰的基态中，发光体具有其用于发光激发光的100%吸收横截面。
[0016]在根据本发明的方法中，发光体不被发光阻抑光从电子基态引出或者从其它电子态返回到电子基态。即，不进行发光体的电子态的改变。取而代之，发光体的现有电子基态被干扰。该干扰至少到这个程度:使得发光体在被干扰的电子基态中与在未被干扰的电子基态中相比以最大一半概率被发光激发光激发到发光态。然而，典型地，该干扰还可更进一步，使得吸收横截 面降低到其在未被干扰的电子基态中的原始值的20%，10%，5%，3%，1%或者更少。该干扰典型地涉及发光体、尤其其原子核在其基态中的空间排列。该空间排列影响发光体对发光激发光的天线功能，或者换言之，影响发光体的用于与尤其呈发光激发光形式的光相互作用的能力、特别是用于吸收光的能力。由于这个原因，对这种排列的干扰改变用于发光激发光的吸收横截面。
[0017]对发光体基态的干扰所引起的阻碍发光体被发光激发光激发的效果也可以根据Franck-Condon原理解释，但其中要估计到，在干扰不但影响发光体的原子核的排列而且影响电子云的排列的情况下，可能违背该原理所基于的假设，尤其Born-Oppenheimer近似。根据Franck-Condon原理的观点，在被干扰的基态，缺乏发光体的被激发的发光电子态的合适的振动能级态。因此，被激发的发光电子态的所有振动能级态的Franck-Condon因子仅是小的并且导致仅小的跃迀概率。这与根据本发明减小用于发光激发光的吸收横截面是同义的。
[0018]此外，发光体的被干扰的基态的术语包含:被干扰的基态不是发光体与其环境的热平衡状态。虽然干扰伴随着发光体的能量提高；干扰也能将发光体提高到其基态的较高振动能级态。然而，发光体在其被干扰的基态中提高的能量不符合试样在发光体的环境中的温度普遍提高。而是被干扰的基态的能量明显高于发光体的由其环境温度所限定的热能。相应地，当再次出现发光体与其环境的热平衡时，根据本发明通过发光阻抑光所引起的对发光体电子基态的干扰就失去。然后仅剩下试样在干扰能量所分布的区域中的小的温度提高。这意味着，在执行根据本发明的方法时首要考虑的时间尺度通过弛豫时间确定，随着所述弛豫时间，发光体回复到其与其环境的热平衡中。在这里，该弛豫时间也被称作碰撞弛豫时间或者振动弛豫时间，因为热平衡典型地通过将运动脉冲和/或振动传递到邻近的分子上来建立。碰撞弛豫时间或振动弛豫时间的典型数量级在较多飞秒(fs)范围至皮秒(ps)范围，即从几十飞秒至几皮秒。典型地，所述数量级在几百到数百飞秒的范围内。
[0019]试样的由于通过发光阻抑光所引入的能量引起的温度提高在一段时间间隔中这样扩张，使得该提高也影响被发光阻抑光的强度分布遗漏的局部最小处，该时间间隔长几个数量级并且在纳秒(ns)范围至微秒(ys)范围内。因此，该时间间隔不规定对于根据本发明的方法重要的附加时间极限，特别是因为在所述方法中，在强度分布的局部最小处之外也不力求试样在测量区域中的温度普遍提高，而是使该提高保持尽可能小。
[0020]不言而喻，在根据本发明的方法中，发光阻抑光具有在发光激发光谱之外的波长，在优选实施方式中也具有在发光体的发光退激发光谱之外的波长，借此可以使用发光阻抑光选择性地用于干扰发光体的电子基态。在此，当对应的吸收横截面例如最大为用于在发光激发光谱或者发光退激发光谱中的发光激发或者发光退激发的最大吸收横截面的5%时，可认为波长为在发光体的发光激发光谱或者发光退激发光谱之外。
[0021]对发光体的电子基态的干扰典型地通过运动脉冲或者振动的分子传递、例如通过分子碰撞来进行。通过被传递到发光体上的运动脉冲或者振动干扰其空间排列。在此，对空间排列的干扰首要涉及发光体的原子核的空间布置，但是也伴随着对包围原子核的电子云的干扰。
[0022]用于干扰发光体基态的运动脉冲或者振动尤其可能出自至少一个被发光阻抑光激发的调制器单元的碰撞弛豫或者振动弛豫。即，发光阻抑光将至少一个调制器单元例如从其电子基态激发到电子激发态，所述电子激发态然后由于碰撞弛豫或者振动弛豫、即在将运动脉冲和/或振动传递到发光体上的情况下，再次转移到电子基态中。
[0023]所述至少一个调制器单元尤其可以是单独的分子或者功能性基团。因此，所述调制器单元可以从不发光的染料的基团中选择，所述染料包括偶氮色素、胡萝卜素、青色素、衍生香豆素和所谓光敏化剂。具体地可以是晶紫或者亚甲蓝。发光体可以是在结构上所使用的发光染料。
[0024]为了有效率地传递运动脉冲和/或振动到发光体上，调制器单元尽可能直接地在空间上配属给发光体。因此，例如在绿色荧光蛋白(GFP)的外罩(桶)中的发光中心旁边的水分子被用作调制器单元，因为它们在空间上紧密地邻近发光中心。
[0025]此外可能的是:所述至少一个调制器单元通过键合耦合在发光体上。这样的键合可以是共价的或者可以包括化学桥。根据键合的类型不同，调制器单元较柔性或者较刚性地耦合在发光体上。决定性的是，由于调制器单元的碰撞弛豫或者振动弛豫，用于发光体的电子基态的所希望的干扰的足够动能被传递到发光体上。
[0026]调制器单元可以相对于它耦合在其上的发光体折曲成角度。即，调制器单元优选具有至少大致相对于发光体的π共轭电子系统正交的π共轭电子系统。那么，尽管可利用耦合到发光体上来传递运动脉冲和/或振动，调制器单元仍尽可能少地干扰不被干扰的发光体的发光特性。
[0027]具体地，调制器单元可以通过发光阻抑光被激发至顺-反异构化。当发光体结合到调制器单元的重排的原子基团上时，在异构化时进行的调制器单元原子基团重排特别有效地作为运动脉冲被传递到耦合的发光体上。在调制器单元的两个在异构化时改变其相对布置的原子基团上也可以分别结合一个发光体。在此，如果由发光阻抑光所激发的异构化不稳定并且调制器单元在异构化之前自发返回到其初始状态，运动脉冲也传递到每个被结合的发光体上，该运动脉冲干扰结合的发光体的基态。
[0028]在被干扰的电子基态中，在发光体中尤其是原子的排列、即原子核的立体或者空间布置被干扰。在此，干扰也可以是原子在发光体的不能发光的其它构象状态的方向上的振动，但该其它构象状态或者不被实现或者不稳定。无论如何，已经提到的发光体与发光激发光相互作用的能力被该干扰有针对性地损害。如同样已经提到的，这样的干扰由于其不符合发光体的热平衡，即使被有效率地激发也仅持续有限时间。相应地，与已知的用于试样在空间上高分辨率地成像的方法相比，根据本发明的方法的方法步骤必须快速地相继执行。
[0029]尤其是，仅当发光体的电子基态被发光阻抑光的脉冲干扰时，才应对试样在测量区域中以发光激发光的脉冲加载所述。即，发光激发光既不应在发光体的基态被干扰之前、也不应在干扰消退之后被施加到试样上。因此，发光激发光在发光阻抑光的强度分布的最小处之外基本上仅照射在具有被干扰的基态的发光体上，从而在该最小处之外不进行发光态的相关激发。如果遵守该条件，则被从试样记录的冷光仅来自发光阻抑光的强度分布的局部最小处，不管它是在试样被加载以发光激发光期间还是之后记录的。
[0030]为了在以发光激发光加载时确实存在对基态的干扰所希望的空间分布，还不允许发光体从其被干扰的基态再返回到与其环境的热平衡中。为了确保这一点，发光激发光距离发光阻抑光的最大时间间距可遵循1000fs、500fs或者更短的时间。如果不可能或者仅以大的花费才能将发光激发光限制在一个时间段上，在该时间段中发光体的电子基态确实被干扰，则可以这样优化利用本发明方法的提高分辨率的效果:记录从测量区域发射的冷光的时间段已经结束，而发光体的电子基态还被发光阻抑光的之前的脉冲干扰，即使发光激发光的脉冲还未消退。被检测的冷光的具有处于被干扰的基态的碰撞弛豫时间或振动弛豫时间的范围内的时间分辨率的这种“门(Gaten) ”使得只记录这样的发光体的冷光:该发光体在发光体的电子基态的干扰以围绕发光阻抑光的强度分布的最小处的希望的空间分布给出的时间点被激发。典型地，在以发光激发光对发光体的激发继续进行期间，最晚在发光阻抑光的脉冲之后几个ps、通常仅大约lps，在本发明方法中记录发射的冷光的所述有限时间段结束。
[0031]与荧光发光态的典型寿命相比，几个ps可能只是短的并且因此不足以影响可从被激发的发光体原则上获得的冷光的较大部分。然而其它发光态，包括从三重基态被电子激发的发光三重态或者例如Raman散射物质的参与光散射的发光过渡态，可能具有短得多的寿命。在通过根据本发明的发光阻抑光干扰进行光散射的物质的基态时，其散射光谱被移动式改变或者其它方式改变。
[0032]发光阻抑光的脉冲的持续时间在第一近似中是不明显的，只要该通过脉冲传递的能量足够引起对发光体的基态的希望的干扰。因此，原则上发光阻抑光也可以连续地施加。然而这会关系到对试样中的不希望的热输入，该热输入可能会使得仅在发光阻抑光的强度分布的最小处之外对发光体的电子基态局部干扰越来越困难。已知现象是:荧光染料的荧光发射随着温度上升而下降。试样温度的普遍提高也会使其在其未被干扰的、即处于热平衡中的基态中吸收横截面减小。因此，在本发明中优选，发光阻抑光以短的脉冲施加，所述短的脉冲典型地可以为1fs和100fs之间、通常在50fs和500fs之间长，具体地可以为大约300fs长。通过这类短的脉冲，仅有限的能量被传递到试样上，该能量在扫描试样 时在试样温度没有被原则性提高的情况下也能被耗散。发光阻抑光的每个脉冲向具有由衍射极限所确定的大小的测量区域中输入的用于根据本发明干扰发光体基态的能量在IpJ至10，OOOpJ的典型范围内，通常在5pJ和500pJ之间。在该能量情况下，在测量区域中引起的试样温度提高保持小，即使通过发光阻抑光引入的能量不再从试样导出。
[0033]优选发光阻抑光的脉冲具有这样的强度:该脉冲使得在测量区域中对发光体电子基态的干扰在其强度分布的局部最小处之外饱和。即，对电子基态的干扰在测量区域中在局部最小处之外的各处至少这样大，使得用于发光激发光的吸收横截面减小至少50%。
[0034]实践中可以这样设计发光阻抑光的脉冲，使得它使至少一个调制器单元的通过碰撞弛豫或者振动弛豫而松弛的激发态饱和。通过以足够密度设置调制器单元则可以确保在发光阻抑光的强度分布的最小处之外各处对发光体的希望的基态的希望的干扰。
[0035]根据本发明的方法使得能够以最小的花费同时对具有不同发光体、即发射不同波长的冷光的发光体的不同结构成像。为此，原则上，所有可用相同激发阻抑光激发的相同调制器单元耦合在不同的发光体上并且不同波长的冷光被分开记录并对应于在激发阻抑光的强度分布的局部最小处的位置上的各个发光体，就足够了。激发阻抑光的强度分布的局部最小处对调制器单元耦合在其上的所有发光体限定试样体积，冷光可来自该体积。即使将不同的发光体用具有与相应发光体协调的不同波长的发光激发光激发到其发光态，这也是没问题的，因为在此不必使不同强度分布的局部最小处如在对具有不同发光体的不同结构同时成像时那样重合，其它情况下则通常要求这样。
[0036]在根据本发明的方法的另一拓展实施方式中，在记录从测量区域发射的冷光之前，附加地以传统发光阻抑光的具有局部最小处的强度分布加载试样，所述传统发光阻抑光落入发光体的吸收光谱中并且在参与被激发的电子激发态的情况下阻碍发光体发光。该附加的传统发光阻抑光可以根据已知的STED原理、GSD原理或者RESOLFT原理进一步限制可从试样中发射出冷光的空间区域。即，传统的发光阻抑光可以是STED光、GSD光或者关断光，其中，后者以可转换的发光体为前提。然而在此，对于STED、GSD或者RESOLFT来说典型的发光体褪色风险不出现或者至少明显更少出现，因为传统发光阻抑光的高强度仅(或者至少主要地)照射到处于其被干扰的基态而不处于被电子激发并从而倾向于光化学褪色的状态中的发光体上。在本发明方法的该实施方式中，村集体发光阻抑光在其强度分布的局部最小处附近以其相对小的强度起作用，该强度分布不关系到较大的发光体光化学褪色风险。
[0037]根据本发明的方法的最后所说明的变型也可以这样解释:通过以发光阻抑光干扰基态，发光体在STED方法、GSD方法或者RESOLFT方法情况下的STED光、GSD光或者关断光的高强度区域内转换为保护态，在保护态中，发光体不像在其它情况下那样强地产生由于STED光、GSD光或者关断光的高强度而被光化学褪色的风险。原则上，这种有利效果也可以在此时实现:根据本发明的发光阻抑光虽然首要干扰发光体的基态而不电子激发该基态，但部分地也起到传统发光阻抑光的作用，即起到STED光、GSD光或关断光的作用，因而通过一个波长以两种方式提高根据本发明的方法的地点分辨率。
[0038]从权利要求、说明书和附图中得出本发明的有利扩展方案。在说明书中所提到的特征和多个特征的组合的优点仅是示例性的，并且可以替代地或者累积地产生效果，而不必强制性地由本发明实施方式实现这些优点。在不因此改变所附的权利要求的主题的情况下，就原始的申请文件和专利的公开内容而言适用的是:从附图、尤其所示出的几何形状和多个构件相对于彼此的相对尺寸以及它们的相对布置和作用连接，可得知进一步的特征。本发明的不同实施方式的特征或者不同权利要求的特征的组合在偏离权利要求的所选择的引用关系的情况下也是可行的，在此被建议。这也涉及单独的附图中示出或者在其说明书中提到的特征。这些特征也可以与不同权利要求的特征组合。也可以为了本发明的进一步的实施方式而取消在权利要求中列举的特征。
[0039]在权利要求和说明书中所提到的特征在其数量方面应这样理解:刚好存在该数量或者比所提到的数量更大的数量，而不需要明确地使用副词“至少”。即，如果例如提到一个元件，则应这样理解:存在恰好一个元件、两个元件或者多个元件。这些特征可以通过其它的特征来补充，或者可以是唯一的特征，由所述特征组成相应的产品。
[0040]包含在权利要求中的附图标记不是对由权利要求保护的主题的范围的限制。它们仅用于使权利要求更容易理解的目的。
【附图说明】
[0041]下面参考在附图中示出的优选实施例进一步解释和说明本发明。
[0042]图1示出作为发光体的例子的荧光染料在其单重态中的能量谱。
[0043]图2示意性地示出具有两个耦合上的调制器单元的发光体。
[0044]图3示意性表示出一种发光体，在该发光体中，多个具有发光的中心的调制器单元布置在共同的外壳中。
[0045]图4示出调制器单元在其单重态中的能量光谱，
[0046]图5说明根据本发明的方法的单个的步骤；和
[0047]图6为在图5中所说明的方法的主要的步骤的时间流程图。
【具体实施方式】
[0048]在图1中所表示出的荧光染料在其单重态中的能量谱包括具有不同的振动能级态的电子基态Stl和被激发的发光的电子态S 10借助于激发光I可将荧光染料从其基态Stl激发到其激发态Si。该状态S1自发地衰变为基态SC1，其中，发射冷光2、在这里具体是荧光。然而，激发态S1也可以在发射冷光2之前有针对性地借助于STED光3来减灭，STED光具有不同于激发光I和冷光2的波长并且STED光使荧光染料从其激发态31在受激地发射与STED光3相同波长的光4的情况下返回其基态激发光I也可以具有不同于冷光2的波长，尤其较短的波长，从而冷光2可以在其波长上与所有其它的光分开。
[0049]用以吸收激发光I的吸收横截面、即激发光I导致荧光染料被从其基态Stl激发到被激发的电子态S1的概率，取决于，荧光染料是否处于基态S ^的具有低能量的振动能级态中。因此，吸收横截面随着荧光染料的温度的强烈提高和占据基态Stl的更高振动能级态而减小。然而，在根据本发明的方法中，不引起荧光染料在热平衡中的普遍的温度提高。而是焚光染料在焚光阻抑光或者说发光阻抑光的强度分布的最小处之外被一个或多个运动脉冲和/或振动直接传递这样干扰，使得它虽然保持在其电子基态Stl中，但是用于激发光I的吸收横截面明显减小。这可以被解释为，单个荧光染料的振动能量或者振荡能量由于每次碰撞和用于激发光I的吸收横截面的相应减小而提高。这种能量提高明显超出荧光染料基于其周围环境温度的热能。如果在根据本发明的方法中在以发光阻抑光的加载结束之后又出现荧光染料与其环境的热平衡，则已再次失去其基态的使用于激发光I的吸收横截面减小的干扰。与其环境处于热平衡的荧光染料的保持的小的温度提高虽然还能在一定时间在发光阻抑光的强度分布的局部最小处的位置上具有局部最小处，但是不再导致在该局部最小处之中和之外显著不同的用于发光激发光的吸收横截面。为了提高地点分辨率，只有紧接着荧光染料的碰撞激发之后的热不平衡状态是可利用的。
[0050]为了在发光体中引起这种碰撞激发(到现在为止所说明的荧光染料是这种发光体的一个例子)，调制器单元5耦合到发光体6上，这些调制器单元吸收发光阻抑光并且将其转换为运动脉冲和/或振动。这在图2中以草图示出，在该图中，两个调制器单元5通过键7这样折曲90°地耦合到发光体6上，使得其共轭电子系统基本上与发光体6的共轭电子系统正交。调制器单元5的数量也可以小于或大于两个。键合的方式也可以是不同的。但是，理想地，不损害发光体6的发光特性的键合将从调制器单元5发出的运动脉冲和/或振荡有效地传递到发光体6上。具体地，可被发光阻抑光激发至顺-反异构化的连接例如偶氮生色团很好地适合于作为调制器单元5，以将这样的运动脉冲传递到各个结合的发光体6上，所述运动脉冲根据本发明干扰发光体的基态。在此可以使两个发光体结合到调制器单元的两个原子基团上，所述两个原子基团在异构化时相对于彼此重排。
[0051]图3示出发光体6，在该发光体中，发光中心8与调制器单元5共同地被外壳9紧密围绕。这类的状况在例如绿色荧光蛋白中出现，在其中，调制器单元5为水分子。这些水分子可以被以发光阻抑光激发到一种状态，该状态由于振动弛豫或者碰撞弛豫而衰变，其中，从调制器单元5发出的运动脉冲和振动被传递到发光体6或者说其发光中心8上，并且其用于激发光I的吸收横截面根据图1减小。
[0052]图4画出在调制器单元I在单重态中的能量谱的草图。通过发光阻抑光10使调制器单元I从基态Stl转换到被激发的电子态、例 如其S i态或者S2态。尤其是，为了激发向较高的S2态的过渡所需的能量可以通过激发光的在UV范围内并从而在发光体6的吸收光谱和发射光谱之外的波长来提供。被激发的S1态或者S 2态非常快速地由于振动弛豫或碰撞弛豫11衰变回到基态Stl，其中，在调制器单元5合适地耦合的情况下，运动脉冲和/或振动被传递到发光体6上并且以希望的方式干扰其基态。
[0053]图5画出根据本发明的方法的步骤的草图。根据图5(a)，对试样12在测量区域13中以发光阻抑光10加载。在此，发光阻抑光10的强度分布在测量区域13的中心具有呈零位置形式的局部最小处14。即，在局部最小处14之外各处、但不在局部最小处14中，发光阻抑光10干扰发光体6的基态，通过该发光体标记试样12中的结构15。
[0054]在根据图5(b)的下一步骤中，对试样12在测量区域13中以激发光I加载。但是，激发光I只能(或者至少主要只能)在发光阻抑光10的局部最小处14中根据图1激发例如为荧光染料的发光体6。因此，在根据图5(d)的步骤中将从测量区域13记录的荧光2对应于所述局部最小处14，因为所述冷光只能(或者至少主要只能)来自该局部最小处14之内的发光体6。
[0055]在图5(c)中画出附加的、可选的方法步骤的草图，在该方法步骤中，在步骤(d)之前，对试样12在测量区域13中附加地以STED光3加载，所述STED光也具有在测量区域13的中心的局部最小处16。如果该局部最小处16还小于局部最小处14，则由此还更强烈地限制根据图5 (d)的冷光2空间对应，由此还进一步提高在对结构15成像时的空间分辨率。
[0056]在扫描具有局部最小处14或者16的试样时，对局部最小处在试样中的所有位置重复进行在图5中所画出草图的步骤。借此检测发光体6在试样中的分布并且因此对以该发光体标记的结构15成像。
[0057]在图5中所画出的、发光阻抑光10和STED光3的强度分布仅是示例性的。他们可以采用任意的其它形状，即，邻接局部最小处14或者16具有如从STED-荧光显微镜已知的那样的任意强度变化。
[0058]图6表不出发光阻抑光10的脉冲、对发光体的基态产生的干扰17、激发光I的随后的脉冲以及记录试样的冷光的时间间隔At的在时间上的顺序。在此，以实线示出激发光I的短脉冲，该短脉冲在干扰17插入之后才开始并且在干扰17消退之前已结束。在这种情况下，时间间隔At也可以还进一步延伸直到信噪比下降，而地点分辨率不因此受损。反之，以虚线示出激发光I的较长脉冲，该较长脉冲虽然也在干扰17插入之后才开始，但也在干扰17消退之后才结束。为了仍然记录仅来自发光阻抑光10的强度分布的局部最小处的试样冷光，时间间隔At在发光阻抑光10的脉冲之后的一段预给定时间之后结束。这段时间这样选择，使得对发光体的基态的干扰17在根据图5的局部最小处14之外还未消退。因此，时间间隔At典型地在发光阻抑光10的脉冲之后几个ps、通常仅大约Ips结束。
[0059]附图标记列表
[0060]I 激发光
[0061]2 冷光
[0062]3 STED 光
[0063]4 受激光
[0064]5 调制器单元
[0065]6 发光体
[0066]7 键
[0067]8 发光的中心
[0068]9 外壳
[0069]10发光阻抑光
[0070]11碰撞弛豫或者振动弛豫
[0071]12试样
[0072]13测量区域
[0073]14局部最小处
[0074]15结构
[0075]16局部最小处
[0076]17干扰
[0077]S。基态
[0078]S1激发态
[0079]At时间间隔
【主权项】
1.用于试样(12)的具有发光体(6)的结构(15)的空间高分辨率成像的方法， -其中，对所述试样(12)在测量区域(13)中以发光阻抑光(10)的具有局部最小处(14)的强度分布加载； -其中，对所述试样(12)在所述测量区域(13)中以发光激发光(I)加载，所述发光激发光将所述发光体(6)从电子基态(Stl)出发激发到发光态(S1)； -其中，记录从所述测量区域(13)发射的冷光(2)，并且 -其中，将所记录的冷光(2)对应于所述局部最小处(14)在所述试样(12)中的位置， 其特征在于，以所述发光阻抑光(10)这样干扰所述发光体￠)的所述电子基态(Stl),使得所述发光体(6)在被干扰的电子基态(Stl)中具有用于所述发光激发光(I)的减小至少50%的吸收横截面。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)具有在所述发光体(6)的发光激发光谱和/或荧光发射光谱之外的波长。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发光体￠)的电子基态(Stl)被分子的运动脉冲和/或振动干扰。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述运动脉冲或者振动从至少一个被所述发光阻抑光(10)激发的调制器单元(5)发出。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述至少一个调制器单元(5)在空间上配属于所述发光体(6)。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述至少一个调制器单元(5)化学地结合在所述发光体(6)上。7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)激发所述调制器单元(5)至顺-反异构化。8.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在被干扰的电子基态(Stl)中，所述发光体￠)中的原子排列被干扰。9.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光体(6)在被干扰的电子基态(Stl)中不处于与其环境的热平衡中。10.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，仅当所述发光体(6)的电子基态(Stl)被所述发光阻抑光(10)的脉冲干扰时，对所述试样(12)在所述测量区域(13)中以所述发光激发光(19)的脉冲加载。11.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所述发光体(6)的电子基态(Stl)还被所述发光阻抑光(10)的之前的脉冲干扰期间，记录从所述测量区域(13)发射的冷光(2)的时间段结束。12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)的脉冲具有在1fs至10，OOOfs的范围内、优选在50fs至500fs的范围内的长度。13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)的脉冲在所述测量区域中具有在IpJ至100pJ范围内、优选5pJ至500pJ范围内的能量。14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)的脉冲使在所述测量区域(13)中对所述发光体￠)的电子基态(Stl)的干扰在所述局部最小处(14)之外饱和。15.根据权利要求9至13中任一项和权利要求4至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)的脉冲使所述至少一个调制器单元(5)的状态(S1)的激发饱和，所述运动脉冲和/或振动从所述调制器单元发出。16.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其特征在于，在由其发光态发射不同波长的冷光(2)的不同发光体(6)上耦合相同的调制器单元，并且，将所述不同波长的冷光(2)分开记录并且对应于所述局部的最小处(14)的位置上的各个发光体(6)。17.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在记录从所述测量区域(13)发射的冷光⑵之前，对所述试样(12)以传统的STED光(3)、GSD光或者关断光的具有局部最小处的强度分布加载。
【专利摘要】为了试样(12)的具有发光体(6)的结构(15)的空间高分辨率成像，对试样(12)在测量区域(13)中加载以发光阻抑光(10)的具有局部最小处(14)的强度分布。然后对试样(12)在测量区域(13)中加载以发光激发光(1)，发光激发光将发光体(6)从电子基态(S0)激发到发光态，记录从测量区域(13)发射的冷光(2)。将记录的冷光(2)对应于所述局部最小处(14)在试样(12)中的位置。用发光阻抑光(10)干扰发光体(6)的电子基态，使得发光体(6)在被干扰的电子基态中具有用于发光激发光(1)的减小至少50％的吸收横截面。
【IPC分类】G01N21/17, G01N21/64
【公开号】CN104903701
【申请号】CN201480004445
【发明人】S·W·黑尔
【申请人】马克思-普朗克科学促进协会
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年1月9日
【公告号】DE102013100174A1, EP2943773A1, US20150308954, WO2014108453A1
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法，其中，对试样在测量区域中以发光阻抑光的具有局部最小处的强度分布加载，其中，对试样在测量区域中以发光激发光加载，所述发光激发光使发光体从电子基态出发被激发到发光状态，其中，记录从测量区域所发射的冷光，并且，将所记录的冷光对应于所述局部最小处在试样中的位置。
[0002]在这样的方法中，由测量区域所发射的冷光的强度是发光体在局部最小处在试样中的位置上的浓度的尺度。通过在局部最小处的每个位置上重复上述步骤来扫描具有局部最小处的试样，检测发光体在试样中的分布并且因此对具有发光体的结构成像。
[0003]在这里，用术语“发光体”是指这样的任意物质:当其处于被激发的发光态时，从该物质可获得作为测量信号的荧光。荧光染料尤其属于这样的物质。但是，该以基于冷光发射的过程不必是荧光。也可以涉及散射、例如Raman散射，在所述散射中，从被激发的过渡状态发射散射光，所述被激发的过渡状态被看作被激发的发光态。
[0004]试样的让人感兴趣的结构可以本身具有发光体，即为自动发光的。然而，试样的让人感兴趣的结构也可以以发光体人工标记。以发光体对结构的人工标记例如可以通过所谓的抗体染色、即通过发光体通过免疫反应连接，或者通过基因技术的改变来进行，所述基因技术的改变导致发光体与让人感兴趣的结构的共同表达。
[0005]如果在这里谈到一种状态、例如发光体的可激发的电子基态或者被激发的发光态，则涉及发光体的能发光的最小单元即分子、复合物、缺陷处、量子点或者诸如此类的电子状态。
[0006]如果在这里谈论的是光、例如发光阻抑光的强度分布的局部最小处，则以此尤其指的是强度分布的由干涉所产生的零位置。这样的零位置可以具有四个比它在光聚焦时由于衍射极限而可能的更小的尺寸。在此也能涉及真实的零位置，在该零位置中，光的强度实际上返回到零，或者涉及一种这样的零位置:在该零位置中，光的强度由于缺乏理想的光学情况而仅基本上返回到零。如果在这里谈到局部最小处的大小，则该大小尤其涉及体积的大小，在该体积中，相应的光造成通过该光所追求的效果、例如通过该光激发过渡未至饱和。
【背景技术】
[0007]一种已知的用于试样的具有发光体的结构在空间上高分辨率成像的方法作为GSD(基态耗竭，Ground State Deplet1n)网栅荧光显微镜已知，该方法以上述顺序包括独立权利要求1前序部分的步骤。在这种已知的方法中，以呈GSD光形式的发光阻抑光使发光体经过其电子被激发发光态、例如电子被激发单重态转为暗态、例如长寿命的三重态，发光体不被发光激发光从暗态激发到发光态。这发生在发光阻抑光的强度分布的局部最小处之外各处，直至饱和。即，在以发光阻抑光加载之后，只在发光阻抑光的强度分布的局部最小处中发光体还处于其电子基态，发光体被发光激发光从电子基态激发到发光态。因此，在以发光激发光激发之后，由发光体发射的冷光仅来自发光阻抑光的强度分布的局部最小处，因此对应于局部最小处在试样中的位置。
[0008]在以关键词GSD已知的方法中也存在发光体褪色的巨大风险，因为发光体不但在其被以发光阻抑光所转换到的长寿命的暗态中而且在其在转到其暗态中时中间占据的电子激发的发光态中以提高的程度例如倾向于与氧气化学反应和/或承受这样的风险:发光体被发光阻抑光或者发光激发光进一步电子激发，从而发生发光体的光化学褪色。
[0009]另一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法作为 RESOLFT(可逆饱和焚光过渡 Reversible Saturable Optical FluorescenceTransit1ns)网栅荧光显微镜的变型已知，该RESOLFT网栅荧光显微镜使用所谓可转换的发光体，该方法以上述顺序具有独立权利要求1前序部分的方法步骤。借助于呈关断光形式的发光阻抑光可将发光体从它在其中起发光体作用的第一构象状态转换到它在其中不起发光体作用的第二构象形态，即，在第二构象状态中，至少借助于在第一构象状态下适合于激发发光态的发光激发光不能将发光体激发到发光态，在发光态下，发光体发射被记录为测量信号的冷光。为了在发光阻抑光的强度分布的局部最小处之外各处促进这样的转换直至饱和，在第二构象状态的寿命足够长的情况下，仅需要相对小的光强度。此外不存在被转换到其另一构象状态中的发光体从该另一构象状态褪色出来的显著风险，因为发光体在该构象状态下对发光阻抑光和发光激发光不响应。然而，可转换的发光体借助于发光阻抑光向其第二构象状态的转换也经过被激发的电子态进行，该被激发的电子态在发光阻抑光的强度较高的情况下可以是用于发光体的光化学褪色的起点。由于该原因和其它原因，在有多个可转换的发光体时，两种构象状态之间的可用的转换过程的绝对数量是受限的，尤其当发光体根据需求主动地、即通过发光促进光从其不能发光的第二构象状态切换到其能发光的第一构象状态时。此外，即使在所述构象状态之间主动地来回切换，所述构象状态的已经提到的长寿命意味着:以关键词RESOLFT已知的用于试样的具有可转换的发光体的结构的空间高分辨率成像的方法也相对较慢。最后，商业上可用的适合于标记试样中的结构的可转换发光体的数量是有限的，尤其与大量原则上可用的发光体相比。而且开发新的稳定的可转换发光体是费事的。
[0010]一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率地成像的方法作为STED(受激辐射耗竭)网栅荧光显微镜已知，该方法以原则上与开头部分所列举的不同的顺序包括独立权利要求1前序部分的方法步骤。在这里，首先对试样在测量区域中以发光激发光加载，发光激发光将发光体从电子基态激发到发光态。然后对试样在测量区域中以呈STED光形式的发光阻抑光的具有局部最小处的强度分布加载，发光阻抑光使被激发的发光态通过受激发射再退激发到基态。当发光阻抑光使被激发的发光态在局部最小处之外各处通过受激发射又被退激发时，接着由测量区域发射的荧光只可能来自发光退激发光的强度分布的局部最小处，因此对应于局部最小处在试样中的位置。
[0011]在以关键词STED已知的方法中，在试样的具有发光体的结构的成像中实际也达到非常高的地点分辨率。然而在此，发光体显著承受光化学负荷并且因此强烈地倾向于褪色。原因在于，发光退激发光加载已经处于其被激发的发光状态下的发光体，该发光退激发光为了约束其强度分布的呈零位置形式的局部最小处而必须以高的绝对强度来施加。因此，除了所希望的使发光体返回其基态的受激发射外，其它过程、尤其发光体的在更大程度上并且导致褪色的电子激励也不是不可能的。对起先通过手激发射而被退激发的发光体的重新激发也可通过本来设置用于荧光退激发的光发生。
[0012]所有已知的、具有独立权利要求1前序部分的特征的、用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法基于:发光阻抑光使发光体或者在发光激发光射入之前从其能发光的基态经过被激发的电子态转换到暗态，或者从被激发的发光态返回到基态。即，在任何情况下，发光体被加载以高强度的、具有在发光体的吸收光谱中的波长的发光阻抑光，并且，与发光体的光化学褪色危险相关联的、被激发的电子态借助于发光阻抑光而参与到地点分辨率的提高中。而且，似乎在暗态寿命和必需的发光阻抑光强度之间产生关联，暗态寿命越长，该关联越少可能失效。
【发明内容】
[0013]本发明的任务是，提出一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法，在该方法中，发光体承受特别小的光化学褪色，但在扫描具有发光阻抑光的强度分布的最小处的试样时仍允许高的速度。
[0014]本发明的该任务通过具有独立权利要求1的特征的方法解决。在从属权利要求中定义根据本发明的方法的优选实施方式。
[0015]在用于试样的具有发光体的结构空间高分辨率成像的方法中，对试样在测量区域中以发光阻抑光的具有局部最小处的强度分布加载，其中，对试样在测量区域中以发光激发光加载，该发光激发光使发光体从电子基态出发被激发到发光态，其中，记录从测量区域所发射的冷光，将所记录的冷光对应于局部最小处在试样中的位置，在该方法中，以发光阻抑光这样干扰发光体的电子基态，使得发光体在被干扰的电子基态中具有用于发光激发光的减小至少50%的吸收横截面。在评估用于发光激发光的吸收横截面时的比较标准在这里为未被干扰的基态，在该未被干扰的基态中，发光体具有其用于发光激发光的100%吸收横截面。
[0016]在根据本发明的方法中，发光体不被发光阻抑光从电子基态引出或者从其它电子态返回到电子基态。即，不进行发光体的电子态的改变。取而代之，发光体的现有电子基态被干扰。该干扰至少到这个程度:使得发光体在被干扰的电子基态中与在未被干扰的电子基态中相比以最大一半概率被发光激发光激发到发光态。然而，典型地，该干扰还可更进一步，使得吸收横截 面降低到其在未被干扰的电子基态中的原始值的20%，10%，5%，3%，1%或者更少。该干扰典型地涉及发光体、尤其其原子核在其基态中的空间排列。该空间排列影响发光体对发光激发光的天线功能，或者换言之，影响发光体的用于与尤其呈发光激发光形式的光相互作用的能力、特别是用于吸收光的能力。由于这个原因，对这种排列的干扰改变用于发光激发光的吸收横截面。
[0017]对发光体基态的干扰所引起的阻碍发光体被发光激发光激发的效果也可以根据Franck-Condon原理解释，但其中要估计到，在干扰不但影响发光体的原子核的排列而且影响电子云的排列的情况下，可能违背该原理所基于的假设，尤其Born-Oppenheimer近似。根据Franck-Condon原理的观点，在被干扰的基态，缺乏发光体的被激发的发光电子态的合适的振动能级态。因此，被激发的发光电子态的所有振动能级态的Franck-Condon因子仅是小的并且导致仅小的跃迀概率。这与根据本发明减小用于发光激发光的吸收横截面是同义的。
[0018]此外，发光体的被干扰的基态的术语包含:被干扰的基态不是发光体与其环境的热平衡状态。虽然干扰伴随着发光体的能量提高；干扰也能将发光体提高到其基态的较高振动能级态。然而，发光体在其被干扰的基态中提高的能量不符合试样在发光体的环境中的温度普遍提高。而是被干扰的基态的能量明显高于发光体的由其环境温度所限定的热能。相应地，当再次出现发光体与其环境的热平衡时，根据本发明通过发光阻抑光所引起的对发光体电子基态的干扰就失去。然后仅剩下试样在干扰能量所分布的区域中的小的温度提高。这意味着，在执行根据本发明的方法时首要考虑的时间尺度通过弛豫时间确定，随着所述弛豫时间，发光体回复到其与其环境的热平衡中。在这里，该弛豫时间也被称作碰撞弛豫时间或者振动弛豫时间，因为热平衡典型地通过将运动脉冲和/或振动传递到邻近的分子上来建立。碰撞弛豫时间或振动弛豫时间的典型数量级在较多飞秒(fs)范围至皮秒(ps)范围，即从几十飞秒至几皮秒。典型地，所述数量级在几百到数百飞秒的范围内。
[0019]试样的由于通过发光阻抑光所引入的能量引起的温度提高在一段时间间隔中这样扩张，使得该提高也影响被发光阻抑光的强度分布遗漏的局部最小处，该时间间隔长几个数量级并且在纳秒(ns)范围至微秒(ys)范围内。因此，该时间间隔不规定对于根据本发明的方法重要的附加时间极限，特别是因为在所述方法中，在强度分布的局部最小处之外也不力求试样在测量区域中的温度普遍提高，而是使该提高保持尽可能小。
[0020]不言而喻，在根据本发明的方法中，发光阻抑光具有在发光激发光谱之外的波长，在优选实施方式中也具有在发光体的发光退激发光谱之外的波长，借此可以使用发光阻抑光选择性地用于干扰发光体的电子基态。在此，当对应的吸收横截面例如最大为用于在发光激发光谱或者发光退激发光谱中的发光激发或者发光退激发的最大吸收横截面的5%时，可认为波长为在发光体的发光激发光谱或者发光退激发光谱之外。
[0021]对发光体的电子基态的干扰典型地通过运动脉冲或者振动的分子传递、例如通过分子碰撞来进行。通过被传递到发光体上的运动脉冲或者振动干扰其空间排列。在此，对空间排列的干扰首要涉及发光体的原子核的空间布置，但是也伴随着对包围原子核的电子云的干扰。
[0022]用于干扰发光体基态的运动脉冲或者振动尤其可能出自至少一个被发光阻抑光激发的调制器单元的碰撞弛豫或者振动弛豫。即，发光阻抑光将至少一个调制器单元例如从其电子基态激发到电子激发态，所述电子激发态然后由于碰撞弛豫或者振动弛豫、即在将运动脉冲和/或振动传递到发光体上的情况下，再次转移到电子基态中。
[0023]所述至少一个调制器单元尤其可以是单独的分子或者功能性基团。因此，所述调制器单元可以从不发光的染料的基团中选择，所述染料包括偶氮色素、胡萝卜素、青色素、衍生香豆素和所谓光敏化剂。具体地可以是晶紫或者亚甲蓝。发光体可以是在结构上所使用的发光染料。
[0024]为了有效率地传递运动脉冲和/或振动到发光体上，调制器单元尽可能直接地在空间上配属给发光体。因此，例如在绿色荧光蛋白(GFP)的外罩(桶)中的发光中心旁边的水分子被用作调制器单元，因为它们在空间上紧密地邻近发光中心。
[0025]此外可能的是:所述至少一个调制器单元通过键合耦合在发光体上。这样的键合可以是共价的或者可以包括化学桥。根据键合的类型不同，调制器单元较柔性或者较刚性地耦合在发光体上。决定性的是，由于调制器单元的碰撞弛豫或者振动弛豫，用于发光体的电子基态的所希望的干扰的足够动能被传递到发光体上。
[0026]调制器单元可以相对于它耦合在其上的发光体折曲成角度。即，调制器单元优选具有至少大致相对于发光体的π共轭电子系统正交的π共轭电子系统。那么，尽管可利用耦合到发光体上来传递运动脉冲和/或振动，调制器单元仍尽可能少地干扰不被干扰的发光体的发光特性。
[0027]具体地，调制器单元可以通过发光阻抑光被激发至顺-反异构化。当发光体结合到调制器单元的重排的原子基团上时，在异构化时进行的调制器单元原子基团重排特别有效地作为运动脉冲被传递到耦合的发光体上。在调制器单元的两个在异构化时改变其相对布置的原子基团上也可以分别结合一个发光体。在此，如果由发光阻抑光所激发的异构化不稳定并且调制器单元在异构化之前自发返回到其初始状态，运动脉冲也传递到每个被结合的发光体上，该运动脉冲干扰结合的发光体的基态。
[0028]在被干扰的电子基态中，在发光体中尤其是原子的排列、即原子核的立体或者空间布置被干扰。在此，干扰也可以是原子在发光体的不能发光的其它构象状态的方向上的振动，但该其它构象状态或者不被实现或者不稳定。无论如何，已经提到的发光体与发光激发光相互作用的能力被该干扰有针对性地损害。如同样已经提到的，这样的干扰由于其不符合发光体的热平衡，即使被有效率地激发也仅持续有限时间。相应地，与已知的用于试样在空间上高分辨率地成像的方法相比，根据本发明的方法的方法步骤必须快速地相继执行。
[0029]尤其是，仅当发光体的电子基态被发光阻抑光的脉冲干扰时，才应对试样在测量区域中以发光激发光的脉冲加载所述。即，发光激发光既不应在发光体的基态被干扰之前、也不应在干扰消退之后被施加到试样上。因此，发光激发光在发光阻抑光的强度分布的最小处之外基本上仅照射在具有被干扰的基态的发光体上，从而在该最小处之外不进行发光态的相关激发。如果遵守该条件，则被从试样记录的冷光仅来自发光阻抑光的强度分布的局部最小处，不管它是在试样被加载以发光激发光期间还是之后记录的。
[0030]为了在以发光激发光加载时确实存在对基态的干扰所希望的空间分布，还不允许发光体从其被干扰的基态再返回到与其环境的热平衡中。为了确保这一点，发光激发光距离发光阻抑光的最大时间间距可遵循1000fs、500fs或者更短的时间。如果不可能或者仅以大的花费才能将发光激发光限制在一个时间段上，在该时间段中发光体的电子基态确实被干扰，则可以这样优化利用本发明方法的提高分辨率的效果:记录从测量区域发射的冷光的时间段已经结束，而发光体的电子基态还被发光阻抑光的之前的脉冲干扰，即使发光激发光的脉冲还未消退。被检测的冷光的具有处于被干扰的基态的碰撞弛豫时间或振动弛豫时间的范围内的时间分辨率的这种“门(Gaten) ”使得只记录这样的发光体的冷光:该发光体在发光体的电子基态的干扰以围绕发光阻抑光的强度分布的最小处的希望的空间分布给出的时间点被激发。典型地，在以发光激发光对发光体的激发继续进行期间，最晚在发光阻抑光的脉冲之后几个ps、通常仅大约lps，在本发明方法中记录发射的冷光的所述有限时间段结束。
[0031]与荧光发光态的典型寿命相比，几个ps可能只是短的并且因此不足以影响可从被激发的发光体原则上获得的冷光的较大部分。然而其它发光态，包括从三重基态被电子激发的发光三重态或者例如Raman散射物质的参与光散射的发光过渡态，可能具有短得多的寿命。在通过根据本发明的发光阻抑光干扰进行光散射的物质的基态时，其散射光谱被移动式改变或者其它方式改变。
[0032]发光阻抑光的脉冲的持续时间在第一近似中是不明显的，只要该通过脉冲传递的能量足够引起对发光体的基态的希望的干扰。因此，原则上发光阻抑光也可以连续地施加。然而这会关系到对试样中的不希望的热输入，该热输入可能会使得仅在发光阻抑光的强度分布的最小处之外对发光体的电子基态局部干扰越来越困难。已知现象是:荧光染料的荧光发射随着温度上升而下降。试样温度的普遍提高也会使其在其未被干扰的、即处于热平衡中的基态中吸收横截面减小。因此，在本发明中优选，发光阻抑光以短的脉冲施加，所述短的脉冲典型地可以为1fs和100fs之间、通常在50fs和500fs之间长，具体地可以为大约300fs长。通过这类短的脉冲，仅有限的能量被传递到试样上，该能量在扫描试样 时在试样温度没有被原则性提高的情况下也能被耗散。发光阻抑光的每个脉冲向具有由衍射极限所确定的大小的测量区域中输入的用于根据本发明干扰发光体基态的能量在IpJ至10，OOOpJ的典型范围内，通常在5pJ和500pJ之间。在该能量情况下，在测量区域中引起的试样温度提高保持小，即使通过发光阻抑光引入的能量不再从试样导出。
[0033]优选发光阻抑光的脉冲具有这样的强度:该脉冲使得在测量区域中对发光体电子基态的干扰在其强度分布的局部最小处之外饱和。即，对电子基态的干扰在测量区域中在局部最小处之外的各处至少这样大，使得用于发光激发光的吸收横截面减小至少50%。
[0034]实践中可以这样设计发光阻抑光的脉冲，使得它使至少一个调制器单元的通过碰撞弛豫或者振动弛豫而松弛的激发态饱和。通过以足够密度设置调制器单元则可以确保在发光阻抑光的强度分布的最小处之外各处对发光体的希望的基态的希望的干扰。
[0035]根据本发明的方法使得能够以最小的花费同时对具有不同发光体、即发射不同波长的冷光的发光体的不同结构成像。为此，原则上，所有可用相同激发阻抑光激发的相同调制器单元耦合在不同的发光体上并且不同波长的冷光被分开记录并对应于在激发阻抑光的强度分布的局部最小处的位置上的各个发光体，就足够了。激发阻抑光的强度分布的局部最小处对调制器单元耦合在其上的所有发光体限定试样体积，冷光可来自该体积。即使将不同的发光体用具有与相应发光体协调的不同波长的发光激发光激发到其发光态，这也是没问题的，因为在此不必使不同强度分布的局部最小处如在对具有不同发光体的不同结构同时成像时那样重合，其它情况下则通常要求这样。
[0036]在根据本发明的方法的另一拓展实施方式中，在记录从测量区域发射的冷光之前，附加地以传统发光阻抑光的具有局部最小处的强度分布加载试样，所述传统发光阻抑光落入发光体的吸收光谱中并且在参与被激发的电子激发态的情况下阻碍发光体发光。该附加的传统发光阻抑光可以根据已知的STED原理、GSD原理或者RESOLFT原理进一步限制可从试样中发射出冷光的空间区域。即，传统的发光阻抑光可以是STED光、GSD光或者关断光，其中，后者以可转换的发光体为前提。然而在此，对于STED、GSD或者RESOLFT来说典型的发光体褪色风险不出现或者至少明显更少出现，因为传统发光阻抑光的高强度仅(或者至少主要地)照射到处于其被干扰的基态而不处于被电子激发并从而倾向于光化学褪色的状态中的发光体上。在本发明方法的该实施方式中，村集体发光阻抑光在其强度分布的局部最小处附近以其相对小的强度起作用，该强度分布不关系到较大的发光体光化学褪色风险。
[0037]根据本发明的方法的最后所说明的变型也可以这样解释:通过以发光阻抑光干扰基态，发光体在STED方法、GSD方法或者RESOLFT方法情况下的STED光、GSD光或者关断光的高强度区域内转换为保护态，在保护态中，发光体不像在其它情况下那样强地产生由于STED光、GSD光或者关断光的高强度而被光化学褪色的风险。原则上，这种有利效果也可以在此时实现:根据本发明的发光阻抑光虽然首要干扰发光体的基态而不电子激发该基态，但部分地也起到传统发光阻抑光的作用，即起到STED光、GSD光或关断光的作用，因而通过一个波长以两种方式提高根据本发明的方法的地点分辨率。
[0038]从权利要求、说明书和附图中得出本发明的有利扩展方案。在说明书中所提到的特征和多个特征的组合的优点仅是示例性的，并且可以替代地或者累积地产生效果，而不必强制性地由本发明实施方式实现这些优点。在不因此改变所附的权利要求的主题的情况下，就原始的申请文件和专利的公开内容而言适用的是:从附图、尤其所示出的几何形状和多个构件相对于彼此的相对尺寸以及它们的相对布置和作用连接，可得知进一步的特征。本发明的不同实施方式的特征或者不同权利要求的特征的组合在偏离权利要求的所选择的引用关系的情况下也是可行的，在此被建议。这也涉及单独的附图中示出或者在其说明书中提到的特征。这些特征也可以与不同权利要求的特征组合。也可以为了本发明的进一步的实施方式而取消在权利要求中列举的特征。
[0039]在权利要求和说明书中所提到的特征在其数量方面应这样理解:刚好存在该数量或者比所提到的数量更大的数量，而不需要明确地使用副词“至少”。即，如果例如提到一个元件，则应这样理解:存在恰好一个元件、两个元件或者多个元件。这些特征可以通过其它的特征来补充，或者可以是唯一的特征，由所述特征组成相应的产品。
[0040]包含在权利要求中的附图标记不是对由权利要求保护的主题的范围的限制。它们仅用于使权利要求更容易理解的目的。
【附图说明】
[0041]下面参考在附图中示出的优选实施例进一步解释和说明本发明。
[0042]图1示出作为发光体的例子的荧光染料在其单重态中的能量谱。
[0043]图2示意性地示出具有两个耦合上的调制器单元的发光体。
[0044]图3示意性表示出一种发光体，在该发光体中，多个具有发光的中心的调制器单元布置在共同的外壳中。
[0045]图4示出调制器单元在其单重态中的能量光谱，
[0046]图5说明根据本发明的方法的单个的步骤；和
[0047]图6为在图5中所说明的方法的主要的步骤的时间流程图。
【具体实施方式】
[0048]在图1中所表示出的荧光染料在其单重态中的能量谱包括具有不同的振动能级态的电子基态Stl和被激发的发光的电子态S 10借助于激发光I可将荧光染料从其基态Stl激发到其激发态Si。该状态S1自发地衰变为基态SC1，其中，发射冷光2、在这里具体是荧光。然而，激发态S1也可以在发射冷光2之前有针对性地借助于STED光3来减灭，STED光具有不同于激发光I和冷光2的波长并且STED光使荧光染料从其激发态31在受激地发射与STED光3相同波长的光4的情况下返回其基态激发光I也可以具有不同于冷光2的波长，尤其较短的波长，从而冷光2可以在其波长上与所有其它的光分开。
[0049]用以吸收激发光I的吸收横截面、即激发光I导致荧光染料被从其基态Stl激发到被激发的电子态S1的概率，取决于，荧光染料是否处于基态S ^的具有低能量的振动能级态中。因此，吸收横截面随着荧光染料的温度的强烈提高和占据基态Stl的更高振动能级态而减小。然而，在根据本发明的方法中，不引起荧光染料在热平衡中的普遍的温度提高。而是焚光染料在焚光阻抑光或者说发光阻抑光的强度分布的最小处之外被一个或多个运动脉冲和/或振动直接传递这样干扰，使得它虽然保持在其电子基态Stl中，但是用于激发光I的吸收横截面明显减小。这可以被解释为，单个荧光染料的振动能量或者振荡能量由于每次碰撞和用于激发光I的吸收横截面的相应减小而提高。这种能量提高明显超出荧光染料基于其周围环境温度的热能。如果在根据本发明的方法中在以发光阻抑光的加载结束之后又出现荧光染料与其环境的热平衡，则已再次失去其基态的使用于激发光I的吸收横截面减小的干扰。与其环境处于热平衡的荧光染料的保持的小的温度提高虽然还能在一定时间在发光阻抑光的强度分布的局部最小处的位置上具有局部最小处，但是不再导致在该局部最小处之中和之外显著不同的用于发光激发光的吸收横截面。为了提高地点分辨率，只有紧接着荧光染料的碰撞激发之后的热不平衡状态是可利用的。
[0050]为了在发光体中引起这种碰撞激发(到现在为止所说明的荧光染料是这种发光体的一个例子)，调制器单元5耦合到发光体6上，这些调制器单元吸收发光阻抑光并且将其转换为运动脉冲和/或振动。这在图2中以草图示出，在该图中，两个调制器单元5通过键7这样折曲90°地耦合到发光体6上，使得其共轭电子系统基本上与发光体6的共轭电子系统正交。调制器单元5的数量也可以小于或大于两个。键合的方式也可以是不同的。但是，理想地，不损害发光体6的发光特性的键合将从调制器单元5发出的运动脉冲和/或振荡有效地传递到发光体6上。具体地，可被发光阻抑光激发至顺-反异构化的连接例如偶氮生色团很好地适合于作为调制器单元5，以将这样的运动脉冲传递到各个结合的发光体6上，所述运动脉冲根据本发明干扰发光体的基态。在此可以使两个发光体结合到调制器单元的两个原子基团上，所述两个原子基团在异构化时相对于彼此重排。
[0051]图3示出发光体6，在该发光体中，发光中心8与调制器单元5共同地被外壳9紧密围绕。这类的状况在例如绿色荧光蛋白中出现，在其中，调制器单元5为水分子。这些水分子可以被以发光阻抑光激发到一种状态，该状态由于振动弛豫或者碰撞弛豫而衰变，其中，从调制器单元5发出的运动脉冲和振动被传递到发光体6或者说其发光中心8上，并且其用于激发光I的吸收横截面根据图1减小。
[0052]图4画出在调制器单元I在单重态中的能量谱的草图。通过发光阻抑光10使调制器单元I从基态Stl转换到被激发的电子态、例 如其S i态或者S2态。尤其是，为了激发向较高的S2态的过渡所需的能量可以通过激发光的在UV范围内并从而在发光体6的吸收光谱和发射光谱之外的波长来提供。被激发的S1态或者S 2态非常快速地由于振动弛豫或碰撞弛豫11衰变回到基态Stl，其中，在调制器单元5合适地耦合的情况下，运动脉冲和/或振动被传递到发光体6上并且以希望的方式干扰其基态。
[0053]图5画出根据本发明的方法的步骤的草图。根据图5(a)，对试样12在测量区域13中以发光阻抑光10加载。在此，发光阻抑光10的强度分布在测量区域13的中心具有呈零位置形式的局部最小处14。即，在局部最小处14之外各处、但不在局部最小处14中，发光阻抑光10干扰发光体6的基态，通过该发光体标记试样12中的结构15。
[0054]在根据图5(b)的下一步骤中，对试样12在测量区域13中以激发光I加载。但是，激发光I只能(或者至少主要只能)在发光阻抑光10的局部最小处14中根据图1激发例如为荧光染料的发光体6。因此，在根据图5(d)的步骤中将从测量区域13记录的荧光2对应于所述局部最小处14，因为所述冷光只能(或者至少主要只能)来自该局部最小处14之内的发光体6。
[0055]在图5(c)中画出附加的、可选的方法步骤的草图，在该方法步骤中，在步骤(d)之前，对试样12在测量区域13中附加地以STED光3加载，所述STED光也具有在测量区域13的中心的局部最小处16。如果该局部最小处16还小于局部最小处14，则由此还更强烈地限制根据图5 (d)的冷光2空间对应，由此还进一步提高在对结构15成像时的空间分辨率。
[0056]在扫描具有局部最小处14或者16的试样时，对局部最小处在试样中的所有位置重复进行在图5中所画出草图的步骤。借此检测发光体6在试样中的分布并且因此对以该发光体标记的结构15成像。
[0057]在图5中所画出的、发光阻抑光10和STED光3的强度分布仅是示例性的。他们可以采用任意的其它形状，即，邻接局部最小处14或者16具有如从STED-荧光显微镜已知的那样的任意强度变化。
[0058]图6表不出发光阻抑光10的脉冲、对发光体的基态产生的干扰17、激发光I的随后的脉冲以及记录试样的冷光的时间间隔At的在时间上的顺序。在此，以实线示出激发光I的短脉冲，该短脉冲在干扰17插入之后才开始并且在干扰17消退之前已结束。在这种情况下，时间间隔At也可以还进一步延伸直到信噪比下降，而地点分辨率不因此受损。反之，以虚线示出激发光I的较长脉冲，该较长脉冲虽然也在干扰17插入之后才开始，但也在干扰17消退之后才结束。为了仍然记录仅来自发光阻抑光10的强度分布的局部最小处的试样冷光，时间间隔At在发光阻抑光10的脉冲之后的一段预给定时间之后结束。这段时间这样选择，使得对发光体的基态的干扰17在根据图5的局部最小处14之外还未消退。因此，时间间隔At典型地在发光阻抑光10的脉冲之后几个ps、通常仅大约Ips结束。
[0059]附图标记列表
[0060]I 激发光
[0061]2 冷光
[0062]3 STED 光
[0063]4 受激光
[0064]5 调制器单元
[0065]6 发光体
[0066]7 键
[0067]8 发光的中心
[0068]9 外壳
[0069]10发光阻抑光
[0070]11碰撞弛豫或者振动弛豫
[0071]12试样
[0072]13测量区域
[0073]14局部最小处
[0074]15结构
[0075]16局部最小处
[0076]17干扰
[0077]S。基态
[0078]S1激发态
[0079]At时间间隔
【主权项】
1.用于试样(12)的具有发光体(6)的结构(15)的空间高分辨率成像的方法， -其中，对所述试样(12)在测量区域(13)中以发光阻抑光(10)的具有局部最小处(14)的强度分布加载； -其中，对所述试样(12)在所述测量区域(13)中以发光激发光(I)加载，所述发光激发光将所述发光体(6)从电子基态(Stl)出发激发到发光态(S1)； -其中，记录从所述测量区域(13)发射的冷光(2)，并且 -其中，将所记录的冷光(2)对应于所述局部最小处(14)在所述试样(12)中的位置， 其特征在于，以所述发光阻抑光(10)这样干扰所述发光体￠)的所述电子基态(Stl),使得所述发光体(6)在被干扰的电子基态(Stl)中具有用于所述发光激发光(I)的减小至少50%的吸收横截面。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)具有在所述发光体(6)的发光激发光谱和/或荧光发射光谱之外的波长。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发光体￠)的电子基态(Stl)被分子的运动脉冲和/或振动干扰。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述运动脉冲或者振动从至少一个被所述发光阻抑光(10)激发的调制器单元(5)发出。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述至少一个调制器单元(5)在空间上配属于所述发光体(6)。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述至少一个调制器单元(5)化学地结合在所述发光体(6)上。7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)激发所述调制器单元(5)至顺-反异构化。8.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在被干扰的电子基态(Stl)中，所述发光体￠)中的原子排列被干扰。9.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光体(6)在被干扰的电子基态(Stl)中不处于与其环境的热平衡中。10.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，仅当所述发光体(6)的电子基态(Stl)被所述发光阻抑光(10)的脉冲干扰时，对所述试样(12)在所述测量区域(13)中以所述发光激发光(19)的脉冲加载。11.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所述发光体(6)的电子基态(Stl)还被所述发光阻抑光(10)的之前的脉冲干扰期间，记录从所述测量区域(13)发射的冷光(2)的时间段结束。12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)的脉冲具有在1fs至10，OOOfs的范围内、优选在50fs至500fs的范围内的长度。13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)的脉冲在所述测量区域中具有在IpJ至100pJ范围内、优选5pJ至500pJ范围内的能量。14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)的脉冲使在所述测量区域(13)中对所述发光体￠)的电子基态(Stl)的干扰在所述局部最小处(14)之外饱和。15.根据权利要求9至13中任一项和权利要求4至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)的脉冲使所述至少一个调制器单元(5)的状态(S1)的激发饱和，所述运动脉冲和/或振动从所述调制器单元发出。16.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其特征在于，在由其发光态发射不同波长的冷光(2)的不同发光体(6)上耦合相同的调制器单元，并且，将所述不同波长的冷光(2)分开记录并且对应于所述局部的最小处(14)的位置上的各个发光体(6)。17.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在记录从所述测量区域(13)发射的冷光⑵之前，对所述试样(12)以传统的STED光(3)、GSD光或者关断光的具有局部最小处的强度分布加载。
【专利摘要】为了试样(12)的具有发光体(6)的结构(15)的空间高分辨率成像，对试样(12)在测量区域(13)中加载以发光阻抑光(10)的具有局部最小处(14)的强度分布。然后对试样(12)在测量区域(13)中加载以发光激发光(1)，发光激发光将发光体(6)从电子基态(S0)激发到发光态，记录从测量区域(13)发射的冷光(2)。将记录的冷光(2)对应于所述局部最小处(14)在试样(12)中的位置。用发光阻抑光(10)干扰发光体(6)的电子基态，使得发光体(6)在被干扰的电子基态中具有用于发光激发光(1)的减小至少50％的吸收横截面。
【IPC分类】G01N21/17, G01N21/64
【公开号】CN104903701
【申请号】CN201480004445
【发明人】S·W·黑尔
【申请人】马克思-普朗克科学促进协会
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年1月9日
【公告号】DE102013100174A1, EP2943773A1, US20150308954, WO2014108453A1
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