肺中的细菌负荷位置的确定的制作方法
肺中的细菌负荷位置的确定的制作方法
【专利说明】
[0001] 与相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月12日提交的美国临时申请号61/736, 239的利益，所述 临时申请的全部内容通过参考并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及受试者的肺中细菌负荷的存在和位置的检测方法。
【背景技术】
[0004] 细菌天然存在于肺中，并且如果细菌负荷保持低水平，这些细菌将不会不利地影 响正常的呼吸功能。细菌的存在被称为定植而不是感染。当上气道中细菌负荷增加时，它 仍可能定植，并且通常不危及生命，但是增加的定植可能是感染的先兆，因此在严重感染发 生之前，可以开始采取措施以降低定植。增加的定植可以使用非侵入性方法，例如通过增加 气道清理或通过给药口服或吸入广谱抗生素来治疗。
[0005] 在肺的下气道更深处，细菌较不常见。下气道中细菌负荷的增加通常与感染相关， 其中细菌具有更高侵袭性。下气路（"下呼吸道"）中细菌负荷的增加可能危及生命，引起 感染例如肺炎。下气路中细菌负荷的增加需要更具侵入性的治疗方法，例如静脉内广谱抗 生素。
[0006] 可以确定增加的细菌负荷是在上呼吸道还是下呼吸道中的快速测试，将有助于确 定适合的治疗方法。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明涉及用于确定受试者的呼吸系统中细菌负荷存在或不存在及其位置的方 法，所述方法包括：向所述受试者给药有效量的在细菌代谢后产生 13〇)2的13C同位素标记 的化合物；从所述受试者收集多个呼出气样品；至少一个所述样品包含来自于所述受试者 的上呼吸道的呼气；并且至少一个所述样品包含来自于所述受试者的下呼吸道的呼气；将 至少一些所述样品导向检测装置的样品室；评估在所述至少一些样品的每个样品中存在的 13〇)2与12〇)2的同位素比率；以及将由此确定的同位素比率与收集所述被导向样品室的样 品的呼吸系统中的位置相关联。
[0009] 附图简述
[0010] 图1是按照本发明的某些实施方式使用的示例性激光吸收装置的平面视图。
[0011] 图2示出了优选的跳跃扫描方法。
[0012] 示例性实施方式的详细描述
[0013] 确定受试者是否具有肺部细菌感染的方法以前已被描述。这些方法包括例如向 受试者给药在细菌代谢后产生 13〇)2的13c同位素标记的化合物。然后收集呼出气的样品并 对其进行分析，以确定样品中存在的13〇) 2与12co2的同位素比率。与对照样品相比，呼出气 样品中13〇) 2与12co2的同位素比率提高，指示了肺部细菌感染。参见例如美国临时申请号 61/715, 992 和U.S. 7, 771，857。
[0014] 然而，这些现有方法不提供关于肺中感染位置的任何信息。那些方法也不能在 定植和感染之间做出区分。本发明涉及用于确定肺中增加的细菌负荷的位置的方法。使 用本发明的方法，可以检测能够将本发明的 13c同位素标记的化合物转变成13〇)2的任何细 菌。这样的细菌的实例包括铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)、结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis)、鲍氏不动杆菌 (Acenitobacterbaumannii)、肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiellapneumonia)、土拉热弗朗 西丝氏菌（Francisellatularenis)、奇异变形杆菌（Proteusmirabilis)和曲霉属物种 (Aspergillusspecies)〇
[0015] 来自于受试者的整个呼出气样品包括来自于上气道和下气道两者的空气。来自于 下气道的空气与来自于上气道的空气相比具有更高的二氧化碳浓度。一般理解，来自于健 康成年人的下气道的空气具有约40mmHg的C02压力。JohnF.Murray，《正常肺脏》（The NormalLung)，第二版，W.B.SaundersCompany,Philadelphia1986,184 页。来自于上气 道的空气一般具有低于1mmHg的C02压力。同上。因此，本领域技术人员可以通过确定C02 浓度来确定呼出气样品是来自于上气道还是下气道。具有较高〇)2浓度的样品来自于下气 道，而具有较低C02浓度的样品来自于上气道。
[0016] "二氧化碳描记术"在本领域中是指监测呼吸气体中二氧化碳的浓度或分 压。用于执行这种监测的装置和方法对于本领域技术人员来说是已知的。参见例如 U.S. 3, 830, 630、U.S. 7, 122, 154和SchubertJ.K.等，"在机械通气患者中肺泡气体的C02 控制的取样"（C02-controlledsamplingofalveolargasinmechanicallyventilated patients),J.Appl.Physiol. (1985). 2001Feb；90 (2):486~92〇
[0017] 也可以使用主动压力感应来确定呼出气源自于肺中何处。参见例如TO 2008/060165、U.S. 7, 547, 285。或者，可以使用被动压力感应来引导和分离来自于上 呼吸道和下呼吸道的样品。参见例如Bio-VOC?呼吸取样器（MarkesInternational Limited，UnitedKingdom)、U.S. 3, 734, 692、TO1994/018885、TO2003/049595 和TO 2004/032727。
[0018] 呼出气样品的来源的确定，也可以通过测量呼气样品的温度来实现。参见例如 U.S. 4, 248, 245。或者，使用本领域中已知的经胸电阻抗法来监测呼出气。
[0019] 在本领域中还已了解，在整个呼出气中，首先呼出的样品将来自于上气道，而在较 晚时间呼出的样品将来自于下气道。因此，专业技术人员可以将呼出气样品的位置与收集 样品的时间在整个呼气过程中的时间点相关联。
[0020] 本发明的方法包括向受试者给药有效量的在细菌代谢后产生13〇)2的13c同位素标 记的化合物。这样的化合物的示例性实例包括同位素标记的脲、同位素标记的甘氨酸、同位 素标记的瓜氨酸或其混合物。 13c同位素标记的化合物的给药可以通过任何已知手段来实 现。优选的给药方法包括吸入和摄食。通过注射即肌肉内、皮下、腹膜和真皮内注射给药， 也在本发明的范围之内。
[0021] 在本发明的某些实施方式中，将13c同位素标记的化合物给药到呼吸道的特定区 域。例如，在某些实施方式中，将13c同位素标记的化合物递送到肺的下部区域，即肺泡区 域。在某些实施方式中，将13c同位素标记的化合物递送到肺的上部区域。在其他实施方式 中，将13c同位素标记的化合物递送到肺的支气管区域。在又一些实施方式中，将13c同位素 标记的化合物递送到肺的外周区域。用于将化合物定向递送到呼吸道的特定区域的方法和 装置在本领域中是已知的。参见例如u.S. 8, 534, 277。
[0022] 在本发明的范围内，可以在给药13C同位素标记的化合物之前从受试者收集一个 或多个呼出气样品。这样的样品可以在本发明的方法中用作对照样品。或者，对照样品可 以包括在尚未给药 13c同位素标记的化合物的群体的呼出气中存在的130)2与12C02的同位 素比率。
[0023] 在给药13C同位素标记的化合物后适合的时间段后，从受试者收集多个呼出气样 品。"适合的时间段"是指化合物被细菌转变成二氧化碳所需的时间长度。优选地，在给药 后不超过40-70分钟后收集样品。
[0024] 在某些实施方式中，可以评估受试者完成基本上完整的呼气所需的时间。也可以 评估受试者的呼吸模式。这些评估可用于例如确定在呼气期间用于取样的预选时间段。
[0025] 可以将样品收集在适合于容纳呼出气样品的任何容器中，例如袋子或小瓶。也可 以通过使用适合的吹嘴将样品直接呼出到装置中。也可以通过使用来自于其他呼吸设备例 如呼吸机上的适合端口的鼻插管进行收集，将样品直接呼出到检测装置的样品室中。
[0026] 至少一个呼出气样品来自于受试者的上呼吸道，并且至少一个呼出气样品来自于 受试者的下呼吸道。专业技术人员可以通过确定样品的相对二氧化碳浓度来鉴定呼出气样 品的来源。较高的二氧化碳浓度指示了源自于下气道的样品。较低的二 氧化碳浓度指示了 源自于上气道的样品。
[0027] 或者，专业技术人员可以将呼出气样品的来源与样品收集的时间点相关联。在整 个呼气开始时或附近收集的样品源自于上气道。在整个呼气结束时或附近收集的样品源自 于下气道。
[0028] 呼出气的来源也可以使用本领域中已知的任何方法来确定，例如二氧化碳描记 术、主动压力感应、被动压力感应、温度感应和经胸电阻抗。
[0029] 对样品进行分析以确定样品中130)2与12C02的同位素比率。对于给定的时间段来 说或直至活性水平的确定达到预设准确度，优选地取样至少大部分呼出气，最优选地取样 每个呼出气。通过将样品的同位素比率与样品来源相关联，专业技术人员可以确定存在或 不存在细菌负荷的增加，以及所述增加是在上气道还是下气道中。
[0030] 将样品导向检测装置的样品室。开动检测装置的激光光源以发射一对或多对波 长 2054. 37 和 2052. 42、2054. 96 和 2051. 67 或 2760. 53 和 2760. 08 纳米。将由此开动的激 光引导通过样品室中的样品，以使这样的波长射到检测器上。然后可以确定样品中存在的 130) 2与120)2的同位素比率。
[0031] 可以产生显示测试受试者的呼气中13〇)2与12co2的比率随时间变化的图或曲线。 显示了 13〇)2与12co2的比率随时间增加的曲线，证实了存在细菌感染。
[0032] 将130)2与12C02的浓度或量（比率）与健康受试者中130)2与 12C02的标准浓度（比 率）进行比较，并方便地产生曲线。从所述曲线，可以直接确定或诊断存在或不存在增加的 细菌负荷。用于将输出比率与从健康受试者预期的比率进行比较的其他方法，也可以使用。
[0033] 在示例性实施方式中，可以将曲线拟合于这些测量的浓度，然后优选地通过确定 曲线的上升速率进行分析。这样的分析（上升速率）指示了受试者中细菌负荷的活性水平， 其可用于诊断受试者中细菌负荷的存在和程度。这同一种方法经过修改，可用于确定疗法 的有效性以及感染或定植的抑制和/或治愈的预后。
[0034] 在本发明的范围内，包括通过将在给药13C_同位素标记的化合物后获得的呼出气 样品中13〇)2与 12C02的同位素比率与给药13C_同位素标记的化合物之前从所述受试者获得 的呼出气样品中13〇)2与 120)2的同位素比率进行比较，来检测受试者中存在或不存在细菌 负荷的方法。
[0035] 在本发明的范围内，在吸入13C_同位素标记的化合物后获得的呼出气样品中13C02 与12〇)2的比率与在吸入13c-同位素标记的化合物之前从所述受试者获得的呼出气样品中 13〇)2与 12co2的同位素比率相比的提高，指示了细菌负荷的存在。如果所述样品源自于上气 道，则在上气道中可能存在定植。如果所述样品源自于下气道，则在下气道中可能存在感 染。
[0036] -旦确定了增加的细菌负荷是在上气道还是下气道中，则可以启动适合的疗法。 例如，如果增加的细菌负荷是在上气道中，则可以在受试者的呼吸道中启动增加的气道清 理。也可以给药口服或吸入抗生素或其他适合的治疗药剂。
[0037] 如果增加的细菌负荷是在下气道中，可以考虑更具侵入性的治疗。这样的治疗可 以包括例如给药治疗药剂。这样的药剂包括例如抗生素如静脉内广谱抗生素。
[0038] 可用于本发明的检测装置将包含样品室，呼气样品可以被导入其中。这些装置还 将包含激光光源，其被开动以发射一对或多对波长2054. 37和2052. 42、2054. 96和2051. 67 或2760. 53和2760. 08纳米。这些装置还将包含用于检测所述一对或多对波长的检测器。
[0039] 可用于本发明的检测装置可以包含小的、极低功率的近红外二极管激光器，以获 得具有高度准确性和灵敏度的野外便携式电池运行的S13〇)2测量仪器。这些装置和使用它 们的方法可用于确定具有或怀疑具有细菌定植或感染的受试者的呼出气样品中的S13co2。
[0040] 优选的检测装置将分析呼出的二氧化碳样品中的碳同位素比率而不受温度变化 的不利影响。测量二氧化碳同位素比率的准确性和精确度，可以受到二氧化碳基态总数变 化的影响。样品中同位素差异的来源可能是多种多样的，并且不是本发明的主题。相反，已 认识到确定同位素比率的值是内在重要且在商业上有用的。
[0041] 光吸收光谱术是基于公知的Beer-Lambert定律。通过测量由光束被气体样品的 光吸收所造成的激光光束强度1〇的变化，来确定气体浓度。如果使用样品池进行分析，使 得光束的通路长度和测量装置的固有特征恒定，则吸收测量允许计算气体的数量密度n或 气体浓度。
[0042] 气相二极管激光吸收测量法查询气体分子的各个吸收线。这些吸收线对应于气体 分子例如二氧化碳通过吸收光的光子从基态能态向更高的激发能态的跃迀。在降低的样品 气体压力下，这些线通常十分狭窄，从而允许在其他背景气体例如水蒸气存在下选择性地 检测气体。由于 12c与13c之间的质量差异，co2的同位素具有相对于彼此出现在迀移的波 长处的独特吸收线。
[0043] 吸收测量法受到气体温度影响，并且这种温度敏感性的量级随着吸收线的选择和 光跃迀的总基态能量而变。在室温下的一群分子分布在许多离散的分子能态上，其总能量 随着分子旋转和振动的速度而变。也就是说，按照玻尔兹曼分布，基态分子群体分布在离散 的旋转和振动能态周围。
[0044]AS13C02的温度依赖性可以影响基于二氧化碳的同位素测量的二极管激光器的 长期稳定性和灵敏度。[参考文献2-6]具有近似相等的基态能量的130)2和 120)2吸收线可 用于获得同位素比率测量法的相对温度不灵敏度。
[0045] 已显示，垂直空腔表面发射激光器（VCSEL)获得10至15CHT1的扫描范围。它们已 被用于产生坚固的高精度野外仪器，其实例为由SouthwestSciences,Inc制造的激光湿度 计和由SouthernCrossCompany制造的手持式甲烧泄漏检测器。因此，对于在本发明中使 用的某些装置来说，可以使用VCSEL，其可以在所需光谱波长范围内，在总体试验装置的背 景中以有用的扫描速率进行扫描，以便提供本发明的一些或所有所需益处。在某些实施方 式中，VCSEL装置引起在约lOcnT1的范围内以千赫兹或更高的扫描速率扫描。
[0046] 适合的激光源也可以从多个、通常为一对激光发射器形成。这样的发射器可以 被制造成在波长对的优选波长之一处发射。可用于本发明的VCSEL装置可以从德国的 VertilasGmbH订购，并且也可以由激光发射器的其他来源制造。
[0047] 已经鉴定了 130)2和12C02的光谱线对，其每对具有近零的基态能量差、小于12CHT1 的线分离，并且基本上没有水干扰。现在已发现，这些线对在确定气体样品中13〇)2/12〇) 2的 同位素比率中非常有用。使用这些对的测量的温度依赖性理想地比较低。
[0048] 下面的光谱线对在分析呼出气样品中，在气体池中使用VCSEL进行二氧化碳同位 素吸收测量中非常有用：
[0050] 应该认识到，在上面的线对中鉴定到的波长是标称的，并且从列出值的一些变动 可能是有用的。就此而言，应该理解，有用的波长将是足够接近所叙述的值，以便提供本发 明的一个或多个益处的波长。因此，这样的波长将赋予提高的准确度、提高的温度稳定性或 本文中提出的对于co2同位素比率的测量来说理想的另一种性质。一般来说，优选的波长 将在所叙述的值的0. 5纳米之内。
[0051] 除了以所需波长运行的激光光源之外，可用于本发明的装置包括用于容纳气体样 品的样品容器，所述容器被构造成利用镜子提供通过样品的相对长的光径。包含一个或多 个信号检测器，此外还包含用于控制激光并用于收集和操控来自于一个或多个检测器的输 出信号的控制电路。有助于样品收集、样品制备、数据解读和显示等的其他设备，也可以包 含在本发明提供的系统和工具箱中。所有这样的部件优选地足够坚固耐用，以便允许在实 验室外以及甚至在手持背景下部署装置。
[0052] 本发明的装置也可用于系统或工具箱中。系统或工具箱的部件可以包括样品收集 容器例如气密袋子，优选为以注入端口、注射器和有助于样品收集和向装置的样品室转移 的其他物品为特征的气密袋子。取决于待取样的气体的来源，这样的样品收 集元件可以采 取不同的构造。因此，其可例如用于收集受试者的呼气，例如当取样来自于受试者的胃的顶 部空间气体时。
[0053] 具有适合于在本发明的某些实施方式中使用的通用元件排列方式的便携式装置 和系统是已知的。例如，由SouthernCrossCorp.销售的'96Hawk手持式甲烧泄漏检测 器系统，提供样品容器、镜子组件、电源、样品操控和可以被改造以适用于本发明的其他部 件。然而，这样的系统原本并不适合于这样的应用。因此，必须实现能够扫描必需的光谱线 对并具有有效的频率、稳定性和准确性的二极管激光源的供应。同样地，用于以所需的准确 度探测所选线对中的光吸收的检测器，以及数据收集、储存、操控和显示或报告装置和/或 软件，也是需要的。
[0054] 图1描绘了可用于本发明的一种装置的某些方面。描绘了一种C02光吸收测量装 置100,其包含二极管激光源、镜子114和气体样品室104。合在一起，它们与样品室内未不 出的优选反射的表面联合，形成光径。有效长度比样品室的物理长度长许多倍的光径，允许 增强激光被样品室中的气体样品的吸收。在方便的情况下，包含一个或多个气泵112以运 输气体样品进出样品室，样品室同样可以提供有一个或多个压力计。优选地，还使用参比气 体室106连同用于引导激光通过参比气体室106的镜子114。通过样品室和参比室的光径 通往一个或多个检测器108,用于评估激光的强度。控制模块110中的一个或多个处理器， 通过与参比室中的参比样品进行参比，确定入射激光被样品室中的样品吸收的量。这种确 定可以通过装置在板的或其外部的常规固件软件来进行。优选地，提供电连接116,其能够 将信号或处理过的数据从装置输出到外部显示器或数据收集和操控装置。根据某些优选实 施方式，构成本发明的装置和系统的一些或所有元件以及它们执行的功能，在控制器的控 制下运行。这样的仪器在板的或仪器外部的控制器，可以是通用目的的数字计算装置或特 殊目的的数字或数字-模拟装置。通过控制器进行的控制可以是例如对用于激光、检测器、 气体样品泵、处理器和其他部件的电力供应的控制。
[0055] 在操作中，将怀疑含有二氧化碳的气体样品置于本发明的装置的样品室中。然后 使一个或多个激光光源优选地通过往复途径穿越样品室，以便增加总光径长度并提高测量 灵敏度。然后将光源导向一个或多个传感器并对传感器读数进行解读，以产生样品的波长 吸收值。用于做出这种确定的方法在本领域中是公知的，并包括例如直接吸收光谱术、波长 调制光谱术、光腔衰荡光谱术和其他可替选方案。通过比较具有每个所选波长对的光的吸 收，二氧化碳样品中碳12和碳13同位素的值变得已知。必然地，可以计算它们的比率。对 于本发明的某些优选实施方式来说，提供参比气体样品并对其进行照射、检测和信号解读。 由此获得的数据被用于标准化从样品室的照射产生的数据。
[0056] 装置的机械部分，包括通向一个或多个激光光源、检测器和任何数据储存、呈递和 操控元件的电力供应，优选地在控制器的控制之下，不论它是数字还是模拟的。也可以使用 或额外使用数字计算机。这样的计算机可以在板或通过控制接口连接。
[0057] 优选地，根据本发明的光吸收的测定可以通过波长调制光谱技术（WMS)来实现。 尽管WMS以前已被用于S13C02测量[17]，但对于目前已被确定用于二氧化碳中的同位素比 率确定的线对来说，它从未被执行过。
[0058] 对于在本发明中的使用来说，WMS比直接吸收光谱术更加优选，尽管如果需要，也 可以使用直接测量。对于直接吸收测量来说，将激光器电流匀变，以便跨过气体吸收线重 复地扫描波长输出，并将产生的光谱共平均。直接吸收光谱的分析包括在大的检测器信号 上检测小的变化。对于非常低的浓度变化来说，这是成问题的。为了进行WMS，在二极管激 光器电流匀变上叠加小的高频正弦调制。这种电流调制产生同样高频率下的激光波长的调 制。靶气体的吸收将波长调制转变成入射到检测器上的激光强度的振幅调制，向检测器光 电流增添AC分量。在调制频率的2倍处将检测器光电流解调制，即2f检测。这仅仅选择 性地放大AC分量（零背景测量值），并使测量值从近DC向激光噪音被降低的更高频率迀 移。通过在足够高的频率OlOkHz)下进行信号检测，极大降低了光谱噪音，以避免激光输 出功率的波动，即激光过量（1/f)噪音。在仔细优化的实验室设置中，WMS具有低至IX1(T7 的测量吸收，这接近检测器的噪音极限。然而，在紧凑的野外仪器中，背景人为假象通常将 可检测的最小吸收amin限制到1X10^TV2。使用改进的缩放比例作为t1/2,通过在100至 300秒的时间段中对2f信号进行更长时间的平均，可以提高amin的值。
[0059] 本文中描述的130)2和 12C02吸收线对在气体样品中产生相对温度不敏感的S13C02 同位素比率确定，并且被几条不需测量的吸收线分隔开。代替在每一对的两个目标峰之间 连续地扫描激光波长，使电子装置以跳跃扫描的方式操作激光器。这被示出在图2中。激 光器电流扫描被编程为具有不连续性，其将快速改变波长。优选地不使用跳跃后的前几个 数据点，因为在电流跳跃后激光波长可能不立即稳定。在本发明中使用的VCSEL，即使使用 四次电流跳跃也可以以这种方式运行，以便同时测量5条不同的吸收线而不过度降低灵敏 度。
[0060] 用于口服给药或吸入、即肺部给药的组合物在本文中另有描述。口服组合物包括 粉剂或颗粒剂、在水或非水性介质中的悬液或溶液、袋剂、胶囊或片剂。增稠剂、稀释剂、调 味剂、分散助剂、乳化剂或粘合剂，可能是合乎需要的。用于肺部给药的组合物包括可药用 载体、添加剂或赋形剂以及推进剂和任选地溶剂和/或分散剂，以促进向受试者的肺部递 送。
[0061] 注射用无菌组合物可以按照本领域中已知的方法来制备。
[0062] 尽管已参考大量实施方式和可替选方式对本发明进行了阐述，但本说明书不被当 作限制。本发明仅仅通过其权利要求书来衡量。
[0063] 参考文献
[0064] 1.Bell，G.D.等，"14C-脲呼气分析，一种用于胃中幽门螺旋杆菌的非侵入性测 试'，（14C-ureabreathanalysis,anon-invasivetestforCampylobacterpyloriin thestomach)，Lancet，1987.l:p. 1367-1368。
[0065] 2.Chelboun，J.和P.Kocna，"同位素选择性非色散红外光谱可以在累计13C02呼 气试验中与同位素比率质谱术竞争：准确性的评估"（Isotopeselectivenondispersive infraredspectrometrycancompetewithisotoperatiomassspectrometry incumulative13C02breathtests:assessmentofaccuracy)?Kin.Biochem. Metab.，2005. 13 (34) :p. 92-97。
[0066] 3.Castrillo,A.等，"利用激光吸收光谱术测量大气C02中的13C/12C同位素比 率：基于 2.05-um二极管激光器的新的展望"（Measuringthe13C/12Cisotoperatio inatmosphericC02bymeansoflaserabsorptionspectrometry:anewperspective basedona2. 05-umdiodelaser)，IsotopesinEnvironmentalandHealth Studies，2006. 42(1) :p. 47-56。
[0067] 4.Gagliardi，G.等，"使用便携式2.008-um二极管激光器光谱仪高精度确 定 13C02/12C02 同位素比率"（High-precisiondeterminationofthe13C02/12C02isotoperatiousingaportable2. 008-umdiode-laserspectrometer)?Appl.Phys. B，2003. 77:p. 119-124。
[0068]S.HomenG.等，"在NIR中使用可调节的二极管激光器（TDL)光谱术进行C02 的同位素选择性分析"（IsotopeselectiveanalysisofC02withtunablediode laser(TDL)spectrosc opyintheNIR)，Analyst，2004.129:p.772_778〇
[0069] 6.Wahl，E.H.等，"应用光腔衰荡光谱术进行二氧化碳中13C12C的高精 度同位素比率钡I]量''（Applicationsofcavityring-downspectroscopytohigh precisionisotoperatiomeasurementof13C12Cincarbondioxide)，Isotopesin EnvironmentalandHealthStudies，2006. 42:p. 21_35〇
[0070] 7.H〇Vde，D.C.等，"使用垂直空腔表面发射激光器的痕量气体检测"（TraceGas DetectionUsingVerticalCavitySurfaceEmittingLasers)，在《环境和过程监测的 光学遥感》（OpticalRemoteSensingforEnvironmentalandProcessMonitoring)中， 1995.SanFrancisco,CA〇
[0071] 8.美国专利 6, 800, 855
[0072] 9.美国专利 5, 929, 442
[0073] 本文中引用的所有参考文献以其全部内容通过参考并入本文。
【主权项】
I. 一种用于确定受试者的呼吸系统中细菌负载存在或不存在及其位置的方法，所述方 法包括： a. 向所述受试者给药有效量的在细菌代谢后产生130)2的13C同位素标记的化合物； b. 从所述受试者收集多个呼出气样品；
1. 至少一个所述样品包含来自于所述受试者的上呼吸道的呼气；并且 ii.至少一个所述样品包含来自于所述受试者的下呼吸道的呼气； c. 将至少一些所述样品导向检测装置的样品室； d. 评估所述至少一些样品的每个样品中存在的130)2与120)2的同位素比率；以及 e. 将由此确定的同位素比率与收集所述被导向样品室的样品的呼吸系统中的位置相 关联。
2. 权利要求1的方法，其中所述至少一些被导向样品室的样品的同位素比率对于在收 集相应样品的呼吸系统中的位置处细菌负荷存在或不存在是决定性的。
3. 权利要求1的方法，其还包括： a. 开动所述检测装置的激光光源以发射一对或多对波长2054. 37纳米和2052. 42纳 米；2054. 96纳米和2051. 67纳米；或2760. 53纳米和2760. 08纳米；以及 b. 引导由此开动的激光通过所述样品室中的样品，以使这样的波长射到检测器上。
4. 权利要求1的方法，其还包括将所述导向样品室的至少一个样品的同位素比率与对 照样品的同位素比率进行比较，以执行所述确定。
5. 权利要求4的方法，其中所述对照样品包含在给药所述13C同位素标记的化合物之 前来自于所述受试者的至少一个呼出气样品。
6. 权利要求4的方法，其中所述对照样品包括尚未给药所述13C同位素标记的化合物 的群体的呼出气中存在的13〇)2与 120)2的同位素比率。
7. 权利要求1的方法，其中通过在所述受试者呼气期间，在预选的时间段中收集每个 所述样品，来确定所述样品的位置。
8. 权利要求7的方法，其中用于收集多个样品的时间段，在评估所述受试者的呼吸模 式后确定。
9. 权利要求8的方法，其中所述评估包括测量所述受试者完成基本上完整的呼气所需 的时间。
10. 权利要求1的方法，其中至少一些所述导向样品室的样品在呼吸系统中的位置，通 过确定所述样品中所述受试者呼气中的总二氧化碳水平来确定。 II. 权利要求1的方法，其中所述细菌负荷在肺中。
12. 权利要求1的方法，其中所述13C同位素标记的化合物通过吸入给药。
13. 权利要求1的方法，其中所述13C同位素标记的化合物通过摄食给药。
14. 权利要求1的方法，其中所述13C同位素标记的化合物通过注射给药。
15. 权利要求1的方法，所述确定是确定铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)、金 黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)、结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis)、 鲍氏不动杆菌（Acenitobacterbaumannii)、肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiellapneumonia)、 土拉热弗朗西丝氏菌（Francisellatularenis)、奇异变形杆菌（Proteusmirabilis)或曲 霉（Aspergillusspecies)的细菌负荷的存在。
16. 权利要求3的方法，其中所述装置还包含用于解读或呈现所述检测器收到的信号 的处理器。
17. 权利要求3的方法，其中所述装置还包含一个或多个电源、气泵、压力计、信号处理 器和参比气体室。
18. 权利要求3的方法，其中所述装置的激光光源使用波长调制光谱技术来扫描所述 波长对。
19. 权利要求3的方法，其中所述波长对是2054. 37纳米和2052. 42纳米。
20. 权利要求3的方法，其中所述波长对是2051. 67纳米和2054. 96纳米。
21. 权利要求3的方法，其中所述波长对是2760. 53纳米和2760. 08纳米。
22. 权利要求3的方法，其中所述装置的激光光源包括一对激光发射器。
23. 权利要求3的方法，其中所述装置的激光光源是垂直空腔表面发射激光器。
24. 权利要求1的方法，其中所述13C同位素标记的化合物是同位素标记的脲、同位素 标记的甘氨酸、同位素标记的瓜氨酸或其混合物。
25. 权利要求1的方法，其中所述同位素标记的化合物是13C标记的脲。
26. 权利要求1的方法，其中所述同位素标记的化合物是13C标记的脲与13C标记的甘 氨酸的混合物。
27. 权利要求1的方法，其还包括将所述13C-同位素标记的化合物给药后获得的被评 估的呼出气样品中13〇)2与 12CO2的同位素比率，与所述13C-同位素标记的化合物给药之前 从所述受试者获得的至少一个呼出气样品中13〇) 2与12CO2的同位素比率进行比较。
28. 权利要求1的方法，其中在吸入所述13C-同位素标记的化合物之前所述导向样品 室的至少一些样品中13〇)2与 12CO2的同位素比率与在吸入所述13C-同位素标记的化合物之 前从所述受试者获得的至少一个呼出气样品中13〇) 2与12CO2的同位素比率相比的增加，指 示在所述受试者的肺中存在细菌负荷。
29. 权利要求1的方法，其中在吸入所述13C-同位素标记的化合物之前130)2与120) 2的 同位素比率与从所述受试者获得的来自于上呼吸道的至少一个呼出气样品中13〇)2与 12CO2 的同位素比率相比的增加，指示在所述受试者的上呼吸道中存在细菌定植。
30. 权利要求1的方法，其中在吸入所述13C-同位素标记的化合物之前130)2与120) 2的 同位素比率与从所述受试者获得的来自于下呼吸道的至少一个呼出气样品中13〇)2与 12CO2 的同位素比率相比的增加，指示在所述受试者的下呼吸道中存在细菌感染。
31. 权利要求29的方法，其还包括增加所述受试者的呼吸道中的气道清理的步骤。
32. 权利要求29或30的方法，其还包括向所述受试者给药用于减少所述定植或感染的 治疗药剂的步骤。
【专利摘要】本发明涉及确定受试者肺中的细菌负荷的位置的方法。
【IPC分类】G01N21/39, G01N33/497
【公开号】CN104903725
【申请号】CN201380064969
【发明人】伊丽莎白·A·佩尔贾基特
【申请人】艾维萨制药公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年12月12日
【公告号】CA2893821A1, EP2932262A1, US20140179809, WO2014093604A1
【专利说明】
[0001] 与相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月12日提交的美国临时申请号61/736, 239的利益，所述 临时申请的全部内容通过参考并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及受试者的肺中细菌负荷的存在和位置的检测方法。
【背景技术】
[0004] 细菌天然存在于肺中，并且如果细菌负荷保持低水平，这些细菌将不会不利地影 响正常的呼吸功能。细菌的存在被称为定植而不是感染。当上气道中细菌负荷增加时，它 仍可能定植，并且通常不危及生命，但是增加的定植可能是感染的先兆，因此在严重感染发 生之前，可以开始采取措施以降低定植。增加的定植可以使用非侵入性方法，例如通过增加 气道清理或通过给药口服或吸入广谱抗生素来治疗。
[0005] 在肺的下气道更深处，细菌较不常见。下气道中细菌负荷的增加通常与感染相关， 其中细菌具有更高侵袭性。下气路（"下呼吸道"）中细菌负荷的增加可能危及生命，引起 感染例如肺炎。下气路中细菌负荷的增加需要更具侵入性的治疗方法，例如静脉内广谱抗 生素。
[0006] 可以确定增加的细菌负荷是在上呼吸道还是下呼吸道中的快速测试，将有助于确 定适合的治疗方法。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明涉及用于确定受试者的呼吸系统中细菌负荷存在或不存在及其位置的方 法，所述方法包括：向所述受试者给药有效量的在细菌代谢后产生 13〇)2的13C同位素标记 的化合物；从所述受试者收集多个呼出气样品；至少一个所述样品包含来自于所述受试者 的上呼吸道的呼气；并且至少一个所述样品包含来自于所述受试者的下呼吸道的呼气；将 至少一些所述样品导向检测装置的样品室；评估在所述至少一些样品的每个样品中存在的 13〇)2与12〇)2的同位素比率；以及将由此确定的同位素比率与收集所述被导向样品室的样 品的呼吸系统中的位置相关联。
[0009] 附图简述
[0010] 图1是按照本发明的某些实施方式使用的示例性激光吸收装置的平面视图。
[0011] 图2示出了优选的跳跃扫描方法。
[0012] 示例性实施方式的详细描述
[0013] 确定受试者是否具有肺部细菌感染的方法以前已被描述。这些方法包括例如向 受试者给药在细菌代谢后产生 13〇)2的13c同位素标记的化合物。然后收集呼出气的样品并 对其进行分析，以确定样品中存在的13〇) 2与12co2的同位素比率。与对照样品相比，呼出气 样品中13〇) 2与12co2的同位素比率提高，指示了肺部细菌感染。参见例如美国临时申请号 61/715, 992 和U.S. 7, 771，857。
[0014] 然而，这些现有方法不提供关于肺中感染位置的任何信息。那些方法也不能在 定植和感染之间做出区分。本发明涉及用于确定肺中增加的细菌负荷的位置的方法。使 用本发明的方法，可以检测能够将本发明的 13c同位素标记的化合物转变成13〇)2的任何细 菌。这样的细菌的实例包括铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)、结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis)、鲍氏不动杆菌 (Acenitobacterbaumannii)、肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiellapneumonia)、土拉热弗朗 西丝氏菌（Francisellatularenis)、奇异变形杆菌（Proteusmirabilis)和曲霉属物种 (Aspergillusspecies)〇
[0015] 来自于受试者的整个呼出气样品包括来自于上气道和下气道两者的空气。来自于 下气道的空气与来自于上气道的空气相比具有更高的二氧化碳浓度。一般理解，来自于健 康成年人的下气道的空气具有约40mmHg的C02压力。JohnF.Murray，《正常肺脏》（The NormalLung)，第二版，W.B.SaundersCompany,Philadelphia1986,184 页。来自于上气 道的空气一般具有低于1mmHg的C02压力。同上。因此，本领域技术人员可以通过确定C02 浓度来确定呼出气样品是来自于上气道还是下气道。具有较高〇)2浓度的样品来自于下气 道，而具有较低C02浓度的样品来自于上气道。
[0016] "二氧化碳描记术"在本领域中是指监测呼吸气体中二氧化碳的浓度或分 压。用于执行这种监测的装置和方法对于本领域技术人员来说是已知的。参见例如 U.S. 3, 830, 630、U.S. 7, 122, 154和SchubertJ.K.等，"在机械通气患者中肺泡气体的C02 控制的取样"（C02-controlledsamplingofalveolargasinmechanicallyventilated patients),J.Appl.Physiol. (1985). 2001Feb；90 (2):486~92〇
[0017] 也可以使用主动压力感应来确定呼出气源自于肺中何处。参见例如TO 2008/060165、U.S. 7, 547, 285。或者，可以使用被动压力感应来引导和分离来自于上 呼吸道和下呼吸道的样品。参见例如Bio-VOC?呼吸取样器（MarkesInternational Limited，UnitedKingdom)、U.S. 3, 734, 692、TO1994/018885、TO2003/049595 和TO 2004/032727。
[0018] 呼出气样品的来源的确定，也可以通过测量呼气样品的温度来实现。参见例如 U.S. 4, 248, 245。或者，使用本领域中已知的经胸电阻抗法来监测呼出气。
[0019] 在本领域中还已了解，在整个呼出气中，首先呼出的样品将来自于上气道，而在较 晚时间呼出的样品将来自于下气道。因此，专业技术人员可以将呼出气样品的位置与收集 样品的时间在整个呼气过程中的时间点相关联。
[0020] 本发明的方法包括向受试者给药有效量的在细菌代谢后产生13〇)2的13c同位素标 记的化合物。这样的化合物的示例性实例包括同位素标记的脲、同位素标记的甘氨酸、同位 素标记的瓜氨酸或其混合物。 13c同位素标记的化合物的给药可以通过任何已知手段来实 现。优选的给药方法包括吸入和摄食。通过注射即肌肉内、皮下、腹膜和真皮内注射给药， 也在本发明的范围之内。
[0021] 在本发明的某些实施方式中，将13c同位素标记的化合物给药到呼吸道的特定区 域。例如，在某些实施方式中，将13c同位素标记的化合物递送到肺的下部区域，即肺泡区 域。在某些实施方式中，将13c同位素标记的化合物递送到肺的上部区域。在其他实施方式 中，将13c同位素标记的化合物递送到肺的支气管区域。在又一些实施方式中，将13c同位素 标记的化合物递送到肺的外周区域。用于将化合物定向递送到呼吸道的特定区域的方法和 装置在本领域中是已知的。参见例如u.S. 8, 534, 277。
[0022] 在本发明的范围内，可以在给药13C同位素标记的化合物之前从受试者收集一个 或多个呼出气样品。这样的样品可以在本发明的方法中用作对照样品。或者，对照样品可 以包括在尚未给药 13c同位素标记的化合物的群体的呼出气中存在的130)2与12C02的同位 素比率。
[0023] 在给药13C同位素标记的化合物后适合的时间段后，从受试者收集多个呼出气样 品。"适合的时间段"是指化合物被细菌转变成二氧化碳所需的时间长度。优选地，在给药 后不超过40-70分钟后收集样品。
[0024] 在某些实施方式中，可以评估受试者完成基本上完整的呼气所需的时间。也可以 评估受试者的呼吸模式。这些评估可用于例如确定在呼气期间用于取样的预选时间段。
[0025] 可以将样品收集在适合于容纳呼出气样品的任何容器中，例如袋子或小瓶。也可 以通过使用适合的吹嘴将样品直接呼出到装置中。也可以通过使用来自于其他呼吸设备例 如呼吸机上的适合端口的鼻插管进行收集，将样品直接呼出到检测装置的样品室中。
[0026] 至少一个呼出气样品来自于受试者的上呼吸道，并且至少一个呼出气样品来自于 受试者的下呼吸道。专业技术人员可以通过确定样品的相对二氧化碳浓度来鉴定呼出气样 品的来源。较高的二氧化碳浓度指示了源自于下气道的样品。较低的二 氧化碳浓度指示了 源自于上气道的样品。
[0027] 或者，专业技术人员可以将呼出气样品的来源与样品收集的时间点相关联。在整 个呼气开始时或附近收集的样品源自于上气道。在整个呼气结束时或附近收集的样品源自 于下气道。
[0028] 呼出气的来源也可以使用本领域中已知的任何方法来确定，例如二氧化碳描记 术、主动压力感应、被动压力感应、温度感应和经胸电阻抗。
[0029] 对样品进行分析以确定样品中130)2与12C02的同位素比率。对于给定的时间段来 说或直至活性水平的确定达到预设准确度，优选地取样至少大部分呼出气，最优选地取样 每个呼出气。通过将样品的同位素比率与样品来源相关联，专业技术人员可以确定存在或 不存在细菌负荷的增加，以及所述增加是在上气道还是下气道中。
[0030] 将样品导向检测装置的样品室。开动检测装置的激光光源以发射一对或多对波 长 2054. 37 和 2052. 42、2054. 96 和 2051. 67 或 2760. 53 和 2760. 08 纳米。将由此开动的激 光引导通过样品室中的样品，以使这样的波长射到检测器上。然后可以确定样品中存在的 130) 2与120)2的同位素比率。
[0031] 可以产生显示测试受试者的呼气中13〇)2与12co2的比率随时间变化的图或曲线。 显示了 13〇)2与12co2的比率随时间增加的曲线，证实了存在细菌感染。
[0032] 将130)2与12C02的浓度或量（比率）与健康受试者中130)2与 12C02的标准浓度（比 率）进行比较，并方便地产生曲线。从所述曲线，可以直接确定或诊断存在或不存在增加的 细菌负荷。用于将输出比率与从健康受试者预期的比率进行比较的其他方法，也可以使用。
[0033] 在示例性实施方式中，可以将曲线拟合于这些测量的浓度，然后优选地通过确定 曲线的上升速率进行分析。这样的分析（上升速率）指示了受试者中细菌负荷的活性水平， 其可用于诊断受试者中细菌负荷的存在和程度。这同一种方法经过修改，可用于确定疗法 的有效性以及感染或定植的抑制和/或治愈的预后。
[0034] 在本发明的范围内，包括通过将在给药13C_同位素标记的化合物后获得的呼出气 样品中13〇)2与 12C02的同位素比率与给药13C_同位素标记的化合物之前从所述受试者获得 的呼出气样品中13〇)2与 120)2的同位素比率进行比较，来检测受试者中存在或不存在细菌 负荷的方法。
[0035] 在本发明的范围内，在吸入13C_同位素标记的化合物后获得的呼出气样品中13C02 与12〇)2的比率与在吸入13c-同位素标记的化合物之前从所述受试者获得的呼出气样品中 13〇)2与 12co2的同位素比率相比的提高，指示了细菌负荷的存在。如果所述样品源自于上气 道，则在上气道中可能存在定植。如果所述样品源自于下气道，则在下气道中可能存在感 染。
[0036] -旦确定了增加的细菌负荷是在上气道还是下气道中，则可以启动适合的疗法。 例如，如果增加的细菌负荷是在上气道中，则可以在受试者的呼吸道中启动增加的气道清 理。也可以给药口服或吸入抗生素或其他适合的治疗药剂。
[0037] 如果增加的细菌负荷是在下气道中，可以考虑更具侵入性的治疗。这样的治疗可 以包括例如给药治疗药剂。这样的药剂包括例如抗生素如静脉内广谱抗生素。
[0038] 可用于本发明的检测装置将包含样品室，呼气样品可以被导入其中。这些装置还 将包含激光光源，其被开动以发射一对或多对波长2054. 37和2052. 42、2054. 96和2051. 67 或2760. 53和2760. 08纳米。这些装置还将包含用于检测所述一对或多对波长的检测器。
[0039] 可用于本发明的检测装置可以包含小的、极低功率的近红外二极管激光器，以获 得具有高度准确性和灵敏度的野外便携式电池运行的S13〇)2测量仪器。这些装置和使用它 们的方法可用于确定具有或怀疑具有细菌定植或感染的受试者的呼出气样品中的S13co2。
[0040] 优选的检测装置将分析呼出的二氧化碳样品中的碳同位素比率而不受温度变化 的不利影响。测量二氧化碳同位素比率的准确性和精确度，可以受到二氧化碳基态总数变 化的影响。样品中同位素差异的来源可能是多种多样的，并且不是本发明的主题。相反，已 认识到确定同位素比率的值是内在重要且在商业上有用的。
[0041] 光吸收光谱术是基于公知的Beer-Lambert定律。通过测量由光束被气体样品的 光吸收所造成的激光光束强度1〇的变化，来确定气体浓度。如果使用样品池进行分析，使 得光束的通路长度和测量装置的固有特征恒定，则吸收测量允许计算气体的数量密度n或 气体浓度。
[0042] 气相二极管激光吸收测量法查询气体分子的各个吸收线。这些吸收线对应于气体 分子例如二氧化碳通过吸收光的光子从基态能态向更高的激发能态的跃迀。在降低的样品 气体压力下，这些线通常十分狭窄，从而允许在其他背景气体例如水蒸气存在下选择性地 检测气体。由于 12c与13c之间的质量差异，co2的同位素具有相对于彼此出现在迀移的波 长处的独特吸收线。
[0043] 吸收测量法受到气体温度影响，并且这种温度敏感性的量级随着吸收线的选择和 光跃迀的总基态能量而变。在室温下的一群分子分布在许多离散的分子能态上，其总能量 随着分子旋转和振动的速度而变。也就是说，按照玻尔兹曼分布，基态分子群体分布在离散 的旋转和振动能态周围。
[0044]AS13C02的温度依赖性可以影响基于二氧化碳的同位素测量的二极管激光器的 长期稳定性和灵敏度。[参考文献2-6]具有近似相等的基态能量的130)2和 120)2吸收线可 用于获得同位素比率测量法的相对温度不灵敏度。
[0045] 已显示，垂直空腔表面发射激光器（VCSEL)获得10至15CHT1的扫描范围。它们已 被用于产生坚固的高精度野外仪器，其实例为由SouthwestSciences,Inc制造的激光湿度 计和由SouthernCrossCompany制造的手持式甲烧泄漏检测器。因此，对于在本发明中使 用的某些装置来说，可以使用VCSEL，其可以在所需光谱波长范围内，在总体试验装置的背 景中以有用的扫描速率进行扫描，以便提供本发明的一些或所有所需益处。在某些实施方 式中，VCSEL装置引起在约lOcnT1的范围内以千赫兹或更高的扫描速率扫描。
[0046] 适合的激光源也可以从多个、通常为一对激光发射器形成。这样的发射器可以 被制造成在波长对的优选波长之一处发射。可用于本发明的VCSEL装置可以从德国的 VertilasGmbH订购，并且也可以由激光发射器的其他来源制造。
[0047] 已经鉴定了 130)2和12C02的光谱线对，其每对具有近零的基态能量差、小于12CHT1 的线分离，并且基本上没有水干扰。现在已发现，这些线对在确定气体样品中13〇)2/12〇) 2的 同位素比率中非常有用。使用这些对的测量的温度依赖性理想地比较低。
[0048] 下面的光谱线对在分析呼出气样品中，在气体池中使用VCSEL进行二氧化碳同位 素吸收测量中非常有用：
[0050] 应该认识到，在上面的线对中鉴定到的波长是标称的，并且从列出值的一些变动 可能是有用的。就此而言，应该理解，有用的波长将是足够接近所叙述的值，以便提供本发 明的一个或多个益处的波长。因此，这样的波长将赋予提高的准确度、提高的温度稳定性或 本文中提出的对于co2同位素比率的测量来说理想的另一种性质。一般来说，优选的波长 将在所叙述的值的0. 5纳米之内。
[0051] 除了以所需波长运行的激光光源之外，可用于本发明的装置包括用于容纳气体样 品的样品容器，所述容器被构造成利用镜子提供通过样品的相对长的光径。包含一个或多 个信号检测器，此外还包含用于控制激光并用于收集和操控来自于一个或多个检测器的输 出信号的控制电路。有助于样品收集、样品制备、数据解读和显示等的其他设备，也可以包 含在本发明提供的系统和工具箱中。所有这样的部件优选地足够坚固耐用，以便允许在实 验室外以及甚至在手持背景下部署装置。
[0052] 本发明的装置也可用于系统或工具箱中。系统或工具箱的部件可以包括样品收集 容器例如气密袋子，优选为以注入端口、注射器和有助于样品收集和向装置的样品室转移 的其他物品为特征的气密袋子。取决于待取样的气体的来源，这样的样品收 集元件可以采 取不同的构造。因此，其可例如用于收集受试者的呼气，例如当取样来自于受试者的胃的顶 部空间气体时。
[0053] 具有适合于在本发明的某些实施方式中使用的通用元件排列方式的便携式装置 和系统是已知的。例如，由SouthernCrossCorp.销售的'96Hawk手持式甲烧泄漏检测 器系统，提供样品容器、镜子组件、电源、样品操控和可以被改造以适用于本发明的其他部 件。然而，这样的系统原本并不适合于这样的应用。因此，必须实现能够扫描必需的光谱线 对并具有有效的频率、稳定性和准确性的二极管激光源的供应。同样地，用于以所需的准确 度探测所选线对中的光吸收的检测器，以及数据收集、储存、操控和显示或报告装置和/或 软件，也是需要的。
[0054] 图1描绘了可用于本发明的一种装置的某些方面。描绘了一种C02光吸收测量装 置100,其包含二极管激光源、镜子114和气体样品室104。合在一起，它们与样品室内未不 出的优选反射的表面联合，形成光径。有效长度比样品室的物理长度长许多倍的光径，允许 增强激光被样品室中的气体样品的吸收。在方便的情况下，包含一个或多个气泵112以运 输气体样品进出样品室，样品室同样可以提供有一个或多个压力计。优选地，还使用参比气 体室106连同用于引导激光通过参比气体室106的镜子114。通过样品室和参比室的光径 通往一个或多个检测器108,用于评估激光的强度。控制模块110中的一个或多个处理器， 通过与参比室中的参比样品进行参比，确定入射激光被样品室中的样品吸收的量。这种确 定可以通过装置在板的或其外部的常规固件软件来进行。优选地，提供电连接116,其能够 将信号或处理过的数据从装置输出到外部显示器或数据收集和操控装置。根据某些优选实 施方式，构成本发明的装置和系统的一些或所有元件以及它们执行的功能，在控制器的控 制下运行。这样的仪器在板的或仪器外部的控制器，可以是通用目的的数字计算装置或特 殊目的的数字或数字-模拟装置。通过控制器进行的控制可以是例如对用于激光、检测器、 气体样品泵、处理器和其他部件的电力供应的控制。
[0055] 在操作中，将怀疑含有二氧化碳的气体样品置于本发明的装置的样品室中。然后 使一个或多个激光光源优选地通过往复途径穿越样品室，以便增加总光径长度并提高测量 灵敏度。然后将光源导向一个或多个传感器并对传感器读数进行解读，以产生样品的波长 吸收值。用于做出这种确定的方法在本领域中是公知的，并包括例如直接吸收光谱术、波长 调制光谱术、光腔衰荡光谱术和其他可替选方案。通过比较具有每个所选波长对的光的吸 收，二氧化碳样品中碳12和碳13同位素的值变得已知。必然地，可以计算它们的比率。对 于本发明的某些优选实施方式来说，提供参比气体样品并对其进行照射、检测和信号解读。 由此获得的数据被用于标准化从样品室的照射产生的数据。
[0056] 装置的机械部分，包括通向一个或多个激光光源、检测器和任何数据储存、呈递和 操控元件的电力供应，优选地在控制器的控制之下，不论它是数字还是模拟的。也可以使用 或额外使用数字计算机。这样的计算机可以在板或通过控制接口连接。
[0057] 优选地，根据本发明的光吸收的测定可以通过波长调制光谱技术（WMS)来实现。 尽管WMS以前已被用于S13C02测量[17]，但对于目前已被确定用于二氧化碳中的同位素比 率确定的线对来说，它从未被执行过。
[0058] 对于在本发明中的使用来说，WMS比直接吸收光谱术更加优选，尽管如果需要，也 可以使用直接测量。对于直接吸收测量来说，将激光器电流匀变，以便跨过气体吸收线重 复地扫描波长输出，并将产生的光谱共平均。直接吸收光谱的分析包括在大的检测器信号 上检测小的变化。对于非常低的浓度变化来说，这是成问题的。为了进行WMS，在二极管激 光器电流匀变上叠加小的高频正弦调制。这种电流调制产生同样高频率下的激光波长的调 制。靶气体的吸收将波长调制转变成入射到检测器上的激光强度的振幅调制，向检测器光 电流增添AC分量。在调制频率的2倍处将检测器光电流解调制，即2f检测。这仅仅选择 性地放大AC分量（零背景测量值），并使测量值从近DC向激光噪音被降低的更高频率迀 移。通过在足够高的频率OlOkHz)下进行信号检测，极大降低了光谱噪音，以避免激光输 出功率的波动，即激光过量（1/f)噪音。在仔细优化的实验室设置中，WMS具有低至IX1(T7 的测量吸收，这接近检测器的噪音极限。然而，在紧凑的野外仪器中，背景人为假象通常将 可检测的最小吸收amin限制到1X10^TV2。使用改进的缩放比例作为t1/2,通过在100至 300秒的时间段中对2f信号进行更长时间的平均，可以提高amin的值。
[0059] 本文中描述的130)2和 12C02吸收线对在气体样品中产生相对温度不敏感的S13C02 同位素比率确定，并且被几条不需测量的吸收线分隔开。代替在每一对的两个目标峰之间 连续地扫描激光波长，使电子装置以跳跃扫描的方式操作激光器。这被示出在图2中。激 光器电流扫描被编程为具有不连续性，其将快速改变波长。优选地不使用跳跃后的前几个 数据点，因为在电流跳跃后激光波长可能不立即稳定。在本发明中使用的VCSEL，即使使用 四次电流跳跃也可以以这种方式运行，以便同时测量5条不同的吸收线而不过度降低灵敏 度。
[0060] 用于口服给药或吸入、即肺部给药的组合物在本文中另有描述。口服组合物包括 粉剂或颗粒剂、在水或非水性介质中的悬液或溶液、袋剂、胶囊或片剂。增稠剂、稀释剂、调 味剂、分散助剂、乳化剂或粘合剂，可能是合乎需要的。用于肺部给药的组合物包括可药用 载体、添加剂或赋形剂以及推进剂和任选地溶剂和/或分散剂，以促进向受试者的肺部递 送。
[0061] 注射用无菌组合物可以按照本领域中已知的方法来制备。
[0062] 尽管已参考大量实施方式和可替选方式对本发明进行了阐述，但本说明书不被当 作限制。本发明仅仅通过其权利要求书来衡量。
[0063] 参考文献
[0064] 1.Bell，G.D.等，"14C-脲呼气分析，一种用于胃中幽门螺旋杆菌的非侵入性测 试'，（14C-ureabreathanalysis,anon-invasivetestforCampylobacterpyloriin thestomach)，Lancet，1987.l:p. 1367-1368。
[0065] 2.Chelboun，J.和P.Kocna，"同位素选择性非色散红外光谱可以在累计13C02呼 气试验中与同位素比率质谱术竞争：准确性的评估"（Isotopeselectivenondispersive infraredspectrometrycancompetewithisotoperatiomassspectrometry incumulative13C02breathtests:assessmentofaccuracy)?Kin.Biochem. Metab.，2005. 13 (34) :p. 92-97。
[0066] 3.Castrillo,A.等，"利用激光吸收光谱术测量大气C02中的13C/12C同位素比 率：基于 2.05-um二极管激光器的新的展望"（Measuringthe13C/12Cisotoperatio inatmosphericC02bymeansoflaserabsorptionspectrometry:anewperspective basedona2. 05-umdiodelaser)，IsotopesinEnvironmentalandHealth Studies，2006. 42(1) :p. 47-56。
[0067] 4.Gagliardi，G.等，"使用便携式2.008-um二极管激光器光谱仪高精度确 定 13C02/12C02 同位素比率"（High-precisiondeterminationofthe13C02/12C02isotoperatiousingaportable2. 008-umdiode-laserspectrometer)?Appl.Phys. B，2003. 77:p. 119-124。
[0068]S.HomenG.等，"在NIR中使用可调节的二极管激光器（TDL)光谱术进行C02 的同位素选择性分析"（IsotopeselectiveanalysisofC02withtunablediode laser(TDL)spectrosc opyintheNIR)，Analyst，2004.129:p.772_778〇
[0069] 6.Wahl，E.H.等，"应用光腔衰荡光谱术进行二氧化碳中13C12C的高精 度同位素比率钡I]量''（Applicationsofcavityring-downspectroscopytohigh precisionisotoperatiomeasurementof13C12Cincarbondioxide)，Isotopesin EnvironmentalandHealthStudies，2006. 42:p. 21_35〇
[0070] 7.H〇Vde，D.C.等，"使用垂直空腔表面发射激光器的痕量气体检测"（TraceGas DetectionUsingVerticalCavitySurfaceEmittingLasers)，在《环境和过程监测的 光学遥感》（OpticalRemoteSensingforEnvironmentalandProcessMonitoring)中， 1995.SanFrancisco,CA〇
[0071] 8.美国专利 6, 800, 855
[0072] 9.美国专利 5, 929, 442
[0073] 本文中引用的所有参考文献以其全部内容通过参考并入本文。
【主权项】
I. 一种用于确定受试者的呼吸系统中细菌负载存在或不存在及其位置的方法，所述方 法包括： a. 向所述受试者给药有效量的在细菌代谢后产生130)2的13C同位素标记的化合物； b. 从所述受试者收集多个呼出气样品；
1. 至少一个所述样品包含来自于所述受试者的上呼吸道的呼气；并且 ii.至少一个所述样品包含来自于所述受试者的下呼吸道的呼气； c. 将至少一些所述样品导向检测装置的样品室； d. 评估所述至少一些样品的每个样品中存在的130)2与120)2的同位素比率；以及 e. 将由此确定的同位素比率与收集所述被导向样品室的样品的呼吸系统中的位置相 关联。
2. 权利要求1的方法，其中所述至少一些被导向样品室的样品的同位素比率对于在收 集相应样品的呼吸系统中的位置处细菌负荷存在或不存在是决定性的。
3. 权利要求1的方法，其还包括： a. 开动所述检测装置的激光光源以发射一对或多对波长2054. 37纳米和2052. 42纳 米；2054. 96纳米和2051. 67纳米；或2760. 53纳米和2760. 08纳米；以及 b. 引导由此开动的激光通过所述样品室中的样品，以使这样的波长射到检测器上。
4. 权利要求1的方法，其还包括将所述导向样品室的至少一个样品的同位素比率与对 照样品的同位素比率进行比较，以执行所述确定。
5. 权利要求4的方法，其中所述对照样品包含在给药所述13C同位素标记的化合物之 前来自于所述受试者的至少一个呼出气样品。
6. 权利要求4的方法，其中所述对照样品包括尚未给药所述13C同位素标记的化合物 的群体的呼出气中存在的13〇)2与 120)2的同位素比率。
7. 权利要求1的方法，其中通过在所述受试者呼气期间，在预选的时间段中收集每个 所述样品，来确定所述样品的位置。
8. 权利要求7的方法，其中用于收集多个样品的时间段，在评估所述受试者的呼吸模 式后确定。
9. 权利要求8的方法，其中所述评估包括测量所述受试者完成基本上完整的呼气所需 的时间。
10. 权利要求1的方法，其中至少一些所述导向样品室的样品在呼吸系统中的位置，通 过确定所述样品中所述受试者呼气中的总二氧化碳水平来确定。 II. 权利要求1的方法，其中所述细菌负荷在肺中。
12. 权利要求1的方法，其中所述13C同位素标记的化合物通过吸入给药。
13. 权利要求1的方法，其中所述13C同位素标记的化合物通过摄食给药。
14. 权利要求1的方法，其中所述13C同位素标记的化合物通过注射给药。
15. 权利要求1的方法，所述确定是确定铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)、金 黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)、结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis)、 鲍氏不动杆菌（Acenitobacterbaumannii)、肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiellapneumonia)、 土拉热弗朗西丝氏菌（Francisellatularenis)、奇异变形杆菌（Proteusmirabilis)或曲 霉（Aspergillusspecies)的细菌负荷的存在。
16. 权利要求3的方法，其中所述装置还包含用于解读或呈现所述检测器收到的信号 的处理器。
17. 权利要求3的方法，其中所述装置还包含一个或多个电源、气泵、压力计、信号处理 器和参比气体室。
18. 权利要求3的方法，其中所述装置的激光光源使用波长调制光谱技术来扫描所述 波长对。
19. 权利要求3的方法，其中所述波长对是2054. 37纳米和2052. 42纳米。
20. 权利要求3的方法，其中所述波长对是2051. 67纳米和2054. 96纳米。
21. 权利要求3的方法，其中所述波长对是2760. 53纳米和2760. 08纳米。
22. 权利要求3的方法，其中所述装置的激光光源包括一对激光发射器。
23. 权利要求3的方法，其中所述装置的激光光源是垂直空腔表面发射激光器。
24. 权利要求1的方法，其中所述13C同位素标记的化合物是同位素标记的脲、同位素 标记的甘氨酸、同位素标记的瓜氨酸或其混合物。
25. 权利要求1的方法，其中所述同位素标记的化合物是13C标记的脲。
26. 权利要求1的方法，其中所述同位素标记的化合物是13C标记的脲与13C标记的甘 氨酸的混合物。
27. 权利要求1的方法，其还包括将所述13C-同位素标记的化合物给药后获得的被评 估的呼出气样品中13〇)2与 12CO2的同位素比率，与所述13C-同位素标记的化合物给药之前 从所述受试者获得的至少一个呼出气样品中13〇) 2与12CO2的同位素比率进行比较。
28. 权利要求1的方法，其中在吸入所述13C-同位素标记的化合物之前所述导向样品 室的至少一些样品中13〇)2与 12CO2的同位素比率与在吸入所述13C-同位素标记的化合物之 前从所述受试者获得的至少一个呼出气样品中13〇) 2与12CO2的同位素比率相比的增加，指 示在所述受试者的肺中存在细菌负荷。
29. 权利要求1的方法，其中在吸入所述13C-同位素标记的化合物之前130)2与120) 2的 同位素比率与从所述受试者获得的来自于上呼吸道的至少一个呼出气样品中13〇)2与 12CO2 的同位素比率相比的增加，指示在所述受试者的上呼吸道中存在细菌定植。
30. 权利要求1的方法，其中在吸入所述13C-同位素标记的化合物之前130)2与120) 2的 同位素比率与从所述受试者获得的来自于下呼吸道的至少一个呼出气样品中13〇)2与 12CO2 的同位素比率相比的增加，指示在所述受试者的下呼吸道中存在细菌感染。
31. 权利要求29的方法，其还包括增加所述受试者的呼吸道中的气道清理的步骤。
32. 权利要求29或30的方法，其还包括向所述受试者给药用于减少所述定植或感染的 治疗药剂的步骤。
【专利摘要】本发明涉及确定受试者肺中的细菌负荷的位置的方法。
【IPC分类】G01N21/39, G01N33/497
【公开号】CN104903725
【申请号】CN201380064969
【发明人】伊丽莎白·A·佩尔贾基特
【申请人】艾维萨制药公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年12月12日
【公告号】CA2893821A1, EP2932262A1, US20140179809, WO2014093604A1
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