对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法
对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种以球状体（spheroid)的形态的变化为指标来筛选对细胞的上皮 性维持起作用的物质的方法。
【背景技术】
[0002] 上皮-间质转化（Epithelial-MesenchymalTransition:EMT)是指细胞无法维持 作为上皮的特性而获得作为间质系的特性的现象。近年来，报道了上皮-间质转化参与癌 细胞的浸润、转移和/或组织的重塑（remodeling)、纤维化等。因此，人们期待将对细胞的 上皮性维持起作用的物质、即阻碍上皮-间质转化的物质、或诱导出作为上皮-间质转化的 相反现象的间质-上皮转化（Mesenchymal-EpithelialTransition:MET)的物质开发为癌 或纤维症等的治疗药。
[0003] 以往，作为筛选对细胞的上皮性维持起作用的物质的方法，存在有：使被实验物质 接触被诱导进行了上皮-间质转化的细胞，以表示上皮-间质转化状态的生物标记物量的 变化作为指标来进行评价的方法（例如参照专利文献1)。
[0004] 现有技术文献
[0005] 专利文献1 :国际公开号W02009/111067
【发明内容】
[0006] 发明要解决的课题
[0007] 但是，以生物标记物量为指标的筛选方法的检测耗费工夫和成本。因此，该方法难 以适用于制药初期阶段的筛选那样的必须快速评价大量样品的筛选。另外，存在有低浓度 的生物标记物的检测困难因而缺乏可信度这样的问题。
[0008] 因此，本发明的目的在于提供一种可迅速且以低成本实施、并且可取得可信度高 的数据的对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法。
[0009] 用于解决课题的手段
[0010] 本发明人等发现了，在作为上皮细胞所表达的细胞间粘接因子的E-cadherin的 表达量与在规定的培养基材上培养的细胞所表现的行为之间存在有相关关系。即发现了， 如果因上皮-间质转化而使得E-cadherin的表达降低而无法维持细胞的上皮性时，则该细 胞获得高的迀移能力而变为在规定的培养基材上容易形成球状体的状态，并且形成的球状 体根据E-cadherin的表达量而呈现不同的形态。然后，作为以球状体形态的变化为指标的 筛选方法，完成了本发明。
[0011] 本发明的要旨如下所述。
[0012] 本发明的对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法的特征在于，包含如下工 序：(a)在可形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，（b)使所述细胞与被实验物质接触 的工序，（c)以球状体的形态的变化作为指标来评价被实验物质对于所述细胞的上皮性维 持所产生的效果的工序。
[0013] 在此情况下，所述工序（c)可通过测定规定尺寸的球状体数量来评价。
[0014] 另外，所述工序（c)可通过使用可检测球状体内的低氧区域的试剂来评价。
[0015] 所述工序（a)可在具有作为细胞粘接面而起作用的规定的凹凸结构的培养基材 上进行。
[0016] 在此情况下，所述凹凸结构优选为通过将包含规定的平面形状的单元结构规则地 进行多个排列而得到的凹凸结构。
[0017] 另外，凹凸结构可以是通过将单元结构间的宽度为3 ym以下、平面方向的形状为 多边形并且最小内径为3 ym以下的单元结构规则地进行多个排列而形成的凹凸结构。
[0018] 发明效果
[0019] 本发明的筛选方法由于以球状体的形态的变化作为指标来进行评价，因而可迅速 且以低成本筛选目标物质。另外，由于是利用了可认为相比于单层细胞而言更反映了接近 生物体内的状态的球状体的方法，因而可有效地进行筛选。进一步，由于可同时地捕捉多个 指标来评价，因此可获得可信度高的筛选结果。
【附图说明】
[0020] 图1是表示本发明方法中使用的培养基材的凹凸结构的俯视图。
[0021] 图2是表示球状体的形态的照片。
[0022] 图3是表示E-cadherin的表达量的照片以及图表。
[0023]图4是表示上皮-间质转化阻碍剂对球状体的形态所产生的效果的显微镜照片。
[0024] 图5是表示低氧区域检测试剂的信号强度的图表。
[0025] 图6是表示E-cadherin基因的表达量的图表。
[0026] 图7是表示N-cadherin基因的表达量的图表。
[0027] 图8是表示Vimentin基因的表达量的图表。
[0028] 图9是表示ZEB1基因的表达量的图表。
[0029] 附图标记说明：
[0030]1单元结构
[0031] 2 线
【具体实施方式】
[0032] 本发明的筛选方法包含如下工序：（a)在可形成球状体的培养基材上培养细胞的 工序，（b)使所述细胞与被实验物质接触的工序，（c)以球状体的形态的变化作为指标来评 价被实验物质对于所述细胞的上皮性维持所产生的效果的工序。
[0033] 本发明中的球状体是指细胞彼此三维地进行聚集、凝集化而得到的细胞聚集体。
[0034]另外，本发明中的细胞的上皮性维持是指抑制、阻碍了上皮-间质转化的状态，或 者促进、诱导了间质-上皮转化的状态。因此，本发明的筛选方法大致划分为阻碍上皮-间 质转化的物质的筛选方法以及诱导间质-上皮转化的物质的筛选方法。
[0035] 关于阻碍上皮_间质转化的物质的筛选方法，例如可通过如下工序来进行：在可 形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，使该细胞与上皮-间质转化诱导剂接触的工 序，使培养细胞与被实验物质接触的工序，以球状体的形态的变化作为指标来评价被实验 物质对于细胞的上皮-间质转化产生的效果的工序。作为上皮-间质转化诱导剂，例如可 使用TGF-0、TNF-a、EGF、IL-4等。另外，关于使培养细胞与上皮-间质转化诱导剂接触 的工序，如果是在使培养细胞与被实验物质接触的工序以前，则可在任一时间点进行，例如 可在细胞接种时进行，也可在细胞接种后经过数天后进行，也可与使培养细胞与上皮-间 质转化诱导剂接触的工序同时地进行。
[0036] 关于诱导间质_上皮转化的物质的筛选方法，例如可通过如下工序来进行：在 可形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，使培养细胞与被实验物质接触的工序，以球 状体的形态的变化作为指标来评价被实验物质对于细胞的间质_上皮转化产生的效果 的工序。在该方法中，优选使用E-cadherin表达量低的细胞、例如人胰腺癌衍生细胞株 MIAPaCa-2、PANC-l、A1165等来进行。此外，也可在通过插入使培养细胞与上皮-间质转化 诱导剂接触的工序而诱导为间质系细胞之后，使被实验物质与培养细胞进行接触。特别是， 使用上皮癌（例如A549)和/或腺癌（例如Capan-2)等的细胞的情况下，优选在接种时进 行利用上皮-间质转化诱导剂的处理。
[0037] 本发明中的以球状体的形态变化为指标的评价可通过比较负对照组与被实验样 品组的球状体的外观及/或内部结构的差异来进行。
[0038] 关于外观的差异，可将球状体的形状（圆形度）、尺寸、数量等的变化设为指标。例 如，与负对照组相比，在被实验样品组中在球状体的尺寸变大了的情况下，和/或规定的尺 寸以上的球状体数量增加了的情况下，和/或球状体的圆形度更接近1的情况下，被实验物 质可评价为是具有维持细胞的上皮性的效果的物质。另外，代替以规定的尺寸以上的球状 体数量的变化为指标（或者与其并进），也可将没有形成球状体的细胞数量的变化设为指 标。这是因为，可将其认为是球状体形态变化的一个方式。 [0039] 另一方面，关于内部结构的差异，可将球状体内的低氧区域和/或氧浓度的变化 设为指标。例如，与负对照组相比，在被实验样品组中在球状体内的低氧区域大的情况下， 形成了细胞间粘接紧凑的球状体，被实验物质可评价为是具有维持细胞的上皮性的效果的 物质。
[0040] 此外，本发明的筛选方法由于可同时地捕捉球状体的外观的差异和内部结构的差 异，因而可取得可信度高的数据。进一步，本发明的方法由于可基于视觉性参数来进行评 价，因而可容易追踪经时性变化。
[0041] 关于球状体形态的外观差异的测定，除了可利用使用了相位差显微镜等生物显微 镜的观察、计量来进行之外，还可通过使用板读取器（platereader)、可测定三维形状的装 置、以图像数据为对象的解析算法等来进行。
[0042] 另一方面，关于内部结构的差异的测定，如果是可检测低氧区域的测定则可以是 任何样的方法，例如可通过使用发出磷光的化合物来进行。这是由于，如果使用发出磷光 的化合物，则可通过利用基于氧的磷光淬灭现象而将低氧状态变为可视化，可掌握低氧区 域以及氧浓度。该化合物如果是发出磷光而发生基于氧的淬灭现象的化合物则没有特别 限制，但是优选为发出细胞透过性高的长波长的磷光、磷光寿命长、磷光量子收率高的化 合物。作为该化合物的例子，列举出以Ir(III)作为中心金属并且以芳香族系分子为配 体的铱络合物，具体列举出双（2-苯并[b]噻吩-2-基-吡啶）（乙酰丙酮）合铱（III) (Bis(2-benzo[b]thiophen-2-yl-pyridine) (acetylacetonate)iridium(III)) 〇 此外，由 于磷光信号可进行定量化，因而可容易地求出被实验物质在上皮-间质转化方面的阻碍效 率或间质-上皮转化诱导效率。
[0043] 关于本发明中的可形成球状体的培养基材，如果是与在通常的单层培养中使用的 培养基材相比而言与细胞的粘接性受到抑制的培养基材，则可以是任何样的培养基材，例 如可使用通过将培养基材表面的亲水性或疏水性进行改性而得到的培养基材等。
[0044] 关于培养基材的材质，如果是对细胞而言无毒性的材质则也可以是任何样的材 质，例如可使用"聚苯乙烯"、"聚乙烯"、"聚丙烯"、"聚酰亚胺"、"聚乳酸和/或聚乳酸-聚 乙醇酸共聚物、聚己内酯等生物降解性聚合物"、"聚甲基戊烯等聚烯烃树脂"、"环状烯烃共 聚物（COC)和/或环状烯烃聚合物（COP)等环状烯烃系热塑性树脂"、"丙烯酸树脂"、"光固 化性树脂和/或热固化性树脂等其它的树脂"、"氧化铝等金属"、"玻璃"、"石英玻璃"、"硅" 等。另外也可使用通过在由硅和/或玻璃等形成的基板主体的表面形成"树脂"、"光致抗蚀 剂"、"氧化铝等金属"等的被覆层而得到的基材。
[0045] 关于培养基材的表面，只要可作为细胞粘接面而发挥功能，那么也可实施紫外线 照射、伽马射线照射、等离子体照射和/或各种物质的涂布等这样的用于控制细胞的粘接 性的处理。
[0046] 另外，本发明的筛选方法中，也可使用具有作为细胞粘接面而起作用的规定的凹 凸结构的培养基材来进行。
[0047] 作为凹凸结构，根据培养的细胞的性质，可制成线状（线宽/线距）、支柱状、空穴 状等各种形状，但是优选为将包含规定的平面形状的单元结构1规则地进行多个排列而得 到的结构。例如，如图1所示那样，可制成通过将平面形状为多边形的单元结构1以多个进 行连续而得到的凹凸结构。此时，从可使细胞在等向性且均匀的结构上生长这样的观点考 虑，更优选为正三角形、正方形、正六边形等正多边形或圆形的结构。另外，也可将支柱状和 /或空穴状的凹凸结构与由包含平面形状的单元结构1形成的凹凸结构进行组合。此外， 从使得培养细胞接近于在生物体内的状态这样的观点考虑，关于线2的宽度，如3ym以下、 2ym以下、1ym以下、700nm以下、500nm以下、250nm以下那样，越小则越优选。可认为这是 由于，线2的宽度变得越小，则粘接于凹凸结构面的细胞越可一边生长很多的伪足一边形 成球状体。
[0048] 另外，关于单元结构1的深度，根据培养的细胞的性质，形成为lnm以上、10nm以 上、100nm以上、200nm以上、500nm以上、1ym以上、10ym以上、100ym以上等各种尺寸。另 外，作为该凹凸的深宽比（Aspectratio)，存在有0. 2以上、0. 5以上、1以上、2以上等各种 深宽比。
[0049] 另外，单元结构1的最小内径（优选为最大内径）优选为3ym以下，如2ym以下、 1ym以下、700nm以下、500nm以下、250nm以下这样，越小则越优选。此处，内径是指外切于 单元结构1的2根平行线间的距离。因此，最小内径是指外切于单元结构1的二根平行线 间的距离之中最短的距离，最大内径是指外切于单元结构1的二根平行线间的距离之中最 长的距离。例如，在单元结构1为正六边形的情况下，对向的平行的边与边之间的距离成为 最小内径，对向的顶点间的距离成为最大内径。另外，在单元结构1为长方形的情况下，短 边的长度成为最小内径，对角线的长度成为最大内径。
[0050] 凹凸结构的形成方法可以是任何的方法，例如可使用纳米压印技术、溶液流铸法、 蚀刻、喷砂、电晕放电等。此时，从可更精密地控制形状等的观点考虑，优选为利用纳米压印 技术的方法。
[0051] 以下，通过实施例来具体说明本发明。但本发明不受限于以下的记述。
[0052] 实施例1
[0053] [E-cadherin表达量与球状体形态的相关关系]
[0054] (1)细胞接种以及观察
[0055] 在细胞培养容器NanoCulture(注册商标）皿（SCIVAX公司制，35mm皿，凹凸结 构面的材质=聚甲基戊烯（三井化学公司制TPX)，凹凸结构的平面形状=正方形，单元结 构间的宽度（线宽）=7〇〇nm，单元结构的最小内径=3ym，深度=1ym)上，将细胞以 2. 5X105cells进行接种，在培养第3天利用光学显微镜进行了观察。作为细胞，使用了人胰 腺癌细胞株、BxPC-3、Capan-1、Capan-2、AsPC-1、PANC-1、MIAPaCa-2。关于培养基，BxPC-3、 AsPC-l、PANC-l使用 了含有 10%FBS的RPMI1640 培养基，Capan-1 使用 了含有 10%FBS的 1^]\1培养基，〇3口311-2使用了含有10%?83的]^(：〇7'8 54培养基，]\1^^3〇3-2使用了含有 10%FBS的DMEM培养基。
[0056] (2)蛋白质印迹（WesternBlotting)
[0057] 在与（1)同样的细胞培养容器NanoCulture(注册商标）皿（SCIVAX公司制，35mm 皿）上，接种与（1)同样的细胞，培养了 5天后，通过吸液（pipetting)回收该细胞。用PBS 洗涤所回收的该细胞，将利用溶解缓冲液进行溶解而得到的细胞溶解液设为了样品。接 着，利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE)将各种细胞株的样品（蛋白质20yg份） 进行分离，其后，将蛋白质转印于PVDF膜。关于蛋白质的检测，通过使用作为一次抗体的 抗E-cadherin小鼠单克隆抗体（BDBiosciences:Cat#610182)、作为二次抗体的HRP标 记了的抗小鼠抗体（SantaCruz:sc_2005)、作为检测试剂的ECLPlusWesternBlotting DetectionSystem(GEHealthcare公司制）来进行。
[0058] 将（1)以及（2)的结果示于图2以及图3。可知，在E-cadherin的表达量高的 BxPC-3或Capan-2中，球状体的圆形度接 近于1，形成着细胞粘接紧凑的球状体。与此相 对，可知，在E-cadherin的表达量低的PANC-1或MIAPaCa-2中，相比于之前所述的细胞株 而言，球状体的圆形度远离1，形成着细胞粘接松弛的球状体。
[0059] 实施例2
[0060][上皮-间质转化阻碍剂对球状体的形态产生的效果]
[0061] (1)预培育
[0062] 在细胞培养容器NanoCulture(注册商标）板（SCIVAX公司制，384孔板，凹凸结构 面的材质=聚甲基戊烯（三井化学公司制TPX)，凹凸结构的平面形状=正方形，单元结构 间的宽度（线宽）=7〇〇nm，单元结构的最小内径=3ym，深度=1ym)上，将含有5%FBS 以及1. 0%Matrigel(注册商标）的DMEM培养基以25y1逐一地添加于各孔中，以1000Xg 进行了 5分钟离心。
[0063] (2)细胞接种
[0064] 利用含有5 %FBS的DMEM培养基将人肺癌衍生细胞的株A549调整为 13. 5X104cells/ml，将调整得到的细胞悬浊液以25y1逐个地添加于所述的板的各孔中 (细胞数量为3. 4X103cells/孔，培养基添加物的最终浓度为5%FBS，0. 5%Matrigel)。
[0065] (3)上皮-间质转化的诱导剂以及阻碍剂的添加
[0066] 在培养第3天，将作为上皮-间质转化诱导剂的TGF- 0 2 (R&Dsystems公司 制；302-B2-002)以及TNF-a(R&Dsystems公司制；210-TA-010)分别按照最终浓度成 为5ng/ml以及10ng/ml的方式添加于各孔。与此同时，将作为TGF- 0 2的阻碍剂的 SB431542(MiltenyiBiotec公司制；130-095-561)按照最终浓度成为10yM的方式进行了 添加。在不添加SB431542的全部的孔中，按照最终浓度成为0. 1%的方式添加了二甲基亚 砜。
[0067] (4)低氧区域检测试剂的添加
[0068] 在培养第5天，将低氧区域检测用试剂LOX-1(SCIVAX公司制）按照最终浓度成为 2yM的方式添加于各孔。LOX-1是含有发出红色磷光的铱络合物的试剂。
[0069] (5)观察
[0070] 在培养第6天，进行了利用荧光显微镜的观察。
[0071] 利用荧光显微镜进行观察、摄像，将得到的结果示于图4。首先，将各孔的明视野图 像进行比较时，则在没有添加上皮_间质转化诱导剂的孔（对照）中，圆形度接近于1，形成 着紧凑的球状体。与此相对，可知，在添加了上皮-间质转化诱导剂的孔中，超过半数的球 状体发生崩解，残剩的球状体的轮廓的凹凸也变大了。而且，可知，在添加了上皮-间质转 化的诱导剂和阻碍剂的孔中，与没有添加阻碍剂的孔比较而言，球状体的崩解被抑制的同 时，球状体的轮廓的凹凸也变小了。另一方面可知，将各孔的荧光视野图像进行比较时，则 与对照相比，在添加了上皮-间质转化的诱导剂的孔中，红色强度弱且红色区域变小，在向 其中添加了阻碍剂的孔中红色强度强且红色区域变大。即可知低氧区域变大。另外，将通 过将此时的红色信号进行定量化而得到的结果示于图5。可知，添加了上皮-间质转化阻碍 剂的孔具有没有添加上皮-间质转化阻碍剂的孔的约2倍的红色信号。
[0072] 实施例3
[0073] [在添加上皮-间质转化的诱导剂以及阻碍剂时的基因表达变化的验证]
[0074] 为了验证在实施例2中确认的球状体的形态的变化是否反映了上皮-间质转化以 及上皮_间质转化阻碍，因而针对于作为上皮或间质系标记物而公知的基因，利用qRT-PCR 测定其表达水平，将测定结果示于图6~图9。关于从（1)预培育到（3)上皮-间质转化的诱 导剂以及阻碍剂的添加为止的工序，与实施例2所示的工序同样地进行。然后，在培养第6 天，使用RNeasyPlusMiniKit(QIAGEN公司制）从各样品中提取总RNA，使用PrimeScript RTreagentKit(TakaraBioInc.制）将该RNA进行逆转录，将逆转录得到的逆转录物用 于qRT-PCR。在PCR中使用了SYBERPremixExTaqII(TakaraBioInc?制）。另外，在其 反应以及检测中使用了ThermalCyclerDice(TakaraBioInc.制）。将在PCR中使用的 引物示于下述表1。予以说明，关于数据，利用内标基因（TBP)的表达量进行修正，然后将对 照的表达量设为1，以这一情况下的相对值的方式进行示出。
[0075] 表 1
[0077] 关于作为上皮标记物而公知的E-cadherin的表达量，通过添加上皮-间质转化诱 导剂而减少为对照的1成以下，通过添加阻碍剂而恢复至对照的6成左右（图6)。另一方 面，关于作为间质系标记物而公知的N-cadherin的表达量，通过添加上皮-间质转化诱导 剂而增加至对照的约9倍，通过添加阻碍剂而减少至与对照相同的程度（图7)。同样地，关 于作为间质系标记物的Vimentin、以及作为抑制E-cadherin表达的转印因子的ZEB1的表 达，也示出了与N-cadherin近似的表达水平变化（图8及图9)。这些结果揭示了，在实施 例2中确认的球状体形态的变化所反映的是在上皮-间质转化以及上皮-间质转化阻碍时 产生的细胞性质的变化。
[0078] 产业上的利用可能性
[0079] 本发明方法可应用于抗癌剂和纤维症治疗药等的药剂筛选。
【主权项】
1. 一种对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法，其特征在于，包含如下工序： (a)在可形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，（b)使所述细胞与被实验物质接 触的工序，（c)以球状体的形态的变化作为指标来评价被实验物质对于所述细胞的上皮性 维持所产生的效果的工序。2. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述工序（c)通过测定规定尺寸的球 状体数量来评价。3. 根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，所述工序（c)使用可检测球状体 内的低氧区域的试剂来评价。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的筛选方法，其特征在于，所述工序（a)在具有作 为细胞粘接面而起作用的规定的凹凸结构的培养基材上进行。5. 根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述凹凸结构是通过将包含规定的 平面形状的单元结构规则地进行多个排列而得到的凹凸结构。6. 根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述凹凸结构是通过将单元结构间 的宽度为3ym以下、平面方向的形状为多边形并且最小内径为3ym以下的单元结构规则 地进行多个排列而形成。
【专利摘要】本发明提供一种可迅速且以低成本实施并且可取得可信度高的数据的、对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法。本筛选方法包含如下工序：（a）在可形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，（b）使所述细胞与被实验物质接触的工序，（c）以球状体的形态的变化作为指标来评价被实验物质对于所述细胞的上皮性维持所产生的效果的工序。此时，所述工序（c）可通过测定规定尺寸的球状体数量和/或通过测定球状体内的低氧区域来评价。
【IPC分类】G01N33/15, G01N33/50
【公开号】CN104903726
【申请号】CN201280076584
【发明人】伊藤学, 新井一也, 梶田浩志, 田中觉
【申请人】Jsr株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2012年9月5日
【公告号】EP2894472A1, US20140065655, WO2014038025A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种以球状体（spheroid)的形态的变化为指标来筛选对细胞的上皮 性维持起作用的物质的方法。
【背景技术】
[0002] 上皮-间质转化（Epithelial-MesenchymalTransition:EMT)是指细胞无法维持 作为上皮的特性而获得作为间质系的特性的现象。近年来，报道了上皮-间质转化参与癌 细胞的浸润、转移和/或组织的重塑（remodeling)、纤维化等。因此，人们期待将对细胞的 上皮性维持起作用的物质、即阻碍上皮-间质转化的物质、或诱导出作为上皮-间质转化的 相反现象的间质-上皮转化（Mesenchymal-EpithelialTransition:MET)的物质开发为癌 或纤维症等的治疗药。
[0003] 以往，作为筛选对细胞的上皮性维持起作用的物质的方法，存在有：使被实验物质 接触被诱导进行了上皮-间质转化的细胞，以表示上皮-间质转化状态的生物标记物量的 变化作为指标来进行评价的方法（例如参照专利文献1)。
[0004] 现有技术文献
[0005] 专利文献1 :国际公开号W02009/111067
【发明内容】
[0006] 发明要解决的课题
[0007] 但是，以生物标记物量为指标的筛选方法的检测耗费工夫和成本。因此，该方法难 以适用于制药初期阶段的筛选那样的必须快速评价大量样品的筛选。另外，存在有低浓度 的生物标记物的检测困难因而缺乏可信度这样的问题。
[0008] 因此，本发明的目的在于提供一种可迅速且以低成本实施、并且可取得可信度高 的数据的对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法。
[0009] 用于解决课题的手段
[0010] 本发明人等发现了，在作为上皮细胞所表达的细胞间粘接因子的E-cadherin的 表达量与在规定的培养基材上培养的细胞所表现的行为之间存在有相关关系。即发现了， 如果因上皮-间质转化而使得E-cadherin的表达降低而无法维持细胞的上皮性时，则该细 胞获得高的迀移能力而变为在规定的培养基材上容易形成球状体的状态，并且形成的球状 体根据E-cadherin的表达量而呈现不同的形态。然后，作为以球状体形态的变化为指标的 筛选方法，完成了本发明。
[0011] 本发明的要旨如下所述。
[0012] 本发明的对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法的特征在于，包含如下工 序：(a)在可形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，（b)使所述细胞与被实验物质接触 的工序，（c)以球状体的形态的变化作为指标来评价被实验物质对于所述细胞的上皮性维 持所产生的效果的工序。
[0013] 在此情况下，所述工序（c)可通过测定规定尺寸的球状体数量来评价。
[0014] 另外，所述工序（c)可通过使用可检测球状体内的低氧区域的试剂来评价。
[0015] 所述工序（a)可在具有作为细胞粘接面而起作用的规定的凹凸结构的培养基材 上进行。
[0016] 在此情况下，所述凹凸结构优选为通过将包含规定的平面形状的单元结构规则地 进行多个排列而得到的凹凸结构。
[0017] 另外，凹凸结构可以是通过将单元结构间的宽度为3 ym以下、平面方向的形状为 多边形并且最小内径为3 ym以下的单元结构规则地进行多个排列而形成的凹凸结构。
[0018] 发明效果
[0019] 本发明的筛选方法由于以球状体的形态的变化作为指标来进行评价，因而可迅速 且以低成本筛选目标物质。另外，由于是利用了可认为相比于单层细胞而言更反映了接近 生物体内的状态的球状体的方法，因而可有效地进行筛选。进一步，由于可同时地捕捉多个 指标来评价，因此可获得可信度高的筛选结果。
【附图说明】
[0020] 图1是表示本发明方法中使用的培养基材的凹凸结构的俯视图。
[0021] 图2是表示球状体的形态的照片。
[0022] 图3是表示E-cadherin的表达量的照片以及图表。
[0023]图4是表示上皮-间质转化阻碍剂对球状体的形态所产生的效果的显微镜照片。
[0024] 图5是表示低氧区域检测试剂的信号强度的图表。
[0025] 图6是表示E-cadherin基因的表达量的图表。
[0026] 图7是表示N-cadherin基因的表达量的图表。
[0027] 图8是表示Vimentin基因的表达量的图表。
[0028] 图9是表示ZEB1基因的表达量的图表。
[0029] 附图标记说明：
[0030]1单元结构
[0031] 2 线
【具体实施方式】
[0032] 本发明的筛选方法包含如下工序：（a)在可形成球状体的培养基材上培养细胞的 工序，（b)使所述细胞与被实验物质接触的工序，（c)以球状体的形态的变化作为指标来评 价被实验物质对于所述细胞的上皮性维持所产生的效果的工序。
[0033] 本发明中的球状体是指细胞彼此三维地进行聚集、凝集化而得到的细胞聚集体。
[0034]另外，本发明中的细胞的上皮性维持是指抑制、阻碍了上皮-间质转化的状态，或 者促进、诱导了间质-上皮转化的状态。因此，本发明的筛选方法大致划分为阻碍上皮-间 质转化的物质的筛选方法以及诱导间质-上皮转化的物质的筛选方法。
[0035] 关于阻碍上皮_间质转化的物质的筛选方法，例如可通过如下工序来进行：在可 形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，使该细胞与上皮-间质转化诱导剂接触的工 序，使培养细胞与被实验物质接触的工序，以球状体的形态的变化作为指标来评价被实验 物质对于细胞的上皮-间质转化产生的效果的工序。作为上皮-间质转化诱导剂，例如可 使用TGF-0、TNF-a、EGF、IL-4等。另外，关于使培养细胞与上皮-间质转化诱导剂接触 的工序，如果是在使培养细胞与被实验物质接触的工序以前，则可在任一时间点进行，例如 可在细胞接种时进行，也可在细胞接种后经过数天后进行，也可与使培养细胞与上皮-间 质转化诱导剂接触的工序同时地进行。
[0036] 关于诱导间质_上皮转化的物质的筛选方法，例如可通过如下工序来进行：在 可形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，使培养细胞与被实验物质接触的工序，以球 状体的形态的变化作为指标来评价被实验物质对于细胞的间质_上皮转化产生的效果 的工序。在该方法中，优选使用E-cadherin表达量低的细胞、例如人胰腺癌衍生细胞株 MIAPaCa-2、PANC-l、A1165等来进行。此外，也可在通过插入使培养细胞与上皮-间质转化 诱导剂接触的工序而诱导为间质系细胞之后，使被实验物质与培养细胞进行接触。特别是， 使用上皮癌（例如A549)和/或腺癌（例如Capan-2)等的细胞的情况下，优选在接种时进 行利用上皮-间质转化诱导剂的处理。
[0037] 本发明中的以球状体的形态变化为指标的评价可通过比较负对照组与被实验样 品组的球状体的外观及/或内部结构的差异来进行。
[0038] 关于外观的差异，可将球状体的形状（圆形度）、尺寸、数量等的变化设为指标。例 如，与负对照组相比，在被实验样品组中在球状体的尺寸变大了的情况下，和/或规定的尺 寸以上的球状体数量增加了的情况下，和/或球状体的圆形度更接近1的情况下，被实验物 质可评价为是具有维持细胞的上皮性的效果的物质。另外，代替以规定的尺寸以上的球状 体数量的变化为指标（或者与其并进），也可将没有形成球状体的细胞数量的变化设为指 标。这是因为，可将其认为是球状体形态变化的一个方式。 [0039] 另一方面，关于内部结构的差异，可将球状体内的低氧区域和/或氧浓度的变化 设为指标。例如，与负对照组相比，在被实验样品组中在球状体内的低氧区域大的情况下， 形成了细胞间粘接紧凑的球状体，被实验物质可评价为是具有维持细胞的上皮性的效果的 物质。
[0040] 此外，本发明的筛选方法由于可同时地捕捉球状体的外观的差异和内部结构的差 异，因而可取得可信度高的数据。进一步，本发明的方法由于可基于视觉性参数来进行评 价，因而可容易追踪经时性变化。
[0041] 关于球状体形态的外观差异的测定，除了可利用使用了相位差显微镜等生物显微 镜的观察、计量来进行之外，还可通过使用板读取器（platereader)、可测定三维形状的装 置、以图像数据为对象的解析算法等来进行。
[0042] 另一方面，关于内部结构的差异的测定，如果是可检测低氧区域的测定则可以是 任何样的方法，例如可通过使用发出磷光的化合物来进行。这是由于，如果使用发出磷光 的化合物，则可通过利用基于氧的磷光淬灭现象而将低氧状态变为可视化，可掌握低氧区 域以及氧浓度。该化合物如果是发出磷光而发生基于氧的淬灭现象的化合物则没有特别 限制，但是优选为发出细胞透过性高的长波长的磷光、磷光寿命长、磷光量子收率高的化 合物。作为该化合物的例子，列举出以Ir(III)作为中心金属并且以芳香族系分子为配 体的铱络合物，具体列举出双（2-苯并[b]噻吩-2-基-吡啶）（乙酰丙酮）合铱（III) (Bis(2-benzo[b]thiophen-2-yl-pyridine) (acetylacetonate)iridium(III)) 〇 此外，由 于磷光信号可进行定量化，因而可容易地求出被实验物质在上皮-间质转化方面的阻碍效 率或间质-上皮转化诱导效率。
[0043] 关于本发明中的可形成球状体的培养基材，如果是与在通常的单层培养中使用的 培养基材相比而言与细胞的粘接性受到抑制的培养基材，则可以是任何样的培养基材，例 如可使用通过将培养基材表面的亲水性或疏水性进行改性而得到的培养基材等。
[0044] 关于培养基材的材质，如果是对细胞而言无毒性的材质则也可以是任何样的材 质，例如可使用"聚苯乙烯"、"聚乙烯"、"聚丙烯"、"聚酰亚胺"、"聚乳酸和/或聚乳酸-聚 乙醇酸共聚物、聚己内酯等生物降解性聚合物"、"聚甲基戊烯等聚烯烃树脂"、"环状烯烃共 聚物（COC)和/或环状烯烃聚合物（COP)等环状烯烃系热塑性树脂"、"丙烯酸树脂"、"光固 化性树脂和/或热固化性树脂等其它的树脂"、"氧化铝等金属"、"玻璃"、"石英玻璃"、"硅" 等。另外也可使用通过在由硅和/或玻璃等形成的基板主体的表面形成"树脂"、"光致抗蚀 剂"、"氧化铝等金属"等的被覆层而得到的基材。
[0045] 关于培养基材的表面，只要可作为细胞粘接面而发挥功能，那么也可实施紫外线 照射、伽马射线照射、等离子体照射和/或各种物质的涂布等这样的用于控制细胞的粘接 性的处理。
[0046] 另外，本发明的筛选方法中，也可使用具有作为细胞粘接面而起作用的规定的凹 凸结构的培养基材来进行。
[0047] 作为凹凸结构，根据培养的细胞的性质，可制成线状（线宽/线距）、支柱状、空穴 状等各种形状，但是优选为将包含规定的平面形状的单元结构1规则地进行多个排列而得 到的结构。例如，如图1所示那样，可制成通过将平面形状为多边形的单元结构1以多个进 行连续而得到的凹凸结构。此时，从可使细胞在等向性且均匀的结构上生长这样的观点考 虑，更优选为正三角形、正方形、正六边形等正多边形或圆形的结构。另外，也可将支柱状和 /或空穴状的凹凸结构与由包含平面形状的单元结构1形成的凹凸结构进行组合。此外， 从使得培养细胞接近于在生物体内的状态这样的观点考虑，关于线2的宽度，如3ym以下、 2ym以下、1ym以下、700nm以下、500nm以下、250nm以下那样，越小则越优选。可认为这是 由于，线2的宽度变得越小，则粘接于凹凸结构面的细胞越可一边生长很多的伪足一边形 成球状体。
[0048] 另外，关于单元结构1的深度，根据培养的细胞的性质，形成为lnm以上、10nm以 上、100nm以上、200nm以上、500nm以上、1ym以上、10ym以上、100ym以上等各种尺寸。另 外，作为该凹凸的深宽比（Aspectratio)，存在有0. 2以上、0. 5以上、1以上、2以上等各种 深宽比。
[0049] 另外，单元结构1的最小内径（优选为最大内径）优选为3ym以下，如2ym以下、 1ym以下、700nm以下、500nm以下、250nm以下这样，越小则越优选。此处，内径是指外切于 单元结构1的2根平行线间的距离。因此，最小内径是指外切于单元结构1的二根平行线 间的距离之中最短的距离，最大内径是指外切于单元结构1的二根平行线间的距离之中最 长的距离。例如，在单元结构1为正六边形的情况下，对向的平行的边与边之间的距离成为 最小内径，对向的顶点间的距离成为最大内径。另外，在单元结构1为长方形的情况下，短 边的长度成为最小内径，对角线的长度成为最大内径。
[0050] 凹凸结构的形成方法可以是任何的方法，例如可使用纳米压印技术、溶液流铸法、 蚀刻、喷砂、电晕放电等。此时，从可更精密地控制形状等的观点考虑，优选为利用纳米压印 技术的方法。
[0051] 以下，通过实施例来具体说明本发明。但本发明不受限于以下的记述。
[0052] 实施例1
[0053] [E-cadherin表达量与球状体形态的相关关系]
[0054] (1)细胞接种以及观察
[0055] 在细胞培养容器NanoCulture(注册商标）皿（SCIVAX公司制，35mm皿，凹凸结 构面的材质=聚甲基戊烯（三井化学公司制TPX)，凹凸结构的平面形状=正方形，单元结 构间的宽度（线宽）=7〇〇nm，单元结构的最小内径=3ym，深度=1ym)上，将细胞以 2. 5X105cells进行接种，在培养第3天利用光学显微镜进行了观察。作为细胞，使用了人胰 腺癌细胞株、BxPC-3、Capan-1、Capan-2、AsPC-1、PANC-1、MIAPaCa-2。关于培养基，BxPC-3、 AsPC-l、PANC-l使用 了含有 10%FBS的RPMI1640 培养基，Capan-1 使用 了含有 10%FBS的 1^]\1培养基，〇3口311-2使用了含有10%?83的]^(：〇7'8 54培养基，]\1^^3〇3-2使用了含有 10%FBS的DMEM培养基。
[0056] (2)蛋白质印迹（WesternBlotting)
[0057] 在与（1)同样的细胞培养容器NanoCulture(注册商标）皿（SCIVAX公司制，35mm 皿）上，接种与（1)同样的细胞，培养了 5天后，通过吸液（pipetting)回收该细胞。用PBS 洗涤所回收的该细胞，将利用溶解缓冲液进行溶解而得到的细胞溶解液设为了样品。接 着，利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE)将各种细胞株的样品（蛋白质20yg份） 进行分离，其后，将蛋白质转印于PVDF膜。关于蛋白质的检测，通过使用作为一次抗体的 抗E-cadherin小鼠单克隆抗体（BDBiosciences:Cat#610182)、作为二次抗体的HRP标 记了的抗小鼠抗体（SantaCruz:sc_2005)、作为检测试剂的ECLPlusWesternBlotting DetectionSystem(GEHealthcare公司制）来进行。
[0058] 将（1)以及（2)的结果示于图2以及图3。可知，在E-cadherin的表达量高的 BxPC-3或Capan-2中，球状体的圆形度接 近于1，形成着细胞粘接紧凑的球状体。与此相 对，可知，在E-cadherin的表达量低的PANC-1或MIAPaCa-2中，相比于之前所述的细胞株 而言，球状体的圆形度远离1，形成着细胞粘接松弛的球状体。
[0059] 实施例2
[0060][上皮-间质转化阻碍剂对球状体的形态产生的效果]
[0061] (1)预培育
[0062] 在细胞培养容器NanoCulture(注册商标）板（SCIVAX公司制，384孔板，凹凸结构 面的材质=聚甲基戊烯（三井化学公司制TPX)，凹凸结构的平面形状=正方形，单元结构 间的宽度（线宽）=7〇〇nm，单元结构的最小内径=3ym，深度=1ym)上，将含有5%FBS 以及1. 0%Matrigel(注册商标）的DMEM培养基以25y1逐一地添加于各孔中，以1000Xg 进行了 5分钟离心。
[0063] (2)细胞接种
[0064] 利用含有5 %FBS的DMEM培养基将人肺癌衍生细胞的株A549调整为 13. 5X104cells/ml，将调整得到的细胞悬浊液以25y1逐个地添加于所述的板的各孔中 (细胞数量为3. 4X103cells/孔，培养基添加物的最终浓度为5%FBS，0. 5%Matrigel)。
[0065] (3)上皮-间质转化的诱导剂以及阻碍剂的添加
[0066] 在培养第3天，将作为上皮-间质转化诱导剂的TGF- 0 2 (R&Dsystems公司 制；302-B2-002)以及TNF-a(R&Dsystems公司制；210-TA-010)分别按照最终浓度成 为5ng/ml以及10ng/ml的方式添加于各孔。与此同时，将作为TGF- 0 2的阻碍剂的 SB431542(MiltenyiBiotec公司制；130-095-561)按照最终浓度成为10yM的方式进行了 添加。在不添加SB431542的全部的孔中，按照最终浓度成为0. 1%的方式添加了二甲基亚 砜。
[0067] (4)低氧区域检测试剂的添加
[0068] 在培养第5天，将低氧区域检测用试剂LOX-1(SCIVAX公司制）按照最终浓度成为 2yM的方式添加于各孔。LOX-1是含有发出红色磷光的铱络合物的试剂。
[0069] (5)观察
[0070] 在培养第6天，进行了利用荧光显微镜的观察。
[0071] 利用荧光显微镜进行观察、摄像，将得到的结果示于图4。首先，将各孔的明视野图 像进行比较时，则在没有添加上皮_间质转化诱导剂的孔（对照）中，圆形度接近于1，形成 着紧凑的球状体。与此相对，可知，在添加了上皮-间质转化诱导剂的孔中，超过半数的球 状体发生崩解，残剩的球状体的轮廓的凹凸也变大了。而且，可知，在添加了上皮-间质转 化的诱导剂和阻碍剂的孔中，与没有添加阻碍剂的孔比较而言，球状体的崩解被抑制的同 时，球状体的轮廓的凹凸也变小了。另一方面可知，将各孔的荧光视野图像进行比较时，则 与对照相比，在添加了上皮-间质转化的诱导剂的孔中，红色强度弱且红色区域变小，在向 其中添加了阻碍剂的孔中红色强度强且红色区域变大。即可知低氧区域变大。另外，将通 过将此时的红色信号进行定量化而得到的结果示于图5。可知，添加了上皮-间质转化阻碍 剂的孔具有没有添加上皮-间质转化阻碍剂的孔的约2倍的红色信号。
[0072] 实施例3
[0073] [在添加上皮-间质转化的诱导剂以及阻碍剂时的基因表达变化的验证]
[0074] 为了验证在实施例2中确认的球状体的形态的变化是否反映了上皮-间质转化以 及上皮_间质转化阻碍，因而针对于作为上皮或间质系标记物而公知的基因，利用qRT-PCR 测定其表达水平，将测定结果示于图6~图9。关于从（1)预培育到（3)上皮-间质转化的诱 导剂以及阻碍剂的添加为止的工序，与实施例2所示的工序同样地进行。然后，在培养第6 天，使用RNeasyPlusMiniKit(QIAGEN公司制）从各样品中提取总RNA，使用PrimeScript RTreagentKit(TakaraBioInc.制）将该RNA进行逆转录，将逆转录得到的逆转录物用 于qRT-PCR。在PCR中使用了SYBERPremixExTaqII(TakaraBioInc?制）。另外，在其 反应以及检测中使用了ThermalCyclerDice(TakaraBioInc.制）。将在PCR中使用的 引物示于下述表1。予以说明，关于数据，利用内标基因（TBP)的表达量进行修正，然后将对 照的表达量设为1，以这一情况下的相对值的方式进行示出。
[0075] 表 1
[0077] 关于作为上皮标记物而公知的E-cadherin的表达量，通过添加上皮-间质转化诱 导剂而减少为对照的1成以下，通过添加阻碍剂而恢复至对照的6成左右（图6)。另一方 面，关于作为间质系标记物而公知的N-cadherin的表达量，通过添加上皮-间质转化诱导 剂而增加至对照的约9倍，通过添加阻碍剂而减少至与对照相同的程度（图7)。同样地，关 于作为间质系标记物的Vimentin、以及作为抑制E-cadherin表达的转印因子的ZEB1的表 达，也示出了与N-cadherin近似的表达水平变化（图8及图9)。这些结果揭示了，在实施 例2中确认的球状体形态的变化所反映的是在上皮-间质转化以及上皮-间质转化阻碍时 产生的细胞性质的变化。
[0078] 产业上的利用可能性
[0079] 本发明方法可应用于抗癌剂和纤维症治疗药等的药剂筛选。
【主权项】
1. 一种对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法，其特征在于，包含如下工序： (a)在可形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，（b)使所述细胞与被实验物质接 触的工序，（c)以球状体的形态的变化作为指标来评价被实验物质对于所述细胞的上皮性 维持所产生的效果的工序。2. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述工序（c)通过测定规定尺寸的球 状体数量来评价。3. 根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，所述工序（c)使用可检测球状体 内的低氧区域的试剂来评价。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的筛选方法，其特征在于，所述工序（a)在具有作 为细胞粘接面而起作用的规定的凹凸结构的培养基材上进行。5. 根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述凹凸结构是通过将包含规定的 平面形状的单元结构规则地进行多个排列而得到的凹凸结构。6. 根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述凹凸结构是通过将单元结构间 的宽度为3ym以下、平面方向的形状为多边形并且最小内径为3ym以下的单元结构规则 地进行多个排列而形成。
【专利摘要】本发明提供一种可迅速且以低成本实施并且可取得可信度高的数据的、对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法。本筛选方法包含如下工序：（a）在可形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，（b）使所述细胞与被实验物质接触的工序，（c）以球状体的形态的变化作为指标来评价被实验物质对于所述细胞的上皮性维持所产生的效果的工序。此时，所述工序（c）可通过测定规定尺寸的球状体数量和/或通过测定球状体内的低氧区域来评价。
【IPC分类】G01N33/15, G01N33/50
【公开号】CN104903726
【申请号】CN201280076584
【发明人】伊藤学, 新井一也, 梶田浩志, 田中觉
【申请人】Jsr株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2012年9月5日
【公告号】EP2894472A1, US20140065655, WO2014038025A1
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