诊断、预后、治疗和筛选方案的制作方法
诊断、预后、治疗和筛选方案的制作方法
【专利说明】
[0001] 优先权要求
[0002] 本申请要求2012年11月8日提交的澳大利亚临时专利申请第2012904887号的 优先权，其公开内容通过引用包括在本文中。
技术领域
[0003] 本说明书一般涉及与免疫激活，特别是黏膜免疫激活相关联的传染原或其它病症 的诊断，预后和治疗方案领域。更具体而言，本说明书涉及作为生物标记的抗体在免疫激活 和/或与免疫激活相关联的病患的诊断、预后和治疗中的用途。提出的本方案正准备引进 到实验室和床边自测模式中以满足全世界的目标人群。
【背景技术】
[0004] 本说明书中提及的参考书目细节列在说明书的最后。
[0005] 提到的任何现有技术不是且不应被视为承认或任何形式的启示该现有技术组成 任何国家中的公知常识的一部分。
[0006] 特异性抗体（免疫球蛋白（Ig))类的检测被认为是人类和动物疾病的诊断和研宄 方法的重要步骤。例如，抗原-特异性IgM类抗体的检测广泛地用作感染有病毒如甲型肝 炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼罗病毒、登革病毒、麻瘆病毒；和感染有细菌如梅毒（梅毒螺旋 体）的诊断测试，因为IgM类抗体通常在感染的急性期期间产生于受感染的宿主体内，并仅 在几个月是可检测的。
[0007] 相反地，IgG类抗体通常终身存留并可以指示特定病原体的现症或既往感染。存 在于人体中，用特异性药物可表明当前或过去的感染情况。对于如人类免疫缺陷病毒（HIV) 的慢性感染而言，患者不能自发地清除病毒，IgG类抗体的检测用于感染的诊断，而对于如 丙型肝炎病毒（HCV)等其它的感染，一部分患者可以自发地或在治疗后清除病毒，抗原-特 异性IgG的检测不用于当前或持续感染的诊断。IgG类抗体还主要负责机体血浆部分抗 体-介导的免疫。
[0008]IgA类抗体也已经被用于帮助感染的诊断，包括戊型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、和 登革病毒，以及感染的疫苗和免疫的研宄。IgA用于诊断目的是有吸引力的，因为它在急性 感染期期间显著地产生，需要或不需要IgM的同时检测，高水平的抗原-特异性IgA可以提 供当前感染的标记。另外，因为IgA是分泌在黏膜上皮表面的主要抗体种类，它的存在被认 为是黏膜免疫的标记。作为感染的生物标记的不同IgA结构形式的作用未被理解，如特别 是dlgA。SIgA在感染中的作用和使SIgA产生应答的抗原尚未被研宄，设计为用于快速地 且便捷地评估患者血清中的这些应答的诊断和预后的方案也未被开发。
[0009] 大多数动物中，IgA几乎完全以二聚体或更高多聚体的形式合成，本文将其统 一描述为dlgA，其能够与多聚Ig受体（plgR)相互作用。这种相互作用导致大量分泌型 IgA(SIgA)分泌进入上皮组织的内腔（参见图1和2)。然而，在人类和高等灵长类中，dlgA 仅仅是总IgA的很少部分，单体IgA(mlgA)代表约90 %的总IgA，且二聚体或较高聚合体形 式的IgA代表约10%的总IgA。
[0010] IgA、IgM、IgG和其它抗体种类或同种型的检测通常使用其它物种中制备的抗体试 剂来进行，比如对人类IgM特异的兔抗体，或对人类IgA特异的小鼠单克隆抗体，或对各个 抗体亚类如IgAl、IgA2或]^61、]^623、]^6213、]^63、]^64特异的单克隆抗体。基于抗体的 捕获测定与通过最优化方案最小化的非特异性结合的水平有关。
[0011] 需要改善用于监测与受试者的黏膜表面和黏膜免疫反应有关的感染的血清学手 段，以及需要可以用于评估二聚或多聚抗体的产生和/或用于二聚或多聚抗体纯化的试 剂。
[0012] 实施方案概述
[0013] 因此一个实施方案中，本说明书提供了抗体捕获方法，其包括（i)获得包含抗体 的生物样品，（ii)使生物样品与重组plgR或dlgA-结合变体接触，其中所述plgR或变体 结合dlgA并形成plgR-dlgA复合物。一旦所述复合物形成，所述复合物可被定量。一些实 施方案中，dlgA可以从所述plgR中释放并进一步加工。一个实施方案中，采用所述方法用 于dlgA抗体的纯化，作为采用木菠萝素（jacalin)琼脂糖的现有方法的替代方案。复合物 的检测使用本领域的常规方法和已知的试剂，如ELISA或其它基于免疫测定的方法。
[0014] -个实施方案中，所述方法还包括（iii)直接地或间接地评估所述plgR-sIgA复 合物的水平或plgR-sIgA和感兴趣的抗原间形成的复合物的水平。
[0015] -个实施方案中，所述plgR或dlgA-结合变体结合dlgA并且基本上不结合IgM， 或其中所述plgR或变体结合dlgA和IgM。用于检测抗原特异性IgM和dlgA的方法可与用 于总IgA、IgG和其它个别同种型、亚型和结构形式以及它们中两种或更多种的组合的测试 联用。
[0016] 一个实施方案中，生物样品为血液或血清样品。可选择的生物样品包括包含表达 dlgA的细胞的样品。因此，一些实施方案中，所述方法可用来在永生化B细胞的筛选或分离 中检测表达dlgA的个别B-细胞。
[0017] 另一个实施方案中，生物样品从受试者中获得。在一些实施方案中，受试者为人类 或灵长类，以及在另一个实施方案中，受试者为除灵长类或人类物种外的哺乳动物或禽类 动物物种。基于感兴趣的靶抗体和抗体来源的物种选择不同形式的重组PlgR。
[0018] 如在一个实施方案中所阐明的，plgR为重组HpIgA或RpIgR。便利地，在一个实施 方案中，重组plgR或dlgA-结合变体的跨膜结构域和/或胞浆结构域缺失。在其它实施方 案中，重组plgR包含异源检测或结合域。在另一个实施方案中，重组plgR或IgA-结合变 体在多糖缺陷细胞中重组产生，如CH0细胞。
[0019] 在上述方法的示例性实施方案中，重组plgR结合到固体支持物上。
[0020] 在一个实施方案中，将生物样品在用于所述方法之前耗尽IgM或dlgA抗体，这就 允许结合IgM和dlgA的plgR在测定中被利用以特异性地检测dlgA。同样地，dlgA的耗竭 (例如使用R/HpIgR)有利于在测定中利用HpIgR以特异性地检测IgM。一些实施方案中， 为了减少与dlgA的竞争，样品使用之前被耗竭IgG。然而，当竞争性抗体在本申请抗体/同 种型捕获模式中被洗掉时，此类竞争的缺乏是上述方法的一个优势。
[0021] 可采用任何感兴趣的抗原，以及在非限制性实施方案中，所述感兴趣的抗原是传 染原的抗原或与侵袭黏膜表面或相关组织的受试者病症相关的抗原。例如，传染原包括 HIV、麻风病、梅毒、肝炎、登革病毒、麻瘆和风瘆。
[0022] 在一个实施方案中，上述方法还包括使生物样品与抗-SC结合剂或抗-SC抗体接 触，其中所述抗-SC结合剂或抗-SC抗体结合SIgA并形成SIgA-结合剂/抗体复合物。在 另一个实施方案中，所述方法还包括使包含所述plgR-dlgA复合物的样品与变性溶液接 触，去除来自复合物的任何SIgA并测定生物样品中SIgA和dlgA的比值。
[0023] 另一方面，本说明书实现了用于确定测试受试者的肠壁完整性的抗体捕获方法， 所述方法包括：（i)获得包含来自测试受试者的抗体的生物样品，（ii)使所述生物样品和 重组plgR或dlgA-结合变体接触，其中所述plgR或变体结合dlgA并形成plgR-dlgA复合 物，和（iii)使所述生物样品与特异性抗-SIgA结合剂或抗-SC结合剂/抗体接触，其中 抗-SIgA结合剂或抗-SC结合剂/抗体结合SIgA并形成SIgA-结合剂/抗体复合物，以及 (iv)测定和比较（ii)中形成的复合物的水平与（iii)中形成的复合物的水平，其中SIgA 与dlgA的比值与来自对照受试者的相应水平或比值相比较，并提供肠道完整/渗漏的测 定。
[0024] 在上述方法的一个实施方案中，确定了SIgA2/dIgA2和/或SlgAl/dlgAl的水平 或比值。
[0025] 在另一个实施方案中，所述抗体捕获方法包括（i)获得包含抗体的生物样品， (ii)使所述生物样品与重组PIgR或dlgA或IgM-结合变体接触，其中，所述pIgR或变体结 合IgM和/或IgA并形成plgR-IgM和/或plgR-dlgA复合物。
[0026] 可选地，所述抗体捕获方法可以包括（i)获得包含抗体的生物样品，（ii)使所述 生物样品与重组plgR接触，其中所述plgR或变体结合IgM并形成plgR-IgM复合物。
[0027] 在另一个说明性的实施方案中，实现了用于检测受试者抗原-特异性dlgA的存在 的方法，所述方法包括（i)获得来自受试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述样品与R/ HpIgR和抗原接触，以及（iii)测定抗原-特异性dlgA的水平。
[0028] 另一个实施方案中，描述了用于检测受试者抗原-特异性IgM存在的方法，所述方 法包括（i)获得来自受试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述样品与HpIgR和抗原接触， 以及（iii)测定抗原-特异性IgM的水平。
[0029] 在一个实施方案中，所述方法用于检测受试者抗原-特异IgM和dlgA的存在，所 述方法包括（i)获得来自受试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述样品与HpIgR和R/ HpIgR和抗原接触，以及（iii)测定抗原-特异性IgM和抗原-特异性dlgA的水平。
[0030] 再一方面，本说明书提供了用于评估受试者免疫状态的试剂盒，所述试剂盒包含， a)免疫图形设备，其包含可操作地连接到样品部分、测试部分和任选地对照部分的多孔膜； 以及还包含吸管部分、包含重组plgR分子或其dlgA-结合变体的部分、包含感兴趣的抗原 部分和任选的偶联部分；以及b)使用免疫图形设备检测从受试者中获得的生物样品中抗 原特异性dlgA抗体存在的说明书。
[0031] 如本文结合所述方法所描述的，在试剂盒的一些实施方案中，pIgR为HpIgR和/或 R/HpIgR。一些实施方案中，重组plgR或dlgA-结合变体的跨膜结构域和/或胞浆结构域 缺失。在一个实施方案中，重组PlgR包含异源检测或结合结构域。在另一个实施方案中， 重组PlgR或IgA-结合变体在多糖缺陷细胞中重组产生。
[0032] 在一个实施方案中，重组plgR结合到固体支持物上。
[0033] -个实施方案中，生物样品在用于上述方法之前耗尽IgM或dlgA抗体，本发明的 试剂盒以及其中所含试剂供体外使用。
[0034] 可采用任何抗原，然而在一个实施方案中，感兴趣的抗原是传染原抗原或与受试 者侵袭黏膜表面或相关组织的的病症相关的抗原。示例性的传染原选自HIV、麻风病、梅毒、 肝炎、登革病毒、麻瘆和风瘆。使用重组plgR检测到相对于对照水平抗原特异性dlgA的升 高水平便于诊断、筛选和治疗选择。在一些实施方案中，考虑以下治疗方法：其包括要求抗 原-特异性dlgA水平的测试，并且如果对于感染或病症而言所述测试是阳性的，那么将治 疗施用于所述诊断受试者。
[0035] 另一个实施方案中，试剂盒还包括抗-SIgA结合剂/抗体或抗-SC抗体，其中所述 抗-SIgA结合剂/抗体或抗-SC抗体结合SIgA并形成SIgA-结合剂/抗体复合物。
[0036] 另一方面，提供了重组plgR，其适合用于捕获或检测dlgA和/或IgM。示例性的重 组plgRs包括R/HpIgR或HpIgR或者R/HpIgR或HpIgR的dlgA和/或IgM结合变体。示 例性氨基酸和核苷酸序列如SEQIDN0:1-20所列，需要记住的是这些序列的一部分编码或 提供完全任选的CD4胞浆结构域，其可以被删除、修饰、补充或用本领域已知的其它结合或 检测分子代替。一旦考虑到本发明，有用的重组PlgR的变体对技术人员是显而易见的并很 容易被制备和测试。
[0037] 支持和描述本申请方法和试剂盒的附图的详细说明
[0038] 如果附图包含彩色图示或实体，附图的彩色版本经请求可从专利权人或从有关专 利局得到，如果从专利局获得，可能需要缴纳费用。
[0039] 图1提供了dlgA的产生以及在黏膜表面作为SIgA分泌的示意图。在黏膜下组织 产生的大多数dlgA随后结合到plgR上并经胞吞转运到黏膜表面，在那里plgR被裂解以产 生SIgA(或游离的SC)，SIgA组成抵抗病原体的第一防御层。plgR的结合依赖于聚合Ig中 J-链的存在，并且结合发生于人类的IgM和dlgA两者。
[0040] 图2提供了dlgAl的结构以及其与plgR相互作用的图示，相互作用后的plgR随 后被裂解以产生SIgAl。plgR相关的分泌组分部分与两个单独的IgA分子的J-链和Fc区 两者都相互作用。
[0041] 图3提供了相对于人类（HpIgR)的嵌合R/HpIgR，以及所述R/HpIgR在其C-端融 合人类CD4胞浆结构域的结构的图示。所述R/HpIgR和其它形式在293T细胞中高水平表 达和分泌，如通过利用对来自瞬时转染细胞的粗上清液（SN)进行SDS-PAGE凝胶的考马斯 亮蓝染色来检测R/HpIgR所示。通过利用针对所述CD4胞浆结构域（纯的）的单克隆抗体 4B4的固定基质的亲和层析法很容易纯化到均质、高浓度的R/HpIgR-cyto。纯的plgR或粗 SN可以被优先用在dlgA的检测和结合中。
[0042] 图4提供了相对于重组形式的R/HpIgR-cyto(底部），全长（天然的）plgR(顶部） 结构的示意图，其中所述plgR的跨膜结构域（TM)和胞浆结构域（cyto)已经被人CD4的胞 浆结构域替代。由于所述TM结构域的缺失，产物从细胞中分泌出来而不是保留在细胞表 面。
[0043] 图5提供了相对于重组形式的R/pIgR-cyto(底部），全长（天然的）兔plgR(顶 部）结构的示意图，其中兔plgR的跨膜结构域（TM)和胞浆结构域（cyto)已经被人CD4的 胞浆结构域替代。由于TM结构域的缺失，产物从细胞中分泌出来而不是保留在细胞表面。
[0044] 图 6 提供了HpIgRcyto、RpIgR-cyto和嵌合R/HpIgR-cyto结构的示意图。plgR 的这些形式显示了通过所述CD4胞浆结构域与塑料或其它固体表面的相互作用，与诸如聚 苯乙稀ELISA板（NuncImmulon或类似的）的固体表面的高效结合。
[0045] 图7提供了RpIgR和嵌合R/HpIgR结构的示意图。在⑶4胞浆结构域缺乏时，通 过与针对兔plgR的抗体反应能检测到所述RpIgR，并且通过与针对兔（结构域1)和/或人 (结构域2-5)plgR的抗体反应能检测到嵌合R/HpIgR。优选的抗体必须能够与结合到dlgA 的PlgR相互作用，而不仅仅与游离的PlgR相互作用。
[0046] 图8提供了比较HpIgR和R/HpIgR与人IgM和dlgA结合的ELISA结果。HpIgR或 R/HpIgR固定在96孔NuncImmulon板上于4°C过夜，将纯化的人IgM或dlgA在PBS中的稀 释液结合到被固定的PlgR形式上过夜。洗涤后，使用偶联辣根过氧化物酶（HRP)的抗-IgM 或抗-IgA以及比色底物TMB检测所述捕获的IgM或dlgA。结果证明HpIgR显示优先的与 IgM(品红色）的结合以及与dlgA(绿色）的结合，然而R/HpIgR显示与IgM的结合大大减 少（黄色），但是保留了与dlgA强的结合（蓝色）。
[0047] 图9提供了比较使用R/HpIgR检测固定的dlgA的ELISA结果。纯化的dlgA或没 有dlgA(空白（mock))的稀释液固定在预先包被有抗-IgA的96孔NuncImmulon板上， 以便dlgA通过抗原-抗体的相互作用而不是被动吸附结合到板上。使用R/HpIgR( "无尾 的"）或没有PlgR( "空白"）、抗-分泌组分和抗-鼠HRP以及TMB底物检测dlgA。结果表 明R/HpIgR能够检测最低测试浓度（31ng/mL)的dlgA，ELISA中有强的信号，背景可忽略。
[0048] 图10为用于检测诸如人血清或血浆的样品中抗原-特异性dlgA存在的一个优选 实验方法的示意图。将重组R/HpIgR-cyto固定在ELISA板上，并与血清或其它样品孵育。 二聚体IgA被捕获在固相上，并且经洗涤后去掉其它样品组分（如未被捕获的IgA和IgG， 左），抗原-特异性dlgA的存在通过连续的抗原加入以及链霉亲和素-HRP来检测，所述抗 原是生物素化的，或与针对所述抗原的生物素化的单克隆抗体起反应的。通过这种方式，通 过与抗原-特异性dlgA的反应固定的任何抗原将通过所述生物素-亲和素相互作用显示 信号。
[004 9] 图11为相比于使用抗-IgM捕获的标准方法检测HAV-特异性IgM，用于检测血清 中甲型肝炎病毒-特异性dlgA的一种优选的实验方法（的示意图。
[0050] 图12提供了显示IgM捕获中HAV-特异性IgM的检测的ELISA结果，使用来自患有 急性HAV感染的患者的连续稀释的血清（AccurunHAV面板样品121)。血清样品是稀释前 未触动过的（未被触动的，紫色），或是使用Capture-SelectIgM(BAC)基本上耗竭IgM(红 色）的。结果显示与未触动过的血清相比较，该IgM耗竭方法降低了样品中HAV-特异性 IgM的水平约256倍。
[0051] 图13提供了显示R/HpIgR捕获中HAV-特异性dlgA的检测的ELISA结果，使用来 自患有急性HAV感染的患者的连续稀释的血清（AccurunHAV面板样品121)。血清样品是 稀释前未触动过的（未被触动过的，紫色），或是使用Capture-SelectlgM(BAC)基本上耗 竭IgM(红色）。结果首先显示获得的强信号证明了HAV-特异性dlgA的检出，其次该信号 是dlgA而不是IgM特异性的，因为与未触动过的血清相比，IgM耗竭方法基本上没有降低 HAV-特异性反应的水平，与图12中显示的IgM检测的结果形成对照。
[0052] 图14提供了显示R/HpIgR捕获中HAV-特异性dlgA检测的ELISA结果，使用来自 患有或没有患急性HAV感染的患者的血清（AccurunHAV面板，阳性的（POS)，低阳性的（LOW P0S)，或阴性的（NEG))。结果显示在所有P0S样品和两个LOWP0S样品的一个中很强地检 出了HAV-特异性dlgA，在NEG样品中有最小化的背景反应，这证实了抗原-特异性dlgA的 R/HpIgR捕获用于急性HAV感染诊断的效用。
[0053] 图15提供了显示在R/HpIgR捕获或HpIgR捕获中戊型肝炎病毒（HEV)-特异性 dlgA的检测的ELISA结果，使用来自患有或没有患急性HEV感染的患者的血清。在左边，显 示个体样品的ELISA0D，证实了抗原-特异性dlgA的R/HpIgR捕获用于急性HEV感染诊断 的效用，以及HpIgR捕获用于该目的的较低但仍然显著的效用，以及任一样品中可忽略的 背景反应。在右边，显示的是每个血清样品的连续稀释液的反应，这确认了用于急性HEV感 染诊断的R/HpIgR捕获的效用和HpIgR捕获的较低效用。很可能的是，在这些实例中HpIgR 捕获的较低效用是由于血清中相对于dlgA高得多的IgM的总浓度，这导致通过HpIgR捕获 的IgM仅较低比例特异性针对HEV。
[0054] 图16为用于抗原-特异性dlgA(或IgM)的检测的第二优选方法的示意图，其中抗 原直接包被到ELISA板上（在这种情况下，戊型肝炎病毒（HEV)抗原）。将血清样品加载于 所述板上并且抗原-特异性抗体，包括IgM和dlgA，结合到所述抗原，然后用抗-IgMHRP， 或R/HpIgR和抗-人SCHRP检测。最终洗涤后，用TMB底物使信号产生。
[0055] 图17提供了HEV-特异性dlgA与HEV-特异性IgM的比较结果。两种方法都能够 检出所有ffiV-感染患者，与dlgA试验中对照患者（HEV阴性的）的极低的背景，以及IgM试 验中的低背景相比，HEV-感染患者有强的ELISA信号。值得注意的是，一些样品显示与IgM 相比较高的dlgA水平（样品J13,J7)，而其它样品显示与dlgA相比较高的IgM水平（J4， J11)。这证明患者中dlgA和IgM的应答是独立的，并且表明IgM和dlgA检测的组合在一 些合适的试验模式中可能是有用的。
[0056] 图18提供了HEV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较结果，使用未触动 过的，或通过Capture-SelectIgM基本上耗尽IgM的血清，然后将其连续稀释。结果证实 了所述IgM试验对IgM是特异的，因为反应通过IgM耗竭被消除，然而dlgA分析主要特异 性地针对dlgA而不是IgM，因为反应仅轻微地受IgM耗竭的影响。
[0057] 图19提供了HEV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较结果，使用未触动 过的，或通过Capture-SelectlgM基本上耗尽IgM的血清。结果证实述IgM试验对IgM是 特异的，因为通过IgM耗竭反应被消除，然而dlgA试验主要特异性地针对dlgA而不是IgM， 因为反应仅轻微地受IgM耗竭的影响。
[0058] 图20提供了HEV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较结果，使用未触动 过的，或通过Capture-SelectlgM基本上耗尽IgM的血清。结果证实了IgM试验对IgM是 特异性的，因为通过IgM耗尽所述反应被消除，然而dlgA试验主要特异性地针对dlgA而不 是IgM，因为反应仅轻微地受IgM耗竭的影响。当使用配对t检验比较耗竭前后的样品时， IgM耗竭后dlgA活性的降低在统计上是显著的，但是当使用Mann-Whitney检验比较耗竭前 后的总样本集时是不显著的。
[0059] 图21提供了表明R/HpIgR可以用于小鼠二聚体IgA的捕获⑷和检测（B) 的ELISA结果，单体（人类）IgA的背景反应可忽略。A.将纯化的小鼠IgA单克隆抗体 3H1 (抗-HAV)或纯化的单体人类IgA的稀释液包被在板上并用R/HpIgR和抗-SC抗体检 测。B.将R/HpIgR包被在板上并允许纯化的小鼠IgA单克隆抗体3H1或纯化的单体人类IgA的稀释液结合过夜，然后用抗-小鼠IgA或抗-人类IgA检测。来自不同物种的IgA与 人或兔plgR的结合是本领域已知的，并且这表明了本文所描述的新的plgR策略具有诊断 其它物种的感染的效用。它还可用于纯化来自其它物种的dlgA-例如-相对于木菠萝凝集 素琼脂糖，小鼠、兔或大鼠IgA单克隆抗体的纯化。
[0060] 图22提供了ELISA结果，其表明了R/HpIgR用于小鼠二聚体IgA和人二聚体IgA的检测是同样有效的，单体人IgA有可忽略的背景反应。A.纯化的小鼠IgA单克隆抗体 3H1 (抗-HAV)或纯化的二聚体或单体人IgA的稀释液包被在板上并用R/HpIgR和抗-SC抗 体检测。
[0061]图23提供了概述急性人类免疫缺陷（HIV)感染的致病结果的模型，其引起肠道以 及外周快速的CD4消耗，随后肠道屏障功能下降，肠道内容物的渗漏和微生物易位的增加， 引起免疫激活的增加，其促使发病和⑶4T-细胞水平的进一步下降（Brenchleyetal，Nat Med12:. 1365-1371,2006)。对简单、标准化的分析存在未满足的需求，所述分析能够用于 检测发病途径中这些步骤的一步或多步，以便可以为患者提供适当的干预，目前只有CD4 试验已整合到用于HIV-感染患者的护理标准中。检测肠道中⑶4的消耗需要内窥镜检查； 检测肠道屏障功能降低需要复杂的糖激发研宄或其它方法；检测肠道渗漏和微生物易位可 以使用如血清中细菌LPS或16sRNA的标记物来实现，但是结果是高度变异的，部分由于个 体之间肠道菌群的广泛变异性；免疫激活需要复杂的流式细胞术方案，使仪器/操作者标 准化是困难的。
[0062] 图24为由病原HIV或SIV感染诱导的肠道渗漏导致的微生物易位增加的示意图， 所述增加是与非病原SIV感染的正常低水平易位相比。
[0063] 图25阐明了微生物易位增加的一个预期后果为由于黏膜抗原暴露而导致的IgA 应答增加的诱发。Frenchetal，JInfectDis. 200(B): 1212-1215, 2009 证明了随访 6 年 后HIV患者中IgA的总水平与经历高效抗逆转录病毒治疗的患者的CD4T-细胞的水平呈负 相关，表明即使在用目前最有效的抗病毒治疗的患者中，微生物易位有助于发病。然而这些 结果也说明个体之间总IgA是高度可变的，并且没有提供可以用在个别患者的管理中的预 后标志物。
[0064] 图26提供了由病原HIV或SIV感染诱发的肠道渗漏导致的微生物易位增加的示 意图，所述增加与非病原SIV感染的正常低水平易位相比，显示对血浆部分中的二聚化IgA 和分泌型IgA水平的预期影响。在正常条件或非病原HIV感染下，肠道屏障完整性被保持， 并且肠道腔SIgA的水平反映了它的前体物dlgA在固有层中的量。通过肠道M-细胞的主 动运输，或少量的肠道渗漏，只有极少量SIgA返回到血浆部分。渗漏或主动运输的量可以 通过将SIgA的血清/血浆浓度与它的前体物dlgA的血清/血浆浓度比较，得到SIgA/dIgA 的比值来估算。在致病HIV或SIV感染，或其它导致肠道渗漏的生理激发的条件下，dlgA的 总量可能会稍微升高并且可引起较高水平的SIgA分泌到内腔。然而，由于通过受损的肠道 屏障的被动渗漏，更高比例的SIgA返回到血浆部分，导致SIgA/dIgA比值升高。
[0065] 图27提供了能用来测定不同IgA形式的相对含量以便估算SIgA/dIgA的比值的 几种典型分析中的一个的示意图。在这个实例中，通过使用R/HpIgR捕获dlgA测定dlgA 的量，并使用针对IgAl、或IgA2,或针对这两种IgA亚类的单克隆抗体检测。单体IgA不结 合plgR;SIgA结合R/HpIgR但是亲和力低于dlgA，并且如果需要，可以通过3. 5M尿素的洗 涤被去除。用同样的方式测定SIgA，但是使用抗-SC抗体捕获代替R/HpIgR。然后将SIgA/ dlgA比值计算为SIgA和dlgA的分析反应性的简单比值。
[0066] 图28提供了ELISA结果，其显示了与大部分HIV-感染患者和所有对照受试者（品 红色）相比，一部分HIV-感染患者中高度地升高的SIgA2/dIgA2(S/d)比值的检测。升高 的SIgA/dIgA的分析临界值被设定为非-HIV对照受试者中所述SIgA/dIgA比值的平均值 +3标准差，并且7/30的HIV-感染受试者显示SIgA/dIgA比值高于该临界值。显著地，正常 受试者中SIgA/dIgA比值的范围小于单独的SIgA或dlgA的范围，因为dlgA作为SIgA前 体物的作用提供了对每个患者的正常化效应。
[0067] 图29提供了ELISA结果，其表明患者和对照血清中SIgA的总量（任意单位）。正 常患者的SIgA2量在11-倍范围变动，但是所有正常对照都落在平均值+3标准差的截止范 围内。HIV-感染患者中的SIgA2量在稍大范围（16倍）内变动，但是只有2/30患者高于所 述截止范围。所述HIV-感染患者中，在图28中显示SIgA2/dIgA2比值升高的那些患者用 红色标记标示。能够看出，SIgA2/dIgA2比值升高的这些患者在整个总SIgA2信号的正常范 围的大部分找到，因此不能基于单独的总SIgA2信号与正常对照区分。这证实了使用SIgA/ dlgA比值的效用，因为dlgA作为SIgA前体物的作用提供了对每位患者的正常化效应。R/ HpIgR系统提供了用于测定该比值的效用。
[0068] 图30阐明了图28和29中显示的不同HIV-感染群体中SIgA2/dIgA2比值相对于 免疫激活标志物，⑶8+HLA-DR+⑶38+T-细胞的关联性。当总关联性低时，很明显的是在该 实验中的SIgA2/dIgA2比值>4的患者具有升高的免疫激活标志物的水平（p〈0.0001)。 [0069] 图31阐明了在与图30中相同的群体中，SIgAl/dIgAl比值相对于免疫激活标志物 ⑶8+HLA-DR+⑶38+T-细胞的关联性。当总关联性再次低于对于IgA2而言的总关联性时， 很明显的是在该实验中的SIgAl/dIgAl比值>10的患者具有升高的免疫激活标志物的水平 (p〈0.015)。对于IgAl的较低关联性和有显著性的较高临界比值（10对4)强调了特异性 地测定IgA2的价值，由于它的主要合成部位在肠道（SIgA渗漏的组织）中很有可能会是肠 道渗漏和免疫激活的临床相关标志物。
[0070] 图32阐明了在与图30和31中相同的群体中，SIgAl/dIgAl比值相对于SIgA2/ dIgA2比值的关联性。当SIgAl/dIgAl比值与SIgA2/dIgA2显著相关时，值得注意的是存在 一些患者有高度升高的SIgAl/dIgAl比值和相对低的SIgA2/dIgA2比值。这表明在计算作 为肠道渗漏和免疫激活的测量的SIgA/dIgA比值中除了测定IgA2外，测定IgAl、或总IgA 也可能存在一些价值。
[0071] 图33提供了CHMERA-OMcyto (R/HpIgR-cyto)的核苷酸序列和氨基酸序列，显示 了加下划线的兔序列和以黑色显不的人序列，和以灰色显不的CD4cyto序列。
[0072] 图34提供了CmMERA-CD4(R/HpIgR)的核苷酸序列和氨基酸序列，显示了加下划 线的兔序列和以黑色显示的人序列。
[0073] 图35提供了图示和制成表的数据，显示丙型肝炎病毒特异性dlgA的检测。除了 通过粪口途径人与人间传播的急性、自限性的甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒外，还存在导 致病毒性肝炎的至少三种其它病毒，所述病毒性肝炎通常是慢性的并且导致严重的长期疾 病，并且其中所述病毒被认为是血源性的，即乙型肝炎、丙型肝炎和丁型肝炎。在该实例中， 可以看出，即使对于如丙型肝炎病毒而言的慢性感染，HCV-特异性dlgA在感染后仅相对 短的时间内可检测，直到最后血液样品测试HCV为阴性后约100天，表明HCV-特异性dlgA 可为急性感染的标志物。在该分析中，有4/5(80%)的HCV-患者有可检测的HCV-特异性 dlgA时，对本领域技术人员显而易见的是，有多种方法能被用来增加用于检测急性-期HCV 的该分析的灵敏度，其在确定利用抗病毒药物或包含干扰素的药物治疗患者的最佳选择方 面是有用的。还显而易见的是，因为病毒-特异性dlgA存在于不同的疾病范围内，包括甲 型肝炎、戊型肝炎、丙型肝炎和肺结核，可以合理地推测出对于任何其他感染疾病，它是可 检测的，并且在预后和治疗方案中具有功用。
[0074] 图36提供了比较用于结合R/HpIgR或HpIgR的不同商购的抗体的数据的图示。对 本领域技术人员明显的是，存在很多针对pIgR(又被称为分泌组分或SC)的不同单克隆和 多克隆抗体，其可用于检测结合的plgR，从而在多种方法中检测抗原-特异性或总dlgA或 IgM。在本实例中，可以看出，一些可商购的抗体能用于该目的，其中重组表达的嵌合型R/ HpIgR或重组表达的人类HpIgR的连续稀释液包被在聚苯乙烯ELISA板上，然后使用小鼠 单克隆或绵羊多克隆抗体的连续稀释液检测，以及利用适当的抗_物种抗体检测。要注意 的是R/HpIgR以较高浓度存在，因此在本实验中没有分析信号的滴定，而用较低浓度存在 的HpIgR，抗体反应性的滴定揭示了市售的Abeam单克隆抗体17921与绵羊多克隆抗体大致 等效，而Abcaml7377和3924出现较低反应，针对SC的NordicImmunology单抗也是如此。 兔抗体为阴性对照，这些和其它抗体可以根据它们与游离plgR形式或者与已经结合dlgA 或plgM的plgR形式的结合来选择，由此满足R/HpIgR或HpIgR或其dlgA-结合相应的变 体的检测的目的需要。
[0075] 具体实施方案的描述
[0076] 在整个说明书和随后的权利要求书中，除非文中另有要求，词语"包含 (comprise) "及其变化形式如"包含（comprises) "和"包含（comprising) "，应被理解为意 味着包括阐明的整数或要素或方法步骤或者整数或要素或方法步骤的组，但是不排除任何 其它整数或要素或方法步骤或者整数或要素或方法步骤的组。
[0077] 所述"由…组成"是指包括，并限于，词组"由…组成"后的任何要素。因此，所述 词组"由…组成"表明所述列出的要素是必须的或强制的，并且没有其他要素可以存在。所 述"基本上由…组成"是指包括该词组后所列的任何要素，并限于不干扰或有助于本公开已 经指明的所列要素的活性或作用的其它要素。因此，所述词组"基本上由…组成"表明所列 要素是必须的或强制的，但是其它要素是可选的并且可以存在或可以不存在，这取决于它 们是否影响所列要素的活性或作用。
[0078] 如本文所用的，单数形式的"a"，"an"和〃the"包括其复数形式，除非本文另有清 楚的规定。
[0079] 核苷酸和氨基酸序列由序列标识号（SEQIDN0:)来提及。SEQIDNOs:数字上对 应于序列标识符<400>1(SEQIDN0:1)，〈400>2(SEQID勵:2)，等等。表1提供了序列标识 符的总结。序列表在说明书的最后提供。
[0080] 如文中所描述的，本公开内容提供了抗体捕获方法，其包括确定生物 样品中二聚 的或多聚的IgA(dlgA)的水平或存在。本发明的所述方法可通过仅检测dlgA的水平或存 在来实施，或者它可与确定一种或多种另外的抗体形式（例如，单体，二聚的，多聚的或五 聚的复合物）、种类（同种型）、或亚类（例如，dlgAl、dIgA2、SIgA2、等等）的水平或存在 的方案结合来实施用。一些实施方案中，利结合感兴趣的dlgA分子的特异性抗原来实施上 述方法。在其它实施方案中，可实施所述方法用以鉴定受试者中产生dlgA应答的感兴趣的 抗原，可以在来自受试者的样品中检测dlgA应答。在一些实施方案中，所述方法能够实现 诊断分析和治疗方案等的开发，用于评估黏膜表面和如肠道相关的淋巴组织（GALT)的相 关组织中分泌型IgA的应答。
[0081] 本申请的方法部分基于使用重组多聚Ig受体（plgR)在结合分析中以高灵敏度和 高特异性检测dlgA或IgM的能力。本申请的方法采用结合dlgA和IgM的重组pIgR或pIgR的重组变体，以及优先结合dlgA并且基本上不能结合IgM的重组plgR或plgR的变体。 [0082] 相应地，本申请说明书提供了抗体-捕获方法，其包括检测或捕获分泌性 dlgA(SIgA)的前提物，即dlgA。一些实施方案中，所述方法包括步骤（i)使来自受试者的 生物样品与重组多聚免疫球蛋白（Ig)受体或其dlgA-结合变体接触，其中所述plgR或变 体结合dlgA和IgM;或其中所述plgR或变体结合dlgA且基本上不能结合IgM，并且其中所 述plgR基本上不结合单体IgA，和步骤（ii)确定已经结合至plgR的dlgA的水平或存在。 一些实施方案中，步骤（ii)包括检测dlgA和plgR间的复合物或结合的dlgA和抗原间的 复合物。
[0083] 本文中提到的"生物样品"包括从受试者中获得的包含抗体的样品。该术语也包 括包含表达dlgA的细胞如杂交瘤细胞的样品，和包含从体外培养的细胞株中所表达的重 组dlgA的样品。来自受试者的生物样品包括血液和血清样品、其它体液、活组织标本等等。 优选血液和血清样品。提到的"抗原"包括蛋白质或传染原或蛋白质的部分或传染原的部 分，正如本领域所公知的。提到的"R/HpIgR"包括包含来自兔plgA序列或者来源于大鼠或 小鼠的类似dlgA-结合变体序列或其功能性（dlgA-结合）变体的免疫球蛋白结构域的嵌 合形式。因此，R包括源于兔、或小鼠、或大鼠的序列。
[0084] 可通过任何便利的方案确定dlgA或plgR或者dlgA和重组plgR间的复合物或者 重组dlgA和抗原间的复合物的存在或水平。
[0085] 多种多样的试验用于研宄、分析、开发并且临床上检测感兴趣的分析物。免疫测定 法是一种特别有用的分析形式，其利用抗体_抗原类型或蛋白质-蛋白质反应的特异性、强 度和多样性来分析样品并检测其中的特异性组分。多种免疫测定技术是可用的，如在wild D."TheImmunoassayHandbook^ 免疫测定手册）"自然出版集团（NaturePublishing Group), 2001.中所描述的那些。
[0086] 检测抗体复合物、抗原或抗体_配体复合物的方法为本领域所熟知。例如，酶联 免疫吸附法（ELISA)和放射免疫分析法（RIA)常规使用于实验室中。这些方法一般要求 一些实验室技术的技能水平。也已经开发出需要极少的技能并能快速进行的多种方法，其 因此适合于床旁护理或分析中检测针对特异性抗原的抗体。特别地，免疫层析或量油尺 (dipstick)酶联免疫吸附测定试剂盒已经开发用以分析多种传染原。
[0087] 特别考虑免疫层析设备，其包含如重组plgR的dlgA-结合试剂，并且还包含感兴 趣的抗原，如文中所描述的已鉴定为结合来自感染受试者或呈现黏膜免疫激活的受试者的dIgA〇
[0088] 试剂盒或免疫层析设备包括，例如，反向流动或侧向流动模式。
[0089] 在示例性的实施方案中，提供了用于评估来自受试者的生物样品的免疫状态的试 剂盒，其采用一种或多种感兴趣的抗原，后者由来自患有活动性感染或与黏膜免疫激活有 关的病症的受试者的dlgA所识别，并且采用plgR分子或其dlgA-结合变体作为dlgA-结 合试剂。一个优选的实施方案中，所述抗原不是TB抗原。
[0090] 一些实施方案中，所述试剂盒包括：
[0091] a)免疫图形设备，其包含可操作地连接到样品部分、测试部分和任选的对照部分 的多孔膜；并且还包含吸管部分、包含PlgR分子或其dlgA-结合变体的部分、包含感兴趣的 抗原或试剂的部分以及任选的偶联部分；和
[0092] b)用于使用所述免疫图形设备以检测样品中抗原特异性dlgA抗体存在的说明 书。
[0093] -个实施方案中，所述plgR或其dlgA-结合变体为HpIgR或R/HpIgR或其dlgA 结合变体。
[0094] 本申请的分析法可采用本领域已知的多种适合的检测标志物。一些实施方案中， 可利用检测标志物的可检测特性来检测所述检测标志物，并且利用可检测标志物的多种检 测方案为本领域普通技术人员所熟知的。一些实施方案中，所述检测标志物直接地或间接 地结合或以其他方式与感兴趣的抗原或传染原关联。其它实施方案中，dlgA结合试剂，如 plgA包含或被设计为与检测标志物相互作用。一些实施方案中，使用本领域已知的结合伴 侣诸如但不限于生物素：亲和素或者抗-生物素抗体：生物素，将检测标志物连接至抗原或 dlgA结合试剂。
[0095] 多聚免疫球蛋白受体（plgR)由PIGR基因编码并在黏膜上皮细胞中表达，在那里 它促进dlgA的摄取和SIgA的分泌。plgR有五个结合至dlgA(包括结合至其J链）的免疫 球蛋白样结构域，包括其J-链。plgR还结合五聚IgM。
[0096] 如本文中所确定的，使用重组人类多聚Ig受体和其部分和变体，以高灵敏度和高 特异性检测dlgA和IgM是可能的（参见图3)。一个特别的非限制性的实施方案中，显示利 用重组形式的多聚Ig受体，dlgA能被选择性地检测，所述重组形式的多聚Ig受体具有来 源于兔plgR的至少结构域1，例如，兔（结构域1)和人类（结构域2_5)pIgRs的嵌合体，或 具有来自兔PlgR的所有结构域的嵌合体。一些实施方案中，本文描述的重组PlgR被设计 为优先结合dIgA(±IgMIgM)，以及能够用于特异性地捕获dlgA(IgM)到固相上用于与感 兴趣的抗原反应（在这种情况下，所述PlgR不需要有相关的检测试剂），或可选择地用于检 测结合到固定在固相上的感兴趣的抗原的dIgA(±IgM)的存在，在这种情况下，可以利用 本领域熟知的方法，使用抗体或针对PIgR本身、或针对表位标签或引入到所述重组PIgR中 的其它位点的其它试剂可方便地检测所述PlgR。PlgR的另外优势是它在分析中显示非常 低的背景反应，与典型的基于抗体的检测试剂不同。
[0097] Roeetat,JImmunol162:6046-52, 1999描述了包含来源于兔的免疫球蛋白样 结构域1 0)1)和来源于优先结合dlgA超过IgM的人类plgR的D2-5的嵌合体plgR。然而， 他们没有公开或提示这种形式或任何其它PlgR变体用于检测或结合仅dlgA用于诊断目的 的用途或本文公开的重组plgR或dlgA结合变体的优势。用兔（大鼠或小鼠）D1取代人D1 提供了对dlgA的优先结合，但是也可以预期，D2-D5的任何一种或多种也可用兔序列代替 以产生优先结合dlgA的分子并且这些变体也包含在内。相应地，一些实施方案中，D1、D2、 D3、D4或D5中的任何一种或多种用兔、小鼠或大鼠的同系物替代。
[0098] -些实施方案中，所述重组plgR缺少跨膜结构域（ATM)。其它实施方案中，所 述重组plgR缺少胞浆结构域。一些实施方案中，所述重组plgR缺少TM结构域和胞浆结构 域（ACYT)。一些实施方案中，重组plgR包含在胞浆结构域的取代并提供了⑶4胞浆结构 域。考虑重组PlgR的多种形式，以及示例性的实施例在图4-7中被阐明，并在【附图说明】中 进一步描述。设计和测试具有理想水平的特异性dlgA的重组plgR的能力在图8中被图示 并在对图8的说明中进行了描述。
[0099] Phillips-Quagliataetal,JImmunol165:2544-2555, 2000 表明大鼠和小鼠都 主要地结合dlgA，但是对于小鼠而言存在一种在B细胞上表达的形式，其仅有单个氨基酸 的变化但是结合IgM和dlgA两者-以下引用自第2552页：
[0100] 尽管人类PlgR和T560小鼠plgR结合plgA和IgM，但是兔（44)和大鼠（47)肝细 胞PlgR仅很好地结合plgA并且不传送IgM到胆汁中。因为小鼠肝脏同样地传送plgA但 是不传送IgM到胆汁中（48, 49)，一般地假设小鼠肝细胞plgR类似于大鼠和兔plgR，很弱 地或者一点都不结合IgM。如果这是真的话，那么必须要解释小鼠肝细胞和T560pIgR之间 的不同，使得后者表现的更像人类PlgR。考虑到小鼠肝细胞和T560B细胞plgRs的氨基酸 序列是相同的，除了结构域2中Val到Ala的变化，上述不同最可能体现了plgR的有差别 的折叠或糖基化，很可能是后者。很容易想到的是，来自肝细胞的PlgR上大体积碳水化合 物能干扰IgM但是不干扰IgA的结合。此外，已经表明的是，与天然SC本身相比，人类SC 的去糖基化允许它以10倍高的效率抑制生物素化的天然SC结合pIgA，这表明人类pIgR的 一些碳水化合物部分实际上甚至可阻碍PlgA的结合。
[0101] 因此，在一些实施方案中，包括R/HpIgR的所述重组plgR的去糖基化变体用于提 高对dlgA的亲和力。一些实施方案中，这可通过在本领域已知的多糖缺陷细胞株诸如，例 如，多糖缺陷CH0细胞株中表达所述plgR来实现。
[0102] 在多个实施方案中，重组plgR包含跨膜结构域的缺失（ATM)，以允许重组蛋白 的便利分泌和作为诊断/预后/筛选试剂的易用性。
[0103] -些实施方案中，重组plgR包含异源检测结构域。
[0104] 多个检测结构域为本领域已知并且包含在本申请中。
[0105] -些实施方案中，重组plgR包含异源结合结构域。
[0106] 多个结合结构域为本领域已知并且包含在本申请中。
[0107] 其它实施方案中，所述重组PlgR结合到固体支持物。固体支持物包括板、孔、珠、 琼脂糖颗粒、硝化纤维条等等。
[0108] 一些实施方案中，重组PlgR产生于多糖缺陷细胞，如多糖缺陷CH0细胞中用以提 高相对于IgM对dlgA的优先结合。
[0109] -些实施方案中，重组plgR来源于灵长类如人类plgR并且包含至少一种来源于 非-灵长类如兔、小鼠、大鼠的免疫球蛋白样结构域。
[0110] 一些实施方案中，重组plgR包含在SEQIDN0:2,或SEQIDN0:4,或SEQIDN0:6， 或SEQIDNO: 12,或SEQIDNO: 14,或SEQIDNO: 16中所列的氨基酸序列，或其dlgA结合 部分或/和其dlgA结合变体。示例性变体包含与SEQIDNO: 2, 4, 6, 12, 14或16或其缺失 胞浆结构域的缺失变体中的一个至少70%的氨基酸序列同一性。
[0111] 变体包括缺失，取代和插入变体。本文示例的是一个或多个免疫球蛋白 结构域⑶发生变化的人源plgR。变体包括"部分"，其包括包含参考序列的约 50% ,60% ,70% ,80% ,85% ,90% ,95%的片段。来自低级哺乳动物如大鼠、小鼠或兔的 结构域的等同结构域取代。
[0112] 还考虑所列举的氨基酸序列的"变体"。变体分子被设计为保留修饰前的重组plgR 的dlgA结合功能活性或显示提高的活性。根据本发明的多肽变体可理性地，或通过已建立 的突变方法来鉴定（参见，例如，Watson,J.D.etal,"MolecularBiologyoftheGene", 第四版，Benjamin/Cummings,MenloPark,California, 1987)。随机突变方法不需要关于 待被突变的序列的先验信息。该方法具有以下优势：它评估基于它的功能的特定突变的有 利条件，因此不需要理解如何或为何产生的突变蛋白质采用特定的构象。事实上，目标基 因序列的随机突变已经是一种用于获得具有理想特性的突变蛋白的途径（Leatherbarrow R.，J.Prot.Eng.，7:7-16，1986;KnowlesJ.R.，Science，25:1252-1258，1987;Shaw W.V.，Biochem.J.，246: 1-17, 1987;GeritJ.A.，Chem.Rev.，#7: 1079-1105, 1987) 〇 可选择地，想得到特定的序列变异，可以采用定点突变基因的方法。因此，这样 的方法可以用来选择性地仅改变所述蛋白质中被认为重要的那些氨基酸（Craik C.S.，Science，228:29-297, 1985;Croninetal，Biochem.，27:4572-4579, 1988;Wilkset al，Science，22:1541-1544, 1988)。示例性的氨基酸影响所述重组plgR的糖基化。来自理 性地或已确立的突变方法或来自组合化学的多肽可以包含保守的氨基酸取代。本领域很好 理解的是，一些氨基酸可改变为有广泛相似特性的其它氨基酸，而不改变所述多肽的活性 特征（保守取代，参见表3)。
[0113] 变体plgR多肽包含与至少在免疫球蛋白样结构域区域的氨基酸序列至少50%的 序列同一性。
[0114] 如本文中所使用的术语"序列同一性"是指对比窗口上，在氨基酸对氨基酸的基 础上序列相同或功能上或结构上相似的程度。因此，"序列同一性百分比"的计算例如通过 比较对比窗口上的两个最佳对齐的序列，确定两个序列上出现相同的氨基酸残基（例如， Ala,Pro,Ser,Thr,Gly,Val,Leu,He,Phe,Tyr,Trp,Lys,Arg,His,Asp,Glu,Asn,Gin,Cys和 Met)的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以对比窗口中位置的总数 目（即，窗口的大小），并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。出于本发明的目 的，"序列同一性"将被理解为表示通过DNASIS计算机程序（Version2. 5ForWindows;可 以从位于美国加利福尼亚州南旧金山的Hitachi软件工程有限公司获得）并用在软件所附 的参考手册中所使用的标准缺省值所计算出的"匹配百分比"。类似的注解可用于序列相似 性中，其视为相同的、取代包括保守性取代。
[0115] 优选地，特定序列和参考序列（核苷酸或氨基酸）之间的相似性百分比为至少约 60 %或至少约70%或至少约80 %或至少约90 %或至少约95 %或以上，诸如至少约96%， 97%，98%，99%或更高。还考虑60%和100%之间的相似性或同一性百分比，如60,61，62， 63, 64, 65,66,67,68,69,70, 71，72, 73,74, 75,76,77,78,79, 80,81，82,83,84, 85,86,87， 88,89,90,91，92,93,94,95,96,97,98,99 或 100%。
[0116] 另一个实施方案中提供了由SEQIDN0:1，SEQIDN0:3,SEQIDN0:5,SEQID NO: 11，SEQIDNO: 13或SEQIDNO: 15中所列的核苷酸序列编码的重组plgR，或其dlgA-结 合且任选地IgM-非结合变体，与其具有至少60%核苷酸序列同一性，或与缺乏胞浆结构域 的其缺失变体具有至少60%的核苷酸序列同一性。
[0117] 在一些便利的实施方案中，重组plgR为包含至少一个来源于兔的免疫球蛋白样 结构域的人重组plgR变体。
[0118] 一些实施方案中，采用结合plgM和dlgA的（人）plgR。一些实施方案中，使用已 知的方案耗尽IgG和/或IgM，并且，如果IgM被耗尽，那么人plgR对于样品剩余物质中的 dlgA是选择性的。一些实施方案中，为了许多感染的诊断，优选检测dlgA和plgM两者-确 实文献中报道了IgA加IgM用于戊型肝炎的诊断，并且如本文所阐明的，存在一些样品用于 甲型肝炎或戊型肝炎的诊断，其中IgM或dlgA更强烈，这提示它们的组合检测是有用的。 然而这可使用，例如，抗-IgM和R/HpIgR的混合物来实现，可用HpIgR和R/HpIgR的混合物 (所以IgM不能竞争过dlgA)更便利地实现，或如果存在的HpIgR过量地超过IgM和dlgA 的总和，单独用HpIgR实现。提议使用相同试剂的两种变体是优选的 ，而不是一种抗体加一 种重组蛋白。特别地，PlgR比抗体有更好的热稳定，这是用于测试产品的优势。
[0119] 重组plgR的用途也是高度地有利的，尤其是因为该试剂在结合分析中表现了低 背景（与基于抗体的试剂相比至少低50%的背景），不同于大多数基于抗体的结合试剂。另 外，重组plgR表现出高的热稳定性。例如，冻干的重组plgR在重构前三周后于60°C下保留 50%活性并且45°C下100%的活性，其与同样条件下干燥的抗-IgM抗体活性的快速丧失形 成了有利的对比。
[0120] 在实施方案中，如果基本上只有dlgA(或IgM)待被检测，可采用重组人类plgR或 dlgA和IgM结合变体作为结合试剂，但是特异性地检测结合的dlgA(dlgAl或dIgA2)使用 抗_IgAl/IgA2来实现，在本实施方案中，IgM的存在不是问题。
[0121] 一些实施方案中，上述方法供在评估黏膜表面或相关的组织的病症或感染或对其 免疫的方法中使用。特异的抗原的示例性应用在包含附图10-22的附图和【附图说明】中描 述，并且本文中特别确考虑这些一般方案，以及对其的常规变异。
[0122] 示例性黏膜表面包括上下呼吸道、肠道和肠道相关的淋巴组织、生殖道和肝脏。
[0123] 示例性感染包括但不限于由细菌、病毒、寄生虫和其它传染性生物体介导的那些 感染。在某些实施方案中，传染原包括HIV、麻风病、梅毒、肝炎（例如，册￥、祖￥、11〇0、登革 病毒、麻瘆、风瘆等。
[0124] 示例性病症包括器官疾病，如呼吸道、肺、肠道、生殖道和肝脏。肠道病症包括溃疡 性结肠炎、克罗恩氏病、肠易激综合症、肠漏综合征等。
[0125] 所提到的"受试者"包括人类和多种哺乳动物或其它动物，包括野生的和饲养的动 物、宠物、昆虫和潜在的用于新发传染病的传播媒介。关于受试者，这些受试者可能患有感 染，它们可能已经暴露于感染或它们已经暴露于传染原。
[0126] -个实施方案中，图10为用于检测如人血清或血浆的样品中抗原_特异性dlgA 存在的一个优选实验方法的示意。重组R/HpIgR-cyto固定在ELISA板上，并与血清或其它 样品孵育。将二聚体IgA捕获在固相上，并洗涤后去掉其它样品组分（如没有被捕获的IgA 和IgG，左），通过抗原的连续加入检测抗原-特异性dlgA的存在，所述抗原是例如生物素 化的，或与针对抗原的生物素化的单克隆抗体以及链霉亲和素-HRP反应。通过这种方式， 通过与抗原-特异性dlgA反应固定的的任何抗原通过生物素-链霉亲和素相互作用或同 等的试剂产生信号。
[0127] 一个实施方案中，图11为用于检测血清中甲型肝炎病毒-特异性dlgA存在的一 个优选实验方法的示意图（右），与使用标准抗-IgM捕获的方法检测HAV-特异性IgM相比 (左）。
[0128] 一个实施方案中，图16为用于抗原-特异性dlgA(或IgM)的检测的第二优选方 法的示意图，其中抗原直接包被到ELISA板上（在该例中，戊型肝炎病毒（HEV)抗原）。将 血清样品施加于所述板上并且抗原-特异性抗体，包括IgM和dlgA，结合到所述抗原，然后 用抗-IgMHRP，或R/HpIgR和抗-人类SCHRP检测。最终洗涤后，用TMB底物或同等试剂 使信号产生。
[0129] 另一个实施方案中，图23提供了概括急性人类免疫缺陷（HIV)感染的致病结果的 模型，其引起肠道以及所述外周快速的CD4消耗，与肠道屏障功能的随后下降，肠道内容物 的渗漏和微生物易位的增加，引起免疫激活的增加，其促使发病和CD4T-细胞水平的进一 步下降（Brenchleyetal,NatMed12:. 1365-1371，2006)。对以下存在未满足的需求：用 于能够检测发病途径中这些步骤的一步或多步的简单标准化试验，以便对患者提供适当的 干预，只有⑶4测试法已经整合到用于HIV-感染患者的治疗标准中。检测肠道中⑶4的消 耗需要内窥镜检查；检测降低的肠道屏障功能需要复杂的糖应激研宄或其它方法；检测肠 道渗漏和微生物易位可以使用如血清中细菌LPS或16sRNA的标记物实现，但是结果是高度 变异可变的，部分由于个体之间肠道菌群的广泛变异性；免疫激活需要复杂的流式细胞方 案，这使仪器/操作者标准化是困难的。
[0130] 图24提供了与非病原SIV感染的正常低水平移位相比，由病原HIV或SIV感染诱 导的肠道渗漏的导致微生物易位增加的示意图。
[0131] 图25阐明了一个预期的微生物易位增加的后果为由于黏膜抗原暴露导致的IgA 应答增加的诱发。Frenchetal，JInfectDis. 200(B): 1212-1215, 2009 证实了随访 6 年 后HIV患者中IgA的总水平确实与经历高效抗逆转录病毒治疗的患者的CD4T-细胞的水平 呈负相关，这表明即使在用目前最有效的抗病毒治疗的患者中，微生物易位有助于发病。然 而这些结果也说明总IgA在个体之间是高度可变的，并且不提供可以用在各个患者的管理 中的预后标志物。
[0132] 图26提供了与非病原SIV感染的正常低水平移位相比，由病原HIV或SIV感染 诱导的肠道渗漏导致的微生物易位增加的示意图，表明血浆部分中的二聚体IgA和分泌型 IgA水平的预期效果。在正常条件或非病原HIV感染下，维持了肠道屏障完整性，并且肠道 内腔SIgA的水平反应了固有层中它的前体物dlgA的量。只有极少量SIgA返回到血浆部 分，通过肠道M-细胞的主动运输，或少量的肠道渗漏。渗漏或主动运输的量可以通过将SIg A的血清/血浆浓度与它前体物dlgA的血清/血浆浓度进行比较，产生SIgA/dIgA的比值 来估算。在致病HIV或SIV感染，或其它导致肠道渗漏的生理应激的条件下，dlgA的总量 可能会稍微升高并且可引起较高水平的SIgA分泌到内腔。然而，由于通过受损肠道屏障的 被动渗漏，高得多比例的SIgA返回到血浆部分，导致升高的SIgA/dIgA比值。
[0133] 另一个实施方案中，本说明书提供了用于评估肠壁完整性的方法。一些实施方案 中，和本文所讨论的，该评估提供了用于HIV感染患者的预后标志物。一些实施方案中，所 述方法包括确定来自人类受试者的样品中SIgA和dlgA相对水平或比值。一些实施方案中， 所述方法包括步骤（i)使生物样品与重组多聚免疫球蛋白（Ig)受体（plgR)或其dlgA-结 合变体接触，其中所述plgR或变体结合dlgA和IgM;或其中所述plgR或变体结合dlgA并 且基本上不能结合IgM，以及其中所述plgR基本上不结合单体IgA或分泌型IgA，和步骤 (ii)确定已经结合到plgR的dlgA的水平或存在。一些实施方案中，步骤（ii)包括检测 dlgA和plgR之间的复合物，或结合的dlgA和基本上如本文所描述的抗原之间的复合物。 该实施方案的另一种表示中，本说明书考虑了确定用于评估HIV感染受试者的dlgA/SIgA 比值的方法。
[0134] 正常地，血浆中仅发现微量的分泌型IgA(SIgA)，但是在肠道屏障完整性受损的患 者中，本文提出的是，大部分SIgA渗过所述肠道屏障并且进入血浆。各个患者之间正常浓 度的SIgA不同，因为患者有广泛变化的SIgA前体物dlgA的水平。因此，同时测定dlgA和 SIgA两者的浓度，各个患者中SIgA与dlgA的比值提供肠道完整性/渗漏的测定是有用的。
[0135] 图27提供了能够用来测定不同IgA形式的相对含量以此估算SIgA/dIgA的比值 的几种典型分析中一个的示意图。在该实例中，通过使用R/HpIgR捕获dlgA来测定dlgA 的量，并使用针对IgAl、或IgA2,或针对这两种IgA亚类的单克隆抗体来检测。单体IgA不 结合plgR;SIgA结合R/HpIgR但是相比dlgA有较低的亲和力，并且如果需要，能通过3. 5M 尿素的洗涤去除。以同样的方式测定SIgA，但是使用抗-SC抗体捕获代替R/HpIgR。然后 将SIgA/dIgA比值计算为SIgA和dlgA分析反应的简单比值。
[0136] 如本实例所示，与患者血浆中dlgA相比，一部分感染有HIV的患者呈现升高的 SIgA的水平，与这些患者中升高的免疫激活标志物一致。另外的实施方案中，肠道渗漏能 通过检验个体1 84同种型来确定，因为1§42((11§42,51§42)代表约50%的产生于肠粘膜的 IgA，但是仅约10%的其它组织的IgA，从而SIgA2与dIgA2的比值很可能在个体患者中提 供非常敏感的肠道渗漏的测量。
[0137] 因此，在一些实施方案中，上述方法包括测定SIgA2和dIgA2的水平，并且确定 SIgA2与dIgA2的比值，其中相对于对照，所述比值指示肠道渗漏存在或不存在或肠道渗漏 程度。一些实施方案中，该比值提供了用于HIV感染的患者的标志物，从而潜在地便于改进 受试者HIV感染的管理。这些分析是简单的，并且具有用于高通量的潜能作为用于整合入 定量的床旁检测设备的潜力。
[0138] 因为plgR和dlgA间的反应不仅在哺乳类动物间而且在所有脊椎物种间高度地保 守，提出的是，该方法具有用于检测dlgA，以及IgM的功用，当需要时，在多种不同物种中， 提供便利的和通用的试剂用于检测如蝙蝠和其它野生的或饲养的动物物种中免疫激活或 dlgA和/或IgM的应答，对于它们而言，可能没有可用的抗-免疫球蛋白试剂。该方法在诊 断饲养动物中农业感兴趣的疾病中是有用的，以及对于新发传染病，用于诊断疾病和检测 储存宿主。
[0139] 本发明提供了plgR的重组表达形式和dlgA(±IgM)间的特异性相互作用的应用， 允许PlgR用于特异性结合或检测固相表面的dIgA(±IgM)或其它理想的分析组分。
[0140] 一个实施方案中，本文所描述的方法和/或如本文所描述的重组plgR或其变体被 许可供在抗原筛选或抗体选择和纯化中使用。
[0141] 根据本文所述的诊断或预后测试的结果，考虑治疗方案。
[0142] 一些实施方案中，方法还包括：（i)使用本文所描述的方法产生数据；(b)将所述 数据转化为计算机-可读形式；并且（C)操作计算机执行一种算法，其中所述算法确定作计 算机-可读数据和指示疾病或病症诊断的数据之间的拟合接近度。一些实施方案中，所述 算法包含人工智能程序，如模糊逻辑，聚类分析或神经网络。本申请方法也可用在病理平台 的管理中的个体化或群体的医药途径中。
[0143] 本公开内容提供了计算机程序和硬件，用于诊断一旦感染的受试者，随着时间的 过去或对治疗或其它影响物的应答。数值分配到复合层，其存储于机器可读存储介质中。计 算机程序产品为一种如下的产品：能够转化这样的数值为编码并且存储所述编码到计算机 可读介质中，并且任选地能够评估所述存储数据和输入数据之间的关系，并且任选地评估 潜在的TB状态和/或肺炎的知识数据库。
[0144] 因此本说明书提供了基于Web的系统，其中复合层上的数据由客户端提供到中心 服务器，其分析并与对照相比较并且任选地考虑其它信息如患者年龄、性别、体重和其它医 疗病患，并且从而提供诊断报告。
[0145] 因此分析可以以试剂盒的形式或基于计算机的系统，其包含需要的试剂以形成并 检测本文中所描述的抗体复合物，以及包含计算机硬件和/或包括算法的软件以促进报告 的确定和传送给临床医生。
[0146] 本发明考虑允许使用者确定关于TB受试者状态的方法，所述方法包括：
[0147] (a)通过通信网络从使用者处接受来自如本文所描述的方法的实施的数据；
[0148] (b)通过多变量分析处理受试者数据以提供诊断指标值；
[0149] (c)根据所述指标值与预定值的比较确定所述受试者的状态；并且
[0150] (d)通过所述通信网络将所述受试者状态的指示传送给使用者。
[0151] 便利地，所述方法一般还包括：
[0152] (a)使使用者使用远端站确定数据；并且
[0153] (b)通过通信网络将数据从所述终端站传送到基站。
[0154] 如本文中所用的，当提及抗原-结合分子时，术语"特异地结合"等类似术语指以 下结合反应：在异源蛋白群体和其它生物制剂存在下确定抗原存在的结合反应。因此，在 指定的免疫试验的条件下，指明的抗原_结合分子结合特定的抗原并且不大量结合样品中 存在的其它蛋白或抗原。在这样的条件下，与抗原的特异性结合可能需要基于其对特定的 抗原的特异性而选择的抗原-结合分子。例如，可以产生对于选定的蛋白抗原的抗原-结 合分子，其结合选定的蛋白抗原但是不结合样品中存在的其它蛋白质。可以利用多种免 疫分析模式来选择与特定蛋白特异性地免疫-相互作用的抗原-结合分子。例如，固相 ELISA免疫试验常规地用于选择与蛋白质特异性地免疫-相互作用的单克隆抗体。对于能 被用来确定特异的免疫反应的免疫分析模式和条件的说明，参见HarlowandLane(1988) Antibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPublications，NewYork〇
[0155]例如，特异性的识别由一抗（多克隆或单克隆的）提供并且二级检测系统用来检 测所述一抗的存在（或结合）。可检测的标签能偶联到二抗上，如荧光标签，放射标签，或产 生可量化的产物，例如有色产物的酶（例如，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶）。另一合适的方 法中，一抗本身能被可检测地标记。例如，蛋白质-特异性单克隆抗体，既能被用作免疫吸 附剂，又能作为酶标探针以检测和定量本申请方法或试剂盒中所形成的复合物。
[0156] 样品中存在的这样蛋白质的量能通过利用线性回归计算机算法参考标准或参考 制剂中存在的量来计算（参见Lacobillietal, (1988)BreastCancerResearchand Treatment11:19-30)。其它实施方案中，采用对感兴趣的蛋白质的两种不同的单克隆抗 体，一种作为免疫吸附剂和另一种作为酶标探针。
[0157] 实施例中所示例的分析以ELISA模式完成，每孔有单个抗原，每一单抗体形式或 种类或同种型。然而存在它们能合并为单一分析的熟知的方法，例如使用Liminx珠或类似 的方法，其中多种单独抗原包被在珠子上，其具有能用仪器辨别的不同的荧光标记强度，并 且每个珠子上结合抗原的抗体的量能分别地从所述单个样品中测定。相似地，Luminex珠 能包被有抗体或其它试剂以捕获来自样品的单独抗体形式或同种型，然后加入标记的一个 或多个抗原并且评估不同的同种型反应。这能在微阵列或其它阵列中完成。已确立有用的 ELISA参数后，将这些结果传送到多重模式中是常规的。在横向流和其它床旁检测设备中， 如果样品流经膜，很容易得到分离的抗原，其呈现在膜上为分开的条带或点，然后共同检测 一种或多种同种型的抗体；或者得到用于所述抗体同种型的不同的捕获抗体，然后检测结 合到每个固定的抗体条带或点上的（标记的）抗原。后者的方法（同种型捕获，通过固定 的患者抗体结合的标签抗原的检测）为最优选的方法。
[0158] 此外，蛋白质捕获阵列领域的最新发展允许大量蛋白质的同时检测和/或定量。 例如，过滤膜上的低密度蛋白质阵列，如通用的蛋白质阵列系统（Ge(2000)NucleicAcids Res. 28(2) :e3)使用标准的ELISA技术和扫描电荷耦合装置（CCD)检测器允许成像阵列的 抗原。还已经发展了免疫-传感器阵列，其实现了临床分析物的同时检测。目前使用蛋白 质阵列，用以表征体液中，如健康或疾病受试者、以及药物治疗前后的受试者的血清中蛋白 质的表达是可能的。
[0159] 蛋白质捕获阵列通常包括多个蛋白质捕获试剂，每个捕获试剂界定了所述阵列 的空间上不同的特征。蛋白质捕获试剂可以为任何分子或分子复合物，其有结合蛋白质 的能力并且使它固定到阵列上的蛋白质捕获试剂的位点上。所述蛋白质捕获试剂可为 蛋白质，在细胞中其天然功能为特异性地结合另一蛋白质，如抗体或受体。可选地，所述 蛋白质捕获试剂可代替为部分地或完全地合成的或重组的蛋白质，其特异性地结合蛋白 质。可选地，所述蛋白质捕获试剂可为蛋白质，其通过对特异的蛋白质或靶肽的结合亲和 力已经从诱变处理的、随机化的、或完全随机的和合成的库中体外筛选出来。所使用的筛 选方法可任选地为展示方法，如本领域已知的，如核糖体展示技术或噬菌体展示技术。可 选地，通过体外筛选获得的蛋白质捕获试剂可为特异性地结合蛋白靶标的DNA或RNA适体 (参见，例如，Potyrailoetal.，（1998)Anal.Chem.70:3419_3425;Cohenetal.(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:14272-14277 ；Fukuda,etal. (1997)NucleicAcidsSymp. S er. 37:237-238;availablefromSomaLogic)。例如，适体通过Selex?方法选自寡核昔酸 库，并且它们与蛋白质的相互作用能通过共价结合提高，凭借溴化脱氧尿苷和UV-激活交 联的合并（photoaptamers)。适体具有通过自动化寡核苷酸合成的简便生产性以及DNA的 稳定性和强健性的优势。通用荧光蛋白染色能用来检测结合。可选地，所述体外筛选的蛋 白质捕获试剂可为多肽（例如，抗原）（参见，例如1?<^61^8 3]1(15208丨31^(1997)?1'0〇.似1：1. AcadSci.USA94:12297-12302)。
[0160] 捕获分子阵列的可替代选择通过"分子印迹"技术产生，其中肽类（例如，来 自蛋白质的C-端区）用作模板使在可聚合的矩阵上产生结构互补、序列-特异的腔； 所述腔然后能特异性地捕获含有适当的一级氨基酸序列的（变性）蛋白质（例如可从ProteinPrint?andAspiraBiosystems处或获得）。
[0161]例示性蛋白质捕获阵列包括包含空间地寻址的TB抗原或抗体结合试剂的阵列， 其能便于众多抗原和抗体的大量的平行分析。这样的阵列已经显示具有所要求的特异性 和可接受的背景的特性，并且一些可商业购买（例如，BDBiosciences,Clontech,BioRad andSigma)。用于制备阵列的多种方法已经被报道（参见，例如Lopezetal. (2003) J.Chromatogr.B787:19-27 ；Cahi11(2000)TrendsinBiotechnology7:47-51 ；U.S.Pat. App.Pub. 2002/0055186 ;U.S.Pat.App.Pub. 2003/0003599;PCT公开TO03/062444;PCT公 开TO03/077851;PCT公开W0 02/59601;PCT公开W0 02/39120;PCT公开W0 01/79849; PCT公开TO99/39210)。
[0162] 免疫球蛋白抗原-结合分子通过传统免疫法（例如，多克隆血清和杂交瘤）制备， 或者从噬菌体展示技术或核糖体展示文库库中筛选后，作为重组片段，通常表达于大肠杆 菌中（可从CambridgeAntibodyTechnology,Biolnvent,AffitechandBiosite获得）。 可选地，包含VH和VL结构域的非-共价结合的'组合抗体（combibodies) '，能从产生双体 细菌克隆（例如，可从Domantis获得）的组合所建立的矩阵模式中产生。作为蛋白质-捕 获试剂使用的例示性抗原-结合分子包括单克隆抗体，多克隆抗体，Fv，Fab，Fab'和F(ab'）^ 免疫球蛋白片段，合成的稳定的Fv片段，例如，单链Fv片段（scFv)，二硫键稳定的Fv片段 (dsFv)，单可变区结构域（dAbs)微抗，组合抗体和多价抗体如双体和多-scFv，来自骆蛇科 或改造的人类等同物的单域抗体。
[0163] 单独的空间上不同的蛋白质捕获试剂通常附在支持物表面，其一般为平面的或波 状外形的。常见的物理支持物包括载玻片，硅，微孔，硝化纤维或PVDF膜，以及磁珠和其它 磁珠。
[0164] 当递送到平面表面的蛋白质微滴被广泛地应用时，相关的可替代结构包括基于微 流体发展的CD离心设备（可从Gyros购买）和专业的芯片设计，如板中设计的微通道（The LivingChip?,可从Biotrove处购买）和娃表面的微小3D柱（例如，可从Zyomyx购买）。
[0165] 悬浮颗粒也能用作阵列的基础，如果它们被编码用于识别的话；系统包括用于微 珠的彩色编码（例如，可从Luminex,Bio-Rad和NanomicsBiosystems购买）和半导体纳 米晶体（例如，QDots?,可从QuantumDots处购买），以及珠条形码（UltraPlex?,可从 Smartbeads购买）和多金属微棒（Nanobarcodes?颗粒，可从Surromed处购买）。珠子也 能被装配到半导体芯片（例如，可从LEAPStechnologyandBioArraySolutions购买） 的平面阵列上。如果使用颗粒，单独的蛋白质捕获试剂通常附在单独颗粒上以提供阵列的 空间分辨率或分离。然后可分别地分析颗粒，但是用并行的分隔的方式，例如在微量滴定板 的孔或分开的试管中。
[0166] 在操作中，在适合蛋白质或肽结合的条件下，将蛋白质样品（参见，例如U.S.Pat. App.Pub. 2002/0055186)递送到蛋白质-捕获阵列上，并且洗涤所述阵列，以从所述阵列上 去除未结合的或非特异结合的样品中的组分。其次，结合至阵列的每个特征的蛋白质或肽 的存在或量使用适当的检测系统来检测。相对于结合所述阵列的第二特征的第二蛋白质的 量，可确定结合所述阵列的特征的蛋白质的量。某些实施方案中，样品中第二种或随后的蛋 白质的量为已经已知的或已知不变的。
[0167] 一个说明性实例中，荧光标记能用于检测结合至阵列的蛋白质。阅读DNA微阵列 中所使用的相同仪器方法对蛋白质捕获试验是可用的。对于差别显示，捕获阵列（例如， 抗体阵列）能用荧光标记蛋白形式探测或用不同的荧光团（例如，Cy-3和Cy-5)标记并且 混合，这样所述颜色充当了靶丰度变化的读出器。荧光读出敏感性能通过酪胺信号放大术 (TSA)(例如，可从PerkinElmerLifesciences购买）扩增10-100倍。平面波导技术（例 如，可从Zeptosens购买）实现超灵敏的荧光检测，具有无冲洗程序的额外优势。高灵敏性 也能通过悬浮珠和颗粒来实现，利用藻红蛋白（可从Luminex购买）作为标记或半导体纳 米晶体（可从QuantumDot购买）的性能。荧光能量共振转移已经适应于检测未标记配体 的结合，其在阵列上是有用的（例如，可从Affibody购买）。已经发展了一些可选的读出 器，包括适配的表面等离子体共振（例如，可从HTSBiosystems和IntrinsicBioprobes 购买），滚环DNA扩增（可从MolecularStaging购买），质谱分析法（例如，可从Sense Proteomic,Ciphergen,Intrinsic和Bioprobes购买），共振光散射（例如，可从Genicon Sciences购买）和原子力显微技术（例如，可从BioForceLaboratories购买）。用于自 动化的样品与载玻片上的阵列孵育以及冲洗的微流体系统已经由NextGen和PerkinElmer LifeSciences共同开发。
[0168] 在某些实施方案中，用于检测dlgA或其它预选产物所使用的技术包括内标或外 标以允许这些产物的定量或半定量测定，从而实现生物样品中这些表达产物的水平或功能 活性与参考样品或样品中相应表达产物的有效比较。这样的标准通过有技能的操作者使用 标准方案来确定。特定的实施例中，确定了各个表达产物的水平或功能活性的绝对值。对 照可包括-个人和群体对照和来自诊断测试的样品-较早的时间点。
[0169] 特定的实施方案中，所述诊断方法使用公开的系统实施，例如国际公布申请号W0 02/090579和提交于2003年11月14日的共同审理中的PCT申请No.PCT/AU03/01517,所 述系统包含至少一个与基站连接的终端站。当收集预定的数据时，基站通常与一个或多个 数据库连接，所述数据库包含来自许多个体的预定数据，代表TB抗原特异性抗体和它们同 种型结构（二聚的/多聚的）或亚型的水平。在操作中，所述基站适合于从所述终端站，通 常通过通信网络，接收受试者数据，并且将所述受试者数据与储存在数据库中的预定数据 进行比较，所述受试者数据代表从测试受试者获得的生物样品中至少一种抗体类型的测定 的或正常化的水平。将所述受试者和预定数据相比较允许基站根据比较的结果确定所述受 试者的状态。这样，基站尝试鉴定具有与所述测试受试者相似参数值的个体，并且一旦基于 该鉴定确定了状态，所述基站提供给终端站诊断的指示。一个实施方案中，分许可重组plgR 在TB抗原筛选或TB血清学诊断中使用。
[0170] 本说明书的每个实施方案在细节上作必要的修改后，适用于所有其它实施方案 中，除非另有明确的规定。
[0171] 显然，功能上同等的方法和采用这样方法的试剂盒在本文所描述的发明范围内。
[0172] 本发明通过以下的非限制性实施例进一步描述。
[0173] 实施例1
[0174]ELISA显示嵌合plgR对dlgA的结合优于IgM，但是人plgR对IgM的强结合
[0175] 如图8中所示，进行了ELISA比较HpIgR和R/HpIgR对人IgM和dlgA的结合，显 示了相对于对IgM，嵌合plgR对dlgA的优先结合，但是人plgR对IgM有强的结合。HpIgR 或R/HpIgR固定在96孔Nunc免疫板上于4°C过夜。将在PBS中纯化的人IgM或dlgA的稀 释液结合到固定的plgR形式上过夜。洗涤后，使用偶联辣根过氧化物酶（HRP)的抗-IgM 或抗-IgA以及比色底物TMB检测捕获的IgM或dlgA。本结果证实了HpIgR显示除结合 dlgA(绿色）外，还优先结合IgM(品红色），然而R/HpIgR显示对IgM的结合大大降低（黄 色）但是保留对dlgA的强结合（蓝色）。
[0176] 实施例2
[0177]ELISA显示利用R/HpIgR检测固定的dlgA，背景可忽略
[0178] 进行了ELISA以比较利用R/HpIgR对固定的dlgA的检测。纯化的dlgA或无 dlgA(空白对照）的稀释液固定在预先包被有抗-IgA的96孔Nunc免疫板上，以便使所述 dlgA通过抗体-抗原的相互作用而不是被动吸附结合到所述板上。使用R/HpIgR(〃无尾的 〃）或无PlgR(〃空白〃），抗-分泌组分和抗-小鼠HRP以及TMB底物检测dlgA。结果（参 见图9)证实R/HpIgR能够检测在最低测试浓度（31ng/mL)的dlgA，在ELISA中有强的信 号，背景可忽略。
[0179] 实施例3
[0180] ELISA显示在IgM捕获中HAV-特异性IgM的有效耗竭
[0181] 使用来自患有急性HAV感染的患者的血清的连续稀释液（AccurunHAV面板样品 121)，进行ELISA，显示了在IgM捕获中HAV-特异性IgM的检测。血清样品为稀释前未触动 过的（未触动过的，紫色）或使用Capture-SelectIgM(BAC)基本上耗竭IgM(红色）。结 果（参见图12)显示与未触动过的血清相比，该IgM耗竭方法降低了样品中HAV-特异性的 IgM的水平约256倍。
[0182] 实施例4
[0183]ELISA显示在个体患者中，相比IgM，甲型肝炎病毒-特异性dlgA的检测，有或没 有IgM的耗竭
[0184] 使用来自患有急性HAV感染的患者的血清的连续稀释液（AccurunHAV面板样品 121)，进行ELISA，显示了在R/HpIgR捕获中HAV-特异性dlgA的检测。血清样品为稀释前 未触动过的（未触动过的，紫色）或使用Capture-SelectIgM(BAC)基本上耗竭IgM(红 色）的。结果首先表明显示HAV-特异性dlgA的检测的获得的强信号，其次该信号为dlgA 而非IgM特异性的，因为与未触动过的血清相比，IgM耗竭方法基本上没有降低HAV-特异 性反应的水平，与用于IgM检测的图12中显示的结果形成对照。
[0185] 实施例5
[0186] 用于诊断急性HAV-感染的抗原-特异性dlgA的R/HpIgR捕获
[0187] 使用来自患有急性HAV感染的患者的血清的连续稀释液（AccurunHAV面板样品 121)，进行ELISA，显示了在R/HpIgR捕获中HAV-特异性dlgA的检测。血清样品为稀释前 未触动过（未触动过的，紫色）或使用Capture-SelectIgM(BAC)基本上耗竭IgM的（红 色）。结果（参见图13)首先显示证实HAV-特异性dlgA的检测的获得的强信号，其次该信 号为dlgA而非IgM特异性的，因为与未触动过的血清相比，IgM耗竭方法基本上没有降低 HAV-特异性反应的水平，与用于IgM检测的图12中显示的结果形成对照。
[0188] 使用来自患有或没有急性HAV感染的患者的血清（AccurunHAV面板，阳性的 (P0S)，低阳性的（LOWP0S)，或阴性的（NEG))，进行ELISA，显示在R/HpIgR捕获中HAV-特 异性dlgA的检测。结果（图14)显示在所有POS样品以及两个LOWPOS样品的一个中强 烈的HAV-特异性dlgA的检测，NEG样品中有最小化的背景反应，这证实抗原-特异性dlgA 的R/HpIgR捕获用于急性HAV感染诊断的效用。
[0189] 实施例6
[0190] 用于急性HEV感染诊断的R/HpIgR捕获和HpIgR捕获的效用
[0191] 使用来自患有或没有急性HEV感染的患者的血清，进行ELISA，显示了在R/HpIgR 捕获或HpIgR捕获中戊型肝炎病毒（HEV)-特异性dlgA的检测。图15的左边，显示个体 样品的ELISA0D，证实抗原-特异性dlgA的R/HpIgR捕获用于急性HEV感染诊断的效用， HpIgR捕获用于该目的的较低但仍然显著的效用，以及任一样品中可忽略的背景反应。图 15的右边，显示的是每个血清样品的连续稀释液的反应，确认用于急性HEV感染的诊断中 R/HpIgR捕获的效用和HpIgR捕获的较低效用。很可能的是，在这些实施例中HpIgR捕获的 较低效用是由于血清中相对于dlgA高得多的IgM的总浓度，这导致通过HpIgR捕获的仅低 比例的IgM为HEV特异性的。
[0192] 实施例7
[0193] 使用HEV感染患者说明抗原-特异性dlgA或IgM的检测
[0194]HEV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较。两种方法都能够检测到所有 HEV-感染的患者，有强的ELISA信号（图17)，与dlgA分析中对照（HEV-阴性）患者的极 低的背景，以及IgM分析中的低背景相比。显著地，一些样品显示较高的dlgA水平，与IgM 相比（样品J13,J7)，而其它样品显示较高的IgM水平，与dlgA相比（J4,J11)。这证明了 患者中dlgA和IgM的应答是独立的，并且建议了IgM和dlgA的合并检测在一些合适的分 析模式中可能是有用的。图17阐明了dlgA分析基本上无背景，而高度优化的商业化IgM 分析产生低的但是可检测的背景。
[0195] 使用未触动过的，或利用Capture-SelectIgM基本上耗竭了IgM，然后连续稀释 的血清，进行了ffiV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较。结果（图18)确认了所 述IgM分析对IgM是特异的，因为反应通过IgM耗竭被消除，而dlgA分析主要特异性针对 dlgA而不是IgM，因为反应仅轻微的受IgM耗竭的影响。
[0196] 使用未触动过的，或通过Capture-SelectIgM基本上耗竭了IgM的血清，实施了 ffiV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较。结果（图19)确认了IgM分析对IgM 是特异的，因为反应通过IgM耗竭被消除，然而所述dlgA分析主要特异性针对dlgA而不是 IgM，因为反应仅轻微地受IgM耗竭的影响。
[0197] 使用未触动过的，或通过Capture-SelectIgM基本上耗竭IgM的血清，实施了 ffiV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较。结果（图20)确认了IgM分析对IgM是 特异的，因为反应通过IgM耗竭被消除，而所述dlgA分析主要特异性针对dlgA而不是IgM， 因为反应仅轻微地受IgM耗竭的影响。当使用配对t检验比较耗竭前后的样品时，IgM耗 竭后dlgA活性的降低在统计上是显著的，但是当使用Mann-Whitney检验比较耗竭前后的 总样本集时是不显著的。
[0198] 实施例8
[0199] 小鼠dlgA的R/HpIgR捕获和检测
[0200] 实施了ELISA，表明R/HpIgR能用在小鼠二聚体IgA的捕获（A)和检测⑶中，对于 单体（人类）IgA有可忽略的背景反应。图21A纯化的小鼠IgA单克隆抗体3H1 (抗-HAV) 或纯化的单体人IgA的稀释液包被在板上并用R/HpIgR以及抗-SC抗体检测。B.R/HpIgR 包被在板上，并允许纯化的小鼠IgA单克隆抗体3H1或纯化的单体人IgA的稀释液结合过 夜，然后用抗-小鼠IgA或抗-人IgA检测。来自不同物种的IgA对人或兔plgR的结合是 本领域所公知的，这证实了文中所描述的新的plgR策略具有用于诊断其它物 种感染的效 用。
[0201] 实施了ELISA，显示R/HpIgR用于检测小鼠二聚IgA和人二聚IgA是同等有效的， 对单体人IgA有可忽略的背景反应。图22A.纯化的小鼠IgA单克隆抗体3H1 (抗-HAV)或 纯化的二聚体或单体人IgA的稀释液包被在板上并用R/HpIgR和抗-SC抗体检测。
[0202] 实施例9
[0203]HIV-感染的受试者中HIV发病的评估和SIgA/dIgA比值的效用的说明
[0204] 可以用于测定不同IgA形式的相对量以便估算SIgA/dIgA比值的几种典型分析中 的一个的示意图（参见图27)。在该实施例中，dlgA的量通过利用R/HpIgR捕获dlgA来测 定，并使用针对IgAl、或IgA2,或针对这两种IgA亚类的单克隆抗体检测。单体IgA不结合 plgR;SIgA结合R/HpIgR但是比dlgA有较低亲和力，并且如果需要，能通过3. 5M尿素的洗 涤被去除。用同样的方式测定SIgA但是使用抗-SC抗体捕获代替R/HpIgR。然后将SIgA/ dlgA比值计算为SIgA和dlgA的分析反应的简单比值。
[0205] 实施了ELISA，显示与大部分HIV-感染患者和所有对照受试者（品红色）相比， 在一部分HIV-感染患者中检测到显著升高的SIgA2/dIgA2(S/d)比值。用于升高的SIgA/ dlgA的分析截止值被设定为非-HIV对照受试者中SIgA/dIgA比值的平均值+3标准差， 并且7/30的HIV-感染受试者显示SIgA/dIgA比值高于该截止值。显著地，正常受试者中 SIgA/dIgA比值的范围小于单独的SIgA或dlgA的范围，因为dlgA作为SIgA前体物的作用 提供了对每个患者的正常化效应。
[0206] 实施了ELISA，显示了患者和对照血清中SIgA的总量（任意单位）。正常患者中 SIgA2量在11-倍范围变化，但是所有正常对照落入平均值+3标准差的截止内。HIV-感染 患者中SIgA2量在稍大范围（16倍）变化，但是只有2/30患者高于上述截止范围（参见 图29)。在HIV-感染的患者中，在图28中显示升高的SIgA2/dIgA2比值的那些患者用红 色标记指示（菱形，秩次为11，16, 19, 23, 24, 28和30)。能够看出的是，具有升高的SIgA2/ dIgA2比值的这些患者在遍及总SIgA2信号的大部分正常范围内存在，因此不能基于单独 的总SIgA2与正常对照相区分。这确认使用SIgA/dIgA比值的效用，因为作为SIgA前体物 的dlgA的作用提供了对每位患者的正常化效应。R/HpIgR系统提供了用于测定该值的效 用。
[0207] 图30说明了与图28和29中所显示的不同HIV-感染群体中，SIgA2/dIgA2比值 相对于免疫激活标志物⑶8+HLA-DR+⑶38+T-细胞的关联性。当总关联性低时，很明显的是 在该实验中的SIgA2/dIgA2比值>4的患者有升高的免疫激活标志物的水平（p〈0. 0001)。
[0208] 图31说明了在与图30相同的群体中，SIgAl/dIgAl比值相对于免疫激活标记， ⑶8+HLA-DR+⑶38+T-细胞的关联性。当总关联性再低于对于IgA2而言的总关联性时， 很明显的是在该实验中的SIgAl/dIgAl比值>10的患者有升高的免疫激活标志物的水平 (p〈0. 015)。关于IgAl的较低关联性和显著性的较高截止比（10对4)强调了特异性地测 定IgA2的价值，由于它的主要合成部位在肠道（肠道为SIgA渗漏的组织）中，有可能是肠 道渗漏和免疫激活的临床上相关的标志物。
[0209] 图32说明了与图30和31中相同的群体中SIgAl/dIgAl比值相对于SIgA2/dIgA2 比值的关联性。当SIgAl/dIgAl比值与SIgA2/dIgA2显著相关时，值得注意的是有一些患 者具有高度升高的SIgAl/dIgAl比值和相对低的SIgA2/dIgA2比值。这表明SIgA/dIgA比 值的计算中除了IgA2外，测定IgAl、或总IgA作为肠道渗漏和免疫激活的测量也可能存在 一些价值。
[0210] 本文中引用的每项专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用的方式以其整体 并入本文。
[0211] 对本领域技术人员来说显而易见的是，可以对本发明作出许多修饰而不超出本发 明的范围。
[0212] 表 1
[0213] 序列标识符概述
[0215]
[0216]表2
[0217] 氨基酸亚分类
[0219]
[0220] 表 3
[0221] 示例性和优选的氨基酸取代
[0223] 文献目录
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【主权项】
1. 抗体捕获方法，其包括：（i)获得包含抗体的生物样品，（ii)使所述生物样品与重组 plgR或dlgA-结合变体相接触，其中所述plgR或变体结合dlgA并形成plgR-dlgA复合物。2. 如权利要求1所述的方法，其还包括（iii)直接或间接地评估所述plgR-dlgA复合 物的水平或者PlgR-dlgA与感兴趣的抗原之间的复合物的水平。3. 如权利要求1或2所述的抗体捕获方法，其中所述plgR或dlgA-结合变体结合dlgA 并且基本上不结合IgM，或者其中所述plgR或变体结合dlgA和IgM。4. 如权利要求1-3中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述生物样品为血液样品或血 清样品。5. 如权利要求1-4中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述生物样品获自受试者。6. 如权利要求5所述的抗体捕获方法，其中所述受试者为人类或灵长类动物。7. 如权利要求5所述的抗体捕获方法，其中所述受试者是除灵长类或人类物种外的哺 乳动物或禽类动物物种。8. 如权利要求1-7中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述plgR为重组HpIgA或 RpIgR09. 如权利要求1-7中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述重组plgR或dlgA-结合变 体的跨膜结构域和/或胞浆结构域缺失。10. 如权利要求1-9中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述重组plgR包含异源检测 或结合结构域。11. 如利要求1-10中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述重组PlgR或IgA-结合变 体在多糖缺陷细胞中重组产生。12. 如权利要求1-11中任一项所述的抗体捕获方法，其中将所述重组plgR结合到固体 支持物。13. 如权利要求1-12中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述生物样品在用于所述方 法之前被耗竭IgM或dlgA抗体。14. 如权利要求2-13中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的抗原为传染原抗原或者 与侵袭黏膜表面或相关组织的受试者病症相关的抗原。15. 如权利要求13所述的方法，其中所述传染原选自HIV，麻风、梅毒、肝炎、登革病毒、 麻瘆和风瘆。16. 如权利要求1-14中任一项所述的方法，其还包括使所述生物样品与抗-SC结合剂 或抗-SC抗体相接触，其中所述抗-SC-结合剂或抗-SC抗体结合SIgA并形成SIgA-结合 剂/抗体复合物。17. 如权利要求1-14中任一项所述的方法，其还包括使包含所述plgR-dlgA复合物的 样品与变性溶液相接触以去除来自所述复合物的任何SIgA，以及测定生物样品中SIgA和 dlgA的比值。18. 用于确定测试受试者肠壁完整性的抗体捕获方法，所述方法包括：（i)获得来自所 述测试受试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述生物样品与重组PlgR或dlgA-结合变 体相接触，其中所述PlgR或变体结合dlgA并形成plgR-dlgA复合物，和（iii)使所述生物 样品与特异性抗-SIgA结合剂或抗-SC结合剂/抗体相接触，其中所述抗-SIgA-结合剂或 抗-SC结合剂/抗体结合SIgA并且形成SIgA-结合剂/抗体复合物，以及（iv)测定并比较 (ii)中形成的所述复合物的水平与（iii)中形成的所述复合物的水平，其中SIgA与dlgA的比值与来自对照受试者的相应水平或比值相比较，并提供肠道完整性/渗漏的测定。19. 如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中确定SIgA2/dIgA2和/或SIgAl/ dlgAl的水平或比值。20. 抗体捕获方法，其包括：（i)获得包含抗体的生物样品，（ii)使所述生物样品与重 组PlgR或dlgA或IgM-结合变体相接触，其中所述plgR或变体结合IgM和/或IgA并形 成PlgR-IgM和 / 或plgR-dlgA复合物。21. 抗体捕获方法，其包括：（i)获得包含抗体的生物样品，（ii)使所述生物样品与重 组PlgR相接触，其中所述PlgR或变体结合IgM并形成plgR-IgM复合物。22. 用于检测受试者中抗原-特异性dlgA存在的方法，所述方法包括：（i)获得来自受 试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述样品与R/HpIgR和抗原相接触，以及（iii)测定 抗原-特异性dlgA的水平。23. 用于检测受试者中抗原-特异性IgM存在的方法，所述方法包括：（i)获得来自受 试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述样品与HpIgR和抗原相接触，以及（iii)测定抗 原-特异性IgM的水平。24. 用于检测受试者中抗原-特异性IgM和dlgA存在的方法，所述方法包括：（i)获 得来自受试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述样品与HpIgR和R/HpIgR以及抗原相接 触，以及（iii)测定抗原-特异性IgM和抗原-特异性dlgA的水平。25. 用于评估受试者免疫状态的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)免疫图形设备，其包含 可操作地连接到样品部分、测试部分，和任选的对照部分的多孔膜；并且还包含吸管部分、 包含重组PlgR分子或其dlgA-结合变体的部分，包含感兴趣的抗原部分和任选的偶联部 分；以及b)使用所述免疫图形设备检测样品中抗原特异性dlgA抗体存在的说明书。26. 如权利要求25所述的试剂盒，其中所述plgR为HpIgR和/或R/HpIgR。27. 如权利要求25或26所述的试剂盒，其中所述重组plgR或dlgA-结合变体的跨膜 结构域和/或胞浆结构域缺失。28. 如权利要求25-27中任一项所述的试剂盒，其中所述重组plgR包含异源检测或结 合结构域。29. 如权利要求25-28中任一项所述的试剂盒，其中所述重组plgR或IgA-结合变体在 多糖缺陷细胞中重组产生。30. 如权利要求25-29中任一项所述的试剂盒，其中将所述重组plgR结合到固体支持 物。31. 如权利要求25-30中任一项所述的试剂盒，其中所述感兴趣的抗原为传染原抗原 或者与侵袭黏膜表面或相关组织的受试者病症相关的抗原。32. 如权利要求31所述的试剂盒，其中所述传染原选自HIV，麻风，梅毒，肝炎，登革病 毒，麻瘆和风瘆。33. 如权利要求25-32中任一项所述的试剂盒，其还包含抗-SIgA结合剂/抗体或 抗-SC抗体，其中所述抗-SIgA结合剂/抗体或抗-SC抗体结合SIgA并形成SIgA-结合剂 /抗体复合物。34. 重组plgR，其用于捕获或检测dlgA和/或IgM，或者供捕获或检测dlgA和/或IgM35.权利要求34所述的重组plgR，其为R/HpIgR或HpIgR或者R/HpIgR或HpIgR的 dlgA和/或IgM结合变体。 使用。
【专利摘要】本申请描述了抗体捕获方法，包括(i)获得包含抗体的生物样品，(ii)使所述生物样品与重组pIgR或dIgA-结合变体接触，其中所述pIgR或变体结合dIgA并形成pIgR-dIgA复合物。所述方法还可包括(iii)直接地或间接地评估所述pIgR-dIgA复合物的水平或pIgR-dIgA与感兴趣的抗原之间的复合物的水平。还有一种确定测试受试者的肠壁完整性的抗体捕获方法，其中将所述SIgA与dIgA的水平或比值与来自对照受试者的相应的水平或比值进行比较。当用于捕获或检测dIgA和/或IgM或供捕获或检测dIgA和/或IgM使用时，本申请提供了体现所述方法和重组pIgR的试剂盒。
【IPC分类】G01N33/53, C12N15/12
【公开号】CN104903727
【申请号】CN201380069755
【发明人】大卫·安德鲁·安德森, 玛丽·路易斯·加西亚, 纳丁·卡梅尔·巴奈斯, 哈瑞雅赫·穆赫德·哈纳菲亚, 阿兰·李·兰迪
【申请人】马克法兰伯尼特医学研究与公共健康协会有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月8日
【公告号】EP2917731A1, US20150330993, WO2014071456A1
【专利说明】
[0001] 优先权要求
[0002] 本申请要求2012年11月8日提交的澳大利亚临时专利申请第2012904887号的 优先权，其公开内容通过引用包括在本文中。
技术领域
[0003] 本说明书一般涉及与免疫激活，特别是黏膜免疫激活相关联的传染原或其它病症 的诊断，预后和治疗方案领域。更具体而言，本说明书涉及作为生物标记的抗体在免疫激活 和/或与免疫激活相关联的病患的诊断、预后和治疗中的用途。提出的本方案正准备引进 到实验室和床边自测模式中以满足全世界的目标人群。
【背景技术】
[0004] 本说明书中提及的参考书目细节列在说明书的最后。
[0005] 提到的任何现有技术不是且不应被视为承认或任何形式的启示该现有技术组成 任何国家中的公知常识的一部分。
[0006] 特异性抗体（免疫球蛋白（Ig))类的检测被认为是人类和动物疾病的诊断和研宄 方法的重要步骤。例如，抗原-特异性IgM类抗体的检测广泛地用作感染有病毒如甲型肝 炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼罗病毒、登革病毒、麻瘆病毒；和感染有细菌如梅毒（梅毒螺旋 体）的诊断测试，因为IgM类抗体通常在感染的急性期期间产生于受感染的宿主体内，并仅 在几个月是可检测的。
[0007] 相反地，IgG类抗体通常终身存留并可以指示特定病原体的现症或既往感染。存 在于人体中，用特异性药物可表明当前或过去的感染情况。对于如人类免疫缺陷病毒（HIV) 的慢性感染而言，患者不能自发地清除病毒，IgG类抗体的检测用于感染的诊断，而对于如 丙型肝炎病毒（HCV)等其它的感染，一部分患者可以自发地或在治疗后清除病毒，抗原-特 异性IgG的检测不用于当前或持续感染的诊断。IgG类抗体还主要负责机体血浆部分抗 体-介导的免疫。
[0008]IgA类抗体也已经被用于帮助感染的诊断，包括戊型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、和 登革病毒，以及感染的疫苗和免疫的研宄。IgA用于诊断目的是有吸引力的，因为它在急性 感染期期间显著地产生，需要或不需要IgM的同时检测，高水平的抗原-特异性IgA可以提 供当前感染的标记。另外，因为IgA是分泌在黏膜上皮表面的主要抗体种类，它的存在被认 为是黏膜免疫的标记。作为感染的生物标记的不同IgA结构形式的作用未被理解，如特别 是dlgA。SIgA在感染中的作用和使SIgA产生应答的抗原尚未被研宄，设计为用于快速地 且便捷地评估患者血清中的这些应答的诊断和预后的方案也未被开发。
[0009] 大多数动物中，IgA几乎完全以二聚体或更高多聚体的形式合成，本文将其统 一描述为dlgA，其能够与多聚Ig受体（plgR)相互作用。这种相互作用导致大量分泌型 IgA(SIgA)分泌进入上皮组织的内腔（参见图1和2)。然而，在人类和高等灵长类中，dlgA 仅仅是总IgA的很少部分，单体IgA(mlgA)代表约90 %的总IgA，且二聚体或较高聚合体形 式的IgA代表约10%的总IgA。
[0010] IgA、IgM、IgG和其它抗体种类或同种型的检测通常使用其它物种中制备的抗体试 剂来进行，比如对人类IgM特异的兔抗体，或对人类IgA特异的小鼠单克隆抗体，或对各个 抗体亚类如IgAl、IgA2或]^61、]^623、]^6213、]^63、]^64特异的单克隆抗体。基于抗体的 捕获测定与通过最优化方案最小化的非特异性结合的水平有关。
[0011] 需要改善用于监测与受试者的黏膜表面和黏膜免疫反应有关的感染的血清学手 段，以及需要可以用于评估二聚或多聚抗体的产生和/或用于二聚或多聚抗体纯化的试 剂。
[0012] 实施方案概述
[0013] 因此一个实施方案中，本说明书提供了抗体捕获方法，其包括（i)获得包含抗体 的生物样品，（ii)使生物样品与重组plgR或dlgA-结合变体接触，其中所述plgR或变体 结合dlgA并形成plgR-dlgA复合物。一旦所述复合物形成，所述复合物可被定量。一些实 施方案中，dlgA可以从所述plgR中释放并进一步加工。一个实施方案中，采用所述方法用 于dlgA抗体的纯化，作为采用木菠萝素（jacalin)琼脂糖的现有方法的替代方案。复合物 的检测使用本领域的常规方法和已知的试剂，如ELISA或其它基于免疫测定的方法。
[0014] -个实施方案中，所述方法还包括（iii)直接地或间接地评估所述plgR-sIgA复 合物的水平或plgR-sIgA和感兴趣的抗原间形成的复合物的水平。
[0015] -个实施方案中，所述plgR或dlgA-结合变体结合dlgA并且基本上不结合IgM， 或其中所述plgR或变体结合dlgA和IgM。用于检测抗原特异性IgM和dlgA的方法可与用 于总IgA、IgG和其它个别同种型、亚型和结构形式以及它们中两种或更多种的组合的测试 联用。
[0016] 一个实施方案中，生物样品为血液或血清样品。可选择的生物样品包括包含表达 dlgA的细胞的样品。因此，一些实施方案中，所述方法可用来在永生化B细胞的筛选或分离 中检测表达dlgA的个别B-细胞。
[0017] 另一个实施方案中，生物样品从受试者中获得。在一些实施方案中，受试者为人类 或灵长类，以及在另一个实施方案中，受试者为除灵长类或人类物种外的哺乳动物或禽类 动物物种。基于感兴趣的靶抗体和抗体来源的物种选择不同形式的重组PlgR。
[0018] 如在一个实施方案中所阐明的，plgR为重组HpIgA或RpIgR。便利地，在一个实施 方案中，重组plgR或dlgA-结合变体的跨膜结构域和/或胞浆结构域缺失。在其它实施方 案中，重组plgR包含异源检测或结合域。在另一个实施方案中，重组plgR或IgA-结合变 体在多糖缺陷细胞中重组产生，如CH0细胞。
[0019] 在上述方法的示例性实施方案中，重组plgR结合到固体支持物上。
[0020] 在一个实施方案中，将生物样品在用于所述方法之前耗尽IgM或dlgA抗体，这就 允许结合IgM和dlgA的plgR在测定中被利用以特异性地检测dlgA。同样地，dlgA的耗竭 (例如使用R/HpIgR)有利于在测定中利用HpIgR以特异性地检测IgM。一些实施方案中， 为了减少与dlgA的竞争，样品使用之前被耗竭IgG。然而，当竞争性抗体在本申请抗体/同 种型捕获模式中被洗掉时，此类竞争的缺乏是上述方法的一个优势。
[0021] 可采用任何感兴趣的抗原，以及在非限制性实施方案中，所述感兴趣的抗原是传 染原的抗原或与侵袭黏膜表面或相关组织的受试者病症相关的抗原。例如，传染原包括 HIV、麻风病、梅毒、肝炎、登革病毒、麻瘆和风瘆。
[0022] 在一个实施方案中，上述方法还包括使生物样品与抗-SC结合剂或抗-SC抗体接 触，其中所述抗-SC结合剂或抗-SC抗体结合SIgA并形成SIgA-结合剂/抗体复合物。在 另一个实施方案中，所述方法还包括使包含所述plgR-dlgA复合物的样品与变性溶液接 触，去除来自复合物的任何SIgA并测定生物样品中SIgA和dlgA的比值。
[0023] 另一方面，本说明书实现了用于确定测试受试者的肠壁完整性的抗体捕获方法， 所述方法包括：（i)获得包含来自测试受试者的抗体的生物样品，（ii)使所述生物样品和 重组plgR或dlgA-结合变体接触，其中所述plgR或变体结合dlgA并形成plgR-dlgA复合 物，和（iii)使所述生物样品与特异性抗-SIgA结合剂或抗-SC结合剂/抗体接触，其中 抗-SIgA结合剂或抗-SC结合剂/抗体结合SIgA并形成SIgA-结合剂/抗体复合物，以及 (iv)测定和比较（ii)中形成的复合物的水平与（iii)中形成的复合物的水平，其中SIgA 与dlgA的比值与来自对照受试者的相应水平或比值相比较，并提供肠道完整/渗漏的测 定。
[0024] 在上述方法的一个实施方案中，确定了SIgA2/dIgA2和/或SlgAl/dlgAl的水平 或比值。
[0025] 在另一个实施方案中，所述抗体捕获方法包括（i)获得包含抗体的生物样品， (ii)使所述生物样品与重组PIgR或dlgA或IgM-结合变体接触，其中，所述pIgR或变体结 合IgM和/或IgA并形成plgR-IgM和/或plgR-dlgA复合物。
[0026] 可选地，所述抗体捕获方法可以包括（i)获得包含抗体的生物样品，（ii)使所述 生物样品与重组plgR接触，其中所述plgR或变体结合IgM并形成plgR-IgM复合物。
[0027] 在另一个说明性的实施方案中，实现了用于检测受试者抗原-特异性dlgA的存在 的方法，所述方法包括（i)获得来自受试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述样品与R/ HpIgR和抗原接触，以及（iii)测定抗原-特异性dlgA的水平。
[0028] 另一个实施方案中，描述了用于检测受试者抗原-特异性IgM存在的方法，所述方 法包括（i)获得来自受试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述样品与HpIgR和抗原接触， 以及（iii)测定抗原-特异性IgM的水平。
[0029] 在一个实施方案中，所述方法用于检测受试者抗原-特异IgM和dlgA的存在，所 述方法包括（i)获得来自受试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述样品与HpIgR和R/ HpIgR和抗原接触，以及（iii)测定抗原-特异性IgM和抗原-特异性dlgA的水平。
[0030] 再一方面，本说明书提供了用于评估受试者免疫状态的试剂盒，所述试剂盒包含， a)免疫图形设备，其包含可操作地连接到样品部分、测试部分和任选地对照部分的多孔膜； 以及还包含吸管部分、包含重组plgR分子或其dlgA-结合变体的部分、包含感兴趣的抗原 部分和任选的偶联部分；以及b)使用免疫图形设备检测从受试者中获得的生物样品中抗 原特异性dlgA抗体存在的说明书。
[0031] 如本文结合所述方法所描述的，在试剂盒的一些实施方案中，pIgR为HpIgR和/或 R/HpIgR。一些实施方案中，重组plgR或dlgA-结合变体的跨膜结构域和/或胞浆结构域 缺失。在一个实施方案中，重组PlgR包含异源检测或结合结构域。在另一个实施方案中， 重组PlgR或IgA-结合变体在多糖缺陷细胞中重组产生。
[0032] 在一个实施方案中，重组plgR结合到固体支持物上。
[0033] -个实施方案中，生物样品在用于上述方法之前耗尽IgM或dlgA抗体，本发明的 试剂盒以及其中所含试剂供体外使用。
[0034] 可采用任何抗原，然而在一个实施方案中，感兴趣的抗原是传染原抗原或与受试 者侵袭黏膜表面或相关组织的的病症相关的抗原。示例性的传染原选自HIV、麻风病、梅毒、 肝炎、登革病毒、麻瘆和风瘆。使用重组plgR检测到相对于对照水平抗原特异性dlgA的升 高水平便于诊断、筛选和治疗选择。在一些实施方案中，考虑以下治疗方法：其包括要求抗 原-特异性dlgA水平的测试，并且如果对于感染或病症而言所述测试是阳性的，那么将治 疗施用于所述诊断受试者。
[0035] 另一个实施方案中，试剂盒还包括抗-SIgA结合剂/抗体或抗-SC抗体，其中所述 抗-SIgA结合剂/抗体或抗-SC抗体结合SIgA并形成SIgA-结合剂/抗体复合物。
[0036] 另一方面，提供了重组plgR，其适合用于捕获或检测dlgA和/或IgM。示例性的重 组plgRs包括R/HpIgR或HpIgR或者R/HpIgR或HpIgR的dlgA和/或IgM结合变体。示 例性氨基酸和核苷酸序列如SEQIDN0:1-20所列，需要记住的是这些序列的一部分编码或 提供完全任选的CD4胞浆结构域，其可以被删除、修饰、补充或用本领域已知的其它结合或 检测分子代替。一旦考虑到本发明，有用的重组PlgR的变体对技术人员是显而易见的并很 容易被制备和测试。
[0037] 支持和描述本申请方法和试剂盒的附图的详细说明
[0038] 如果附图包含彩色图示或实体，附图的彩色版本经请求可从专利权人或从有关专 利局得到，如果从专利局获得，可能需要缴纳费用。
[0039] 图1提供了dlgA的产生以及在黏膜表面作为SIgA分泌的示意图。在黏膜下组织 产生的大多数dlgA随后结合到plgR上并经胞吞转运到黏膜表面，在那里plgR被裂解以产 生SIgA(或游离的SC)，SIgA组成抵抗病原体的第一防御层。plgR的结合依赖于聚合Ig中 J-链的存在，并且结合发生于人类的IgM和dlgA两者。
[0040] 图2提供了dlgAl的结构以及其与plgR相互作用的图示，相互作用后的plgR随 后被裂解以产生SIgAl。plgR相关的分泌组分部分与两个单独的IgA分子的J-链和Fc区 两者都相互作用。
[0041] 图3提供了相对于人类（HpIgR)的嵌合R/HpIgR，以及所述R/HpIgR在其C-端融 合人类CD4胞浆结构域的结构的图示。所述R/HpIgR和其它形式在293T细胞中高水平表 达和分泌，如通过利用对来自瞬时转染细胞的粗上清液（SN)进行SDS-PAGE凝胶的考马斯 亮蓝染色来检测R/HpIgR所示。通过利用针对所述CD4胞浆结构域（纯的）的单克隆抗体 4B4的固定基质的亲和层析法很容易纯化到均质、高浓度的R/HpIgR-cyto。纯的plgR或粗 SN可以被优先用在dlgA的检测和结合中。
[0042] 图4提供了相对于重组形式的R/HpIgR-cyto(底部），全长（天然的）plgR(顶部） 结构的示意图，其中所述plgR的跨膜结构域（TM)和胞浆结构域（cyto)已经被人CD4的胞 浆结构域替代。由于所述TM结构域的缺失，产物从细胞中分泌出来而不是保留在细胞表 面。
[0043] 图5提供了相对于重组形式的R/pIgR-cyto(底部），全长（天然的）兔plgR(顶 部）结构的示意图，其中兔plgR的跨膜结构域（TM)和胞浆结构域（cyto)已经被人CD4的 胞浆结构域替代。由于TM结构域的缺失，产物从细胞中分泌出来而不是保留在细胞表面。
[0044] 图 6 提供了HpIgRcyto、RpIgR-cyto和嵌合R/HpIgR-cyto结构的示意图。plgR 的这些形式显示了通过所述CD4胞浆结构域与塑料或其它固体表面的相互作用，与诸如聚 苯乙稀ELISA板（NuncImmulon或类似的）的固体表面的高效结合。
[0045] 图7提供了RpIgR和嵌合R/HpIgR结构的示意图。在⑶4胞浆结构域缺乏时，通 过与针对兔plgR的抗体反应能检测到所述RpIgR，并且通过与针对兔（结构域1)和/或人 (结构域2-5)plgR的抗体反应能检测到嵌合R/HpIgR。优选的抗体必须能够与结合到dlgA 的PlgR相互作用，而不仅仅与游离的PlgR相互作用。
[0046] 图8提供了比较HpIgR和R/HpIgR与人IgM和dlgA结合的ELISA结果。HpIgR或 R/HpIgR固定在96孔NuncImmulon板上于4°C过夜，将纯化的人IgM或dlgA在PBS中的稀 释液结合到被固定的PlgR形式上过夜。洗涤后，使用偶联辣根过氧化物酶（HRP)的抗-IgM 或抗-IgA以及比色底物TMB检测所述捕获的IgM或dlgA。结果证明HpIgR显示优先的与 IgM(品红色）的结合以及与dlgA(绿色）的结合，然而R/HpIgR显示与IgM的结合大大减 少（黄色），但是保留了与dlgA强的结合（蓝色）。
[0047] 图9提供了比较使用R/HpIgR检测固定的dlgA的ELISA结果。纯化的dlgA或没 有dlgA(空白（mock))的稀释液固定在预先包被有抗-IgA的96孔NuncImmulon板上， 以便dlgA通过抗原-抗体的相互作用而不是被动吸附结合到板上。使用R/HpIgR( "无尾 的"）或没有PlgR( "空白"）、抗-分泌组分和抗-鼠HRP以及TMB底物检测dlgA。结果表 明R/HpIgR能够检测最低测试浓度（31ng/mL)的dlgA，ELISA中有强的信号，背景可忽略。
[0048] 图10为用于检测诸如人血清或血浆的样品中抗原-特异性dlgA存在的一个优选 实验方法的示意图。将重组R/HpIgR-cyto固定在ELISA板上，并与血清或其它样品孵育。 二聚体IgA被捕获在固相上，并且经洗涤后去掉其它样品组分（如未被捕获的IgA和IgG， 左），抗原-特异性dlgA的存在通过连续的抗原加入以及链霉亲和素-HRP来检测，所述抗 原是生物素化的，或与针对所述抗原的生物素化的单克隆抗体起反应的。通过这种方式，通 过与抗原-特异性dlgA的反应固定的任何抗原将通过所述生物素-亲和素相互作用显示 信号。
[004 9] 图11为相比于使用抗-IgM捕获的标准方法检测HAV-特异性IgM，用于检测血清 中甲型肝炎病毒-特异性dlgA的一种优选的实验方法（的示意图。
[0050] 图12提供了显示IgM捕获中HAV-特异性IgM的检测的ELISA结果，使用来自患有 急性HAV感染的患者的连续稀释的血清（AccurunHAV面板样品121)。血清样品是稀释前 未触动过的（未被触动的，紫色），或是使用Capture-SelectIgM(BAC)基本上耗竭IgM(红 色）的。结果显示与未触动过的血清相比较，该IgM耗竭方法降低了样品中HAV-特异性 IgM的水平约256倍。
[0051] 图13提供了显示R/HpIgR捕获中HAV-特异性dlgA的检测的ELISA结果，使用来 自患有急性HAV感染的患者的连续稀释的血清（AccurunHAV面板样品121)。血清样品是 稀释前未触动过的（未被触动过的，紫色），或是使用Capture-SelectlgM(BAC)基本上耗 竭IgM(红色）。结果首先显示获得的强信号证明了HAV-特异性dlgA的检出，其次该信号 是dlgA而不是IgM特异性的，因为与未触动过的血清相比，IgM耗竭方法基本上没有降低 HAV-特异性反应的水平，与图12中显示的IgM检测的结果形成对照。
[0052] 图14提供了显示R/HpIgR捕获中HAV-特异性dlgA检测的ELISA结果，使用来自 患有或没有患急性HAV感染的患者的血清（AccurunHAV面板，阳性的（POS)，低阳性的（LOW P0S)，或阴性的（NEG))。结果显示在所有P0S样品和两个LOWP0S样品的一个中很强地检 出了HAV-特异性dlgA，在NEG样品中有最小化的背景反应，这证实了抗原-特异性dlgA的 R/HpIgR捕获用于急性HAV感染诊断的效用。
[0053] 图15提供了显示在R/HpIgR捕获或HpIgR捕获中戊型肝炎病毒（HEV)-特异性 dlgA的检测的ELISA结果，使用来自患有或没有患急性HEV感染的患者的血清。在左边，显 示个体样品的ELISA0D，证实了抗原-特异性dlgA的R/HpIgR捕获用于急性HEV感染诊断 的效用，以及HpIgR捕获用于该目的的较低但仍然显著的效用，以及任一样品中可忽略的 背景反应。在右边，显示的是每个血清样品的连续稀释液的反应，这确认了用于急性HEV感 染诊断的R/HpIgR捕获的效用和HpIgR捕获的较低效用。很可能的是，在这些实例中HpIgR 捕获的较低效用是由于血清中相对于dlgA高得多的IgM的总浓度，这导致通过HpIgR捕获 的IgM仅较低比例特异性针对HEV。
[0054] 图16为用于抗原-特异性dlgA(或IgM)的检测的第二优选方法的示意图，其中抗 原直接包被到ELISA板上（在这种情况下，戊型肝炎病毒（HEV)抗原）。将血清样品加载于 所述板上并且抗原-特异性抗体，包括IgM和dlgA，结合到所述抗原，然后用抗-IgMHRP， 或R/HpIgR和抗-人SCHRP检测。最终洗涤后，用TMB底物使信号产生。
[0055] 图17提供了HEV-特异性dlgA与HEV-特异性IgM的比较结果。两种方法都能够 检出所有ffiV-感染患者，与dlgA试验中对照患者（HEV阴性的）的极低的背景，以及IgM试 验中的低背景相比，HEV-感染患者有强的ELISA信号。值得注意的是，一些样品显示与IgM 相比较高的dlgA水平（样品J13,J7)，而其它样品显示与dlgA相比较高的IgM水平（J4， J11)。这证明患者中dlgA和IgM的应答是独立的，并且表明IgM和dlgA检测的组合在一 些合适的试验模式中可能是有用的。
[0056] 图18提供了HEV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较结果，使用未触动 过的，或通过Capture-SelectIgM基本上耗尽IgM的血清，然后将其连续稀释。结果证实 了所述IgM试验对IgM是特异的，因为反应通过IgM耗竭被消除，然而dlgA分析主要特异 性地针对dlgA而不是IgM，因为反应仅轻微地受IgM耗竭的影响。
[0057] 图19提供了HEV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较结果，使用未触动 过的，或通过Capture-SelectlgM基本上耗尽IgM的血清。结果证实述IgM试验对IgM是 特异的，因为通过IgM耗竭反应被消除，然而dlgA试验主要特异性地针对dlgA而不是IgM， 因为反应仅轻微地受IgM耗竭的影响。
[0058] 图20提供了HEV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较结果，使用未触动 过的，或通过Capture-SelectlgM基本上耗尽IgM的血清。结果证实了IgM试验对IgM是 特异性的，因为通过IgM耗尽所述反应被消除，然而dlgA试验主要特异性地针对dlgA而不 是IgM，因为反应仅轻微地受IgM耗竭的影响。当使用配对t检验比较耗竭前后的样品时， IgM耗竭后dlgA活性的降低在统计上是显著的，但是当使用Mann-Whitney检验比较耗竭前 后的总样本集时是不显著的。
[0059] 图21提供了表明R/HpIgR可以用于小鼠二聚体IgA的捕获⑷和检测（B) 的ELISA结果，单体（人类）IgA的背景反应可忽略。A.将纯化的小鼠IgA单克隆抗体 3H1 (抗-HAV)或纯化的单体人类IgA的稀释液包被在板上并用R/HpIgR和抗-SC抗体检 测。B.将R/HpIgR包被在板上并允许纯化的小鼠IgA单克隆抗体3H1或纯化的单体人类IgA的稀释液结合过夜，然后用抗-小鼠IgA或抗-人类IgA检测。来自不同物种的IgA与 人或兔plgR的结合是本领域已知的，并且这表明了本文所描述的新的plgR策略具有诊断 其它物种的感染的效用。它还可用于纯化来自其它物种的dlgA-例如-相对于木菠萝凝集 素琼脂糖，小鼠、兔或大鼠IgA单克隆抗体的纯化。
[0060] 图22提供了ELISA结果，其表明了R/HpIgR用于小鼠二聚体IgA和人二聚体IgA的检测是同样有效的，单体人IgA有可忽略的背景反应。A.纯化的小鼠IgA单克隆抗体 3H1 (抗-HAV)或纯化的二聚体或单体人IgA的稀释液包被在板上并用R/HpIgR和抗-SC抗 体检测。
[0061]图23提供了概述急性人类免疫缺陷（HIV)感染的致病结果的模型，其引起肠道以 及外周快速的CD4消耗，随后肠道屏障功能下降，肠道内容物的渗漏和微生物易位的增加， 引起免疫激活的增加，其促使发病和⑶4T-细胞水平的进一步下降（Brenchleyetal，Nat Med12:. 1365-1371,2006)。对简单、标准化的分析存在未满足的需求，所述分析能够用于 检测发病途径中这些步骤的一步或多步，以便可以为患者提供适当的干预，目前只有CD4 试验已整合到用于HIV-感染患者的护理标准中。检测肠道中⑶4的消耗需要内窥镜检查； 检测肠道屏障功能降低需要复杂的糖激发研宄或其它方法；检测肠道渗漏和微生物易位可 以使用如血清中细菌LPS或16sRNA的标记物来实现，但是结果是高度变异的，部分由于个 体之间肠道菌群的广泛变异性；免疫激活需要复杂的流式细胞术方案，使仪器/操作者标 准化是困难的。
[0062] 图24为由病原HIV或SIV感染诱导的肠道渗漏导致的微生物易位增加的示意图， 所述增加是与非病原SIV感染的正常低水平易位相比。
[0063] 图25阐明了微生物易位增加的一个预期后果为由于黏膜抗原暴露而导致的IgA 应答增加的诱发。Frenchetal，JInfectDis. 200(B): 1212-1215, 2009 证明了随访 6 年 后HIV患者中IgA的总水平与经历高效抗逆转录病毒治疗的患者的CD4T-细胞的水平呈负 相关，表明即使在用目前最有效的抗病毒治疗的患者中，微生物易位有助于发病。然而这些 结果也说明个体之间总IgA是高度可变的，并且没有提供可以用在个别患者的管理中的预 后标志物。
[0064] 图26提供了由病原HIV或SIV感染诱发的肠道渗漏导致的微生物易位增加的示 意图，所述增加与非病原SIV感染的正常低水平易位相比，显示对血浆部分中的二聚化IgA 和分泌型IgA水平的预期影响。在正常条件或非病原HIV感染下，肠道屏障完整性被保持， 并且肠道腔SIgA的水平反映了它的前体物dlgA在固有层中的量。通过肠道M-细胞的主 动运输，或少量的肠道渗漏，只有极少量SIgA返回到血浆部分。渗漏或主动运输的量可以 通过将SIgA的血清/血浆浓度与它的前体物dlgA的血清/血浆浓度比较，得到SIgA/dIgA 的比值来估算。在致病HIV或SIV感染，或其它导致肠道渗漏的生理激发的条件下，dlgA的 总量可能会稍微升高并且可引起较高水平的SIgA分泌到内腔。然而，由于通过受损的肠道 屏障的被动渗漏，更高比例的SIgA返回到血浆部分，导致SIgA/dIgA比值升高。
[0065] 图27提供了能用来测定不同IgA形式的相对含量以便估算SIgA/dIgA的比值的 几种典型分析中的一个的示意图。在这个实例中，通过使用R/HpIgR捕获dlgA测定dlgA 的量，并使用针对IgAl、或IgA2,或针对这两种IgA亚类的单克隆抗体检测。单体IgA不结 合plgR;SIgA结合R/HpIgR但是亲和力低于dlgA，并且如果需要，可以通过3. 5M尿素的洗 涤被去除。用同样的方式测定SIgA，但是使用抗-SC抗体捕获代替R/HpIgR。然后将SIgA/ dlgA比值计算为SIgA和dlgA的分析反应性的简单比值。
[0066] 图28提供了ELISA结果，其显示了与大部分HIV-感染患者和所有对照受试者（品 红色）相比，一部分HIV-感染患者中高度地升高的SIgA2/dIgA2(S/d)比值的检测。升高 的SIgA/dIgA的分析临界值被设定为非-HIV对照受试者中所述SIgA/dIgA比值的平均值 +3标准差，并且7/30的HIV-感染受试者显示SIgA/dIgA比值高于该临界值。显著地，正常 受试者中SIgA/dIgA比值的范围小于单独的SIgA或dlgA的范围，因为dlgA作为SIgA前 体物的作用提供了对每个患者的正常化效应。
[0067] 图29提供了ELISA结果，其表明患者和对照血清中SIgA的总量（任意单位）。正 常患者的SIgA2量在11-倍范围变动，但是所有正常对照都落在平均值+3标准差的截止范 围内。HIV-感染患者中的SIgA2量在稍大范围（16倍）内变动，但是只有2/30患者高于所 述截止范围。所述HIV-感染患者中，在图28中显示SIgA2/dIgA2比值升高的那些患者用 红色标记标示。能够看出，SIgA2/dIgA2比值升高的这些患者在整个总SIgA2信号的正常范 围的大部分找到，因此不能基于单独的总SIgA2信号与正常对照区分。这证实了使用SIgA/ dlgA比值的效用，因为dlgA作为SIgA前体物的作用提供了对每位患者的正常化效应。R/ HpIgR系统提供了用于测定该比值的效用。
[0068] 图30阐明了图28和29中显示的不同HIV-感染群体中SIgA2/dIgA2比值相对于 免疫激活标志物，⑶8+HLA-DR+⑶38+T-细胞的关联性。当总关联性低时，很明显的是在该 实验中的SIgA2/dIgA2比值>4的患者具有升高的免疫激活标志物的水平（p〈0.0001)。 [0069] 图31阐明了在与图30中相同的群体中，SIgAl/dIgAl比值相对于免疫激活标志物 ⑶8+HLA-DR+⑶38+T-细胞的关联性。当总关联性再次低于对于IgA2而言的总关联性时， 很明显的是在该实验中的SIgAl/dIgAl比值>10的患者具有升高的免疫激活标志物的水平 (p〈0.015)。对于IgAl的较低关联性和有显著性的较高临界比值（10对4)强调了特异性 地测定IgA2的价值，由于它的主要合成部位在肠道（SIgA渗漏的组织）中很有可能会是肠 道渗漏和免疫激活的临床相关标志物。
[0070] 图32阐明了在与图30和31中相同的群体中，SIgAl/dIgAl比值相对于SIgA2/ dIgA2比值的关联性。当SIgAl/dIgAl比值与SIgA2/dIgA2显著相关时，值得注意的是存在 一些患者有高度升高的SIgAl/dIgAl比值和相对低的SIgA2/dIgA2比值。这表明在计算作 为肠道渗漏和免疫激活的测量的SIgA/dIgA比值中除了测定IgA2外，测定IgAl、或总IgA 也可能存在一些价值。
[0071] 图33提供了CHMERA-OMcyto (R/HpIgR-cyto)的核苷酸序列和氨基酸序列，显示 了加下划线的兔序列和以黑色显不的人序列，和以灰色显不的CD4cyto序列。
[0072] 图34提供了CmMERA-CD4(R/HpIgR)的核苷酸序列和氨基酸序列，显示了加下划 线的兔序列和以黑色显示的人序列。
[0073] 图35提供了图示和制成表的数据，显示丙型肝炎病毒特异性dlgA的检测。除了 通过粪口途径人与人间传播的急性、自限性的甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒外，还存在导 致病毒性肝炎的至少三种其它病毒，所述病毒性肝炎通常是慢性的并且导致严重的长期疾 病，并且其中所述病毒被认为是血源性的，即乙型肝炎、丙型肝炎和丁型肝炎。在该实例中， 可以看出，即使对于如丙型肝炎病毒而言的慢性感染，HCV-特异性dlgA在感染后仅相对 短的时间内可检测，直到最后血液样品测试HCV为阴性后约100天，表明HCV-特异性dlgA 可为急性感染的标志物。在该分析中，有4/5(80%)的HCV-患者有可检测的HCV-特异性 dlgA时，对本领域技术人员显而易见的是，有多种方法能被用来增加用于检测急性-期HCV 的该分析的灵敏度，其在确定利用抗病毒药物或包含干扰素的药物治疗患者的最佳选择方 面是有用的。还显而易见的是，因为病毒-特异性dlgA存在于不同的疾病范围内，包括甲 型肝炎、戊型肝炎、丙型肝炎和肺结核，可以合理地推测出对于任何其他感染疾病，它是可 检测的，并且在预后和治疗方案中具有功用。
[0074] 图36提供了比较用于结合R/HpIgR或HpIgR的不同商购的抗体的数据的图示。对 本领域技术人员明显的是，存在很多针对pIgR(又被称为分泌组分或SC)的不同单克隆和 多克隆抗体，其可用于检测结合的plgR，从而在多种方法中检测抗原-特异性或总dlgA或 IgM。在本实例中，可以看出，一些可商购的抗体能用于该目的，其中重组表达的嵌合型R/ HpIgR或重组表达的人类HpIgR的连续稀释液包被在聚苯乙烯ELISA板上，然后使用小鼠 单克隆或绵羊多克隆抗体的连续稀释液检测，以及利用适当的抗_物种抗体检测。要注意 的是R/HpIgR以较高浓度存在，因此在本实验中没有分析信号的滴定，而用较低浓度存在 的HpIgR，抗体反应性的滴定揭示了市售的Abeam单克隆抗体17921与绵羊多克隆抗体大致 等效，而Abcaml7377和3924出现较低反应，针对SC的NordicImmunology单抗也是如此。 兔抗体为阴性对照，这些和其它抗体可以根据它们与游离plgR形式或者与已经结合dlgA 或plgM的plgR形式的结合来选择，由此满足R/HpIgR或HpIgR或其dlgA-结合相应的变 体的检测的目的需要。
[0075] 具体实施方案的描述
[0076] 在整个说明书和随后的权利要求书中，除非文中另有要求，词语"包含 (comprise) "及其变化形式如"包含（comprises) "和"包含（comprising) "，应被理解为意 味着包括阐明的整数或要素或方法步骤或者整数或要素或方法步骤的组，但是不排除任何 其它整数或要素或方法步骤或者整数或要素或方法步骤的组。
[0077] 所述"由…组成"是指包括，并限于，词组"由…组成"后的任何要素。因此，所述 词组"由…组成"表明所述列出的要素是必须的或强制的，并且没有其他要素可以存在。所 述"基本上由…组成"是指包括该词组后所列的任何要素，并限于不干扰或有助于本公开已 经指明的所列要素的活性或作用的其它要素。因此，所述词组"基本上由…组成"表明所列 要素是必须的或强制的，但是其它要素是可选的并且可以存在或可以不存在，这取决于它 们是否影响所列要素的活性或作用。
[0078] 如本文所用的，单数形式的"a"，"an"和〃the"包括其复数形式，除非本文另有清 楚的规定。
[0079] 核苷酸和氨基酸序列由序列标识号（SEQIDN0:)来提及。SEQIDNOs:数字上对 应于序列标识符<400>1(SEQIDN0:1)，〈400>2(SEQID勵:2)，等等。表1提供了序列标识 符的总结。序列表在说明书的最后提供。
[0080] 如文中所描述的，本公开内容提供了抗体捕获方法，其包括确定生物 样品中二聚 的或多聚的IgA(dlgA)的水平或存在。本发明的所述方法可通过仅检测dlgA的水平或存 在来实施，或者它可与确定一种或多种另外的抗体形式（例如，单体，二聚的，多聚的或五 聚的复合物）、种类（同种型）、或亚类（例如，dlgAl、dIgA2、SIgA2、等等）的水平或存在 的方案结合来实施用。一些实施方案中，利结合感兴趣的dlgA分子的特异性抗原来实施上 述方法。在其它实施方案中，可实施所述方法用以鉴定受试者中产生dlgA应答的感兴趣的 抗原，可以在来自受试者的样品中检测dlgA应答。在一些实施方案中，所述方法能够实现 诊断分析和治疗方案等的开发，用于评估黏膜表面和如肠道相关的淋巴组织（GALT)的相 关组织中分泌型IgA的应答。
[0081] 本申请的方法部分基于使用重组多聚Ig受体（plgR)在结合分析中以高灵敏度和 高特异性检测dlgA或IgM的能力。本申请的方法采用结合dlgA和IgM的重组pIgR或pIgR的重组变体，以及优先结合dlgA并且基本上不能结合IgM的重组plgR或plgR的变体。 [0082] 相应地，本申请说明书提供了抗体-捕获方法，其包括检测或捕获分泌性 dlgA(SIgA)的前提物，即dlgA。一些实施方案中，所述方法包括步骤（i)使来自受试者的 生物样品与重组多聚免疫球蛋白（Ig)受体或其dlgA-结合变体接触，其中所述plgR或变 体结合dlgA和IgM;或其中所述plgR或变体结合dlgA且基本上不能结合IgM，并且其中所 述plgR基本上不结合单体IgA，和步骤（ii)确定已经结合至plgR的dlgA的水平或存在。 一些实施方案中，步骤（ii)包括检测dlgA和plgR间的复合物或结合的dlgA和抗原间的 复合物。
[0083] 本文中提到的"生物样品"包括从受试者中获得的包含抗体的样品。该术语也包 括包含表达dlgA的细胞如杂交瘤细胞的样品，和包含从体外培养的细胞株中所表达的重 组dlgA的样品。来自受试者的生物样品包括血液和血清样品、其它体液、活组织标本等等。 优选血液和血清样品。提到的"抗原"包括蛋白质或传染原或蛋白质的部分或传染原的部 分，正如本领域所公知的。提到的"R/HpIgR"包括包含来自兔plgA序列或者来源于大鼠或 小鼠的类似dlgA-结合变体序列或其功能性（dlgA-结合）变体的免疫球蛋白结构域的嵌 合形式。因此，R包括源于兔、或小鼠、或大鼠的序列。
[0084] 可通过任何便利的方案确定dlgA或plgR或者dlgA和重组plgR间的复合物或者 重组dlgA和抗原间的复合物的存在或水平。
[0085] 多种多样的试验用于研宄、分析、开发并且临床上检测感兴趣的分析物。免疫测定 法是一种特别有用的分析形式，其利用抗体_抗原类型或蛋白质-蛋白质反应的特异性、强 度和多样性来分析样品并检测其中的特异性组分。多种免疫测定技术是可用的，如在wild D."TheImmunoassayHandbook^ 免疫测定手册）"自然出版集团（NaturePublishing Group), 2001.中所描述的那些。
[0086] 检测抗体复合物、抗原或抗体_配体复合物的方法为本领域所熟知。例如，酶联 免疫吸附法（ELISA)和放射免疫分析法（RIA)常规使用于实验室中。这些方法一般要求 一些实验室技术的技能水平。也已经开发出需要极少的技能并能快速进行的多种方法，其 因此适合于床旁护理或分析中检测针对特异性抗原的抗体。特别地，免疫层析或量油尺 (dipstick)酶联免疫吸附测定试剂盒已经开发用以分析多种传染原。
[0087] 特别考虑免疫层析设备，其包含如重组plgR的dlgA-结合试剂，并且还包含感兴 趣的抗原，如文中所描述的已鉴定为结合来自感染受试者或呈现黏膜免疫激活的受试者的dIgA〇
[0088] 试剂盒或免疫层析设备包括，例如，反向流动或侧向流动模式。
[0089] 在示例性的实施方案中，提供了用于评估来自受试者的生物样品的免疫状态的试 剂盒，其采用一种或多种感兴趣的抗原，后者由来自患有活动性感染或与黏膜免疫激活有 关的病症的受试者的dlgA所识别，并且采用plgR分子或其dlgA-结合变体作为dlgA-结 合试剂。一个优选的实施方案中，所述抗原不是TB抗原。
[0090] 一些实施方案中，所述试剂盒包括：
[0091] a)免疫图形设备，其包含可操作地连接到样品部分、测试部分和任选的对照部分 的多孔膜；并且还包含吸管部分、包含PlgR分子或其dlgA-结合变体的部分、包含感兴趣的 抗原或试剂的部分以及任选的偶联部分；和
[0092] b)用于使用所述免疫图形设备以检测样品中抗原特异性dlgA抗体存在的说明 书。
[0093] -个实施方案中，所述plgR或其dlgA-结合变体为HpIgR或R/HpIgR或其dlgA 结合变体。
[0094] 本申请的分析法可采用本领域已知的多种适合的检测标志物。一些实施方案中， 可利用检测标志物的可检测特性来检测所述检测标志物，并且利用可检测标志物的多种检 测方案为本领域普通技术人员所熟知的。一些实施方案中，所述检测标志物直接地或间接 地结合或以其他方式与感兴趣的抗原或传染原关联。其它实施方案中，dlgA结合试剂，如 plgA包含或被设计为与检测标志物相互作用。一些实施方案中，使用本领域已知的结合伴 侣诸如但不限于生物素：亲和素或者抗-生物素抗体：生物素，将检测标志物连接至抗原或 dlgA结合试剂。
[0095] 多聚免疫球蛋白受体（plgR)由PIGR基因编码并在黏膜上皮细胞中表达，在那里 它促进dlgA的摄取和SIgA的分泌。plgR有五个结合至dlgA(包括结合至其J链）的免疫 球蛋白样结构域，包括其J-链。plgR还结合五聚IgM。
[0096] 如本文中所确定的，使用重组人类多聚Ig受体和其部分和变体，以高灵敏度和高 特异性检测dlgA和IgM是可能的（参见图3)。一个特别的非限制性的实施方案中，显示利 用重组形式的多聚Ig受体，dlgA能被选择性地检测，所述重组形式的多聚Ig受体具有来 源于兔plgR的至少结构域1，例如，兔（结构域1)和人类（结构域2_5)pIgRs的嵌合体，或 具有来自兔PlgR的所有结构域的嵌合体。一些实施方案中，本文描述的重组PlgR被设计 为优先结合dIgA(±IgMIgM)，以及能够用于特异性地捕获dlgA(IgM)到固相上用于与感 兴趣的抗原反应（在这种情况下，所述PlgR不需要有相关的检测试剂），或可选择地用于检 测结合到固定在固相上的感兴趣的抗原的dIgA(±IgM)的存在，在这种情况下，可以利用 本领域熟知的方法，使用抗体或针对PIgR本身、或针对表位标签或引入到所述重组PIgR中 的其它位点的其它试剂可方便地检测所述PlgR。PlgR的另外优势是它在分析中显示非常 低的背景反应，与典型的基于抗体的检测试剂不同。
[0097] Roeetat,JImmunol162:6046-52, 1999描述了包含来源于兔的免疫球蛋白样 结构域1 0)1)和来源于优先结合dlgA超过IgM的人类plgR的D2-5的嵌合体plgR。然而， 他们没有公开或提示这种形式或任何其它PlgR变体用于检测或结合仅dlgA用于诊断目的 的用途或本文公开的重组plgR或dlgA结合变体的优势。用兔（大鼠或小鼠）D1取代人D1 提供了对dlgA的优先结合，但是也可以预期，D2-D5的任何一种或多种也可用兔序列代替 以产生优先结合dlgA的分子并且这些变体也包含在内。相应地，一些实施方案中，D1、D2、 D3、D4或D5中的任何一种或多种用兔、小鼠或大鼠的同系物替代。
[0098] -些实施方案中，所述重组plgR缺少跨膜结构域（ATM)。其它实施方案中，所 述重组plgR缺少胞浆结构域。一些实施方案中，所述重组plgR缺少TM结构域和胞浆结构 域（ACYT)。一些实施方案中，重组plgR包含在胞浆结构域的取代并提供了⑶4胞浆结构 域。考虑重组PlgR的多种形式，以及示例性的实施例在图4-7中被阐明，并在【附图说明】中 进一步描述。设计和测试具有理想水平的特异性dlgA的重组plgR的能力在图8中被图示 并在对图8的说明中进行了描述。
[0099] Phillips-Quagliataetal,JImmunol165:2544-2555, 2000 表明大鼠和小鼠都 主要地结合dlgA，但是对于小鼠而言存在一种在B细胞上表达的形式，其仅有单个氨基酸 的变化但是结合IgM和dlgA两者-以下引用自第2552页：
[0100] 尽管人类PlgR和T560小鼠plgR结合plgA和IgM，但是兔（44)和大鼠（47)肝细 胞PlgR仅很好地结合plgA并且不传送IgM到胆汁中。因为小鼠肝脏同样地传送plgA但 是不传送IgM到胆汁中（48, 49)，一般地假设小鼠肝细胞plgR类似于大鼠和兔plgR，很弱 地或者一点都不结合IgM。如果这是真的话，那么必须要解释小鼠肝细胞和T560pIgR之间 的不同，使得后者表现的更像人类PlgR。考虑到小鼠肝细胞和T560B细胞plgRs的氨基酸 序列是相同的，除了结构域2中Val到Ala的变化，上述不同最可能体现了plgR的有差别 的折叠或糖基化，很可能是后者。很容易想到的是，来自肝细胞的PlgR上大体积碳水化合 物能干扰IgM但是不干扰IgA的结合。此外，已经表明的是，与天然SC本身相比，人类SC 的去糖基化允许它以10倍高的效率抑制生物素化的天然SC结合pIgA，这表明人类pIgR的 一些碳水化合物部分实际上甚至可阻碍PlgA的结合。
[0101] 因此，在一些实施方案中，包括R/HpIgR的所述重组plgR的去糖基化变体用于提 高对dlgA的亲和力。一些实施方案中，这可通过在本领域已知的多糖缺陷细胞株诸如，例 如，多糖缺陷CH0细胞株中表达所述plgR来实现。
[0102] 在多个实施方案中，重组plgR包含跨膜结构域的缺失（ATM)，以允许重组蛋白 的便利分泌和作为诊断/预后/筛选试剂的易用性。
[0103] -些实施方案中，重组plgR包含异源检测结构域。
[0104] 多个检测结构域为本领域已知并且包含在本申请中。
[0105] -些实施方案中，重组plgR包含异源结合结构域。
[0106] 多个结合结构域为本领域已知并且包含在本申请中。
[0107] 其它实施方案中，所述重组PlgR结合到固体支持物。固体支持物包括板、孔、珠、 琼脂糖颗粒、硝化纤维条等等。
[0108] 一些实施方案中，重组PlgR产生于多糖缺陷细胞，如多糖缺陷CH0细胞中用以提 高相对于IgM对dlgA的优先结合。
[0109] -些实施方案中，重组plgR来源于灵长类如人类plgR并且包含至少一种来源于 非-灵长类如兔、小鼠、大鼠的免疫球蛋白样结构域。
[0110] 一些实施方案中，重组plgR包含在SEQIDN0:2,或SEQIDN0:4,或SEQIDN0:6， 或SEQIDNO: 12,或SEQIDNO: 14,或SEQIDNO: 16中所列的氨基酸序列，或其dlgA结合 部分或/和其dlgA结合变体。示例性变体包含与SEQIDNO: 2, 4, 6, 12, 14或16或其缺失 胞浆结构域的缺失变体中的一个至少70%的氨基酸序列同一性。
[0111] 变体包括缺失，取代和插入变体。本文示例的是一个或多个免疫球蛋白 结构域⑶发生变化的人源plgR。变体包括"部分"，其包括包含参考序列的约 50% ,60% ,70% ,80% ,85% ,90% ,95%的片段。来自低级哺乳动物如大鼠、小鼠或兔的 结构域的等同结构域取代。
[0112] 还考虑所列举的氨基酸序列的"变体"。变体分子被设计为保留修饰前的重组plgR 的dlgA结合功能活性或显示提高的活性。根据本发明的多肽变体可理性地，或通过已建立 的突变方法来鉴定（参见，例如，Watson,J.D.etal,"MolecularBiologyoftheGene", 第四版，Benjamin/Cummings,MenloPark,California, 1987)。随机突变方法不需要关于 待被突变的序列的先验信息。该方法具有以下优势：它评估基于它的功能的特定突变的有 利条件，因此不需要理解如何或为何产生的突变蛋白质采用特定的构象。事实上，目标基 因序列的随机突变已经是一种用于获得具有理想特性的突变蛋白的途径（Leatherbarrow R.，J.Prot.Eng.，7:7-16，1986;KnowlesJ.R.，Science，25:1252-1258，1987;Shaw W.V.，Biochem.J.，246: 1-17, 1987;GeritJ.A.，Chem.Rev.，#7: 1079-1105, 1987) 〇 可选择地，想得到特定的序列变异，可以采用定点突变基因的方法。因此，这样 的方法可以用来选择性地仅改变所述蛋白质中被认为重要的那些氨基酸（Craik C.S.，Science，228:29-297, 1985;Croninetal，Biochem.，27:4572-4579, 1988;Wilkset al，Science，22:1541-1544, 1988)。示例性的氨基酸影响所述重组plgR的糖基化。来自理 性地或已确立的突变方法或来自组合化学的多肽可以包含保守的氨基酸取代。本领域很好 理解的是，一些氨基酸可改变为有广泛相似特性的其它氨基酸，而不改变所述多肽的活性 特征（保守取代，参见表3)。
[0113] 变体plgR多肽包含与至少在免疫球蛋白样结构域区域的氨基酸序列至少50%的 序列同一性。
[0114] 如本文中所使用的术语"序列同一性"是指对比窗口上，在氨基酸对氨基酸的基 础上序列相同或功能上或结构上相似的程度。因此，"序列同一性百分比"的计算例如通过 比较对比窗口上的两个最佳对齐的序列，确定两个序列上出现相同的氨基酸残基（例如， Ala,Pro,Ser,Thr,Gly,Val,Leu,He,Phe,Tyr,Trp,Lys,Arg,His,Asp,Glu,Asn,Gin,Cys和 Met)的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以对比窗口中位置的总数 目（即，窗口的大小），并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。出于本发明的目 的，"序列同一性"将被理解为表示通过DNASIS计算机程序（Version2. 5ForWindows;可 以从位于美国加利福尼亚州南旧金山的Hitachi软件工程有限公司获得）并用在软件所附 的参考手册中所使用的标准缺省值所计算出的"匹配百分比"。类似的注解可用于序列相似 性中，其视为相同的、取代包括保守性取代。
[0115] 优选地，特定序列和参考序列（核苷酸或氨基酸）之间的相似性百分比为至少约 60 %或至少约70%或至少约80 %或至少约90 %或至少约95 %或以上，诸如至少约96%， 97%，98%，99%或更高。还考虑60%和100%之间的相似性或同一性百分比，如60,61，62， 63, 64, 65,66,67,68,69,70, 71，72, 73,74, 75,76,77,78,79, 80,81，82,83,84, 85,86,87， 88,89,90,91，92,93,94,95,96,97,98,99 或 100%。
[0116] 另一个实施方案中提供了由SEQIDN0:1，SEQIDN0:3,SEQIDN0:5,SEQID NO: 11，SEQIDNO: 13或SEQIDNO: 15中所列的核苷酸序列编码的重组plgR，或其dlgA-结 合且任选地IgM-非结合变体，与其具有至少60%核苷酸序列同一性，或与缺乏胞浆结构域 的其缺失变体具有至少60%的核苷酸序列同一性。
[0117] 在一些便利的实施方案中，重组plgR为包含至少一个来源于兔的免疫球蛋白样 结构域的人重组plgR变体。
[0118] 一些实施方案中，采用结合plgM和dlgA的（人）plgR。一些实施方案中，使用已 知的方案耗尽IgG和/或IgM，并且，如果IgM被耗尽，那么人plgR对于样品剩余物质中的 dlgA是选择性的。一些实施方案中，为了许多感染的诊断，优选检测dlgA和plgM两者-确 实文献中报道了IgA加IgM用于戊型肝炎的诊断，并且如本文所阐明的，存在一些样品用于 甲型肝炎或戊型肝炎的诊断，其中IgM或dlgA更强烈，这提示它们的组合检测是有用的。 然而这可使用，例如，抗-IgM和R/HpIgR的混合物来实现，可用HpIgR和R/HpIgR的混合物 (所以IgM不能竞争过dlgA)更便利地实现，或如果存在的HpIgR过量地超过IgM和dlgA 的总和，单独用HpIgR实现。提议使用相同试剂的两种变体是优选的 ，而不是一种抗体加一 种重组蛋白。特别地，PlgR比抗体有更好的热稳定，这是用于测试产品的优势。
[0119] 重组plgR的用途也是高度地有利的，尤其是因为该试剂在结合分析中表现了低 背景（与基于抗体的试剂相比至少低50%的背景），不同于大多数基于抗体的结合试剂。另 外，重组plgR表现出高的热稳定性。例如，冻干的重组plgR在重构前三周后于60°C下保留 50%活性并且45°C下100%的活性，其与同样条件下干燥的抗-IgM抗体活性的快速丧失形 成了有利的对比。
[0120] 在实施方案中，如果基本上只有dlgA(或IgM)待被检测，可采用重组人类plgR或 dlgA和IgM结合变体作为结合试剂，但是特异性地检测结合的dlgA(dlgAl或dIgA2)使用 抗_IgAl/IgA2来实现，在本实施方案中，IgM的存在不是问题。
[0121] 一些实施方案中，上述方法供在评估黏膜表面或相关的组织的病症或感染或对其 免疫的方法中使用。特异的抗原的示例性应用在包含附图10-22的附图和【附图说明】中描 述，并且本文中特别确考虑这些一般方案，以及对其的常规变异。
[0122] 示例性黏膜表面包括上下呼吸道、肠道和肠道相关的淋巴组织、生殖道和肝脏。
[0123] 示例性感染包括但不限于由细菌、病毒、寄生虫和其它传染性生物体介导的那些 感染。在某些实施方案中，传染原包括HIV、麻风病、梅毒、肝炎（例如，册￥、祖￥、11〇0、登革 病毒、麻瘆、风瘆等。
[0124] 示例性病症包括器官疾病，如呼吸道、肺、肠道、生殖道和肝脏。肠道病症包括溃疡 性结肠炎、克罗恩氏病、肠易激综合症、肠漏综合征等。
[0125] 所提到的"受试者"包括人类和多种哺乳动物或其它动物，包括野生的和饲养的动 物、宠物、昆虫和潜在的用于新发传染病的传播媒介。关于受试者，这些受试者可能患有感 染，它们可能已经暴露于感染或它们已经暴露于传染原。
[0126] -个实施方案中，图10为用于检测如人血清或血浆的样品中抗原_特异性dlgA 存在的一个优选实验方法的示意。重组R/HpIgR-cyto固定在ELISA板上，并与血清或其它 样品孵育。将二聚体IgA捕获在固相上，并洗涤后去掉其它样品组分（如没有被捕获的IgA 和IgG，左），通过抗原的连续加入检测抗原-特异性dlgA的存在，所述抗原是例如生物素 化的，或与针对抗原的生物素化的单克隆抗体以及链霉亲和素-HRP反应。通过这种方式， 通过与抗原-特异性dlgA反应固定的的任何抗原通过生物素-链霉亲和素相互作用或同 等的试剂产生信号。
[0127] 一个实施方案中，图11为用于检测血清中甲型肝炎病毒-特异性dlgA存在的一 个优选实验方法的示意图（右），与使用标准抗-IgM捕获的方法检测HAV-特异性IgM相比 (左）。
[0128] 一个实施方案中，图16为用于抗原-特异性dlgA(或IgM)的检测的第二优选方 法的示意图，其中抗原直接包被到ELISA板上（在该例中，戊型肝炎病毒（HEV)抗原）。将 血清样品施加于所述板上并且抗原-特异性抗体，包括IgM和dlgA，结合到所述抗原，然后 用抗-IgMHRP，或R/HpIgR和抗-人类SCHRP检测。最终洗涤后，用TMB底物或同等试剂 使信号产生。
[0129] 另一个实施方案中，图23提供了概括急性人类免疫缺陷（HIV)感染的致病结果的 模型，其引起肠道以及所述外周快速的CD4消耗，与肠道屏障功能的随后下降，肠道内容物 的渗漏和微生物易位的增加，引起免疫激活的增加，其促使发病和CD4T-细胞水平的进一 步下降（Brenchleyetal,NatMed12:. 1365-1371，2006)。对以下存在未满足的需求：用 于能够检测发病途径中这些步骤的一步或多步的简单标准化试验，以便对患者提供适当的 干预，只有⑶4测试法已经整合到用于HIV-感染患者的治疗标准中。检测肠道中⑶4的消 耗需要内窥镜检查；检测降低的肠道屏障功能需要复杂的糖应激研宄或其它方法；检测肠 道渗漏和微生物易位可以使用如血清中细菌LPS或16sRNA的标记物实现，但是结果是高度 变异可变的，部分由于个体之间肠道菌群的广泛变异性；免疫激活需要复杂的流式细胞方 案，这使仪器/操作者标准化是困难的。
[0130] 图24提供了与非病原SIV感染的正常低水平移位相比，由病原HIV或SIV感染诱 导的肠道渗漏的导致微生物易位增加的示意图。
[0131] 图25阐明了一个预期的微生物易位增加的后果为由于黏膜抗原暴露导致的IgA 应答增加的诱发。Frenchetal，JInfectDis. 200(B): 1212-1215, 2009 证实了随访 6 年 后HIV患者中IgA的总水平确实与经历高效抗逆转录病毒治疗的患者的CD4T-细胞的水平 呈负相关，这表明即使在用目前最有效的抗病毒治疗的患者中，微生物易位有助于发病。然 而这些结果也说明总IgA在个体之间是高度可变的，并且不提供可以用在各个患者的管理 中的预后标志物。
[0132] 图26提供了与非病原SIV感染的正常低水平移位相比，由病原HIV或SIV感染 诱导的肠道渗漏导致的微生物易位增加的示意图，表明血浆部分中的二聚体IgA和分泌型 IgA水平的预期效果。在正常条件或非病原HIV感染下，维持了肠道屏障完整性，并且肠道 内腔SIgA的水平反应了固有层中它的前体物dlgA的量。只有极少量SIgA返回到血浆部 分，通过肠道M-细胞的主动运输，或少量的肠道渗漏。渗漏或主动运输的量可以通过将SIg A的血清/血浆浓度与它前体物dlgA的血清/血浆浓度进行比较，产生SIgA/dIgA的比值 来估算。在致病HIV或SIV感染，或其它导致肠道渗漏的生理应激的条件下，dlgA的总量 可能会稍微升高并且可引起较高水平的SIgA分泌到内腔。然而，由于通过受损肠道屏障的 被动渗漏，高得多比例的SIgA返回到血浆部分，导致升高的SIgA/dIgA比值。
[0133] 另一个实施方案中，本说明书提供了用于评估肠壁完整性的方法。一些实施方案 中，和本文所讨论的，该评估提供了用于HIV感染患者的预后标志物。一些实施方案中，所 述方法包括确定来自人类受试者的样品中SIgA和dlgA相对水平或比值。一些实施方案中， 所述方法包括步骤（i)使生物样品与重组多聚免疫球蛋白（Ig)受体（plgR)或其dlgA-结 合变体接触，其中所述plgR或变体结合dlgA和IgM;或其中所述plgR或变体结合dlgA并 且基本上不能结合IgM，以及其中所述plgR基本上不结合单体IgA或分泌型IgA，和步骤 (ii)确定已经结合到plgR的dlgA的水平或存在。一些实施方案中，步骤（ii)包括检测 dlgA和plgR之间的复合物，或结合的dlgA和基本上如本文所描述的抗原之间的复合物。 该实施方案的另一种表示中，本说明书考虑了确定用于评估HIV感染受试者的dlgA/SIgA 比值的方法。
[0134] 正常地，血浆中仅发现微量的分泌型IgA(SIgA)，但是在肠道屏障完整性受损的患 者中，本文提出的是，大部分SIgA渗过所述肠道屏障并且进入血浆。各个患者之间正常浓 度的SIgA不同，因为患者有广泛变化的SIgA前体物dlgA的水平。因此，同时测定dlgA和 SIgA两者的浓度，各个患者中SIgA与dlgA的比值提供肠道完整性/渗漏的测定是有用的。
[0135] 图27提供了能够用来测定不同IgA形式的相对含量以此估算SIgA/dIgA的比值 的几种典型分析中一个的示意图。在该实例中，通过使用R/HpIgR捕获dlgA来测定dlgA 的量，并使用针对IgAl、或IgA2,或针对这两种IgA亚类的单克隆抗体来检测。单体IgA不 结合plgR;SIgA结合R/HpIgR但是相比dlgA有较低的亲和力，并且如果需要，能通过3. 5M 尿素的洗涤去除。以同样的方式测定SIgA，但是使用抗-SC抗体捕获代替R/HpIgR。然后 将SIgA/dIgA比值计算为SIgA和dlgA分析反应的简单比值。
[0136] 如本实例所示，与患者血浆中dlgA相比，一部分感染有HIV的患者呈现升高的 SIgA的水平，与这些患者中升高的免疫激活标志物一致。另外的实施方案中，肠道渗漏能 通过检验个体1 84同种型来确定，因为1§42((11§42,51§42)代表约50%的产生于肠粘膜的 IgA，但是仅约10%的其它组织的IgA，从而SIgA2与dIgA2的比值很可能在个体患者中提 供非常敏感的肠道渗漏的测量。
[0137] 因此，在一些实施方案中，上述方法包括测定SIgA2和dIgA2的水平，并且确定 SIgA2与dIgA2的比值，其中相对于对照，所述比值指示肠道渗漏存在或不存在或肠道渗漏 程度。一些实施方案中，该比值提供了用于HIV感染的患者的标志物，从而潜在地便于改进 受试者HIV感染的管理。这些分析是简单的，并且具有用于高通量的潜能作为用于整合入 定量的床旁检测设备的潜力。
[0138] 因为plgR和dlgA间的反应不仅在哺乳类动物间而且在所有脊椎物种间高度地保 守，提出的是，该方法具有用于检测dlgA，以及IgM的功用，当需要时，在多种不同物种中， 提供便利的和通用的试剂用于检测如蝙蝠和其它野生的或饲养的动物物种中免疫激活或 dlgA和/或IgM的应答，对于它们而言，可能没有可用的抗-免疫球蛋白试剂。该方法在诊 断饲养动物中农业感兴趣的疾病中是有用的，以及对于新发传染病，用于诊断疾病和检测 储存宿主。
[0139] 本发明提供了plgR的重组表达形式和dlgA(±IgM)间的特异性相互作用的应用， 允许PlgR用于特异性结合或检测固相表面的dIgA(±IgM)或其它理想的分析组分。
[0140] 一个实施方案中，本文所描述的方法和/或如本文所描述的重组plgR或其变体被 许可供在抗原筛选或抗体选择和纯化中使用。
[0141] 根据本文所述的诊断或预后测试的结果，考虑治疗方案。
[0142] 一些实施方案中，方法还包括：（i)使用本文所描述的方法产生数据；(b)将所述 数据转化为计算机-可读形式；并且（C)操作计算机执行一种算法，其中所述算法确定作计 算机-可读数据和指示疾病或病症诊断的数据之间的拟合接近度。一些实施方案中，所述 算法包含人工智能程序，如模糊逻辑，聚类分析或神经网络。本申请方法也可用在病理平台 的管理中的个体化或群体的医药途径中。
[0143] 本公开内容提供了计算机程序和硬件，用于诊断一旦感染的受试者，随着时间的 过去或对治疗或其它影响物的应答。数值分配到复合层，其存储于机器可读存储介质中。计 算机程序产品为一种如下的产品：能够转化这样的数值为编码并且存储所述编码到计算机 可读介质中，并且任选地能够评估所述存储数据和输入数据之间的关系，并且任选地评估 潜在的TB状态和/或肺炎的知识数据库。
[0144] 因此本说明书提供了基于Web的系统，其中复合层上的数据由客户端提供到中心 服务器，其分析并与对照相比较并且任选地考虑其它信息如患者年龄、性别、体重和其它医 疗病患，并且从而提供诊断报告。
[0145] 因此分析可以以试剂盒的形式或基于计算机的系统，其包含需要的试剂以形成并 检测本文中所描述的抗体复合物，以及包含计算机硬件和/或包括算法的软件以促进报告 的确定和传送给临床医生。
[0146] 本发明考虑允许使用者确定关于TB受试者状态的方法，所述方法包括：
[0147] (a)通过通信网络从使用者处接受来自如本文所描述的方法的实施的数据；
[0148] (b)通过多变量分析处理受试者数据以提供诊断指标值；
[0149] (c)根据所述指标值与预定值的比较确定所述受试者的状态；并且
[0150] (d)通过所述通信网络将所述受试者状态的指示传送给使用者。
[0151] 便利地，所述方法一般还包括：
[0152] (a)使使用者使用远端站确定数据；并且
[0153] (b)通过通信网络将数据从所述终端站传送到基站。
[0154] 如本文中所用的，当提及抗原-结合分子时，术语"特异地结合"等类似术语指以 下结合反应：在异源蛋白群体和其它生物制剂存在下确定抗原存在的结合反应。因此，在 指定的免疫试验的条件下，指明的抗原_结合分子结合特定的抗原并且不大量结合样品中 存在的其它蛋白或抗原。在这样的条件下，与抗原的特异性结合可能需要基于其对特定的 抗原的特异性而选择的抗原-结合分子。例如，可以产生对于选定的蛋白抗原的抗原-结 合分子，其结合选定的蛋白抗原但是不结合样品中存在的其它蛋白质。可以利用多种免 疫分析模式来选择与特定蛋白特异性地免疫-相互作用的抗原-结合分子。例如，固相 ELISA免疫试验常规地用于选择与蛋白质特异性地免疫-相互作用的单克隆抗体。对于能 被用来确定特异的免疫反应的免疫分析模式和条件的说明，参见HarlowandLane(1988) Antibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPublications，NewYork〇
[0155]例如，特异性的识别由一抗（多克隆或单克隆的）提供并且二级检测系统用来检 测所述一抗的存在（或结合）。可检测的标签能偶联到二抗上，如荧光标签，放射标签，或产 生可量化的产物，例如有色产物的酶（例如，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶）。另一合适的方 法中，一抗本身能被可检测地标记。例如，蛋白质-特异性单克隆抗体，既能被用作免疫吸 附剂，又能作为酶标探针以检测和定量本申请方法或试剂盒中所形成的复合物。
[0156] 样品中存在的这样蛋白质的量能通过利用线性回归计算机算法参考标准或参考 制剂中存在的量来计算（参见Lacobillietal, (1988)BreastCancerResearchand Treatment11:19-30)。其它实施方案中，采用对感兴趣的蛋白质的两种不同的单克隆抗 体，一种作为免疫吸附剂和另一种作为酶标探针。
[0157] 实施例中所示例的分析以ELISA模式完成，每孔有单个抗原，每一单抗体形式或 种类或同种型。然而存在它们能合并为单一分析的熟知的方法，例如使用Liminx珠或类似 的方法，其中多种单独抗原包被在珠子上，其具有能用仪器辨别的不同的荧光标记强度，并 且每个珠子上结合抗原的抗体的量能分别地从所述单个样品中测定。相似地，Luminex珠 能包被有抗体或其它试剂以捕获来自样品的单独抗体形式或同种型，然后加入标记的一个 或多个抗原并且评估不同的同种型反应。这能在微阵列或其它阵列中完成。已确立有用的 ELISA参数后，将这些结果传送到多重模式中是常规的。在横向流和其它床旁检测设备中， 如果样品流经膜，很容易得到分离的抗原，其呈现在膜上为分开的条带或点，然后共同检测 一种或多种同种型的抗体；或者得到用于所述抗体同种型的不同的捕获抗体，然后检测结 合到每个固定的抗体条带或点上的（标记的）抗原。后者的方法（同种型捕获，通过固定 的患者抗体结合的标签抗原的检测）为最优选的方法。
[0158] 此外，蛋白质捕获阵列领域的最新发展允许大量蛋白质的同时检测和/或定量。 例如，过滤膜上的低密度蛋白质阵列，如通用的蛋白质阵列系统（Ge(2000)NucleicAcids Res. 28(2) :e3)使用标准的ELISA技术和扫描电荷耦合装置（CCD)检测器允许成像阵列的 抗原。还已经发展了免疫-传感器阵列，其实现了临床分析物的同时检测。目前使用蛋白 质阵列，用以表征体液中，如健康或疾病受试者、以及药物治疗前后的受试者的血清中蛋白 质的表达是可能的。
[0159] 蛋白质捕获阵列通常包括多个蛋白质捕获试剂，每个捕获试剂界定了所述阵列 的空间上不同的特征。蛋白质捕获试剂可以为任何分子或分子复合物，其有结合蛋白质 的能力并且使它固定到阵列上的蛋白质捕获试剂的位点上。所述蛋白质捕获试剂可为 蛋白质，在细胞中其天然功能为特异性地结合另一蛋白质，如抗体或受体。可选地，所述 蛋白质捕获试剂可代替为部分地或完全地合成的或重组的蛋白质，其特异性地结合蛋白 质。可选地，所述蛋白质捕获试剂可为蛋白质，其通过对特异的蛋白质或靶肽的结合亲和 力已经从诱变处理的、随机化的、或完全随机的和合成的库中体外筛选出来。所使用的筛 选方法可任选地为展示方法，如本领域已知的，如核糖体展示技术或噬菌体展示技术。可 选地，通过体外筛选获得的蛋白质捕获试剂可为特异性地结合蛋白靶标的DNA或RNA适体 (参见，例如，Potyrailoetal.，（1998)Anal.Chem.70:3419_3425;Cohenetal.(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:14272-14277 ；Fukuda,etal. (1997)NucleicAcidsSymp. S er. 37:237-238;availablefromSomaLogic)。例如，适体通过Selex?方法选自寡核昔酸 库，并且它们与蛋白质的相互作用能通过共价结合提高，凭借溴化脱氧尿苷和UV-激活交 联的合并（photoaptamers)。适体具有通过自动化寡核苷酸合成的简便生产性以及DNA的 稳定性和强健性的优势。通用荧光蛋白染色能用来检测结合。可选地，所述体外筛选的蛋 白质捕获试剂可为多肽（例如，抗原）（参见，例如1?<^61^8 3]1(15208丨31^(1997)?1'0〇.似1：1. AcadSci.USA94:12297-12302)。
[0160] 捕获分子阵列的可替代选择通过"分子印迹"技术产生，其中肽类（例如，来 自蛋白质的C-端区）用作模板使在可聚合的矩阵上产生结构互补、序列-特异的腔； 所述腔然后能特异性地捕获含有适当的一级氨基酸序列的（变性）蛋白质（例如可从ProteinPrint?andAspiraBiosystems处或获得）。
[0161]例示性蛋白质捕获阵列包括包含空间地寻址的TB抗原或抗体结合试剂的阵列， 其能便于众多抗原和抗体的大量的平行分析。这样的阵列已经显示具有所要求的特异性 和可接受的背景的特性，并且一些可商业购买（例如，BDBiosciences,Clontech,BioRad andSigma)。用于制备阵列的多种方法已经被报道（参见，例如Lopezetal. (2003) J.Chromatogr.B787:19-27 ；Cahi11(2000)TrendsinBiotechnology7:47-51 ；U.S.Pat. App.Pub. 2002/0055186 ;U.S.Pat.App.Pub. 2003/0003599;PCT公开TO03/062444;PCT公 开TO03/077851;PCT公开W0 02/59601;PCT公开W0 02/39120;PCT公开W0 01/79849; PCT公开TO99/39210)。
[0162] 免疫球蛋白抗原-结合分子通过传统免疫法（例如，多克隆血清和杂交瘤）制备， 或者从噬菌体展示技术或核糖体展示文库库中筛选后，作为重组片段，通常表达于大肠杆 菌中（可从CambridgeAntibodyTechnology,Biolnvent,AffitechandBiosite获得）。 可选地，包含VH和VL结构域的非-共价结合的'组合抗体（combibodies) '，能从产生双体 细菌克隆（例如，可从Domantis获得）的组合所建立的矩阵模式中产生。作为蛋白质-捕 获试剂使用的例示性抗原-结合分子包括单克隆抗体，多克隆抗体，Fv，Fab，Fab'和F(ab'）^ 免疫球蛋白片段，合成的稳定的Fv片段，例如，单链Fv片段（scFv)，二硫键稳定的Fv片段 (dsFv)，单可变区结构域（dAbs)微抗，组合抗体和多价抗体如双体和多-scFv，来自骆蛇科 或改造的人类等同物的单域抗体。
[0163] 单独的空间上不同的蛋白质捕获试剂通常附在支持物表面，其一般为平面的或波 状外形的。常见的物理支持物包括载玻片，硅，微孔，硝化纤维或PVDF膜，以及磁珠和其它 磁珠。
[0164] 当递送到平面表面的蛋白质微滴被广泛地应用时，相关的可替代结构包括基于微 流体发展的CD离心设备（可从Gyros购买）和专业的芯片设计，如板中设计的微通道（The LivingChip?,可从Biotrove处购买）和娃表面的微小3D柱（例如，可从Zyomyx购买）。
[0165] 悬浮颗粒也能用作阵列的基础，如果它们被编码用于识别的话；系统包括用于微 珠的彩色编码（例如，可从Luminex,Bio-Rad和NanomicsBiosystems购买）和半导体纳 米晶体（例如，QDots?,可从QuantumDots处购买），以及珠条形码（UltraPlex?,可从 Smartbeads购买）和多金属微棒（Nanobarcodes?颗粒，可从Surromed处购买）。珠子也 能被装配到半导体芯片（例如，可从LEAPStechnologyandBioArraySolutions购买） 的平面阵列上。如果使用颗粒，单独的蛋白质捕获试剂通常附在单独颗粒上以提供阵列的 空间分辨率或分离。然后可分别地分析颗粒，但是用并行的分隔的方式，例如在微量滴定板 的孔或分开的试管中。
[0166] 在操作中，在适合蛋白质或肽结合的条件下，将蛋白质样品（参见，例如U.S.Pat. App.Pub. 2002/0055186)递送到蛋白质-捕获阵列上，并且洗涤所述阵列，以从所述阵列上 去除未结合的或非特异结合的样品中的组分。其次，结合至阵列的每个特征的蛋白质或肽 的存在或量使用适当的检测系统来检测。相对于结合所述阵列的第二特征的第二蛋白质的 量，可确定结合所述阵列的特征的蛋白质的量。某些实施方案中，样品中第二种或随后的蛋 白质的量为已经已知的或已知不变的。
[0167] 一个说明性实例中，荧光标记能用于检测结合至阵列的蛋白质。阅读DNA微阵列 中所使用的相同仪器方法对蛋白质捕获试验是可用的。对于差别显示，捕获阵列（例如， 抗体阵列）能用荧光标记蛋白形式探测或用不同的荧光团（例如，Cy-3和Cy-5)标记并且 混合，这样所述颜色充当了靶丰度变化的读出器。荧光读出敏感性能通过酪胺信号放大术 (TSA)(例如，可从PerkinElmerLifesciences购买）扩增10-100倍。平面波导技术（例 如，可从Zeptosens购买）实现超灵敏的荧光检测，具有无冲洗程序的额外优势。高灵敏性 也能通过悬浮珠和颗粒来实现，利用藻红蛋白（可从Luminex购买）作为标记或半导体纳 米晶体（可从QuantumDot购买）的性能。荧光能量共振转移已经适应于检测未标记配体 的结合，其在阵列上是有用的（例如，可从Affibody购买）。已经发展了一些可选的读出 器，包括适配的表面等离子体共振（例如，可从HTSBiosystems和IntrinsicBioprobes 购买），滚环DNA扩增（可从MolecularStaging购买），质谱分析法（例如，可从Sense Proteomic,Ciphergen,Intrinsic和Bioprobes购买），共振光散射（例如，可从Genicon Sciences购买）和原子力显微技术（例如，可从BioForceLaboratories购买）。用于自 动化的样品与载玻片上的阵列孵育以及冲洗的微流体系统已经由NextGen和PerkinElmer LifeSciences共同开发。
[0168] 在某些实施方案中，用于检测dlgA或其它预选产物所使用的技术包括内标或外 标以允许这些产物的定量或半定量测定，从而实现生物样品中这些表达产物的水平或功能 活性与参考样品或样品中相应表达产物的有效比较。这样的标准通过有技能的操作者使用 标准方案来确定。特定的实施例中，确定了各个表达产物的水平或功能活性的绝对值。对 照可包括-个人和群体对照和来自诊断测试的样品-较早的时间点。
[0169] 特定的实施方案中，所述诊断方法使用公开的系统实施，例如国际公布申请号W0 02/090579和提交于2003年11月14日的共同审理中的PCT申请No.PCT/AU03/01517,所 述系统包含至少一个与基站连接的终端站。当收集预定的数据时，基站通常与一个或多个 数据库连接，所述数据库包含来自许多个体的预定数据，代表TB抗原特异性抗体和它们同 种型结构（二聚的/多聚的）或亚型的水平。在操作中，所述基站适合于从所述终端站，通 常通过通信网络，接收受试者数据，并且将所述受试者数据与储存在数据库中的预定数据 进行比较，所述受试者数据代表从测试受试者获得的生物样品中至少一种抗体类型的测定 的或正常化的水平。将所述受试者和预定数据相比较允许基站根据比较的结果确定所述受 试者的状态。这样，基站尝试鉴定具有与所述测试受试者相似参数值的个体，并且一旦基于 该鉴定确定了状态，所述基站提供给终端站诊断的指示。一个实施方案中，分许可重组plgR 在TB抗原筛选或TB血清学诊断中使用。
[0170] 本说明书的每个实施方案在细节上作必要的修改后，适用于所有其它实施方案 中，除非另有明确的规定。
[0171] 显然，功能上同等的方法和采用这样方法的试剂盒在本文所描述的发明范围内。
[0172] 本发明通过以下的非限制性实施例进一步描述。
[0173] 实施例1
[0174]ELISA显示嵌合plgR对dlgA的结合优于IgM，但是人plgR对IgM的强结合
[0175] 如图8中所示，进行了ELISA比较HpIgR和R/HpIgR对人IgM和dlgA的结合，显 示了相对于对IgM，嵌合plgR对dlgA的优先结合，但是人plgR对IgM有强的结合。HpIgR 或R/HpIgR固定在96孔Nunc免疫板上于4°C过夜。将在PBS中纯化的人IgM或dlgA的稀 释液结合到固定的plgR形式上过夜。洗涤后，使用偶联辣根过氧化物酶（HRP)的抗-IgM 或抗-IgA以及比色底物TMB检测捕获的IgM或dlgA。本结果证实了HpIgR显示除结合 dlgA(绿色）外，还优先结合IgM(品红色），然而R/HpIgR显示对IgM的结合大大降低（黄 色）但是保留对dlgA的强结合（蓝色）。
[0176] 实施例2
[0177]ELISA显示利用R/HpIgR检测固定的dlgA，背景可忽略
[0178] 进行了ELISA以比较利用R/HpIgR对固定的dlgA的检测。纯化的dlgA或无 dlgA(空白对照）的稀释液固定在预先包被有抗-IgA的96孔Nunc免疫板上，以便使所述 dlgA通过抗体-抗原的相互作用而不是被动吸附结合到所述板上。使用R/HpIgR(〃无尾的 〃）或无PlgR(〃空白〃），抗-分泌组分和抗-小鼠HRP以及TMB底物检测dlgA。结果（参 见图9)证实R/HpIgR能够检测在最低测试浓度（31ng/mL)的dlgA，在ELISA中有强的信 号，背景可忽略。
[0179] 实施例3
[0180] ELISA显示在IgM捕获中HAV-特异性IgM的有效耗竭
[0181] 使用来自患有急性HAV感染的患者的血清的连续稀释液（AccurunHAV面板样品 121)，进行ELISA，显示了在IgM捕获中HAV-特异性IgM的检测。血清样品为稀释前未触动 过的（未触动过的，紫色）或使用Capture-SelectIgM(BAC)基本上耗竭IgM(红色）。结 果（参见图12)显示与未触动过的血清相比，该IgM耗竭方法降低了样品中HAV-特异性的 IgM的水平约256倍。
[0182] 实施例4
[0183]ELISA显示在个体患者中，相比IgM，甲型肝炎病毒-特异性dlgA的检测，有或没 有IgM的耗竭
[0184] 使用来自患有急性HAV感染的患者的血清的连续稀释液（AccurunHAV面板样品 121)，进行ELISA，显示了在R/HpIgR捕获中HAV-特异性dlgA的检测。血清样品为稀释前 未触动过的（未触动过的，紫色）或使用Capture-SelectIgM(BAC)基本上耗竭IgM(红 色）的。结果首先表明显示HAV-特异性dlgA的检测的获得的强信号，其次该信号为dlgA 而非IgM特异性的，因为与未触动过的血清相比，IgM耗竭方法基本上没有降低HAV-特异 性反应的水平，与用于IgM检测的图12中显示的结果形成对照。
[0185] 实施例5
[0186] 用于诊断急性HAV-感染的抗原-特异性dlgA的R/HpIgR捕获
[0187] 使用来自患有急性HAV感染的患者的血清的连续稀释液（AccurunHAV面板样品 121)，进行ELISA，显示了在R/HpIgR捕获中HAV-特异性dlgA的检测。血清样品为稀释前 未触动过（未触动过的，紫色）或使用Capture-SelectIgM(BAC)基本上耗竭IgM的（红 色）。结果（参见图13)首先显示证实HAV-特异性dlgA的检测的获得的强信号，其次该信 号为dlgA而非IgM特异性的，因为与未触动过的血清相比，IgM耗竭方法基本上没有降低 HAV-特异性反应的水平，与用于IgM检测的图12中显示的结果形成对照。
[0188] 使用来自患有或没有急性HAV感染的患者的血清（AccurunHAV面板，阳性的 (P0S)，低阳性的（LOWP0S)，或阴性的（NEG))，进行ELISA，显示在R/HpIgR捕获中HAV-特 异性dlgA的检测。结果（图14)显示在所有POS样品以及两个LOWPOS样品的一个中强 烈的HAV-特异性dlgA的检测，NEG样品中有最小化的背景反应，这证实抗原-特异性dlgA 的R/HpIgR捕获用于急性HAV感染诊断的效用。
[0189] 实施例6
[0190] 用于急性HEV感染诊断的R/HpIgR捕获和HpIgR捕获的效用
[0191] 使用来自患有或没有急性HEV感染的患者的血清，进行ELISA，显示了在R/HpIgR 捕获或HpIgR捕获中戊型肝炎病毒（HEV)-特异性dlgA的检测。图15的左边，显示个体 样品的ELISA0D，证实抗原-特异性dlgA的R/HpIgR捕获用于急性HEV感染诊断的效用， HpIgR捕获用于该目的的较低但仍然显著的效用，以及任一样品中可忽略的背景反应。图 15的右边，显示的是每个血清样品的连续稀释液的反应，确认用于急性HEV感染的诊断中 R/HpIgR捕获的效用和HpIgR捕获的较低效用。很可能的是，在这些实施例中HpIgR捕获的 较低效用是由于血清中相对于dlgA高得多的IgM的总浓度，这导致通过HpIgR捕获的仅低 比例的IgM为HEV特异性的。
[0192] 实施例7
[0193] 使用HEV感染患者说明抗原-特异性dlgA或IgM的检测
[0194]HEV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较。两种方法都能够检测到所有 HEV-感染的患者，有强的ELISA信号（图17)，与dlgA分析中对照（HEV-阴性）患者的极 低的背景，以及IgM分析中的低背景相比。显著地，一些样品显示较高的dlgA水平，与IgM 相比（样品J13,J7)，而其它样品显示较高的IgM水平，与dlgA相比（J4,J11)。这证明了 患者中dlgA和IgM的应答是独立的，并且建议了IgM和dlgA的合并检测在一些合适的分 析模式中可能是有用的。图17阐明了dlgA分析基本上无背景，而高度优化的商业化IgM 分析产生低的但是可检测的背景。
[0195] 使用未触动过的，或利用Capture-SelectIgM基本上耗竭了IgM，然后连续稀释 的血清，进行了ffiV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较。结果（图18)确认了所 述IgM分析对IgM是特异的，因为反应通过IgM耗竭被消除，而dlgA分析主要特异性针对 dlgA而不是IgM，因为反应仅轻微的受IgM耗竭的影响。
[0196] 使用未触动过的，或通过Capture-SelectIgM基本上耗竭了IgM的血清，实施了 ffiV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较。结果（图19)确认了IgM分析对IgM 是特异的，因为反应通过IgM耗竭被消除，然而所述dlgA分析主要特异性针对dlgA而不是 IgM，因为反应仅轻微地受IgM耗竭的影响。
[0197] 使用未触动过的，或通过Capture-SelectIgM基本上耗竭IgM的血清，实施了 ffiV-特异性dlgA相对于HEV-特异性IgM的比较。结果（图20)确认了IgM分析对IgM是 特异的，因为反应通过IgM耗竭被消除，而所述dlgA分析主要特异性针对dlgA而不是IgM， 因为反应仅轻微地受IgM耗竭的影响。当使用配对t检验比较耗竭前后的样品时，IgM耗 竭后dlgA活性的降低在统计上是显著的，但是当使用Mann-Whitney检验比较耗竭前后的 总样本集时是不显著的。
[0198] 实施例8
[0199] 小鼠dlgA的R/HpIgR捕获和检测
[0200] 实施了ELISA，表明R/HpIgR能用在小鼠二聚体IgA的捕获（A)和检测⑶中，对于 单体（人类）IgA有可忽略的背景反应。图21A纯化的小鼠IgA单克隆抗体3H1 (抗-HAV) 或纯化的单体人IgA的稀释液包被在板上并用R/HpIgR以及抗-SC抗体检测。B.R/HpIgR 包被在板上，并允许纯化的小鼠IgA单克隆抗体3H1或纯化的单体人IgA的稀释液结合过 夜，然后用抗-小鼠IgA或抗-人IgA检测。来自不同物种的IgA对人或兔plgR的结合是 本领域所公知的，这证实了文中所描述的新的plgR策略具有用于诊断其它物 种感染的效 用。
[0201] 实施了ELISA，显示R/HpIgR用于检测小鼠二聚IgA和人二聚IgA是同等有效的， 对单体人IgA有可忽略的背景反应。图22A.纯化的小鼠IgA单克隆抗体3H1 (抗-HAV)或 纯化的二聚体或单体人IgA的稀释液包被在板上并用R/HpIgR和抗-SC抗体检测。
[0202] 实施例9
[0203]HIV-感染的受试者中HIV发病的评估和SIgA/dIgA比值的效用的说明
[0204] 可以用于测定不同IgA形式的相对量以便估算SIgA/dIgA比值的几种典型分析中 的一个的示意图（参见图27)。在该实施例中，dlgA的量通过利用R/HpIgR捕获dlgA来测 定，并使用针对IgAl、或IgA2,或针对这两种IgA亚类的单克隆抗体检测。单体IgA不结合 plgR;SIgA结合R/HpIgR但是比dlgA有较低亲和力，并且如果需要，能通过3. 5M尿素的洗 涤被去除。用同样的方式测定SIgA但是使用抗-SC抗体捕获代替R/HpIgR。然后将SIgA/ dlgA比值计算为SIgA和dlgA的分析反应的简单比值。
[0205] 实施了ELISA，显示与大部分HIV-感染患者和所有对照受试者（品红色）相比， 在一部分HIV-感染患者中检测到显著升高的SIgA2/dIgA2(S/d)比值。用于升高的SIgA/ dlgA的分析截止值被设定为非-HIV对照受试者中SIgA/dIgA比值的平均值+3标准差， 并且7/30的HIV-感染受试者显示SIgA/dIgA比值高于该截止值。显著地，正常受试者中 SIgA/dIgA比值的范围小于单独的SIgA或dlgA的范围，因为dlgA作为SIgA前体物的作用 提供了对每个患者的正常化效应。
[0206] 实施了ELISA，显示了患者和对照血清中SIgA的总量（任意单位）。正常患者中 SIgA2量在11-倍范围变化，但是所有正常对照落入平均值+3标准差的截止内。HIV-感染 患者中SIgA2量在稍大范围（16倍）变化，但是只有2/30患者高于上述截止范围（参见 图29)。在HIV-感染的患者中，在图28中显示升高的SIgA2/dIgA2比值的那些患者用红 色标记指示（菱形，秩次为11，16, 19, 23, 24, 28和30)。能够看出的是，具有升高的SIgA2/ dIgA2比值的这些患者在遍及总SIgA2信号的大部分正常范围内存在，因此不能基于单独 的总SIgA2与正常对照相区分。这确认使用SIgA/dIgA比值的效用，因为作为SIgA前体物 的dlgA的作用提供了对每位患者的正常化效应。R/HpIgR系统提供了用于测定该值的效 用。
[0207] 图30说明了与图28和29中所显示的不同HIV-感染群体中，SIgA2/dIgA2比值 相对于免疫激活标志物⑶8+HLA-DR+⑶38+T-细胞的关联性。当总关联性低时，很明显的是 在该实验中的SIgA2/dIgA2比值>4的患者有升高的免疫激活标志物的水平（p〈0. 0001)。
[0208] 图31说明了在与图30相同的群体中，SIgAl/dIgAl比值相对于免疫激活标记， ⑶8+HLA-DR+⑶38+T-细胞的关联性。当总关联性再低于对于IgA2而言的总关联性时， 很明显的是在该实验中的SIgAl/dIgAl比值>10的患者有升高的免疫激活标志物的水平 (p〈0. 015)。关于IgAl的较低关联性和显著性的较高截止比（10对4)强调了特异性地测 定IgA2的价值，由于它的主要合成部位在肠道（肠道为SIgA渗漏的组织）中，有可能是肠 道渗漏和免疫激活的临床上相关的标志物。
[0209] 图32说明了与图30和31中相同的群体中SIgAl/dIgAl比值相对于SIgA2/dIgA2 比值的关联性。当SIgAl/dIgAl比值与SIgA2/dIgA2显著相关时，值得注意的是有一些患 者具有高度升高的SIgAl/dIgAl比值和相对低的SIgA2/dIgA2比值。这表明SIgA/dIgA比 值的计算中除了IgA2外，测定IgAl、或总IgA作为肠道渗漏和免疫激活的测量也可能存在 一些价值。
[0210] 本文中引用的每项专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用的方式以其整体 并入本文。
[0211] 对本领域技术人员来说显而易见的是，可以对本发明作出许多修饰而不超出本发 明的范围。
[0212] 表 1
[0213] 序列标识符概述
[0215]
[0216]表2
[0217] 氨基酸亚分类
[0219]
[0220] 表 3
[0221] 示例性和优选的氨基酸取代
[0223] 文献目录
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【主权项】
1. 抗体捕获方法，其包括：（i)获得包含抗体的生物样品，（ii)使所述生物样品与重组 plgR或dlgA-结合变体相接触，其中所述plgR或变体结合dlgA并形成plgR-dlgA复合物。2. 如权利要求1所述的方法，其还包括（iii)直接或间接地评估所述plgR-dlgA复合 物的水平或者PlgR-dlgA与感兴趣的抗原之间的复合物的水平。3. 如权利要求1或2所述的抗体捕获方法，其中所述plgR或dlgA-结合变体结合dlgA 并且基本上不结合IgM，或者其中所述plgR或变体结合dlgA和IgM。4. 如权利要求1-3中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述生物样品为血液样品或血 清样品。5. 如权利要求1-4中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述生物样品获自受试者。6. 如权利要求5所述的抗体捕获方法，其中所述受试者为人类或灵长类动物。7. 如权利要求5所述的抗体捕获方法，其中所述受试者是除灵长类或人类物种外的哺 乳动物或禽类动物物种。8. 如权利要求1-7中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述plgR为重组HpIgA或 RpIgR09. 如权利要求1-7中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述重组plgR或dlgA-结合变 体的跨膜结构域和/或胞浆结构域缺失。10. 如权利要求1-9中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述重组plgR包含异源检测 或结合结构域。11. 如利要求1-10中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述重组PlgR或IgA-结合变 体在多糖缺陷细胞中重组产生。12. 如权利要求1-11中任一项所述的抗体捕获方法，其中将所述重组plgR结合到固体 支持物。13. 如权利要求1-12中任一项所述的抗体捕获方法，其中所述生物样品在用于所述方 法之前被耗竭IgM或dlgA抗体。14. 如权利要求2-13中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的抗原为传染原抗原或者 与侵袭黏膜表面或相关组织的受试者病症相关的抗原。15. 如权利要求13所述的方法，其中所述传染原选自HIV，麻风、梅毒、肝炎、登革病毒、 麻瘆和风瘆。16. 如权利要求1-14中任一项所述的方法，其还包括使所述生物样品与抗-SC结合剂 或抗-SC抗体相接触，其中所述抗-SC-结合剂或抗-SC抗体结合SIgA并形成SIgA-结合 剂/抗体复合物。17. 如权利要求1-14中任一项所述的方法，其还包括使包含所述plgR-dlgA复合物的 样品与变性溶液相接触以去除来自所述复合物的任何SIgA，以及测定生物样品中SIgA和 dlgA的比值。18. 用于确定测试受试者肠壁完整性的抗体捕获方法，所述方法包括：（i)获得来自所 述测试受试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述生物样品与重组PlgR或dlgA-结合变 体相接触，其中所述PlgR或变体结合dlgA并形成plgR-dlgA复合物，和（iii)使所述生物 样品与特异性抗-SIgA结合剂或抗-SC结合剂/抗体相接触，其中所述抗-SIgA-结合剂或 抗-SC结合剂/抗体结合SIgA并且形成SIgA-结合剂/抗体复合物，以及（iv)测定并比较 (ii)中形成的所述复合物的水平与（iii)中形成的所述复合物的水平，其中SIgA与dlgA的比值与来自对照受试者的相应水平或比值相比较，并提供肠道完整性/渗漏的测定。19. 如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中确定SIgA2/dIgA2和/或SIgAl/ dlgAl的水平或比值。20. 抗体捕获方法，其包括：（i)获得包含抗体的生物样品，（ii)使所述生物样品与重 组PlgR或dlgA或IgM-结合变体相接触，其中所述plgR或变体结合IgM和/或IgA并形 成PlgR-IgM和 / 或plgR-dlgA复合物。21. 抗体捕获方法，其包括：（i)获得包含抗体的生物样品，（ii)使所述生物样品与重 组PlgR相接触，其中所述PlgR或变体结合IgM并形成plgR-IgM复合物。22. 用于检测受试者中抗原-特异性dlgA存在的方法，所述方法包括：（i)获得来自受 试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述样品与R/HpIgR和抗原相接触，以及（iii)测定 抗原-特异性dlgA的水平。23. 用于检测受试者中抗原-特异性IgM存在的方法，所述方法包括：（i)获得来自受 试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述样品与HpIgR和抗原相接触，以及（iii)测定抗 原-特异性IgM的水平。24. 用于检测受试者中抗原-特异性IgM和dlgA存在的方法，所述方法包括：（i)获 得来自受试者的包含抗体的生物样品，（ii)使所述样品与HpIgR和R/HpIgR以及抗原相接 触，以及（iii)测定抗原-特异性IgM和抗原-特异性dlgA的水平。25. 用于评估受试者免疫状态的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)免疫图形设备，其包含 可操作地连接到样品部分、测试部分，和任选的对照部分的多孔膜；并且还包含吸管部分、 包含重组PlgR分子或其dlgA-结合变体的部分，包含感兴趣的抗原部分和任选的偶联部 分；以及b)使用所述免疫图形设备检测样品中抗原特异性dlgA抗体存在的说明书。26. 如权利要求25所述的试剂盒，其中所述plgR为HpIgR和/或R/HpIgR。27. 如权利要求25或26所述的试剂盒，其中所述重组plgR或dlgA-结合变体的跨膜 结构域和/或胞浆结构域缺失。28. 如权利要求25-27中任一项所述的试剂盒，其中所述重组plgR包含异源检测或结 合结构域。29. 如权利要求25-28中任一项所述的试剂盒，其中所述重组plgR或IgA-结合变体在 多糖缺陷细胞中重组产生。30. 如权利要求25-29中任一项所述的试剂盒，其中将所述重组plgR结合到固体支持 物。31. 如权利要求25-30中任一项所述的试剂盒，其中所述感兴趣的抗原为传染原抗原 或者与侵袭黏膜表面或相关组织的受试者病症相关的抗原。32. 如权利要求31所述的试剂盒，其中所述传染原选自HIV，麻风，梅毒，肝炎，登革病 毒，麻瘆和风瘆。33. 如权利要求25-32中任一项所述的试剂盒，其还包含抗-SIgA结合剂/抗体或 抗-SC抗体，其中所述抗-SIgA结合剂/抗体或抗-SC抗体结合SIgA并形成SIgA-结合剂 /抗体复合物。34. 重组plgR，其用于捕获或检测dlgA和/或IgM，或者供捕获或检测dlgA和/或IgM35.权利要求34所述的重组plgR，其为R/HpIgR或HpIgR或者R/HpIgR或HpIgR的 dlgA和/或IgM结合变体。 使用。
【专利摘要】本申请描述了抗体捕获方法，包括(i)获得包含抗体的生物样品，(ii)使所述生物样品与重组pIgR或dIgA-结合变体接触，其中所述pIgR或变体结合dIgA并形成pIgR-dIgA复合物。所述方法还可包括(iii)直接地或间接地评估所述pIgR-dIgA复合物的水平或pIgR-dIgA与感兴趣的抗原之间的复合物的水平。还有一种确定测试受试者的肠壁完整性的抗体捕获方法，其中将所述SIgA与dIgA的水平或比值与来自对照受试者的相应的水平或比值进行比较。当用于捕获或检测dIgA和/或IgM或供捕获或检测dIgA和/或IgM使用时，本申请提供了体现所述方法和重组pIgR的试剂盒。
【IPC分类】G01N33/53, C12N15/12
【公开号】CN104903727
【申请号】CN201380069755
【发明人】大卫·安德鲁·安德森, 玛丽·路易斯·加西亚, 纳丁·卡梅尔·巴奈斯, 哈瑞雅赫·穆赫德·哈纳菲亚, 阿兰·李·兰迪
【申请人】马克法兰伯尼特医学研究与公共健康协会有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月8日
【公告号】EP2917731A1, US20150330993, WO2014071456A1
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