生物成像方法
生物成像方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于分析体外样本的方法和计算机程序产品。
[0002] 发明背景
[0003] 在很多环境中实施体外分析，以便识别生物样本如微生物、细胞和组织培养、细胞 或亚细胞提取物、以及纯化的分子。使不同物质的样本与它们通常的生物背景隔离且提供 可以使它们在其中生长的环境。通常以皮式培养皿的形式提供这种环境，为了使样本生长 将皮式培养皿放置到培养箱中。皮式培养皿通常包括促进样本生长的微生物学培养基。理 想情况下，适当培养基上的培育引起许多样本集落（colony)的生长。通常实施随后的集落 分析，以识别微生物和评估它们对抗菌剂的敏感性或抗性。
[0004] 例如，样本分析的重要部分是识别集落中的特定的微生物或细菌的能力。另外，还 可以基于样本中的微生物的生长和与应用于样本的任何药物的相互作用分析利用适当的 药物对细菌的处理。
[0005] 通过有资格的科学家对皮式培养皿的视觉分析实施许多初步分析。初步的视觉分 析十分有效，但是由于不同的微生物的形状、颜色、大小和形态的巨大多样性，易于出现可 能难以解释的人为误差和不一致性。然而，目测仍然是目前快速地识别微生物的最好的方 法之一。另外，因为许多生长是"随机的"，所以模拟微生物生长和找到适合于所说明的上述 多样性的自动化系统，并非易事。
[0006] 已知的培养箱可以包括窗口，可以通过该窗口观察样本，但是通常，将皮式培养皿 取出培养箱，实施视觉上的分析。初步的视觉分析涉及将皮式培养皿拿到光源前面识别集 落。然后，可以根据需要在具体的已识别的集落上实施更详细的化学和显微镜分析方法。
[0007] 在现有技术中已有生物扫描器，也就是，用于扫描或计数细菌菌落的设备。例如， US 2004/0101951和US 2010/0232660都公开了用于扫描生物生长平皿的生物扫描器，它 们具有不同的结构但是同样都具有生成平皿的图像和执行这些图像的分析，以便检测生 物生长的能力。然而，两者都利用提供正面照射或背面照射的单一光源。实际上，在US 2004/0101951和US 2010/0232660中都指出了，"某些生物生长平皿可能仅需要正面照射 或背面照射，但是不是需要两种照射"。这样的照射是基本的且不能提供足够好的品质的图 像以获得以有效的方式实施初步分析。
[0008] 存在某些现有技术系统，在所述系统中通过不同的颜色或波长的光照射皮式培养 皿中的样本，以便形成样本的图像。通过适当定向的照相机捕捉该图像。
[0009] FR2926820公开用于检测生物样本中的至少一种具体的微生物的方法，所述方法 包括，使培养基经受至少两种辐射的步骤，每一种辐射呈现特定的波长，以及其他步骤。优 选地，使用两种照射系统，每一种照射系统发出特定波长的辐射。更具体地，FR2926820的 图1显示明显的顶部照射和紫外线背光照射的组合。然后，将来自两种不同的照射的后来 的组合图像用于检测具体微生物的存在。
[0010] 同样地，已发表的日本专利申请，JP2010104301，描述用于检测微生物的方法，该 方法包括显像步骤，以便获取微生物在其上进行生长的培养基的图像和集落检测步骤，所 述方法也利用顶部照射和背光照射的组合。
[0011] 一旦获得了生物样本的图像，处理技术就可以用于增强图像。然而，存在许多与增 强生物样本的图像相关的问题。这些问题可能涉及下列方面：
[0012] -正在观察的集落的大小；
[0013]--个集落与另一个集落的接近程度；
[0014]-集落的颜色混合；
[0015] _皮式培养皿的性质；
[0016]-培养基的性质；
[0017] _其他。
[0018] 本发明的第一个问题涉及集落的邻近集落的确定，以便提供关于集落的检选过程 的指导。看来，需要确定集落周围的一个或多个隔离区。
[0019] 另一个问题涉及照射伪影的存在，如镜面反射，其起因于定向照射源的使用。看 来，存在解决位于生物样本的图像中的集落上的照射伪影的问题的另外的需求。
[0020] 考虑位于皮式培养皿的外围的集落，另外的问题涉及集落的数目的确定。看来，存 在改进生物样本的图像中的集落的计数方法的需要。
[0021] 本发明的目标
[0022] 本发明的目标是克服所提及的上述问题中的至少一些问题。
【发明内容】
[0023] 本发明提供如在随附权利要求中陈述的方法和计算机程序产品。
[0024] 根据本发明的第一方面，提供了用于定义细胞培养皿内感兴趣的对象周围的隔离 区的方法，方法包括下列步骤：
[0025]-利用多个照射源中的一个或多个获得细胞培养皿的一个或多个图像，每一个照 射源能够从不同的方向照射器皿；
[0026]-选择图像或图像的组合，用于进一步处理；
[0027]-应用圆形对象检测变换，以识别细胞培养皿中的一个或多个是大体上圆形的对 象的感兴趣的对象并确定感兴趣的对象的中心，其中感兴趣的圆形对象代表细胞培养皿中 隔离的集落；
[0028]-应用二值化步骤获得感兴趣的对象和其他对象的二值化图像，其中二值化图像 的中心对应于感兴趣的对象的中心；
[0029] _重复地形成半径不断增加的同心圆，其中同心圆以二值化图像的中心为中心；
[0030]-识别冠状物（corona)，其中通过具有连续的半径值的两个圆圈划定冠状物的界 限；
[0031]-对于每一个冠状物：
[0032]_确定位于冠状物中的任何其他对象的存在和位置，从而确定其他对象的存在和 位置；
[0033]-确定定义感兴趣的对象周围没有其他对象的角扇区（angularsector)的空隙 角（clearanceangle)，从而定义感兴趣的对象周围的隔离区。
[0034]优选地，方法还包括提供对象的检选模式（picking profile)，其中检选模式包括 与每一个冠状物和相应的空隙角相关的值。
[0035] 优选地，方法还包括利用检选模式联合用于检选过程的查找表确定用于与查找表 的具体的标准相关的集落的检选过程的可用性。
[0036] 提供了计算机程序产品，其包括用于引起可编程的数据处理装置执行根据本发明 的第一目标的方法的图像处理步骤，或服务上面提出的数据处理装置的指令。计算机程序 产品可以包括存储在机器可读的存储介质内的所述指令。
[0037] 根据本发明的第二个方面，提供了用于形成生物样本的改进的图像的方法，其中 图像包括像素，每一个像素具有第一像素值，方法包括下列步骤：
[0038]-利用数目为N的照射源照射生物样本；
[0039] _获取每一个不同的照射源下的生物样本的图像，以获得N幅图像；
[0040] -利用已获得的N幅图像确定N个像素值；
[0041]-基于N个像素值确定校正的像素值；
[0042]-对于每一个像素，利用校正的像素值代替第一像素值，以便获得生物样本的改进 的图像。
[0043] 优选地，方法还包括被均匀地布置在生物样本周围的照射源，照射源对于生物样 本具有相同的入射角。
[0044] 优选地，N幅图像包括与相应的颜色通道相关的N幅彩色图像或N幅黑白图像。
[0045] 优选地，校正值是N个像素值的中间值并且计算每一个颜色通道的中间值。
[0046] 提供了计算机程序产品，包括用于引起可编程的数据处理装置执行根据本发明的 第二目标的方法的图像处理步骤，或用于服务上面提到的数据处理装置的指令。计算机程 序产品可以包括存储在机器可读的存储介质内的所述指令。
[0047] 根据本发明的第三方面，提供了用于确定细胞培养皿的图像中的对象的数目的方 法，其中包括由对象和对象的组组成的元素，方法包括下列步骤：
[0048] _利用照射源的已确定的视图（view)获取细胞培养皿和各个元素的图像；
[0049]-应用二值化步骤获得图像的二值化版本，其中二值化图像包括内部二值化图像 和外部二值化图像，其中内部二值化图像对应于细胞培养皿的内部部分，而外部二值化图 像对应于细胞培养皿的外部部分；
[0050]-确定每一个元素在二值化图像中的位置，以便确定组分是位于内部二值化图像 中还是位于外部二值化图像中；
[0051]-如果组分位于内部二值化图像中，则利用相应的第一像素值代替表示内部二值 化图像中的组分的图像的像素的像素值，以便获得第一合成图像；
[0052]-如果组分位于外部二值化图像中，则利用相应的第二像素值代替表示外部二值 化图像中的组分的图像的像素的像素值，以便获得第二合成图像；
[0053] _结合第一合成图像和第二合成图像，以便获得其中合成图像的像素值取决于像 素与对象边缘的接近程度的合成图像；
[0054] _将分割算法应用于合成图像，以便获得包括具有可分辨的边缘的对象的图像。
[0055] 优选地，二值化步骤包括内部二值化步骤和外部二值化步骤。
[0056] 优选地，外部二值化步骤包括应用形态关闭功能获得生成图像，其中确定的视图 是背光视图。
[0057] 优选地，将生成图像从第一颜色空间变换到第二颜色空间，即，如感觉更加均匀的 L、a、b颜色空间。
[0058] 优选地，通过利用元素的像素值确定元素的第一像素值，其中确定的视图是底部 环形视图。
[0059] 优选地，通过计算外部二值化图像的相应像距中的元素的像素值和生成图像中的 元素的像素值的平均值确定元素的第二像素值。
[0060] 优选地，分割算法是分水岭算法。
[0061] 提供了计算机程序产品，其包括用于引起可编程的数据处理装置执行根据本发明 的第三目标的方法的图像处理步骤，或用于服务上面提到的数据处理装置的指令。计算机 程序产品可以包括存储在机器可读的存储介质内的所述指令。
【附图说明】
[0062] 现在，通过实例，对附图进行参考，其中：
[0063]图1是根据本发明的一个方面的生物分析系统；
[0064]图2a、2b和2c是根据本发明的一个方面的、图1的系统的成像系统的示意图；[0065]图3是根据本发明的一个方面的、图2的系统的简化图，显示应用于样本的不同类 型的照射；
[0066] 图4a是根据本发明的一个方面的背光照射源的示意图；
[0067] 图4b是与垂直照射相关的漫射器的示意性的前视图和后视图表示。
[0068] 图4c是与环形照射相关的漫射器的示意性的前视图和后视图表示；
[0069]图5是根据本发明的一个方面的样本抽拉框和相关的近似水平的照射源的示意 图；
[0070] 图6是根据本发明的一个方面的环形照射源的示意图；
[0071] 图7是根据本发明的一个方面显示用于不同应用的不同的照射类型的表格；
[0072] 图8是根据本发明的一个方面显示用于与不同的图像处理技术相关的不同的培 养基的不同的 照射类型的表格；
[0073] 图9a是根据本发明的一个方面的第一图像增强技术的源图像；
[0074] 图9b是根据本发明的一个方面的使用第一图像增强技术之后的生成图像；
[0075] 图10是根据本发明的一个方面的图像处理技术的实例；
[0076] 图11是根据本发明的一个方面的标志检测的处理过程；
[0077] 图12a和12b是显示根据本发明的一个方面的图像处理技术的步骤的流程图；
[0078] 图13是显示根据本发明的一个方面的图像处理技术的步骤的流程图；
[0079] 图14是显示根据本发明的一个方面的用于改进检选方法的步骤的流程图；
[0080] 图15显不根据现有技术的查找表的实例；
[0081] 图16表示根据本发明的一个方面的、取决于距离集落的隔离距离和集落周围的 隔离角的集落的检选模式；
[0082] 图17显示根据现有技术的来自三种颜色通道的四种照射源的图像；
[0083] 图18是显示根据本发明的第二个方面的用于去除位于皮式培养皿中的集落的图 像上的照射伪影的方法的步骤的流程图；
[0084] 图19图示了根据本发明的第二个方面的四个不同的图像，每一个图像指的是不 同照射源的视图；
[0085] 图20显示了根据本发明的第二个方面利用图19的四个不同的图像产生的中间图 像；
[0086] 图21是显示根据本发明的第三个方面的用于计数皮式培养皿中的集落的方法的 步骤的流程图；
[0087] 图22表示根据本发明的第三个方面显示皮式培养皿的内半径和外半径的皮式培 养皿的图像；
[0088] 图23表示根据本发明的第三个方面的皮式培养皿的二值化图像；
[0089] 图24显示了根据本发明的第三个方面在应用形态学打开功能之后的二值化图 像；
[0090] 图25显示了根据本发明的第三个方面的内部二值化图像；
[0091] 图26显示了根据本发明的第三个方面的外部二值化图像；
[0092] 图27显示了根据本发明的第三个方面利用背光视图照射的第一生成图像；
[0093] 图28显示了根据本发明的第三个方面改善图27的第一生成图像的图像II;
[0094] 图29显示了根据本发明的第三个方面改善图27的第一生成图像的图像12;
[0095] 图30显示了根据本发明的第三个方面在处理涉及参数II和12的到Lab空间的 转换之后的组合的外部二值化图像；
[0096] 图31显示了根据本发明的第三个方面的皮式培养皿的合成图像；以及
[0097] 图32显示了根据本发明的第三个方面的用于计数集落的皮式培养皿的最终图 像。
【具体实施方式】
[0098] 本发明涉及用于以全自动或半自动的方式分析生物样品的方法。在本说明书中， 术语"对象"涉及实物如气泡或集落，术语"标志"涉及细胞培养皿如皮式培养皿的特征。例 如，标志可能涉及与序号或任何识别标志有关的伪影或墨点。术语"特点"涉及对象如集落 的特性。另外，术语"有盖培养皿"定义皮式培养皿和覆盖皮式培养皿的盖子的组装。
[0099] 如图1所示，系统100包括样本器皿库102、自动划线机器（automatic streaking machine) 104、智能培养箱系统106、处理单元108和识别系统110。
[0100] 样本库102人工地或自动地产生样本器皿，生物样本可以在该样本器皿内生长和 随后进行分析。样本器皿通常是皮式培养皿，但是也可以使用其他细胞培养皿。因此，此处 对皮式培养皿的引用不是旨在进行限制。
[0101] 样本器皿库将适当的培养基加入到培养皿内，使生物样本能够生长。可以依靠传 送带或其他的自动化系统将皮式培养皿从样本器皿库传送到处理过程的下一个阶段。可替 换地，可通过运算符将样本传到下一个阶段。
[0102] 自动划线机器104将生物样本应用于皮式培养皿，然后以已知的方式指定样本。 在皮式培养皿中，例如，利用具有长度大约等于培养皿的半径的梳齿（comb)应用样本。应 用梳齿，且随后执行操作以将生物样本散布在培养皿的表面上。适当的自动划线机器的实 例是由申请人以PREVI? Isola的商标名称进行了商用的自动划线机器。
[0103] -旦生物样本被分散在培养皿中的培养基上，就通过运算符人工地或依靠传送带 或其他自动化系统将培养皿传到处理过程的下一个阶段。
[0104] 智能培养箱系统106包括培养箱112和成像系统114。将皮式培养皿引入到培养 箱中，并在预定的温度下，将培养皿培育预定的时间。这能够使生物样本生长，在培养皿的 表面上产生微生物的许多集落。一旦按照要求将培养皿培育完毕，就将培养皿传到成像系 统114。总的来说，成像系统是用于整体生成系统中生成的集落和培养基的图像的新系统。 将在下面进一步描述成像系统的细节。
[0105]图像用于样本分析的第一阶段。这个阶段可以识别集落和生物样本的其他方面， 以便帮助和促进整个系统的其他的活动和功能。
[0106] 在产生培养皿的图像之后，然后将培养皿传到处理过程的下一个阶段。可以通过 传送带或其他自动化系统自动地或通过运算符人工地实施这个步骤。
[0107] 取决于所需的样本分析，处理单元108可以采用许多不同的形式。例如，可以基于 图像提取具体的集落，用于进一步的分析或处理。此时，可以将很多其他处理过程应用于培 养皿。如果必要的话，可以将培养皿放回到培养箱中，用于进一步生长和/或放回到成像系 统。
[0108] 在完成所有必须的处理和成像之后，可借助于人工处理或自动化处理将培养皿传 送到识别系统110。
[0109] 识别系统110可以被用于使用多种方法识别培养皿上以集落形式出现的微生物。 可以通过微生物的新陈代谢的分析实施识别，并且该识别可以是自动的或人工的。例如，可 以利用由申请人商业化的VITEK?系统实施自动化的分析。还可以利用质谱分析技术实 施识别。其他分析还可以包括检测抗菌药物耐药性机制。
[0110] 应该明白，可以改变整个系统的多个元件，以实施不同的功能。另外，可以以不同 的顺序实施某些步骤。
[0111] 如先前提到的，智能培养箱系统是本发明的重要方面且包括独特的成像系统。现 在将根据图2a、2b和2c更详细地描述成像系统。成像系统114包括底部单元202。底部 单元包括用于生成红色、绿色和蓝色背光照射的光学器件和控制线路。如图2b所示，底部 单元可以包括控制器，其可以是具有三个位置的机械轮的形式。这些位置对应于不同的照 射，分别是"无背景"、"白色背景"和"黑色背景"。"无背景"位置涉及机械轮中的圆孔150。 "白色背景"位置涉及机械轮中的白色背景圆160。"黑色背景"位置涉及机械轮中的黑色背 景圆170。取决于样本的性质，无背景用于背光，然而黑白背景用于所有其他类型的照射。
[0112] 在底部单元之上，有样本保持单元204。样本保持单元可以包括可以进进出出滑动 的抽拉框且包括适于支撑皮式培养皿的凹槽206。另外，如图2c所示，样本保持单元包括四 个红/绿/蓝水平照射源，分别是208、210、212和214。四个照射源以直线方式位于样本凹 槽周围且是可独立地控制的。在使用中，皮式培养皿的顶部大体上与四个水平照射源的顶 部成一条直线。水平照射源允许以水平或近似水平的光束照射皮式培养皿。
[0113] 应该注意，凹槽的底部是光学上能透射的，以便在使用中允许背光照射照射样本。 样本保持单元还包括操作四个水平照射源所需的光学器件和控制元件。
[0114] 样本保持单元可以包括可替换的定向（未示出），在该定向中通过传送带将样本 移动到用于成像的位置。抽拉框可以被具有样本保持区域的传送带系统代替，这些系统中 的每一个都是透明的，以允许使用背光照射。传送带系统可以将样本移动到适当的位置，然 后可以获取必需的图像。然后，传送带将下一个样本移动到用于成像的位置，同时第一个样 本被继续移动到处理的下一个阶段。这使得能够在不同的位置获取图像且同时移动样本。
[0115] 在另外的替换方式中，系统可以包括能够将皮式培养皿加载到样本架中或加载到 传送带上的机械臂。另外，机械臂可以在成像之前去除有盖培养皿的盖子和之后把盖子放 回原处。可以通过倒置有盖培养皿和引起盖子脱落完成这个动作。去除盖子确保盖子不会 在样本被某些照射源照射时产生反射。
[0116] 除了移动到成像区域和离开成像区域之外，样本保持单元还可以包括相对于正常 位置改变样本的位置的机制。例如，样本架或许能够使样本定位在相对于特定光束的特定 角度。也可以利用适当的机制实施其他运动，如样本的旋转。结果，可以通过移动样本保持 单元中的样本或移动照射源实现样本和照射源的任何相对移动。变化是持续的。
[0117] 当样本保持单元在正常位置时，如在成像系统中的机械轮上的水平位置时，可以 增加掩膜，以改进从皮式培养皿的内部获取的图像的质量。
[0118] 成像系统114还包括第一中间单元216,其位于样本保持单元上方。第一中间单元 包括四个以直线方式放置的红/绿/蓝照射源，分别是218、220、222和224。在使用中，使 照射源适合于在样本保持单元中的样本凹槽上产生环形照射，且每一个都可以独立控制。 可以调节环形照射，以便从任何适当的方向入射到样本上，包括侧面、非侧面或任何其他适 当的定向。
[0119] 如图2a所示，成像系统还包括第二中间单元226。第二中间单元包括四个以直线 方式放置的红/绿/蓝照射源，分别是228、230、232和234。照射源是可以各自独立控制， 而且向上直射并从上面的单元反射，以引起反向的环形照射，在使用中，该反向的环形照射 照射样本凹槽中的样本。
[0120] 成像系统的顶部单元236位于第二中间单元上方。顶部单元分别包括白光照射源 238、240、242、244、246、248、250 和 252,其中的四个显示为 238、240、242、244。各自可独立 控制。在使用中布置八个照射源，以便在样本凹槽上产生垂直照射。
[0121] 顶部单元还包括图像捕捉装置254,如照相机，其定向样本凹槽。来自任何一个单 元的照射源的任何组合的照射都可以指向样本凹槽。然后，图像捕捉装置可以捕捉被照射 的样本凹槽中的任何样本的图像。下面将更加详细地解释图像的应用和进一步的处理。
[0122] 顶部单元还可以包括用于操作多个光源的控制面板256。除了每一个单元中控制 它的功能的控制线路和光学器件之外，可能还有总体控制系统（未示出）。控制系统可以包 括计算机、显示单元、处理模块和图像增强算法、图像处理、以及任何其他的处理过程或技 术。
[0123] 控制系统可以用于控制用作专门应用的照射源。另外，对于不同的应用，控制系统 可应用不同的图像增强技术和图像处理。图像增强技术是增强图像的质量或使得专家可看 得见相关信息，以便观察或操作的方法和技术。下面将更加详细地描述的实例包括：照射伪 影的校正等。图像处理是来自图像的信息的提取，以便提供决策支持或自动 的决策。这不 一定包括图像的修饰，而是包括以自动化的方式确定更高级别的信息/解释。下面将更加 详细地描述的实例包括：培养皿边界的检测、照射伪影的检测、集落检选模式的确定、集落 的数目的确定、生长的检测（量、隔离的集落、群集现象）、生长/非生长的总体决策，等等。
[0124] 群集现象倾向于指示群集运动，其是整个固体或半固体表面上的细菌种群 的迅速的（2-10um/s)和协调的迀移。主要地在沙雷氏菌属（Serratia)、沙门氏菌 属（Salmonella)、气单胞菌属（Aeromonas)、芽孢杆菌属（Bacillus)、耶尔森菌属 (Yersinia)、假单胞菌属（Pseudomonas)、变形杆菌属（Proteus)、弧菌属（Vibrio)和埃希 氏菌属（Escherichia)中研宄这种类型的运动性。
[0125] 控制系统可用于实施成像系统的任何其他功能和/或控制操作。这些包括，但是 不限于：
[0126] -将样本装载到样本凹槽，和卸载样本；
[0127]-检查和调整样本在样本凹槽中的定位；
[0128]-控制亮度的水平；
[0129] _控制红/绿/蓝分量的平衡；
[0130]-控制曝光时间；
[0131]-控制照射组合；
[0132]_检验系统；
[0133]-校正系统；和
[0134]-以分析的应用和目的为基础的任何其他适当的控制。
[0135] 形成成像系统的单元的每一个能够相对于另一个单元移动。当这种情况发生时， 可能需要某些光学调整，以确保样本被所有的光源照射。
[0136] 现在，将根据图3更详细地描述成像系统的操作。
[0137] 图3显示成像系统114的示意图，演示多个照射源和它们如何影响位于成像系统 的样本300。样本300可被近似水平的光束302、304照射。除了通过参考标记302和304 说明的那些之外，近似水平的光束还包括进入夹持器的组分和离开夹持器的组分。由图2a 的样本保持单元204中的水平照射源产生近似水平的光束。也可以通过由图2a中的底部 单元202生成的背光光束306照射样本。
[0138] 环形光束308也可以照射样本300并由第一中间单元216产生。由第二中间单元 226产生的反向的环形光束310也可以照射样本。
[0139] 垂直光束312也可以照射样本且由顶部单元236中的照射源形成。
[0140] 垂直光束和背光照射在相对于皮式培养皿中的样本大体上垂直方向中应用照射。 因而，这些照射源的每一个的光轴也垂直于样本。近似水平的、环形和反向的环形照射不垂 直于皮式培养皿。同样地，这些光源的光轴不垂直于样本。非垂直光源相对于利用垂直光 源获得的那些图像，提供了不同范围的可替换的图像。在利用它们形成的任何图像中，这些 非垂直光源提供另外的和不同的光学特征。这确保改进的集落隔离和检测。
[0141]图3中显示并由图2a中的适当单元产生的照射源可以是任何优选类型的光源， 如在红色、绿色和蓝色（RGB)频率上运行的光发射二极管（LED);简单的白光光源；紫外线 (UV)光源或任何其他适当的辐射来源。例如，照射源可以包括322个LED，包括64个白色 LED、86个红色LED、86个绿色LED和86个蓝色LED。任何位置中的光源的数目可以不同于 此处显示和描述的数目。在每一个位置上，通过在各自单独的频率上运行的三个LED的三 元组提供RGB照射。对于不同的照射源，可能有不同的RGBLED的组合。例如，对于背光照 射，LED可能如图4a所示定向。借助于包括LED的特定的布置的特定的插件提供每一种类 型的照射。底部单元202借助于两个插件400和402产生背光光束306,每一个插件包括以 三元组布置的多个二极管。LED的每一个三元组404包括红色、绿色和蓝色LED。以406显 示样本的位置。总共有45个LED三元组位于每一个插件上且用于生成背光光束306。在每 一个三元组中，可以每次点亮红色、绿色和蓝色LED中的一个，以便产生一个接一个的彩色 照射。
[0142] 应该明白，可使用任何适当定向和适当数目的二极管代替上文描述的实例。另外， 可以选择和使用RGB LED的不同组合。
[0143] 另外，对于UV光源，借助于同时发光的两个插件提供UV照射。例如，每一个插件 包括500mA强度的UV LED。
[0144] 插件可以包括用于确定LED的温度和可能的像差的传感器，这样，如果可以预见 问题，可以在连续操作时将LED关掉几秒钟。如图4b所示，在插件400和402和凹槽中的 样本之间还可能存在漫射器。漫射器有助于阻止在生成图片中看到LED，且有助于使背景光 均匀。另外，漫射器吸收来自高功率LED的某些照射。当使用直接照射时，很短的曝光时间 可用于最小化由照相机造成的模糊相关的任何影响。
[0145] 图5显示位于样本保持单元204中的照射源，其产生近似水平光束302、304。有八 个插件，每一个分别覆盖边500、502、504和506的长度的一半。每一个插件携带8个RGB LED的三元组的阵列。可同时、独立地或以任何预定顺序控制照射源。八个插件形成样本抽 拉框机制的部分，其包括样本凹槽。可以针对不同大小的样本或皮式培养皿使用具有不同 大小的孔径510的光学上能透射的界面508。
[0146] 参考图6，第一中间单元216和第二中间单元226中的四个照射源中的每一个分别 包括四个插件600、602、604和606,每一个具有如图所示定向的10RGB LED的阵列608。这 些阵列产生了用于第一中间单元216的环形光束308和用于第二中间单元226的反向的环 形光束310。可以独立地控制每一个插件，以便分别或以组合方式运行。为了阻止来自样本 和培养基的不期望的反射，每一个插件配备有如图4c所示的漫射器。插件的每一个都可以 围绕轴旋转，其中之一如图6中的610所示，这样，可以确定环形光束的位置，以便优化样本 的照射。这种调整对于确保均匀的照射来说是必要的，而不用考虑中间单元相对于样本的 垂直位置。
[0147] 图6显示第一中间单元216的插件的位置。应该明白，第二中间单元226的那些 照射源将向上直射，且将相应地调整旋转。
[0148] 顶部单元236中的垂直照射源238、240、242、244、246、248、250和252，每一个都包 括白光光源，其中每一个光源都可独立控制，以便产生垂直光束312。
[0149] 图2a中的图像捕捉装置254适于从上面捕捉样本的图像。对于具有90mm直径的 皮式培养皿，将产生100mm 2的图像。在标准图像捕捉装置中，这通常等于2050像素2,但是 也可以使用其他像素大小，如2448*2050像素。另外，因为培养皿的高度通常是大约13mm， 取决于皮式培养皿中培养基的厚度，成像设备的景深是大约±6_。
[0150] 在上文提到的所有的照射的实例中，都通过成像设备254从上面捕捉样本的图 像。应该注意，照相机可在预定的时期获得连续的一组图像，以便测量集落的生长和其他 时间相关的影响。另外，对于其中正要测量集落生长发展等的某些应用，照相机可以是摄像 机。也可以通过借助于适当的传送带或机械臂使培养皿进入和离开成像系统的运动引起培 养皿的运动。
[0151] 照相机适于获得根据不同照射源的不同类型的图像。一系列图像可能是具体的应 用所需要的。具体过程包括利用特定的照射或照射的组合照射样本，随后获取使用相关的 照射的特定类型的图像，如单色、黑白、或RGB图像的步骤。接下来，利用不同类型的照射或 照射组合获取另外的图像且过程继续，直到获得了所有必需的图像。在过程中控制照相机， 以获取适当类型的图像。
[0152] 例如，照相机可以包括单色传感器和利用具有17幅图像每秒的最大速度的逐行 扫描C⑶技术。照相机可能具有12至24伏特DC的功率消耗。
[0153] 现在，将描述产生的图像和图像增强处理过程的更多细节。
[0154] 如先前提到的，可从多个不同的光源照射成像系统114中的样本，光源从不同的 方向到达样本。在照射样本之后，从上面获取样本的图像。每一种照射突显样本的不同的 方面。
[0155] 背光照射显不皮式培养皿的细节，包括它的基底上的任何标志、皮式培养皿的边 缘和盖的形式；以及样本中集落的布局和密度的详细的视图。这种照射提供可以隔离集落、 确定相似的集落（例如，a和0溶血种类）之间的差异且通常给出样本的内含物的视图 的信息。
[0156] 本发明中使用的照射的一种类型在生物成像领域中是唯一的。这是近似水平的光 束。在皮式培养皿上利用近似水平的光束意味着，光束穿过皮式培养皿的边缘和盖子且穿 过培养基。这引起光的吸收且在识别集落和集落的特征方面，预计不如其他方向的光束有 用。然而，情况并非如此。
[0157] 近似水平光束的使用增加了大量有价值的信息。即使在光束穿过皮式培养皿和培 养基的同时存在严重的照射吸收，这种情况也成立。随着近似水平光束与集落接触，就向图 像捕捉装置反射和/或折射光束。这导致清晰地显示集落的位置的图像。结果可能如图9a 所示。尽管这种图像是有用的，但是它包括使得集落识别非最佳的许多光学效果。例如，培 养基可能具有非均匀的表面，其在整个样本的颜色和对比度上有变化。同样，由于照射穿过 皮式培养皿的多个层，边缘包括严重的干涉。这使得难以识别样本的边缘的集落。具有边 缘照射校正技术的近似水平光束的应用可以在集落的识别和隔离中提供重要的优势。光源 和目标图像之间的明显对比是非常清晰的。通过利用本发明的边缘照射校正处理过程，用 户将具有更大的识别集落的机会。对于不透明的培养基来说，近似水平的照射是不合适的， 但是在透明和半透明的培养基中去除培养皿伪影和减少灰尘和絹印的影响是有用的。
[0158] 通过样本和它的内含物折射和反射近似水平照射，以便形成可以用于隔离和消除 伪影的图像。图像稍后也可用于确定集落对培养皿的百分比覆盖，以提供集落浓度的估计 和确定非透明的培养基上有生长或没有生长。
[0159] 环形照射朝向样本且通过培养基和已经形成的任何集落反射或折射给图像捕捉 装置。这种照射产生的图像的目的是使区别培养基和集落的颜色成为可能。识别颜色的可 能性经常是用于识别具体的微生物的重要的工具，因为某些微生物具有完全与众不同的着 色。总体结果是最接近于生物学家将期望看到的特定类型的微生物的视图，例如，其颜色、 集落的各个方面等的视图。这对于识别培养基和集落周围的着色的微妙变化来说是特别重 要的。另外，由环形照射产生的图像允许检测显色培养基中的细菌集落下面和周围的颜色 的微妙变化。
[0160] 侧面环形照射是只是光源218、220、222和224中的一个进行照射。这种照射产生 具有可用于识别轮廓和凸起的表面和纹理的具有阴影的图像。由于照射的方向，光源中的 每一个将引起不同的阴影效果。
[0161] 反向的环形照射从顶部单元反射到样本上。然后，样本将照射反射或折射给图像 捕捉装置。因而捕捉的图像给出样本中不同的集落的对比的细节。这种图像也可以提供颜 色信息。进一步地，这种图像可以提供纹理信息；集 落的外貌和颜色的细节；有关群集限制 的信息和关于集落的凸起表面的信息，如高度、形态和形状。
[0162] 反向的环形照射产生准垂直照射，其能够使梯度的变化可视化。这给出有关纹理 和粒度的信息，且可用于检测不具有很高的高度却具有表面不规则性的集落。在一个实施 方式中，利用反向的环形照射获取许多不同的图像且随后组合，以便处理图像的任何潜在 的饱和。
[0163] 垂直的照射源从上面照射样本。通过样本和集落反射照射，以给出提供详细的轮 廓信息的图像。这种图像可以用于识别样本的凸起的表面和集落的高度。然后，这种信息 可以用于识别特定类型的微生物，因为集落的凸起的表面的细节通常是非常特殊的。例如， 某些集落是圆顶状的，其他是崎岖不平的而另一些是平坦的。因而，垂直照射给出群集、气 泡、灰尘的检测等等的良好的视图。容易地产生集落表面和外貌的单色信息。
[0164] 由本发明提供的上述照射方向的变化提供了优势，因为很多不同类型的照射可以 用于获得样本中生长的集落的图像。多个图像可以用于识别不同的特征，且因此提供识别 这些特征的改进方法。
[0165] 如上文描述的，照射源和方向的每一个可以用于强调和增强不同的图像特征。在 不脱离本发明的范围的情况下，可以通过利用来自不同光源和方向的照射改变或调整所描 述的实例。
[0166] 此外，不同波长的照射可以用于不同的应用，例如，用于红外线和紫外线。
[0167] 本发明的应用之一是根据照射源的组合形成图像，以便生成合成图像。
[0168] 底部环形视图涉及在不同位置，也就是，在前面、后面、左边和右边，且与皮式培养 皿成相同仰角的四个照射源。
[0169] 成像系统114利用各自不同的照射源同时地照射皮式培养皿。因而，成像系统114 产生一个与照射源前面、后面、左边和右边的四个位置相关的图像。
[0170] 虽然四个图像可能似乎十分相似，但是由于照射源的方向，在图像上会出现某些 照射伪影，如皮式培养皿上的光的反射或渐变的阴影。
[0171] 照射伪影可以包括镜面反射，其是在照射之后出现的特定方向中的镜面反射。照 射伪影还可以包括与在皮式培养皿中具有特定高度的对象相关的阴影。照射伪影还可以包 括与非均匀的光强度相关的渐变阴影。
[0172] 镜面反射包括亮点且取决于相应的光源。这意味着，可能仅仅在利用与特定的视 图（如右边视图）相关的光源时才发生镜面反射。因而，当利用与其他三种视图相关的光 源时，也就是，利用左视图、前视图和后视图时，可能不会发生镜面反射。
[0173] 如图17所示，其与现有技术相关，镜面反射位于集落边缘。取决于使用的光源的 方向，镜面反射可能位于不同的集落边缘。图17显示表示作为合成图像的四个照射源（也 就是，后面、前面、左边和右边的照射源）同时照射时的图像。
[0174]因此，需要改进图像的质量，以便将图像中的集落检测优化为不存在这样的照射 伪影的情况。
[0175] 本发明的第一方面涉及用于去除照射伪影如镜面反射的方法。
[0176] 该方法用于根据图18中所示的下列步骤操作以去除照射伪影。
[0177] 如图18所示，在步骤2211中，从三种颜色通道R、G和B选择颜色通道。在步骤 2212中，基于已确定的数目为N的视图获取皮式培养皿的图像。每一个N视图涉及以特定 方向朝着皮式培养皿的照射源。因而，如参考标记2213所示，每一个照射源产生正视图图 像、后视图图像、左视图图像或右视图图像。
[0178] 在底部环形照射的背景中，所有的照射源设置成与皮式培养皿成相同的入射角。 在本发明中，用于去除镜面反射的这个方法的底部环形照射包括数字N，其等于产生四个不 同的图像的四个光源。因此，步骤2212提供四个不同的图像。至少，不同的视图的数目N 应该等于三，以便在去除方法结束时获得最佳化的生成的校正的图像。另外，照射源必须均 匀地设置在皮式培养皿的周围而且与皮式培养皿成相同的入射角。
[0179] 在步骤2213,确定N幅图像中的每一个像素的N个值。这意味着，对于与四个照射 源的四个不同的视图对应的所有的四幅图像，利用相应的值定义每一个像素P。
[0180] 在步骤2214中，考虑到每一个像素p，确定校正的像素值。校正的像素值可能与每 一个像素P有关的中间值v相关，其中从像素的N个值确定中间值。这意味着，对于具有四 个值的像素pl，如所述四个值为左下角值（LBpl)、前下角值（FBpl)、后下角值（BBpl)和右 下角值（RBpl)，计算中间值，以便获得相应的颜色通道中的特定的像素的唯一值。因而，在 计算中间值之后，像素P1的中间值可能是N个值中的任何一个。
[0181] 校正的像素值也可能涉及第一计算值，其与N个像素值内的中间数值的像素值的 平均值相关。
[0182] 校正的像素值也可能涉及第二计算值，其与最低值和最高值之外的像素值的平均 值相关。
[0183]因而，包括中间值、第一计算值或第二计算值的校正的像素值可以代替相应的颜 色通道的所考虑的像素的像素值。下面的实例说明其中底部环形视图包括四个不同的光源 (也就是，N = 4)的情况。校正的像素值涉及中间值。确定颜色通道R、G和B中的每一个 的中间值。
[0184] 特定的像素pi的中间值的确定的实例：
[0185] 对于颜色通道R:
[0186] N = 1;左下角视图-图像1-LBpl = R1
[0187] N = 2;前下角视图-图像2-FBpl = R2
[0188] N = 3;右下角视图-图像3-RBpl = R3
[0189] N = 4;后下角视图-图像4-BBpl = R4
[0190]其中 R1>R2>R3>R4,例如，
[0191] 颜色通道R的pi的中间值的确定为：VI (pi) = (R2+R3)/2
[0192] 对于颜色通道G:
[0193] N = 1;左下角视图-图像1-LBpl = G1
[0194] N = 2;前下角视图-图像2-FBpl = G2
[0195] N = 3;右下角视图-图像3-RBpl = G3
[0196] N = 4;后下角视图_图像4_BBpl = G4
[0197]其中 G1>G2>G3>G4,例如，
[0198] 颜色通道G的pi的中间值的确定为：V2(pl) = (G2+G3)/2
[0199] 对于颜色通道B:
[0200] N = 1 ;左下角视图-图像1-LBpl = B1
[0201] N= 2;前下角视图-图像2-FBpl = B2
[0202] N = 3 ;右下角视图-图像3-RBpl = B3
[0203] N = 4;后下角视图-图像4-BBpl = B4
[0204]其中 例如，
[0205] 颜色通道B的pi的中间值的确定为：V3(pl) = (B2+B3)/2
[0206] 在现有技术中，底部环形视图涉及根据如图17所示的N个照射源的同时照射获得 的N幅图像的实际结合。在本发明中，如图19所示，逐一处理来自每一个照射源的每一个 照射。因而，获得了与N个照射源相关的N幅图像。在确定N幅图像的每一个像素的校正 的像素值之后，以算法为基础计算生成图像。在如图20所示的校正的图像中，确定的中间 值影响到每一个相应的像素。这意味着，考虑到每一个颜色通道，像素值等于所考虑的颜色 通道的这个像素的中间值。
[0207] 基于上述实例，如下指定像素pi的中间值：
[0208] 关于颜色通道R，利用VI (pi) = (R2+R3) /2指定pi
[0209] 关于颜色通道G，利用V2 (pi) = (G2+G3) /2指定pi
[0210] 关于颜色通道B，利用V3(pl) = (B2+B3)/2指定pi
[0211] 校正的图像，如图20所示，显示具有如集落的对象而不具有照射伪影的皮式培养 皿。
[0212] 在进一步的图像处理算法的操作期间，考虑照射伪影。这负面地影响用于产生图 像的算法的过程。在现有技术中，需要用于改变与生成的图像相关的算法的步骤。因而，现 有技术方法要求，基于照射伪影的质量和类型，算法的参数适于图像的内含物。用于本发明 的第二方面的上述根据本发明的第一目标的方法的优势是，不需要算法的参数针对所产生 的最终图像而特别调整或调节。
[0213] 在另一个实施方式中，N幅图像还可能包括黑白图像。
[0214] 现在将在另外的实施方式中，描述许多另外的图像处理技术。图10显示一般的图 像处理技术的简化视图。在第一个步骤1700中，利用一个照射源或照射源的组合获取多个 图像。实施培养皿检测技术步骤1702,以便检测培养皿的第一类型的特征（如培养皿的轮 廓和边缘）。然后，在步骤1704中，实施标志检测技术，以便识别第二类型的特征（如培养 皿上的标志或絹印）。在步骤1706中，实施另外的检测技术。存在许多不同的另外的检测 技术，下面将进一步更加详细地描述，这些技术涉及生物对象或集落的检测。可能有在相同 的样本上实施的一系列不同的图像处理技术，并且如果遇到这种情况，则在步骤1708中， 处理过程将被反馈给随后的进一步的图像处理技术。在某些进一步的检测技术中，实施培 养皿检测和/或标志检测可能是没有必要的，因为这些检测可能不能帮助正在实施的进一 步的检测技术。同样地，至少某些进一步的检测技术可以是独立的技术。
[0215] 培养皿检测技术1702是识别由有盖培养皿的壁和盖子形成的环的技术。技术涉 及对象检测技术，如圆形霍夫变换（如在Duda，R. 0.和P. E. Hart的〃Use of the Hough Transformation to Detect Lines and Curves in Pictures,''Comm. ACM, 15 卷，11-15 页 (1972年1月）中描述的），以便检测预定尺寸的圆形对象。背光图像被用作产生样本的良 好的强对比图像。另外，输入皮式培养皿的尺寸，以向变换指示所寻找的一个或多个圆形对 象的性质。也可以输入所寻找的环的数目，这样，培养皿和盖的多个环就可以位于适当的位 置。霍夫变换的应用可能导致皮式培养皿的一个或多个环（盖子或主体）的定位。在另外 的步骤中，如果需要，这种信息能够实现从生成的图像去除皮式培养皿环或对环或培养皿 的外部进行掩蔽。这确保进一步的检测方法可以集中于皮式培养皿的内部。应该注意，霍 夫变换适用于圆形器皿；然而，其他对象检测算法可以用于不同形状的器皿。
[0216] 可替换地，其他类型的对象检测技术可以用于检测皮式培养皿的轮廓，而不使用 圆形霍夫变换。可替换的对象检测技术允许检索图像中的闭合轮廓，以便识别皮式培养 皿的边界。可替换的技术包括以已知的技术为基础检索图像的可能的轮廓的第一步骤，如 J. Canny 的文献"A Computational Approach to Edge Detection"中描述的 C anny 边缘检 测方法、或形态学梯度边缘检测。因而，第一步骤提供灰度图像。
[0217] 可替换的技术包括利用Matlab?函数如"具有孔选项的填充函数（imfill) "填充 检索到的轮廓的第二步骤。这意味着，在其中轮廓是培养皿周围的闭合轮廓的情况中，填充 步骤仅填充培养皿的内部。可替换的技术还包括检索闭合轮廓内的最大的内切圆的步骤。 在进一步的步骤中，以相应的内切圆的半径和中心的位置为基础确定培养平皿半径和培养 皿的中心的位置。可替换的技术的优势是，无需提前知道不确定的轮廓尺寸而实施这个对 象检测技术。
[0218] 参考图11，现在描述标志检测技术。在第一步骤1800中，将皮式培养皿的多个图 像载入系统。
[0219] 在步骤1802中运行分割处理，其中在步骤1802中，以二值化处理过程分割图像， 以便形成数字化的图像。分割处理提供将像素分成多个类别。二值化处理过程是提供黑色 或白色两个类别的像素的具体的分割处理。二值化处理过程以由暗色的墨点制成的絹印的 原始结构为基础。因而，二值化处理过程包括用于检索具有点状形状和深颜色的对象的步 骤。结果，二值化处理过程提供用于将絹印与其他对象如集落、气泡或默认对象进行区别的 改进的方法。步骤1802的二值化处理过程包括用于识别皮式培养皿上的絹印的几个步骤。 二值化处理过程不同于熟知的k均值聚类方法。k均值聚类方法聚集相同颜色的像素。二 值化处理过程聚集具有相似颜色同时也紧密临近的像素。可以在步骤1804中进行搜索，以 便识别对象，即，例如，形状大体上是矩形的对象。更普遍地，可以针对呈现非生物学特性的 特征或对象进行搜索。这些特征可能包括特殊的形状、絹印、条形码、标签、标牌等等。标记 已识别的对象，且假定在皮式培养皿上标记。合成的图像是1806且其可用于进行定位，而 且如果需要，可用于去除或掩蔽培养皿上的标志，而不考虑原始图像。标志的位置可以用于 相同的培养皿的所有其他图像，与是什么样的照射无关，也与在第一个实例中用于检测标 记的图像或一组图像无关。在具体的实例中，当培养皿中显示没有集落时，这种算法可以用 于识别标记。
[0220] 现在将描述某些另外的图像处理技术。图12a和12b显示用于检测隔离的集落的 处理过程。在第一步骤1900中，利用不同的照射源获取多个图像。选择一个图像或多个图 像的组合，用于进一步的处理。然后，在步骤1902中，通过应用圆形霍夫变换处理选择的一 个或多个图像。这个步骤识别圆形对象如细菌的菌落。可输入典型的菌落大小，以限制霍 夫变换搜索特定大小的圆形元素。一旦识别了圆形对象（菌落），就在步骤1904中将隔离 检验应用于每一个圆形对象。进一步根据图12a描述隔离检验。隔离检验包括确定已识别 的圆形对象（未示出）的中心的步骤。然后，应用二值化步骤1908,以便获得其中二值化图 像的中心对应于已识别的圆形对象的中心的二值化图像。其后，在步骤1910中，在二值化 图像上实施圆度的检验，以核实二值化对象是否是圆形的。尺寸和隔离区的确定的进一步 的步骤1912与下面描述的方法相关，并且实施该步骤，以确定菌落的尺寸以及菌落的直径 和菌落周围的隔离的区域。典型的输出如1906所示。
[0221] 对于用户或对于自动检选设备或半自动检选设备来说，皮式培养皿内的菌落的位 置可能是不方便操作的。因此，看来需要提供关于所要检选的菌落的邻近菌落的详细信息。
[0222] 本发明的第二方面是确定感兴趣的对象如集落的邻近集落，以便获得详细信息， 从而对集落的进一步的手工或自动检选处理提供指导。方法的目标是确定集落的邻近集落 的接近程度，以便获得相应的集落的检选模式，从而指导检选处理过程。考虑先前的步骤 1902中的二值化图像。在本发明中，假设二值化图像中的所有的二值化对象是微生物。
[0223] 如图14所示，在二值化图像的中心的附近搜索其他对象，这是感兴趣的对象的中 心。搜索方法包括在步骤1811中形成许多确定半径的圆，以便搜索在二值化掩膜图像的相 应的圆形表面（如二值化掩膜图像的中心周围的冠状物）内的任何其他对象。每一个冠状 物包括具有特定半径值的圆形表面。通过具有连续的半径值（successive radius value) 的两个圆划定每一个冠状物的界限。在步骤1812中，搜索方法还包括确定冠状物中至少一 个其他对象的存在和位置。如果在围绕二值化图像的中心的冠状物中没有其他对象，那么 利用围绕二值化图像的中心的360°的角扇区定义冠状物。如果任何其他对象位于冠状物 内，在步骤1813中实施相应的空隙角的确定。空隙角与用于定义所要通过用户或自动的设 备检选的中心对象的可用性的角扇区相关。空隙角的值与冠状物内检测的许多其他对象的 数目直接成正比例。空隙角与冠状物的角扇区的最大值相关，在所述冠状物的角扇区中不 存在其他对象。因而，可在用于相对于用户或自动的设备自动设备的最好的条件下，在冠状 物的相应的空区域中执行检选处理过程。也可以确定空隙角的其他值，以详细说明感兴趣 的对象周围的所有的相应的隔离区。
[0224] 因而，在步骤1814中产生相关的感兴趣的对象的检选模式。在图16中显示与感 兴趣的具体的对象（也就是，集落）相关的检选模式的实例。检选模式包括与空隙角和相 应的感兴趣的对象的冠状物相关的检选模式值。
[0225] 在现有技术中，如图15所示，查找表定义标准或用户标准如感兴趣的中心对象的 特定的空隙角和特定的配置。取决于对象在皮式培养皿内的隔离水平，几个标准用于将集 落分级。例如，如果没有其他对象位于集落周围的2mm的冠状物内且如果没有其他对象位 于集落周围的30°直到7mm的角扇区中，则集落属于等级C2-A3。以现有知识和用户的习 惯为基础设定标准。在现有技术的过程，用户具有特定的用户标准，这些标准与如何为用户 检选最佳条件的集落相关。基于用户是惯用右手还是惯用左手和/或集落的尺寸和/或集 落的位置（例如，接近皮式培养皿的边缘），标准与检选集落的用户的平常习惯相关。也可 以考虑其他标准。在本发明的第二方面中，在步骤1815中，用户必须确定哪一个用户标准 匹配检选模式，以便确定是否可以实施用于检选集落的检选处理过程。
[0226] 本发明的第二方面提供除了用于指示用户或自动化的设备的现有技术的查找表 之外的工具，上述用户或任何其他自动化的设备标准可以在其中被用于感兴趣的具体的中 心对象。同样地，本发明提供用于确定集落的邻近集落的另外的方法，用于改进集落的检选 处理过程。另外，也可以在没有利用查找表的情况下应用如图16所示的检选模式，以便确 定用于检选集落的最好的条件。
[0227] 如果集落匹配查找表的至少一个标准组合，则将集落确定为隔离的集落。大多数 隔离的集落属于不只一个标准组合。在图16中所示的检选模式中，集落不属于空隙角小于 360°和至集落的距离是3mm的等级C1。然而，如图20所示，集落属于等级C3-A1、C3-A2和 C4-A1。因而，用户或自动设备可以容易地确定哪一个标准可以应用于具体的集落，而不是 尝试应用查找表的所有可能的标准。从本发明获得的检选模式提供指导和当执行检选处理 过程时，允许用户或自动设备节省时间。
[0228] 本发明的第三方面涉及位于皮式培养皿的集落或对象的数目的确定。
[0229] 本发明的第三个方面处理用于计数隔离的集落和计数来自分组集落的群落的解 决方法，其中包括识别位于皮式培养皿的边缘的集落。词语"连接的组分"或"元素"涉及 对象如集落或大量对象。
[0230] 如图21所示，在步骤2511中，应用与皮式培养皿上的反射的去除相关的预处理。 预处理可能以用于去除如根据内部二值化图像和外部二值化图像的第一区别描述的照射 伪影的处理过程为基础。因而，需要定义培养皿内的边界，以确定培养皿的内部部分和培养 皿的外部部分。可以通过应用上文提到的培养皿检测方法估计皮式培养皿的边界的塑料的 中心和半径。然后，将外半径设定为估计的半径的100%，以获得对应于从皮式培养皿的中 心至皮式培养皿的边界的距离的外半径。在图22中显示外半径的极限。
[0231] 例如，以相似的方式，将内半径设定为估计的半径的85%。在图22中显示外半径 的极限。
[0232] 内半径和外半径使得建造内掩膜和外掩膜这两个相应的二元掩膜（binary mask) 成为可能。内掩膜对应于培养皿的内部，不包括培养皿的外围。外掩膜对应于整个培养皿， 包括培养皿的外围。内半径定义皮式培养皿的第一区域且外半径定义皮式培养皿的第二区 域。内部区域和外部区域的组合定义皮式培养皿的整个表面。
[0233] 在步骤2512中，执行二值化处理过程，以获得总体二值化图像。通过利用底部黑 色背景视图执行步骤2512的内部二值化处理过程。然后，将图像转变为灰度图像。然后利 用大津法（Otsu method)二值化灰度图像。大津法用于简化灰度图像，从而提供二值化图 像。在内部二值化方法中，上文描述的使用内部掩膜定义的内部像素用于计算必需的大津 阈值。如图23所示，基于这个阈值，二值化整个图像。
[0234] 然后，利用称为形态学打开的现有技术的功能清理二值化图像。形态学打开功能 允许从图像前景去除小的对象并放置在图像的背景中。在本发明中，形态学打开功能包括 应用具有5个像素半径的盘状结构元素。因此，如图24所示，形态学打开功能的应用因此 去除比结构元素小的对象。
[0235] 由于已经二值化整个培养皿，那么二值化图像包括内部集落和位于皮式培养皿的 外围上的外部集落。在另外的步骤中，二值化图像被分成图25所示的内部二值化图像和图 26所示的外部二值化图像，内部二值化图像包括位于内部掩膜的连接的组分，外部二值化 图像仅仅含有完全或局部地包括在皮式培养皿的外围的连接的组分。本发明的第三个目标 包括用于提供改进的外部二值化图像的步骤。实际上，因为在皮式培养皿的外围上出现很 多反射，所以利用上述二值化步骤获得的外部二值化图像经常是不正确的，这是因为镜面 反射引起对象被错误地认定为集落。因而，需要改进外部二值化图像。下列步骤提供通过 利用上述步骤中确定的内部二值化图像的参数，用于改进外部二值化图像的质量的方法。
[0236] 在步骤2513中，外部二值化处理过程包括利用具有颜色的背光视图的外部二值 化图像。熟知的功能称为用于去除前景中的小孔的形态学关闭。结合具有设定为最小集落 半径的半径的盘状结构元素使用形态学关闭。可以利用内部二值化图像中的集落的最小半 径的估计确定最小的集落半径。基于本领域的技术人员的知识，最小半径可能在10和15 像素之间。在运行形态学关闭功能之后，去除比结构元素小的深色对象，并且作为结果，如 图27所示，可在背光视图中清晰地看到塑料边界。这些步骤提供第一生成图像。
[0237] 在进一步的步骤中，将第一生成图像转变到Lab颜色空间。这意味着，RGB空间的 第一生成图像被转变成Lab颜色空间的第二生成图像。从Lab空间计算如图28所示的II 和图29所示的12这两个图像：
[0238] Ii= 1-[L]
[0239] 且
[0240] I2= [[a] + [b]]
[0241] L、a、b是Lab空间的通道且[*]是利用下面的最大-最小归一化重新调 节在0和 1之间的像素值的运算符：
[0243] 利用图像1:和I 2二者完善外部二值化图像。计算I i上的内部二值化对象的平 均值，以获得E[IJ。计算12上的内部二值化对象的平均值，以获得E[I 2]。将具有低于 〇.9XE[IJ的1:的值的像素设定为0。以相似的方式，将具有低于0.9XE[I2]的1 2的值的 像素设定为〇。那么，如图34所示，外部二值化图像含有比第一生成图像少的不真实的对 象。
[0244] 在最后的步骤中，通过利用具有设定为最小集落半径的半径的盘状结构元素，在 外部二值化图像上应用形态学打开功能。
[0245] 结果，在步骤2514中，产生结合内部二值化图像和改进的外部二值化图像的总体 二值化图像。
[0246]因为位于皮式培养皿的许多连接的组分可能与集落或与许多集落相关，因此需要 改进集落的检测，这在下面的步骤中进行描述。
[0247] 如步骤2515中所示，识别连接的组分，以确定它们在皮式培养皿中的位置。取决 于具体的连接的组分的位置，可以出现两种不同的步骤。
[0248] 如步骤2516中所示，如果连接的组分位于内部二值化图像，那么利用相应的底部 视图中的像素的值指定每一个像素值。因而，获得内部合成图像。
[0249] 如步骤2517中所示，如果连接的组分位于外部二值化图像，那么计算像距。像距 是现有技术中熟知的。像距代表根据对象到对象边缘的距离表示对象的图像。利用计算的 像素值，即，背光视图中相应的像素值和像距内相应的像素值的平均值指定位于外部二值 化图像中的连接的组分的每一个像素值。因而，获得外部二值化图像。
[0250] 在步骤2518中，结合内部合成图像和外部合成图像，以便获得如图31所示的合成 图像。在图31中，利用高值设定集落的中心和利用低值设定集落的边缘。这意味着，合成 图像的像素值取决于像素与对象边缘的接近程度。以上述步骤为基础，合成图像现在代表 取决于集落的形状和颜色这两个标准的集落。现有技术已知的扩展最大值变换功能用于表 示集落的中心。因而，改进了用于分割合成图像的分割算法的应用，详情如下。
[0251] 如步骤2519中所示，将分割算法，如现有技术中已知的分水岭算法应用于合成图 像，以便获得集落的最终的表示。图32所示的最终的图像代表以上述两个标准为基础的集 落。这意味着，对象包括可识别的边缘。因而，最终的图像促进位于最终的图像的集落的计 数过程。
[0252] 应该明白，也可以使用检测过程和最佳的照射源的其他组合。照射源的位置可随 着需要而变化且不依赖于此处描述的影响的位置和方向。
[0253] 可以预期，能够结合多种增强和图像处理技术，以便分析某些样本。这将需要利用 某些或所有的技术。可以任何顺序应用技术且顺序可以从一个样本到下一个样本而变化。 在选择的一种或多种技术应用于样本且没有识别到集落之后，可以确定，在样本上没有生 长集落。
[0254] 在任何图像增强技术或图像处理技术中，系统都可以在处理过程的开始的时候被 提供以附加信息。这些附加信息可以包括与皮式培养皿或其他样本容器相关的细节，例如 尺寸、形状、材料等等。附加信息还可以包括培养基和可能在该材料上生长的任何预期类型 的材料的细节。信息还可以包括成像细节如曝光时间、照射源、皮式培养皿的定向、任何其 他光学或控制参数等等。信息可以指示应用的目的，例如，用于工业、医药等等。视情况而 定，还可以包括任何其他相关的信息。
[0255] 分析样本和检测伪影的这种自动化处理过程提供了很多优势。进行检测和必要时 去除如笔迹和标志的伪影的能力，使得集落的隔离更容易。相同的技术可以用于检测其他 伪影，并在另外的步骤中，从图像去除它们。例如，如果一批培养皿在特定尺寸和颜色的营 养物中具有过多的气泡，可借助于上述描述的处理过程检测这些伪影，并且如果必要，进行 去除。同样地，还可以处理其他光学伪影。
[0256] 上述描述的发明涉及用于获得和处理生物样本的图像的方法和计算机程序产品。 可以在不同的环境中应用本发明的某些或所有的方面。
[0257] 上述描述的发明中的某些涉及至少在某些程度上能够在计算机上实施的处理过 程。因此，可借助于软件或硬件或其任意组合实施提到的处理技术和步骤。已经结合硬件 描述了本发明的方面，应该明白，可以通过适当的软件模块代替该硬件。同样地，可以利用 适当的硬件代替软件模块或处理过程。
[0258] 可以通过用于生物分析的设备的现有控制系统的适当的程序设计及辅助设备、和 /或利用用于图像处理的单独的数据处理装置实施根据第一、第二和第三目标的发明。
[0259] 应该明白，存在本发明的很多可能的变化，其属于本发明的预定范围。
【主权项】
1. 一种用于定义细胞培养皿中感兴趣的对象周围的隔离区的方法，所述方法包括下列 步骤： -利用多个照射源中的一个或多个照射源获得所述细胞培养皿的一个或多个图像，每 一个照射源能够从不同的方向照射所述培养皿； -选择图像或图像的组合，用于进一步处理； -应用圆形对象检测变换，以识别所述细胞培养皿中的一个或多个为实质上圆形的对 象的感兴趣的对象，并且确定感兴趣的对象的中心，其中感兴趣的圆形对象代表所述细胞 培养皿中孤立的集落； -应用二值化步骤以获得所述感兴趣的对象和其他对象的二值化图像，其中，所述二值 化图像的中心对应于所述感兴趣的对象的中心； -重复地形成半径不断增加的同心圆，其中，所述同心圆以所述二值化图像的中心为中 心； -识别冠状物，其中，通过具有连续的半径值的两个圆划定冠状物的界限； -对于每一个冠状物： -确定位于所述冠状物中的任何其他对象的存在和位置，从而确定其他对象的存在和 位置； -确定定义所述感兴趣的对象周围没有其他对象的角扇区的空隙角，从而定义所述感 兴趣的对象周围的隔离区。2. 根据权利要求1所述的方法，还包括提供所述对象的检选模式，其中，所述检选模式 包括与每一个冠状物和相应的空隙角相关的值。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的方法，还包括利用所述检选模式结合用于检选 处理过程的查找表确定与所述查找表的具体的标准相关的集落的检选处理过程的可用性。4. 一种计算机程序产品，包括用于引起可编程的数据处理装置执行根据权利要求1至 3所述的方法的图像处理步骤的指令。5. -种用于形成生物样本的改进的图像的方法，其中，所述图像包括像素，每一个像素 具有第一像素值，所述方法包括下列步骤： -利用数目为N的照射源照射所述生物样本； -获取每一个不同的照射源下的所述生物样本的图像，以获得N幅图像； _利用所获得的N幅图像确定N个像素值； -基于所述N个像素值确定校正的像素值； -对于每一个像素，利用所述校正的像素值代替所述第一像素值，以便获得所述生物样 本的改进的图像。6. 根据权利要求5所述的方法，其中，将所述照射源均匀地布置在所述生物样本周围， 且所述照射源相对于所述生物样本具有相同的入射角。7. 根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中，所述N幅图像包括与相应的颜色通 道相关的N幅彩色图像或N幅黑白图像。8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所校正的值是N个像素值的中间值并且针对每一 个颜色通道计算中间值。9. 一种计算机程序产品，所述计算机程序产品包括用于引起可编程的数据处理装置执 行根据权利要求5至8所述的方法的图像处理步骤的指令。10. -种用于确定包括由对象和对象的组组成的元素的细胞培养皿的图像中的对象的 数目的方法，所述方法包括下列步骤： -利用照射源的已确定的视图获取所述细胞培养皿和元素的图像； -应用二值化步骤以获得所述图像的二值化版本，其中，二值化图像包括内部二值化图 像和外部二值化图像，其中，所述内部二值化图像对应于所述细胞培养皿的内部部分，且所 述外部二值化图像对应于所述细胞培养皿的外部部分； -确定每一个元素在所述二值化图像中的位置，以确定组分是位于所述内部二值化图 像还是位于所述外部二值化图像中； -如果所述组分位于所述内部二值化图像中，则利用相应的第一像素值代替表示所述 内部二值化图像中的所述组分的图像的像素的像素值，以获得第一合成图像； -如果所述组分位于所述外部二值化图像中，则利用相应的第二像素值代替表示所述 外部二值化图像中的所述组分的图像的像素的像素值，以获得第二合成图像； -结合所述第一合成图像和所述第二合成图像，以获得合成的图像，其中所述合成的图 像的像素值取决于像素与所述对象的边缘的接近程度； _将分割算法应用于所述合成的图像，以便获得包括具有可分辨的边缘的对象的图像。11. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述二值化步骤包括内部二值化步骤和外部 二值化步骤。12. 根据权利要求11所述的方法，其中，所述外部二值化步骤包括应用形态学关闭功 能以获得生成图像，其中，所述已确定的视图是背光视图。13. 根据权利要求12所述的方法，其中，将所述生成图像从第一颜色空间转变到感觉 更加均匀的第二颜色空间，如L、a、b颜色空间。14. 根据权利要求10至13中的任一项所述的方法，其中，通过利用所述元素的像素值 确定所述元素的第一像素值，其中，所述已确定的视图是底部环形视图。15. 根据权利要求10至14中的任一项所述的方法，其中，通过计算所述外部二值化图 像的相应的像距内的元素的像素值和所述生成图像中的元素的像素值的平均值确定元素 的第二像素值。16. 根据权利要求10至15中的任一项所述的方法，其中，所述分割算法是分水岭算法。17. -种计算机程序产品，所述计算机程序产品包括用于引起可编程的数据处理装置 执行根据权利要求10至16所述的方法的图像处理步骤的指令。
【专利摘要】一种用于定义细胞培养皿内感兴趣的对象周围的隔离区的方法，方法包括下列步骤：利用多个照射源中的一个或多个获得细胞培养皿的一个或多个图像，每一个照射源能够从不同的方向照射器皿；选择图像或图像的组合，用于进一步处理；应用圆形对象检测变换，以识别细胞培养皿中的一个或多个实质上圆形的感兴趣的对象，其中感兴趣的圆形对象代表细胞培养皿中隔离的集落，并且确定感兴趣的对象的中心；应用二值化步骤获得感兴趣的对象和其他对象的二值化图像，其中二值化图像的中心对应于感兴趣的对象的中心；重复地形成半径不断增加的同心圆，其中同心圆集中在二值化图像的中心；识别冠状物，其中通过具有连续的半径值的两个圆划定冠状物的界限；对于每一个冠状物：确定位于冠状物中的任何其他对象的存在和位置，从而确定其他对象的存在和位置；确定定义感兴趣的对象周围没有其他对象的角扇区的空隙角，从而定义感兴趣的对象周围的隔离区。
【IPC分类】G06T7/00, G06K9/00
【公开号】CN104903914
【申请号】CN201380069532
【发明人】劳伦·埃拉诺, 纪尧姆·苏特拉, 罗瑞德·穆诺兹, 科琳·菲尔希龙, D·德科, 弗莱德瑞克·皮恩斯顿
【申请人】生物梅里埃公司, 原子能与替代能源委员会
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月7日
【公告号】EP2731051A1, EP2917873A1, US20150278575, WO2014072422A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于分析体外样本的方法和计算机程序产品。
[0002] 发明背景
[0003] 在很多环境中实施体外分析，以便识别生物样本如微生物、细胞和组织培养、细胞 或亚细胞提取物、以及纯化的分子。使不同物质的样本与它们通常的生物背景隔离且提供 可以使它们在其中生长的环境。通常以皮式培养皿的形式提供这种环境，为了使样本生长 将皮式培养皿放置到培养箱中。皮式培养皿通常包括促进样本生长的微生物学培养基。理 想情况下，适当培养基上的培育引起许多样本集落（colony)的生长。通常实施随后的集落 分析，以识别微生物和评估它们对抗菌剂的敏感性或抗性。
[0004] 例如，样本分析的重要部分是识别集落中的特定的微生物或细菌的能力。另外，还 可以基于样本中的微生物的生长和与应用于样本的任何药物的相互作用分析利用适当的 药物对细菌的处理。
[0005] 通过有资格的科学家对皮式培养皿的视觉分析实施许多初步分析。初步的视觉分 析十分有效，但是由于不同的微生物的形状、颜色、大小和形态的巨大多样性，易于出现可 能难以解释的人为误差和不一致性。然而，目测仍然是目前快速地识别微生物的最好的方 法之一。另外，因为许多生长是"随机的"，所以模拟微生物生长和找到适合于所说明的上述 多样性的自动化系统，并非易事。
[0006] 已知的培养箱可以包括窗口，可以通过该窗口观察样本，但是通常，将皮式培养皿 取出培养箱，实施视觉上的分析。初步的视觉分析涉及将皮式培养皿拿到光源前面识别集 落。然后，可以根据需要在具体的已识别的集落上实施更详细的化学和显微镜分析方法。
[0007] 在现有技术中已有生物扫描器，也就是，用于扫描或计数细菌菌落的设备。例如， US 2004/0101951和US 2010/0232660都公开了用于扫描生物生长平皿的生物扫描器，它 们具有不同的结构但是同样都具有生成平皿的图像和执行这些图像的分析，以便检测生 物生长的能力。然而，两者都利用提供正面照射或背面照射的单一光源。实际上，在US 2004/0101951和US 2010/0232660中都指出了，"某些生物生长平皿可能仅需要正面照射 或背面照射，但是不是需要两种照射"。这样的照射是基本的且不能提供足够好的品质的图 像以获得以有效的方式实施初步分析。
[0008] 存在某些现有技术系统，在所述系统中通过不同的颜色或波长的光照射皮式培养 皿中的样本，以便形成样本的图像。通过适当定向的照相机捕捉该图像。
[0009] FR2926820公开用于检测生物样本中的至少一种具体的微生物的方法，所述方法 包括，使培养基经受至少两种辐射的步骤，每一种辐射呈现特定的波长，以及其他步骤。优 选地，使用两种照射系统，每一种照射系统发出特定波长的辐射。更具体地，FR2926820的 图1显示明显的顶部照射和紫外线背光照射的组合。然后，将来自两种不同的照射的后来 的组合图像用于检测具体微生物的存在。
[0010] 同样地，已发表的日本专利申请，JP2010104301，描述用于检测微生物的方法，该 方法包括显像步骤，以便获取微生物在其上进行生长的培养基的图像和集落检测步骤，所 述方法也利用顶部照射和背光照射的组合。
[0011] 一旦获得了生物样本的图像，处理技术就可以用于增强图像。然而，存在许多与增 强生物样本的图像相关的问题。这些问题可能涉及下列方面：
[0012] -正在观察的集落的大小；
[0013]--个集落与另一个集落的接近程度；
[0014]-集落的颜色混合；
[0015] _皮式培养皿的性质；
[0016]-培养基的性质；
[0017] _其他。
[0018] 本发明的第一个问题涉及集落的邻近集落的确定，以便提供关于集落的检选过程 的指导。看来，需要确定集落周围的一个或多个隔离区。
[0019] 另一个问题涉及照射伪影的存在，如镜面反射，其起因于定向照射源的使用。看 来，存在解决位于生物样本的图像中的集落上的照射伪影的问题的另外的需求。
[0020] 考虑位于皮式培养皿的外围的集落，另外的问题涉及集落的数目的确定。看来，存 在改进生物样本的图像中的集落的计数方法的需要。
[0021] 本发明的目标
[0022] 本发明的目标是克服所提及的上述问题中的至少一些问题。
【发明内容】
[0023] 本发明提供如在随附权利要求中陈述的方法和计算机程序产品。
[0024] 根据本发明的第一方面，提供了用于定义细胞培养皿内感兴趣的对象周围的隔离 区的方法，方法包括下列步骤：
[0025]-利用多个照射源中的一个或多个获得细胞培养皿的一个或多个图像，每一个照 射源能够从不同的方向照射器皿；
[0026]-选择图像或图像的组合，用于进一步处理；
[0027]-应用圆形对象检测变换，以识别细胞培养皿中的一个或多个是大体上圆形的对 象的感兴趣的对象并确定感兴趣的对象的中心，其中感兴趣的圆形对象代表细胞培养皿中 隔离的集落；
[0028]-应用二值化步骤获得感兴趣的对象和其他对象的二值化图像，其中二值化图像 的中心对应于感兴趣的对象的中心；
[0029] _重复地形成半径不断增加的同心圆，其中同心圆以二值化图像的中心为中心；
[0030]-识别冠状物（corona)，其中通过具有连续的半径值的两个圆圈划定冠状物的界 限；
[0031]-对于每一个冠状物：
[0032]_确定位于冠状物中的任何其他对象的存在和位置，从而确定其他对象的存在和 位置；
[0033]-确定定义感兴趣的对象周围没有其他对象的角扇区（angularsector)的空隙 角（clearanceangle)，从而定义感兴趣的对象周围的隔离区。
[0034]优选地，方法还包括提供对象的检选模式（picking profile)，其中检选模式包括 与每一个冠状物和相应的空隙角相关的值。
[0035] 优选地，方法还包括利用检选模式联合用于检选过程的查找表确定用于与查找表 的具体的标准相关的集落的检选过程的可用性。
[0036] 提供了计算机程序产品，其包括用于引起可编程的数据处理装置执行根据本发明 的第一目标的方法的图像处理步骤，或服务上面提出的数据处理装置的指令。计算机程序 产品可以包括存储在机器可读的存储介质内的所述指令。
[0037] 根据本发明的第二个方面，提供了用于形成生物样本的改进的图像的方法，其中 图像包括像素，每一个像素具有第一像素值，方法包括下列步骤：
[0038]-利用数目为N的照射源照射生物样本；
[0039] _获取每一个不同的照射源下的生物样本的图像，以获得N幅图像；
[0040] -利用已获得的N幅图像确定N个像素值；
[0041]-基于N个像素值确定校正的像素值；
[0042]-对于每一个像素，利用校正的像素值代替第一像素值，以便获得生物样本的改进 的图像。
[0043] 优选地，方法还包括被均匀地布置在生物样本周围的照射源，照射源对于生物样 本具有相同的入射角。
[0044] 优选地，N幅图像包括与相应的颜色通道相关的N幅彩色图像或N幅黑白图像。
[0045] 优选地，校正值是N个像素值的中间值并且计算每一个颜色通道的中间值。
[0046] 提供了计算机程序产品，包括用于引起可编程的数据处理装置执行根据本发明的 第二目标的方法的图像处理步骤，或用于服务上面提到的数据处理装置的指令。计算机程 序产品可以包括存储在机器可读的存储介质内的所述指令。
[0047] 根据本发明的第三方面，提供了用于确定细胞培养皿的图像中的对象的数目的方 法，其中包括由对象和对象的组组成的元素，方法包括下列步骤：
[0048] _利用照射源的已确定的视图（view)获取细胞培养皿和各个元素的图像；
[0049]-应用二值化步骤获得图像的二值化版本，其中二值化图像包括内部二值化图像 和外部二值化图像，其中内部二值化图像对应于细胞培养皿的内部部分，而外部二值化图 像对应于细胞培养皿的外部部分；
[0050]-确定每一个元素在二值化图像中的位置，以便确定组分是位于内部二值化图像 中还是位于外部二值化图像中；
[0051]-如果组分位于内部二值化图像中，则利用相应的第一像素值代替表示内部二值 化图像中的组分的图像的像素的像素值，以便获得第一合成图像；
[0052]-如果组分位于外部二值化图像中，则利用相应的第二像素值代替表示外部二值 化图像中的组分的图像的像素的像素值，以便获得第二合成图像；
[0053] _结合第一合成图像和第二合成图像，以便获得其中合成图像的像素值取决于像 素与对象边缘的接近程度的合成图像；
[0054] _将分割算法应用于合成图像，以便获得包括具有可分辨的边缘的对象的图像。
[0055] 优选地，二值化步骤包括内部二值化步骤和外部二值化步骤。
[0056] 优选地，外部二值化步骤包括应用形态关闭功能获得生成图像，其中确定的视图 是背光视图。
[0057] 优选地，将生成图像从第一颜色空间变换到第二颜色空间，即，如感觉更加均匀的 L、a、b颜色空间。
[0058] 优选地，通过利用元素的像素值确定元素的第一像素值，其中确定的视图是底部 环形视图。
[0059] 优选地，通过计算外部二值化图像的相应像距中的元素的像素值和生成图像中的 元素的像素值的平均值确定元素的第二像素值。
[0060] 优选地，分割算法是分水岭算法。
[0061] 提供了计算机程序产品，其包括用于引起可编程的数据处理装置执行根据本发明 的第三目标的方法的图像处理步骤，或用于服务上面提到的数据处理装置的指令。计算机 程序产品可以包括存储在机器可读的存储介质内的所述指令。
【附图说明】
[0062] 现在，通过实例，对附图进行参考，其中：
[0063]图1是根据本发明的一个方面的生物分析系统；
[0064]图2a、2b和2c是根据本发明的一个方面的、图1的系统的成像系统的示意图；[0065]图3是根据本发明的一个方面的、图2的系统的简化图，显示应用于样本的不同类 型的照射；
[0066] 图4a是根据本发明的一个方面的背光照射源的示意图；
[0067] 图4b是与垂直照射相关的漫射器的示意性的前视图和后视图表示。
[0068] 图4c是与环形照射相关的漫射器的示意性的前视图和后视图表示；
[0069]图5是根据本发明的一个方面的样本抽拉框和相关的近似水平的照射源的示意 图；
[0070] 图6是根据本发明的一个方面的环形照射源的示意图；
[0071] 图7是根据本发明的一个方面显示用于不同应用的不同的照射类型的表格；
[0072] 图8是根据本发明的一个方面显示用于与不同的图像处理技术相关的不同的培 养基的不同的 照射类型的表格；
[0073] 图9a是根据本发明的一个方面的第一图像增强技术的源图像；
[0074] 图9b是根据本发明的一个方面的使用第一图像增强技术之后的生成图像；
[0075] 图10是根据本发明的一个方面的图像处理技术的实例；
[0076] 图11是根据本发明的一个方面的标志检测的处理过程；
[0077] 图12a和12b是显示根据本发明的一个方面的图像处理技术的步骤的流程图；
[0078] 图13是显示根据本发明的一个方面的图像处理技术的步骤的流程图；
[0079] 图14是显示根据本发明的一个方面的用于改进检选方法的步骤的流程图；
[0080] 图15显不根据现有技术的查找表的实例；
[0081] 图16表示根据本发明的一个方面的、取决于距离集落的隔离距离和集落周围的 隔离角的集落的检选模式；
[0082] 图17显示根据现有技术的来自三种颜色通道的四种照射源的图像；
[0083] 图18是显示根据本发明的第二个方面的用于去除位于皮式培养皿中的集落的图 像上的照射伪影的方法的步骤的流程图；
[0084] 图19图示了根据本发明的第二个方面的四个不同的图像，每一个图像指的是不 同照射源的视图；
[0085] 图20显示了根据本发明的第二个方面利用图19的四个不同的图像产生的中间图 像；
[0086] 图21是显示根据本发明的第三个方面的用于计数皮式培养皿中的集落的方法的 步骤的流程图；
[0087] 图22表示根据本发明的第三个方面显示皮式培养皿的内半径和外半径的皮式培 养皿的图像；
[0088] 图23表示根据本发明的第三个方面的皮式培养皿的二值化图像；
[0089] 图24显示了根据本发明的第三个方面在应用形态学打开功能之后的二值化图 像；
[0090] 图25显示了根据本发明的第三个方面的内部二值化图像；
[0091] 图26显示了根据本发明的第三个方面的外部二值化图像；
[0092] 图27显示了根据本发明的第三个方面利用背光视图照射的第一生成图像；
[0093] 图28显示了根据本发明的第三个方面改善图27的第一生成图像的图像II;
[0094] 图29显示了根据本发明的第三个方面改善图27的第一生成图像的图像12;
[0095] 图30显示了根据本发明的第三个方面在处理涉及参数II和12的到Lab空间的 转换之后的组合的外部二值化图像；
[0096] 图31显示了根据本发明的第三个方面的皮式培养皿的合成图像；以及
[0097] 图32显示了根据本发明的第三个方面的用于计数集落的皮式培养皿的最终图 像。
【具体实施方式】
[0098] 本发明涉及用于以全自动或半自动的方式分析生物样品的方法。在本说明书中， 术语"对象"涉及实物如气泡或集落，术语"标志"涉及细胞培养皿如皮式培养皿的特征。例 如，标志可能涉及与序号或任何识别标志有关的伪影或墨点。术语"特点"涉及对象如集落 的特性。另外，术语"有盖培养皿"定义皮式培养皿和覆盖皮式培养皿的盖子的组装。
[0099] 如图1所示，系统100包括样本器皿库102、自动划线机器（automatic streaking machine) 104、智能培养箱系统106、处理单元108和识别系统110。
[0100] 样本库102人工地或自动地产生样本器皿，生物样本可以在该样本器皿内生长和 随后进行分析。样本器皿通常是皮式培养皿，但是也可以使用其他细胞培养皿。因此，此处 对皮式培养皿的引用不是旨在进行限制。
[0101] 样本器皿库将适当的培养基加入到培养皿内，使生物样本能够生长。可以依靠传 送带或其他的自动化系统将皮式培养皿从样本器皿库传送到处理过程的下一个阶段。可替 换地，可通过运算符将样本传到下一个阶段。
[0102] 自动划线机器104将生物样本应用于皮式培养皿，然后以已知的方式指定样本。 在皮式培养皿中，例如，利用具有长度大约等于培养皿的半径的梳齿（comb)应用样本。应 用梳齿，且随后执行操作以将生物样本散布在培养皿的表面上。适当的自动划线机器的实 例是由申请人以PREVI? Isola的商标名称进行了商用的自动划线机器。
[0103] -旦生物样本被分散在培养皿中的培养基上，就通过运算符人工地或依靠传送带 或其他自动化系统将培养皿传到处理过程的下一个阶段。
[0104] 智能培养箱系统106包括培养箱112和成像系统114。将皮式培养皿引入到培养 箱中，并在预定的温度下，将培养皿培育预定的时间。这能够使生物样本生长，在培养皿的 表面上产生微生物的许多集落。一旦按照要求将培养皿培育完毕，就将培养皿传到成像系 统114。总的来说，成像系统是用于整体生成系统中生成的集落和培养基的图像的新系统。 将在下面进一步描述成像系统的细节。
[0105]图像用于样本分析的第一阶段。这个阶段可以识别集落和生物样本的其他方面， 以便帮助和促进整个系统的其他的活动和功能。
[0106] 在产生培养皿的图像之后，然后将培养皿传到处理过程的下一个阶段。可以通过 传送带或其他自动化系统自动地或通过运算符人工地实施这个步骤。
[0107] 取决于所需的样本分析，处理单元108可以采用许多不同的形式。例如，可以基于 图像提取具体的集落，用于进一步的分析或处理。此时，可以将很多其他处理过程应用于培 养皿。如果必要的话，可以将培养皿放回到培养箱中，用于进一步生长和/或放回到成像系 统。
[0108] 在完成所有必须的处理和成像之后，可借助于人工处理或自动化处理将培养皿传 送到识别系统110。
[0109] 识别系统110可以被用于使用多种方法识别培养皿上以集落形式出现的微生物。 可以通过微生物的新陈代谢的分析实施识别，并且该识别可以是自动的或人工的。例如，可 以利用由申请人商业化的VITEK?系统实施自动化的分析。还可以利用质谱分析技术实 施识别。其他分析还可以包括检测抗菌药物耐药性机制。
[0110] 应该明白，可以改变整个系统的多个元件，以实施不同的功能。另外，可以以不同 的顺序实施某些步骤。
[0111] 如先前提到的，智能培养箱系统是本发明的重要方面且包括独特的成像系统。现 在将根据图2a、2b和2c更详细地描述成像系统。成像系统114包括底部单元202。底部 单元包括用于生成红色、绿色和蓝色背光照射的光学器件和控制线路。如图2b所示，底部 单元可以包括控制器，其可以是具有三个位置的机械轮的形式。这些位置对应于不同的照 射，分别是"无背景"、"白色背景"和"黑色背景"。"无背景"位置涉及机械轮中的圆孔150。 "白色背景"位置涉及机械轮中的白色背景圆160。"黑色背景"位置涉及机械轮中的黑色背 景圆170。取决于样本的性质，无背景用于背光，然而黑白背景用于所有其他类型的照射。
[0112] 在底部单元之上，有样本保持单元204。样本保持单元可以包括可以进进出出滑动 的抽拉框且包括适于支撑皮式培养皿的凹槽206。另外，如图2c所示，样本保持单元包括四 个红/绿/蓝水平照射源，分别是208、210、212和214。四个照射源以直线方式位于样本凹 槽周围且是可独立地控制的。在使用中，皮式培养皿的顶部大体上与四个水平照射源的顶 部成一条直线。水平照射源允许以水平或近似水平的光束照射皮式培养皿。
[0113] 应该注意，凹槽的底部是光学上能透射的，以便在使用中允许背光照射照射样本。 样本保持单元还包括操作四个水平照射源所需的光学器件和控制元件。
[0114] 样本保持单元可以包括可替换的定向（未示出），在该定向中通过传送带将样本 移动到用于成像的位置。抽拉框可以被具有样本保持区域的传送带系统代替，这些系统中 的每一个都是透明的，以允许使用背光照射。传送带系统可以将样本移动到适当的位置，然 后可以获取必需的图像。然后，传送带将下一个样本移动到用于成像的位置，同时第一个样 本被继续移动到处理的下一个阶段。这使得能够在不同的位置获取图像且同时移动样本。
[0115] 在另外的替换方式中，系统可以包括能够将皮式培养皿加载到样本架中或加载到 传送带上的机械臂。另外，机械臂可以在成像之前去除有盖培养皿的盖子和之后把盖子放 回原处。可以通过倒置有盖培养皿和引起盖子脱落完成这个动作。去除盖子确保盖子不会 在样本被某些照射源照射时产生反射。
[0116] 除了移动到成像区域和离开成像区域之外，样本保持单元还可以包括相对于正常 位置改变样本的位置的机制。例如，样本架或许能够使样本定位在相对于特定光束的特定 角度。也可以利用适当的机制实施其他运动，如样本的旋转。结果，可以通过移动样本保持 单元中的样本或移动照射源实现样本和照射源的任何相对移动。变化是持续的。
[0117] 当样本保持单元在正常位置时，如在成像系统中的机械轮上的水平位置时，可以 增加掩膜，以改进从皮式培养皿的内部获取的图像的质量。
[0118] 成像系统114还包括第一中间单元216,其位于样本保持单元上方。第一中间单元 包括四个以直线方式放置的红/绿/蓝照射源，分别是218、220、222和224。在使用中，使 照射源适合于在样本保持单元中的样本凹槽上产生环形照射，且每一个都可以独立控制。 可以调节环形照射，以便从任何适当的方向入射到样本上，包括侧面、非侧面或任何其他适 当的定向。
[0119] 如图2a所示，成像系统还包括第二中间单元226。第二中间单元包括四个以直线 方式放置的红/绿/蓝照射源，分别是228、230、232和234。照射源是可以各自独立控制， 而且向上直射并从上面的单元反射，以引起反向的环形照射，在使用中，该反向的环形照射 照射样本凹槽中的样本。
[0120] 成像系统的顶部单元236位于第二中间单元上方。顶部单元分别包括白光照射源 238、240、242、244、246、248、250 和 252,其中的四个显示为 238、240、242、244。各自可独立 控制。在使用中布置八个照射源，以便在样本凹槽上产生垂直照射。
[0121] 顶部单元还包括图像捕捉装置254,如照相机，其定向样本凹槽。来自任何一个单 元的照射源的任何组合的照射都可以指向样本凹槽。然后，图像捕捉装置可以捕捉被照射 的样本凹槽中的任何样本的图像。下面将更加详细地解释图像的应用和进一步的处理。
[0122] 顶部单元还可以包括用于操作多个光源的控制面板256。除了每一个单元中控制 它的功能的控制线路和光学器件之外，可能还有总体控制系统（未示出）。控制系统可以包 括计算机、显示单元、处理模块和图像增强算法、图像处理、以及任何其他的处理过程或技 术。
[0123] 控制系统可以用于控制用作专门应用的照射源。另外，对于不同的应用，控制系统 可应用不同的图像增强技术和图像处理。图像增强技术是增强图像的质量或使得专家可看 得见相关信息，以便观察或操作的方法和技术。下面将更加详细地描述的实例包括：照射伪 影的校正等。图像处理是来自图像的信息的提取，以便提供决策支持或自动 的决策。这不 一定包括图像的修饰，而是包括以自动化的方式确定更高级别的信息/解释。下面将更加 详细地描述的实例包括：培养皿边界的检测、照射伪影的检测、集落检选模式的确定、集落 的数目的确定、生长的检测（量、隔离的集落、群集现象）、生长/非生长的总体决策，等等。
[0124] 群集现象倾向于指示群集运动，其是整个固体或半固体表面上的细菌种群 的迅速的（2-10um/s)和协调的迀移。主要地在沙雷氏菌属（Serratia)、沙门氏菌 属（Salmonella)、气单胞菌属（Aeromonas)、芽孢杆菌属（Bacillus)、耶尔森菌属 (Yersinia)、假单胞菌属（Pseudomonas)、变形杆菌属（Proteus)、弧菌属（Vibrio)和埃希 氏菌属（Escherichia)中研宄这种类型的运动性。
[0125] 控制系统可用于实施成像系统的任何其他功能和/或控制操作。这些包括，但是 不限于：
[0126] -将样本装载到样本凹槽，和卸载样本；
[0127]-检查和调整样本在样本凹槽中的定位；
[0128]-控制亮度的水平；
[0129] _控制红/绿/蓝分量的平衡；
[0130]-控制曝光时间；
[0131]-控制照射组合；
[0132]_检验系统；
[0133]-校正系统；和
[0134]-以分析的应用和目的为基础的任何其他适当的控制。
[0135] 形成成像系统的单元的每一个能够相对于另一个单元移动。当这种情况发生时， 可能需要某些光学调整，以确保样本被所有的光源照射。
[0136] 现在，将根据图3更详细地描述成像系统的操作。
[0137] 图3显示成像系统114的示意图，演示多个照射源和它们如何影响位于成像系统 的样本300。样本300可被近似水平的光束302、304照射。除了通过参考标记302和304 说明的那些之外，近似水平的光束还包括进入夹持器的组分和离开夹持器的组分。由图2a 的样本保持单元204中的水平照射源产生近似水平的光束。也可以通过由图2a中的底部 单元202生成的背光光束306照射样本。
[0138] 环形光束308也可以照射样本300并由第一中间单元216产生。由第二中间单元 226产生的反向的环形光束310也可以照射样本。
[0139] 垂直光束312也可以照射样本且由顶部单元236中的照射源形成。
[0140] 垂直光束和背光照射在相对于皮式培养皿中的样本大体上垂直方向中应用照射。 因而，这些照射源的每一个的光轴也垂直于样本。近似水平的、环形和反向的环形照射不垂 直于皮式培养皿。同样地，这些光源的光轴不垂直于样本。非垂直光源相对于利用垂直光 源获得的那些图像，提供了不同范围的可替换的图像。在利用它们形成的任何图像中，这些 非垂直光源提供另外的和不同的光学特征。这确保改进的集落隔离和检测。
[0141]图3中显示并由图2a中的适当单元产生的照射源可以是任何优选类型的光源， 如在红色、绿色和蓝色（RGB)频率上运行的光发射二极管（LED);简单的白光光源；紫外线 (UV)光源或任何其他适当的辐射来源。例如，照射源可以包括322个LED，包括64个白色 LED、86个红色LED、86个绿色LED和86个蓝色LED。任何位置中的光源的数目可以不同于 此处显示和描述的数目。在每一个位置上，通过在各自单独的频率上运行的三个LED的三 元组提供RGB照射。对于不同的照射源，可能有不同的RGBLED的组合。例如，对于背光照 射，LED可能如图4a所示定向。借助于包括LED的特定的布置的特定的插件提供每一种类 型的照射。底部单元202借助于两个插件400和402产生背光光束306,每一个插件包括以 三元组布置的多个二极管。LED的每一个三元组404包括红色、绿色和蓝色LED。以406显 示样本的位置。总共有45个LED三元组位于每一个插件上且用于生成背光光束306。在每 一个三元组中，可以每次点亮红色、绿色和蓝色LED中的一个，以便产生一个接一个的彩色 照射。
[0142] 应该明白，可使用任何适当定向和适当数目的二极管代替上文描述的实例。另外， 可以选择和使用RGB LED的不同组合。
[0143] 另外，对于UV光源，借助于同时发光的两个插件提供UV照射。例如，每一个插件 包括500mA强度的UV LED。
[0144] 插件可以包括用于确定LED的温度和可能的像差的传感器，这样，如果可以预见 问题，可以在连续操作时将LED关掉几秒钟。如图4b所示，在插件400和402和凹槽中的 样本之间还可能存在漫射器。漫射器有助于阻止在生成图片中看到LED，且有助于使背景光 均匀。另外，漫射器吸收来自高功率LED的某些照射。当使用直接照射时，很短的曝光时间 可用于最小化由照相机造成的模糊相关的任何影响。
[0145] 图5显示位于样本保持单元204中的照射源，其产生近似水平光束302、304。有八 个插件，每一个分别覆盖边500、502、504和506的长度的一半。每一个插件携带8个RGB LED的三元组的阵列。可同时、独立地或以任何预定顺序控制照射源。八个插件形成样本抽 拉框机制的部分，其包括样本凹槽。可以针对不同大小的样本或皮式培养皿使用具有不同 大小的孔径510的光学上能透射的界面508。
[0146] 参考图6，第一中间单元216和第二中间单元226中的四个照射源中的每一个分别 包括四个插件600、602、604和606,每一个具有如图所示定向的10RGB LED的阵列608。这 些阵列产生了用于第一中间单元216的环形光束308和用于第二中间单元226的反向的环 形光束310。可以独立地控制每一个插件，以便分别或以组合方式运行。为了阻止来自样本 和培养基的不期望的反射，每一个插件配备有如图4c所示的漫射器。插件的每一个都可以 围绕轴旋转，其中之一如图6中的610所示，这样，可以确定环形光束的位置，以便优化样本 的照射。这种调整对于确保均匀的照射来说是必要的，而不用考虑中间单元相对于样本的 垂直位置。
[0147] 图6显示第一中间单元216的插件的位置。应该明白，第二中间单元226的那些 照射源将向上直射，且将相应地调整旋转。
[0148] 顶部单元236中的垂直照射源238、240、242、244、246、248、250和252，每一个都包 括白光光源，其中每一个光源都可独立控制，以便产生垂直光束312。
[0149] 图2a中的图像捕捉装置254适于从上面捕捉样本的图像。对于具有90mm直径的 皮式培养皿，将产生100mm 2的图像。在标准图像捕捉装置中，这通常等于2050像素2,但是 也可以使用其他像素大小，如2448*2050像素。另外，因为培养皿的高度通常是大约13mm， 取决于皮式培养皿中培养基的厚度，成像设备的景深是大约±6_。
[0150] 在上文提到的所有的照射的实例中，都通过成像设备254从上面捕捉样本的图 像。应该注意，照相机可在预定的时期获得连续的一组图像，以便测量集落的生长和其他 时间相关的影响。另外，对于其中正要测量集落生长发展等的某些应用，照相机可以是摄像 机。也可以通过借助于适当的传送带或机械臂使培养皿进入和离开成像系统的运动引起培 养皿的运动。
[0151] 照相机适于获得根据不同照射源的不同类型的图像。一系列图像可能是具体的应 用所需要的。具体过程包括利用特定的照射或照射的组合照射样本，随后获取使用相关的 照射的特定类型的图像，如单色、黑白、或RGB图像的步骤。接下来，利用不同类型的照射或 照射组合获取另外的图像且过程继续，直到获得了所有必需的图像。在过程中控制照相机， 以获取适当类型的图像。
[0152] 例如，照相机可以包括单色传感器和利用具有17幅图像每秒的最大速度的逐行 扫描C⑶技术。照相机可能具有12至24伏特DC的功率消耗。
[0153] 现在，将描述产生的图像和图像增强处理过程的更多细节。
[0154] 如先前提到的，可从多个不同的光源照射成像系统114中的样本，光源从不同的 方向到达样本。在照射样本之后，从上面获取样本的图像。每一种照射突显样本的不同的 方面。
[0155] 背光照射显不皮式培养皿的细节，包括它的基底上的任何标志、皮式培养皿的边 缘和盖的形式；以及样本中集落的布局和密度的详细的视图。这种照射提供可以隔离集落、 确定相似的集落（例如，a和0溶血种类）之间的差异且通常给出样本的内含物的视图 的信息。
[0156] 本发明中使用的照射的一种类型在生物成像领域中是唯一的。这是近似水平的光 束。在皮式培养皿上利用近似水平的光束意味着，光束穿过皮式培养皿的边缘和盖子且穿 过培养基。这引起光的吸收且在识别集落和集落的特征方面，预计不如其他方向的光束有 用。然而，情况并非如此。
[0157] 近似水平光束的使用增加了大量有价值的信息。即使在光束穿过皮式培养皿和培 养基的同时存在严重的照射吸收，这种情况也成立。随着近似水平光束与集落接触，就向图 像捕捉装置反射和/或折射光束。这导致清晰地显示集落的位置的图像。结果可能如图9a 所示。尽管这种图像是有用的，但是它包括使得集落识别非最佳的许多光学效果。例如，培 养基可能具有非均匀的表面，其在整个样本的颜色和对比度上有变化。同样，由于照射穿过 皮式培养皿的多个层，边缘包括严重的干涉。这使得难以识别样本的边缘的集落。具有边 缘照射校正技术的近似水平光束的应用可以在集落的识别和隔离中提供重要的优势。光源 和目标图像之间的明显对比是非常清晰的。通过利用本发明的边缘照射校正处理过程，用 户将具有更大的识别集落的机会。对于不透明的培养基来说，近似水平的照射是不合适的， 但是在透明和半透明的培养基中去除培养皿伪影和减少灰尘和絹印的影响是有用的。
[0158] 通过样本和它的内含物折射和反射近似水平照射，以便形成可以用于隔离和消除 伪影的图像。图像稍后也可用于确定集落对培养皿的百分比覆盖，以提供集落浓度的估计 和确定非透明的培养基上有生长或没有生长。
[0159] 环形照射朝向样本且通过培养基和已经形成的任何集落反射或折射给图像捕捉 装置。这种照射产生的图像的目的是使区别培养基和集落的颜色成为可能。识别颜色的可 能性经常是用于识别具体的微生物的重要的工具，因为某些微生物具有完全与众不同的着 色。总体结果是最接近于生物学家将期望看到的特定类型的微生物的视图，例如，其颜色、 集落的各个方面等的视图。这对于识别培养基和集落周围的着色的微妙变化来说是特别重 要的。另外，由环形照射产生的图像允许检测显色培养基中的细菌集落下面和周围的颜色 的微妙变化。
[0160] 侧面环形照射是只是光源218、220、222和224中的一个进行照射。这种照射产生 具有可用于识别轮廓和凸起的表面和纹理的具有阴影的图像。由于照射的方向，光源中的 每一个将引起不同的阴影效果。
[0161] 反向的环形照射从顶部单元反射到样本上。然后，样本将照射反射或折射给图像 捕捉装置。因而捕捉的图像给出样本中不同的集落的对比的细节。这种图像也可以提供颜 色信息。进一步地，这种图像可以提供纹理信息；集 落的外貌和颜色的细节；有关群集限制 的信息和关于集落的凸起表面的信息，如高度、形态和形状。
[0162] 反向的环形照射产生准垂直照射，其能够使梯度的变化可视化。这给出有关纹理 和粒度的信息，且可用于检测不具有很高的高度却具有表面不规则性的集落。在一个实施 方式中，利用反向的环形照射获取许多不同的图像且随后组合，以便处理图像的任何潜在 的饱和。
[0163] 垂直的照射源从上面照射样本。通过样本和集落反射照射，以给出提供详细的轮 廓信息的图像。这种图像可以用于识别样本的凸起的表面和集落的高度。然后，这种信息 可以用于识别特定类型的微生物，因为集落的凸起的表面的细节通常是非常特殊的。例如， 某些集落是圆顶状的，其他是崎岖不平的而另一些是平坦的。因而，垂直照射给出群集、气 泡、灰尘的检测等等的良好的视图。容易地产生集落表面和外貌的单色信息。
[0164] 由本发明提供的上述照射方向的变化提供了优势，因为很多不同类型的照射可以 用于获得样本中生长的集落的图像。多个图像可以用于识别不同的特征，且因此提供识别 这些特征的改进方法。
[0165] 如上文描述的，照射源和方向的每一个可以用于强调和增强不同的图像特征。在 不脱离本发明的范围的情况下，可以通过利用来自不同光源和方向的照射改变或调整所描 述的实例。
[0166] 此外，不同波长的照射可以用于不同的应用，例如，用于红外线和紫外线。
[0167] 本发明的应用之一是根据照射源的组合形成图像，以便生成合成图像。
[0168] 底部环形视图涉及在不同位置，也就是，在前面、后面、左边和右边，且与皮式培养 皿成相同仰角的四个照射源。
[0169] 成像系统114利用各自不同的照射源同时地照射皮式培养皿。因而，成像系统114 产生一个与照射源前面、后面、左边和右边的四个位置相关的图像。
[0170] 虽然四个图像可能似乎十分相似，但是由于照射源的方向，在图像上会出现某些 照射伪影，如皮式培养皿上的光的反射或渐变的阴影。
[0171] 照射伪影可以包括镜面反射，其是在照射之后出现的特定方向中的镜面反射。照 射伪影还可以包括与在皮式培养皿中具有特定高度的对象相关的阴影。照射伪影还可以包 括与非均匀的光强度相关的渐变阴影。
[0172] 镜面反射包括亮点且取决于相应的光源。这意味着，可能仅仅在利用与特定的视 图（如右边视图）相关的光源时才发生镜面反射。因而，当利用与其他三种视图相关的光 源时，也就是，利用左视图、前视图和后视图时，可能不会发生镜面反射。
[0173] 如图17所示，其与现有技术相关，镜面反射位于集落边缘。取决于使用的光源的 方向，镜面反射可能位于不同的集落边缘。图17显示表示作为合成图像的四个照射源（也 就是，后面、前面、左边和右边的照射源）同时照射时的图像。
[0174]因此，需要改进图像的质量，以便将图像中的集落检测优化为不存在这样的照射 伪影的情况。
[0175] 本发明的第一方面涉及用于去除照射伪影如镜面反射的方法。
[0176] 该方法用于根据图18中所示的下列步骤操作以去除照射伪影。
[0177] 如图18所示，在步骤2211中，从三种颜色通道R、G和B选择颜色通道。在步骤 2212中，基于已确定的数目为N的视图获取皮式培养皿的图像。每一个N视图涉及以特定 方向朝着皮式培养皿的照射源。因而，如参考标记2213所示，每一个照射源产生正视图图 像、后视图图像、左视图图像或右视图图像。
[0178] 在底部环形照射的背景中，所有的照射源设置成与皮式培养皿成相同的入射角。 在本发明中，用于去除镜面反射的这个方法的底部环形照射包括数字N，其等于产生四个不 同的图像的四个光源。因此，步骤2212提供四个不同的图像。至少，不同的视图的数目N 应该等于三，以便在去除方法结束时获得最佳化的生成的校正的图像。另外，照射源必须均 匀地设置在皮式培养皿的周围而且与皮式培养皿成相同的入射角。
[0179] 在步骤2213,确定N幅图像中的每一个像素的N个值。这意味着，对于与四个照射 源的四个不同的视图对应的所有的四幅图像，利用相应的值定义每一个像素P。
[0180] 在步骤2214中，考虑到每一个像素p，确定校正的像素值。校正的像素值可能与每 一个像素P有关的中间值v相关，其中从像素的N个值确定中间值。这意味着，对于具有四 个值的像素pl，如所述四个值为左下角值（LBpl)、前下角值（FBpl)、后下角值（BBpl)和右 下角值（RBpl)，计算中间值，以便获得相应的颜色通道中的特定的像素的唯一值。因而，在 计算中间值之后，像素P1的中间值可能是N个值中的任何一个。
[0181] 校正的像素值也可能涉及第一计算值，其与N个像素值内的中间数值的像素值的 平均值相关。
[0182] 校正的像素值也可能涉及第二计算值，其与最低值和最高值之外的像素值的平均 值相关。
[0183]因而，包括中间值、第一计算值或第二计算值的校正的像素值可以代替相应的颜 色通道的所考虑的像素的像素值。下面的实例说明其中底部环形视图包括四个不同的光源 (也就是，N = 4)的情况。校正的像素值涉及中间值。确定颜色通道R、G和B中的每一个 的中间值。
[0184] 特定的像素pi的中间值的确定的实例：
[0185] 对于颜色通道R:
[0186] N = 1;左下角视图-图像1-LBpl = R1
[0187] N = 2;前下角视图-图像2-FBpl = R2
[0188] N = 3;右下角视图-图像3-RBpl = R3
[0189] N = 4;后下角视图-图像4-BBpl = R4
[0190]其中 R1>R2>R3>R4,例如，
[0191] 颜色通道R的pi的中间值的确定为：VI (pi) = (R2+R3)/2
[0192] 对于颜色通道G:
[0193] N = 1;左下角视图-图像1-LBpl = G1
[0194] N = 2;前下角视图-图像2-FBpl = G2
[0195] N = 3;右下角视图-图像3-RBpl = G3
[0196] N = 4;后下角视图_图像4_BBpl = G4
[0197]其中 G1>G2>G3>G4,例如，
[0198] 颜色通道G的pi的中间值的确定为：V2(pl) = (G2+G3)/2
[0199] 对于颜色通道B:
[0200] N = 1 ;左下角视图-图像1-LBpl = B1
[0201] N= 2;前下角视图-图像2-FBpl = B2
[0202] N = 3 ;右下角视图-图像3-RBpl = B3
[0203] N = 4;后下角视图-图像4-BBpl = B4
[0204]其中 例如，
[0205] 颜色通道B的pi的中间值的确定为：V3(pl) = (B2+B3)/2
[0206] 在现有技术中，底部环形视图涉及根据如图17所示的N个照射源的同时照射获得 的N幅图像的实际结合。在本发明中，如图19所示，逐一处理来自每一个照射源的每一个 照射。因而，获得了与N个照射源相关的N幅图像。在确定N幅图像的每一个像素的校正 的像素值之后，以算法为基础计算生成图像。在如图20所示的校正的图像中，确定的中间 值影响到每一个相应的像素。这意味着，考虑到每一个颜色通道，像素值等于所考虑的颜色 通道的这个像素的中间值。
[0207] 基于上述实例，如下指定像素pi的中间值：
[0208] 关于颜色通道R，利用VI (pi) = (R2+R3) /2指定pi
[0209] 关于颜色通道G，利用V2 (pi) = (G2+G3) /2指定pi
[0210] 关于颜色通道B，利用V3(pl) = (B2+B3)/2指定pi
[0211] 校正的图像，如图20所示，显示具有如集落的对象而不具有照射伪影的皮式培养 皿。
[0212] 在进一步的图像处理算法的操作期间，考虑照射伪影。这负面地影响用于产生图 像的算法的过程。在现有技术中，需要用于改变与生成的图像相关的算法的步骤。因而，现 有技术方法要求，基于照射伪影的质量和类型，算法的参数适于图像的内含物。用于本发明 的第二方面的上述根据本发明的第一目标的方法的优势是，不需要算法的参数针对所产生 的最终图像而特别调整或调节。
[0213] 在另一个实施方式中，N幅图像还可能包括黑白图像。
[0214] 现在将在另外的实施方式中，描述许多另外的图像处理技术。图10显示一般的图 像处理技术的简化视图。在第一个步骤1700中，利用一个照射源或照射源的组合获取多个 图像。实施培养皿检测技术步骤1702,以便检测培养皿的第一类型的特征（如培养皿的轮 廓和边缘）。然后，在步骤1704中，实施标志检测技术，以便识别第二类型的特征（如培养 皿上的标志或絹印）。在步骤1706中，实施另外的检测技术。存在许多不同的另外的检测 技术，下面将进一步更加详细地描述，这些技术涉及生物对象或集落的检测。可能有在相同 的样本上实施的一系列不同的图像处理技术，并且如果遇到这种情况，则在步骤1708中， 处理过程将被反馈给随后的进一步的图像处理技术。在某些进一步的检测技术中，实施培 养皿检测和/或标志检测可能是没有必要的，因为这些检测可能不能帮助正在实施的进一 步的检测技术。同样地，至少某些进一步的检测技术可以是独立的技术。
[0215] 培养皿检测技术1702是识别由有盖培养皿的壁和盖子形成的环的技术。技术涉 及对象检测技术，如圆形霍夫变换（如在Duda，R. 0.和P. E. Hart的〃Use of the Hough Transformation to Detect Lines and Curves in Pictures,''Comm. ACM, 15 卷，11-15 页 (1972年1月）中描述的），以便检测预定尺寸的圆形对象。背光图像被用作产生样本的良 好的强对比图像。另外，输入皮式培养皿的尺寸，以向变换指示所寻找的一个或多个圆形对 象的性质。也可以输入所寻找的环的数目，这样，培养皿和盖的多个环就可以位于适当的位 置。霍夫变换的应用可能导致皮式培养皿的一个或多个环（盖子或主体）的定位。在另外 的步骤中，如果需要，这种信息能够实现从生成的图像去除皮式培养皿环或对环或培养皿 的外部进行掩蔽。这确保进一步的检测方法可以集中于皮式培养皿的内部。应该注意，霍 夫变换适用于圆形器皿；然而，其他对象检测算法可以用于不同形状的器皿。
[0216] 可替换地，其他类型的对象检测技术可以用于检测皮式培养皿的轮廓，而不使用 圆形霍夫变换。可替换的对象检测技术允许检索图像中的闭合轮廓，以便识别皮式培养 皿的边界。可替换的技术包括以已知的技术为基础检索图像的可能的轮廓的第一步骤，如 J. Canny 的文献"A Computational Approach to Edge Detection"中描述的 C anny 边缘检 测方法、或形态学梯度边缘检测。因而，第一步骤提供灰度图像。
[0217] 可替换的技术包括利用Matlab?函数如"具有孔选项的填充函数（imfill) "填充 检索到的轮廓的第二步骤。这意味着，在其中轮廓是培养皿周围的闭合轮廓的情况中，填充 步骤仅填充培养皿的内部。可替换的技术还包括检索闭合轮廓内的最大的内切圆的步骤。 在进一步的步骤中，以相应的内切圆的半径和中心的位置为基础确定培养平皿半径和培养 皿的中心的位置。可替换的技术的优势是，无需提前知道不确定的轮廓尺寸而实施这个对 象检测技术。
[0218] 参考图11，现在描述标志检测技术。在第一步骤1800中，将皮式培养皿的多个图 像载入系统。
[0219] 在步骤1802中运行分割处理，其中在步骤1802中，以二值化处理过程分割图像， 以便形成数字化的图像。分割处理提供将像素分成多个类别。二值化处理过程是提供黑色 或白色两个类别的像素的具体的分割处理。二值化处理过程以由暗色的墨点制成的絹印的 原始结构为基础。因而，二值化处理过程包括用于检索具有点状形状和深颜色的对象的步 骤。结果，二值化处理过程提供用于将絹印与其他对象如集落、气泡或默认对象进行区别的 改进的方法。步骤1802的二值化处理过程包括用于识别皮式培养皿上的絹印的几个步骤。 二值化处理过程不同于熟知的k均值聚类方法。k均值聚类方法聚集相同颜色的像素。二 值化处理过程聚集具有相似颜色同时也紧密临近的像素。可以在步骤1804中进行搜索，以 便识别对象，即，例如，形状大体上是矩形的对象。更普遍地，可以针对呈现非生物学特性的 特征或对象进行搜索。这些特征可能包括特殊的形状、絹印、条形码、标签、标牌等等。标记 已识别的对象，且假定在皮式培养皿上标记。合成的图像是1806且其可用于进行定位，而 且如果需要，可用于去除或掩蔽培养皿上的标志，而不考虑原始图像。标志的位置可以用于 相同的培养皿的所有其他图像，与是什么样的照射无关，也与在第一个实例中用于检测标 记的图像或一组图像无关。在具体的实例中，当培养皿中显示没有集落时，这种算法可以用 于识别标记。
[0220] 现在将描述某些另外的图像处理技术。图12a和12b显示用于检测隔离的集落的 处理过程。在第一步骤1900中，利用不同的照射源获取多个图像。选择一个图像或多个图 像的组合，用于进一步的处理。然后，在步骤1902中，通过应用圆形霍夫变换处理选择的一 个或多个图像。这个步骤识别圆形对象如细菌的菌落。可输入典型的菌落大小，以限制霍 夫变换搜索特定大小的圆形元素。一旦识别了圆形对象（菌落），就在步骤1904中将隔离 检验应用于每一个圆形对象。进一步根据图12a描述隔离检验。隔离检验包括确定已识别 的圆形对象（未示出）的中心的步骤。然后，应用二值化步骤1908,以便获得其中二值化图 像的中心对应于已识别的圆形对象的中心的二值化图像。其后，在步骤1910中，在二值化 图像上实施圆度的检验，以核实二值化对象是否是圆形的。尺寸和隔离区的确定的进一步 的步骤1912与下面描述的方法相关，并且实施该步骤，以确定菌落的尺寸以及菌落的直径 和菌落周围的隔离的区域。典型的输出如1906所示。
[0221] 对于用户或对于自动检选设备或半自动检选设备来说，皮式培养皿内的菌落的位 置可能是不方便操作的。因此，看来需要提供关于所要检选的菌落的邻近菌落的详细信息。
[0222] 本发明的第二方面是确定感兴趣的对象如集落的邻近集落，以便获得详细信息， 从而对集落的进一步的手工或自动检选处理提供指导。方法的目标是确定集落的邻近集落 的接近程度，以便获得相应的集落的检选模式，从而指导检选处理过程。考虑先前的步骤 1902中的二值化图像。在本发明中，假设二值化图像中的所有的二值化对象是微生物。
[0223] 如图14所示，在二值化图像的中心的附近搜索其他对象，这是感兴趣的对象的中 心。搜索方法包括在步骤1811中形成许多确定半径的圆，以便搜索在二值化掩膜图像的相 应的圆形表面（如二值化掩膜图像的中心周围的冠状物）内的任何其他对象。每一个冠状 物包括具有特定半径值的圆形表面。通过具有连续的半径值（successive radius value) 的两个圆划定每一个冠状物的界限。在步骤1812中，搜索方法还包括确定冠状物中至少一 个其他对象的存在和位置。如果在围绕二值化图像的中心的冠状物中没有其他对象，那么 利用围绕二值化图像的中心的360°的角扇区定义冠状物。如果任何其他对象位于冠状物 内，在步骤1813中实施相应的空隙角的确定。空隙角与用于定义所要通过用户或自动的设 备检选的中心对象的可用性的角扇区相关。空隙角的值与冠状物内检测的许多其他对象的 数目直接成正比例。空隙角与冠状物的角扇区的最大值相关，在所述冠状物的角扇区中不 存在其他对象。因而，可在用于相对于用户或自动的设备自动设备的最好的条件下，在冠状 物的相应的空区域中执行检选处理过程。也可以确定空隙角的其他值，以详细说明感兴趣 的对象周围的所有的相应的隔离区。
[0224] 因而，在步骤1814中产生相关的感兴趣的对象的检选模式。在图16中显示与感 兴趣的具体的对象（也就是，集落）相关的检选模式的实例。检选模式包括与空隙角和相 应的感兴趣的对象的冠状物相关的检选模式值。
[0225] 在现有技术中，如图15所示，查找表定义标准或用户标准如感兴趣的中心对象的 特定的空隙角和特定的配置。取决于对象在皮式培养皿内的隔离水平，几个标准用于将集 落分级。例如，如果没有其他对象位于集落周围的2mm的冠状物内且如果没有其他对象位 于集落周围的30°直到7mm的角扇区中，则集落属于等级C2-A3。以现有知识和用户的习 惯为基础设定标准。在现有技术的过程，用户具有特定的用户标准，这些标准与如何为用户 检选最佳条件的集落相关。基于用户是惯用右手还是惯用左手和/或集落的尺寸和/或集 落的位置（例如，接近皮式培养皿的边缘），标准与检选集落的用户的平常习惯相关。也可 以考虑其他标准。在本发明的第二方面中，在步骤1815中，用户必须确定哪一个用户标准 匹配检选模式，以便确定是否可以实施用于检选集落的检选处理过程。
[0226] 本发明的第二方面提供除了用于指示用户或自动化的设备的现有技术的查找表 之外的工具，上述用户或任何其他自动化的设备标准可以在其中被用于感兴趣的具体的中 心对象。同样地，本发明提供用于确定集落的邻近集落的另外的方法，用于改进集落的检选 处理过程。另外，也可以在没有利用查找表的情况下应用如图16所示的检选模式，以便确 定用于检选集落的最好的条件。
[0227] 如果集落匹配查找表的至少一个标准组合，则将集落确定为隔离的集落。大多数 隔离的集落属于不只一个标准组合。在图16中所示的检选模式中，集落不属于空隙角小于 360°和至集落的距离是3mm的等级C1。然而，如图20所示，集落属于等级C3-A1、C3-A2和 C4-A1。因而，用户或自动设备可以容易地确定哪一个标准可以应用于具体的集落，而不是 尝试应用查找表的所有可能的标准。从本发明获得的检选模式提供指导和当执行检选处理 过程时，允许用户或自动设备节省时间。
[0228] 本发明的第三方面涉及位于皮式培养皿的集落或对象的数目的确定。
[0229] 本发明的第三个方面处理用于计数隔离的集落和计数来自分组集落的群落的解 决方法，其中包括识别位于皮式培养皿的边缘的集落。词语"连接的组分"或"元素"涉及 对象如集落或大量对象。
[0230] 如图21所示，在步骤2511中，应用与皮式培养皿上的反射的去除相关的预处理。 预处理可能以用于去除如根据内部二值化图像和外部二值化图像的第一区别描述的照射 伪影的处理过程为基础。因而，需要定义培养皿内的边界，以确定培养皿的内部部分和培养 皿的外部部分。可以通过应用上文提到的培养皿检测方法估计皮式培养皿的边界的塑料的 中心和半径。然后，将外半径设定为估计的半径的100%，以获得对应于从皮式培养皿的中 心至皮式培养皿的边界的距离的外半径。在图22中显示外半径的极限。
[0231] 例如，以相似的方式，将内半径设定为估计的半径的85%。在图22中显示外半径 的极限。
[0232] 内半径和外半径使得建造内掩膜和外掩膜这两个相应的二元掩膜（binary mask) 成为可能。内掩膜对应于培养皿的内部，不包括培养皿的外围。外掩膜对应于整个培养皿， 包括培养皿的外围。内半径定义皮式培养皿的第一区域且外半径定义皮式培养皿的第二区 域。内部区域和外部区域的组合定义皮式培养皿的整个表面。
[0233] 在步骤2512中，执行二值化处理过程，以获得总体二值化图像。通过利用底部黑 色背景视图执行步骤2512的内部二值化处理过程。然后，将图像转变为灰度图像。然后利 用大津法（Otsu method)二值化灰度图像。大津法用于简化灰度图像，从而提供二值化图 像。在内部二值化方法中，上文描述的使用内部掩膜定义的内部像素用于计算必需的大津 阈值。如图23所示，基于这个阈值，二值化整个图像。
[0234] 然后，利用称为形态学打开的现有技术的功能清理二值化图像。形态学打开功能 允许从图像前景去除小的对象并放置在图像的背景中。在本发明中，形态学打开功能包括 应用具有5个像素半径的盘状结构元素。因此，如图24所示，形态学打开功能的应用因此 去除比结构元素小的对象。
[0235] 由于已经二值化整个培养皿，那么二值化图像包括内部集落和位于皮式培养皿的 外围上的外部集落。在另外的步骤中，二值化图像被分成图25所示的内部二值化图像和图 26所示的外部二值化图像，内部二值化图像包括位于内部掩膜的连接的组分，外部二值化 图像仅仅含有完全或局部地包括在皮式培养皿的外围的连接的组分。本发明的第三个目标 包括用于提供改进的外部二值化图像的步骤。实际上，因为在皮式培养皿的外围上出现很 多反射，所以利用上述二值化步骤获得的外部二值化图像经常是不正确的，这是因为镜面 反射引起对象被错误地认定为集落。因而，需要改进外部二值化图像。下列步骤提供通过 利用上述步骤中确定的内部二值化图像的参数，用于改进外部二值化图像的质量的方法。
[0236] 在步骤2513中，外部二值化处理过程包括利用具有颜色的背光视图的外部二值 化图像。熟知的功能称为用于去除前景中的小孔的形态学关闭。结合具有设定为最小集落 半径的半径的盘状结构元素使用形态学关闭。可以利用内部二值化图像中的集落的最小半 径的估计确定最小的集落半径。基于本领域的技术人员的知识，最小半径可能在10和15 像素之间。在运行形态学关闭功能之后，去除比结构元素小的深色对象，并且作为结果，如 图27所示，可在背光视图中清晰地看到塑料边界。这些步骤提供第一生成图像。
[0237] 在进一步的步骤中，将第一生成图像转变到Lab颜色空间。这意味着，RGB空间的 第一生成图像被转变成Lab颜色空间的第二生成图像。从Lab空间计算如图28所示的II 和图29所示的12这两个图像：
[0238] Ii= 1-[L]
[0239] 且
[0240] I2= [[a] + [b]]
[0241] L、a、b是Lab空间的通道且[*]是利用下面的最大-最小归一化重新调 节在0和 1之间的像素值的运算符：
[0243] 利用图像1:和I 2二者完善外部二值化图像。计算I i上的内部二值化对象的平 均值，以获得E[IJ。计算12上的内部二值化对象的平均值，以获得E[I 2]。将具有低于 〇.9XE[IJ的1:的值的像素设定为0。以相似的方式，将具有低于0.9XE[I2]的1 2的值的 像素设定为〇。那么，如图34所示，外部二值化图像含有比第一生成图像少的不真实的对 象。
[0244] 在最后的步骤中，通过利用具有设定为最小集落半径的半径的盘状结构元素，在 外部二值化图像上应用形态学打开功能。
[0245] 结果，在步骤2514中，产生结合内部二值化图像和改进的外部二值化图像的总体 二值化图像。
[0246]因为位于皮式培养皿的许多连接的组分可能与集落或与许多集落相关，因此需要 改进集落的检测，这在下面的步骤中进行描述。
[0247] 如步骤2515中所示，识别连接的组分，以确定它们在皮式培养皿中的位置。取决 于具体的连接的组分的位置，可以出现两种不同的步骤。
[0248] 如步骤2516中所示，如果连接的组分位于内部二值化图像，那么利用相应的底部 视图中的像素的值指定每一个像素值。因而，获得内部合成图像。
[0249] 如步骤2517中所示，如果连接的组分位于外部二值化图像，那么计算像距。像距 是现有技术中熟知的。像距代表根据对象到对象边缘的距离表示对象的图像。利用计算的 像素值，即，背光视图中相应的像素值和像距内相应的像素值的平均值指定位于外部二值 化图像中的连接的组分的每一个像素值。因而，获得外部二值化图像。
[0250] 在步骤2518中，结合内部合成图像和外部合成图像，以便获得如图31所示的合成 图像。在图31中，利用高值设定集落的中心和利用低值设定集落的边缘。这意味着，合成 图像的像素值取决于像素与对象边缘的接近程度。以上述步骤为基础，合成图像现在代表 取决于集落的形状和颜色这两个标准的集落。现有技术已知的扩展最大值变换功能用于表 示集落的中心。因而，改进了用于分割合成图像的分割算法的应用，详情如下。
[0251] 如步骤2519中所示，将分割算法，如现有技术中已知的分水岭算法应用于合成图 像，以便获得集落的最终的表示。图32所示的最终的图像代表以上述两个标准为基础的集 落。这意味着，对象包括可识别的边缘。因而，最终的图像促进位于最终的图像的集落的计 数过程。
[0252] 应该明白，也可以使用检测过程和最佳的照射源的其他组合。照射源的位置可随 着需要而变化且不依赖于此处描述的影响的位置和方向。
[0253] 可以预期，能够结合多种增强和图像处理技术，以便分析某些样本。这将需要利用 某些或所有的技术。可以任何顺序应用技术且顺序可以从一个样本到下一个样本而变化。 在选择的一种或多种技术应用于样本且没有识别到集落之后，可以确定，在样本上没有生 长集落。
[0254] 在任何图像增强技术或图像处理技术中，系统都可以在处理过程的开始的时候被 提供以附加信息。这些附加信息可以包括与皮式培养皿或其他样本容器相关的细节，例如 尺寸、形状、材料等等。附加信息还可以包括培养基和可能在该材料上生长的任何预期类型 的材料的细节。信息还可以包括成像细节如曝光时间、照射源、皮式培养皿的定向、任何其 他光学或控制参数等等。信息可以指示应用的目的，例如，用于工业、医药等等。视情况而 定，还可以包括任何其他相关的信息。
[0255] 分析样本和检测伪影的这种自动化处理过程提供了很多优势。进行检测和必要时 去除如笔迹和标志的伪影的能力，使得集落的隔离更容易。相同的技术可以用于检测其他 伪影，并在另外的步骤中，从图像去除它们。例如，如果一批培养皿在特定尺寸和颜色的营 养物中具有过多的气泡，可借助于上述描述的处理过程检测这些伪影，并且如果必要，进行 去除。同样地，还可以处理其他光学伪影。
[0256] 上述描述的发明涉及用于获得和处理生物样本的图像的方法和计算机程序产品。 可以在不同的环境中应用本发明的某些或所有的方面。
[0257] 上述描述的发明中的某些涉及至少在某些程度上能够在计算机上实施的处理过 程。因此，可借助于软件或硬件或其任意组合实施提到的处理技术和步骤。已经结合硬件 描述了本发明的方面，应该明白，可以通过适当的软件模块代替该硬件。同样地，可以利用 适当的硬件代替软件模块或处理过程。
[0258] 可以通过用于生物分析的设备的现有控制系统的适当的程序设计及辅助设备、和 /或利用用于图像处理的单独的数据处理装置实施根据第一、第二和第三目标的发明。
[0259] 应该明白，存在本发明的很多可能的变化，其属于本发明的预定范围。
【主权项】
1. 一种用于定义细胞培养皿中感兴趣的对象周围的隔离区的方法，所述方法包括下列 步骤： -利用多个照射源中的一个或多个照射源获得所述细胞培养皿的一个或多个图像，每 一个照射源能够从不同的方向照射所述培养皿； -选择图像或图像的组合，用于进一步处理； -应用圆形对象检测变换，以识别所述细胞培养皿中的一个或多个为实质上圆形的对 象的感兴趣的对象，并且确定感兴趣的对象的中心，其中感兴趣的圆形对象代表所述细胞 培养皿中孤立的集落； -应用二值化步骤以获得所述感兴趣的对象和其他对象的二值化图像，其中，所述二值 化图像的中心对应于所述感兴趣的对象的中心； -重复地形成半径不断增加的同心圆，其中，所述同心圆以所述二值化图像的中心为中 心； -识别冠状物，其中，通过具有连续的半径值的两个圆划定冠状物的界限； -对于每一个冠状物： -确定位于所述冠状物中的任何其他对象的存在和位置，从而确定其他对象的存在和 位置； -确定定义所述感兴趣的对象周围没有其他对象的角扇区的空隙角，从而定义所述感 兴趣的对象周围的隔离区。2. 根据权利要求1所述的方法，还包括提供所述对象的检选模式，其中，所述检选模式 包括与每一个冠状物和相应的空隙角相关的值。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的方法，还包括利用所述检选模式结合用于检选 处理过程的查找表确定与所述查找表的具体的标准相关的集落的检选处理过程的可用性。4. 一种计算机程序产品，包括用于引起可编程的数据处理装置执行根据权利要求1至 3所述的方法的图像处理步骤的指令。5. -种用于形成生物样本的改进的图像的方法，其中，所述图像包括像素，每一个像素 具有第一像素值，所述方法包括下列步骤： -利用数目为N的照射源照射所述生物样本； -获取每一个不同的照射源下的所述生物样本的图像，以获得N幅图像； _利用所获得的N幅图像确定N个像素值； -基于所述N个像素值确定校正的像素值； -对于每一个像素，利用所述校正的像素值代替所述第一像素值，以便获得所述生物样 本的改进的图像。6. 根据权利要求5所述的方法，其中，将所述照射源均匀地布置在所述生物样本周围， 且所述照射源相对于所述生物样本具有相同的入射角。7. 根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中，所述N幅图像包括与相应的颜色通 道相关的N幅彩色图像或N幅黑白图像。8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所校正的值是N个像素值的中间值并且针对每一 个颜色通道计算中间值。9. 一种计算机程序产品，所述计算机程序产品包括用于引起可编程的数据处理装置执 行根据权利要求5至8所述的方法的图像处理步骤的指令。10. -种用于确定包括由对象和对象的组组成的元素的细胞培养皿的图像中的对象的 数目的方法，所述方法包括下列步骤： -利用照射源的已确定的视图获取所述细胞培养皿和元素的图像； -应用二值化步骤以获得所述图像的二值化版本，其中，二值化图像包括内部二值化图 像和外部二值化图像，其中，所述内部二值化图像对应于所述细胞培养皿的内部部分，且所 述外部二值化图像对应于所述细胞培养皿的外部部分； -确定每一个元素在所述二值化图像中的位置，以确定组分是位于所述内部二值化图 像还是位于所述外部二值化图像中； -如果所述组分位于所述内部二值化图像中，则利用相应的第一像素值代替表示所述 内部二值化图像中的所述组分的图像的像素的像素值，以获得第一合成图像； -如果所述组分位于所述外部二值化图像中，则利用相应的第二像素值代替表示所述 外部二值化图像中的所述组分的图像的像素的像素值，以获得第二合成图像； -结合所述第一合成图像和所述第二合成图像，以获得合成的图像，其中所述合成的图 像的像素值取决于像素与所述对象的边缘的接近程度； _将分割算法应用于所述合成的图像，以便获得包括具有可分辨的边缘的对象的图像。11. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述二值化步骤包括内部二值化步骤和外部 二值化步骤。12. 根据权利要求11所述的方法，其中，所述外部二值化步骤包括应用形态学关闭功 能以获得生成图像，其中，所述已确定的视图是背光视图。13. 根据权利要求12所述的方法，其中，将所述生成图像从第一颜色空间转变到感觉 更加均匀的第二颜色空间，如L、a、b颜色空间。14. 根据权利要求10至13中的任一项所述的方法，其中，通过利用所述元素的像素值 确定所述元素的第一像素值，其中，所述已确定的视图是底部环形视图。15. 根据权利要求10至14中的任一项所述的方法，其中，通过计算所述外部二值化图 像的相应的像距内的元素的像素值和所述生成图像中的元素的像素值的平均值确定元素 的第二像素值。16. 根据权利要求10至15中的任一项所述的方法，其中，所述分割算法是分水岭算法。17. -种计算机程序产品，所述计算机程序产品包括用于引起可编程的数据处理装置 执行根据权利要求10至16所述的方法的图像处理步骤的指令。
【专利摘要】一种用于定义细胞培养皿内感兴趣的对象周围的隔离区的方法，方法包括下列步骤：利用多个照射源中的一个或多个获得细胞培养皿的一个或多个图像，每一个照射源能够从不同的方向照射器皿；选择图像或图像的组合，用于进一步处理；应用圆形对象检测变换，以识别细胞培养皿中的一个或多个实质上圆形的感兴趣的对象，其中感兴趣的圆形对象代表细胞培养皿中隔离的集落，并且确定感兴趣的对象的中心；应用二值化步骤获得感兴趣的对象和其他对象的二值化图像，其中二值化图像的中心对应于感兴趣的对象的中心；重复地形成半径不断增加的同心圆，其中同心圆集中在二值化图像的中心；识别冠状物，其中通过具有连续的半径值的两个圆划定冠状物的界限；对于每一个冠状物：确定位于冠状物中的任何其他对象的存在和位置，从而确定其他对象的存在和位置；确定定义感兴趣的对象周围没有其他对象的角扇区的空隙角，从而定义感兴趣的对象周围的隔离区。
【IPC分类】G06T7/00, G06K9/00
【公开号】CN104903914
【申请号】CN201380069532
【发明人】劳伦·埃拉诺, 纪尧姆·苏特拉, 罗瑞德·穆诺兹, 科琳·菲尔希龙, D·德科, 弗莱德瑞克·皮恩斯顿
【申请人】生物梅里埃公司, 原子能与替代能源委员会
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月7日
【公告号】EP2731051A1, EP2917873A1, US20150278575, WO2014072422A1
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