外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法
外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业应用技术领域，尤其涉及一种外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子 萌发的方法。
【背景技术】
[0002] 土壤盐渍化是一个世界性的资源和生态问题，我国有盐碱地区3. 6X 107 hm2,约 占总耕地面积的十分之一，由于灌溉不当和大量施用化肥等原因，次生盐碱化土壤面积还 在继续扩大，从而导致可耕地面积逐年下降，有研宄指出在未来的25年内耕地面积将减少 30%，所以土壤盐渍化严重制约着农林业生产和生态环境建设。由于盐渍化的土壤中含有 钠、钾、钙、镁等的硫酸盐、氯化物、碳酸盐和重碳酸盐，而且含量较高，因此对于玉米种子的 影响极为严重，盐渍化的土壤会影响玉米种子的早期发芽率及发芽指数，阻碍玉米种子萌 发，降低玉米种子中抗氧化酶活力和抗氧化物质含量，影响胞内氧化还原势以及K+/ Na+离 子平衡，对玉米细胞产生伤害，进而导致玉米种子发芽率极低，甚至不发芽。
【发明内容】
[0003] 本发明对于上述现有技术的不足，提供了一种外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子 萌发的方法。
[0004] 本发明的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，其操作步骤如下： a、 消毒：用5%~15%重量浓度的消毒液浸泡玉米种子10~20min，用水冲洗干净后晾 干，得消毒玉米种； b、 浸糖：用0. 1~lmmol ? I71的糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种30~50h，得耐 盐玉米种。
[0005] 作为本发明的进一步改进，其操作步骤如下： a、消毒：用8%~12%重量浓度的消毒液浸泡玉米种子10~15min，用水冲洗干净后晾 干，得消毒玉米种； 浸糖：用〇. 3~0. 8mmol ? I71的糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种40~50h，得耐 盐玉米种。
[0006] 作为本发明的进一步改进，所述的消毒液为次氯酸钠溶液。
[0007] 作为本发明的进一步改进，所述的糖溶液为葡萄糖溶液或蔗糖溶液。
[0008] 本发明的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，通过对玉米种子进行葡 萄糖溶液或蔗糖溶液的浸种处理，明显提高了玉米种子早期发芽率及发芽指数、促进了玉 米种子的萌发，而且能够提高抗氧化酶活力和抗氧化物质含量，维持胞内氧化还原势以及 K+/ Na+离子平衡，缓解盐胁迫对玉米细胞的伤害，促进盐逆境下玉米种子萌发。
【附图说明】
[0009] 图1是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米种子生长的影响； 图2是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米种子发芽率的影响； 图3是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米种子发芽指数的影响； 图4是Glc和Sue预处理对盐胁迫玉米胚芽TBARS含量的影响； 图5是Glc和Sue预处理对盐胁迫玉米胚芽H202含量的影响； 图6是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽SOD活性的影响； 图7是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽APX活性的影响； 图8是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽GPX活性的影响； 图9是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽GR活性的影响； 图10是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽G6PDH活性的影响； 图11是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽Na+、K+含量的影响； 图12是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽K+/Na+比的影响。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 本发明的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，其操作步骤如下： a、 消毒：用5%重量浓度的次氯酸钠溶液浸泡玉米种子lOmin，用水冲洗干净后晾干，得 消毒玉米种； b、 浸糖：用0. lmmol吨4的葡萄糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种30h，得耐盐玉米 种。
[0011] 实施例2 a、 消毒：用15%重量浓度的次氯酸钠溶液浸泡玉米种子20min，用水冲洗干净后晾干， 得消毒玉米种； b、 浸糖：用lmmol ? I71的蔗糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种50h，得耐盐玉米种。
[0012] 实施例3 a、 消毒：用8%重量浓度的次氯酸钠溶液浸泡玉米种子lOmin，用水冲洗干净后晾干，得 消毒玉米种； b、 浸糖：用0. 3mmol吨4的葡萄糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种40h，得耐盐玉米 种。
[0013] 实施例4 a、 消毒：用12%重量浓度的次氯酸钠溶液浸泡玉米种子15min，用水冲洗干净后晾干， 得消毒玉米种； b、 浸糖：用0. 8mmol吨4的蔗糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种50h，得耐盐玉米种。
[0014] 实施例5 a、 消毒：用10%重量浓度的次氯酸钠溶液浸泡玉米种子10min，用水冲洗干净后晾干， 得消毒玉米种； b、 浸糖：用0. 5mmol吨4的葡萄糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种48h，得耐盐玉米 种。
[0015] 实施例6 a、消毒：用10%重量浓度的次氯酸钠溶液浸泡玉米种子lOmin，用水冲洗干净后晾干， 得消毒玉米种； b、浸糖：用0. 5mmol吨4的蔗糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种48h，得耐盐玉米种。
[0016] 下面以实施例5及实施例6为例，通过对比实验对处理过的玉米种子进行各项指 标检测： 对照组的选择：选取大小一致且无破损的玉米（Zea Mays L.)杂交种垦玉6号（由黑 龙江八一农垦大学玉米育种研宄室提供)，并以实施例5和实施例6的方法进行处理玉米 种子，将其播于含150 mM NaCl的6%水琼脂上，对玉米种子进行盐胁迫处理5 d，以不加盐 的水琼脂作为非胁迫处理；供试7个处理分别为正常生长对照（即水浸种非胁迫处理，CK)、 Glc浸种非胁迫处理（G，实施例5制得的玉米种子)、Sue浸种非胁迫处理（T，实施例6制得 的玉米种子)、水浸种盐胁迫处理（S)、Glc (葡萄糖）浸种盐胁迫处理（G+S)、Suc (蔗糖）浸 种盐胁迫处理（T+S)、甘露醇浸种盐胁迫处理（M+S)，每个处理3次重复，每次100粒种子， 培养皿置于人工气候箱内，25°C黑暗发芽，相对湿度为60%，种子芽长达到种子长度的一半 时即视为发芽，每天记录各处理种子的发芽数，计算发芽率和发芽指数作为萌发动力学的 参数，于盐处理第5 d取玉米胚芽测量各项生理生化指标，其检测方法如下： 1、生长指标的测定：盐处理第5 d，每个处理取10株玉米，测量其芽长、根长。将玉米 胚芽与胚根分离，置于105°C烘箱中杀青15 min，80°C烘干至恒重，然后称取干重，并分别计 算每株幼苗地上部及地下部干重；如图1所示，其为Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米种子 生长的影响；而Glc和Sue预处理对盐胁迫玉米胚芽长、胚根长、芽干重及根干重的影响见 下表1 :
注：各处理如图1所示。同一列数据后的不同字母表示在0. 05水平上差异显著。表 中数值为3次重复均值±必。下表同此。
[0017] 由图1可知，不同处理玉米幼苗胚芽长存在明显差异。由表1可知，非盐胁迫下， CK、G、T处理之间的各项生长指标无显著差异，150 mmol .I/1 NaCl胁迫对玉米生长具有明 显的抑制作用，与CK相比，S处理5 d后玉米胚芽和胚根长降低了 63. 64%和66. 51%，芽干 重及根干重分别降低了 72. 08%和60. 59%，差异显著；G+S、T+S处理的玉米与S相比各生长 指标均有显著提高，其中G+S处理的玉米胚芽长、胚根长、胚芽干重、胚根干重为S处理的 1. 54 倍、1. 30 倍、2. 09 倍、1. 79 倍，T+S 处理分别为 S 的 1. 67 倍、1. 31 倍、2. 69 倍、1. 94 倍， 且T+S处理胚芽干重显著高于G+S处理，M+S处理各生长指标虽然高于S处理，但差异不显 著，说明盐胁迫对于玉米种子早期生长具有明显的抑制作用，而Glc和Sue预处理可缓解盐 胁迫对玉米生长的伤害，促进玉米种子萌发阶段的干物质积累；此外，等渗的甘露醇处理未 能引起相同的效果，说明这种缓解效果并不是由于渗透作用引起的，是由糖浸种引起。
[0018] 如图2、图3所示，与CK相比，0? 5 mmol吨―1 Glc、Suc浸种均可不同程度地提高正 常条件下玉米种子萌发早期(发芽第2 d)的发芽率及发芽指数。盐胁迫下玉米种子发芽率 及发芽指数显著下降，与S处理相比，G+S、T+S处理均可明显提高盐胁迫下玉米种子早期发 芽率和发芽指数，其中Sue浸种处理效果最佳。此外，盐胁迫下甘露醇预处理其发芽率及发 芽指数均为各处理中最低，说明适当浓度的Glc、Suc预浸种(各为0. 5 mmol ?0能显著缓 解150 mmol ? I71 NaCl胁迫对玉米种子萌发的抑制作用。
[0019] 2、硫代巴比妥酸反应物（TBARS)及过氧化氢（H202)含量的测定：参照Hodges等的 方法测定TBARS，取0. 1 g胚芽烘干样品，加入5 ml 5%的三氯乙酸（TCA)研磨成匀浆，于 12000 g离心15 min，取2 ml上清液加入2 ml含0.5%硫代巴比妥酸（TBA)的20% TCA溶 液，沸水浴15 min，上清液分别于450 nm、532 nm、600 nm处比色；测定H202，取0.1 g胚芽 烘干样品，加入5 ml 0? 1% TCA冰浴研磨，12000 g于4 °C离心15 min，取1 ml~2 ml上 清液加入 〇? 5 ml 10 mmol ? I71 磷酸钾缓冲液（pH 7. 0)及 1 ml 1 mol ? I71 KI 于 390 nm 处比色，用1 ml 0. 1% TCA代替上清液作为对照。
[0020] TBARS是反应细胞膜损伤程度的重要指标，由图4、图5所示，盐胁迫下玉米胚芽中 的TBARS含量显著升高，为CK的1. 90倍.与S处理相比，0. 5mmol ? I71的Glc和Sue预处 理可明显降低盐胁迫下玉米胚芽的TBARS 含量，较S处理分别降低28. 78%、30. 35%。H202是 植物体内一类重要的活性氧。盐胁迫下各处理胚芽的H202含量明显升高，其中S处理的H 202含量为CK的2. 81倍.G+S和T+S处理明显降低了盐胁迫下玉米胚芽的H202含量，与S处理 相比分别降低24. 9%、20. 59%，且G+S处理与T+S处理间无显著差异。此外，等渗的甘露醇浸 种未能引起盐胁迫下玉米体内TBARS含量及H202含量的下降，说明外源糖浸种能够降低玉 米胚芽内的R0S含量，维持盐胁迫下玉米胚芽细胞膜的稳定性。
[0021] 3、抗氧化酶活性的测定：称取新鲜胚芽0. 5 g左右，放入预冷的研钵中，用10 ml 预冷的提取缓冲液（K2HP04-KH2P04, pH 7.0，1 mM EDTA，1% PVP，1 mM ASC)研磨匀浆，15000 g于4 °C离心20 min，上清液即为酶粗提液；超氧化物歧化酶（SOD)参照Giannopolitis和 Ries的方法，抗坏血酸过氧化物酶（APX)参照Nakano和Asada的方法，谷胱甘肽过氧化物 酶（GPX)参照Egley等的方法，谷胱甘肽还原酶（GR)参照Schaedle和Bassham方法并改 进.可溶性蛋白含量参照Bradford方法测定.抗氧化酶活性以每mg蛋白质所具有的酶活 力单位数表示。
[0022] S0D是植物体内一类重要的抗氧化酶，能够催化0_2,反应生成02和H 202，APX、GPX、 GR是植物中ASA-GSH氧化还原途径中的关键酶，能够有效的清除植物体内的H202，由图6、 图7、图8、图9所示，150 mmol ? I71 NaCl胁迫明显降低了玉米胚芽抗氧化酶活性，其中S 处理的S0D、APX、GPX、GR活性较CK分别下降55. 4%、46. 28%、29. 33%、37. 46%。盐胁迫条件 下，外源Glc、Sue浸种处理可有效提高玉米胚芽抗氧化酶活力，其中G+S处理的S0D、APX、 GPX、GR活性分别为S处理的1. 66倍、1. 62倍、1. 32倍、1. 38倍，T+S处理分别为S处理的 1. 67倍、1. 60倍、1. 29倍、1. 38倍，且G+S处理与T+S处理间无显著差异，由此可见，Glc和 Sue预处理能够提高玉米胚芽抗氧化能力，有效地减少活性氧的积累，从而降低活性氧自由 基对植物细胞的伤害。
[0023] 4、抗坏血酸、谷胱甘肽含量的测定：取0. 1 g胚芽烘干样品，加入2. 5 ml 5%磺基 水杨酸研磨匀浆，20000 g于4°C下离心20 min，上清液用于还原型抗坏血酸（ASA)、谷胱甘 肽（GSH)及氧化型抗坏血酸（DHA)、谷胱甘肽（GSSG)含量的测定： 表2是Glc和Sue预处理对盐胁迫玉米胚芽抗坏血酸含量、谷胱甘肽含量、还原型抗坏 血酸/氧化型抗坏血酸及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的影响 I-, 1--------在--------k --?.....?.....?.......?
? ------4 -----------------1 ASA、GSH是植物体内重要的非酶类抗氧化剂，能够特异性地清除H202。由表2可知，盐 胁迫5 d后，玉米胚芽内的ASA+DHA、GSH+GSSG含量显著下降，与CK相比分别下降21. 69%、 26. 7%，而Glc、Sue处理均可显著提高盐胁迫下玉米胚芽ASA+DHA、GSH+GSSG含量，特别是 ASA、GSH的含量，进而提高玉米胚芽ASA/DHA、GSH/GSSG ;其中G+S处理ASA含量、GSH含量、 ASA/DHA 及 GSH/GSSG 较 S 处理分别提高了 20. 08%、13. 6%、38. 05%、15. 22%，T+S 处理分别提 高18. 94%、14. 03%、23. 32%、17. 61%，且G+S处理与T+S处理之间无显著差异。此外，本实验 还发现正常环境下外源Glc、Suc浸种处理可以增加胚芽ASA、GSH的积累，提高ASA/DHA比、 GSH/GSSG比，说明外源糖能够诱导ASA、GSH的合成。
[0024] 5、葡萄糖6-磷酸脱氢酶（G6PDH)活性的测定：取0. 5g新鲜胚芽，加入5ml预冷 的酶提取液（0.02 mol.171 Tris-HCl、pH 7.5,0.42 mol.171 甘露醇，5 mmol.L-1 KC1， 5 mmol ? I71 MgS04)冰浴研磨成匀浆，用4层纱布将匀浆过滤，滤液在0°C下3000 r离心 10 min，吸取100 ul上清液，加入2ml反应液（内含0? 5 mmol ? I71 NADP，5 mmol ? I71葡萄 糖-6_ 磷酸，5 mmol ?L_1 MgCl2,0. 05 mmol M,1 Tris_HCl，pH 8. 2)于 340 nm 处比色，5 min 后测定〇D的变化，G6PDH酶比活力以每mg酶蛋白在单位时间的光密度变化来衡量；如图 10所示，盐胁迫条件下玉米胚芽内的G6PDH活性显著下降，与CK相比下降46. 78%，而G+S、 T+S处理均可显著提高盐胁迫下玉米胚芽G6PDH活力，较S处理分别提高50. 46%、50. 41%， 且G+S处理与T+S处理之间无显著差异；此外，正常环境下Glc、Suc处理未能引起G6PDH活 性的变化。
[0025] 6、Na+、K+离子含量的测定：取0. 1 g胚芽烘干样品，加5 ml硫酸，1 ml H202，沙浴 2 h，然后电炉300°C进行消煮，每隔30 min加入1 ml H202，直至混合液无色透明，然后用蒸 馏水定容至100 ml，用原子吸收分光光度计（TAS-990 Super，普析通用)测定Na+、K+离子含 量，见图11、图12可知，150 mmol ?L4的NaCl胁迫5 d后，玉米胚芽中Na+含量显著增加， K+含量及K +/Na+比显著下降，其中S处理Na +含量为CK的10. 31倍，K +含量及K +/Na+较CK 分别下降51. 95%、95. 31%。外源Glc及Sue可显著提高盐胁迫下K+含量，有效降低Na+含 量，进而提高玉米胚芽中K+/Na+，其中G+S与T+S处理Na+含量较S处理下降26. 72%、28. 9%， K+含量分别为S处理的1. 73、1. 73倍，K+/Na+比分别为S处理的2. 34倍、2. 42倍，两处理间 无显著差异。此外，与S处理相比，M+S处理未能引起Na+、K+含量及K+/Na+发生任何显著变 化。
[0026] 综上所述，Glc和Sue浸种处理可有效缓解150 mmol/L NaCl胁迫对玉米种子萌 发的抑制，不同程度地提高种子发芽率、发芽指数，并促进玉米芽长、根长及干重的增加。
[0027] 通过对抗氧化酶系分析，表明葡萄糖和蔗糖预处理显著提高了超氧化物歧化酶 (S0D)、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶（GR)的 活力，从而降低了盐胁迫下玉米胚芽硫代巴比妥酸反应物（TBARS)和过氧化氢（H202)的 含量，维持盐胁迫下细胞膜的稳定；同时，葡萄糖和蔗糖浸种处理可显著提高盐胁迫下玉米 胚芽中抗坏血酸（ASA)、谷胱甘肽（GSH)含量及还原型抗坏血酸/氧化型抗坏血酸（ASA/ DHA)、还原型谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽（GSH/GSSG)比值，提高细胞内的氧化还原势。
[0028] 另外，盐胁迫下玉米胚芽中的K+含量显著降低，Na +含量显著增加，K 7 Na+明显低 于对照处理，外源葡萄糖和蔗糖可显著提高盐胁迫下玉米胚芽中K+含量，并降低Na +含量， K+/ Na+比显著增高。
[0029] 可见，盐胁迫下葡萄糖、蔗糖浸种通过提高抗氧化酶活力和抗氧化物质含量，维持 胞内氧化还原势以及K+/ Na+离子平衡，缓解盐胁迫对玉米细胞的伤害，促进盐逆境下玉米 种子萌发。
【主权项】
1. 外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，其操作步骤如下： 消毒：用5%~15%重量浓度的消毒液浸泡玉米种子10~20min，用水冲洗干净后晾干， 得消毒玉米种； 浸糖：用〇. 1~Immol?L4的糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种30~50h，得耐盐 玉米种。2. 如权利要求1所述的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，其操作步骤如 下： 消毒：用8%~12%重量浓度的消毒液浸泡玉米种子10~15min，用水冲洗干净后晾干， 得消毒玉米种； 浸糖：用〇. 3~0. 8mmol?I71的糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种40~50h，得耐 盐玉米种。3. 如权利要求1或2所述的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，其特征在 于所述的消毒液为次氯酸钠溶液。4. 如权利要求1或2所述的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，其特征在 于所述的糖溶液为葡萄糖溶液或蔗糖溶液。
【专利摘要】本发明的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，涉及农业应用技术领域，其操作步骤如下：a、消毒：用5%～15%消毒液浸泡玉米种子10～20min，用蒸馏水冲洗干净后晾干，得消毒玉米种；b、浸糖：用0.1～1mmol·L-1糖液浸泡消毒玉米种30～50h，得耐盐玉米种。本发明的盐胁迫下促进玉米种子萌发的方法，通过对玉米种子进行葡萄糖或蔗糖的浸种处理，明显提高了玉米种子早期发芽率及发芽指数，表明施用适当浓度的外源糖能够促进玉米种子萌发；利用葡萄糖或蔗糖对玉米种子的浸种处理可有效缓解盐胁迫对玉米种子萌发的抑制，而且不同程度地提高种子发芽率、发芽指数，并促进玉米芽长、根长及干重的增加。
【IPC分类】A01C1/00
【公开号】CN104904368
【申请号】CN201510270518
【发明人】赵长江, 赵莹, 杨克军, 李佐同, 张海燕
【申请人】黑龙江八一农垦大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月26日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业应用技术领域，尤其涉及一种外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子 萌发的方法。
【背景技术】
[0002] 土壤盐渍化是一个世界性的资源和生态问题，我国有盐碱地区3. 6X 107 hm2,约 占总耕地面积的十分之一，由于灌溉不当和大量施用化肥等原因，次生盐碱化土壤面积还 在继续扩大，从而导致可耕地面积逐年下降，有研宄指出在未来的25年内耕地面积将减少 30%，所以土壤盐渍化严重制约着农林业生产和生态环境建设。由于盐渍化的土壤中含有 钠、钾、钙、镁等的硫酸盐、氯化物、碳酸盐和重碳酸盐，而且含量较高，因此对于玉米种子的 影响极为严重，盐渍化的土壤会影响玉米种子的早期发芽率及发芽指数，阻碍玉米种子萌 发，降低玉米种子中抗氧化酶活力和抗氧化物质含量，影响胞内氧化还原势以及K+/ Na+离 子平衡，对玉米细胞产生伤害，进而导致玉米种子发芽率极低，甚至不发芽。
【发明内容】
[0003] 本发明对于上述现有技术的不足，提供了一种外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子 萌发的方法。
[0004] 本发明的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，其操作步骤如下： a、 消毒：用5%~15%重量浓度的消毒液浸泡玉米种子10~20min，用水冲洗干净后晾 干，得消毒玉米种； b、 浸糖：用0. 1~lmmol ? I71的糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种30~50h，得耐 盐玉米种。
[0005] 作为本发明的进一步改进，其操作步骤如下： a、消毒：用8%~12%重量浓度的消毒液浸泡玉米种子10~15min，用水冲洗干净后晾 干，得消毒玉米种； 浸糖：用〇. 3~0. 8mmol ? I71的糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种40~50h，得耐 盐玉米种。
[0006] 作为本发明的进一步改进，所述的消毒液为次氯酸钠溶液。
[0007] 作为本发明的进一步改进，所述的糖溶液为葡萄糖溶液或蔗糖溶液。
[0008] 本发明的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，通过对玉米种子进行葡 萄糖溶液或蔗糖溶液的浸种处理，明显提高了玉米种子早期发芽率及发芽指数、促进了玉 米种子的萌发，而且能够提高抗氧化酶活力和抗氧化物质含量，维持胞内氧化还原势以及 K+/ Na+离子平衡，缓解盐胁迫对玉米细胞的伤害，促进盐逆境下玉米种子萌发。
【附图说明】
[0009] 图1是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米种子生长的影响； 图2是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米种子发芽率的影响； 图3是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米种子发芽指数的影响； 图4是Glc和Sue预处理对盐胁迫玉米胚芽TBARS含量的影响； 图5是Glc和Sue预处理对盐胁迫玉米胚芽H202含量的影响； 图6是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽SOD活性的影响； 图7是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽APX活性的影响； 图8是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽GPX活性的影响； 图9是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽GR活性的影响； 图10是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽G6PDH活性的影响； 图11是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽Na+、K+含量的影响； 图12是Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米胚芽K+/Na+比的影响。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 本发明的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，其操作步骤如下： a、 消毒：用5%重量浓度的次氯酸钠溶液浸泡玉米种子lOmin，用水冲洗干净后晾干，得 消毒玉米种； b、 浸糖：用0. lmmol吨4的葡萄糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种30h，得耐盐玉米 种。
[0011] 实施例2 a、 消毒：用15%重量浓度的次氯酸钠溶液浸泡玉米种子20min，用水冲洗干净后晾干， 得消毒玉米种； b、 浸糖：用lmmol ? I71的蔗糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种50h，得耐盐玉米种。
[0012] 实施例3 a、 消毒：用8%重量浓度的次氯酸钠溶液浸泡玉米种子lOmin，用水冲洗干净后晾干，得 消毒玉米种； b、 浸糖：用0. 3mmol吨4的葡萄糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种40h，得耐盐玉米 种。
[0013] 实施例4 a、 消毒：用12%重量浓度的次氯酸钠溶液浸泡玉米种子15min，用水冲洗干净后晾干， 得消毒玉米种； b、 浸糖：用0. 8mmol吨4的蔗糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种50h，得耐盐玉米种。
[0014] 实施例5 a、 消毒：用10%重量浓度的次氯酸钠溶液浸泡玉米种子10min，用水冲洗干净后晾干， 得消毒玉米种； b、 浸糖：用0. 5mmol吨4的葡萄糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种48h，得耐盐玉米 种。
[0015] 实施例6 a、消毒：用10%重量浓度的次氯酸钠溶液浸泡玉米种子lOmin，用水冲洗干净后晾干， 得消毒玉米种； b、浸糖：用0. 5mmol吨4的蔗糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种48h，得耐盐玉米种。
[0016] 下面以实施例5及实施例6为例，通过对比实验对处理过的玉米种子进行各项指 标检测： 对照组的选择：选取大小一致且无破损的玉米（Zea Mays L.)杂交种垦玉6号（由黑 龙江八一农垦大学玉米育种研宄室提供)，并以实施例5和实施例6的方法进行处理玉米 种子，将其播于含150 mM NaCl的6%水琼脂上，对玉米种子进行盐胁迫处理5 d，以不加盐 的水琼脂作为非胁迫处理；供试7个处理分别为正常生长对照（即水浸种非胁迫处理，CK)、 Glc浸种非胁迫处理（G，实施例5制得的玉米种子)、Sue浸种非胁迫处理（T，实施例6制得 的玉米种子)、水浸种盐胁迫处理（S)、Glc (葡萄糖）浸种盐胁迫处理（G+S)、Suc (蔗糖）浸 种盐胁迫处理（T+S)、甘露醇浸种盐胁迫处理（M+S)，每个处理3次重复，每次100粒种子， 培养皿置于人工气候箱内，25°C黑暗发芽，相对湿度为60%，种子芽长达到种子长度的一半 时即视为发芽，每天记录各处理种子的发芽数，计算发芽率和发芽指数作为萌发动力学的 参数，于盐处理第5 d取玉米胚芽测量各项生理生化指标，其检测方法如下： 1、生长指标的测定：盐处理第5 d，每个处理取10株玉米，测量其芽长、根长。将玉米 胚芽与胚根分离，置于105°C烘箱中杀青15 min，80°C烘干至恒重，然后称取干重，并分别计 算每株幼苗地上部及地下部干重；如图1所示，其为Glc和Sue预处理对盐胁迫下玉米种子 生长的影响；而Glc和Sue预处理对盐胁迫玉米胚芽长、胚根长、芽干重及根干重的影响见 下表1 :
注：各处理如图1所示。同一列数据后的不同字母表示在0. 05水平上差异显著。表 中数值为3次重复均值±必。下表同此。
[0017] 由图1可知，不同处理玉米幼苗胚芽长存在明显差异。由表1可知，非盐胁迫下， CK、G、T处理之间的各项生长指标无显著差异，150 mmol .I/1 NaCl胁迫对玉米生长具有明 显的抑制作用，与CK相比，S处理5 d后玉米胚芽和胚根长降低了 63. 64%和66. 51%，芽干 重及根干重分别降低了 72. 08%和60. 59%，差异显著；G+S、T+S处理的玉米与S相比各生长 指标均有显著提高，其中G+S处理的玉米胚芽长、胚根长、胚芽干重、胚根干重为S处理的 1. 54 倍、1. 30 倍、2. 09 倍、1. 79 倍，T+S 处理分别为 S 的 1. 67 倍、1. 31 倍、2. 69 倍、1. 94 倍， 且T+S处理胚芽干重显著高于G+S处理，M+S处理各生长指标虽然高于S处理，但差异不显 著，说明盐胁迫对于玉米种子早期生长具有明显的抑制作用，而Glc和Sue预处理可缓解盐 胁迫对玉米生长的伤害，促进玉米种子萌发阶段的干物质积累；此外，等渗的甘露醇处理未 能引起相同的效果，说明这种缓解效果并不是由于渗透作用引起的，是由糖浸种引起。
[0018] 如图2、图3所示，与CK相比，0? 5 mmol吨―1 Glc、Suc浸种均可不同程度地提高正 常条件下玉米种子萌发早期(发芽第2 d)的发芽率及发芽指数。盐胁迫下玉米种子发芽率 及发芽指数显著下降，与S处理相比，G+S、T+S处理均可明显提高盐胁迫下玉米种子早期发 芽率和发芽指数，其中Sue浸种处理效果最佳。此外，盐胁迫下甘露醇预处理其发芽率及发 芽指数均为各处理中最低，说明适当浓度的Glc、Suc预浸种(各为0. 5 mmol ?0能显著缓 解150 mmol ? I71 NaCl胁迫对玉米种子萌发的抑制作用。
[0019] 2、硫代巴比妥酸反应物（TBARS)及过氧化氢（H202)含量的测定：参照Hodges等的 方法测定TBARS，取0. 1 g胚芽烘干样品，加入5 ml 5%的三氯乙酸（TCA)研磨成匀浆，于 12000 g离心15 min，取2 ml上清液加入2 ml含0.5%硫代巴比妥酸（TBA)的20% TCA溶 液，沸水浴15 min，上清液分别于450 nm、532 nm、600 nm处比色；测定H202，取0.1 g胚芽 烘干样品，加入5 ml 0? 1% TCA冰浴研磨，12000 g于4 °C离心15 min，取1 ml~2 ml上 清液加入 〇? 5 ml 10 mmol ? I71 磷酸钾缓冲液（pH 7. 0)及 1 ml 1 mol ? I71 KI 于 390 nm 处比色，用1 ml 0. 1% TCA代替上清液作为对照。
[0020] TBARS是反应细胞膜损伤程度的重要指标，由图4、图5所示，盐胁迫下玉米胚芽中 的TBARS含量显著升高，为CK的1. 90倍.与S处理相比，0. 5mmol ? I71的Glc和Sue预处 理可明显降低盐胁迫下玉米胚芽的TBARS 含量，较S处理分别降低28. 78%、30. 35%。H202是 植物体内一类重要的活性氧。盐胁迫下各处理胚芽的H202含量明显升高，其中S处理的H 202含量为CK的2. 81倍.G+S和T+S处理明显降低了盐胁迫下玉米胚芽的H202含量，与S处理 相比分别降低24. 9%、20. 59%，且G+S处理与T+S处理间无显著差异。此外，等渗的甘露醇浸 种未能引起盐胁迫下玉米体内TBARS含量及H202含量的下降，说明外源糖浸种能够降低玉 米胚芽内的R0S含量，维持盐胁迫下玉米胚芽细胞膜的稳定性。
[0021] 3、抗氧化酶活性的测定：称取新鲜胚芽0. 5 g左右，放入预冷的研钵中，用10 ml 预冷的提取缓冲液（K2HP04-KH2P04, pH 7.0，1 mM EDTA，1% PVP，1 mM ASC)研磨匀浆，15000 g于4 °C离心20 min，上清液即为酶粗提液；超氧化物歧化酶（SOD)参照Giannopolitis和 Ries的方法，抗坏血酸过氧化物酶（APX)参照Nakano和Asada的方法，谷胱甘肽过氧化物 酶（GPX)参照Egley等的方法，谷胱甘肽还原酶（GR)参照Schaedle和Bassham方法并改 进.可溶性蛋白含量参照Bradford方法测定.抗氧化酶活性以每mg蛋白质所具有的酶活 力单位数表示。
[0022] S0D是植物体内一类重要的抗氧化酶，能够催化0_2,反应生成02和H 202，APX、GPX、 GR是植物中ASA-GSH氧化还原途径中的关键酶，能够有效的清除植物体内的H202，由图6、 图7、图8、图9所示，150 mmol ? I71 NaCl胁迫明显降低了玉米胚芽抗氧化酶活性，其中S 处理的S0D、APX、GPX、GR活性较CK分别下降55. 4%、46. 28%、29. 33%、37. 46%。盐胁迫条件 下，外源Glc、Sue浸种处理可有效提高玉米胚芽抗氧化酶活力，其中G+S处理的S0D、APX、 GPX、GR活性分别为S处理的1. 66倍、1. 62倍、1. 32倍、1. 38倍，T+S处理分别为S处理的 1. 67倍、1. 60倍、1. 29倍、1. 38倍，且G+S处理与T+S处理间无显著差异，由此可见，Glc和 Sue预处理能够提高玉米胚芽抗氧化能力，有效地减少活性氧的积累，从而降低活性氧自由 基对植物细胞的伤害。
[0023] 4、抗坏血酸、谷胱甘肽含量的测定：取0. 1 g胚芽烘干样品，加入2. 5 ml 5%磺基 水杨酸研磨匀浆，20000 g于4°C下离心20 min，上清液用于还原型抗坏血酸（ASA)、谷胱甘 肽（GSH)及氧化型抗坏血酸（DHA)、谷胱甘肽（GSSG)含量的测定： 表2是Glc和Sue预处理对盐胁迫玉米胚芽抗坏血酸含量、谷胱甘肽含量、还原型抗坏 血酸/氧化型抗坏血酸及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的影响 I-, 1--------在--------k --?.....?.....?.......?
? ------4 -----------------1 ASA、GSH是植物体内重要的非酶类抗氧化剂，能够特异性地清除H202。由表2可知，盐 胁迫5 d后，玉米胚芽内的ASA+DHA、GSH+GSSG含量显著下降，与CK相比分别下降21. 69%、 26. 7%，而Glc、Sue处理均可显著提高盐胁迫下玉米胚芽ASA+DHA、GSH+GSSG含量，特别是 ASA、GSH的含量，进而提高玉米胚芽ASA/DHA、GSH/GSSG ;其中G+S处理ASA含量、GSH含量、 ASA/DHA 及 GSH/GSSG 较 S 处理分别提高了 20. 08%、13. 6%、38. 05%、15. 22%，T+S 处理分别提 高18. 94%、14. 03%、23. 32%、17. 61%，且G+S处理与T+S处理之间无显著差异。此外，本实验 还发现正常环境下外源Glc、Suc浸种处理可以增加胚芽ASA、GSH的积累，提高ASA/DHA比、 GSH/GSSG比，说明外源糖能够诱导ASA、GSH的合成。
[0024] 5、葡萄糖6-磷酸脱氢酶（G6PDH)活性的测定：取0. 5g新鲜胚芽，加入5ml预冷 的酶提取液（0.02 mol.171 Tris-HCl、pH 7.5,0.42 mol.171 甘露醇，5 mmol.L-1 KC1， 5 mmol ? I71 MgS04)冰浴研磨成匀浆，用4层纱布将匀浆过滤，滤液在0°C下3000 r离心 10 min，吸取100 ul上清液，加入2ml反应液（内含0? 5 mmol ? I71 NADP，5 mmol ? I71葡萄 糖-6_ 磷酸，5 mmol ?L_1 MgCl2,0. 05 mmol M,1 Tris_HCl，pH 8. 2)于 340 nm 处比色，5 min 后测定〇D的变化，G6PDH酶比活力以每mg酶蛋白在单位时间的光密度变化来衡量；如图 10所示，盐胁迫条件下玉米胚芽内的G6PDH活性显著下降，与CK相比下降46. 78%，而G+S、 T+S处理均可显著提高盐胁迫下玉米胚芽G6PDH活力，较S处理分别提高50. 46%、50. 41%， 且G+S处理与T+S处理之间无显著差异；此外，正常环境下Glc、Suc处理未能引起G6PDH活 性的变化。
[0025] 6、Na+、K+离子含量的测定：取0. 1 g胚芽烘干样品，加5 ml硫酸，1 ml H202，沙浴 2 h，然后电炉300°C进行消煮，每隔30 min加入1 ml H202，直至混合液无色透明，然后用蒸 馏水定容至100 ml，用原子吸收分光光度计（TAS-990 Super，普析通用)测定Na+、K+离子含 量，见图11、图12可知，150 mmol ?L4的NaCl胁迫5 d后，玉米胚芽中Na+含量显著增加， K+含量及K +/Na+比显著下降，其中S处理Na +含量为CK的10. 31倍，K +含量及K +/Na+较CK 分别下降51. 95%、95. 31%。外源Glc及Sue可显著提高盐胁迫下K+含量，有效降低Na+含 量，进而提高玉米胚芽中K+/Na+，其中G+S与T+S处理Na+含量较S处理下降26. 72%、28. 9%， K+含量分别为S处理的1. 73、1. 73倍，K+/Na+比分别为S处理的2. 34倍、2. 42倍，两处理间 无显著差异。此外，与S处理相比，M+S处理未能引起Na+、K+含量及K+/Na+发生任何显著变 化。
[0026] 综上所述，Glc和Sue浸种处理可有效缓解150 mmol/L NaCl胁迫对玉米种子萌 发的抑制，不同程度地提高种子发芽率、发芽指数，并促进玉米芽长、根长及干重的增加。
[0027] 通过对抗氧化酶系分析，表明葡萄糖和蔗糖预处理显著提高了超氧化物歧化酶 (S0D)、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶（GR)的 活力，从而降低了盐胁迫下玉米胚芽硫代巴比妥酸反应物（TBARS)和过氧化氢（H202)的 含量，维持盐胁迫下细胞膜的稳定；同时，葡萄糖和蔗糖浸种处理可显著提高盐胁迫下玉米 胚芽中抗坏血酸（ASA)、谷胱甘肽（GSH)含量及还原型抗坏血酸/氧化型抗坏血酸（ASA/ DHA)、还原型谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽（GSH/GSSG)比值，提高细胞内的氧化还原势。
[0028] 另外，盐胁迫下玉米胚芽中的K+含量显著降低，Na +含量显著增加，K 7 Na+明显低 于对照处理，外源葡萄糖和蔗糖可显著提高盐胁迫下玉米胚芽中K+含量，并降低Na +含量， K+/ Na+比显著增高。
[0029] 可见，盐胁迫下葡萄糖、蔗糖浸种通过提高抗氧化酶活力和抗氧化物质含量，维持 胞内氧化还原势以及K+/ Na+离子平衡，缓解盐胁迫对玉米细胞的伤害，促进盐逆境下玉米 种子萌发。
【主权项】
1. 外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，其操作步骤如下： 消毒：用5%~15%重量浓度的消毒液浸泡玉米种子10~20min，用水冲洗干净后晾干， 得消毒玉米种； 浸糖：用〇. 1~Immol?L4的糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种30~50h，得耐盐 玉米种。2. 如权利要求1所述的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，其操作步骤如 下： 消毒：用8%~12%重量浓度的消毒液浸泡玉米种子10~15min，用水冲洗干净后晾干， 得消毒玉米种； 浸糖：用〇. 3~0. 8mmol?I71的糖溶液浸泡a步骤制得的消毒玉米种40~50h，得耐 盐玉米种。3. 如权利要求1或2所述的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，其特征在 于所述的消毒液为次氯酸钠溶液。4. 如权利要求1或2所述的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，其特征在 于所述的糖溶液为葡萄糖溶液或蔗糖溶液。
【专利摘要】本发明的外源糖浸种缓解盐胁迫下玉米种子萌发的方法，涉及农业应用技术领域，其操作步骤如下：a、消毒：用5%～15%消毒液浸泡玉米种子10～20min，用蒸馏水冲洗干净后晾干，得消毒玉米种；b、浸糖：用0.1～1mmol·L-1糖液浸泡消毒玉米种30～50h，得耐盐玉米种。本发明的盐胁迫下促进玉米种子萌发的方法，通过对玉米种子进行葡萄糖或蔗糖的浸种处理，明显提高了玉米种子早期发芽率及发芽指数，表明施用适当浓度的外源糖能够促进玉米种子萌发；利用葡萄糖或蔗糖对玉米种子的浸种处理可有效缓解盐胁迫对玉米种子萌发的抑制，而且不同程度地提高种子发芽率、发芽指数，并促进玉米芽长、根长及干重的增加。
【IPC分类】A01C1/00
【公开号】CN104904368
【申请号】CN201510270518
【发明人】赵长江, 赵莹, 杨克军, 李佐同, 张海燕
【申请人】黑龙江八一农垦大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月26日
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