高卢蜜环菌及在促进天麻有性繁殖生长中的应用及栽培方式的制作方法
高卢蜜环菌及在促进天麻有性繁殖生长中的应用及栽培方式的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种高卢蜜环菌及在促进天麻有性繁殖 生长中的应用及栽培方式。
【背景技术】
[0002] 蜜环菌又名榛蘑、苞谷菌，其子实体味美且菌丝、菌索皆可入药，是一类经济价值 极高的药食用真菌；同时猪苓、天麻的生长都离不开蜜环菌的侵染。目前全球共发现蜜环 菌生物种约40种，其中蜜环菌Armillaria gallica、Armillaria ceptisteas被认为是最 能促进天麻生长的蜜环菌生物种，其中生物种Armillaria gallica促进天麻生长的效果更 佳。
[0003] 天麻（Gastrodia elata BI)无根无绿叶片，不能进行光合作用，是多年生草本植 物。其生活史大致如下：在有性繁殖即用种子繁殖阶段，必须与萌发菌（紫萁小菇、石斛 小菇等）建立共生关系，然后种子才能获得营养而萌发；萌发后形成的原球茎又必须同化 蜜环菌才能正常生长发育成米麻、白麻；此后，米麻、白麻与蜜环菌一起进入无性繁殖阶段 直至形成箭麻。形成的箭麻抽蔓开花后就会产生种子，这一过程仅靠箭麻自身的营养来完 成，至此天麻完成了从种子到种子的全部生活史。与萌发菌、蜜环菌先后共生完成其生活 史，是天麻生长发育的主要特点。
[0004] 天麻为贵州地道药材，是我国传统名贵中药，贵州省天麻主产区种植的天麻主要 为乌天麻、红天麻和绿天麻。天麻生长缓慢，自然繁殖系数低，虽然天麻人工栽培技术已经 突破多年，但是与不同类型天麻亲和性好、适应性强、不易退化的蜜环菌，栽培方式等严重 制约着天麻高产栽培的发展。目前未见适应不同类型天麻生长、不同生境的促进天麻高产 的蜜环菌。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种高卢蜜环菌及在促进天麻有性繁殖生长 中的应用及栽培方式，它能g服现有蜜环菌与不同类型天麻共生时的产量不稳定性、适应 性低、易退化、生长势差的缺陷。
[0006] 本发明是这样实现的：高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株，其保藏编号 为 CCTCC M 2015005。
[0007] 所述的高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株CCTCC M 2015005的生物学 形态特征：在标准BDPDA培养基上生长，早期新生菌丝为乳白色，绒毛状菌丝仅着生于接种 组织周围，3天后菌丝由乳白色慢慢变成黄褐色，并开始长出菌索；菌索尖端为白色，生长 至老化后为红褐色；菌索紧贴培养基并向培养基里面生长，分叉形式为单轴分叉，延伸形态 为鹿角状，部分节点分支菌索过多甚至类似气生菌丝长至培养基表面的空间；菌索平均直 径为1. 1mm，平均生长速度为1. 21cm/d。
[0008] 生理生化特征：菌株液体摇瓶时木聚糖酶、CMC酶、漆酶均是先升后降，且发酵终 点时木聚糖酶、漆酶的酶活性远大于发酵第一天的酶活，CMC酶的酶活远低于发酵第一天的 酶活性。菌株在含杂木肩、棉籽壳不同比例的栽培种培养基中培养时，不含杂木肩或棉籽壳 的培养基中生长速度最快且二者没有显著性差异，杂木肩和棉籽壳都含有且比例相差不大 时，菌株菌索生长速度最慢；但是无杂木肩的培养基中菌株菌索易老化，易在管口形成红褐 色菌索。
[0009] 木材利用率：菌株在栽培种培养基中生长时，木质素消耗量远大于半纤维素和纤 维素的消耗量，其中纤维素的消耗量最低。
[0010] 本发明的高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株，其rDNA-ITS核苷酸在 GenBank 的Accession N0?是KP335049;其rDNA-IGS核苷酸在GenBank 的Accession N0?是 KP335048 ;其 Tefl-a 部分核苷酸在 GenBank 的 Accession NO?是 KP335050。
[0011] 具有上述特征的菌株，参照（Antonin V. et al. 2009)等资料，综合生理生化特征， rDNA-ITS、rDNA-IGS、Tefl-a序列结果，鉴定为高卢蜜环菌（Armillaria gallica)，命名为 GZA46。
[0012] 其核苷酸序列如SEQ ID NO : 1-3。
[0013] 高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株CCTCC M 2015005在促进天麻有性 繁殖生长中的应用。
[0014] 所述的天麻为乌天麻、红天麻或绿天麻。
[0015] 米用高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株CCTCC M 2015005进彳丁天麻有 性繁殖的高产栽培方式，
[0016] 1)在3月份前清理场地上的杂树及杂草后，挖坑培植固定菌床，待地温达10°C 时，先在坑底放一层湿润的无芳香的阔叶树树叶、生土或木肩与河沙混合物3-5cm，木肩与 河沙等质量比混合；然后树叶上放2-5cm的生土或木肩与河沙混合物，然后在生土或木肩 与河沙混合物上放置无芳香的阔叶树大菌材，大菌材长为18-24cm,直径7-10cm，在大菌 材之间的间隙中交错放置小菌材，小菌材的长为8-12cm,直径为2-4cm ;然后将高卢蜜环 菌Armillaria gallica GZA46菌株的三级固体种辦成核桃大小放置于大小菌材的接口 处，再将湿润的生土或木肩与河沙混合物回填至将菌材覆盖，再依同样方法摆放一层菌材 和菌种，然后用湿润的生土或木肩与河沙混合物填实固定菌床；最后盖上一层编织袋，覆 8-12cm厚的湿润砂土，做成龟背形并盖上枯枝落叶或杂草；
[0017] 2)培植固定菌床3个月后，进行天麻硕果的有性拌载，以每坑固定菌床为一个单 位取萌发菌并掰碎为约1元硬币大小，将天麻蒴果种子均匀洒在菌块上并拌匀，然后装入 袋中，并保持透气，在18_24°C下恒温放至菌块转白后播种；播种时，揭开固定菌床的编织 袋，取出上层的菌材，露出下层的菌材；按间隔5cm贴近蜜环菌摆放转白拌种萌发菌块一 个，均匀摆完后放一层树叶，回填2~3cm厚的生土或木肩与河沙混合物；按照同样的方式 栽第二层，再将原编织袋回位即可，约半年后即可收获。
[0018] 本发明高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株。采集贵州德江县的野生高 卢蜜环菌菌索，按照表面消毒的组织分离方法，切取0. 5cm的菌索在PDA培养基上培养，纯 化，保存于4°C备用，培养三级菌种后与不同天麻进行有性繁殖，评价白麻、米麻的产量筛选 获得。该GZA46菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌 珞珈山武汉大学生科院保藏中心；邮编：430072)，其保藏编号是CCTCC M 2015005,保藏日 期为2015年1月5日，分类命名为高卢蜜环菌，拉丁文学名为Armillaria gallica。
[0019] 本发明也提供该高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株由PDA试管母种快 速扩繁至优良栽培种的各阶段参数。液体摇瓶发酵时GZA46菌株4天就能结束发酵，液体 GZA46菌种无菌条件下接至优良栽培种培养基后15天就能长满菌瓶。
[0020] 前述液体培养基配方是每升中葡萄糖46g，无水乙醇24g，酵母膏5g，蛋白胨13g， 硫酸镁2g，磷酸二氢钾lgJBiO.OlgJB^OSg，水1000mL，pH自然，121°C高温灭菌30min。 优良栽培种培养基配方是每瓶中2-3cm长直径约lcm无芳香的阔叶树枝条300g，玉米粉 5g，白糖5g，磷酸二氢钾0. 5g，硫酸镁0. 25g，水300ml，121°C高温灭菌2h。
[0021] 高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株在含杂木肩、棉籽壳不同比例的栽 培种培养基中培养时，不含杂木肩或棉籽壳的培养基中生长速度最快且二者没有显著性差 异，杂木肩和棉籽壳都含有且比例相差不大时，GZA46菌株菌索生长速度最慢；但是无杂木 肩的培养基中GZA46菌株菌索易老化，会在管口形成红褐色菌索。
[0022] 本发明从贵州不同的天麻主产区采集分离野生蜜环菌，利用蜜环菌、萌发菌、天麻 蒴果的专一共生关系，筛选出优良的促进不同类型天麻生长的高产菌株，以期解决天麻人 工栽培中蜜环菌不稳定性、易退化、生长势差的缺点，为建立不同生境、不同栽培方式、不同 类型天麻的高产人工栽培技术打下基础。
【附图说明】
[0023] 图1为菌株DJ1发酵过程中木聚糖酶活性变化曲线；
[0024] 图2为菌株DJ1发酵过程中CMC酶活性变化曲线；
[0025] 图3为菌株DJ1发酵过程中漆酶活性均值变化曲线；
[0026] 图4为本发明的实施例中菌材的放置结构示意图；
[0027] 图 5 为高卢蜜环菌 Armillaria gallica GZA46 菌株 CCTCC M 2015005 的平板照 片；
[0028] 注：DJ1 即为 Armillaria gallica GZA46。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1 :本发明高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46的获得：
[0030] 高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株的分离
[0031] 1、采集贵州德江县的野生高卢蜜环菌菌索，按照表面消毒的组织分离方法，切取 0. 5cm的菌索在PDA培养基上培养，纯化，得到Armillaria gallica GZA46菌株，保存于4°C 备用。
[0032] 2、超净工作台中切取已经分离纯化的长0. 5cm的菌索尖端接入含有150mL液体 培养基的250mL三角瓶中（每个三角瓶中接入3段菌索），置于水平摇床上22°C、180r/ min暗培养至菌丝球长满三角瓶（13天）即为一级液体菌种。取一级液体菌种一瓶于无菌 匀质器中，每秒9次拍击，匀浆8分钟后吸取3mL转接入含有150mL液体培养基的容积为 250mL的三角瓶。然后180r/min、22°C暗培养至菌丝球长满三角瓶（4天）即为二级液体菌 种。二级液体菌种接入优良栽培种培养基后，22°C暗培养15天即可长满菌瓶为高卢蜜环菌 Armillaria gallica GZA46 的栽培种。
[0033] 实施例2 :
[0034] 一、米用高卢蜜环菌 Armillaria ga llica GZA46 菌株 CCTCC M 2015005 进行天麻 有性繁殖的高产栽培方式：
[0035] 在贵州省农作物品种资源研宄所的资源圃（N26. 51 °，E106. 66 °，海拔 1114. 3m)，于2013月3月底进行了菌株GZA46和对照菌株（市面上种植天麻常用蜜环菌） 的固定菌床培植，6月按本发明提供的技术进行乌、红、绿天麻蒴果与萌发菌、蜜环菌的拌 载。2014年1月统计了 GZA46菌株和对照菌株的乌、红、绿天麻有性栽培的白麻重量，并用 SPSS软件对白麻产量进行单因素方差分析，结果如表1所示。
[0036] 具体培养方式为：
[0037] 1)在3月份前清理场地上的杂树及杂草后，挖坑培植固定菌床，待地温达10°C时， 先在坑底放一层湿润的无芳香的阔叶树树叶、生土或木肩与河沙混合物3-5cm，木肩与河沙 等质量比混合；然后在树叶上放2_5cm的生土或木肩与河沙混合物，然后在生土或木肩与 河沙混合物上放置无芳香的阔叶树大菌材9kg，大菌材长为20cm,直径7-10cm，在大菌材之 间的间隙中交错放置小菌材3. 5kg，小菌材的长为10cm,直径为2-4cm ;然后将一包0. 75kg 的高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株的三级固体种辦成核桃大小后放置于大小 菌材的接口处，再将湿润的生土或木肩与河沙混合物回填至将菌材覆盖至似露非露，再依 同样方法摆放一层菌材和菌种，然后用湿润的生土或木肩与河沙混合物填实固定菌床；最 后盖上一层编织袋，覆l〇cm厚的湿润砂土，做成龟背形并盖上枯枝落叶；
[0038] 2)培植固定菌床3个月后，进行天麻硕果的有性拌载，以每坑固定菌床为一个单 位取2包萌发菌，每包约lkg，掰碎成蚕豆大小，将天麻蒴果种子均匀洒在菌块上并拌匀， 然后装入袋中，并保持透气，在20°C下恒温放至菌块转白后播种；播种时，揭开固定菌床的 编织袋，取出上层的菌材，露出下层的菌材；按间隔5cm贴近蜜环菌摆放转白拌种萌发菌块 一个，均匀摆完后放一层树叶，回填2~3cm厚的生土或木肩与河沙混合物；按照同样的方 式栽第二层，再将原编织袋回位即可，约半年后即可收获白麻、米麻。
[0039] 表1天麻产量统计
[0041] 注：以上数据是5个重复的均值，并进行的单因素方差分析，字母表示0. 05水平的 显著性差异。
[0042] 从表1看出，天麻有性栽培半年后，用GZA46菌株栽培的红天麻、绿天麻的白麻产 量远大于利用对照菌株（市面上种植天麻常用蜜环菌的）的白麻产量，达到了显著性差异； 用GZA46菌株栽培的乌天麻的白麻产量也大于对照菌株（市面上种植天麻常用蜜环菌的） 的白麻产量，差异较明显接近显著性。所筛得的高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌 株能很好的促进红天麻、绿天麻、乌天麻的生长，是促进天麻生长的高产优良蜜环菌。
[0043] 二、高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46的生物学及生理生化特征测定
[0044] 生物学特征：所述的高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株CCTCC M 2015005的生物学形态特征：在标准BDPDA培养基上生长，早期新生菌丝为乳白色，绒毛状 菌丝仅着生于接种组织周围，3天后菌丝由乳白色慢慢变成黄褐色，并开始长出菌索；菌索 尖端为白色，生长至老化后为红褐色；菌索紧贴培养基并向培养基里面生长，分叉形式为单 轴分叉，延伸形态为鹿角状，部分节点分支菌索过多甚至类似气生菌丝长至培养基表面的 空间；菌索平均直径为1. 1. _，平均生长速度为1. 21cm/d。
[0045] 生理生化特征：菌株液体摇瓶时木聚糖酶、CMC酶、漆酶均是先升后降，且发酵终 点时木聚糖酶、漆酶的酶活性远大于发酵第一天的酶活，CMC酶的酶活远低于发酵第一天的 酶活性。菌株在含杂木肩、棉籽壳不同比例的栽培种培养基中培养时，不含杂木肩或棉籽壳 的培养基中生长速度最快且二者没有显著性差异，杂木肩和棉籽壳都含有且比例相差不 大时，菌株菌索生长速度最慢；但是无杂木肩的培养基中菌株菌索易老化，易在管口形成红 褐色菌索。
[0046] 木材利用率：菌株在栽培种培养基中生长时，木质素消耗量远大于半纤维素和纤 维素的消耗量，其中纤维素的消耗量最低。
[0047] 2. 1.高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株的液体发酵时胞外酶活的测定
[0048] 2. 1. 1标准曲线的制备
[0049] 按董国强、张捷的方法以不同浓度的木糖溶液、葡萄糖溶液与DNS试剂反应，在 530nm处测0D值、制作木糖、葡萄糖标准曲线。
[0050] 2. 1. 2液体菌种的制备
[0051] 将高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46接入含PDA培养基的平皿中，22°C暗培 养15天后，切取0. 5cm长的菌索尖端3段转接入含有150mL液体培养基的容积为250mL的 三角瓶。然后180r/min、22°C暗培养至菌丝球长满三角瓶（13天）即为一级液体菌种。取一 级液体菌种一瓶于无菌匀质器中，每秒9次拍击，匀浆8分钟后吸取3mL转接入含有150mL 液体培养基的容积为250mL的三角瓶。然后180r/min、22°C暗培养至菌丝球长满三角瓶（4 天）即为二级液体菌种。
[0052] 2. 1.3粗酶液的制备
[0053] 在二级液体菌种摇瓶培养过程中，每天定时吸取2mL发酵液作为粗酶液。
[0054] 2. 1. 4木聚糖酶酶活性测定
[0055] 往具塞刻度试管中加入1 %的木聚糖溶液（用pH4. 8, 0. 05M柠檬酸盐缓冲液配 制）1. 5mL，加稀释5倍的粗酶液lmL混匀，50°C水浴准确保温30min，取出后立即加入DNS 试剂1.5mL,具塞摇勾立即煮沸lOmin,取出，冷却后加入蒸馏水补足25mL,轻轻上下摇 匀，用4802型分光光度计测530nm处的0D值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复。
[0056] 2. 1. 5CMC酶活性测定
[0057] 往具塞刻度试管中加入0. 5%的羧甲基纤维素钠溶液（用pH4. 6, 0. 1M醋酸盐缓冲 液配制）1. 5mL，加稀释5倍的粗酶液0. 5mL混匀，50°C水浴准确保温30min，取出后立即加 入DNS试剂1.5mL，具塞摇匀立即煮沸lOmin，取出，冷却后加入蒸馏水补足20mL，轻轻上 下摇匀，用4802型分光光度计测530nm处的0D值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个 重复。
[0058] 2. 1. 6漆酶酶活性测定
[0059] 取0? 5mmol/L 丁香醛连氮100 y L放入2mL离心管，加入酶液50 y L和1. 5mLpH6. 0 的0. 1M磷酸盐缓冲液混匀，25°C恒温水浴5min后立即冰浴终止反应，用4802型分光光度 计测525nm处的0D值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复。
[0060] 2. 1. 7酶活力计算
[0061] 在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物或是转化底物中1微摩尔相关基团所需 的酶量，称为一个国际单位（U)。酶活性以X表示，单位为酶活性单位每升（U/L)。木聚糖 酶、CMC酶活性按式（1)计算，漆酶活性按式（2)计算：
[0063] 式（1)、式（2)中：m是根据标准曲线方程计算测得0D值对应的葡糖糖或木糖的质 量，单位为微g ;M是葡萄糖或木糖的摩尔质量；￥胃_是反应添加的酶液体积，单位是升；￥,&为 反应总体积，单位是升；t是酶反应时间，单位为分钟；n为酶液稀释倍数；e是丁香醛连氮 的摩尔消光系数，65000L ? (mol ? cnO'OD为漆酶吸光度。
[0064] 2. 2.高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株在不同配方的栽培种培养基上 的生长速度。
[0065] 2. 2. 1栽培种培养基制备
[0066] 按培养基配方（表2)将每种培养基的固形物称好混匀，再按对应比例加水混匀 后装入规格为30mmX 200mm的玻璃试管中。装管时注意填实，装满时培养基与橡胶塞间距 lcm，此时培养基重约70g。培养基经121摄氏度灭菌lh即可使用。
[0067] 表2 8种栽培种培养基
[0070] 2. 2. 2菌种制备
[0071] 将高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46接入含PDA培养基的平皿中，22°C暗培 养15天后，切取0. 5cm长的菌索尖端3段转接入含有150mL液体培养基的容积为250mL三 角瓶。然后180r/min、22°C暗培养至菌丝球长满三角瓶（13天）即为一级液体菌种。取一 级液体菌种一瓶至于无菌匀质器中，每秒9次拍击匀浆8分钟后吸取3mL转接入含有150mL 液体培养基的容积为250mL三角瓶。然后180r/min、22°C暗培养至菌丝球长满三角瓶（4 天）即为二级液体菌种。将3mL二级液体种接到各种栽培种培养基中，22°C恒温培养即可 (注意开始一周竖直摆放）。
[0072] 2. 2. 3生长速度的测定
[0073] 培养20天和40天时，测定Armillaria gallica GZA46 (为图表中表不方便，用代 号DJ1表不，下文同）在各培养基中菌丝或菌索的生长速度，每种培养基为一个处理，一个 处理3个重复，数据采用软件spSS20. 0进行统计分析。
[0074] 表3 DJ1的生长速度
[0076] 三、高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株的木材利用率测定参照（王玉万 等，1987、宋宏，2008)测定高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46和对照菌株（市面上种 植天麻常用蜜环菌）在栽培种培养基1中的20天和40天时的半纤维素、纤维素、木质素的 利用率。
[0077] 表4木材的利用率
[0079] 四、GZA46 菌株的 rDNA-ITS、rDNA-IGS、Tefl-a 序列扩增及测序
[0080] 4. 1DNA 的提取
[0081] 液体GZA46菌株的菌丝材料先真空抽滤收集，再用纯水冲洗2次，最后抽滤除尽水 分并至于-70°C冻存备用，总DNA提取采用黄宏文的方法进行。
[0082] 4. 2rDNA_ITS 的扩增
[0083] PCR 反应体系采用通用引物 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4(5'-TCCT CCGCTTAITGATATGC-3'）QPCR反应体系（25yL):10XPCR Buffer 2.5yL，dNTP (各 lOmmol/ L) 1. 0 y L，模板 DNA 溶液 1. 0 y L, 5U/ y L 的 Taq 酶 0? 3 y L, 10 y mol/L 的 ITS1 和 ITS4 引物 各1 y L，加超纯水补足。PCR反应条件：95°C，预变性，3min ;35个循环（94°C，变性，lmin ; 52°〇，退火，11^11;721：，延伸，1.51^11);721：，延伸，101^11。？〇?产物经1.5%的琼脂糖凝胶 电泳检测后，切下目的DNA片段，用BioTeke Corporation凝胶纯化试剂盒回收目的DNA片 段，操作方法按试剂盒的使用说明进行。
[0084] 4. 3rDNA_IGS 的扩增
[0085] PCR 反应体系采用通用引物 CNL12(5'-CTGAACGCCTCTAAGTCAG-3'）和 5SA(5'-CAGA GTCCTATGGCCGTGGAT-3'）QPCR反应体系（25 y L) :10XPCR Buffer 2. 5 y L，dNTP (各 lOmmol/ L) 1. 0 y L，模板 DNA 溶液 1. 0 y L, 5U/ y L 的 Taq 酶 0? 3 y L, 10 y mol/L 的 CNL12 和 5SA 弓| 物各1 y L，加超纯水补足。PCR反应条件：94°C，预变性，3min ;35个循环（94°C，变性，40s ; 58.9°C，退火，40s ;72°C，延伸，100s) ;72°C，延伸，10min。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶 电泳检测后，切下目的DNA片段，用BioTeke Corporation凝胶纯化试剂盒回收目的DNA片 段，操作方法按试剂盒的使用说明进行。
[0086] 4. 4Tef 1-a序列的扩增
[0087] Tefl-a序列的扩增采用类似巢式PCR的程序分两步进行。
[0088] 第一步 PCR 反应体系采用通用引物 EF526F(5'-GTCGTYGTYATYGGHCAYGT-3'）和 EF 1567R(5'-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3'）qPCR反应体系（25 y L) : 10XPCR Buffer 2. 5 y L， dNTP (各 10mmol/L) 0? 5 y L，模板 DNA 溶液 1. 0 y L, 5U/ y L 的 Taq 酶 0? 25 y L, 10 y mol/L 的 EF526F和EF1567R引物各0. 5yL，加超纯水补足。PCR反应条件：94°C，预变性，5min ;10 个循环（94°C，变性，30s ;63°C_54°C每个循环下降一度，退火，55s ;72°C，延伸，1.5min) ;35 个循环（94°C，变性，30s;53°C，退火，55s;72°C，延伸，1.5min) ;72°C，延伸，10min。PCR 产 物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，有清晰目的条带的无需做下一步PCR扩增，无明显条带 的则直接作为下一步PCR反应的模板。
[0089] 第二步 PCR 反应体系采用通用引物 EF595F (5 ' -CGTGACTTCATCAAGAACATG-3 '） 和 EF1160R(5' -CCGATCTTGTAGACGTCCTG-3'）。PCR 反应体系（25 y L) : 10XPCR Buffer 2. 5 y L，dNTP (各 10mmol/L) 0? 5 y L，模板（第一步 PCR 产物）1. 0 y L，5U/ y L 的 Taq 酶 0.2yL，lOymol/L的EF595F和EF1160R引物各lyL，加超纯水补足。PCR反应条件：94°C， 预变性，3min;35 个循环（94°C，变性，30s ;53.5°C，退火，30s ;72°C，延伸，1.5min) ;72°C， 延伸，10min。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的DNA片段，用BioTeke Corporation凝胶纯化试剂盒回收目的DNA片段，操作方法按试剂盒的使用说明进行。
[0090] 4. 5TA克隆及测序
[0091] 按试剂盒操作方法将纯化回收的PCR产物连接到PMD19-T载体上，转入DH5 a感 受态细胞中，活化lh后涂布于含有氨苄、IPTG、x-gal的LB固体培养基中，37°C倒置培养过 夜后挑选阳性克隆菌落于含有氨苄的LB液体培养基培养4h，菌液PCR检测阳性克隆后，送 上海生工生物工程技术服务有限公司做双向测序。每个菌株测序时设两个重复。
[0092] 菌液 PCR 反应体系采用通用引物 M13F(5'-CGCCAGGGmTCCCAGTCACGAC-3'）和 Ml 3R(5'-AGCGGATAACAAITTCACACAGGA-3'）QPCR反应体系（15 y L) : 10XPCR Buffer 1. 5 y 1， dNTP (各 10mmol/L) 1. 2 y L，模板菌液 0? 5 y L, 5U/ y L 的 Taq 酶 0? 15 y L, 10 y mol/L 的 M13F 和M13R引物各0. 3yL，加超纯水补足。PCR反应条件：95°C，预变性，5min ;35个循环（94°C， 变性，30s ;52°C，退火，30s ;72°C，延伸，30s) ;72°C，延伸，10min。
[0093] 4. 6序列分析
[0094] 测序结果经SeqMan软件去除两端的PMD19-T载体或修正，反复校对、拼接组装后 提交GenBank数据库并比对、鉴定菌株。获得序列两两比较采用软件Megalign，GC含量、长 度等分析采用软件Editseq。实验获得菌株GZA46的rDNA-ITS序列如SEQ ID N0 :1所示， 长度为 869bp，在 GenBank 的 Accession N0.是 KF032522 ;菌株 GZA46 的 rDNA-IGS 序列如 SEQ ID N0:2 所示，长度为 910bp，在 GenBank 的 Accession N0.是 KJ643357;菌株 GZA46 的Tefl-a部分序列如SEQ ID N0:1所示，长度为584bp，在GenBank的Accession N0.是 KJ643392。GZA46 的 rDNA-ITS 序列及 rDNA-IGS 序列与 Armillaria gallica 的相似性达 到99%。从进化树也可看出，GZA46与Armillaria gallica的亲缘关系极近，结合形态学 鉴定结果，本发明所述菌株为蜜环菌生物种Armillaria gallica的菌株。
【主权项】
1. 高卢蜜环菌也TBiWariagaWicaGZA46菌株，其保藏编号为CCTCCM2015005。2. 根据权利要求1所述高卢蜜环菌^ariaGZA46菌株CCTCCM 2015005,其特征在于：菌株的生物学形态特征：在标准BDPDA培养基上生长，早期新生菌丝 为乳白色，绒毛状菌丝仅着生于接种组织周围，3天后菌丝由乳白色慢慢变成黄褐色，并开 始长出菌索；菌索尖端为白色，生长至老化后为红褐色；菌索紧贴培养基并向培养基里面 生长，分叉形式为单轴分叉，延伸形态为鹿角状，部分节点分支菌索过多甚至类似气生菌丝 长至培养基表面的空间；菌索平均直径为1. 1._，平均生长速度为I. 21cm/d。3. 根据权利要求1所述的高卢蜜环菌GZA46菌株CCTCCM 2015005,其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO: 1-3。4. 如权利要求1所述的高卢蜜环菌GZA46菌株CCTCCM2015005 在促进天麻有性繁殖生长中的应用。5. 根据权利要求4所述的高卢蜜环菌GZA46菌株CCTCCM 2015005在促进天麻有性繁殖生长中的应用，其特征在于：所述的天麻为乌天麻、红天麻或 绿天麻。6. 米用高卢蜜环菌ArffiiBariaGZA46菌株CCTCCM2015005进彳丁天麻有性 繁殖的高产栽培方式，其特征在于： 1) 在3月份前前清理场地上的杂树及杂草后，挖坑培植固定菌床，待地温达10°C时， 先在坑底放一层湿润的无芳香的阔叶树树叶、生土或木肩与河沙混合物3-5cm，木肩与河沙 等质量比混合；然后在树叶上放2-5cm的生土或木肩与河沙混合物，然后在生土或木肩与 河沙混合物上放置无芳香的阔叶树大菌材；大菌材长为18-24cm,直径7-10cm，在大菌材 之间的间隙中交错放置小菌材，小菌材的长为8-12cm，直径为2-4cm;然后将高卢蜜环菌 GZA46菌株的三级固体种辦成核桃大小放置于大小菌材的接口处，再 将湿润的生土，木肩与河沙混合物回填至将菌材覆盖，再依同样方法摆放一层菌材和菌种， 然后用湿润的木肩河沙混合物填实固定菌床；最后盖上一层编织袋，覆8-12cm厚的湿润砂 土，做成龟背形并盖上枯枝落叶或杂草； 2) 培植固定菌床3个月后，进行天麻硕果的有性拌载，以每坑固定菌床为一个单位 取萌发菌并掰碎，将天麻蒴果种子均匀洒在菌块上并拌匀，然后装入袋中，并保持透气，在 18-24°C下恒温放至菌块转白后播种；播种时，揭开固定菌床的编织袋，取出上层菌材，露出 下层菌材；按间隔5cm贴近蜜环菌摆放转白拌种萌发菌块一个，均匀摆完后放一层树叶，回 填2~3cm厚的生土或木肩与河沙混合物；按照同样的方式栽第二层，再将原编织袋回位即 可，约半年后即可收获米麻及白麻，一年半可收获箭麻和白麻。
【专利摘要】本发明公开了一种高卢蜜环菌及在促进天麻有性繁殖生长中的应用及栽培方式。本发明从贵州不同的天麻主产区采集分离野生蜜环菌，利用蜜环菌、萌发菌、天麻蒴果的专一共生关系，筛选出优良的促进不同类型天麻生长的高产蜜环菌菌株，以期解决天麻人工栽培中蜜环菌不稳定性、易退化、生长势差的缺点，为不同生境、不同栽培方式、不同类型天麻的高产人工栽培技术打下基础。CCTCC M 201500520150105
【IPC分类】A01G1/04, A01G1/00
【公开号】CN104904492
【申请号】CN201510091763
【发明人】朱国胜, 桂阳, 黄万兵, 杨通静, 龚光禄, 卢颖颖
【申请人】贵州省农作物品种资源研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年2月16日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种高卢蜜环菌及在促进天麻有性繁殖 生长中的应用及栽培方式。
【背景技术】
[0002] 蜜环菌又名榛蘑、苞谷菌，其子实体味美且菌丝、菌索皆可入药，是一类经济价值 极高的药食用真菌；同时猪苓、天麻的生长都离不开蜜环菌的侵染。目前全球共发现蜜环 菌生物种约40种，其中蜜环菌Armillaria gallica、Armillaria ceptisteas被认为是最 能促进天麻生长的蜜环菌生物种，其中生物种Armillaria gallica促进天麻生长的效果更 佳。
[0003] 天麻（Gastrodia elata BI)无根无绿叶片，不能进行光合作用，是多年生草本植 物。其生活史大致如下：在有性繁殖即用种子繁殖阶段，必须与萌发菌（紫萁小菇、石斛 小菇等）建立共生关系，然后种子才能获得营养而萌发；萌发后形成的原球茎又必须同化 蜜环菌才能正常生长发育成米麻、白麻；此后，米麻、白麻与蜜环菌一起进入无性繁殖阶段 直至形成箭麻。形成的箭麻抽蔓开花后就会产生种子，这一过程仅靠箭麻自身的营养来完 成，至此天麻完成了从种子到种子的全部生活史。与萌发菌、蜜环菌先后共生完成其生活 史，是天麻生长发育的主要特点。
[0004] 天麻为贵州地道药材，是我国传统名贵中药，贵州省天麻主产区种植的天麻主要 为乌天麻、红天麻和绿天麻。天麻生长缓慢，自然繁殖系数低，虽然天麻人工栽培技术已经 突破多年，但是与不同类型天麻亲和性好、适应性强、不易退化的蜜环菌，栽培方式等严重 制约着天麻高产栽培的发展。目前未见适应不同类型天麻生长、不同生境的促进天麻高产 的蜜环菌。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种高卢蜜环菌及在促进天麻有性繁殖生长 中的应用及栽培方式，它能g服现有蜜环菌与不同类型天麻共生时的产量不稳定性、适应 性低、易退化、生长势差的缺陷。
[0006] 本发明是这样实现的：高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株，其保藏编号 为 CCTCC M 2015005。
[0007] 所述的高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株CCTCC M 2015005的生物学 形态特征：在标准BDPDA培养基上生长，早期新生菌丝为乳白色，绒毛状菌丝仅着生于接种 组织周围，3天后菌丝由乳白色慢慢变成黄褐色，并开始长出菌索；菌索尖端为白色，生长 至老化后为红褐色；菌索紧贴培养基并向培养基里面生长，分叉形式为单轴分叉，延伸形态 为鹿角状，部分节点分支菌索过多甚至类似气生菌丝长至培养基表面的空间；菌索平均直 径为1. 1mm，平均生长速度为1. 21cm/d。
[0008] 生理生化特征：菌株液体摇瓶时木聚糖酶、CMC酶、漆酶均是先升后降，且发酵终 点时木聚糖酶、漆酶的酶活性远大于发酵第一天的酶活，CMC酶的酶活远低于发酵第一天的 酶活性。菌株在含杂木肩、棉籽壳不同比例的栽培种培养基中培养时，不含杂木肩或棉籽壳 的培养基中生长速度最快且二者没有显著性差异，杂木肩和棉籽壳都含有且比例相差不大 时，菌株菌索生长速度最慢；但是无杂木肩的培养基中菌株菌索易老化，易在管口形成红褐 色菌索。
[0009] 木材利用率：菌株在栽培种培养基中生长时，木质素消耗量远大于半纤维素和纤 维素的消耗量，其中纤维素的消耗量最低。
[0010] 本发明的高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株，其rDNA-ITS核苷酸在 GenBank 的Accession N0?是KP335049;其rDNA-IGS核苷酸在GenBank 的Accession N0?是 KP335048 ;其 Tefl-a 部分核苷酸在 GenBank 的 Accession NO?是 KP335050。
[0011] 具有上述特征的菌株，参照（Antonin V. et al. 2009)等资料，综合生理生化特征， rDNA-ITS、rDNA-IGS、Tefl-a序列结果，鉴定为高卢蜜环菌（Armillaria gallica)，命名为 GZA46。
[0012] 其核苷酸序列如SEQ ID NO : 1-3。
[0013] 高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株CCTCC M 2015005在促进天麻有性 繁殖生长中的应用。
[0014] 所述的天麻为乌天麻、红天麻或绿天麻。
[0015] 米用高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株CCTCC M 2015005进彳丁天麻有 性繁殖的高产栽培方式，
[0016] 1)在3月份前清理场地上的杂树及杂草后，挖坑培植固定菌床，待地温达10°C 时，先在坑底放一层湿润的无芳香的阔叶树树叶、生土或木肩与河沙混合物3-5cm，木肩与 河沙等质量比混合；然后树叶上放2-5cm的生土或木肩与河沙混合物，然后在生土或木肩 与河沙混合物上放置无芳香的阔叶树大菌材，大菌材长为18-24cm,直径7-10cm，在大菌 材之间的间隙中交错放置小菌材，小菌材的长为8-12cm,直径为2-4cm ;然后将高卢蜜环 菌Armillaria gallica GZA46菌株的三级固体种辦成核桃大小放置于大小菌材的接口 处，再将湿润的生土或木肩与河沙混合物回填至将菌材覆盖，再依同样方法摆放一层菌材 和菌种，然后用湿润的生土或木肩与河沙混合物填实固定菌床；最后盖上一层编织袋，覆 8-12cm厚的湿润砂土，做成龟背形并盖上枯枝落叶或杂草；
[0017] 2)培植固定菌床3个月后，进行天麻硕果的有性拌载，以每坑固定菌床为一个单 位取萌发菌并掰碎为约1元硬币大小，将天麻蒴果种子均匀洒在菌块上并拌匀，然后装入 袋中，并保持透气，在18_24°C下恒温放至菌块转白后播种；播种时，揭开固定菌床的编织 袋，取出上层的菌材，露出下层的菌材；按间隔5cm贴近蜜环菌摆放转白拌种萌发菌块一 个，均匀摆完后放一层树叶，回填2~3cm厚的生土或木肩与河沙混合物；按照同样的方式 栽第二层，再将原编织袋回位即可，约半年后即可收获。
[0018] 本发明高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株。采集贵州德江县的野生高 卢蜜环菌菌索，按照表面消毒的组织分离方法，切取0. 5cm的菌索在PDA培养基上培养，纯 化，保存于4°C备用，培养三级菌种后与不同天麻进行有性繁殖，评价白麻、米麻的产量筛选 获得。该GZA46菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌 珞珈山武汉大学生科院保藏中心；邮编：430072)，其保藏编号是CCTCC M 2015005,保藏日 期为2015年1月5日，分类命名为高卢蜜环菌，拉丁文学名为Armillaria gallica。
[0019] 本发明也提供该高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株由PDA试管母种快 速扩繁至优良栽培种的各阶段参数。液体摇瓶发酵时GZA46菌株4天就能结束发酵，液体 GZA46菌种无菌条件下接至优良栽培种培养基后15天就能长满菌瓶。
[0020] 前述液体培养基配方是每升中葡萄糖46g，无水乙醇24g，酵母膏5g，蛋白胨13g， 硫酸镁2g，磷酸二氢钾lgJBiO.OlgJB^OSg，水1000mL，pH自然，121°C高温灭菌30min。 优良栽培种培养基配方是每瓶中2-3cm长直径约lcm无芳香的阔叶树枝条300g，玉米粉 5g，白糖5g，磷酸二氢钾0. 5g，硫酸镁0. 25g，水300ml，121°C高温灭菌2h。
[0021] 高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株在含杂木肩、棉籽壳不同比例的栽 培种培养基中培养时，不含杂木肩或棉籽壳的培养基中生长速度最快且二者没有显著性差 异，杂木肩和棉籽壳都含有且比例相差不大时，GZA46菌株菌索生长速度最慢；但是无杂木 肩的培养基中GZA46菌株菌索易老化，会在管口形成红褐色菌索。
[0022] 本发明从贵州不同的天麻主产区采集分离野生蜜环菌，利用蜜环菌、萌发菌、天麻 蒴果的专一共生关系，筛选出优良的促进不同类型天麻生长的高产菌株，以期解决天麻人 工栽培中蜜环菌不稳定性、易退化、生长势差的缺点，为建立不同生境、不同栽培方式、不同 类型天麻的高产人工栽培技术打下基础。
【附图说明】
[0023] 图1为菌株DJ1发酵过程中木聚糖酶活性变化曲线；
[0024] 图2为菌株DJ1发酵过程中CMC酶活性变化曲线；
[0025] 图3为菌株DJ1发酵过程中漆酶活性均值变化曲线；
[0026] 图4为本发明的实施例中菌材的放置结构示意图；
[0027] 图 5 为高卢蜜环菌 Armillaria gallica GZA46 菌株 CCTCC M 2015005 的平板照 片；
[0028] 注：DJ1 即为 Armillaria gallica GZA46。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1 :本发明高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46的获得：
[0030] 高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株的分离
[0031] 1、采集贵州德江县的野生高卢蜜环菌菌索，按照表面消毒的组织分离方法，切取 0. 5cm的菌索在PDA培养基上培养，纯化，得到Armillaria gallica GZA46菌株，保存于4°C 备用。
[0032] 2、超净工作台中切取已经分离纯化的长0. 5cm的菌索尖端接入含有150mL液体 培养基的250mL三角瓶中（每个三角瓶中接入3段菌索），置于水平摇床上22°C、180r/ min暗培养至菌丝球长满三角瓶（13天）即为一级液体菌种。取一级液体菌种一瓶于无菌 匀质器中，每秒9次拍击，匀浆8分钟后吸取3mL转接入含有150mL液体培养基的容积为 250mL的三角瓶。然后180r/min、22°C暗培养至菌丝球长满三角瓶（4天）即为二级液体菌 种。二级液体菌种接入优良栽培种培养基后，22°C暗培养15天即可长满菌瓶为高卢蜜环菌 Armillaria gallica GZA46 的栽培种。
[0033] 实施例2 :
[0034] 一、米用高卢蜜环菌 Armillaria ga llica GZA46 菌株 CCTCC M 2015005 进行天麻 有性繁殖的高产栽培方式：
[0035] 在贵州省农作物品种资源研宄所的资源圃（N26. 51 °，E106. 66 °，海拔 1114. 3m)，于2013月3月底进行了菌株GZA46和对照菌株（市面上种植天麻常用蜜环菌） 的固定菌床培植，6月按本发明提供的技术进行乌、红、绿天麻蒴果与萌发菌、蜜环菌的拌 载。2014年1月统计了 GZA46菌株和对照菌株的乌、红、绿天麻有性栽培的白麻重量，并用 SPSS软件对白麻产量进行单因素方差分析，结果如表1所示。
[0036] 具体培养方式为：
[0037] 1)在3月份前清理场地上的杂树及杂草后，挖坑培植固定菌床，待地温达10°C时， 先在坑底放一层湿润的无芳香的阔叶树树叶、生土或木肩与河沙混合物3-5cm，木肩与河沙 等质量比混合；然后在树叶上放2_5cm的生土或木肩与河沙混合物，然后在生土或木肩与 河沙混合物上放置无芳香的阔叶树大菌材9kg，大菌材长为20cm,直径7-10cm，在大菌材之 间的间隙中交错放置小菌材3. 5kg，小菌材的长为10cm,直径为2-4cm ;然后将一包0. 75kg 的高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株的三级固体种辦成核桃大小后放置于大小 菌材的接口处，再将湿润的生土或木肩与河沙混合物回填至将菌材覆盖至似露非露，再依 同样方法摆放一层菌材和菌种，然后用湿润的生土或木肩与河沙混合物填实固定菌床；最 后盖上一层编织袋，覆l〇cm厚的湿润砂土，做成龟背形并盖上枯枝落叶；
[0038] 2)培植固定菌床3个月后，进行天麻硕果的有性拌载，以每坑固定菌床为一个单 位取2包萌发菌，每包约lkg，掰碎成蚕豆大小，将天麻蒴果种子均匀洒在菌块上并拌匀， 然后装入袋中，并保持透气，在20°C下恒温放至菌块转白后播种；播种时，揭开固定菌床的 编织袋，取出上层的菌材，露出下层的菌材；按间隔5cm贴近蜜环菌摆放转白拌种萌发菌块 一个，均匀摆完后放一层树叶，回填2~3cm厚的生土或木肩与河沙混合物；按照同样的方 式栽第二层，再将原编织袋回位即可，约半年后即可收获白麻、米麻。
[0039] 表1天麻产量统计
[0041] 注：以上数据是5个重复的均值，并进行的单因素方差分析，字母表示0. 05水平的 显著性差异。
[0042] 从表1看出，天麻有性栽培半年后，用GZA46菌株栽培的红天麻、绿天麻的白麻产 量远大于利用对照菌株（市面上种植天麻常用蜜环菌的）的白麻产量，达到了显著性差异； 用GZA46菌株栽培的乌天麻的白麻产量也大于对照菌株（市面上种植天麻常用蜜环菌的） 的白麻产量，差异较明显接近显著性。所筛得的高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌 株能很好的促进红天麻、绿天麻、乌天麻的生长，是促进天麻生长的高产优良蜜环菌。
[0043] 二、高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46的生物学及生理生化特征测定
[0044] 生物学特征：所述的高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株CCTCC M 2015005的生物学形态特征：在标准BDPDA培养基上生长，早期新生菌丝为乳白色，绒毛状 菌丝仅着生于接种组织周围，3天后菌丝由乳白色慢慢变成黄褐色，并开始长出菌索；菌索 尖端为白色，生长至老化后为红褐色；菌索紧贴培养基并向培养基里面生长，分叉形式为单 轴分叉，延伸形态为鹿角状，部分节点分支菌索过多甚至类似气生菌丝长至培养基表面的 空间；菌索平均直径为1. 1. _，平均生长速度为1. 21cm/d。
[0045] 生理生化特征：菌株液体摇瓶时木聚糖酶、CMC酶、漆酶均是先升后降，且发酵终 点时木聚糖酶、漆酶的酶活性远大于发酵第一天的酶活，CMC酶的酶活远低于发酵第一天的 酶活性。菌株在含杂木肩、棉籽壳不同比例的栽培种培养基中培养时，不含杂木肩或棉籽壳 的培养基中生长速度最快且二者没有显著性差异，杂木肩和棉籽壳都含有且比例相差不 大时，菌株菌索生长速度最慢；但是无杂木肩的培养基中菌株菌索易老化，易在管口形成红 褐色菌索。
[0046] 木材利用率：菌株在栽培种培养基中生长时，木质素消耗量远大于半纤维素和纤 维素的消耗量，其中纤维素的消耗量最低。
[0047] 2. 1.高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株的液体发酵时胞外酶活的测定
[0048] 2. 1. 1标准曲线的制备
[0049] 按董国强、张捷的方法以不同浓度的木糖溶液、葡萄糖溶液与DNS试剂反应，在 530nm处测0D值、制作木糖、葡萄糖标准曲线。
[0050] 2. 1. 2液体菌种的制备
[0051] 将高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46接入含PDA培养基的平皿中，22°C暗培 养15天后，切取0. 5cm长的菌索尖端3段转接入含有150mL液体培养基的容积为250mL的 三角瓶。然后180r/min、22°C暗培养至菌丝球长满三角瓶（13天）即为一级液体菌种。取一 级液体菌种一瓶于无菌匀质器中，每秒9次拍击，匀浆8分钟后吸取3mL转接入含有150mL 液体培养基的容积为250mL的三角瓶。然后180r/min、22°C暗培养至菌丝球长满三角瓶（4 天）即为二级液体菌种。
[0052] 2. 1.3粗酶液的制备
[0053] 在二级液体菌种摇瓶培养过程中，每天定时吸取2mL发酵液作为粗酶液。
[0054] 2. 1. 4木聚糖酶酶活性测定
[0055] 往具塞刻度试管中加入1 %的木聚糖溶液（用pH4. 8, 0. 05M柠檬酸盐缓冲液配 制）1. 5mL，加稀释5倍的粗酶液lmL混匀，50°C水浴准确保温30min，取出后立即加入DNS 试剂1.5mL,具塞摇勾立即煮沸lOmin,取出，冷却后加入蒸馏水补足25mL,轻轻上下摇 匀，用4802型分光光度计测530nm处的0D值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复。
[0056] 2. 1. 5CMC酶活性测定
[0057] 往具塞刻度试管中加入0. 5%的羧甲基纤维素钠溶液（用pH4. 6, 0. 1M醋酸盐缓冲 液配制）1. 5mL，加稀释5倍的粗酶液0. 5mL混匀，50°C水浴准确保温30min，取出后立即加 入DNS试剂1.5mL，具塞摇匀立即煮沸lOmin，取出，冷却后加入蒸馏水补足20mL，轻轻上 下摇匀，用4802型分光光度计测530nm处的0D值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个 重复。
[0058] 2. 1. 6漆酶酶活性测定
[0059] 取0? 5mmol/L 丁香醛连氮100 y L放入2mL离心管，加入酶液50 y L和1. 5mLpH6. 0 的0. 1M磷酸盐缓冲液混匀，25°C恒温水浴5min后立即冰浴终止反应，用4802型分光光度 计测525nm处的0D值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复。
[0060] 2. 1. 7酶活力计算
[0061] 在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物或是转化底物中1微摩尔相关基团所需 的酶量，称为一个国际单位（U)。酶活性以X表示，单位为酶活性单位每升（U/L)。木聚糖 酶、CMC酶活性按式（1)计算，漆酶活性按式（2)计算：
[0063] 式（1)、式（2)中：m是根据标准曲线方程计算测得0D值对应的葡糖糖或木糖的质 量，单位为微g ;M是葡萄糖或木糖的摩尔质量；￥胃_是反应添加的酶液体积，单位是升；￥,&为 反应总体积，单位是升；t是酶反应时间，单位为分钟；n为酶液稀释倍数；e是丁香醛连氮 的摩尔消光系数，65000L ? (mol ? cnO'OD为漆酶吸光度。
[0064] 2. 2.高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株在不同配方的栽培种培养基上 的生长速度。
[0065] 2. 2. 1栽培种培养基制备
[0066] 按培养基配方（表2)将每种培养基的固形物称好混匀，再按对应比例加水混匀 后装入规格为30mmX 200mm的玻璃试管中。装管时注意填实，装满时培养基与橡胶塞间距 lcm，此时培养基重约70g。培养基经121摄氏度灭菌lh即可使用。
[0067] 表2 8种栽培种培养基
[0070] 2. 2. 2菌种制备
[0071] 将高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46接入含PDA培养基的平皿中，22°C暗培 养15天后，切取0. 5cm长的菌索尖端3段转接入含有150mL液体培养基的容积为250mL三 角瓶。然后180r/min、22°C暗培养至菌丝球长满三角瓶（13天）即为一级液体菌种。取一 级液体菌种一瓶至于无菌匀质器中，每秒9次拍击匀浆8分钟后吸取3mL转接入含有150mL 液体培养基的容积为250mL三角瓶。然后180r/min、22°C暗培养至菌丝球长满三角瓶（4 天）即为二级液体菌种。将3mL二级液体种接到各种栽培种培养基中，22°C恒温培养即可 (注意开始一周竖直摆放）。
[0072] 2. 2. 3生长速度的测定
[0073] 培养20天和40天时，测定Armillaria gallica GZA46 (为图表中表不方便，用代 号DJ1表不，下文同）在各培养基中菌丝或菌索的生长速度，每种培养基为一个处理，一个 处理3个重复，数据采用软件spSS20. 0进行统计分析。
[0074] 表3 DJ1的生长速度
[0076] 三、高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46菌株的木材利用率测定参照（王玉万 等，1987、宋宏，2008)测定高卢蜜环菌Armillaria gallica GZA46和对照菌株（市面上种 植天麻常用蜜环菌）在栽培种培养基1中的20天和40天时的半纤维素、纤维素、木质素的 利用率。
[0077] 表4木材的利用率
[0079] 四、GZA46 菌株的 rDNA-ITS、rDNA-IGS、Tefl-a 序列扩增及测序
[0080] 4. 1DNA 的提取
[0081] 液体GZA46菌株的菌丝材料先真空抽滤收集，再用纯水冲洗2次，最后抽滤除尽水 分并至于-70°C冻存备用，总DNA提取采用黄宏文的方法进行。
[0082] 4. 2rDNA_ITS 的扩增
[0083] PCR 反应体系采用通用引物 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4(5'-TCCT CCGCTTAITGATATGC-3'）QPCR反应体系（25yL):10XPCR Buffer 2.5yL，dNTP (各 lOmmol/ L) 1. 0 y L，模板 DNA 溶液 1. 0 y L, 5U/ y L 的 Taq 酶 0? 3 y L, 10 y mol/L 的 ITS1 和 ITS4 引物 各1 y L，加超纯水补足。PCR反应条件：95°C，预变性，3min ;35个循环（94°C，变性，lmin ; 52°〇，退火，11^11;721：，延伸，1.51^11);721：，延伸，101^11。？〇?产物经1.5%的琼脂糖凝胶 电泳检测后，切下目的DNA片段，用BioTeke Corporation凝胶纯化试剂盒回收目的DNA片 段，操作方法按试剂盒的使用说明进行。
[0084] 4. 3rDNA_IGS 的扩增
[0085] PCR 反应体系采用通用引物 CNL12(5'-CTGAACGCCTCTAAGTCAG-3'）和 5SA(5'-CAGA GTCCTATGGCCGTGGAT-3'）QPCR反应体系（25 y L) :10XPCR Buffer 2. 5 y L，dNTP (各 lOmmol/ L) 1. 0 y L，模板 DNA 溶液 1. 0 y L, 5U/ y L 的 Taq 酶 0? 3 y L, 10 y mol/L 的 CNL12 和 5SA 弓| 物各1 y L，加超纯水补足。PCR反应条件：94°C，预变性，3min ;35个循环（94°C，变性，40s ; 58.9°C，退火，40s ;72°C，延伸，100s) ;72°C，延伸，10min。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶 电泳检测后，切下目的DNA片段，用BioTeke Corporation凝胶纯化试剂盒回收目的DNA片 段，操作方法按试剂盒的使用说明进行。
[0086] 4. 4Tef 1-a序列的扩增
[0087] Tefl-a序列的扩增采用类似巢式PCR的程序分两步进行。
[0088] 第一步 PCR 反应体系采用通用引物 EF526F(5'-GTCGTYGTYATYGGHCAYGT-3'）和 EF 1567R(5'-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3'）qPCR反应体系（25 y L) : 10XPCR Buffer 2. 5 y L， dNTP (各 10mmol/L) 0? 5 y L，模板 DNA 溶液 1. 0 y L, 5U/ y L 的 Taq 酶 0? 25 y L, 10 y mol/L 的 EF526F和EF1567R引物各0. 5yL，加超纯水补足。PCR反应条件：94°C，预变性，5min ;10 个循环（94°C，变性，30s ;63°C_54°C每个循环下降一度，退火，55s ;72°C，延伸，1.5min) ;35 个循环（94°C，变性，30s;53°C，退火，55s;72°C，延伸，1.5min) ;72°C，延伸，10min。PCR 产 物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，有清晰目的条带的无需做下一步PCR扩增，无明显条带 的则直接作为下一步PCR反应的模板。
[0089] 第二步 PCR 反应体系采用通用引物 EF595F (5 ' -CGTGACTTCATCAAGAACATG-3 '） 和 EF1160R(5' -CCGATCTTGTAGACGTCCTG-3'）。PCR 反应体系（25 y L) : 10XPCR Buffer 2. 5 y L，dNTP (各 10mmol/L) 0? 5 y L，模板（第一步 PCR 产物）1. 0 y L，5U/ y L 的 Taq 酶 0.2yL，lOymol/L的EF595F和EF1160R引物各lyL，加超纯水补足。PCR反应条件：94°C， 预变性，3min;35 个循环（94°C，变性，30s ;53.5°C，退火，30s ;72°C，延伸，1.5min) ;72°C， 延伸，10min。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的DNA片段，用BioTeke Corporation凝胶纯化试剂盒回收目的DNA片段，操作方法按试剂盒的使用说明进行。
[0090] 4. 5TA克隆及测序
[0091] 按试剂盒操作方法将纯化回收的PCR产物连接到PMD19-T载体上，转入DH5 a感 受态细胞中，活化lh后涂布于含有氨苄、IPTG、x-gal的LB固体培养基中，37°C倒置培养过 夜后挑选阳性克隆菌落于含有氨苄的LB液体培养基培养4h，菌液PCR检测阳性克隆后，送 上海生工生物工程技术服务有限公司做双向测序。每个菌株测序时设两个重复。
[0092] 菌液 PCR 反应体系采用通用引物 M13F(5'-CGCCAGGGmTCCCAGTCACGAC-3'）和 Ml 3R(5'-AGCGGATAACAAITTCACACAGGA-3'）QPCR反应体系（15 y L) : 10XPCR Buffer 1. 5 y 1， dNTP (各 10mmol/L) 1. 2 y L，模板菌液 0? 5 y L, 5U/ y L 的 Taq 酶 0? 15 y L, 10 y mol/L 的 M13F 和M13R引物各0. 3yL，加超纯水补足。PCR反应条件：95°C，预变性，5min ;35个循环（94°C， 变性，30s ;52°C，退火，30s ;72°C，延伸，30s) ;72°C，延伸，10min。
[0093] 4. 6序列分析
[0094] 测序结果经SeqMan软件去除两端的PMD19-T载体或修正，反复校对、拼接组装后 提交GenBank数据库并比对、鉴定菌株。获得序列两两比较采用软件Megalign，GC含量、长 度等分析采用软件Editseq。实验获得菌株GZA46的rDNA-ITS序列如SEQ ID N0 :1所示， 长度为 869bp，在 GenBank 的 Accession N0.是 KF032522 ;菌株 GZA46 的 rDNA-IGS 序列如 SEQ ID N0:2 所示，长度为 910bp，在 GenBank 的 Accession N0.是 KJ643357;菌株 GZA46 的Tefl-a部分序列如SEQ ID N0:1所示，长度为584bp，在GenBank的Accession N0.是 KJ643392。GZA46 的 rDNA-ITS 序列及 rDNA-IGS 序列与 Armillaria gallica 的相似性达 到99%。从进化树也可看出，GZA46与Armillaria gallica的亲缘关系极近，结合形态学 鉴定结果，本发明所述菌株为蜜环菌生物种Armillaria gallica的菌株。
【主权项】
1. 高卢蜜环菌也TBiWariagaWicaGZA46菌株，其保藏编号为CCTCCM2015005。2. 根据权利要求1所述高卢蜜环菌^ariaGZA46菌株CCTCCM 2015005,其特征在于：菌株的生物学形态特征：在标准BDPDA培养基上生长，早期新生菌丝 为乳白色，绒毛状菌丝仅着生于接种组织周围，3天后菌丝由乳白色慢慢变成黄褐色，并开 始长出菌索；菌索尖端为白色，生长至老化后为红褐色；菌索紧贴培养基并向培养基里面 生长，分叉形式为单轴分叉，延伸形态为鹿角状，部分节点分支菌索过多甚至类似气生菌丝 长至培养基表面的空间；菌索平均直径为1. 1._，平均生长速度为I. 21cm/d。3. 根据权利要求1所述的高卢蜜环菌GZA46菌株CCTCCM 2015005,其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO: 1-3。4. 如权利要求1所述的高卢蜜环菌GZA46菌株CCTCCM2015005 在促进天麻有性繁殖生长中的应用。5. 根据权利要求4所述的高卢蜜环菌GZA46菌株CCTCCM 2015005在促进天麻有性繁殖生长中的应用，其特征在于：所述的天麻为乌天麻、红天麻或 绿天麻。6. 米用高卢蜜环菌ArffiiBariaGZA46菌株CCTCCM2015005进彳丁天麻有性 繁殖的高产栽培方式，其特征在于： 1) 在3月份前前清理场地上的杂树及杂草后，挖坑培植固定菌床，待地温达10°C时， 先在坑底放一层湿润的无芳香的阔叶树树叶、生土或木肩与河沙混合物3-5cm，木肩与河沙 等质量比混合；然后在树叶上放2-5cm的生土或木肩与河沙混合物，然后在生土或木肩与 河沙混合物上放置无芳香的阔叶树大菌材；大菌材长为18-24cm,直径7-10cm，在大菌材 之间的间隙中交错放置小菌材，小菌材的长为8-12cm，直径为2-4cm;然后将高卢蜜环菌 GZA46菌株的三级固体种辦成核桃大小放置于大小菌材的接口处，再 将湿润的生土，木肩与河沙混合物回填至将菌材覆盖，再依同样方法摆放一层菌材和菌种， 然后用湿润的木肩河沙混合物填实固定菌床；最后盖上一层编织袋，覆8-12cm厚的湿润砂 土，做成龟背形并盖上枯枝落叶或杂草； 2) 培植固定菌床3个月后，进行天麻硕果的有性拌载，以每坑固定菌床为一个单位 取萌发菌并掰碎，将天麻蒴果种子均匀洒在菌块上并拌匀，然后装入袋中，并保持透气，在 18-24°C下恒温放至菌块转白后播种；播种时，揭开固定菌床的编织袋，取出上层菌材，露出 下层菌材；按间隔5cm贴近蜜环菌摆放转白拌种萌发菌块一个，均匀摆完后放一层树叶，回 填2~3cm厚的生土或木肩与河沙混合物；按照同样的方式栽第二层，再将原编织袋回位即 可，约半年后即可收获米麻及白麻，一年半可收获箭麻和白麻。
【专利摘要】本发明公开了一种高卢蜜环菌及在促进天麻有性繁殖生长中的应用及栽培方式。本发明从贵州不同的天麻主产区采集分离野生蜜环菌，利用蜜环菌、萌发菌、天麻蒴果的专一共生关系，筛选出优良的促进不同类型天麻生长的高产蜜环菌菌株，以期解决天麻人工栽培中蜜环菌不稳定性、易退化、生长势差的缺点，为不同生境、不同栽培方式、不同类型天麻的高产人工栽培技术打下基础。CCTCC M 201500520150105
【IPC分类】A01G1/04, A01G1/00
【公开号】CN104904492
【申请号】CN201510091763
【发明人】朱国胜, 桂阳, 黄万兵, 杨通静, 龚光禄, 卢颖颖
【申请人】贵州省农作物品种资源研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年2月16日
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