药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法
药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药用盾叶薯蓣的组培技术领域，具体涉及一种药用盾叶薯蓣无菌短枝生根的方法。
【背景技术】
[0002]薯蓣(D1scorea)不仅是国家二级保护植物，其根茎所含的薯蓣皂素是合成激素类药物的最基本原料，被誉为“激素之母”。盾叶薯蓣是我国薯蓣皂甙元含量最高的药源植物之一，是我国薯蓣皂甙元含量最高的药源植物之一。
[0003]国内外在20世纪70年代中期就开始利用组织培养技术繁殖薯蓣植物，但大多数停留在实验室技术研宄阶段，未能规模化生产种苗。一方面是因为盾叶薯蓣培养周期长，研宄报道大多是依照外植体一愈伤组织一愈伤组织分化一类原球茎或珠芽一生根一完整植株这一技术路线；从外植体诱导愈伤组织到形成完整植株需120?150d，更大的问题是此方法诱导的根与芽的输导系统不相通，移栽成活率低于30% ;另一方面是因为盾叶薯蓣无菌短枝很难生根，原因是盾叶薯蓣茎结构的特殊性造成的，盾叶薯蓣茎内有两圈维管束，导管及韧皮部周围的纤维和木质化薄壁细胞数量增多，使诱导分化的薄壁细胞减少，因而在诱导无菌短枝生根时很难有不定根的分化。上述问题导致盾叶薯蓣组织培养方法无法形成规范化种植，也是成为以薯蓣为原料的医药产品扩大市场的瓶颈。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术不足，目的是提供一种盾叶薯蓣组织培养无菌短枝生根的方法，以期达到室内大规模繁殖种苗，为规模化发展及时提供盾叶薯蓣大批量优质种苗。本发明的目的可以通过以下技术实现:
[0005]一种药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，
[0006](I)外植体的选择:选用盾叶薯蓣经组织培养获得的无菌短枝为外植体；
[0007](2)生根培养:将步骤(I)获得的无菌短枝接种在1/2MS大量+10XMS微量+MS有机 +DL 铁盐 +CCC 0.1 ?2.0mg/L+PP3330.1 ?2.0mg/L+IAA0.01 ?0.lmg/L+IBA0.01 ?
0.2mg/L，以及添加有蔗糖和琼脂的培养基中培养25-40d后形成大量不定根；蔗糖添加量3%，琼脂添加量0.75% ；
[0008](3)试管苗移栽；
[0009](4)移栽至大田进行种茎繁育。
[0010]步骤(2)中生根培养基优选:1/2MS大量+10XMS微量+MS有机+DL铁盐+CCC
1.0mg/L+PP3330.5mg/L+IAA0.05mg/L+IBA0.0lmg/L+3%蔗糖 +0.75%琼脂。
[0011]步骤(2)中生根培养基还可以优选:1/2MS大量+10XMS微量+MS有机+DL铁盐+CCC 0.8mg/L+PP3330.3mg/L+IAA0.03mg/L+IBA0.08mg/L+3%蔗糖 +0.75%琼脂。
[0012]步骤⑵生根培养的温度24°C，每天10-12小时光照，光照强度为1000?20001x ；培养 20-30d。
[0013]步骤(3)试管苗移栽:将出瓶的无菌短枝生根苗用500?800倍的多菌灵或代森锰锌浸泡5?15分钟，随后将幼苗移至有顶玻璃的移栽容器中，在温度为20?30°C，湿度80?90%的条件下生长，25?30d长出新叶时，既已成活。
[0014]步骤(4)种茎繁殖:将移栽成活的幼苗，在自然条件炼苗5?7d后，移栽至大田进行种茎繁育。
[0015]本发明与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0016]1、用生物技术，在无菌条件下诱导盾叶薯蓣短枝生根，并筛选出无菌短枝生根率为95%的培养基配方。
[0017]2、本发明盾叶薯蓣无菌短枝生根的成功，不但解决了无菌短枝很难生根的问题，同时还克服了盾叶薯蓣原球茎或珠芽生根苗难成活的难题，并提高了移栽成活率。
[0018]3、利用外植体一愈伤组织和芽一无菌短枝生根一完整植株这一技术路线，仅需60?90d形成完整植株，5个月左右可获得大量完整植株，进行大规模工厂化育种。
[0019]本发明不仅简化了健康种苗生产程序，而且生产成本低，还解决了无菌短枝很难生根的问题，提高了生产效率。
【附图说明】
[0020]图1-2为盾叶薯蓣无菌短枝生根情况；
[0021]图3为盾叶薯蓣无菌短枝生根苗移栽40d后的生长情况；
[0022]图4为盾叶薯蓣无菌短枝生根苗移栽大田30d后的生长情况。
【具体实施方式】
[0023]下面结合本发明的实施例来进一步说明本发明实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
[0024]实施例1、组织培养快速繁殖盾叶薯蓣无菌短枝生根的方法
[0025]一、培养基配制和灭菌
[0026]无菌短枝生根培养基:1/2MS大量+10*MS微量+MS有机+DL铁盐+CCC1.0mg/L+PP3330.5mg/L+IAA0.05mg/L+IBA0.0lmg/L+3%蔗糖+0.75%琼脂。以上培养基在 121°C下，灭菌20分钟。
[0027]二、生根培养
[0028]取盾叶薯截(salvia hispanica L)顶芽和莖段，首先用洗衣粉清洗干净，在无菌操作台上用无菌水洗5?7次，用70%酒精浸润I分钟，再放入0.1 %的升汞溶液中灭菌12?18分钟，无菌水冲洗5?6次，将顶芽和腋芽转入装有初代培养基MS+6-BA2.0mg/L+KT0.5mg/L上，每个三角瓶外植体个数为3?5个，培养60_90d诱导出愈伤和芽。继代培养时，将愈伤组织分成小块，每隔30d继代一次，每次继代中，每块愈伤组织增大4-6倍，同步分化芽。从继代培养的试管苗中选取长势均匀健壮的盾叶薯蓣试管苗，分成单株，不带原球茎或珠芽，接种在生根培养基上培养。每个培养瓶外植体个数为10?12个，在下述培养条件下进行培养:24°C左右，每天10-12小时光照，光照强度为1000?20001x左右；培养20-30d，无菌短枝生根率95%以上，无菌短枝生根情况如图1-2所示。.
[0029]三、试管苗移栽:
[0030]试管苗出瓶移栽前，炼苗5-7d，出瓶的幼苗先用500?800倍的多菌灵或代森锰锌浸泡10分钟左右，随后将幼苗移至有顶玻璃的移栽容器中，在温度为20?30°C，湿度80?90%的条件下生长，25?30d长出新叶时，既已成活，移栽成活率达到95%以上。生长情况如图3所示。
[0031]实施例2、组织培养快速繁殖盾叶薯蓣无菌短枝生根的方法
[0032]培养基配制和灭菌
[0033]无菌短枝生根培养基:或者优选使用培养基:1/2MS大量+10*MS微量+MS有机+DL铁盐 +CCC 0.8mg/L+PP3330.3mg/L+IAA0.03mg/L+IBA0.08mg/L+3%蔗糖 +0.75%琼脂。以上培养基121°C下，灭菌20分钟。
[0034]从继代培养的试管苗中选取长势均匀健壮的盾叶薯蓣试管苗，分成单株接种到上述生根培养基中，基本操作方法同实施例1 一致；效果与实施例1相差不大。
【主权项】
1.一种药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，其特征在于， (1)外植体的选择:选用盾叶薯蓣经组织培养获得的无菌短枝为外植体； (2)生根培养:将步骤(I)获得的无菌短枝接种在1/2MS大量+1XMS微量+MS有机+DL 铁盐+CCC 0.1 ?2.0mg/L+PP3330.1 ?2.0mg/L+IAA0.01 ?0.lmg/L+IBA0.01 ?0.2mg/L，以及添加有蔗糖和琼脂的培养基中培养25-40d后形成大量不定根； (3)试管苗移栽； (4)移栽至大田进行种茎繁育。2.根据权利要求1所述的药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，其特征在于， 步骤⑵中生根培养基优选:1/2MS大量+10XMS微量+MS有机+DL铁盐+CCC1.0mg/L+PP3330.5mg/L+IAA0.05mg/L+IBA0.0lmg/L+3%蔗糖 +0.75%琼脂。3.根据权利要求1所述的药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，其特征在于， 步骤⑵中生根培养基优选:1/2MS大量+10XMS微量+MS有机+DL铁盐+CCC0.8mg/L+PP3330.3mg/L+IAA0.03mg/L+IBA0.08mg/L+3%蔗糖 +0.75%琼脂。4.根据权利要求1或2或3所述的药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，其特征在于，生根培养的温度24°C，每天10-12小时光照，光照强度为1000?20001x ;培养20-30do5.根据权利要求1所述的药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，其特征在于， 步骤(3)试管苗移栽:将出瓶的无菌短枝生根苗用500?800倍的多菌灵或代森锰锌浸泡5?15分钟，随后将幼苗移至有顶玻璃的移栽容器中，在温度为20?30°C，湿度80?90%的条件下生长，25?30d长出新叶时，既已成活。6.根据权利要求1所述的药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，其特征在于， 步骤⑷种茎繁殖:将移栽成活的幼苗，在自然条件炼苗5?7d后，移栽至大田进行种茎繁育。
【专利摘要】一种药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，步骤包括：选用盾叶薯蓣经组织培养获得的无菌短枝为外植体；将无菌短枝接种在1/2MS大量+10×MS微量+MS有机+DL铁盐+CCC 0.1～2.0mg/L+PP3330.1～2.0mg/L+IAA0.01～0.1mg/L+IBA0.01～0.2mg/L，以及添加有蔗糖和琼脂的培养基中培养25-40d后形成大量不定根；蔗糖添加量3％，琼脂添加量0.75％；最后是移栽和大田进行种茎繁育。本发明不仅简化了健康种苗生产程序，而且生产成本低，还解决了无菌短枝很难生根的问题，提高了生产效率。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN104904601
【申请号】CN201510319287
【发明人】夏新界, 黄丽芳, 刘永源, 杨平辉
【申请人】中国科学院亚热带农业生态研究所, 重庆华方武陵山制药有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月11日
【技术领域】
[0001]本发明属于药用盾叶薯蓣的组培技术领域，具体涉及一种药用盾叶薯蓣无菌短枝生根的方法。
【背景技术】
[0002]薯蓣(D1scorea)不仅是国家二级保护植物，其根茎所含的薯蓣皂素是合成激素类药物的最基本原料，被誉为“激素之母”。盾叶薯蓣是我国薯蓣皂甙元含量最高的药源植物之一，是我国薯蓣皂甙元含量最高的药源植物之一。
[0003]国内外在20世纪70年代中期就开始利用组织培养技术繁殖薯蓣植物，但大多数停留在实验室技术研宄阶段，未能规模化生产种苗。一方面是因为盾叶薯蓣培养周期长，研宄报道大多是依照外植体一愈伤组织一愈伤组织分化一类原球茎或珠芽一生根一完整植株这一技术路线；从外植体诱导愈伤组织到形成完整植株需120?150d，更大的问题是此方法诱导的根与芽的输导系统不相通，移栽成活率低于30% ;另一方面是因为盾叶薯蓣无菌短枝很难生根，原因是盾叶薯蓣茎结构的特殊性造成的，盾叶薯蓣茎内有两圈维管束，导管及韧皮部周围的纤维和木质化薄壁细胞数量增多，使诱导分化的薄壁细胞减少，因而在诱导无菌短枝生根时很难有不定根的分化。上述问题导致盾叶薯蓣组织培养方法无法形成规范化种植，也是成为以薯蓣为原料的医药产品扩大市场的瓶颈。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术不足，目的是提供一种盾叶薯蓣组织培养无菌短枝生根的方法，以期达到室内大规模繁殖种苗，为规模化发展及时提供盾叶薯蓣大批量优质种苗。本发明的目的可以通过以下技术实现:
[0005]一种药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，
[0006](I)外植体的选择:选用盾叶薯蓣经组织培养获得的无菌短枝为外植体；
[0007](2)生根培养:将步骤(I)获得的无菌短枝接种在1/2MS大量+10XMS微量+MS有机 +DL 铁盐 +CCC 0.1 ?2.0mg/L+PP3330.1 ?2.0mg/L+IAA0.01 ?0.lmg/L+IBA0.01 ?
0.2mg/L，以及添加有蔗糖和琼脂的培养基中培养25-40d后形成大量不定根；蔗糖添加量3%，琼脂添加量0.75% ；
[0008](3)试管苗移栽；
[0009](4)移栽至大田进行种茎繁育。
[0010]步骤(2)中生根培养基优选:1/2MS大量+10XMS微量+MS有机+DL铁盐+CCC
1.0mg/L+PP3330.5mg/L+IAA0.05mg/L+IBA0.0lmg/L+3%蔗糖 +0.75%琼脂。
[0011]步骤(2)中生根培养基还可以优选:1/2MS大量+10XMS微量+MS有机+DL铁盐+CCC 0.8mg/L+PP3330.3mg/L+IAA0.03mg/L+IBA0.08mg/L+3%蔗糖 +0.75%琼脂。
[0012]步骤⑵生根培养的温度24°C，每天10-12小时光照，光照强度为1000?20001x ；培养 20-30d。
[0013]步骤(3)试管苗移栽:将出瓶的无菌短枝生根苗用500?800倍的多菌灵或代森锰锌浸泡5?15分钟，随后将幼苗移至有顶玻璃的移栽容器中，在温度为20?30°C，湿度80?90%的条件下生长，25?30d长出新叶时，既已成活。
[0014]步骤(4)种茎繁殖:将移栽成活的幼苗，在自然条件炼苗5?7d后，移栽至大田进行种茎繁育。
[0015]本发明与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0016]1、用生物技术，在无菌条件下诱导盾叶薯蓣短枝生根，并筛选出无菌短枝生根率为95%的培养基配方。
[0017]2、本发明盾叶薯蓣无菌短枝生根的成功，不但解决了无菌短枝很难生根的问题，同时还克服了盾叶薯蓣原球茎或珠芽生根苗难成活的难题，并提高了移栽成活率。
[0018]3、利用外植体一愈伤组织和芽一无菌短枝生根一完整植株这一技术路线，仅需60?90d形成完整植株，5个月左右可获得大量完整植株，进行大规模工厂化育种。
[0019]本发明不仅简化了健康种苗生产程序，而且生产成本低，还解决了无菌短枝很难生根的问题，提高了生产效率。
【附图说明】
[0020]图1-2为盾叶薯蓣无菌短枝生根情况；
[0021]图3为盾叶薯蓣无菌短枝生根苗移栽40d后的生长情况；
[0022]图4为盾叶薯蓣无菌短枝生根苗移栽大田30d后的生长情况。
【具体实施方式】
[0023]下面结合本发明的实施例来进一步说明本发明实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
[0024]实施例1、组织培养快速繁殖盾叶薯蓣无菌短枝生根的方法
[0025]一、培养基配制和灭菌
[0026]无菌短枝生根培养基:1/2MS大量+10*MS微量+MS有机+DL铁盐+CCC1.0mg/L+PP3330.5mg/L+IAA0.05mg/L+IBA0.0lmg/L+3%蔗糖+0.75%琼脂。以上培养基在 121°C下，灭菌20分钟。
[0027]二、生根培养
[0028]取盾叶薯截(salvia hispanica L)顶芽和莖段，首先用洗衣粉清洗干净，在无菌操作台上用无菌水洗5?7次，用70%酒精浸润I分钟，再放入0.1 %的升汞溶液中灭菌12?18分钟，无菌水冲洗5?6次，将顶芽和腋芽转入装有初代培养基MS+6-BA2.0mg/L+KT0.5mg/L上，每个三角瓶外植体个数为3?5个，培养60_90d诱导出愈伤和芽。继代培养时，将愈伤组织分成小块，每隔30d继代一次，每次继代中，每块愈伤组织增大4-6倍，同步分化芽。从继代培养的试管苗中选取长势均匀健壮的盾叶薯蓣试管苗，分成单株，不带原球茎或珠芽，接种在生根培养基上培养。每个培养瓶外植体个数为10?12个，在下述培养条件下进行培养:24°C左右，每天10-12小时光照，光照强度为1000?20001x左右；培养20-30d，无菌短枝生根率95%以上，无菌短枝生根情况如图1-2所示。.
[0029]三、试管苗移栽:
[0030]试管苗出瓶移栽前，炼苗5-7d，出瓶的幼苗先用500?800倍的多菌灵或代森锰锌浸泡10分钟左右，随后将幼苗移至有顶玻璃的移栽容器中，在温度为20?30°C，湿度80?90%的条件下生长，25?30d长出新叶时，既已成活，移栽成活率达到95%以上。生长情况如图3所示。
[0031]实施例2、组织培养快速繁殖盾叶薯蓣无菌短枝生根的方法
[0032]培养基配制和灭菌
[0033]无菌短枝生根培养基:或者优选使用培养基:1/2MS大量+10*MS微量+MS有机+DL铁盐 +CCC 0.8mg/L+PP3330.3mg/L+IAA0.03mg/L+IBA0.08mg/L+3%蔗糖 +0.75%琼脂。以上培养基121°C下，灭菌20分钟。
[0034]从继代培养的试管苗中选取长势均匀健壮的盾叶薯蓣试管苗，分成单株接种到上述生根培养基中，基本操作方法同实施例1 一致；效果与实施例1相差不大。
【主权项】
1.一种药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，其特征在于， (1)外植体的选择:选用盾叶薯蓣经组织培养获得的无菌短枝为外植体； (2)生根培养:将步骤(I)获得的无菌短枝接种在1/2MS大量+1XMS微量+MS有机+DL 铁盐+CCC 0.1 ?2.0mg/L+PP3330.1 ?2.0mg/L+IAA0.01 ?0.lmg/L+IBA0.01 ?0.2mg/L，以及添加有蔗糖和琼脂的培养基中培养25-40d后形成大量不定根； (3)试管苗移栽； (4)移栽至大田进行种茎繁育。2.根据权利要求1所述的药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，其特征在于， 步骤⑵中生根培养基优选:1/2MS大量+10XMS微量+MS有机+DL铁盐+CCC1.0mg/L+PP3330.5mg/L+IAA0.05mg/L+IBA0.0lmg/L+3%蔗糖 +0.75%琼脂。3.根据权利要求1所述的药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，其特征在于， 步骤⑵中生根培养基优选:1/2MS大量+10XMS微量+MS有机+DL铁盐+CCC0.8mg/L+PP3330.3mg/L+IAA0.03mg/L+IBA0.08mg/L+3%蔗糖 +0.75%琼脂。4.根据权利要求1或2或3所述的药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，其特征在于，生根培养的温度24°C，每天10-12小时光照，光照强度为1000?20001x ;培养20-30do5.根据权利要求1所述的药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，其特征在于， 步骤(3)试管苗移栽:将出瓶的无菌短枝生根苗用500?800倍的多菌灵或代森锰锌浸泡5?15分钟，随后将幼苗移至有顶玻璃的移栽容器中，在温度为20?30°C，湿度80?90%的条件下生长，25?30d长出新叶时，既已成活。6.根据权利要求1所述的药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，其特征在于， 步骤⑷种茎繁殖:将移栽成活的幼苗，在自然条件炼苗5?7d后，移栽至大田进行种茎繁育。
【专利摘要】一种药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，步骤包括：选用盾叶薯蓣经组织培养获得的无菌短枝为外植体；将无菌短枝接种在1/2MS大量+10×MS微量+MS有机+DL铁盐+CCC 0.1～2.0mg/L+PP3330.1～2.0mg/L+IAA0.01～0.1mg/L+IBA0.01～0.2mg/L，以及添加有蔗糖和琼脂的培养基中培养25-40d后形成大量不定根；蔗糖添加量3％，琼脂添加量0.75％；最后是移栽和大田进行种茎繁育。本发明不仅简化了健康种苗生产程序，而且生产成本低，还解决了无菌短枝很难生根的问题，提高了生产效率。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN104904601
【申请号】CN201510319287
【发明人】夏新界, 黄丽芳, 刘永源, 杨平辉
【申请人】中国科学院亚热带农业生态研究所, 重庆华方武陵山制药有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月11日
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