一种鲫鱼雌核发育鱼苗的培育方法
一种鲫鱼雌核发育鱼苗的培育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于鱼类遗传育种领域，特别涉及使用同源精子诱导和培育鲫鱼雌核发育 鱼苗的方法。
【背景技术】
[0002] 雌核发育是利用遗传失活的精子激活卵子，当不具有遗传信息的精子穿透入卵 后，卵子能进行发育和分裂，这种遗传失活的精子的精核不与雌性原核结合，胚胎发育是靠 雌核的单套染色体所携带的基因来调控的（吴清江等.鱼类遗传育种工程.上海：上 海科学技术出版社.1999.)。人工诱导雌核发育对鱼类性别控制、单性养殖、快速建立纯 系及加速良种选育都具有重要意义，该技术已经被广泛应用于国内外许多种鱼类遗传育 种的研宄与实践(吴清江等.鲤鱼人工雌核发育及其作为建立近交系新途径的研宄.遗 传学报? 1981， 8:50-55；Louetal.Diploidgynogenesisinducedbyhydrostatic pressureinrainbowtrout,SalmogairdneriRichardson.JournalofFishBiology. 1984,24:665-670;邹曙明等.团头鲂良种雌核发育群体的建立及其遗传变异.水产学 报.2001， 4:311-316;Sunetal.InductionofgynogenesisinJapaneseCrucian carpcwFieri).ActaGeneticaSinica. 2006，33:405-412.)。叶小军等 利用雌核发育技术得到遗传纯合度很高的大黄鱼品系（叶小军等.大黄鱼连续两代雌核发 育群体的微卫星标记分析?水生生物学报? 2010，34:144-151.)，培育出大黄鱼"闽优1 号"；并且通过诱导雌核发育大黄鱼性反转得到生理性雄鱼，进而培育出遗传全雌大黄鱼， 也已应用到生产实践。王桂兴等利用雌核发育技术和性反转技术，培育出具有生长优势的 "北鲆1号"（王桂兴等.牙鲆连续两代减数分裂雌核发育家系的遗传特征.中国水产科 学? 2012，19:381-389.)。
[0003] 鲫鱼aarates)属鲤形目，鲤科，鲫属，又名喜头鱼、鲋鱼、鲫拐子、朝鱼 等，鲫鱼肉味鲜美，是我国名优食用鱼之一，也是传统渔业的主要增养殖对象。据中国鲤科 鱼类志记载(伍献文等.中国鲤科鱼类志.上海：上海出版社.1997)，我国已知的鲫有 2 个种和 1 个亚种（鲫Ckrassiysaurates、黑鲫Ckrassiys 和银鲫 aarates )。为了提高鲫鱼的生产效益，近年来，定向培育和遗传改良等方法培育得 到的新品种层出不穷，但是这些新品种基本上都是三倍体，如人工培育的湘云鲫和其升级 品种湘云鲫2号，异育银鲫和其升级品种中科3号等。我国的二倍体野生鲫鱼 aerates)尽管肉质鲜美，但是由于其生长缓慢，人们对其关注越来越少，二倍体鲫鱼的雌 核发育研宄更是微乎其微。人工诱导雌核发育是加速鱼类优良基因纯合化、使优良的遗传 性状得以迅速固定，从而实现快速育种的最有效方法之一。孙远东等通过人工诱导雌核发 育得到的日本白鲫二倍体比普通白鲫生长更快、抗病力更强（Sunetal.Inductionof gynogenesisinJapaneseCruciancarp{Carassiuscuvieri).ActaGeneticaSinica. 2006，33:405-412)。目前，关于二倍体野生鲫鱼的雌核发育的育种应用还属空白。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种鲫鱼雌核发育鱼苗的培育方法，并对人工诱导获得的 雌核发育子代个体进行分子遗传特征和表型性状的鉴定，为实现批量制备雌核发育二倍体 鲫鱼纯系群体奠定技术基础。
[0005] 为了实现上述目的，本发明涉及以下技术措施： 1、鲫鱼倍性鉴定 利用4个微卫星标记，HLJY018,HLJY029,HLJY049和YJ0004,标记名称和引物序列见 表1，对野生鲫鱼群体进行染色体倍性鉴定，倍性判定方法为：基因分型结果在上述任何一 个微卫星标记中出现过一次三个等位基因的鲫鱼个体即认为是三倍体鲫鱼，从未出现三个 等位基因的个体则认为是二倍体鲫鱼；排除具有三个等位基因的鲫鱼个体，挑选性腺发育 较好的二倍体野鲫的雌、雄个体，作为雌核发育诱导的亲本群体。
[0006] 2、精子遗传物质失活 用预冷的Hanks液将来自1尾二倍体野生鲫鱼的精液稀释5-8倍，调整厚度至l-2mm， 放置于冰盒上，然后放在紫外灯下17cm处照射18-22min，照射过程中遮蔽自然光并置于摇 床上进行，确保精子照射均匀，并用显微镜检测精子活性。
[0007] 3、冷休克诱导减数分裂染色体加倍 取鲫鱼卵子与步骤（2)中遗传灭活的精子混均后，加入曝气水启动人工授精过程， 2-3min后将受精卵置于5. 5-6. 5°C预冷的曝气水中，冷休克处理20 - 25min，然后置于常 温下进行孵化。
[0008] 4、雌核发育鱼苗的遗传鉴定 利用微卫星标记对得到的雌核发育单倍体及雌核发育二倍体鱼苗进行分子遗传鉴定， 从电泳图谱中的每个个体的扩增条带数目检测并鉴定鲫鱼雌核发育个体的染色体倍性。
[0009] 5、早期生长分析 将诱导得到的雌核发育二倍体鲫鱼的鱼苗置于孵化箱内进行养殖，30d后观察全部存 活个体的外观表型特征并测量体重。
[0010] 6、减数分裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法 利用10个父母本出现特异性的微卫星标记，见表1 :HLJY029、YJ0004、HLJY034、HLJY038、HLJY051、HLJY070、HLJY075、HLJY026、HLJY071、HLJY089,对诱导得到的雌核发育 鱼苗进行亲子鉴定，确定其是否含有父本的遗传物质，统计并分析雌核发育子代的纯合度。
[0011] 表1鲫鱼遗传鉴定所用的微卫星引物信息表
本发明中所述Hanks液的配制方法为：NaCl8. 00g、KCl0? 4g、CaCl20. 14g、MgS04 *7H20 0? 2g、KH2P04 0? 06g、Na2HP04 ?H20 0? 06g、NaHC03 0? 35g、C6H1206 1.OOg，蒸馏水定容至 1L。
[0012] 本发明中野鲫精液稀释及遗传物质灭活时温度都保持在0-4°C，且紫外线照射 剂量为 30-40mW/cm2。
[0013] 本发明旨在通过同源减数分裂雌核发育诱导得到种质更纯、生长速度更快、生存 力更强的雌核发育子代，进而为二倍体鲫鱼的遗传育种研宄工作奠定基础，为培育出更多 更优良的鲫鱼养殖新品种提供技术手段。
【附图说明】
[0014] 图1为利用微卫星标记对野鲫进行染色体倍性鉴定的聚丙烯酰胺电泳带型图。
[0015]A图使用标记为HLJY018，B图使用标记为HLJY029;M为PBR322DNAMarker，1-16 为涨渡湖野生鲫鱼。
[0016]图2为鲫鱼雌核发育单倍体与二倍体倍性鉴定的聚丙烯酰胺电泳带型图。
[0017] 使用微卫星标记为HLJY034 ;M为PBR322DNAMarker;6、早分别为雌核发育家系 1所用的雄性、雌性亲本；1-7为雌核发育二倍体鱼苗；8-14为雌核发育单倍体鱼苗。
[0018]图3为鲫鱼雌核发育二倍体鉴定及纯合度分析的聚丙烯酰胺电泳带型图。
[0019]A图使用标记为YJ0004，B图使用标记为HLJY034 ;M为PBR322DNAMarker，S、早 分别为雌核发育家系2所用的雄性、雌性亲本，1-15为雌核发育二倍体鱼苗。
【具体实施方式】
[0020] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0021] 本发明是利用遗传物质灭活的精子与卵子进行人工授精，通过冷休克抑制减数分 裂第二极体排出的原理，诱导鲫鱼同源雌核发育获得雌核发育二倍体鱼苗的方法。
[0022] 【实施例1】 1、鲫鱼倍性鉴定：通过大量筛选鲫鱼微卫星标记，我们获得了可以明确区分二倍体和 三倍体鲫鱼的4个微卫星标记(标记名称和引物序列见表1 ;HLJY018,HLJY029,HLJY049和 YJ0004)，这4个微卫星标记在已知倍性的鲫鱼中的倍性鉴定率达到100%。利用4个微卫星 标记对来自涨渡湖的野生鲫鱼群体进行染色体倍性鉴定，倍性判定方法为：基因分型结果 在上述任何一个微卫星标记中出现过三个等位基因的鲫鱼个体即认为是三倍体鲫鱼，从未 出现三个等位基因的个体则认为是二倍体鲫鱼。DNA提取及微卫星分型步骤如下： (1)剪取涨渡湖野生鲫鱼的尾鳍并置于 无水乙醇中保存，然后利用苯酚/氯仿法抽提 每个个体的基因组DNA。
[0023] (2)以（1)步所提DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系总体积12.5yL， 包含 20-50ng的模板DNA，0.4UTaqDNA聚合酶，1.25yL10XPCRBuffer，0.4yLdNTP (2. 5mM)，0. 4yL正反向混合引物（各2. 5yM)，最后加适量灭菌超纯水至12. 5yL。其 中dNTPs(10mM)为上海生工公司产品；TaqDNA聚合酶（5U/yL)、10XPCRBuffer为大连 TaKaRa公司产品。将上述混合液置于PCR仪上进行扩增，扩增程序为94°C预变性5分钟 后，进行36个PCR反应循环，每个循环包括94°C变性35秒、适当的退火温度下退火35秒、 72 °C延伸40秒；72 °C终延伸8分钟。
[0024] (3)将步骤（2冲的PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因分型，聚丙烯酰胺凝 胶的配制方法为：30%丙烯酰胺9. 5mL、5XTBE5mL、10%过硫酸铵0. 5mL、TEMED5yL、蒸馏 水12mL。凝胶制作完成后将PCR产物加入适量上样缓冲液后点于凝胶中进行电泳，电压控 制在230V，电泳功率为30W。电泳完成后用1%溴化乙锭（EB)溶液对完成电泳的凝胶进行 染色，并用JS-A380 (上海培清）凝胶成像仪对每张凝胶扫描并拍照保存。
[0025] (4)对微卫星分型结果进行分析(如图1)，排除具有三个等位基因的鲫鱼个体，挑 选性腺发育较好的二倍体野鲫的雌、雄个体，作为雌核发育诱导的亲本。
[0026] 2、精子遗传物质失活：用预冷的Hanks液将精液稀释6倍，调整厚度至1. 5mm， 放置于冰盒上，然后放在紫外灯下17cm处照射20min，紫外线照射剂量为30-40mW/cm2,野 鲫精液稀释及遗传物质灭活时温度都保持在0-4°C。所述Hanks液的配制方法为：NaCl 8. 00g、KCl0? 4g、CaCl20. 14g、MgS04 ? 7H20 0? 2g、KH2P04 0? 06g、Na2HP04 .H20 0? 06g、NaHC03 0? 35g、C6H1206 1. 00g，蒸馏水定容至 1L。
[0027] 3、减数分裂诱导染色体加倍：取编号为1的雌性鲫鱼的卵子与遗传灭活的精子 混均后，加入曝气水启动授精，3min后将受精卵置于6. 0°C预冷的曝气水中，冷休克处理 20min，然后置于常温下进行孵化。所获得的鱼苗编为鲫鱼雌核发育家系1。
[0028] 4、雌核发育家系1鱼苗鉴定：无水乙醇固定刚出膜的畸形及正常雌核发育鱼苗样 品，利用步骤1中的DNA提取及微卫星分型方法对雌核发育育苗进行鉴定。图2所使用的 标记（HLJY034)是一个在雌核发育二倍体子代中杂合性较高的标记，所有雌核发育单倍体 与雌核发育二倍体均不含有父本的等位基因；1-7号的雌核发育二倍体带型与母本带型一 致，均含有两个等位基因；8-14号的雌核发育单倍体均含有母本中的其中一个等位基因。 结果表明，诱导得到的鲫鱼雌核发育家系1中的正常鱼苗确为鲫鱼雌核发育二倍体个体。
[0029] 5、早期生长性状及遗传分析：将诱导得到的正常二倍体雌核发育子代置于室内 养殖，30d后存活63尾，测量体重性状，分析发现该雌核发育家系的子代体重值范围为 0. 21-1. 41g，平均为0. 75g，极大个体与极小个体的体重差距在7倍左右。利用10个微卫 星标记对所有个体进行分型并统计纯合度，分析发现经过一代雌核发育鲫鱼雌核发育家系 1所得到的近交系数Z7 = 〇. 69。
[0030]【实施例2】 按照实施例1中的鉴定方法，选取另外一对鲫鱼二倍体亲本，仅对精子处理条件及受 精卵冷休克处理条件稍加改变。
[0031] 1、精子遗传物质失活：用预冷的Hanks液将精液稀释6倍，调整厚度至1. 5mm，放 置于冰盒上，然后放在紫外灯下17cm处照射22min。
[0032] 2、减数分裂诱导染色体加倍：取鲫鱼卵子与遗传灭活的精子混均后，加入曝气水 启动授精，3min后将受精卵置于6.5°C预冷的曝气水中，冷休克处理25min，然后置于常温 下进行孵化。所获得的鱼苗编为鲫鱼雌核发育家系2。
[0033] 3、早期生长性状及遗传分析：将诱导得到的正常二倍体雌核发育子代置于室内 养殖，30d后存活66尾，测量体重性状，分析发现该雌核发育家系的子代体重值范围为 0. 02-2. 18g，平均为0. 49g，极大个体与极小个体的体重差距达200倍左右。利用10对微卫 星引物对得到的该家系雌核发育子代进行鉴定并统计分析其纯合度，图3为其中2个微卫 星标记（YJ0004和HLJY034)对该雌核发育家系子代的鉴定电泳图，所有雌核发育子代都不 含有父本的等位基因，且没有一个个体10个位点都是纯合的，说明鲫鱼雌核发育家系2中 的子代全部为正常二倍体个体。通过统计分析所有雌核发育二倍体个体在这10个位点的 遗传纯合度，发现经过一代雌核发育鲫鱼雌核发育家系2所得到的近交系数0.55。此 外，我们对生长最快的10尾个体及生长最慢的10尾个体进行了杂合度的统计，分别为0. 38 和0. 40,分析发现两者并无显著差异。
【主权项】
1. 一组可用于鲫鱼群体染色体倍性鉴定的微卫星标记，其特征在于：由座位名称为 HLJY018,HLJY029,HLJY049和YJ0004的微卫星标记组成，微卫星标记引物如下所示：基因分型结果在上述任何一个微卫星标记中出现过一次三个等位基因的鲫鱼个体即 认为是三倍体鲫鱼，从未出现三个等位基因的个体则认为是二倍体鲫鱼。2. -种鲫鱼雌核发育鱼苗的培育方法，其特征在于：包含如下步骤： (1) 鲫鱼倍性鉴定 利用权利要求1所述的4个微卫星标记，HLJY018,HLJY029,HLJY049和YJ0004,对鲫 鱼群体进行染色体倍性鉴定，倍性判定方法为：基因分型结果在上述任何一个微卫星标记 中出现过一次三个等位基因的鲫鱼个体即认为是三倍体鲫鱼，从未出现三个等位基因的个 体则认为是二倍体鲫鱼；排除具有三个等位基因的鲫鱼个体，挑选性腺发育较好的二倍体 野鲫的雌、雄个体，作为雌核发育诱导的亲本群体； (2) 精子遗传物质失活 用预冷的Hanks液将来自1尾二倍体鲫鱼的精液稀释5-8倍，调整厚度至l-2mm，放置 于冰盒上，然后放在紫外灯下17cm处照射18-22min，且紫外线照射剂量为30-40mW/cm2,温 度保持在0-4°C;照射过程中遮蔽自然光并置于摇床上进行，确保精子照射均匀，并用显 微镜检测精子活性； (3) 冷休克诱导减数分裂染色体加倍 取鲫鱼卵子与步骤（2)中遗传灭活的精子混均后，加入曝气水启动人工授精过程， 2-3min后将受精卵置于5. 5-6. 5°C预冷的曝气水中，冷休克处理20 - 25min，然后置于常 温下进行孵化； (4) 雌核发育鱼苗的遗传鉴定 利用微卫星标记对得到的雌核发育单倍体及雌核发育二倍体鱼苗进行分子遗传鉴定， 从电泳图谱中的每个个体的扩增条带数目检测并鉴定鲫鱼雌核发育个体的染色体倍性； (5) 早期生长分析 将诱导得到的雌核发育二倍体鲫鱼的鱼苗置于孵化箱内进行养殖，30d后观察全部存 活个体的外观表型特征并测量体重； (6) 减数分裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法 利用10个父母本出现特异性的微卫星标记，其座位名称为HLJY029、YJ0004、HLJY034、HLJY038、HLJY051、HLJY070、HLJY075、HLJY026、HLJY071、HLJY089，微卫星标记引 物如下所示：对诱导得到的雌核发育鱼苗进行亲子鉴定，确定其是否含有父本的遗传物质，统计并 分析雌核发育子代的纯合度。
【专利摘要】本发明公开了一种鲫鱼雌核发育鱼苗的培育方法。首先选择性成熟的二倍体鲫亲本鱼分别收集精液和卵，通过紫外线照射Hanks液稀释过的精子使其遗传物质失活；取灭活后的精子与卵子进行人工授精，然后用冷休克法抑制减数分裂第二极体的排出，使卵子的染色体组加倍，从而培育出可以存活的鲫鱼雌核发育二倍体鱼苗。经过微卫星标记鉴定证实所有雌核发育鱼苗的遗传物质均来自母本，形态测量表明部分雌核发育鱼苗具有明显的早期生长优势。本方法具有操作简单、高效稳定、实用性强等优点。
【IPC分类】A01K61/00
【公开号】CN104904638
【申请号】CN201510366515
【发明人】童金苟, 王新华, 俞小牧, 刘海洋, 付北德, 冯秀
【申请人】中国科学院水生生物研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月29日
【技术领域】
[0001] 本发明属于鱼类遗传育种领域，特别涉及使用同源精子诱导和培育鲫鱼雌核发育 鱼苗的方法。
【背景技术】
[0002] 雌核发育是利用遗传失活的精子激活卵子，当不具有遗传信息的精子穿透入卵 后，卵子能进行发育和分裂，这种遗传失活的精子的精核不与雌性原核结合，胚胎发育是靠 雌核的单套染色体所携带的基因来调控的（吴清江等.鱼类遗传育种工程.上海：上 海科学技术出版社.1999.)。人工诱导雌核发育对鱼类性别控制、单性养殖、快速建立纯 系及加速良种选育都具有重要意义，该技术已经被广泛应用于国内外许多种鱼类遗传育 种的研宄与实践(吴清江等.鲤鱼人工雌核发育及其作为建立近交系新途径的研宄.遗 传学报? 1981， 8:50-55；Louetal.Diploidgynogenesisinducedbyhydrostatic pressureinrainbowtrout,SalmogairdneriRichardson.JournalofFishBiology. 1984,24:665-670;邹曙明等.团头鲂良种雌核发育群体的建立及其遗传变异.水产学 报.2001， 4:311-316;Sunetal.InductionofgynogenesisinJapaneseCrucian carpcwFieri).ActaGeneticaSinica. 2006，33:405-412.)。叶小军等 利用雌核发育技术得到遗传纯合度很高的大黄鱼品系（叶小军等.大黄鱼连续两代雌核发 育群体的微卫星标记分析?水生生物学报? 2010，34:144-151.)，培育出大黄鱼"闽优1 号"；并且通过诱导雌核发育大黄鱼性反转得到生理性雄鱼，进而培育出遗传全雌大黄鱼， 也已应用到生产实践。王桂兴等利用雌核发育技术和性反转技术，培育出具有生长优势的 "北鲆1号"（王桂兴等.牙鲆连续两代减数分裂雌核发育家系的遗传特征.中国水产科 学? 2012，19:381-389.)。
[0003] 鲫鱼aarates)属鲤形目，鲤科，鲫属，又名喜头鱼、鲋鱼、鲫拐子、朝鱼 等，鲫鱼肉味鲜美，是我国名优食用鱼之一，也是传统渔业的主要增养殖对象。据中国鲤科 鱼类志记载(伍献文等.中国鲤科鱼类志.上海：上海出版社.1997)，我国已知的鲫有 2 个种和 1 个亚种（鲫Ckrassiysaurates、黑鲫Ckrassiys 和银鲫 aarates )。为了提高鲫鱼的生产效益，近年来，定向培育和遗传改良等方法培育得 到的新品种层出不穷，但是这些新品种基本上都是三倍体，如人工培育的湘云鲫和其升级 品种湘云鲫2号，异育银鲫和其升级品种中科3号等。我国的二倍体野生鲫鱼 aerates)尽管肉质鲜美，但是由于其生长缓慢，人们对其关注越来越少，二倍体鲫鱼的雌 核发育研宄更是微乎其微。人工诱导雌核发育是加速鱼类优良基因纯合化、使优良的遗传 性状得以迅速固定，从而实现快速育种的最有效方法之一。孙远东等通过人工诱导雌核发 育得到的日本白鲫二倍体比普通白鲫生长更快、抗病力更强（Sunetal.Inductionof gynogenesisinJapaneseCruciancarp{Carassiuscuvieri).ActaGeneticaSinica. 2006，33:405-412)。目前，关于二倍体野生鲫鱼的雌核发育的育种应用还属空白。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种鲫鱼雌核发育鱼苗的培育方法，并对人工诱导获得的 雌核发育子代个体进行分子遗传特征和表型性状的鉴定，为实现批量制备雌核发育二倍体 鲫鱼纯系群体奠定技术基础。
[0005] 为了实现上述目的，本发明涉及以下技术措施： 1、鲫鱼倍性鉴定 利用4个微卫星标记，HLJY018,HLJY029,HLJY049和YJ0004,标记名称和引物序列见 表1，对野生鲫鱼群体进行染色体倍性鉴定，倍性判定方法为：基因分型结果在上述任何一 个微卫星标记中出现过一次三个等位基因的鲫鱼个体即认为是三倍体鲫鱼，从未出现三个 等位基因的个体则认为是二倍体鲫鱼；排除具有三个等位基因的鲫鱼个体，挑选性腺发育 较好的二倍体野鲫的雌、雄个体，作为雌核发育诱导的亲本群体。
[0006] 2、精子遗传物质失活 用预冷的Hanks液将来自1尾二倍体野生鲫鱼的精液稀释5-8倍，调整厚度至l-2mm， 放置于冰盒上，然后放在紫外灯下17cm处照射18-22min，照射过程中遮蔽自然光并置于摇 床上进行，确保精子照射均匀，并用显微镜检测精子活性。
[0007] 3、冷休克诱导减数分裂染色体加倍 取鲫鱼卵子与步骤（2)中遗传灭活的精子混均后，加入曝气水启动人工授精过程， 2-3min后将受精卵置于5. 5-6. 5°C预冷的曝气水中，冷休克处理20 - 25min，然后置于常 温下进行孵化。
[0008] 4、雌核发育鱼苗的遗传鉴定 利用微卫星标记对得到的雌核发育单倍体及雌核发育二倍体鱼苗进行分子遗传鉴定， 从电泳图谱中的每个个体的扩增条带数目检测并鉴定鲫鱼雌核发育个体的染色体倍性。
[0009] 5、早期生长分析 将诱导得到的雌核发育二倍体鲫鱼的鱼苗置于孵化箱内进行养殖，30d后观察全部存 活个体的外观表型特征并测量体重。
[0010] 6、减数分裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法 利用10个父母本出现特异性的微卫星标记，见表1 :HLJY029、YJ0004、HLJY034、HLJY038、HLJY051、HLJY070、HLJY075、HLJY026、HLJY071、HLJY089,对诱导得到的雌核发育 鱼苗进行亲子鉴定，确定其是否含有父本的遗传物质，统计并分析雌核发育子代的纯合度。
[0011] 表1鲫鱼遗传鉴定所用的微卫星引物信息表
本发明中所述Hanks液的配制方法为：NaCl8. 00g、KCl0? 4g、CaCl20. 14g、MgS04 *7H20 0? 2g、KH2P04 0? 06g、Na2HP04 ?H20 0? 06g、NaHC03 0? 35g、C6H1206 1.OOg，蒸馏水定容至 1L。
[0012] 本发明中野鲫精液稀释及遗传物质灭活时温度都保持在0-4°C，且紫外线照射 剂量为 30-40mW/cm2。
[0013] 本发明旨在通过同源减数分裂雌核发育诱导得到种质更纯、生长速度更快、生存 力更强的雌核发育子代，进而为二倍体鲫鱼的遗传育种研宄工作奠定基础，为培育出更多 更优良的鲫鱼养殖新品种提供技术手段。
【附图说明】
[0014] 图1为利用微卫星标记对野鲫进行染色体倍性鉴定的聚丙烯酰胺电泳带型图。
[0015]A图使用标记为HLJY018，B图使用标记为HLJY029;M为PBR322DNAMarker，1-16 为涨渡湖野生鲫鱼。
[0016]图2为鲫鱼雌核发育单倍体与二倍体倍性鉴定的聚丙烯酰胺电泳带型图。
[0017] 使用微卫星标记为HLJY034 ;M为PBR322DNAMarker;6、早分别为雌核发育家系 1所用的雄性、雌性亲本；1-7为雌核发育二倍体鱼苗；8-14为雌核发育单倍体鱼苗。
[0018]图3为鲫鱼雌核发育二倍体鉴定及纯合度分析的聚丙烯酰胺电泳带型图。
[0019]A图使用标记为YJ0004，B图使用标记为HLJY034 ;M为PBR322DNAMarker，S、早 分别为雌核发育家系2所用的雄性、雌性亲本，1-15为雌核发育二倍体鱼苗。
【具体实施方式】
[0020] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0021] 本发明是利用遗传物质灭活的精子与卵子进行人工授精，通过冷休克抑制减数分 裂第二极体排出的原理，诱导鲫鱼同源雌核发育获得雌核发育二倍体鱼苗的方法。
[0022] 【实施例1】 1、鲫鱼倍性鉴定：通过大量筛选鲫鱼微卫星标记，我们获得了可以明确区分二倍体和 三倍体鲫鱼的4个微卫星标记(标记名称和引物序列见表1 ;HLJY018,HLJY029,HLJY049和 YJ0004)，这4个微卫星标记在已知倍性的鲫鱼中的倍性鉴定率达到100%。利用4个微卫星 标记对来自涨渡湖的野生鲫鱼群体进行染色体倍性鉴定，倍性判定方法为：基因分型结果 在上述任何一个微卫星标记中出现过三个等位基因的鲫鱼个体即认为是三倍体鲫鱼，从未 出现三个等位基因的个体则认为是二倍体鲫鱼。DNA提取及微卫星分型步骤如下： (1)剪取涨渡湖野生鲫鱼的尾鳍并置于 无水乙醇中保存，然后利用苯酚/氯仿法抽提 每个个体的基因组DNA。
[0023] (2)以（1)步所提DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系总体积12.5yL， 包含 20-50ng的模板DNA，0.4UTaqDNA聚合酶，1.25yL10XPCRBuffer，0.4yLdNTP (2. 5mM)，0. 4yL正反向混合引物（各2. 5yM)，最后加适量灭菌超纯水至12. 5yL。其 中dNTPs(10mM)为上海生工公司产品；TaqDNA聚合酶（5U/yL)、10XPCRBuffer为大连 TaKaRa公司产品。将上述混合液置于PCR仪上进行扩增，扩增程序为94°C预变性5分钟 后，进行36个PCR反应循环，每个循环包括94°C变性35秒、适当的退火温度下退火35秒、 72 °C延伸40秒；72 °C终延伸8分钟。
[0024] (3)将步骤（2冲的PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因分型，聚丙烯酰胺凝 胶的配制方法为：30%丙烯酰胺9. 5mL、5XTBE5mL、10%过硫酸铵0. 5mL、TEMED5yL、蒸馏 水12mL。凝胶制作完成后将PCR产物加入适量上样缓冲液后点于凝胶中进行电泳，电压控 制在230V，电泳功率为30W。电泳完成后用1%溴化乙锭（EB)溶液对完成电泳的凝胶进行 染色，并用JS-A380 (上海培清）凝胶成像仪对每张凝胶扫描并拍照保存。
[0025] (4)对微卫星分型结果进行分析(如图1)，排除具有三个等位基因的鲫鱼个体，挑 选性腺发育较好的二倍体野鲫的雌、雄个体，作为雌核发育诱导的亲本。
[0026] 2、精子遗传物质失活：用预冷的Hanks液将精液稀释6倍，调整厚度至1. 5mm， 放置于冰盒上，然后放在紫外灯下17cm处照射20min，紫外线照射剂量为30-40mW/cm2,野 鲫精液稀释及遗传物质灭活时温度都保持在0-4°C。所述Hanks液的配制方法为：NaCl 8. 00g、KCl0? 4g、CaCl20. 14g、MgS04 ? 7H20 0? 2g、KH2P04 0? 06g、Na2HP04 .H20 0? 06g、NaHC03 0? 35g、C6H1206 1. 00g，蒸馏水定容至 1L。
[0027] 3、减数分裂诱导染色体加倍：取编号为1的雌性鲫鱼的卵子与遗传灭活的精子 混均后，加入曝气水启动授精，3min后将受精卵置于6. 0°C预冷的曝气水中，冷休克处理 20min，然后置于常温下进行孵化。所获得的鱼苗编为鲫鱼雌核发育家系1。
[0028] 4、雌核发育家系1鱼苗鉴定：无水乙醇固定刚出膜的畸形及正常雌核发育鱼苗样 品，利用步骤1中的DNA提取及微卫星分型方法对雌核发育育苗进行鉴定。图2所使用的 标记（HLJY034)是一个在雌核发育二倍体子代中杂合性较高的标记，所有雌核发育单倍体 与雌核发育二倍体均不含有父本的等位基因；1-7号的雌核发育二倍体带型与母本带型一 致，均含有两个等位基因；8-14号的雌核发育单倍体均含有母本中的其中一个等位基因。 结果表明，诱导得到的鲫鱼雌核发育家系1中的正常鱼苗确为鲫鱼雌核发育二倍体个体。
[0029] 5、早期生长性状及遗传分析：将诱导得到的正常二倍体雌核发育子代置于室内 养殖，30d后存活63尾，测量体重性状，分析发现该雌核发育家系的子代体重值范围为 0. 21-1. 41g，平均为0. 75g，极大个体与极小个体的体重差距在7倍左右。利用10个微卫 星标记对所有个体进行分型并统计纯合度，分析发现经过一代雌核发育鲫鱼雌核发育家系 1所得到的近交系数Z7 = 〇. 69。
[0030]【实施例2】 按照实施例1中的鉴定方法，选取另外一对鲫鱼二倍体亲本，仅对精子处理条件及受 精卵冷休克处理条件稍加改变。
[0031] 1、精子遗传物质失活：用预冷的Hanks液将精液稀释6倍，调整厚度至1. 5mm，放 置于冰盒上，然后放在紫外灯下17cm处照射22min。
[0032] 2、减数分裂诱导染色体加倍：取鲫鱼卵子与遗传灭活的精子混均后，加入曝气水 启动授精，3min后将受精卵置于6.5°C预冷的曝气水中，冷休克处理25min，然后置于常温 下进行孵化。所获得的鱼苗编为鲫鱼雌核发育家系2。
[0033] 3、早期生长性状及遗传分析：将诱导得到的正常二倍体雌核发育子代置于室内 养殖，30d后存活66尾，测量体重性状，分析发现该雌核发育家系的子代体重值范围为 0. 02-2. 18g，平均为0. 49g，极大个体与极小个体的体重差距达200倍左右。利用10对微卫 星引物对得到的该家系雌核发育子代进行鉴定并统计分析其纯合度，图3为其中2个微卫 星标记（YJ0004和HLJY034)对该雌核发育家系子代的鉴定电泳图，所有雌核发育子代都不 含有父本的等位基因，且没有一个个体10个位点都是纯合的，说明鲫鱼雌核发育家系2中 的子代全部为正常二倍体个体。通过统计分析所有雌核发育二倍体个体在这10个位点的 遗传纯合度，发现经过一代雌核发育鲫鱼雌核发育家系2所得到的近交系数0.55。此 外，我们对生长最快的10尾个体及生长最慢的10尾个体进行了杂合度的统计，分别为0. 38 和0. 40,分析发现两者并无显著差异。
【主权项】
1. 一组可用于鲫鱼群体染色体倍性鉴定的微卫星标记，其特征在于：由座位名称为 HLJY018,HLJY029,HLJY049和YJ0004的微卫星标记组成，微卫星标记引物如下所示：基因分型结果在上述任何一个微卫星标记中出现过一次三个等位基因的鲫鱼个体即 认为是三倍体鲫鱼，从未出现三个等位基因的个体则认为是二倍体鲫鱼。2. -种鲫鱼雌核发育鱼苗的培育方法，其特征在于：包含如下步骤： (1) 鲫鱼倍性鉴定 利用权利要求1所述的4个微卫星标记，HLJY018,HLJY029,HLJY049和YJ0004,对鲫 鱼群体进行染色体倍性鉴定，倍性判定方法为：基因分型结果在上述任何一个微卫星标记 中出现过一次三个等位基因的鲫鱼个体即认为是三倍体鲫鱼，从未出现三个等位基因的个 体则认为是二倍体鲫鱼；排除具有三个等位基因的鲫鱼个体，挑选性腺发育较好的二倍体 野鲫的雌、雄个体，作为雌核发育诱导的亲本群体； (2) 精子遗传物质失活 用预冷的Hanks液将来自1尾二倍体鲫鱼的精液稀释5-8倍，调整厚度至l-2mm，放置 于冰盒上，然后放在紫外灯下17cm处照射18-22min，且紫外线照射剂量为30-40mW/cm2,温 度保持在0-4°C;照射过程中遮蔽自然光并置于摇床上进行，确保精子照射均匀，并用显 微镜检测精子活性； (3) 冷休克诱导减数分裂染色体加倍 取鲫鱼卵子与步骤（2)中遗传灭活的精子混均后，加入曝气水启动人工授精过程， 2-3min后将受精卵置于5. 5-6. 5°C预冷的曝气水中，冷休克处理20 - 25min，然后置于常 温下进行孵化； (4) 雌核发育鱼苗的遗传鉴定 利用微卫星标记对得到的雌核发育单倍体及雌核发育二倍体鱼苗进行分子遗传鉴定， 从电泳图谱中的每个个体的扩增条带数目检测并鉴定鲫鱼雌核发育个体的染色体倍性； (5) 早期生长分析 将诱导得到的雌核发育二倍体鲫鱼的鱼苗置于孵化箱内进行养殖，30d后观察全部存 活个体的外观表型特征并测量体重； (6) 减数分裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法 利用10个父母本出现特异性的微卫星标记，其座位名称为HLJY029、YJ0004、HLJY034、HLJY038、HLJY051、HLJY070、HLJY075、HLJY026、HLJY071、HLJY089，微卫星标记引 物如下所示：对诱导得到的雌核发育鱼苗进行亲子鉴定，确定其是否含有父本的遗传物质，统计并 分析雌核发育子代的纯合度。
【专利摘要】本发明公开了一种鲫鱼雌核发育鱼苗的培育方法。首先选择性成熟的二倍体鲫亲本鱼分别收集精液和卵，通过紫外线照射Hanks液稀释过的精子使其遗传物质失活；取灭活后的精子与卵子进行人工授精，然后用冷休克法抑制减数分裂第二极体的排出，使卵子的染色体组加倍，从而培育出可以存活的鲫鱼雌核发育二倍体鱼苗。经过微卫星标记鉴定证实所有雌核发育鱼苗的遗传物质均来自母本，形态测量表明部分雌核发育鱼苗具有明显的早期生长优势。本方法具有操作简单、高效稳定、实用性强等优点。
【IPC分类】A01K61/00
【公开号】CN104904638
【申请号】CN201510366515
【发明人】童金苟, 王新华, 俞小牧, 刘海洋, 付北德, 冯秀
【申请人】中国科学院水生生物研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月29日
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