一种人源化小鼠的制作方法
一种人源化小鼠的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种人源化小鼠，尤其是一种在人源细胞表达人 鼠融合CD47基因进而促进人源细胞在小鼠体内正常生长发育并发挥功能的人源化小鼠。
【背景技术】
[0002] 人类免疫学、免疫病理学等的研宄发现转化为临床疗法时常受到不能直接在人体 进行体内实验研宄的限制。人类疾病的小鼠模型虽然能提供很多有用信息，但是由于人类 生理与动物生理有显著的差别，利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上，而 非人类的灵长类动物研宄能够填平物种亲缘关系太远而存在的差别沟壑，但是其使用受限 于其高昂的费用、缺乏近交系和伦理问题。在转化医学时代，复杂的生物学机制需要体内实 验分析，因此，这就需要一种新的动物模型，该模型要能支持体内人体组织和细胞的研宄。 人源化小鼠刚好符合这个要求，该模型的使用能获得对很多人类感染和炎症疾病的深入研 宄。
[0003] 1988年世上第一个成功地用重症联合免疫缺陷（SCID)小鼠建立了异基因移植小 鼠模型【Mosier DE，et al. Nature 1988;335:256 - 9.】。目前制作免疫系统人源化小鼠是 通过在免疫缺陷小鼠移植人体造血干细胞。常见的受体鼠有NOD-scid IL2ry-/_小鼠、 BALB/c背景的Rag2-/-IL2r y-/-小鼠和C57BL/6背景的Rag2-/-IL2r y -/-CD47-/-小 鼠【Lavender KJ，et al. Blood. 2013, 122 (25): 4013-4020】。通过敲除IL2ry、Rag2基因 或Prkdc基因自然突变能导致免疫功能障碍，使B、T和NK细胞缺失，从而能进行异种移 植【Shultz LD，et al. Nat Rev Immunol. 2007 ;7:118-130;Ito M，et al. Blood 2002; 100:3175 - 3182 ；Shultz LD, et al. J Immunol. 2005；174:6477 - 6489]〇
[0004] NOD遗传背景的小鼠相对缺乏吞细胞活性【Legrand N, et al. J Immunol 2006;176:2053 - 2058 ;Shultz LD，et al.J Immunol 1995;154:180 - 191】，而BALB/c 和C57BL/6小鼠吞噬细胞活性较强，阻碍了人源化T、NK细胞的发育。吞噬细胞的活性能 通过⑶47和SIRPa分子间的相互识别并结合而被抑制【Barclay AN. 2009;Curr Opin Immunol 21:47 - 52】。SIRPa表达在巨噬细胞和树突状细胞上，该分子能识别并结合 0)47分子，而⑶47分子广泛表达于几乎所有的细胞上【Kharitonenkov A, et al. Nature 1997；386:181 - 186 ；Seiffert M, et al. Blood 1999；94: 3633 - 3643 ；Lindberg FP, et al.J Cell Biol 1993;123:485 - 496】。不表达CD47的造血细胞会很快被血液中的巨 噬细胞和树突状细胞所清除【01 denborg PA,et al. Science 2000;288:2051 - 2054; Blazar BR,et al.J Exp Med 2001;194:541 - 550】，因此CD47是一个识别自身细胞的 必要标记物。由于人源细胞表达的⑶47不同于小鼠⑶47,小鼠SIRPa分子不能识别 人CD47分子，因此人源细胞容易被小鼠吞噬细胞吞噬，从而使建立人源化小鼠难于成 功。基于此，近来针对SIRPa和⑶47分子进行了基因修饰来阻止小鼠细胞吞噬人源细 胞，比如在人源造血干细胞转入小鼠⑶47分子【Legrand N，et al.Proc Natl Acad Sci USA. 2011 ; 108(32):13224 - 13229】，在小鼠转入人SIRPa基因【StrowigT, et al. Proc NatlAcadSciUSA. 2011 ;108(32): 13218 - 13223】，敲除小鼠CD47 基因【LavenderKJ，et al.Blood. 2013, 122(25) : 4013-4020】等，取得了较好的效果。
[0005] 尽管在人源细胞表达小鼠⑶47能阻止吞噬细胞吞噬人源细胞，但是由于 CD47分子本身也是一个信号分子，它不仅能与SIRPa反应，还能与多种其他分子进 行反应（如thrombospondin,integrins,其他的SIRP家族成员SIRPy等）【van BeekEM,etal.JImmunol2005 :175:7781 - 7787:SarfatiM.etal.CurrentDrug Targets, 2008 ;9:842-850】，因此，CD47除了作为SIRPa配体而起到识别自我组织的 作用外，它还通过与其他配体结合而介导其他许多生理活动，比如影响T细胞功能等 (0)47与thrombospondin-1 (TSP-1)或可溶性⑶47单克隆抗体结合能抑制T细胞功能【AviceMN，etal.J.Immunol. 2000 ;165(8):4624_31;AviceMN，etal.J.Immunol. 2001; 167(5):2459-68；LiZ,etal.J.Immunol. 2001 ；166(4):2427-36；ffaclavicekM,et al.J.Immunol. 1997 ; 159 (11) : 5345-54】)、影响细胞自我更新（CD47与配体TSP-1结合后通 过抑制c-myc等的表达而影响细胞自我更新等【KaurS，etal.SciRep. 2013 ;3:1673】）、 以及影响炎性反应（⑶47与⑶47单克隆抗体或L-SIRP-alpha结合抑制IL-12R的表达并下 调活化的T细胞对IL-12 的反应【LatourS,etal.JImmunol. 2001 ; 167(5) : 2547-54.】）。 因此CD47不仅仅作为一个与它反应的受体的配体而存在，它本身也是一个信号分子或受 体，起到传递胞外信号进细胞的作用。
[0006] 在现有的制作人源化小鼠技术中，为了不使小鼠巨噬细胞和DC细胞吞噬人源细 胞，只是把小鼠⑶47基因表达于人源细胞上，该表达于人源细胞上的小鼠⑶47分子只是起 到让小鼠吞噬细胞识别人源细胞为自身细胞而不吞噬人源细胞的作用，但是由于小鼠CD47 分子与人CD47分子存在差异，很多胞外信号并不能通过小鼠CD47分子被人源细胞感知并 触发应有的生理反应，而本身就表达在人源细胞上的人CD47分子对小鼠CD47的配体或受 体又不能识别，从而使得人源细胞在小鼠体内缺乏很多需要通过CD47传递的胞外信号的 刺激，细胞外的信息不能畅达至细胞内，从而影响到人源细胞在小鼠体内生长发育的正常 进行与功能的正常发挥。这一点已经被我们实验所证实，比如在表达了小鼠⑶47的人源T 细胞，小鼠TSP-1或可溶性CD47单克隆抗体不能抑制该人源T细胞的功能，而对于小鼠T 细胞则其功能能被小鼠TSP-1或可溶性CD47单克隆抗体抑制，说明在人源细胞表达的小鼠 CD47不能把胞外信息顺利传递到人源细胞内部。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了克服现有制备人源化小鼠技术的在人源细胞表达的小鼠 CD47不能顺畅地把胞外信号进传递入胞内的缺点，本发明通过基因改建提供一种人源化小 鼠，该小鼠不仅能使小鼠吞噬细胞识别人源细胞为自身细胞而不再吞噬人源细胞，而且能 使人源细胞在小鼠体内获得正常的胞外信息，促进其在小鼠体内进行正常的生长发育并发 挥功能，从而提高人源化小鼠的应用价值。
[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0009] 本发明的人源化小鼠，其人源细胞上表达小鼠-人融合⑶47基因，该基因的胞外 部分为小鼠CD47序列，而穿膜部分和胞内部分为人CD47序列；或者胞外部分和穿膜部分为 小鼠CD47氨基酸序列，胞内部分为人CD47氨基酸序列。
[0010] 本发明的人源化小鼠，人源细胞上表达的融合CD47分子，其胞外部分能被小鼠 SIRPa、TSP-1及其他小鼠CD47的配体或受体所识别，胞内部分能很好地把胞外所受到的 信号让人源细胞感知并作出应有的反应，达到既能使小鼠吞噬细胞识别人源细胞为自身细 胞而不再吞噬，又能使人源细胞在小鼠体内环境下获得正常的胞外信息的目的。
[0011] 本发明的有益效果是转入该小鼠-人融合⑶47基因的人源细胞，在不被小鼠吞噬 细胞吞噬的同时，能使小鼠体内环境下胞外信息传递到人源细胞并被人源细胞所感知并作 出应有反应，使人源化小鼠中的人源细胞正常生长发育并发挥功能。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明融合CD47的载体质粒图，其中各元件如下：
[0013]
[0014]
[0015] 图2是经免疫接种灭活的白色念珠菌3天后，对照人源化小鼠（人源细胞表达小 鼠CD47)和融合CD47人源化小鼠（人源细胞表达小鼠-人融合CD47)中人源CD4和白介 素4双阳性细胞白介素表达强度的比较图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和实施例对本发 明进一步说明（下面序列ID1是本发明融合CD47 序列）。
[0017] 1、人-鼠⑶47融合基因的构建
[0018] 首先，小鼠CD47(如GENBANKaccessionnumber:AB012693)的第 1 至第 142 氨基 酸残基与人CD47(如GENBANKaccessionnumber:BT006907)的第 145 至 305 氨基酸残基 融合在一起，相对应的核苷酸序列为序列ID1。根据该设计好的序列，在5'端ATG前加上 三个保护核苷酸和Xbal限制性内切酶识别序列以及Kozak序列GCCACC，在终止密码子后加 上Bglll限制性内切酶识别序列和三个保护核苷酸。该序列DNA委托生物技术公司合成。 [0019] 以上合成好的DNA经BglII和Xbal酶切，分离片段后克隆入慢病毒表达载体多克 隆位点相应的酶切点间。图1为融合CD47载体质粒图。
[0020] 2、慢病毒的制备
[0021] 将293T细胞培养在6孔细胞培养板中的改良杜氏伊格尔培养基（Dulbecco's ModifiedEagle'sMedium，DMEM)完全培养基（在DMEM完全培养基中添加10%胎牛血清、 100单位/ml青霉素、100yg/ml链霉素、2mML-谷氨酰胺等）中（37°C，5 %C02)，待细胞 90 %汇合时，用含5 %FBS、不含抗生素的DMEM新鲜培养基替换掉老培养基，每孔加1. 5ml 培养基，放入37°C，5 %C0培养箱备用。取两个1.5ml离心管，每管加入预先37°C加热 的0PTI-MEM培养基250y1，然后在其中一管中加入经纯化的2. 5yg上述构建好的慢病毒 CD47融合蛋白表达载体质粒（或作为对照的慢病毒小鼠CD47表达载体质粒）以及VSV-G质 粒和包装质粒，混勾，常温5分钟；同时在另一管中加入Lipofectamine2000脂质体5yl， 混匀，常温5分钟。把两管内容物加在一起混匀，常温放置20分钟，然后加到细胞培养孔中， 轻轻摇晃均匀，然后置于37°C，5 %C02培养，6小时后用新鲜完全DMEM培养基（在DMEM培 养基中添加了 10 %胎牛血清、100单位/ml青霉素、100yg/ml链霉素、2mML-谷氨酰胺等） 置换掉老培养基，再培养约30个小时后收集上清液，500g离心5分钟，取上清，-80度保存 备用。
[0022] 3、人⑶34造血干细胞分离、病毒感染及移植
[0023] 从产妇获取新鲜脐带血，按照⑶34磁珠分离试剂盒（STEMCELL公司）产品使用说 明进行CD34阳性细胞分离。分离后的CD34阳性细胞培养于添加有100纳克/毫升人干细 胞因子（rhSCF)、100纳克/毫升Flt3配体（Flt3-L)、50纳克/毫升促血小板生成素（Tpo) 的完全培养基【含有15%胎牛血清、2毫摩尔/升谷氨酰胺、0. 1毫摩尔/升非必需氨基酸、 1 %青霉素/链霉素（l〇〇x，Gibco)的高糖改良杜氏伊格尔培养基（Dulbecco'sModified Eagle'sMedium，DMEM)】，48小时后用制备好的慢病毒上清液进行病毒感染，感染方法为离 心感染法，即在细胞中加好含有6微克每毫升polybrene的病毒上清液，然后在离心机上 900g离心45分钟，连续两天进行两次离心感染。第二次感染后换上新鲜含有细胞因子的完 全培养基，培养24小时后进行GFP阳性细胞流式细胞仪筛选，筛选出的GFP阳性细胞进行 移植。移植前免疫缺陷的受体小鼠（BALB/cRag2-/-IL2ry-/_小鼠）经不同剂量137Cs 源放射线照射或不照射，从尾静脉注入感染好的CD34阳性骨髓细胞。
[0024] 4、移植后免疫应答
[0025] 移植后6周测定小鼠外周血人源细胞比例，人源细胞表达小鼠⑶47的人源化小鼠 (对照人源化小鼠）和人源细胞表达小鼠-人融合CD47的人源化小鼠（融合CD47人源化 小鼠）中人源细胞比例分别为62. 9±23. 6%和67. 4±20. 2%，两者无显著差别。
[0026] 挑选人源细胞达到80 %以上的人源化小鼠，接种5X105灭活的白色念珠菌来免 疫小鼠。接种后3天，从小鼠取出脾脏细胞，用红细胞裂解液去除红细胞，用1%胎牛血清 的PBS洗两遍，然后用FITC标记的抗⑶4抗体和APC标记的抗人⑶45抗体对脾脏白细胞 冰上孵育30分钟，然后用含1%胎牛血清的PBS洗两遍，然后在固定-透膜剂（Cytofix/ Cytoperm)中固定和透膜15分钟，用透膜冲洗液冲洗两遍，然后用PE标记的抗白介素 4 (anti-IL-4)抗体在冰上标记30分钟，细胞用含1 %胎牛血清的PBS洗两遍，重悬于 400y1的PBS中，上流式细胞仪进行检测。结果见图2，对照人源化小鼠的人源⑶4和白介 素4双阳性细胞表达的白介素4显著小于融合CD47人源化小鼠的人源CD4和白介素4双 阳性细胞，提示后者有更好的体液免疫应答。
[0027] 本发明上述融合CD47DNA序列，如SEQIDNO. 1所示，具体是：
[0028] ATGTGGCCCTTGGCGGCGGCGCTGTTGCTGGGCTCCTGCTGCTGCGGTTCAGCTCAACTACTGTTTAGT AACGTCAACTCCATAGAGTTCACTTCATGCAATGAAACTGTGGTCATCCCTTGCATCGTCCGTAATGTGGAGGCGCA AAGCACCGAAGAAATGTTTGTGAAGTGGAAGTTGAACAAATCGTATATTTTCATCTATGATGGAAATAAAAATAGCA CTACTACAGATCAAAACTTTACCAGTGCAAAAATCTCAGTCTCAGACTTAATCAATGGCATTGCCTCTTTGAAAATG GATAAGCGCGATGCCATGGTGGGAAACTACACTTGCGAAGTGACAGAGTTATCCAGAGAAGGCAAAACAGTTATAGA GCTGAAAAACCGCACGGTTTCGTGGTTTTCTCCAAATGAAAAGATCCTCATTGTTATTTTCCCAATTTTTGCTATAC TCCTGTTCTGGGGACAGTTTGGTATTAAAACACTTAAATATAGATCCGGTGGTATGGATGAGAAAACAATTGCTTTA CTTGTTGCTGGACTAGTGATCACTGTCATTGTCATTGTTGGAGCCATTCTTTTCGTCCCAGGTGAATATTCATTAAA GAATGCTACTGGCCTTGGTTTAATTGTGACTTCTACAGGGATATTAATATTACTTCACTACTATGTGTTTAGTACAG CGATTGGATTAACCTCCTTCGTCATTGCCATATTGGTTATTCAGGTGATAGCCTATATCCTCGCTGTGGTTGGACTG AGTCTCTGTATTGCGGCGTGTATACCAATGCATGGCCCTCTTCTGATTTCAGGTTTGAGTATCTTAGCTCTAGCACA ATTACTTGGACTAGTTTATATGAAATTTGTGGAATAACTGAAGTGAAGTGATGGACTCCGATTTGGAGAGTAG
[0029] 上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合 本发明要求，均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种人源化小鼠，其特征在于其人源细胞上表达小鼠-人融合⑶47基因。2. 如权利要求1所述的一种人源化小鼠，其特征在于其人源细胞上表达的小鼠-人融 合CD47分子，胞外部分为小鼠CD47氨基酸序列，穿膜部分和胞内部分为人CD47氨基酸序 列；或者胞外部分和穿膜部分为小鼠CD47氨基酸序列，胞内部分为人CD47氨基酸序列。3. 如权利要求1所述的一种人源化小鼠，其特征在于其人源细胞上表达的小鼠-人融 合⑶47基因如SEQIDNO. 1所示，为小鼠⑶47的第1至第142氨基酸残基与人⑶47的第 145至305氨基酸残基融合在一起。4. 如权利要求1所述的一种人源化小鼠，其特征在于人源化小鼠，人源细胞上表达的 融合CD47分子，其胞外部分能被小鼠SIRPa、TSP-I及其他小鼠CD47的配体或受体所识 另IJ，胞内部分能很好地把胞外所受到的信号让人源细胞感知并作出应有的反应，达到既能 使小鼠吞噬细胞识别人源细胞为自身细胞而不再吞，又能使人源细胞在小鼠体内环境下 获得正常的胞外信息的目的。
【专利摘要】本发明公开一种人源化小鼠。该人源化小鼠其人源细胞上表达小鼠-人融合CD47基因如SEQ ID NO.1所示，该基因的胞外部分为小鼠CD47序列，而穿膜部分和胞内部分为人CD47序列；或者胞外部分和穿膜部分为小鼠CD47氨基酸序列，胞内部分为人CD47氨基酸序列。本发明转入该小鼠-人融合CD47基因的人源细胞，在不被小鼠吞噬细胞吞噬的同时，能使小鼠体内环境下胞外信息传递到人源细胞并被人源细胞所感知并作出应有反应，使人源化小鼠中的人源细胞正常生长发育并发挥功能。
【IPC分类】A01K67/027
【公开号】CN104904661
【申请号】CN201510310055
【发明人】王彦刈
【申请人】王彦刈
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月5日
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种人源化小鼠，尤其是一种在人源细胞表达人 鼠融合CD47基因进而促进人源细胞在小鼠体内正常生长发育并发挥功能的人源化小鼠。
【背景技术】
[0002] 人类免疫学、免疫病理学等的研宄发现转化为临床疗法时常受到不能直接在人体 进行体内实验研宄的限制。人类疾病的小鼠模型虽然能提供很多有用信息，但是由于人类 生理与动物生理有显著的差别，利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上，而 非人类的灵长类动物研宄能够填平物种亲缘关系太远而存在的差别沟壑，但是其使用受限 于其高昂的费用、缺乏近交系和伦理问题。在转化医学时代，复杂的生物学机制需要体内实 验分析，因此，这就需要一种新的动物模型，该模型要能支持体内人体组织和细胞的研宄。 人源化小鼠刚好符合这个要求，该模型的使用能获得对很多人类感染和炎症疾病的深入研 宄。
[0003] 1988年世上第一个成功地用重症联合免疫缺陷（SCID)小鼠建立了异基因移植小 鼠模型【Mosier DE，et al. Nature 1988;335:256 - 9.】。目前制作免疫系统人源化小鼠是 通过在免疫缺陷小鼠移植人体造血干细胞。常见的受体鼠有NOD-scid IL2ry-/_小鼠、 BALB/c背景的Rag2-/-IL2r y-/-小鼠和C57BL/6背景的Rag2-/-IL2r y -/-CD47-/-小 鼠【Lavender KJ，et al. Blood. 2013, 122 (25): 4013-4020】。通过敲除IL2ry、Rag2基因 或Prkdc基因自然突变能导致免疫功能障碍，使B、T和NK细胞缺失，从而能进行异种移 植【Shultz LD，et al. Nat Rev Immunol. 2007 ;7:118-130;Ito M，et al. Blood 2002; 100:3175 - 3182 ；Shultz LD, et al. J Immunol. 2005；174:6477 - 6489]〇
[0004] NOD遗传背景的小鼠相对缺乏吞细胞活性【Legrand N, et al. J Immunol 2006;176:2053 - 2058 ;Shultz LD，et al.J Immunol 1995;154:180 - 191】，而BALB/c 和C57BL/6小鼠吞噬细胞活性较强，阻碍了人源化T、NK细胞的发育。吞噬细胞的活性能 通过⑶47和SIRPa分子间的相互识别并结合而被抑制【Barclay AN. 2009;Curr Opin Immunol 21:47 - 52】。SIRPa表达在巨噬细胞和树突状细胞上，该分子能识别并结合 0)47分子，而⑶47分子广泛表达于几乎所有的细胞上【Kharitonenkov A, et al. Nature 1997；386:181 - 186 ；Seiffert M, et al. Blood 1999；94: 3633 - 3643 ；Lindberg FP, et al.J Cell Biol 1993;123:485 - 496】。不表达CD47的造血细胞会很快被血液中的巨 噬细胞和树突状细胞所清除【01 denborg PA,et al. Science 2000;288:2051 - 2054; Blazar BR,et al.J Exp Med 2001;194:541 - 550】，因此CD47是一个识别自身细胞的 必要标记物。由于人源细胞表达的⑶47不同于小鼠⑶47,小鼠SIRPa分子不能识别 人CD47分子，因此人源细胞容易被小鼠吞噬细胞吞噬，从而使建立人源化小鼠难于成 功。基于此，近来针对SIRPa和⑶47分子进行了基因修饰来阻止小鼠细胞吞噬人源细 胞，比如在人源造血干细胞转入小鼠⑶47分子【Legrand N，et al.Proc Natl Acad Sci USA. 2011 ; 108(32):13224 - 13229】，在小鼠转入人SIRPa基因【StrowigT, et al. Proc NatlAcadSciUSA. 2011 ;108(32): 13218 - 13223】，敲除小鼠CD47 基因【LavenderKJ，et al.Blood. 2013, 122(25) : 4013-4020】等，取得了较好的效果。
[0005] 尽管在人源细胞表达小鼠⑶47能阻止吞噬细胞吞噬人源细胞，但是由于 CD47分子本身也是一个信号分子，它不仅能与SIRPa反应，还能与多种其他分子进 行反应（如thrombospondin,integrins,其他的SIRP家族成员SIRPy等）【van BeekEM,etal.JImmunol2005 :175:7781 - 7787:SarfatiM.etal.CurrentDrug Targets, 2008 ;9:842-850】，因此，CD47除了作为SIRPa配体而起到识别自我组织的 作用外，它还通过与其他配体结合而介导其他许多生理活动，比如影响T细胞功能等 (0)47与thrombospondin-1 (TSP-1)或可溶性⑶47单克隆抗体结合能抑制T细胞功能【AviceMN，etal.J.Immunol. 2000 ;165(8):4624_31;AviceMN，etal.J.Immunol. 2001; 167(5):2459-68；LiZ,etal.J.Immunol. 2001 ；166(4):2427-36；ffaclavicekM,et al.J.Immunol. 1997 ; 159 (11) : 5345-54】)、影响细胞自我更新（CD47与配体TSP-1结合后通 过抑制c-myc等的表达而影响细胞自我更新等【KaurS，etal.SciRep. 2013 ;3:1673】）、 以及影响炎性反应（⑶47与⑶47单克隆抗体或L-SIRP-alpha结合抑制IL-12R的表达并下 调活化的T细胞对IL-12 的反应【LatourS,etal.JImmunol. 2001 ; 167(5) : 2547-54.】）。 因此CD47不仅仅作为一个与它反应的受体的配体而存在，它本身也是一个信号分子或受 体，起到传递胞外信号进细胞的作用。
[0006] 在现有的制作人源化小鼠技术中，为了不使小鼠巨噬细胞和DC细胞吞噬人源细 胞，只是把小鼠⑶47基因表达于人源细胞上，该表达于人源细胞上的小鼠⑶47分子只是起 到让小鼠吞噬细胞识别人源细胞为自身细胞而不吞噬人源细胞的作用，但是由于小鼠CD47 分子与人CD47分子存在差异，很多胞外信号并不能通过小鼠CD47分子被人源细胞感知并 触发应有的生理反应，而本身就表达在人源细胞上的人CD47分子对小鼠CD47的配体或受 体又不能识别，从而使得人源细胞在小鼠体内缺乏很多需要通过CD47传递的胞外信号的 刺激，细胞外的信息不能畅达至细胞内，从而影响到人源细胞在小鼠体内生长发育的正常 进行与功能的正常发挥。这一点已经被我们实验所证实，比如在表达了小鼠⑶47的人源T 细胞，小鼠TSP-1或可溶性CD47单克隆抗体不能抑制该人源T细胞的功能，而对于小鼠T 细胞则其功能能被小鼠TSP-1或可溶性CD47单克隆抗体抑制，说明在人源细胞表达的小鼠 CD47不能把胞外信息顺利传递到人源细胞内部。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了克服现有制备人源化小鼠技术的在人源细胞表达的小鼠 CD47不能顺畅地把胞外信号进传递入胞内的缺点，本发明通过基因改建提供一种人源化小 鼠，该小鼠不仅能使小鼠吞噬细胞识别人源细胞为自身细胞而不再吞噬人源细胞，而且能 使人源细胞在小鼠体内获得正常的胞外信息，促进其在小鼠体内进行正常的生长发育并发 挥功能，从而提高人源化小鼠的应用价值。
[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0009] 本发明的人源化小鼠，其人源细胞上表达小鼠-人融合⑶47基因，该基因的胞外 部分为小鼠CD47序列，而穿膜部分和胞内部分为人CD47序列；或者胞外部分和穿膜部分为 小鼠CD47氨基酸序列，胞内部分为人CD47氨基酸序列。
[0010] 本发明的人源化小鼠，人源细胞上表达的融合CD47分子，其胞外部分能被小鼠 SIRPa、TSP-1及其他小鼠CD47的配体或受体所识别，胞内部分能很好地把胞外所受到的 信号让人源细胞感知并作出应有的反应，达到既能使小鼠吞噬细胞识别人源细胞为自身细 胞而不再吞噬，又能使人源细胞在小鼠体内环境下获得正常的胞外信息的目的。
[0011] 本发明的有益效果是转入该小鼠-人融合⑶47基因的人源细胞，在不被小鼠吞噬 细胞吞噬的同时，能使小鼠体内环境下胞外信息传递到人源细胞并被人源细胞所感知并作 出应有反应，使人源化小鼠中的人源细胞正常生长发育并发挥功能。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明融合CD47的载体质粒图，其中各元件如下：
[0013]
[0014]
[0015] 图2是经免疫接种灭活的白色念珠菌3天后，对照人源化小鼠（人源细胞表达小 鼠CD47)和融合CD47人源化小鼠（人源细胞表达小鼠-人融合CD47)中人源CD4和白介 素4双阳性细胞白介素表达强度的比较图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和实施例对本发 明进一步说明（下面序列ID1是本发明融合CD47 序列）。
[0017] 1、人-鼠⑶47融合基因的构建
[0018] 首先，小鼠CD47(如GENBANKaccessionnumber:AB012693)的第 1 至第 142 氨基 酸残基与人CD47(如GENBANKaccessionnumber:BT006907)的第 145 至 305 氨基酸残基 融合在一起，相对应的核苷酸序列为序列ID1。根据该设计好的序列，在5'端ATG前加上 三个保护核苷酸和Xbal限制性内切酶识别序列以及Kozak序列GCCACC，在终止密码子后加 上Bglll限制性内切酶识别序列和三个保护核苷酸。该序列DNA委托生物技术公司合成。 [0019] 以上合成好的DNA经BglII和Xbal酶切，分离片段后克隆入慢病毒表达载体多克 隆位点相应的酶切点间。图1为融合CD47载体质粒图。
[0020] 2、慢病毒的制备
[0021] 将293T细胞培养在6孔细胞培养板中的改良杜氏伊格尔培养基（Dulbecco's ModifiedEagle'sMedium，DMEM)完全培养基（在DMEM完全培养基中添加10%胎牛血清、 100单位/ml青霉素、100yg/ml链霉素、2mML-谷氨酰胺等）中（37°C，5 %C02)，待细胞 90 %汇合时，用含5 %FBS、不含抗生素的DMEM新鲜培养基替换掉老培养基，每孔加1. 5ml 培养基，放入37°C，5 %C0培养箱备用。取两个1.5ml离心管，每管加入预先37°C加热 的0PTI-MEM培养基250y1，然后在其中一管中加入经纯化的2. 5yg上述构建好的慢病毒 CD47融合蛋白表达载体质粒（或作为对照的慢病毒小鼠CD47表达载体质粒）以及VSV-G质 粒和包装质粒，混勾，常温5分钟；同时在另一管中加入Lipofectamine2000脂质体5yl， 混匀，常温5分钟。把两管内容物加在一起混匀，常温放置20分钟，然后加到细胞培养孔中， 轻轻摇晃均匀，然后置于37°C，5 %C02培养，6小时后用新鲜完全DMEM培养基（在DMEM培 养基中添加了 10 %胎牛血清、100单位/ml青霉素、100yg/ml链霉素、2mML-谷氨酰胺等） 置换掉老培养基，再培养约30个小时后收集上清液，500g离心5分钟，取上清，-80度保存 备用。
[0022] 3、人⑶34造血干细胞分离、病毒感染及移植
[0023] 从产妇获取新鲜脐带血，按照⑶34磁珠分离试剂盒（STEMCELL公司）产品使用说 明进行CD34阳性细胞分离。分离后的CD34阳性细胞培养于添加有100纳克/毫升人干细 胞因子（rhSCF)、100纳克/毫升Flt3配体（Flt3-L)、50纳克/毫升促血小板生成素（Tpo) 的完全培养基【含有15%胎牛血清、2毫摩尔/升谷氨酰胺、0. 1毫摩尔/升非必需氨基酸、 1 %青霉素/链霉素（l〇〇x，Gibco)的高糖改良杜氏伊格尔培养基（Dulbecco'sModified Eagle'sMedium，DMEM)】，48小时后用制备好的慢病毒上清液进行病毒感染，感染方法为离 心感染法，即在细胞中加好含有6微克每毫升polybrene的病毒上清液，然后在离心机上 900g离心45分钟，连续两天进行两次离心感染。第二次感染后换上新鲜含有细胞因子的完 全培养基，培养24小时后进行GFP阳性细胞流式细胞仪筛选，筛选出的GFP阳性细胞进行 移植。移植前免疫缺陷的受体小鼠（BALB/cRag2-/-IL2ry-/_小鼠）经不同剂量137Cs 源放射线照射或不照射，从尾静脉注入感染好的CD34阳性骨髓细胞。
[0024] 4、移植后免疫应答
[0025] 移植后6周测定小鼠外周血人源细胞比例，人源细胞表达小鼠⑶47的人源化小鼠 (对照人源化小鼠）和人源细胞表达小鼠-人融合CD47的人源化小鼠（融合CD47人源化 小鼠）中人源细胞比例分别为62. 9±23. 6%和67. 4±20. 2%，两者无显著差别。
[0026] 挑选人源细胞达到80 %以上的人源化小鼠，接种5X105灭活的白色念珠菌来免 疫小鼠。接种后3天，从小鼠取出脾脏细胞，用红细胞裂解液去除红细胞，用1%胎牛血清 的PBS洗两遍，然后用FITC标记的抗⑶4抗体和APC标记的抗人⑶45抗体对脾脏白细胞 冰上孵育30分钟，然后用含1%胎牛血清的PBS洗两遍，然后在固定-透膜剂（Cytofix/ Cytoperm)中固定和透膜15分钟，用透膜冲洗液冲洗两遍，然后用PE标记的抗白介素 4 (anti-IL-4)抗体在冰上标记30分钟，细胞用含1 %胎牛血清的PBS洗两遍，重悬于 400y1的PBS中，上流式细胞仪进行检测。结果见图2，对照人源化小鼠的人源⑶4和白介 素4双阳性细胞表达的白介素4显著小于融合CD47人源化小鼠的人源CD4和白介素4双 阳性细胞，提示后者有更好的体液免疫应答。
[0027] 本发明上述融合CD47DNA序列，如SEQIDNO. 1所示，具体是：
[0028] ATGTGGCCCTTGGCGGCGGCGCTGTTGCTGGGCTCCTGCTGCTGCGGTTCAGCTCAACTACTGTTTAGT AACGTCAACTCCATAGAGTTCACTTCATGCAATGAAACTGTGGTCATCCCTTGCATCGTCCGTAATGTGGAGGCGCA AAGCACCGAAGAAATGTTTGTGAAGTGGAAGTTGAACAAATCGTATATTTTCATCTATGATGGAAATAAAAATAGCA CTACTACAGATCAAAACTTTACCAGTGCAAAAATCTCAGTCTCAGACTTAATCAATGGCATTGCCTCTTTGAAAATG GATAAGCGCGATGCCATGGTGGGAAACTACACTTGCGAAGTGACAGAGTTATCCAGAGAAGGCAAAACAGTTATAGA GCTGAAAAACCGCACGGTTTCGTGGTTTTCTCCAAATGAAAAGATCCTCATTGTTATTTTCCCAATTTTTGCTATAC TCCTGTTCTGGGGACAGTTTGGTATTAAAACACTTAAATATAGATCCGGTGGTATGGATGAGAAAACAATTGCTTTA CTTGTTGCTGGACTAGTGATCACTGTCATTGTCATTGTTGGAGCCATTCTTTTCGTCCCAGGTGAATATTCATTAAA GAATGCTACTGGCCTTGGTTTAATTGTGACTTCTACAGGGATATTAATATTACTTCACTACTATGTGTTTAGTACAG CGATTGGATTAACCTCCTTCGTCATTGCCATATTGGTTATTCAGGTGATAGCCTATATCCTCGCTGTGGTTGGACTG AGTCTCTGTATTGCGGCGTGTATACCAATGCATGGCCCTCTTCTGATTTCAGGTTTGAGTATCTTAGCTCTAGCACA ATTACTTGGACTAGTTTATATGAAATTTGTGGAATAACTGAAGTGAAGTGATGGACTCCGATTTGGAGAGTAG
[0029] 上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合 本发明要求，均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种人源化小鼠，其特征在于其人源细胞上表达小鼠-人融合⑶47基因。2. 如权利要求1所述的一种人源化小鼠，其特征在于其人源细胞上表达的小鼠-人融 合CD47分子，胞外部分为小鼠CD47氨基酸序列，穿膜部分和胞内部分为人CD47氨基酸序 列；或者胞外部分和穿膜部分为小鼠CD47氨基酸序列，胞内部分为人CD47氨基酸序列。3. 如权利要求1所述的一种人源化小鼠，其特征在于其人源细胞上表达的小鼠-人融 合⑶47基因如SEQIDNO. 1所示，为小鼠⑶47的第1至第142氨基酸残基与人⑶47的第 145至305氨基酸残基融合在一起。4. 如权利要求1所述的一种人源化小鼠，其特征在于人源化小鼠，人源细胞上表达的 融合CD47分子，其胞外部分能被小鼠SIRPa、TSP-I及其他小鼠CD47的配体或受体所识 另IJ，胞内部分能很好地把胞外所受到的信号让人源细胞感知并作出应有的反应，达到既能 使小鼠吞噬细胞识别人源细胞为自身细胞而不再吞，又能使人源细胞在小鼠体内环境下 获得正常的胞外信息的目的。
【专利摘要】本发明公开一种人源化小鼠。该人源化小鼠其人源细胞上表达小鼠-人融合CD47基因如SEQ ID NO.1所示，该基因的胞外部分为小鼠CD47序列，而穿膜部分和胞内部分为人CD47序列；或者胞外部分和穿膜部分为小鼠CD47氨基酸序列，胞内部分为人CD47氨基酸序列。本发明转入该小鼠-人融合CD47基因的人源细胞，在不被小鼠吞噬细胞吞噬的同时，能使小鼠体内环境下胞外信息传递到人源细胞并被人源细胞所感知并作出应有反应，使人源化小鼠中的人源细胞正常生长发育并发挥功能。
【IPC分类】A01K67/027
【公开号】CN104904661
【申请号】CN201510310055
【发明人】王彦刈
【申请人】王彦刈
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月5日
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