一种豆酸奶适制性发酵剂及其制备方法和应用
一种豆酸奶适制性发酵剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，特别涉及一种豆酸奶适制性发酵剂及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 我国大豆加工产业历史悠久，大豆制品种类繁多，大豆生产成本较低。大豆中 蛋白质含量为38 %~42 %，大显异黄酮含量占0. 05 %~0. 3%。大显异黄酮（soybean isoflavones，SIF)是大豆中的主要活性成分，其结构与雌激素相似，同样具有雌激素样作 用，因此又叫植物雌激素（phy-toestrogen)。大豆中含有染料木素（Genistein)、黄豆苷元 (Daidzein)和黄豆黄素（Glycitein)等3种苷元，有9种异黄酮苷均为葡萄糖苷，研宄表 明这三种苷元是大豆异黄酮组分主要的生物活性物质，具有抗氧化能力和雌激素样活性， 能够预防心血管疾病、抗肿瘤、抗早老年性痴呆、缓解更年期症状和预防骨质疏松等功能。 大豆异黄酮的在小肠中的生物可利用度为10%~40%，而染料木素的生物可利用度高达 56%。然而，染料木素在大豆异黄酮中所占比例不足10%。
[0003] 开菲尔（kefir)起源于俄罗斯西伯利亚地区，也有人认为起源于我国西藏，是一 种具有轻微的起泡性和含低度酒精的发酵乳饮料，适合大多数人群饮用。传统的开菲尔， 是以牛奶或羊奶为原料，由开菲尔粒或开菲尔粒中必需菌相作发酵剂，制得的一种带有酒 味的发酵乳，又称牛奶酒或酸乳酒，有"发酵乳制品中的香槟"之称。开菲尔粒上主要栖息 着乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等微生物，菌相极为复杂，不同地区和来源的开菲尔粒中所含菌 相有一定差异。由于开菲尔粒中多种有益微生物的代谢作用，使得开菲尔酸奶含有比普通 酸奶更为丰富的微生物及其代谢产物。开菲尔中很少发现有双歧杆菌，而双歧杆菌是著名 的益生菌，可以调节人体肠道中的微生物群，抑制病原微生物的生长；有利于某些矿物质如 钙、铁、镁、锌等吸收，缓解乳糖不耐症；调节免疫系统、防止腹泻、抑制肿瘤等功效。
[0004] 目前，已有利用开菲尔发酵剂发酵豆乳制备豆酸乳的研宄，尚未产业化。研宄表 明，天然的开菲尔粒制备的发酵剂发酵豆乳，对大豆异黄酮转化能力较弱，豆酸奶中大豆异 黄酮的生物可利用度较低。
【发明内容】
[0005] 为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种豆酸 奶适制性发酵剂的制备方法。即通过改造自然开菲尔粒中的菌相，以提高大豆异黄酮的生 物转化率及其生物可利用度，制备适合发酵豆乳生产酸豆奶的开菲尔发酵剂。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的豆酸奶适制性发酵剂。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种豆酸奶适制性发酵剂的制备方法，包 括如下制备步骤：将外源菌群加入还原乳与开菲尔粒混合发酵，经多代驯化后改造开菲尔 发酵剂，改造后的开菲尔发酵剂菌群结构发生变化，用以发酵豆乳生产豆酸奶，可生物转化 大豆异黄酮，提高豆酸奶中染料木素和黄豆苷元的浓度。
[0008] 所述的外源菌群包括婴儿双歧杆菌（Bifidobacteriuminfantis)、植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)、两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)、乳双歧杆菌 (Bifidobacteriumanimalis)、瑞士乳杆菌（Lactobacillushelveticus)、发酵乳杆菌 (Lactobacillusfermentium)、奠肠球菌（enterococcusfaecalis)中的一种或几种的混 合物。
[0009] 上述的豆酸奶适制性发酵剂的制备方法，具体制备步骤如下：
[0010] 第一步，将15g全脂奶粉加入无菌水中，定容至150mL，制成质量体积百分含量为 10% (w/v)还原乳，搅拌均勾后的混合液加热至83°C~85°C，保温10min~20min杀菌；然 后，冷却至室温后，接种开菲尔粒和外源菌群，在25°C下静置发酵24h;
[0011] 第二步，换奶滤出开菲尔粒，按第一步的方法与新鲜制备的外源菌群混合接种到 10 %的还原乳中，在25°C下静置发酵24h;
[0012] 第三步，按第二步的方法，继续改造开菲尔粒中的菌相，如此进行8~15次接种， 完成开非尔粒的改造；
[0013] 第四步，将改造后的开菲尔粒换奶，按第一步的方法制备还原乳，仅接种改造后的 开菲尔粒，不再接种外源菌群，进行换奶和继续培养8~10代，获得改造后稳定期的开菲尔 粒；
[0014] 第五步，发酵剂的制备：将第四步改造后稳定期的开菲尔粒接种于灭菌后的10% 还原乳中，25°C静置发酵20~24h，过滤，所得滤液为豆酸奶适制性发酵剂。
[0015] 第一步和第四步中所述开菲尔粒的接种量为还原乳体积的2~5% ;
[0016] 第一步中所述外源菌群的接种量为106CFU/mL。
[0017] -种豆酸奶适制性发酵剂由上述制备方法获得。
[0018] 上述豆酸奶适制性发酵剂在制备豆酸奶中应用。
[0019] 应用上述豆酸奶适制性发酵剂制备豆酸奶的方法，具体步骤如下：
[0020] (1)将豆浆和还原乳按体积比1 :0~1比例混合，加入8%~10%的蔗糖后，搅拌 均匀；
[0021] (2)将搅拌均匀后的混合液加热至85°C~95°C，保温10min~20min杀菌；
[0022] (3)杀菌混合液冷却至20°C~25°C后，接种3 %~6 %的上述制备获得的豆酸奶适 制性发酵剂，在22°C~25°C下静置发酵22h~24h;
[0023] (4)将成熟的豆酸乳移至4°C冷库后熟12h~24h，获得豆酸奶。
[0024] 步骤⑴中所述的豆浆优选为豆水比为1 :6~8的比例制备获得。
[0025] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0026] 本发明通过添加外源菌群以改造开菲尔中的菌相，并用以发酵生产豆酸奶，可显 著提高大豆异黄酮的生物转化率，转化后染料木素和黄豆苷元的含量显著提高。本发明豆 酸奶适制性发酵剂具有以下优点：
[0027] 1、所生产的豆酸奶具有明显特有的豆乳香味，口感香滑，回味无穷。
[0028] 2、通过发酵可消除豆浆特有的豆腥味，蛋白质消化率明显提高。
[0029] 3、发酵后豆乳后，发酵后的豆酸奶中染料木素和黄豆苷元含量增加，大豆异黄酮 进行生物转化产生生物活性更强和生物利用度更高的染料木素和黄豆苷元等活性组分，增 强了豆酸奶的保健功效。
【附图说明】
[0030] 图1是为外源菌群改造后的开菲尔粒细菌群落结构的DGGE指纹图谱；其中：CK表 示不添加外源菌株进行改造的开菲尔；每个样品采用3个数字进行表征，第一位数字表示 开菲尔株系：l_Turkish株，2-Caucasus株，3-Tibet株；第二位数字表示添加的外源菌株的 情况：1_添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌；2-添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌，两歧 双歧杆菌，婴儿双歧杆菌；第三位数字表示添加外源菌株改造后的不同时间点：1-改造末 期，即刚改造完毕即进行冷冻，2-稳定期，即改造完成后，不再添加外源菌株继续进行10次 传代后冷冻。
[0031] 图2为外源菌群改造后的开菲尔发酵剂发酵豆乳生产豆酸奶的感官评分；其中： 注：横坐标为开菲儿发酵剂：CK为不添加外源菌群的自然开菲尔菌群，CK1-开菲尔Turkish 株，CK2-开菲尔Caucasus株，CK3-开菲尔Tibet株；其余为改造后的稳定期开菲尔，左边 一位数代表开菲尔株系：1-Turkish株，2-Caucasus株，3-Tibet株；右边一位数代表添加的 外源菌群：1-添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌；2-添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌， 两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆菌。
[0032] 图3外源菌群改 造后的开菲尔发酵剂发酵豆乳后染料木素和黄豆苷元生物转化 情况；其中：A、GE-染料木素；B、DE-黄豆苷元；横坐标为开菲儿发酵剂：CK为不添加外源 菌群的自然开菲尔菌群，CK1-开菲尔Turkish株，CK2-开菲尔Caucasus株，CK3-开菲 尔Tibet株；其余为改造后的稳定期开菲尔，左边一位数代表开菲尔株系：1-Turkish株， 2-Caucasus株，3-开菲尔Tibet株；右边一位数代表添加的外源菌群：1-添加乳双歧杆菌、 植物乳杆菌；2-添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌，两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆菌。
[0033] 图4外源菌群改造后的开菲尔发酵剂发酵豆乳后大豆异黄酮各组分生物转化概 况；其中：图中数据为豆酸奶中各组分浓度减去发酵前豆乳中相应组分浓度所得的差；图 例为开菲儿发酵剂：CK2为不添加外源菌群的自然开菲尔菌群（Caucasus株）；其余为改 造后的稳定期开菲尔，左边一位数代表开菲尔来源：1-Turkish株，2-Caucasus株，3-Tibet 株；右边一位数代表添加的外源菌群：1-添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌；2-添加乳双歧杆 菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌，两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆菌；大豆异黄酮各组分及其标识： 黄豆苷（D)，黄豆黄苷（GL)，染料木苷（G)，丙二酰基黄豆苷（MD)，丙二酰基黄豆黄苷（MGL)， 乙酰基黄豆苷（AD)，乙酰基黄豆黄苷（AGL)，丙二酰基染料木苷（MG)，黄豆苷元（DE)，大豆 黄素（GLE)，乙酰基染料木苷（AG)，染料木素（GE)。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0035] 实施例1 :开菲尔粒的改造之一
[0036] (1)开菲尔株系：1号开菲尔（Turkish株）、2号开菲尔（Caucasus株）、3号开菲 尔（Tibet株）。
[0037] (2)外源菌株：包括婴儿双歧杆菌（Bifidobacteriuminfantis)、植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)、两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)、乳双歧杆菌 (Bifidobacteriumanimalis)、瑞士乳杆菌（Lactobacillushelveticus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentium)、奠肠球菌（enterococcusfaecalis)等。
[0038] (3)菌种的活化：全脂奶粉添加无菌水溶解，定容至150mL制成质量体积百分比为 10% (w/v)还原乳，巴氏灭菌（85°C，10min)冷却至室温，接种开菲尔（kefir)粒，接种量 3. 3% (5/150,v/v)，25°C发酵24h，然后滤出开菲尔粒重新接种到新鲜配制的还原乳，反复 活化3天3次。
[0039] (4)开菲尔粒菌相改造：按步骤（3)的方法配制10% (w/v)还原乳，同时接种开菲 尔（kefir)粒、植物乳杆菌和乳双歧杆菌，在25°C下静置发酵24h;换奶滤出开菲尔粒，与新 鲜的植物乳杆菌和乳双歧杆菌混合接种到10%的还原乳中，菌的接种量均为10 6CFU/mL，在 25°C下静置发酵24h;如此循环，第12d滤出开菲尔粒后将滤液真空冷冻干燥，所得菌粉即 为改造末期的发酵剂；将开菲尔粒继续换奶培养，但不再添加外源菌群，继续换奶l〇d10 次后，第22d滤出开菲尔粒后将滤液真空冷冻干燥，所得菌粉即为稳定期的发酵剂。
[0040] 实施例2 :开菲尔粒的改造之二
[0041] 将实施例1所得的外源菌群改造的最后一次换奶后所得的开菲尔粒滤出，与新鲜 培养的瑞士乳杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌混合接种到10%的还原乳中，各菌的接种 量为10 6CFU/mL，在25°C下发酵24h;如此循环，第12d滤出开菲尔粒后将滤液真空冷冻干 燥，所得菌粉即为改造末期的发酵剂；将开菲尔粒继续换奶培养，但不再添加外源菌群，继 续换奶l〇d10次后，第22d滤出开菲尔粒后将滤液真空冷冻干燥，所得菌粉即为稳定期的 发酵剂。
[0042] 实施例3 :开菲尔菌相的DGGE分析
[0043] 1)冻干粉菌群的DNA提取：取0?13g冻干粉，加入500ulTES缓冲液（含50mg/ml 溶菌酶），用漩涡振荡器充分震荡10分钟，悬浮沉淀，37°C保温lh，加入150ul20%SDS(W/ V)37°C保温30min，加入300ul5MNaCl混勾，上2000xg离心15min，取上清液，加入等体 积的酷：氯仿：异戊醇（25:24:1)混勾，12000Xg离心20min，取上清液，反复抽提2次， 取上清，向上清液中加入10%的NaAC(pH5. 4)和等体积异丙醇，混匀，冰箱中放置30min， 12000xg离心15min，弃上清，用70%，的乙醇洗绦沉淀，12000xg离心15min，取沉淀，干燥， 加30111(1(11120溶解0嫩，0.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，-201：冰箱保存备用。
[0044] 2)PCR扩增：细菌PCR扩增对象为细菌16SrDNA的V3可变区：上游引物 gc338F(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3'），下游引物 518R(5'-AITACCGCGGCTGCTGG-3'）。引物均由上海捷瑞 生工合成提供。
[0045] 3)PCR反应体系（50yL) :25yLPCRmix，各0.5yL上下游引物（lOymol.L-1)， 2yLDNA模板，补充ddH20至终体积50yL。
[0046] 4)DNA扩增采用降落PCR，反应程序为94°C预变性4min，先20个循环（94°C变性 30s，退火温度从65°C到55°C，每个循环降低0. 5°C，退火30s，72°C延伸30s)，再于恒定退火 温度下进行10个循环（94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s)，最终72°C延伸10min。
[0047] 5)PCR-DGGE分析
[0048] 参照Muyzeretal描述的方法对16SrRNA基因的扩增产物进行DGGE分 析。DGGE使用8%聚丙烯酰胺凝胶，将100%变性梯度定义为包含40%(v/v)甲酰 胺和 7M尿素，电泳米用DCodeUniversalMutationDetectionSystem(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)，电泳缓冲液为IXTris-acetate_EDTA(TAE，pH8. 0)。首 先在220V电压下预电泳5min，随后在85V的固定电压下电泳llh。电泳结束后，进行硝酸 银染色。具体步骤如下：
[0049] a)用去离子水清新大小两块洗玻璃板，用电吹风将玻璃板吹干后用70%乙醇擦 拭玻璃板，再用吹风机吹干；
[0050] b)将海绵垫放置在制胶架上，然后把支持条夹在两块玻璃板之间，再用夹子夹 好，垂直放在制胶板上的海绵上，用纸板调整好夹条两边的位置使其平行，调整偏心轮固定 好；
[0051]c)封底胶的制作：加入2mL0%变性储存液，13yL10%APS，4yLTEMED，配好后 用注射器将封底胶注入玻璃夹板中，待其凝固，以免漏胶；
[0052] d)将两根细管与Y形管相连，Y形管连接在进胶器上，用MilliQ水洗净甩干；
[0053]e)分别配置好高，低浓度的胶，所用的变性梯度范围为40% -65%，用8%的聚丙 烯酰胺凝胶，加入13yLTEMED，56yL10%APS，将配制好的胶混匀后分别吸入进胶器内， 里侧为高浓度胶，外侧为低浓度胶，安装好相应的配件。
[0054]f)固定好进胶器后缓慢而且连续地将胶注入两块玻璃板之间，切勿产生气泡。进 胶完毕后在胶的上方注射部分去尚子水，将胶压成一条直线。
[0055] g)确定胶凝固后倒出凝胶 上方的水，用吸水纸吸干，配制2mL的封顶胶，配方和封 底胶一样，将封顶胶灌入凝胶上方，立即插入梳子，打开电泳装置，注意要将电泳装置中的 lxTAE加到FILL线以上，缓冲液加热到60°C。
[0056]h)待胶完全凝固后垂直拔掉梳子，用去离子水清洗点样孔，清除碎胶，之后用吸 水纸吸干残留的水，把夹板取出来并卡入电泳架上。向点样孔内注入电泳缓冲液lxTAE。 取5yLPCR产物点样，然后将电泳架放入到电泳槽内，盖上温度控制装置使温度上升到 60°C.电泳在85V电压下运行llh，电泳结束后银染染色。
[0057] 结果参见附图1和附表1，由附图1可见，3种开菲尔在添加外源菌群进行改造后， 开菲尔发酵剂的优势种群发生明显变化，如开菲尔Turkish株外源加入乳双歧杆菌、植物 乳杆菌后，条带8和10亮度明显增强，由表1可知，条带8位Lactobacilluspontis，条带 10为嗜热链球菌；加入乳双歧杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌，两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆 菌等5株菌后，条带11亮度显著增强，由表1可见，条带11为Lactobacilluscrispatus。
[0058] 表1细菌DGGE指纹图谱上条带的序列分析
[0059]
[0060] 实施例4 :豆酸奶适制性发酵剂发酵豆酸奶的感官评价
[0061] 豆酸奶的制备方法如下：
[0062] 首先，将豆浆和还原乳按体积比1 :0~1混合，加入10%的蔗糖后，搅拌均匀；
[0063] 然后将搅拌均勾后的混合液加热至85°C~95°C，保温lOmin~20min杀菌。
[0064] 接着，杀菌混合液冷却至室温后，接种5%的开菲尔发酵液菌种，在25°C下发酵 24h〇
[0065] 最后，将成熟的豆酸乳移至4°C冷库后熟12h~24h;所得产品进行感官评定。
[0066] 感官评价结果表明，开菲尔发酵剂在外源菌群改造后，发酵的豆酸奶风味没有明 显的变化（见图2)。
[0067] 实施例5:大异黄酮组分分析
[0068] (1)豆酸奶制备：按实施例3的方法制备豆酸奶，然后对豆酸奶发酵前后的大豆异 黄酮组分含量进行分析。
[0069] (2)样品处理：精确称取0?5g豆酸奶于15mL离心管中，并与5mL80%甲醇混合。 盖紧离心管，于60°C的水浴锅中摇动2h，4°C12000xg离心lOmin，取lmL上清液用80%甲 醇稀释10和100倍，原上清液和稀释的上清液都过〇. 22ym滤膜，20yL(lmL于液相瓶中） 用于HPLC分析。
[0070] (3)HPLC条件
[0071] 色谱柱：C18 色谱柱（150mmX3. 9mm，4ym)，柱温 40°C;
[0072] 流动相：A_0. 1%冰醋酸水溶液，B-0. 1%冰醋酸甲醇溶液；
[0073]洗脱梯度：0~42min_85%~50%A;50%A稳定 3min;45 ~50min_50%~85% A,85%A稳定lOmin;
[0074]流速：1.OmL/min；
[0075] 检测器：光电二极管阵列检测器（PDA-100)，检测波长260nm;
[0076] 进样量：20yL。
[0077] 分析结果见图3和图4,由图3-4可见，外源菌群改造开菲尔后，染料木素和黄豆苷 元的含量明显增加，开菲尔Tibet株在添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌，两歧双 歧杆菌，婴儿双歧杆菌几种菌株进行改造后，染料木素和黄豆苷元增加最多。
[0078] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种豆酸奶适制性发酵剂的制备方法，其特征在于：包括如下制备步骤：将外源菌 群加入还原乳与开菲尔粒混合发酵，经多代驯化后改造开菲尔发酵剂，改造后的开菲尔发 酵剂菌群结构发生变化，用以发酵豆乳生产豆酸奶，可生物转化大豆异黄酮，提高豆酸奶中 染料木素和黄豆苷元的浓度。2. 根据权利要求1所述的豆酸奶适制性发酵剂的制备方法，其特征在于：所述的外 源菌群包括婴儿双歧杆菌（Bifidobacteriuminfantis)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)、两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)、乳双歧杆菌（Bifidobacterium animalis)、瑞士 乳杆菌（Lactobacillushelveticus)、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentium)、奠肠球菌（enterococcusfaecalis)中的一种或几种的混合物。3. 根据权利要求1所述的豆酸奶适制性发酵剂的制备方法，其特征在于：具体制备步 骤如下： 第一步，将15g全脂奶粉加入无菌水中，定容至150mL，制成质量体积百分含量为10% 还原乳，搅拌均勾后的混合液加热至83°C~85°C，保温IOmin~20min杀菌；然后，冷却至 室温后，接种开菲尔粒和外源菌群，在25°C下静置发酵24h; 第二步，换奶滤出开菲尔粒，按第一步的方法与新鲜制备的外源菌群混合接种到10% 的还原乳中，在25°C下静置发酵24h; 第四步，将改造后的开菲尔粒换奶，按第一步的方法制备还原乳，仅接种改造后的开菲 尔粒，不再接种外源菌群，进行换奶和继续培养8~10代，获得改造后稳定期的开菲尔粒； 第五步，发酵剂的制备：将第四步改造后稳定期的开菲尔粒接种于灭菌后的10%还原 乳中，25°C静置发酵20~24h，过滤，所得滤液为豆酸奶适制性发酵剂。4. 根据权利要求3所述的豆酸奶适制性发酵剂的制备方法，其特征在于：第一步和第 四步中所述开菲尔粒的接种量为还原乳体积的2~5% ; 第一步中所述外源菌群的接种量为l〇6CFU/mL。5. -种豆酸奶适制性发酵剂由权利要求1~4任一项所述的制备方法获得。6. 权利要求5所述的豆酸奶适制性发酵剂在制备豆酸奶中应用。7. 根据权利要求6所述的豆酸奶适制性发酵剂在制备豆酸奶中应用，其特征在于：应 用权利要求6所述的豆酸奶适制性发酵剂制备豆酸奶的方法，具体步骤如下： (1) 将豆浆和还原乳按体积比1 :〇~1混合，也可直接使用纯豆浆，加入8%~10%的 蔗糖后，搅拌均匀； (2) 将搅拌均匀后的混合液加热至85°C~95°C，保温IOmin~20min杀菌； (3) 杀菌混合液冷却至20°C~25°C后，接种3 %~6%的豆酸奶适制性发酵剂，在 22°C~25°C下静置发酵22h~24h; (4) 将成熟的豆酸乳移至4°C冷库后熟12h~24h，获得豆酸奶。8. 根据权利要求7所述的豆酸奶适制性发酵剂在制备豆酸奶中应用，其特征在于：步 骤（1)中所述的豆浆为豆水比为1 :6~8的比例制备获得。
【专利摘要】本发明公开了一种豆酸奶适制性发酵剂及其制备方法和应用，属于生物工程领域。所述的豆酸奶适制性发酵剂的制备方法包括如下制备步骤：将外源菌群加入还原乳与开菲尔粒混合发酵，经多代驯化后改造开菲尔发酵剂，改造后的开菲尔发酵剂菌群结构发生变化，用以发酵豆乳生产豆酸奶，可生物转化大豆异黄酮，提高豆酸奶中染料木素和黄豆苷元的浓度。采用改造后的开菲尔粒制作发酵剂发酵豆乳，开发一种口感爽滑，营养丰富的开菲尔豆酸奶，可提高人体对植物蛋白的吸收利用，增加豆酸奶中的益生菌，而且可以将大豆异黄酮进行生物转化，提高豆酸奶中染料木素和黄豆苷元的浓度，从而提高大豆异黄酮的生物可利用度。
【IPC分类】A23C11/10
【公开号】CN104904859
【申请号】CN201510191711
【发明人】方祥, 陈小曲, 廖振林
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年4月21日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，特别涉及一种豆酸奶适制性发酵剂及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 我国大豆加工产业历史悠久，大豆制品种类繁多，大豆生产成本较低。大豆中 蛋白质含量为38 %~42 %，大显异黄酮含量占0. 05 %~0. 3%。大显异黄酮（soybean isoflavones，SIF)是大豆中的主要活性成分，其结构与雌激素相似，同样具有雌激素样作 用，因此又叫植物雌激素（phy-toestrogen)。大豆中含有染料木素（Genistein)、黄豆苷元 (Daidzein)和黄豆黄素（Glycitein)等3种苷元，有9种异黄酮苷均为葡萄糖苷，研宄表 明这三种苷元是大豆异黄酮组分主要的生物活性物质，具有抗氧化能力和雌激素样活性， 能够预防心血管疾病、抗肿瘤、抗早老年性痴呆、缓解更年期症状和预防骨质疏松等功能。 大豆异黄酮的在小肠中的生物可利用度为10%~40%，而染料木素的生物可利用度高达 56%。然而，染料木素在大豆异黄酮中所占比例不足10%。
[0003] 开菲尔（kefir)起源于俄罗斯西伯利亚地区，也有人认为起源于我国西藏，是一 种具有轻微的起泡性和含低度酒精的发酵乳饮料，适合大多数人群饮用。传统的开菲尔， 是以牛奶或羊奶为原料，由开菲尔粒或开菲尔粒中必需菌相作发酵剂，制得的一种带有酒 味的发酵乳，又称牛奶酒或酸乳酒，有"发酵乳制品中的香槟"之称。开菲尔粒上主要栖息 着乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等微生物，菌相极为复杂，不同地区和来源的开菲尔粒中所含菌 相有一定差异。由于开菲尔粒中多种有益微生物的代谢作用，使得开菲尔酸奶含有比普通 酸奶更为丰富的微生物及其代谢产物。开菲尔中很少发现有双歧杆菌，而双歧杆菌是著名 的益生菌，可以调节人体肠道中的微生物群，抑制病原微生物的生长；有利于某些矿物质如 钙、铁、镁、锌等吸收，缓解乳糖不耐症；调节免疫系统、防止腹泻、抑制肿瘤等功效。
[0004] 目前，已有利用开菲尔发酵剂发酵豆乳制备豆酸乳的研宄，尚未产业化。研宄表 明，天然的开菲尔粒制备的发酵剂发酵豆乳，对大豆异黄酮转化能力较弱，豆酸奶中大豆异 黄酮的生物可利用度较低。
【发明内容】
[0005] 为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种豆酸 奶适制性发酵剂的制备方法。即通过改造自然开菲尔粒中的菌相，以提高大豆异黄酮的生 物转化率及其生物可利用度，制备适合发酵豆乳生产酸豆奶的开菲尔发酵剂。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的豆酸奶适制性发酵剂。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种豆酸奶适制性发酵剂的制备方法，包 括如下制备步骤：将外源菌群加入还原乳与开菲尔粒混合发酵，经多代驯化后改造开菲尔 发酵剂，改造后的开菲尔发酵剂菌群结构发生变化，用以发酵豆乳生产豆酸奶，可生物转化 大豆异黄酮，提高豆酸奶中染料木素和黄豆苷元的浓度。
[0008] 所述的外源菌群包括婴儿双歧杆菌（Bifidobacteriuminfantis)、植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)、两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)、乳双歧杆菌 (Bifidobacteriumanimalis)、瑞士乳杆菌（Lactobacillushelveticus)、发酵乳杆菌 (Lactobacillusfermentium)、奠肠球菌（enterococcusfaecalis)中的一种或几种的混 合物。
[0009] 上述的豆酸奶适制性发酵剂的制备方法，具体制备步骤如下：
[0010] 第一步，将15g全脂奶粉加入无菌水中，定容至150mL，制成质量体积百分含量为 10% (w/v)还原乳，搅拌均勾后的混合液加热至83°C~85°C，保温10min~20min杀菌；然 后，冷却至室温后，接种开菲尔粒和外源菌群，在25°C下静置发酵24h;
[0011] 第二步，换奶滤出开菲尔粒，按第一步的方法与新鲜制备的外源菌群混合接种到 10 %的还原乳中，在25°C下静置发酵24h;
[0012] 第三步，按第二步的方法，继续改造开菲尔粒中的菌相，如此进行8~15次接种， 完成开非尔粒的改造；
[0013] 第四步，将改造后的开菲尔粒换奶，按第一步的方法制备还原乳，仅接种改造后的 开菲尔粒，不再接种外源菌群，进行换奶和继续培养8~10代，获得改造后稳定期的开菲尔 粒；
[0014] 第五步，发酵剂的制备：将第四步改造后稳定期的开菲尔粒接种于灭菌后的10% 还原乳中，25°C静置发酵20~24h，过滤，所得滤液为豆酸奶适制性发酵剂。
[0015] 第一步和第四步中所述开菲尔粒的接种量为还原乳体积的2~5% ;
[0016] 第一步中所述外源菌群的接种量为106CFU/mL。
[0017] -种豆酸奶适制性发酵剂由上述制备方法获得。
[0018] 上述豆酸奶适制性发酵剂在制备豆酸奶中应用。
[0019] 应用上述豆酸奶适制性发酵剂制备豆酸奶的方法，具体步骤如下：
[0020] (1)将豆浆和还原乳按体积比1 :0~1比例混合，加入8%~10%的蔗糖后，搅拌 均匀；
[0021] (2)将搅拌均匀后的混合液加热至85°C~95°C，保温10min~20min杀菌；
[0022] (3)杀菌混合液冷却至20°C~25°C后，接种3 %~6 %的上述制备获得的豆酸奶适 制性发酵剂，在22°C~25°C下静置发酵22h~24h;
[0023] (4)将成熟的豆酸乳移至4°C冷库后熟12h~24h，获得豆酸奶。
[0024] 步骤⑴中所述的豆浆优选为豆水比为1 :6~8的比例制备获得。
[0025] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0026] 本发明通过添加外源菌群以改造开菲尔中的菌相，并用以发酵生产豆酸奶，可显 著提高大豆异黄酮的生物转化率，转化后染料木素和黄豆苷元的含量显著提高。本发明豆 酸奶适制性发酵剂具有以下优点：
[0027] 1、所生产的豆酸奶具有明显特有的豆乳香味，口感香滑，回味无穷。
[0028] 2、通过发酵可消除豆浆特有的豆腥味，蛋白质消化率明显提高。
[0029] 3、发酵后豆乳后，发酵后的豆酸奶中染料木素和黄豆苷元含量增加，大豆异黄酮 进行生物转化产生生物活性更强和生物利用度更高的染料木素和黄豆苷元等活性组分，增 强了豆酸奶的保健功效。
【附图说明】
[0030] 图1是为外源菌群改造后的开菲尔粒细菌群落结构的DGGE指纹图谱；其中：CK表 示不添加外源菌株进行改造的开菲尔；每个样品采用3个数字进行表征，第一位数字表示 开菲尔株系：l_Turkish株，2-Caucasus株，3-Tibet株；第二位数字表示添加的外源菌株的 情况：1_添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌；2-添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌，两歧 双歧杆菌，婴儿双歧杆菌；第三位数字表示添加外源菌株改造后的不同时间点：1-改造末 期，即刚改造完毕即进行冷冻，2-稳定期，即改造完成后，不再添加外源菌株继续进行10次 传代后冷冻。
[0031] 图2为外源菌群改造后的开菲尔发酵剂发酵豆乳生产豆酸奶的感官评分；其中： 注：横坐标为开菲儿发酵剂：CK为不添加外源菌群的自然开菲尔菌群，CK1-开菲尔Turkish 株，CK2-开菲尔Caucasus株，CK3-开菲尔Tibet株；其余为改造后的稳定期开菲尔，左边 一位数代表开菲尔株系：1-Turkish株，2-Caucasus株，3-Tibet株；右边一位数代表添加的 外源菌群：1-添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌；2-添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌， 两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆菌。
[0032] 图3外源菌群改 造后的开菲尔发酵剂发酵豆乳后染料木素和黄豆苷元生物转化 情况；其中：A、GE-染料木素；B、DE-黄豆苷元；横坐标为开菲儿发酵剂：CK为不添加外源 菌群的自然开菲尔菌群，CK1-开菲尔Turkish株，CK2-开菲尔Caucasus株，CK3-开菲 尔Tibet株；其余为改造后的稳定期开菲尔，左边一位数代表开菲尔株系：1-Turkish株， 2-Caucasus株，3-开菲尔Tibet株；右边一位数代表添加的外源菌群：1-添加乳双歧杆菌、 植物乳杆菌；2-添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌，两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆菌。
[0033] 图4外源菌群改造后的开菲尔发酵剂发酵豆乳后大豆异黄酮各组分生物转化概 况；其中：图中数据为豆酸奶中各组分浓度减去发酵前豆乳中相应组分浓度所得的差；图 例为开菲儿发酵剂：CK2为不添加外源菌群的自然开菲尔菌群（Caucasus株）；其余为改 造后的稳定期开菲尔，左边一位数代表开菲尔来源：1-Turkish株，2-Caucasus株，3-Tibet 株；右边一位数代表添加的外源菌群：1-添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌；2-添加乳双歧杆 菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌，两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆菌；大豆异黄酮各组分及其标识： 黄豆苷（D)，黄豆黄苷（GL)，染料木苷（G)，丙二酰基黄豆苷（MD)，丙二酰基黄豆黄苷（MGL)， 乙酰基黄豆苷（AD)，乙酰基黄豆黄苷（AGL)，丙二酰基染料木苷（MG)，黄豆苷元（DE)，大豆 黄素（GLE)，乙酰基染料木苷（AG)，染料木素（GE)。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0035] 实施例1 :开菲尔粒的改造之一
[0036] (1)开菲尔株系：1号开菲尔（Turkish株）、2号开菲尔（Caucasus株）、3号开菲 尔（Tibet株）。
[0037] (2)外源菌株：包括婴儿双歧杆菌（Bifidobacteriuminfantis)、植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)、两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)、乳双歧杆菌 (Bifidobacteriumanimalis)、瑞士乳杆菌（Lactobacillushelveticus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentium)、奠肠球菌（enterococcusfaecalis)等。
[0038] (3)菌种的活化：全脂奶粉添加无菌水溶解，定容至150mL制成质量体积百分比为 10% (w/v)还原乳，巴氏灭菌（85°C，10min)冷却至室温，接种开菲尔（kefir)粒，接种量 3. 3% (5/150,v/v)，25°C发酵24h，然后滤出开菲尔粒重新接种到新鲜配制的还原乳，反复 活化3天3次。
[0039] (4)开菲尔粒菌相改造：按步骤（3)的方法配制10% (w/v)还原乳，同时接种开菲 尔（kefir)粒、植物乳杆菌和乳双歧杆菌，在25°C下静置发酵24h;换奶滤出开菲尔粒，与新 鲜的植物乳杆菌和乳双歧杆菌混合接种到10%的还原乳中，菌的接种量均为10 6CFU/mL，在 25°C下静置发酵24h;如此循环，第12d滤出开菲尔粒后将滤液真空冷冻干燥，所得菌粉即 为改造末期的发酵剂；将开菲尔粒继续换奶培养，但不再添加外源菌群，继续换奶l〇d10 次后，第22d滤出开菲尔粒后将滤液真空冷冻干燥，所得菌粉即为稳定期的发酵剂。
[0040] 实施例2 :开菲尔粒的改造之二
[0041] 将实施例1所得的外源菌群改造的最后一次换奶后所得的开菲尔粒滤出，与新鲜 培养的瑞士乳杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌混合接种到10%的还原乳中，各菌的接种 量为10 6CFU/mL，在25°C下发酵24h;如此循环，第12d滤出开菲尔粒后将滤液真空冷冻干 燥，所得菌粉即为改造末期的发酵剂；将开菲尔粒继续换奶培养，但不再添加外源菌群，继 续换奶l〇d10次后，第22d滤出开菲尔粒后将滤液真空冷冻干燥，所得菌粉即为稳定期的 发酵剂。
[0042] 实施例3 :开菲尔菌相的DGGE分析
[0043] 1)冻干粉菌群的DNA提取：取0?13g冻干粉，加入500ulTES缓冲液（含50mg/ml 溶菌酶），用漩涡振荡器充分震荡10分钟，悬浮沉淀，37°C保温lh，加入150ul20%SDS(W/ V)37°C保温30min，加入300ul5MNaCl混勾，上2000xg离心15min，取上清液，加入等体 积的酷：氯仿：异戊醇（25:24:1)混勾，12000Xg离心20min，取上清液，反复抽提2次， 取上清，向上清液中加入10%的NaAC(pH5. 4)和等体积异丙醇，混匀，冰箱中放置30min， 12000xg离心15min，弃上清，用70%，的乙醇洗绦沉淀，12000xg离心15min，取沉淀，干燥， 加30111(1(11120溶解0嫩，0.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，-201：冰箱保存备用。
[0044] 2)PCR扩增：细菌PCR扩增对象为细菌16SrDNA的V3可变区：上游引物 gc338F(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3'），下游引物 518R(5'-AITACCGCGGCTGCTGG-3'）。引物均由上海捷瑞 生工合成提供。
[0045] 3)PCR反应体系（50yL) :25yLPCRmix，各0.5yL上下游引物（lOymol.L-1)， 2yLDNA模板，补充ddH20至终体积50yL。
[0046] 4)DNA扩增采用降落PCR，反应程序为94°C预变性4min，先20个循环（94°C变性 30s，退火温度从65°C到55°C，每个循环降低0. 5°C，退火30s，72°C延伸30s)，再于恒定退火 温度下进行10个循环（94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s)，最终72°C延伸10min。
[0047] 5)PCR-DGGE分析
[0048] 参照Muyzeretal描述的方法对16SrRNA基因的扩增产物进行DGGE分 析。DGGE使用8%聚丙烯酰胺凝胶，将100%变性梯度定义为包含40%(v/v)甲酰 胺和 7M尿素，电泳米用DCodeUniversalMutationDetectionSystem(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)，电泳缓冲液为IXTris-acetate_EDTA(TAE，pH8. 0)。首 先在220V电压下预电泳5min，随后在85V的固定电压下电泳llh。电泳结束后，进行硝酸 银染色。具体步骤如下：
[0049] a)用去离子水清新大小两块洗玻璃板，用电吹风将玻璃板吹干后用70%乙醇擦 拭玻璃板，再用吹风机吹干；
[0050] b)将海绵垫放置在制胶架上，然后把支持条夹在两块玻璃板之间，再用夹子夹 好，垂直放在制胶板上的海绵上，用纸板调整好夹条两边的位置使其平行，调整偏心轮固定 好；
[0051]c)封底胶的制作：加入2mL0%变性储存液，13yL10%APS，4yLTEMED，配好后 用注射器将封底胶注入玻璃夹板中，待其凝固，以免漏胶；
[0052] d)将两根细管与Y形管相连，Y形管连接在进胶器上，用MilliQ水洗净甩干；
[0053]e)分别配置好高，低浓度的胶，所用的变性梯度范围为40% -65%，用8%的聚丙 烯酰胺凝胶，加入13yLTEMED，56yL10%APS，将配制好的胶混匀后分别吸入进胶器内， 里侧为高浓度胶，外侧为低浓度胶，安装好相应的配件。
[0054]f)固定好进胶器后缓慢而且连续地将胶注入两块玻璃板之间，切勿产生气泡。进 胶完毕后在胶的上方注射部分去尚子水，将胶压成一条直线。
[0055] g)确定胶凝固后倒出凝胶 上方的水，用吸水纸吸干，配制2mL的封顶胶，配方和封 底胶一样，将封顶胶灌入凝胶上方，立即插入梳子，打开电泳装置，注意要将电泳装置中的 lxTAE加到FILL线以上，缓冲液加热到60°C。
[0056]h)待胶完全凝固后垂直拔掉梳子，用去离子水清洗点样孔，清除碎胶，之后用吸 水纸吸干残留的水，把夹板取出来并卡入电泳架上。向点样孔内注入电泳缓冲液lxTAE。 取5yLPCR产物点样，然后将电泳架放入到电泳槽内，盖上温度控制装置使温度上升到 60°C.电泳在85V电压下运行llh，电泳结束后银染染色。
[0057] 结果参见附图1和附表1，由附图1可见，3种开菲尔在添加外源菌群进行改造后， 开菲尔发酵剂的优势种群发生明显变化，如开菲尔Turkish株外源加入乳双歧杆菌、植物 乳杆菌后，条带8和10亮度明显增强，由表1可知，条带8位Lactobacilluspontis，条带 10为嗜热链球菌；加入乳双歧杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌，两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆 菌等5株菌后，条带11亮度显著增强，由表1可见，条带11为Lactobacilluscrispatus。
[0058] 表1细菌DGGE指纹图谱上条带的序列分析
[0059]
[0060] 实施例4 :豆酸奶适制性发酵剂发酵豆酸奶的感官评价
[0061] 豆酸奶的制备方法如下：
[0062] 首先，将豆浆和还原乳按体积比1 :0~1混合，加入10%的蔗糖后，搅拌均匀；
[0063] 然后将搅拌均勾后的混合液加热至85°C~95°C，保温lOmin~20min杀菌。
[0064] 接着，杀菌混合液冷却至室温后，接种5%的开菲尔发酵液菌种，在25°C下发酵 24h〇
[0065] 最后，将成熟的豆酸乳移至4°C冷库后熟12h~24h;所得产品进行感官评定。
[0066] 感官评价结果表明，开菲尔发酵剂在外源菌群改造后，发酵的豆酸奶风味没有明 显的变化（见图2)。
[0067] 实施例5:大异黄酮组分分析
[0068] (1)豆酸奶制备：按实施例3的方法制备豆酸奶，然后对豆酸奶发酵前后的大豆异 黄酮组分含量进行分析。
[0069] (2)样品处理：精确称取0?5g豆酸奶于15mL离心管中，并与5mL80%甲醇混合。 盖紧离心管，于60°C的水浴锅中摇动2h，4°C12000xg离心lOmin，取lmL上清液用80%甲 醇稀释10和100倍，原上清液和稀释的上清液都过〇. 22ym滤膜，20yL(lmL于液相瓶中） 用于HPLC分析。
[0070] (3)HPLC条件
[0071] 色谱柱：C18 色谱柱（150mmX3. 9mm，4ym)，柱温 40°C;
[0072] 流动相：A_0. 1%冰醋酸水溶液，B-0. 1%冰醋酸甲醇溶液；
[0073]洗脱梯度：0~42min_85%~50%A;50%A稳定 3min;45 ~50min_50%~85% A,85%A稳定lOmin;
[0074]流速：1.OmL/min；
[0075] 检测器：光电二极管阵列检测器（PDA-100)，检测波长260nm;
[0076] 进样量：20yL。
[0077] 分析结果见图3和图4,由图3-4可见，外源菌群改造开菲尔后，染料木素和黄豆苷 元的含量明显增加，开菲尔Tibet株在添加乳双歧杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌，两歧双 歧杆菌，婴儿双歧杆菌几种菌株进行改造后，染料木素和黄豆苷元增加最多。
[0078] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种豆酸奶适制性发酵剂的制备方法，其特征在于：包括如下制备步骤：将外源菌 群加入还原乳与开菲尔粒混合发酵，经多代驯化后改造开菲尔发酵剂，改造后的开菲尔发 酵剂菌群结构发生变化，用以发酵豆乳生产豆酸奶，可生物转化大豆异黄酮，提高豆酸奶中 染料木素和黄豆苷元的浓度。2. 根据权利要求1所述的豆酸奶适制性发酵剂的制备方法，其特征在于：所述的外 源菌群包括婴儿双歧杆菌（Bifidobacteriuminfantis)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)、两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)、乳双歧杆菌（Bifidobacterium animalis)、瑞士 乳杆菌（Lactobacillushelveticus)、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentium)、奠肠球菌（enterococcusfaecalis)中的一种或几种的混合物。3. 根据权利要求1所述的豆酸奶适制性发酵剂的制备方法，其特征在于：具体制备步 骤如下： 第一步，将15g全脂奶粉加入无菌水中，定容至150mL，制成质量体积百分含量为10% 还原乳，搅拌均勾后的混合液加热至83°C~85°C，保温IOmin~20min杀菌；然后，冷却至 室温后，接种开菲尔粒和外源菌群，在25°C下静置发酵24h; 第二步，换奶滤出开菲尔粒，按第一步的方法与新鲜制备的外源菌群混合接种到10% 的还原乳中，在25°C下静置发酵24h; 第四步，将改造后的开菲尔粒换奶，按第一步的方法制备还原乳，仅接种改造后的开菲 尔粒，不再接种外源菌群，进行换奶和继续培养8~10代，获得改造后稳定期的开菲尔粒； 第五步，发酵剂的制备：将第四步改造后稳定期的开菲尔粒接种于灭菌后的10%还原 乳中，25°C静置发酵20~24h，过滤，所得滤液为豆酸奶适制性发酵剂。4. 根据权利要求3所述的豆酸奶适制性发酵剂的制备方法，其特征在于：第一步和第 四步中所述开菲尔粒的接种量为还原乳体积的2~5% ; 第一步中所述外源菌群的接种量为l〇6CFU/mL。5. -种豆酸奶适制性发酵剂由权利要求1~4任一项所述的制备方法获得。6. 权利要求5所述的豆酸奶适制性发酵剂在制备豆酸奶中应用。7. 根据权利要求6所述的豆酸奶适制性发酵剂在制备豆酸奶中应用，其特征在于：应 用权利要求6所述的豆酸奶适制性发酵剂制备豆酸奶的方法，具体步骤如下： (1) 将豆浆和还原乳按体积比1 :〇~1混合，也可直接使用纯豆浆，加入8%~10%的 蔗糖后，搅拌均匀； (2) 将搅拌均匀后的混合液加热至85°C~95°C，保温IOmin~20min杀菌； (3) 杀菌混合液冷却至20°C~25°C后，接种3 %~6%的豆酸奶适制性发酵剂，在 22°C~25°C下静置发酵22h~24h; (4) 将成熟的豆酸乳移至4°C冷库后熟12h~24h，获得豆酸奶。8. 根据权利要求7所述的豆酸奶适制性发酵剂在制备豆酸奶中应用，其特征在于：步 骤（1)中所述的豆浆为豆水比为1 :6~8的比例制备获得。
【专利摘要】本发明公开了一种豆酸奶适制性发酵剂及其制备方法和应用，属于生物工程领域。所述的豆酸奶适制性发酵剂的制备方法包括如下制备步骤：将外源菌群加入还原乳与开菲尔粒混合发酵，经多代驯化后改造开菲尔发酵剂，改造后的开菲尔发酵剂菌群结构发生变化，用以发酵豆乳生产豆酸奶，可生物转化大豆异黄酮，提高豆酸奶中染料木素和黄豆苷元的浓度。采用改造后的开菲尔粒制作发酵剂发酵豆乳，开发一种口感爽滑，营养丰富的开菲尔豆酸奶，可提高人体对植物蛋白的吸收利用，增加豆酸奶中的益生菌，而且可以将大豆异黄酮进行生物转化，提高豆酸奶中染料木素和黄豆苷元的浓度，从而提高大豆异黄酮的生物可利用度。
【IPC分类】A23C11/10
【公开号】CN104904859
【申请号】CN201510191711
【发明人】方祥, 陈小曲, 廖振林
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年4月21日
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