三大类菌混合液体发酵、固体发酵物饲料添加剂及其制备方法
三大类菌混合液体发酵、固体发酵物饲料添加剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及到的是两种饲料添加剂，特别涉及三大类菌液体发酵、固体发酵饲料 添加剂及其制备方法，属微生物发酵领域。
【背景技术】
[0002] 混菌发酵是指两种或两种以上的微生物协同作用，共同完成某一目的新型发酵技 术。混菌发酵具有很强的独特性，能够以一类菌体的代谢产物成为另一类菌的营养物质，并 且能够获取某些单一发酵无法得到的产物，发酵代谢产物具有累加效应，发酵代谢产物利 用率高等优点。
[0003] 近年来微生物制剂产品应用越来越广泛，在制药方面更，生物制药工程已经成为 制药行业发展的重点；环境工程方面，污水处理，空气净化方面也得到了很大的应用；农业 方面，微生物先天所具有的改良土壤、解磷、解钾、促进植物吸收、防治病害方面也起到的巨 大的作用；饲料方面，在肠道内的种群优势作用、夺氧杀菌作用、提早建立免疫体统作用，促 进饲料利用率方面都起到了至关重要的作用。
[0004] 目前市场上流通的大多是以单菌干粉的形式存在，优势在于便宜保存，菌数多等 优点，同时存在代谢产物少，菌数高在饲料中添加混合是否均匀，在动物体内多久可以复 苏，如养殖户添加药物，菌剂基本上起不到作用等不利因素。
【发明内容】
[0005] 鉴于益生菌菌剂现有特性，本发明提供了采用三大类菌种酵母菌、乳酸菌和芽孢 杆菌的混合液体发酵和固体发酵形式得到液体饲料添加剂和固体饲料添加剂，该添加剂天 然、安全、绿色、营养价值高、能够预防疾病、提高机体免疫能力。
[0006] 本发明提供了利用这三大类菌混合液体发酵饲料添加剂的方法，具有菌数高、无 污染、通过饮水利用快的优点；还提供了这三大类菌混合固体发酵饲料添加剂的方法，产物 具有活力高、有丰富的代谢产物、发酵具有特殊酸香味，更容易吸引采食对象等优点。
[0007] 本发明使用的菌种是乳酸菌类5种菌：CGMCC1. 0557植物乳杆菌、CGMCC1. 1854嗜 酸乳杆菌、CGMCC1. 1480保加利亚乳杆菌、CICC6026植物乳杆菌、ACCC10637嗜酸乳杆菌；酵 母菌类3种菌：CGMCC2. 0120产朊假丝酵母、ACCC20060产朊假丝酵母、安琪酵母；芽孢杆菌 类6种菌： CGMCC1. 2009凝结芽孢杆菌、CGMCC1. 0813地衣芽孢杆菌、CGMCC1. 1806枯草芽孢杆菌、CGMCC1. 0504枯草芽孢杆菌、ACCC10619枯草芽孢杆菌、CICC10262纳豆芽孢杆菌。
[0008] 本发明是通过下述技术方案实现的： 液体发酵饲料添加剂的添加量在畜禽饮水中添加〇. 5%-3% ;固体发酵饲料添加剂在畜 禽饲料的0. 5%-5% ; 本发明提供的三大类菌混合液体发酵物饲料添加剂的制备方法包括以下步骤： a. 母种培育：将上述乳酸菌5种菌分别取0. 5ml菌液接种到已灭菌装有液体培养基的 试管中，在37°C条件下厌氧培养48小时，母种备用； 所述液体培养基为MRS乳酸菌培养基和鲜奶培养基； 将上述酵母菌3种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在28°C条件下培 养24小时，母种备用； 所述斜面培养基为PDA培养基； 将上述芽孢菌类6种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在37°C条件下 培养12小时，母种备用； 所述斜面培养基为LB培养基； b. 二级种子培养：将上述a所述的母种乳酸菌5种菌按照1%的接种量注入500ml液 体培养基中，在37°C条件下厌氧静置培养48小时，得液态菌液； 将上述a所述的母种酵母菌3种菌分别用蒸馏水洗脱后均匀涂布到装有固体培养基的 茄子瓶中，在28°C条件下静置培养24小时，得固态菌种，使用时用蒸馏水洗脱； 将上述a所述的母种芽孢菌6种菌分别用接种环接种到装有液体培养基的三角瓶中， 在37°C条件下气浴摇床中震荡培养12小时，得液体菌液； c. 将上述b所得的菌种全部接种到装有750L培养基的1000L发酵罐中37°C培养先厌 氧培养48小时，后耗氧培养24小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为 0. 02L-0. 5L，接种量为1%-5%。c所述的培养基为：葡萄糖5%，乳清粉0. 5%，硫酸铵0. 4%，酵 母膏0. 4%，氯化钠1%，磷酸氢二钾0. 1%，硫酸镁0. 02%，鲜奶3%，消泡剂0. 02%，其余为水；初 始ph为7。
[0009] 本发明提供的三大类菌混合固体发酵物饲料添加剂的制备方法包括以下步骤： a. 母种培育：同上述液体发酵物饲料添加的制备方法； b. 二级种子培养：同上述液体发酵物饲料添加的制备方法： c. 将上述b所得的菌液，乳酸菌接种到750L培养基的1000L乳酸菌发酵罐中，37°C培 养厌氧培养48小时；酵母菌接种到750L培养基的1000L酵母菌发酵罐中，28°C培养耗氧培 养24小时；芽孢菌接种到750L培养基的1000L芽孢菌发酵罐中，37°C培养耗氧、搅拌培养 16小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为 0? 02L-0. 5L，接种量为 1%-5% ; d. 将上述c培养好的菌液按照1:1:1的转移到已空消灭菌后的3000L发酵罐中，混合 均匀备用； e. 将上述d培养好的菌液按照5%-20%的比例接种到灭菌冷却后的固体培养基中，搅匀 后用呼吸袋按照50kg/袋包装，密封后堆放到无菌室内发酵，发酵时间不小于7天，温度控 制不低于28°C，不高于37°C; c要求的液体培养基，乳酸菌液体培养基的配方为：葡萄糖10%，酵母膏0. 5%，酪蛋白胨 0. 5%，柠檬酸氢二铵0. 2%，磷酸氢二钾0. 2%，乙酸钠0. 5%，硫酸锰微量，吐温-80 0. 1%，硫酸 镁0. 02%，乳清粉0. 2%，硫酸铵0. 2%，鲜奶4%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph6 ; 酵母菌培养基的配方为：葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏0. 5%，玉米面5%，糖化酶 0. 05%，尿素0. 1%，硫酸铵0. 1%，乳清粉2%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph自然； 芽孢杆菌培养基配方为：氯化钠1%，葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏〇. 5%，硫酸铵 0. 5%，磷酸氢二钾0. 2%，乳清粉2%，其余为水，初始ph为7 ; e.要求的固体培养基配方为：纤维饲料4%，玉米5%，沸石粉10%，米糠30%，硫酸铵2%， 尿素1%，乳清粉5%，葡萄糖5%，糖蜜15%，菌液5%-20%，其余为水。
[0010] 本发明通过合理的设计发酵时间、过程控制、接种量、固体发酵形式，使益生菌的 这三大类菌体都能保持稳定的活性和含有丰富的大量代谢产物。
[0011] 本发明的优点及有益效果为： 1、 本发明制备的混合液体发酵物饲料添加和固体发酵物饲料添加剂天然、安全、绿色、 无污染，能预防疾病，提高机体的免疫能力； 2、 本发明可根据用户自己的意愿选择混合液体发酵物饲料添加或者固体发酵物饲料 添加剂，方便用户； 3、 本发明为液体或30%-40%的湿固体发酵产品，在机体内活化时间短，见效快； 4、 本发明除了具有大量的有益菌外，还含有其生长过程中大量的优势代谢产物，如多 糖、肽、氨基酸和维生素等物质，更有益于机体营养的补充； 5、 固体发酵物饲料添加剂具有特殊酸香味，更容易吸引采食对象，促进采食量。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 以三大类菌混合液体发酵物饲料添加剂，具体步骤如下： a. 母种培育：将上述乳酸菌5种菌分别取0. 5ml菌液接种到已灭菌装有液体培养基的 试管中，在37°C条件下厌氧培养48小时，母种备用； 所述液体培养基为MRS乳酸菌培养基和鲜奶培养基； 将上述酵母菌3种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在28°C条件下培 养24小时，母种备用； 所述斜面培养基为PDA培养基； 将上述芽孢菌类6种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在37°C条件下 培养12小时，母种备用； 所述斜面培养基为LB培养基； b. 二级种子培养：将上述a所述的母种乳酸菌5种菌按照1%的接种量注入500ml液 体培养基中，在37°C条件下厌氧静置培养48小时，得液态菌液； 将上述a所述的母种酵母菌3种菌分别用蒸馏水洗脱后均匀涂布到装有固体培养基的 茄子瓶中，在28°C条件下静置培养24小时，得固态菌种，使用时用蒸馏水洗脱； 将上述a所述的母种芽孢菌6种菌分别用接种环接种到装有液体培养基的三角瓶中， 在37°C条件下气浴摇床中震荡培养12小时，得液体菌液； c. 将上述b所得的菌种接种到装有750L培养基的1000L发酵罐中37°C培养先厌氧培 养48小时，后耗氧培养24小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为0. 2L， 接种量为5%。
[0013] 实施例2以三大类菌混合液体发酵物饲料添加剂，具体步骤如下： 母种培育，二级种子培养同实施实例1a、b c. 上述b所得的菌液，乳酸菌接种到750L培养基的1000L乳酸菌发酵罐中，37°C培养 厌氧培养48小时；酵母菌接种到750L培养基的1000L酵母菌发酵罐中，28°C培养耗氧培养 24小时；芽孢菌接种到750L培养基的1000L芽孢菌发酵罐中，37°C培养耗氧、搅拌培养16 小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为〇. 2L， 接种量为3% ; d . 将上述c培养好的菌液按照1:1:1的转移到已空消灭菌后的3000L发酵罐中，混合 均匀备用； e. 将上述d培养好的菌液按照5%-20%的比例接种到灭菌冷却后的固体培养基中，搅匀 后用呼吸袋按照50kg/袋包装，密封后堆放到无菌室内发酵，发酵时间不小于7天，温度控 制不低于28°C，不高于37°C; c要求的液体培养基，乳酸菌液体培养基的配方为：葡萄糖10%，酵母膏0. 5%，酪蛋白胨 0. 5%，柠檬酸氢二铵0. 2%，磷酸氢二钾0. 2%，乙酸钠0. 5%，硫酸锰微量，吐温-80 0. 1%，硫酸 镁0. 02%，乳清粉0. 2%，硫酸铵0. 2%，鲜奶4%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph6 ; 酵母菌培养基的配方为：葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏0. 5%，玉米面5%，糖化酶 0. 05%，尿素0. 1%，硫酸铵0. 1%，乳清粉2%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph自然； 芽孢杆菌培养基配方为：氯化钠1%，葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏〇. 5%，硫酸铵 0. 5%，磷酸氢二钾0. 2%，乳清粉2%，其余为水，初始ph为7 ; e要求的固体培养基配方为：纤维饲料4%，玉米5%，沸石粉10%，米糠30%，硫酸铵2%，尿 素1%，乳清粉5%，匍萄糖5%，糖蜜15%，菌液5%_20%，其余为水。
[0014] 实施例3 (芽孢杆菌菌液体发酵物饲料添加剂） 纯种培养以上述6种芽孢杆菌液体发酵物饲料添加剂，方法与实施例1相同。
[0015] 实施例4 以实施例1方法得到的菌液按照实施例2的发酵方法得到固体发酵物饲料添加剂。
[0016] 效果实例1发酵物添加剂对肉鸡影响生长 1. 实验动物：选择1日龄肉鸡5000只，公母不限，随机分成5组，每组1000只，做好标 记，分栏饲养； 2. 饲养饲料：5组分别标号Y1饮用实施例1的液体发酵物添加剂、Y2饮用实施实例3 液体发酵物添加剂，以上两组分别在每日饮水量种添加〇. 5%，正常喂食饲料；G1、G2分别使 用例2、4得到的固体发酵物添加剂，添加量为2%;P正常饲料喂养； 3. 喂养管理方式相同； 4. 30天后对肉鸡生长效果的影响，见表1
从表1种可以看出，添加了液体发酵物饲料添加剂和固体发酵物添加剂的肉料比明显 小于正常饲料喂养的肉鸡，但日增重大，死亡率低，经济效果好，尤为Yl，Gl，G2效果明显好 于其他两组，同时也说明了，三大菌类混合发酵的饲料添加剂的效果强于单类菌发酵的饲 料添加剂的效果。对比每栏时，能够明显感觉到普通喂食饲料的鸡舍臭气味道最大，说明益 生菌(这三大类菌）对改善饲养环境也能起到作用。死亡率低说明肉鸡免疫系统增强，从而 降低养殖成本，提高经济效益。
[0017] 效果实例2发酵物添加剂对蛋鸡的影响 1. 实验动物选择125日龄的蛋鸡5000只，按照效果实例1的编组方式编组 2. 饲养饲料同效果实例1的喂养方式，全程饲喂； 3. 管理方式相同 4. 结果分析 喂食混菌发酵的液体饲料添加和固体饲料添加剂的蛋壳色泽好，但中增加12. 1%，产蛋 期延长7-10天。
【主权项】
1. 三大类菌混合液体发酵、固体发酵物饲料添加剂，其特征在于所述的混菌发酵物是 由乳酸菌类5种菌：CGMCC1. 0557植物乳杆菌、CGMCC1. 1854嗜酸乳杆菌、CGMCC1. 1480保加 利亚乳杆菌、CICC6026植物乳杆菌、ACCC10637嗜酸乳杆菌；酵母菌类3种菌：CGMCC2. 0120 产朊假丝酵母、ACCC20060产朊假丝酵母、安琪酵母；芽孢杆菌类6种菌： CGMCC1. 2009凝结芽孢杆菌、CGMCC1. 0813地衣芽孢杆菌、CGMCC1. 1806枯草芽孢杆菌、CGMCC1. 0504枯草芽孢杆菌、ACCC10619枯草芽孢杆菌、CICC10262纳豆芽孢杆菌发酵而成 的液体制剂和固体制剂。2. 根据权利要求1所述的混菌发酵物，其特征在于：固体发酵饲料添加剂含水量 30%-40%〇3. 根据权利要求1所述的混菌发酵物，其特征在于：液体发酵饲料添加剂的添加量在 畜禽饮水中添加〇. 5%-3% ;固体发酵饲料添加剂在畜禽饲料的0. 5%-5%。4. 权利要求1所述的混合发酵物饲料添加剂中液体发酵饲料添加剂的制备方法，其特 征在于：乳酸菌类5种菌、酵母菌类3种菌、芽孢杆菌类6种菌在同一发酵罐中进行厌氧和 耗氧培养； 包括以下步骤： a. 母种培育：将上述乳酸菌5种菌分别取0. 5ml菌液接种到已灭菌装有液体培养基的 试管中，在37°C条件下厌氧培养48小时，母种备用； 所述液体培养基为MRS乳酸菌培养基和鲜奶培养基； 将上述酵母菌3种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在28°C条件下培 养24小时，母种备用； 所述斜面培养基为PDA培养基； 将上述芽孢菌类6种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在37°C条件下 培养12小时，母种备用； 所述斜面培养基为LB培养基； b. 二级种子培养：将上述a所述的母种乳酸菌5种菌按照1%的接种量注入500ml液 体培养基中，在37°C条件下厌氧静置培养48小时，得液态菌液； 将上述a所述的母种酵母菌3种菌分别用蒸馏水洗脱后均匀涂布到装有固体培养基的 茄子瓶中，在28°C条件下静置培养24小时，得固态菌种，使用时用蒸馏水洗脱； 将上述a所述的母种芽孢菌6种菌分别用接种环接种到装有液体培养基的三角瓶中， 在37°C条件下气浴摇床中震荡培养12小时，得液体菌液； c. 将上述b所得的菌种全部接种到装有750L培养基的1000L发酵罐中37 °C培养先厌 氧培养48小时，后耗氧培养24小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为 0? 02L-0. 5L，接种量为 1%-5%。5. 根据权利要求4所述的制备方法中c所述的培养基，其特征在于：所述的培养基配 方为：葡萄糖5%，乳清粉0. 5%，硫酸铵0. 4%，酵母膏0. 4%，氯化钠1%，磷酸氢二钾0. 1%，硫酸 镁0. 02%，鲜奶3%，消泡剂0. 02%，其余为水；初始ph为7。6. 权利要求1所述的混合发酵物饲料添加剂中固体发酵饲料添加剂的制备方法，其 特征在于：乳酸菌类5种菌、酵母菌类3种菌、芽孢杆菌类6种菌在同一发酵罐中进行厌氧 和耗氧培养； 包括以下步骤： a. 母种培育：同权利要求4 ; b. 二级种子培养：同权利要求4 : c. 将上述b所得的菌液，乳酸菌接种到750L培养基的1000 L乳酸菌发酵罐中，37°C培 养厌氧培养48小时；酵母菌接种到750L培养基的1000L酵母菌发酵罐中，28°C培养耗氧培 养24小时；芽孢菌接种到750L培养基的1000L芽孢菌发酵罐中，37°C培养耗氧、搅拌培养 16小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为 0? 02L-0. 5L，接种量为 1%-5% ; d. 将上述c培养好的菌液按照1:1:1的转移到已空消灭菌后的3000L发酵罐中，混合 均匀备用； e. 将上述d培养好的菌液按照5%-20%的比例接种到灭菌冷却后的固体培养基中，搅匀 后用呼吸袋按照50kg/袋包装，密封后堆放到无菌室内发酵，发酵时间不小于7天，温度控 制不低于28°C，不高于37°C。7. 根据权利要求6所述的制备方法中c要求的液体培养基，其特征在于所述乳酸菌 液体培养基的配方为：葡萄糖10%，酵母膏〇. 5%，酪蛋白胨0. 5%，柠檬酸氢二铵0. 2%，磷酸 氢二钾0. 2%，乙酸钠0. 5%，硫酸锰微量，吐温-80 0. 1%，硫酸镁0. 02%，乳清粉0. 2%，硫酸铵 0. 2%，鲜奶4%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph6 ; 酵母菌培养基的配方为：葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏0. 5%，玉米面5%，糖化酶 0. 05%，尿素0. 1%，硫酸铵0. 1%，乳清粉2%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph自然； 芽孢杆菌培养基配方为：氯化钠1%，葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏〇. 5%，硫酸铵 0. 5%，磷酸氢二钾0. 2%，乳清粉2%，其余为水，初始ph为7。8. 根据权利要求6所述的制备方法中e要求的固体培养基，其特征在于所述固体培养 基的配方为：纤维饲料4%，玉米5%，沸石粉10%，米糠30%，硫酸铵2%，尿素1%，乳清粉5%，葡 萄糖5%，糖蜜15%，菌液5%-20%，其余为水。
【专利摘要】本发明涉及的是三大类菌混合液体发酵、固体发酵物饲料添加剂及其制备方法，属于微生物发酵领域，该混菌发酵物是由乳酸菌（5种菌种）、酵母菌（3种菌种）、芽孢杆菌（6种菌种）混菌发酵而制成，该混菌发酵物饲料添加剂的制备方法首先是通过试管斜面培养基和试管液体培养基培养成母种，然后经过摇床耗氧培养、斜面固体培养和厌氧三角瓶培养，发酵罐发酵成液体饲料添加剂或发酵罐发酵培养后接种到固体发酵成饲料添加剂。本发明制备的混菌发酵物饲料添加剂天然、安全绿色、含有丰富的代谢产物、营养价值高、能够提供畜禽肠胃内需要的益生菌群、预防疾病、提高畜禽免疫力、减少畜禽有害气体排放，改善畜禽舍环境。本发明提供的制备方法培养基配方简单，可节约生产成本、降低发酵能耗、发酵产率高、产品质量好。
【IPC分类】A23K1/16, A23K1/00
【公开号】CN104904994
【申请号】CN201510408325
【发明人】程延庆, 苗晓微, 梁代华
【申请人】谷实农牧集团股份有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年7月14日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及到的是两种饲料添加剂，特别涉及三大类菌液体发酵、固体发酵饲料 添加剂及其制备方法，属微生物发酵领域。
【背景技术】
[0002] 混菌发酵是指两种或两种以上的微生物协同作用，共同完成某一目的新型发酵技 术。混菌发酵具有很强的独特性，能够以一类菌体的代谢产物成为另一类菌的营养物质，并 且能够获取某些单一发酵无法得到的产物，发酵代谢产物具有累加效应，发酵代谢产物利 用率高等优点。
[0003] 近年来微生物制剂产品应用越来越广泛，在制药方面更，生物制药工程已经成为 制药行业发展的重点；环境工程方面，污水处理，空气净化方面也得到了很大的应用；农业 方面，微生物先天所具有的改良土壤、解磷、解钾、促进植物吸收、防治病害方面也起到的巨 大的作用；饲料方面，在肠道内的种群优势作用、夺氧杀菌作用、提早建立免疫体统作用，促 进饲料利用率方面都起到了至关重要的作用。
[0004] 目前市场上流通的大多是以单菌干粉的形式存在，优势在于便宜保存，菌数多等 优点，同时存在代谢产物少，菌数高在饲料中添加混合是否均匀，在动物体内多久可以复 苏，如养殖户添加药物，菌剂基本上起不到作用等不利因素。
【发明内容】
[0005] 鉴于益生菌菌剂现有特性，本发明提供了采用三大类菌种酵母菌、乳酸菌和芽孢 杆菌的混合液体发酵和固体发酵形式得到液体饲料添加剂和固体饲料添加剂，该添加剂天 然、安全、绿色、营养价值高、能够预防疾病、提高机体免疫能力。
[0006] 本发明提供了利用这三大类菌混合液体发酵饲料添加剂的方法，具有菌数高、无 污染、通过饮水利用快的优点；还提供了这三大类菌混合固体发酵饲料添加剂的方法，产物 具有活力高、有丰富的代谢产物、发酵具有特殊酸香味，更容易吸引采食对象等优点。
[0007] 本发明使用的菌种是乳酸菌类5种菌：CGMCC1. 0557植物乳杆菌、CGMCC1. 1854嗜 酸乳杆菌、CGMCC1. 1480保加利亚乳杆菌、CICC6026植物乳杆菌、ACCC10637嗜酸乳杆菌；酵 母菌类3种菌：CGMCC2. 0120产朊假丝酵母、ACCC20060产朊假丝酵母、安琪酵母；芽孢杆菌 类6种菌： CGMCC1. 2009凝结芽孢杆菌、CGMCC1. 0813地衣芽孢杆菌、CGMCC1. 1806枯草芽孢杆菌、CGMCC1. 0504枯草芽孢杆菌、ACCC10619枯草芽孢杆菌、CICC10262纳豆芽孢杆菌。
[0008] 本发明是通过下述技术方案实现的： 液体发酵饲料添加剂的添加量在畜禽饮水中添加〇. 5%-3% ;固体发酵饲料添加剂在畜 禽饲料的0. 5%-5% ; 本发明提供的三大类菌混合液体发酵物饲料添加剂的制备方法包括以下步骤： a. 母种培育：将上述乳酸菌5种菌分别取0. 5ml菌液接种到已灭菌装有液体培养基的 试管中，在37°C条件下厌氧培养48小时，母种备用； 所述液体培养基为MRS乳酸菌培养基和鲜奶培养基； 将上述酵母菌3种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在28°C条件下培 养24小时，母种备用； 所述斜面培养基为PDA培养基； 将上述芽孢菌类6种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在37°C条件下 培养12小时，母种备用； 所述斜面培养基为LB培养基； b. 二级种子培养：将上述a所述的母种乳酸菌5种菌按照1%的接种量注入500ml液 体培养基中，在37°C条件下厌氧静置培养48小时，得液态菌液； 将上述a所述的母种酵母菌3种菌分别用蒸馏水洗脱后均匀涂布到装有固体培养基的 茄子瓶中，在28°C条件下静置培养24小时，得固态菌种，使用时用蒸馏水洗脱； 将上述a所述的母种芽孢菌6种菌分别用接种环接种到装有液体培养基的三角瓶中， 在37°C条件下气浴摇床中震荡培养12小时，得液体菌液； c. 将上述b所得的菌种全部接种到装有750L培养基的1000L发酵罐中37°C培养先厌 氧培养48小时，后耗氧培养24小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为 0. 02L-0. 5L，接种量为1%-5%。c所述的培养基为：葡萄糖5%，乳清粉0. 5%，硫酸铵0. 4%，酵 母膏0. 4%，氯化钠1%，磷酸氢二钾0. 1%，硫酸镁0. 02%，鲜奶3%，消泡剂0. 02%，其余为水；初 始ph为7。
[0009] 本发明提供的三大类菌混合固体发酵物饲料添加剂的制备方法包括以下步骤： a. 母种培育：同上述液体发酵物饲料添加的制备方法； b. 二级种子培养：同上述液体发酵物饲料添加的制备方法： c. 将上述b所得的菌液，乳酸菌接种到750L培养基的1000L乳酸菌发酵罐中，37°C培 养厌氧培养48小时；酵母菌接种到750L培养基的1000L酵母菌发酵罐中，28°C培养耗氧培 养24小时；芽孢菌接种到750L培养基的1000L芽孢菌发酵罐中，37°C培养耗氧、搅拌培养 16小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为 0? 02L-0. 5L，接种量为 1%-5% ; d. 将上述c培养好的菌液按照1:1:1的转移到已空消灭菌后的3000L发酵罐中，混合 均匀备用； e. 将上述d培养好的菌液按照5%-20%的比例接种到灭菌冷却后的固体培养基中，搅匀 后用呼吸袋按照50kg/袋包装，密封后堆放到无菌室内发酵，发酵时间不小于7天，温度控 制不低于28°C，不高于37°C; c要求的液体培养基，乳酸菌液体培养基的配方为：葡萄糖10%，酵母膏0. 5%，酪蛋白胨 0. 5%，柠檬酸氢二铵0. 2%，磷酸氢二钾0. 2%，乙酸钠0. 5%，硫酸锰微量，吐温-80 0. 1%，硫酸 镁0. 02%，乳清粉0. 2%，硫酸铵0. 2%，鲜奶4%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph6 ; 酵母菌培养基的配方为：葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏0. 5%，玉米面5%，糖化酶 0. 05%，尿素0. 1%，硫酸铵0. 1%，乳清粉2%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph自然； 芽孢杆菌培养基配方为：氯化钠1%，葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏〇. 5%，硫酸铵 0. 5%，磷酸氢二钾0. 2%，乳清粉2%，其余为水，初始ph为7 ; e.要求的固体培养基配方为：纤维饲料4%，玉米5%，沸石粉10%，米糠30%，硫酸铵2%， 尿素1%，乳清粉5%，葡萄糖5%，糖蜜15%，菌液5%-20%，其余为水。
[0010] 本发明通过合理的设计发酵时间、过程控制、接种量、固体发酵形式，使益生菌的 这三大类菌体都能保持稳定的活性和含有丰富的大量代谢产物。
[0011] 本发明的优点及有益效果为： 1、 本发明制备的混合液体发酵物饲料添加和固体发酵物饲料添加剂天然、安全、绿色、 无污染，能预防疾病，提高机体的免疫能力； 2、 本发明可根据用户自己的意愿选择混合液体发酵物饲料添加或者固体发酵物饲料 添加剂，方便用户； 3、 本发明为液体或30%-40%的湿固体发酵产品，在机体内活化时间短，见效快； 4、 本发明除了具有大量的有益菌外，还含有其生长过程中大量的优势代谢产物，如多 糖、肽、氨基酸和维生素等物质，更有益于机体营养的补充； 5、 固体发酵物饲料添加剂具有特殊酸香味，更容易吸引采食对象，促进采食量。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 以三大类菌混合液体发酵物饲料添加剂，具体步骤如下： a. 母种培育：将上述乳酸菌5种菌分别取0. 5ml菌液接种到已灭菌装有液体培养基的 试管中，在37°C条件下厌氧培养48小时，母种备用； 所述液体培养基为MRS乳酸菌培养基和鲜奶培养基； 将上述酵母菌3种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在28°C条件下培 养24小时，母种备用； 所述斜面培养基为PDA培养基； 将上述芽孢菌类6种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在37°C条件下 培养12小时，母种备用； 所述斜面培养基为LB培养基； b. 二级种子培养：将上述a所述的母种乳酸菌5种菌按照1%的接种量注入500ml液 体培养基中，在37°C条件下厌氧静置培养48小时，得液态菌液； 将上述a所述的母种酵母菌3种菌分别用蒸馏水洗脱后均匀涂布到装有固体培养基的 茄子瓶中，在28°C条件下静置培养24小时，得固态菌种，使用时用蒸馏水洗脱； 将上述a所述的母种芽孢菌6种菌分别用接种环接种到装有液体培养基的三角瓶中， 在37°C条件下气浴摇床中震荡培养12小时，得液体菌液； c. 将上述b所得的菌种接种到装有750L培养基的1000L发酵罐中37°C培养先厌氧培 养48小时，后耗氧培养24小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为0. 2L， 接种量为5%。
[0013] 实施例2以三大类菌混合液体发酵物饲料添加剂，具体步骤如下： 母种培育，二级种子培养同实施实例1a、b c. 上述b所得的菌液，乳酸菌接种到750L培养基的1000L乳酸菌发酵罐中，37°C培养 厌氧培养48小时；酵母菌接种到750L培养基的1000L酵母菌发酵罐中，28°C培养耗氧培养 24小时；芽孢菌接种到750L培养基的1000L芽孢菌发酵罐中，37°C培养耗氧、搅拌培养16 小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为〇. 2L， 接种量为3% ; d . 将上述c培养好的菌液按照1:1:1的转移到已空消灭菌后的3000L发酵罐中，混合 均匀备用； e. 将上述d培养好的菌液按照5%-20%的比例接种到灭菌冷却后的固体培养基中，搅匀 后用呼吸袋按照50kg/袋包装，密封后堆放到无菌室内发酵，发酵时间不小于7天，温度控 制不低于28°C，不高于37°C; c要求的液体培养基，乳酸菌液体培养基的配方为：葡萄糖10%，酵母膏0. 5%，酪蛋白胨 0. 5%，柠檬酸氢二铵0. 2%，磷酸氢二钾0. 2%，乙酸钠0. 5%，硫酸锰微量，吐温-80 0. 1%，硫酸 镁0. 02%，乳清粉0. 2%，硫酸铵0. 2%，鲜奶4%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph6 ; 酵母菌培养基的配方为：葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏0. 5%，玉米面5%，糖化酶 0. 05%，尿素0. 1%，硫酸铵0. 1%，乳清粉2%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph自然； 芽孢杆菌培养基配方为：氯化钠1%，葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏〇. 5%，硫酸铵 0. 5%，磷酸氢二钾0. 2%，乳清粉2%，其余为水，初始ph为7 ; e要求的固体培养基配方为：纤维饲料4%，玉米5%，沸石粉10%，米糠30%，硫酸铵2%，尿 素1%，乳清粉5%，匍萄糖5%，糖蜜15%，菌液5%_20%，其余为水。
[0014] 实施例3 (芽孢杆菌菌液体发酵物饲料添加剂） 纯种培养以上述6种芽孢杆菌液体发酵物饲料添加剂，方法与实施例1相同。
[0015] 实施例4 以实施例1方法得到的菌液按照实施例2的发酵方法得到固体发酵物饲料添加剂。
[0016] 效果实例1发酵物添加剂对肉鸡影响生长 1. 实验动物：选择1日龄肉鸡5000只，公母不限，随机分成5组，每组1000只，做好标 记，分栏饲养； 2. 饲养饲料：5组分别标号Y1饮用实施例1的液体发酵物添加剂、Y2饮用实施实例3 液体发酵物添加剂，以上两组分别在每日饮水量种添加〇. 5%，正常喂食饲料；G1、G2分别使 用例2、4得到的固体发酵物添加剂，添加量为2%;P正常饲料喂养； 3. 喂养管理方式相同； 4. 30天后对肉鸡生长效果的影响，见表1
从表1种可以看出，添加了液体发酵物饲料添加剂和固体发酵物添加剂的肉料比明显 小于正常饲料喂养的肉鸡，但日增重大，死亡率低，经济效果好，尤为Yl，Gl，G2效果明显好 于其他两组，同时也说明了，三大菌类混合发酵的饲料添加剂的效果强于单类菌发酵的饲 料添加剂的效果。对比每栏时，能够明显感觉到普通喂食饲料的鸡舍臭气味道最大，说明益 生菌(这三大类菌）对改善饲养环境也能起到作用。死亡率低说明肉鸡免疫系统增强，从而 降低养殖成本，提高经济效益。
[0017] 效果实例2发酵物添加剂对蛋鸡的影响 1. 实验动物选择125日龄的蛋鸡5000只，按照效果实例1的编组方式编组 2. 饲养饲料同效果实例1的喂养方式，全程饲喂； 3. 管理方式相同 4. 结果分析 喂食混菌发酵的液体饲料添加和固体饲料添加剂的蛋壳色泽好，但中增加12. 1%，产蛋 期延长7-10天。
【主权项】
1. 三大类菌混合液体发酵、固体发酵物饲料添加剂，其特征在于所述的混菌发酵物是 由乳酸菌类5种菌：CGMCC1. 0557植物乳杆菌、CGMCC1. 1854嗜酸乳杆菌、CGMCC1. 1480保加 利亚乳杆菌、CICC6026植物乳杆菌、ACCC10637嗜酸乳杆菌；酵母菌类3种菌：CGMCC2. 0120 产朊假丝酵母、ACCC20060产朊假丝酵母、安琪酵母；芽孢杆菌类6种菌： CGMCC1. 2009凝结芽孢杆菌、CGMCC1. 0813地衣芽孢杆菌、CGMCC1. 1806枯草芽孢杆菌、CGMCC1. 0504枯草芽孢杆菌、ACCC10619枯草芽孢杆菌、CICC10262纳豆芽孢杆菌发酵而成 的液体制剂和固体制剂。2. 根据权利要求1所述的混菌发酵物，其特征在于：固体发酵饲料添加剂含水量 30%-40%〇3. 根据权利要求1所述的混菌发酵物，其特征在于：液体发酵饲料添加剂的添加量在 畜禽饮水中添加〇. 5%-3% ;固体发酵饲料添加剂在畜禽饲料的0. 5%-5%。4. 权利要求1所述的混合发酵物饲料添加剂中液体发酵饲料添加剂的制备方法，其特 征在于：乳酸菌类5种菌、酵母菌类3种菌、芽孢杆菌类6种菌在同一发酵罐中进行厌氧和 耗氧培养； 包括以下步骤： a. 母种培育：将上述乳酸菌5种菌分别取0. 5ml菌液接种到已灭菌装有液体培养基的 试管中，在37°C条件下厌氧培养48小时，母种备用； 所述液体培养基为MRS乳酸菌培养基和鲜奶培养基； 将上述酵母菌3种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在28°C条件下培 养24小时，母种备用； 所述斜面培养基为PDA培养基； 将上述芽孢菌类6种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在37°C条件下 培养12小时，母种备用； 所述斜面培养基为LB培养基； b. 二级种子培养：将上述a所述的母种乳酸菌5种菌按照1%的接种量注入500ml液 体培养基中，在37°C条件下厌氧静置培养48小时，得液态菌液； 将上述a所述的母种酵母菌3种菌分别用蒸馏水洗脱后均匀涂布到装有固体培养基的 茄子瓶中，在28°C条件下静置培养24小时，得固态菌种，使用时用蒸馏水洗脱； 将上述a所述的母种芽孢菌6种菌分别用接种环接种到装有液体培养基的三角瓶中， 在37°C条件下气浴摇床中震荡培养12小时，得液体菌液； c. 将上述b所得的菌种全部接种到装有750L培养基的1000L发酵罐中37 °C培养先厌 氧培养48小时，后耗氧培养24小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为 0? 02L-0. 5L，接种量为 1%-5%。5. 根据权利要求4所述的制备方法中c所述的培养基，其特征在于：所述的培养基配 方为：葡萄糖5%，乳清粉0. 5%，硫酸铵0. 4%，酵母膏0. 4%，氯化钠1%，磷酸氢二钾0. 1%，硫酸 镁0. 02%，鲜奶3%，消泡剂0. 02%，其余为水；初始ph为7。6. 权利要求1所述的混合发酵物饲料添加剂中固体发酵饲料添加剂的制备方法，其 特征在于：乳酸菌类5种菌、酵母菌类3种菌、芽孢杆菌类6种菌在同一发酵罐中进行厌氧 和耗氧培养； 包括以下步骤： a. 母种培育：同权利要求4 ; b. 二级种子培养：同权利要求4 : c. 将上述b所得的菌液，乳酸菌接种到750L培养基的1000 L乳酸菌发酵罐中，37°C培 养厌氧培养48小时；酵母菌接种到750L培养基的1000L酵母菌发酵罐中，28°C培养耗氧培 养24小时；芽孢菌接种到750L培养基的1000L芽孢菌发酵罐中，37°C培养耗氧、搅拌培养 16小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为 0? 02L-0. 5L，接种量为 1%-5% ; d. 将上述c培养好的菌液按照1:1:1的转移到已空消灭菌后的3000L发酵罐中，混合 均匀备用； e. 将上述d培养好的菌液按照5%-20%的比例接种到灭菌冷却后的固体培养基中，搅匀 后用呼吸袋按照50kg/袋包装，密封后堆放到无菌室内发酵，发酵时间不小于7天，温度控 制不低于28°C，不高于37°C。7. 根据权利要求6所述的制备方法中c要求的液体培养基，其特征在于所述乳酸菌 液体培养基的配方为：葡萄糖10%，酵母膏〇. 5%，酪蛋白胨0. 5%，柠檬酸氢二铵0. 2%，磷酸 氢二钾0. 2%，乙酸钠0. 5%，硫酸锰微量，吐温-80 0. 1%，硫酸镁0. 02%，乳清粉0. 2%，硫酸铵 0. 2%，鲜奶4%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph6 ; 酵母菌培养基的配方为：葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏0. 5%，玉米面5%，糖化酶 0. 05%，尿素0. 1%，硫酸铵0. 1%，乳清粉2%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph自然； 芽孢杆菌培养基配方为：氯化钠1%，葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏〇. 5%，硫酸铵 0. 5%，磷酸氢二钾0. 2%，乳清粉2%，其余为水，初始ph为7。8. 根据权利要求6所述的制备方法中e要求的固体培养基，其特征在于所述固体培养 基的配方为：纤维饲料4%，玉米5%，沸石粉10%，米糠30%，硫酸铵2%，尿素1%，乳清粉5%，葡 萄糖5%，糖蜜15%，菌液5%-20%，其余为水。
【专利摘要】本发明涉及的是三大类菌混合液体发酵、固体发酵物饲料添加剂及其制备方法，属于微生物发酵领域，该混菌发酵物是由乳酸菌（5种菌种）、酵母菌（3种菌种）、芽孢杆菌（6种菌种）混菌发酵而制成，该混菌发酵物饲料添加剂的制备方法首先是通过试管斜面培养基和试管液体培养基培养成母种，然后经过摇床耗氧培养、斜面固体培养和厌氧三角瓶培养，发酵罐发酵成液体饲料添加剂或发酵罐发酵培养后接种到固体发酵成饲料添加剂。本发明制备的混菌发酵物饲料添加剂天然、安全绿色、含有丰富的代谢产物、营养价值高、能够提供畜禽肠胃内需要的益生菌群、预防疾病、提高畜禽免疫力、减少畜禽有害气体排放，改善畜禽舍环境。本发明提供的制备方法培养基配方简单，可节约生产成本、降低发酵能耗、发酵产率高、产品质量好。
【IPC分类】A23K1/16, A23K1/00
【公开号】CN104904994
【申请号】CN201510408325
【发明人】程延庆, 苗晓微, 梁代华
【申请人】谷实农牧集团股份有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年7月14日
最新回复(0)