固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉及功能性大豆蛋白的方法
固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉及功能性大豆蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及豆粉及大豆蛋白，特别是涉及一种固体发酵法制备富含大豆抗毒素的 豆粉及蛋白的方法；属于食品加工技术领域。
【背景技术】
[0002] 我国人均资源相当匮乏，巨大的人口总量和物质需求与生态环境的有限承载能力 和脆弱性之间的矛盾日益尖锐，且中国人口在急速老龄化。人口老龄化和不合理膳食等原 因可能导致老年性骨质疏松、糖尿病及其它相关疾病高发，特别是更年期妇女面临的形势 更为严峻。由于雌性激素分泌水平下降，处于更年期和绝经后的妇女很容易并发其他的一 些疾病，如乳腺癌、更年期忧郁症。因此，针对中老年特别是更年期和绝经后妇女，合理补充 植物蛋白和植物雌激素来实现健康保健和疾病的防治尤为重要。
[0003] 大豆蛋白作为食品配料广泛用于各类体系中。在国际市场上，美国有2500余种食 品需要添加大豆蛋白，日本每年消耗大豆蛋白达60余万吨。相对于蛋白质的加工功能特 性，人们对食品蛋白的营养和特殊功能性要求逐渐迫切。目前，大豆蛋白食品由于其在慢性 疾病的预防作用，作为健康食品在欧美市场上正以10%的速度增长，种类增加到了万余种。 对于特殊人群的不同需要应该开发特定的功能性蛋白产品，如更年期妇女需要食品蛋白质 具有如减肥、降血脂、预防糖尿病、预防更年期综合症和骨质疏松的特殊功能。
[0004] 大豆除了含有丰富的植物蛋白，也含有大量具有生物活性的多酚。异黄酮作为大 豆中存在的活性成分，表现较强的抗氧化活性、抗真菌活性，抗肿瘤、改善心血管功能、提高 机体免疫力，有效预防和减轻骨质疏松、妇女更年期综合症等多种疾病的活性。普遍认为， 食品中的异黄酮主要以糖苷的形式存在，几乎不能为人体细胞所吸收，生物利用率较低，只 有在人体消化酶（特别是0 -葡萄糖苷酶）作用下转化为苷元形式才能被吸收，表现出较 高的生物活性。近些年发现，大豆组织在遭遇外界刺激或感染病菌后合成并积累的植物抗 毒素，对人体同样具有多重生物学功效，如抗氧化、抗炎、抗癌等，在功能食品和膳食补充剂 领域有着广阔的应用前景。异戊烯基异黄酮（Glyceollins)作为大豆在生物或非生物因素 诱导下累积形成的植物抗毒素之一，表现了强大的生物活性功能，抗癌、降脂、降血压等功 能。研宄发现，食品级的酱油曲霉等真菌可以诱导异黄酮转化为更高活性的Glyceollin。 此领域的基础研宄及产品开发逐渐成为热点问题。
[0005] 在特殊人群专用保健食品开发方面，强化大豆蛋白中的生物活性成分含量是行之 有效的方法之一。从国际食品业的发展趋势看，功能性大豆蛋白食品即将成为21世纪促进 人类健康的基本保健食品和主流食品。富含生物活性苷元型异黄酮和Glyceollins的豆 粉及大豆蛋白的开发将满足中老年特殊人群对功能性食品的强大市场需求。富含苷元及 Glyceollins的大豆所表现出的抗肿瘤、改善心血管疾病及预防骨质疏松的活性在一定程 度上与大豆中的多酚-蛋白质相互作用有关，而目前并未存在Glyceollins与蛋白质相互 作用的蛋白产品的研宄。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种固体发酵法制备 富含苷元型异黄酮及Glyceollins的功能性大豆粉及蛋白的方法。
[0007] 本发明针对目前专用蛋白配料应用面窄的现状，从营养性质出发，拟利用固态发 酵等生物转化技术，通过合理的设计，将大豆中糖苷型异黄酮转化为具有更高生物活性的 苷元型异黄酮和Glyceollins，制备富含异黄酮苷元和Glyceollins的豆粉及大豆蛋白配 料。
[0008] 本发明目的通过如下技术方案实现：
[0009] -种固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉的方法：将米曲霉孢子悬浮液接种于 已浸泡6~12h，去皮、损伤的大豆中；得到染菌的大豆；将染菌的大豆置于培养皿中，封口 膜密封，20~30°C暗箱中进行固态发酵3~5d，冻干、粉碎，得到富含大豆抗毒素的豆粉。 [0010] 优选地，所述曲霉孢子悬浮液按国标SB/T10815 - 1999《孢子数测定法》方法制 备。
[0011] 优选地，所述接种是以个作为孢子数单位，将1. 〇~4.OmL孢子数分别为IX107~ 5X107个、1X10 8~5X10 8个和1X10 9~5X10 9个的米曲霉孢子悬浮液分别接种于4~ l〇g大豆中。
[0012] 一种固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白的方法：将所述富含大豆 抗毒素的豆粉用正己烷进行脱脂，即可得到富含大豆抗毒素的脱脂豆粉；
[0013] 将所得脱脂豆粉过筛，分别以g和mL作为质量和体积的单位，将脱脂豆粉按 1:10~1:15的料液比分散于去离子水中，用氢氧化钠调节料液的pH值至8. 0~9. 0,室温 搅拌50~60min，离心后收集上清液；将上清液用盐酸调pH至4. 5~5. 0,静置30~40min 后，离心，所得沉淀用湿重7~10倍去离子水重新分散，调节其pH至中性后，即得富含大豆 抗毒素的功能性大豆蛋白。
[0014] 优选地，所述脱脂是分别以g和mL作为质量和体积的单位，将富含大豆抗毒素的 豆粉与正己烷按照1:10~1:15混合。
[0015] 优选地，所述盐酸和氢氧化钠的浓度为1. 0~2. 0mol/L。
[0016] 优选地，所述离心的转速都为6000~8000rpm/min;离心的时间都为10~20min。
[0017] 优选地，所述过筛为过60目筛。
[0018] 应用本发明方法，所得的3d发酵豆粉中糖苷大部分转化为苷元，且Glyceollins 得到了最大富集；通过碱溶酸沉所提取得到的大豆蛋白中蛋白得率多56. 13%，糖苷含量 降低，苷元及Glyceollins含量显著增加。
[0019] 相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
[0020] 1)现有技术多采用外源添加异黄酮及其转化酶等技术实现异黄酮的生物转化和 异黄酮在大豆蛋白中的富集，存在需要用有机溶剂以及乳化剂等不安全因素；本发明通过 微生物转化技术生产富含植物抗毒素的功能蛋白配料，不仅能克服大豆分离蛋白未形成生 产能力的局限，而且工艺条件温和，不需要加入有机溶剂和乳化剂等化学成分，安全性好。
[0021] 2)本发明以高异黄酮大豆种子为主要原料，通过利用具有较高生物转化活性的米 曲霉对大豆进行侵染，在固体发酵过程中实现糖苷型异黄酮向具有更高生物活性的苷元型 异黄酮及Glyceollins的转化和积累，明确大豆种子固体发酵工艺，实现Glyceollins的积 累。
[0022] 3)本发明利用生物转化理念获得具有良好生物适用性的高苷元型异黄酮及 Glyceollins功能性大豆豆粉及蛋白配料，建立低成本的大豆加工新技术，开发功能性保健 食品。
【附图说明】
[0023] 图1为六种大豆异黄酮混标的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0024] 为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的发明，但实施 例不构成对本发明保护范围的限定。
[0025] 本发明中蛋白含量采用GB/T5009. 5 - 03凯氏定氮法测定，用于计算蛋白提取率。
[0026] 本发明获得的豆粉及蛋白样品中异黄酮含量采用液相色谱法测定，液相色谱测定 条件及计算方法参考国标GB/T23788 -2009,其中，Glyceollins(Glys)的含量以大豆苷元 标品进行当量计算，单位为大豆素/豆粉（mgDE/kgDW)。
[0027] 实施例1
[0028] 未损伤组：取6g大豆种子，用70%的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后 用无菌水25°C浸泡12h，去皮。将1. 5mL孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107个）加入大 豆中，用无菌勺子混匀。将已染菌的大豆置于培养皿中，每皿25 - 30瓣，封口膜密封，25°C 暗箱培养，所得发酵豆子冻干备用。
[0029] 损伤组：取大豆种子，用70 %的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后用无 菌水25°C浸泡12h，去皮，并用手术刀在豆子表面各划3次进行损伤处理。
[0030] 将1.5mL孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107)加入损伤后的大豆中，用无菌勺 子混匀。将已染菌的6g大豆置于培养皿中，每皿25 -30瓣，封口膜密封，25°C暗箱培养3d， 所得发酵豆子冻干、粉碎、备用。以未接种大豆种子（〇)作为空白对照。
[0031] 获得的豆粉样品（损伤组和未损伤组）中异黄酮含量采用液相色谱法测定，液相 色谱测定条件及计算方法参考国标GB/T23788 - 2009,具体是根据附图1中3种糖苷型和 3种苷元型异黄酮的出峰时间，结合国标GB/T23788 -2009,对实施例1中各种样品中6种 异黄酮及Glyceollins的含量进行计算，其中，Glyceollins(Glys)的含量以大豆苷元标品 进行当量计算，单位为大豆素/豆粉（mgDE/kgDW)，经计算，测试结果如表1。
[0032] 表1实施例1中的苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW)变化
[0033] CN104905162A 说明书 4/7 页
[0034] 由表1可知，损伤处理组中的总异黄酮糖苷和总苷元含量分别为224. 67mg/kg 和892. 51mg/kg，而未损伤处理组中总异黄酮糖苷和总苷元含量则分别为852. 96mg/kg 和309. 05mg/kg，损伤对发酵大豆中Glyceollins的生成量有显著的影响，损伤处理的发 酵大豆中Glyceollins的含量是未损伤发酵大豆中的4倍。损伤作为大豆中苷元转化 为植物抗毒素的诱导子之一，由于菌种等因素的影响，其与微生物诱导子结合对发酵生成 Glyceollins的研宄结果不同，在米曲霉侵染的条件下，损伤不仅能促进大豆中异黄酮糖苷 转化为苷元，还能大大促进Glyceollins的积累。
[0035] 实施例2
[0036] 取6g大豆种子，用质量浓度70%的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后 用无菌水25°C浸泡12h，去皮，损伤。将1.5mL孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107个） 加入损伤后的大豆中，用无菌勺子混匀。将已染菌的大豆置于培养皿中，每皿25 -30瓣，封 口膜密封，25°C暗箱分别培养0d、ld、3d、5d，所得发酵豆子冻干、粉碎、备用。以未接种大豆 (〇)作为空白对照。测试方法同实施例1，测试结果见表2。
[0037] 表2实施例2中的苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW)变化
[ 0038]
[0039] 经计算，由实施例2中的结果可知，以大豆为原料，当菌接种量（107个）等条件一 定时，分别将已侵染米曲霉的大豆进行培养，制备得到不同发酵时间的发酵豆粉。由表2可 知，在每克豆子孢子数为1〇 7个的条件下，随着发酵时间的增长，异黄酮糖苷和苷元含量持 续降低，Glyceollins的含量则不断增加，而发酵5天后所得的豆粉中苷元型异黄酮含量升 高，Glyceollins含量则减少。这是由于随着发酵时间的增长，大豆中的糖苷在微生物及损 伤的刺激下应激转化游离态苷元，苷元则进一步转化为具有更高生物活性的Glyceollins， 当发酵时间达到5天时，由于大豆中营养物质的减少及米曲霉生长的需要，大豆中苷元型 异黄酮得到积累而Glyceollins则被分解为分子量更小的物质。由此可知，3d为豆粉积累 最大量植物抗毒素的最佳时间。
[0040] 实施例3 :
[0041] 取6g大豆种子，用70%的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后用无菌水 25°C浸泡12h，去皮，损伤。分别按每克豆子接种孢子数为107个、10 8个和10 9个的孢子悬 浮液（1.5mL)加入损伤后的大豆中，用无菌勺子混匀。将已染菌的大豆置于培养皿中，每皿 25 -30瓣，封口膜密封，25°C暗箱分别培养3d，所得发酵豆子冻干、粉碎、备用。以未接种大 豆（〇)作为空白对照。测试方法同实施例1，测试结果见表3。
[0042] 表3实施例3中的苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW)变化
[0043]
[0044] 以高异黄酮大豆为原料，当培养时间等条件一定时，分别将孢子数为10 7、108、109 个的菌接种到已经过处理的大豆中，制备得到不同孢子浓度所得发酵豆粉乙醇提取液进行 HPLC定量，所得的菌接种量对发酵大豆中苷元及Glyceollins含量的影响结果如表3所示。 随着菌接种量的增加，发酵豆粉中苷元含量先增加后降低，而Glyceollins含量持续降低， 且在菌接种量为1〇7个时，Glyceollins的生成量达到最大值，这可能是因为菌接种量的增 加，促进了糖苷型异黄酮向苷元型异黄酮转化，而苷元性异黄酮的较快积累则抑制了苷元 进一步转化Glyceollins的反应。因此，菌接种量为107个发酵最佳菌侵染浓度。
[0045] 实施例4 :
[0046] 取6g大豆种子，用70%的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后用无菌水 25°C浸泡12h，去皮，损伤。将1. 5mL的孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107个）加入损伤 后的大豆中，用无菌勺子混匀。将已染菌的大豆置于培养皿中，每皿25 -30瓣，封口膜密封， 25°C暗箱培养0(1、1(1、3(1、5(1，所得发酵豆子冻干、粉碎，将粉碎所得的豆粉用正己烷脱脂，得 到富含大豆抗毒素的脱脂豆粉；
[0047] 脱脂豆粉过60目筛，将3g的脱脂豆粉按1:10的料液比（质量体积比，质量单位g， 体积单位mL)分散于去离子水中，用2.Omol/L氢氧化钠调节料液的pH值至8. 0,室温搅拌 60min后8000rpm/min离心20min，收集上清液。将上清液用2. 0mol/L盐酸调pH至4. 5,静 置30min后，以6000rpm/min离心10min，所得沉淀用湿重7~10倍去离子水重新分散，调节 其pH至中性后，即得富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白。以未接种大豆所提取得到的蛋白 作为空白对照（0)。获得的大豆蛋白样品（不同发酵天数）中异黄酮含量采用液相色谱法测 定，液相色谱测定条件及计算方法参考国标GB/T23788 - 2009,其中，Glyceollins(Glys) 的含量以大豆苷元标品进行当量计算，单位为大豆素/豆粉（mgDE/kgDW)，测试方法同实 施例1，测试结果如表4。
[0048] 表4实施例4中的不同天数蛋白苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW) 变化
[0049]
[0050] 对实施例4中不同发酵天数所提取得到的蛋白的得率、糖苷、苷元及Glyceollins 的含量进行计算，所得的结果如表4所示，由表4可知，利用碱溶酸沉所提取得到的蛋白 含量均超过56. 13%，与实施例2相比较可知，所提取得到的蛋白中糖苷含量明显降低， 苷元及Glyceollins含量明显增加，其中以Glyceollins的含量增加最为显著，这可能 是由于大部分苷元及Glyceollins的疏水性较强，其水溶性均较差，因此，在提取过程 中，苷元及Glyceol1ins与大豆蛋白质发生了强的疏水相互作用，从而使得蛋白中苷元及 Glyceollins得到了大幅度的富集。
[0051] 实施例5:
[0052] 取6g大豆种子，用70%的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后用无菌水 25°C浸泡12h，去皮，进行未损伤（NH)和损伤（H)处理。
[0053] 将1.5mL的孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107个）加入损伤后的大豆中，用无 菌勺子混匀。将已染菌的大豆置于培养皿中，每皿25 -30瓣，封口膜密封，25°C暗箱培养3d， 所得发酵豆子冻干、粉碎，将粉碎所得的豆粉用正己烷脱脂，得到富含大豆抗毒素的脱脂豆 粉；
[0054] 脱脂豆粉过60目筛，将3g的脱脂豆粉按1:10的料液比（质量体积比，质量单位 g，体积单位mL)分散于去离子水中，用2. 0mol/L氢氧化钠调节料液的pH值至8. 0,室温搅 拌60min后8000rpm/min离心20min，收集上清液。将上清液用2. 0mol/L盐酸调pH至4. 5， 静置30min后，以6000rpm/min离心10min，所得沉淀用湿重7~10倍去离子水重新分散， 调节其pH至中性后，即得富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白。以未接种大豆所提取得到的 蛋白作为空白对照（0)。
[0055] 获得的大豆蛋白样品（损伤组和未损伤组）中异黄酮含量采用液相色谱法测定， 液相色谱测定条件及计算方法参考国标GB/T23788 -2009,其中，Glyceollins(Glys)的含 量以大豆苷元标品进行当量计算，单位为大豆素/豆粉（mgDE/kgDW)，测试方法同实施例 1，测试结果如表5。
[0056] 表5实施例5中的损伤处理对蛋白苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW) 变化
[0057]
[0058]对实施例5中未经过任何处理的大豆（0)、发酵前未损伤处理所得的发酵豆（NH) 和发酵前进行损伤所得发酵豆（H)中所提取得到的蛋白的得率、糖苷、苷元及Glyceollins 的含量进行计算，所得的结果如表5所示，由表5可知，未经过任何处理的大豆（0)、NH和 H中所提取得到的蛋白得率差别不大，经过发酵所得到的大豆所得到的蛋白中总糖苷含 量明显降低、总苷元含量明显增加，并均伴随着Glyceollins的生成，其中，H中总苷元及 Glyceollins的含量明显高于NH，这是因为损伤作为糖苷转化为苷元、Glyceollins生成 反应的诱导子，能在豆子进行发酵的过程中促进苷元及Glyceollins的积累，并且，苷元及 Glyceollins作为多酚，在蛋白提取过程中，多酚含量越高，蛋白与多酚之间的相互作用越 强，从而积累了苷元及Glyceollins。
【主权项】
1. 一种固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉的方法，其特征在于，将米曲霉孢子悬 浮液接种于已浸泡6~12h，去皮、损伤的大豆中；得到染菌的大豆；将染菌的大豆置于培养 皿中，封口膜密封，20~30°C暗箱中进行固态发酵3~5d，冻干、粉碎，得到富含大豆抗毒素 的豆粉。2. 根据权利要求1所述的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉的方法，其特征在 于，所述曲霉孢子悬浮液按国标SB/T10815 - 1999《孢子数测定法》方法制备。3. 根据权利要求1所述的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉的方法，其特征在 于，所述接种是以个作为孢子数单位，将I. 〇~4.OmL孢子数分别为IXIO7~5X10 7个、 IXIO8~5X108个和IX10 9~5X109个的米曲霉孢子悬浮液分别接种于4~IOg大豆中。4. 一种应用权利要求1 - 3任一项所述方法的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能 性大豆蛋白的方法，其特征在于，将所述富含大豆抗毒素的豆粉用正己烷进行脱脂，即可得 到富含大豆抗毒素的脱脂豆粉； 将所得脱脂豆粉过筛，分别以g和mL作为质量和体积的单位，将脱脂豆粉按1:10~ 1:15的料液比分散于去离子水中，用氢氧化钠调节料液的pH值至8. 0~9. 0,室温搅拌 50~60min，离心后收集上清液；将上清液用盐酸调pH至4. 5~5. 0,静置30~40min后， 离心，所得沉淀用湿重7~10倍去离子水重新分散，调节其pH至中性后，即得富含大豆抗 毒素的功能性大S蛋白。5. 根据权利要求4所述的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白的方法， 其特征在于，所述脱脂是分别以g和mL作为质量和体积的单位，将富含大豆抗毒素的豆粉 与正己烷按照1:10~1:15混合。6. 根据权利要求4所述的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白的方法， 其特征在于，所述盐酸和氢氧化钠的浓度都为I. 0~2.Omol/L。7. 根据权利要求4所述的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白的方法， 其特征在于，所述离心的转速都为6000~8000rpm/min;离心的时间都为10~20min。8. 根据权利要求4所述的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白的方法， 其特征在于，所述过筛为过60目筛。
【专利摘要】本发明公开了固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉及功能性大豆蛋白的方法。该方法将米曲霉孢子悬浮液接种于已浸泡6～12h，去皮、损伤的大豆中，得到染菌的大豆；将染菌的大豆置于培养皿中，封口膜密封，20～30℃暗箱中进行固态发酵3～5d，冻干、粉碎，得到富含大豆抗毒素的豆粉。将所得富含大豆抗毒素的豆粉用正己烷脱脂，所得脱脂豆粉进行碱溶酸沉，即得富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白。本发明方法豆粉及蛋白达到了富集苷元型异黄酮及Glyceollins的效果，且蛋白得率较高，适合于工业化生产，可作为专用蛋白配料应用于更年期妇女豆粉制品、乳制品和植物蛋白饮料中。
【IPC分类】A23J1/14, A23L1/29, A23L1/20, A23L1/305
【公开号】CN104905162
【申请号】CN201510312809
【发明人】王金梅, 陈燕琼, 杨晓泉, 胡文锋, 苏铧佳, 颜喆
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月9日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及豆粉及大豆蛋白，特别是涉及一种固体发酵法制备富含大豆抗毒素的 豆粉及蛋白的方法；属于食品加工技术领域。
【背景技术】
[0002] 我国人均资源相当匮乏，巨大的人口总量和物质需求与生态环境的有限承载能力 和脆弱性之间的矛盾日益尖锐，且中国人口在急速老龄化。人口老龄化和不合理膳食等原 因可能导致老年性骨质疏松、糖尿病及其它相关疾病高发，特别是更年期妇女面临的形势 更为严峻。由于雌性激素分泌水平下降，处于更年期和绝经后的妇女很容易并发其他的一 些疾病，如乳腺癌、更年期忧郁症。因此，针对中老年特别是更年期和绝经后妇女，合理补充 植物蛋白和植物雌激素来实现健康保健和疾病的防治尤为重要。
[0003] 大豆蛋白作为食品配料广泛用于各类体系中。在国际市场上，美国有2500余种食 品需要添加大豆蛋白，日本每年消耗大豆蛋白达60余万吨。相对于蛋白质的加工功能特 性，人们对食品蛋白的营养和特殊功能性要求逐渐迫切。目前，大豆蛋白食品由于其在慢性 疾病的预防作用，作为健康食品在欧美市场上正以10%的速度增长，种类增加到了万余种。 对于特殊人群的不同需要应该开发特定的功能性蛋白产品，如更年期妇女需要食品蛋白质 具有如减肥、降血脂、预防糖尿病、预防更年期综合症和骨质疏松的特殊功能。
[0004] 大豆除了含有丰富的植物蛋白，也含有大量具有生物活性的多酚。异黄酮作为大 豆中存在的活性成分，表现较强的抗氧化活性、抗真菌活性，抗肿瘤、改善心血管功能、提高 机体免疫力，有效预防和减轻骨质疏松、妇女更年期综合症等多种疾病的活性。普遍认为， 食品中的异黄酮主要以糖苷的形式存在，几乎不能为人体细胞所吸收，生物利用率较低，只 有在人体消化酶（特别是0 -葡萄糖苷酶）作用下转化为苷元形式才能被吸收，表现出较 高的生物活性。近些年发现，大豆组织在遭遇外界刺激或感染病菌后合成并积累的植物抗 毒素，对人体同样具有多重生物学功效，如抗氧化、抗炎、抗癌等，在功能食品和膳食补充剂 领域有着广阔的应用前景。异戊烯基异黄酮（Glyceollins)作为大豆在生物或非生物因素 诱导下累积形成的植物抗毒素之一，表现了强大的生物活性功能，抗癌、降脂、降血压等功 能。研宄发现，食品级的酱油曲霉等真菌可以诱导异黄酮转化为更高活性的Glyceollin。 此领域的基础研宄及产品开发逐渐成为热点问题。
[0005] 在特殊人群专用保健食品开发方面，强化大豆蛋白中的生物活性成分含量是行之 有效的方法之一。从国际食品业的发展趋势看，功能性大豆蛋白食品即将成为21世纪促进 人类健康的基本保健食品和主流食品。富含生物活性苷元型异黄酮和Glyceollins的豆 粉及大豆蛋白的开发将满足中老年特殊人群对功能性食品的强大市场需求。富含苷元及 Glyceollins的大豆所表现出的抗肿瘤、改善心血管疾病及预防骨质疏松的活性在一定程 度上与大豆中的多酚-蛋白质相互作用有关，而目前并未存在Glyceollins与蛋白质相互 作用的蛋白产品的研宄。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种固体发酵法制备 富含苷元型异黄酮及Glyceollins的功能性大豆粉及蛋白的方法。
[0007] 本发明针对目前专用蛋白配料应用面窄的现状，从营养性质出发，拟利用固态发 酵等生物转化技术，通过合理的设计，将大豆中糖苷型异黄酮转化为具有更高生物活性的 苷元型异黄酮和Glyceollins，制备富含异黄酮苷元和Glyceollins的豆粉及大豆蛋白配 料。
[0008] 本发明目的通过如下技术方案实现：
[0009] -种固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉的方法：将米曲霉孢子悬浮液接种于 已浸泡6~12h，去皮、损伤的大豆中；得到染菌的大豆；将染菌的大豆置于培养皿中，封口 膜密封，20~30°C暗箱中进行固态发酵3~5d，冻干、粉碎，得到富含大豆抗毒素的豆粉。 [0010] 优选地，所述曲霉孢子悬浮液按国标SB/T10815 - 1999《孢子数测定法》方法制 备。
[0011] 优选地，所述接种是以个作为孢子数单位，将1. 〇~4.OmL孢子数分别为IX107~ 5X107个、1X10 8~5X10 8个和1X10 9~5X10 9个的米曲霉孢子悬浮液分别接种于4~ l〇g大豆中。
[0012] 一种固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白的方法：将所述富含大豆 抗毒素的豆粉用正己烷进行脱脂，即可得到富含大豆抗毒素的脱脂豆粉；
[0013] 将所得脱脂豆粉过筛，分别以g和mL作为质量和体积的单位，将脱脂豆粉按 1:10~1:15的料液比分散于去离子水中，用氢氧化钠调节料液的pH值至8. 0~9. 0,室温 搅拌50~60min，离心后收集上清液；将上清液用盐酸调pH至4. 5~5. 0,静置30~40min 后，离心，所得沉淀用湿重7~10倍去离子水重新分散，调节其pH至中性后，即得富含大豆 抗毒素的功能性大豆蛋白。
[0014] 优选地，所述脱脂是分别以g和mL作为质量和体积的单位，将富含大豆抗毒素的 豆粉与正己烷按照1:10~1:15混合。
[0015] 优选地，所述盐酸和氢氧化钠的浓度为1. 0~2. 0mol/L。
[0016] 优选地，所述离心的转速都为6000~8000rpm/min;离心的时间都为10~20min。
[0017] 优选地，所述过筛为过60目筛。
[0018] 应用本发明方法，所得的3d发酵豆粉中糖苷大部分转化为苷元，且Glyceollins 得到了最大富集；通过碱溶酸沉所提取得到的大豆蛋白中蛋白得率多56. 13%，糖苷含量 降低，苷元及Glyceollins含量显著增加。
[0019] 相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
[0020] 1)现有技术多采用外源添加异黄酮及其转化酶等技术实现异黄酮的生物转化和 异黄酮在大豆蛋白中的富集，存在需要用有机溶剂以及乳化剂等不安全因素；本发明通过 微生物转化技术生产富含植物抗毒素的功能蛋白配料，不仅能克服大豆分离蛋白未形成生 产能力的局限，而且工艺条件温和，不需要加入有机溶剂和乳化剂等化学成分，安全性好。
[0021] 2)本发明以高异黄酮大豆种子为主要原料，通过利用具有较高生物转化活性的米 曲霉对大豆进行侵染，在固体发酵过程中实现糖苷型异黄酮向具有更高生物活性的苷元型 异黄酮及Glyceollins的转化和积累，明确大豆种子固体发酵工艺，实现Glyceollins的积 累。
[0022] 3)本发明利用生物转化理念获得具有良好生物适用性的高苷元型异黄酮及 Glyceollins功能性大豆豆粉及蛋白配料，建立低成本的大豆加工新技术，开发功能性保健 食品。
【附图说明】
[0023] 图1为六种大豆异黄酮混标的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0024] 为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的发明，但实施 例不构成对本发明保护范围的限定。
[0025] 本发明中蛋白含量采用GB/T5009. 5 - 03凯氏定氮法测定，用于计算蛋白提取率。
[0026] 本发明获得的豆粉及蛋白样品中异黄酮含量采用液相色谱法测定，液相色谱测定 条件及计算方法参考国标GB/T23788 -2009,其中，Glyceollins(Glys)的含量以大豆苷元 标品进行当量计算，单位为大豆素/豆粉（mgDE/kgDW)。
[0027] 实施例1
[0028] 未损伤组：取6g大豆种子，用70%的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后 用无菌水25°C浸泡12h，去皮。将1. 5mL孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107个）加入大 豆中，用无菌勺子混匀。将已染菌的大豆置于培养皿中，每皿25 - 30瓣，封口膜密封，25°C 暗箱培养，所得发酵豆子冻干备用。
[0029] 损伤组：取大豆种子，用70 %的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后用无 菌水25°C浸泡12h，去皮，并用手术刀在豆子表面各划3次进行损伤处理。
[0030] 将1.5mL孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107)加入损伤后的大豆中，用无菌勺 子混匀。将已染菌的6g大豆置于培养皿中，每皿25 -30瓣，封口膜密封，25°C暗箱培养3d， 所得发酵豆子冻干、粉碎、备用。以未接种大豆种子（〇)作为空白对照。
[0031] 获得的豆粉样品（损伤组和未损伤组）中异黄酮含量采用液相色谱法测定，液相 色谱测定条件及计算方法参考国标GB/T23788 - 2009,具体是根据附图1中3种糖苷型和 3种苷元型异黄酮的出峰时间，结合国标GB/T23788 -2009,对实施例1中各种样品中6种 异黄酮及Glyceollins的含量进行计算，其中，Glyceollins(Glys)的含量以大豆苷元标品 进行当量计算，单位为大豆素/豆粉（mgDE/kgDW)，经计算，测试结果如表1。
[0032] 表1实施例1中的苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW)变化
[0033] CN104905162A 说明书 4/7 页
[0034] 由表1可知，损伤处理组中的总异黄酮糖苷和总苷元含量分别为224. 67mg/kg 和892. 51mg/kg，而未损伤处理组中总异黄酮糖苷和总苷元含量则分别为852. 96mg/kg 和309. 05mg/kg，损伤对发酵大豆中Glyceollins的生成量有显著的影响，损伤处理的发 酵大豆中Glyceollins的含量是未损伤发酵大豆中的4倍。损伤作为大豆中苷元转化 为植物抗毒素的诱导子之一，由于菌种等因素的影响，其与微生物诱导子结合对发酵生成 Glyceollins的研宄结果不同，在米曲霉侵染的条件下，损伤不仅能促进大豆中异黄酮糖苷 转化为苷元，还能大大促进Glyceollins的积累。
[0035] 实施例2
[0036] 取6g大豆种子，用质量浓度70%的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后 用无菌水25°C浸泡12h，去皮，损伤。将1.5mL孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107个） 加入损伤后的大豆中，用无菌勺子混匀。将已染菌的大豆置于培养皿中，每皿25 -30瓣，封 口膜密封，25°C暗箱分别培养0d、ld、3d、5d，所得发酵豆子冻干、粉碎、备用。以未接种大豆 (〇)作为空白对照。测试方法同实施例1，测试结果见表2。
[0037] 表2实施例2中的苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW)变化
[ 0038]
[0039] 经计算，由实施例2中的结果可知，以大豆为原料，当菌接种量（107个）等条件一 定时，分别将已侵染米曲霉的大豆进行培养，制备得到不同发酵时间的发酵豆粉。由表2可 知，在每克豆子孢子数为1〇 7个的条件下，随着发酵时间的增长，异黄酮糖苷和苷元含量持 续降低，Glyceollins的含量则不断增加，而发酵5天后所得的豆粉中苷元型异黄酮含量升 高，Glyceollins含量则减少。这是由于随着发酵时间的增长，大豆中的糖苷在微生物及损 伤的刺激下应激转化游离态苷元，苷元则进一步转化为具有更高生物活性的Glyceollins， 当发酵时间达到5天时，由于大豆中营养物质的减少及米曲霉生长的需要，大豆中苷元型 异黄酮得到积累而Glyceollins则被分解为分子量更小的物质。由此可知，3d为豆粉积累 最大量植物抗毒素的最佳时间。
[0040] 实施例3 :
[0041] 取6g大豆种子，用70%的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后用无菌水 25°C浸泡12h，去皮，损伤。分别按每克豆子接种孢子数为107个、10 8个和10 9个的孢子悬 浮液（1.5mL)加入损伤后的大豆中，用无菌勺子混匀。将已染菌的大豆置于培养皿中，每皿 25 -30瓣，封口膜密封，25°C暗箱分别培养3d，所得发酵豆子冻干、粉碎、备用。以未接种大 豆（〇)作为空白对照。测试方法同实施例1，测试结果见表3。
[0042] 表3实施例3中的苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW)变化
[0043]
[0044] 以高异黄酮大豆为原料，当培养时间等条件一定时，分别将孢子数为10 7、108、109 个的菌接种到已经过处理的大豆中，制备得到不同孢子浓度所得发酵豆粉乙醇提取液进行 HPLC定量，所得的菌接种量对发酵大豆中苷元及Glyceollins含量的影响结果如表3所示。 随着菌接种量的增加，发酵豆粉中苷元含量先增加后降低，而Glyceollins含量持续降低， 且在菌接种量为1〇7个时，Glyceollins的生成量达到最大值，这可能是因为菌接种量的增 加，促进了糖苷型异黄酮向苷元型异黄酮转化，而苷元性异黄酮的较快积累则抑制了苷元 进一步转化Glyceollins的反应。因此，菌接种量为107个发酵最佳菌侵染浓度。
[0045] 实施例4 :
[0046] 取6g大豆种子，用70%的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后用无菌水 25°C浸泡12h，去皮，损伤。将1. 5mL的孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107个）加入损伤 后的大豆中，用无菌勺子混匀。将已染菌的大豆置于培养皿中，每皿25 -30瓣，封口膜密封， 25°C暗箱培养0(1、1(1、3(1、5(1，所得发酵豆子冻干、粉碎，将粉碎所得的豆粉用正己烷脱脂，得 到富含大豆抗毒素的脱脂豆粉；
[0047] 脱脂豆粉过60目筛，将3g的脱脂豆粉按1:10的料液比（质量体积比，质量单位g， 体积单位mL)分散于去离子水中，用2.Omol/L氢氧化钠调节料液的pH值至8. 0,室温搅拌 60min后8000rpm/min离心20min，收集上清液。将上清液用2. 0mol/L盐酸调pH至4. 5,静 置30min后，以6000rpm/min离心10min，所得沉淀用湿重7~10倍去离子水重新分散，调节 其pH至中性后，即得富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白。以未接种大豆所提取得到的蛋白 作为空白对照（0)。获得的大豆蛋白样品（不同发酵天数）中异黄酮含量采用液相色谱法测 定，液相色谱测定条件及计算方法参考国标GB/T23788 - 2009,其中，Glyceollins(Glys) 的含量以大豆苷元标品进行当量计算，单位为大豆素/豆粉（mgDE/kgDW)，测试方法同实 施例1，测试结果如表4。
[0048] 表4实施例4中的不同天数蛋白苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW) 变化
[0049]
[0050] 对实施例4中不同发酵天数所提取得到的蛋白的得率、糖苷、苷元及Glyceollins 的含量进行计算，所得的结果如表4所示，由表4可知，利用碱溶酸沉所提取得到的蛋白 含量均超过56. 13%，与实施例2相比较可知，所提取得到的蛋白中糖苷含量明显降低， 苷元及Glyceollins含量明显增加，其中以Glyceollins的含量增加最为显著，这可能 是由于大部分苷元及Glyceollins的疏水性较强，其水溶性均较差，因此，在提取过程 中，苷元及Glyceol1ins与大豆蛋白质发生了强的疏水相互作用，从而使得蛋白中苷元及 Glyceollins得到了大幅度的富集。
[0051] 实施例5:
[0052] 取6g大豆种子，用70%的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后用无菌水 25°C浸泡12h，去皮，进行未损伤（NH)和损伤（H)处理。
[0053] 将1.5mL的孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107个）加入损伤后的大豆中，用无 菌勺子混匀。将已染菌的大豆置于培养皿中，每皿25 -30瓣，封口膜密封，25°C暗箱培养3d， 所得发酵豆子冻干、粉碎，将粉碎所得的豆粉用正己烷脱脂，得到富含大豆抗毒素的脱脂豆 粉；
[0054] 脱脂豆粉过60目筛，将3g的脱脂豆粉按1:10的料液比（质量体积比，质量单位 g，体积单位mL)分散于去离子水中，用2. 0mol/L氢氧化钠调节料液的pH值至8. 0,室温搅 拌60min后8000rpm/min离心20min，收集上清液。将上清液用2. 0mol/L盐酸调pH至4. 5， 静置30min后，以6000rpm/min离心10min，所得沉淀用湿重7~10倍去离子水重新分散， 调节其pH至中性后，即得富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白。以未接种大豆所提取得到的 蛋白作为空白对照（0)。
[0055] 获得的大豆蛋白样品（损伤组和未损伤组）中异黄酮含量采用液相色谱法测定， 液相色谱测定条件及计算方法参考国标GB/T23788 -2009,其中，Glyceollins(Glys)的含 量以大豆苷元标品进行当量计算，单位为大豆素/豆粉（mgDE/kgDW)，测试方法同实施例 1，测试结果如表5。
[0056] 表5实施例5中的损伤处理对蛋白苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW) 变化
[0057]
[0058]对实施例5中未经过任何处理的大豆（0)、发酵前未损伤处理所得的发酵豆（NH) 和发酵前进行损伤所得发酵豆（H)中所提取得到的蛋白的得率、糖苷、苷元及Glyceollins 的含量进行计算，所得的结果如表5所示，由表5可知，未经过任何处理的大豆（0)、NH和 H中所提取得到的蛋白得率差别不大，经过发酵所得到的大豆所得到的蛋白中总糖苷含 量明显降低、总苷元含量明显增加，并均伴随着Glyceollins的生成，其中，H中总苷元及 Glyceollins的含量明显高于NH，这是因为损伤作为糖苷转化为苷元、Glyceollins生成 反应的诱导子，能在豆子进行发酵的过程中促进苷元及Glyceollins的积累，并且，苷元及 Glyceollins作为多酚，在蛋白提取过程中，多酚含量越高，蛋白与多酚之间的相互作用越 强，从而积累了苷元及Glyceollins。
【主权项】
1. 一种固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉的方法，其特征在于，将米曲霉孢子悬 浮液接种于已浸泡6~12h，去皮、损伤的大豆中；得到染菌的大豆；将染菌的大豆置于培养 皿中，封口膜密封，20~30°C暗箱中进行固态发酵3~5d，冻干、粉碎，得到富含大豆抗毒素 的豆粉。2. 根据权利要求1所述的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉的方法，其特征在 于，所述曲霉孢子悬浮液按国标SB/T10815 - 1999《孢子数测定法》方法制备。3. 根据权利要求1所述的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉的方法，其特征在 于，所述接种是以个作为孢子数单位，将I. 〇~4.OmL孢子数分别为IXIO7~5X10 7个、 IXIO8~5X108个和IX10 9~5X109个的米曲霉孢子悬浮液分别接种于4~IOg大豆中。4. 一种应用权利要求1 - 3任一项所述方法的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能 性大豆蛋白的方法，其特征在于，将所述富含大豆抗毒素的豆粉用正己烷进行脱脂，即可得 到富含大豆抗毒素的脱脂豆粉； 将所得脱脂豆粉过筛，分别以g和mL作为质量和体积的单位，将脱脂豆粉按1:10~ 1:15的料液比分散于去离子水中，用氢氧化钠调节料液的pH值至8. 0~9. 0,室温搅拌 50~60min，离心后收集上清液；将上清液用盐酸调pH至4. 5~5. 0,静置30~40min后， 离心，所得沉淀用湿重7~10倍去离子水重新分散，调节其pH至中性后，即得富含大豆抗 毒素的功能性大S蛋白。5. 根据权利要求4所述的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白的方法， 其特征在于，所述脱脂是分别以g和mL作为质量和体积的单位，将富含大豆抗毒素的豆粉 与正己烷按照1:10~1:15混合。6. 根据权利要求4所述的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白的方法， 其特征在于，所述盐酸和氢氧化钠的浓度都为I. 0~2.Omol/L。7. 根据权利要求4所述的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白的方法， 其特征在于，所述离心的转速都为6000~8000rpm/min;离心的时间都为10~20min。8. 根据权利要求4所述的固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白的方法， 其特征在于，所述过筛为过60目筛。
【专利摘要】本发明公开了固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉及功能性大豆蛋白的方法。该方法将米曲霉孢子悬浮液接种于已浸泡6～12h，去皮、损伤的大豆中，得到染菌的大豆；将染菌的大豆置于培养皿中，封口膜密封，20～30℃暗箱中进行固态发酵3～5d，冻干、粉碎，得到富含大豆抗毒素的豆粉。将所得富含大豆抗毒素的豆粉用正己烷脱脂，所得脱脂豆粉进行碱溶酸沉，即得富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白。本发明方法豆粉及蛋白达到了富集苷元型异黄酮及Glyceollins的效果，且蛋白得率较高，适合于工业化生产，可作为专用蛋白配料应用于更年期妇女豆粉制品、乳制品和植物蛋白饮料中。
【IPC分类】A23J1/14, A23L1/29, A23L1/20, A23L1/305
【公开号】CN104905162
【申请号】CN201510312809
【发明人】王金梅, 陈燕琼, 杨晓泉, 胡文锋, 苏铧佳, 颜喆
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月9日
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