一种重组水蛭素滴眼液及其制备方法
一种重组水蛭素滴眼液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药领域，具体为一种重组水蛭素滴眼液及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 水蛭素是一类最初从医用水蛭唾液腺中分离得到的由65~66个氨基酸组成的多 肽物质，主要有HV1、HV2、HV3三种同源性很高的异构体（Hirudinvariant)。水輕素可以通 过直接抑制凝血酶的活性而有效地抑制动脉、静脉血栓的形成及弥散性血管内凝血（DIC)， 因此，水蛭素在预防和治疗深度静脉血栓、冠状动脉血栓、以及心绞痛等疾病方面具有极高 的应用价值。
[0003] 目前，国外已有两个重组水輕素产品批准上市：1.Desirudin(商品名： Revasc，瑞士Novartis产品）；2.Lepirudin(商品名：Refludan，英国Pharmion及美 国BerlexLaboratories产品）。两者结构上仅在N-端存在微小差异，Desirudin为 Vall_Val2,而Lepirudin为Leul_Tyr2。Desirudin用于手术时深度静脉血栓（DVT)的预 防与治疗，Lepirudin用于肝素诱导的血小板减少性疾病病人的抗凝治疗。此外，水蛭素在 防治不稳定性心绞痛、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓等方面都具 有巨大的潜在临床应用价值。
[0004] 吴梧桐等（中国发明专利，专利号：03132224.7)药理试验证明重组水蛭素对 D-半乳糖及亚硒酸钠诱导的白内障均具有显著防治效果，其发明的重组水蛭素滴眼液，采 用壳聚糖为增稠剂，主要用于治疗白内障。然而，壳聚糖大分子具有活泼的羟基和氨基，在 一定的条件下，容易发生水解、烷基化、酰基化、羧甲基化、磺化、硝化、卤化、氧化、还原、缩 合和络合等化学反应，并生成各种性质不确定的壳聚糖衍生物。
[0005] 增稠剂大多数以物理增稠的原理来提高药物的生物利用度，且必须达到一定浓度 才可起作用。但是，物理增稠发挥的增效作用比较有限，当粘度达到一定值时，药效就不会 随着粘度的增大而增加。这类增稠剂常用的有：泊洛沙姆、卡波姆、羟丙甲纤维素等。此外， 在这些增稠剂中，有些是牛顿流体，眨眼时会有疼痛感，且对pH和/或温度敏感，另外一 些还有较多的配伍禁忌。例如，泊洛沙姆温度敏感性凝胶，虽然在25°C以上可由液相转变 为半固体，但当回到低温时，半固体凝胶却很难回到液体状态，因此用于大生产其工艺难以 控制。另外，卡波姆凝胶由于盐类电解质可使其粘性下降，碱土金属离子以及阳离子聚合 物等也可与之结合成不溶性的盐，强酸也可以使其失去粘性，因此，卡波姆有较多的配伍禁 忌。羟丙甲纤维素等纤维素衍生物、聚乙烯醇以及聚乙烯吡咯烷酮等作为滴眼液的增稠剂， 其缺点主要是它们属于牛顿流体，粘度随浓度的增大而提高但不受切变力（如眨眼时的切 变力）的影响，有时为了产生明显的增稠作用，必须添加其至一定浓度，然而当粘度达到一 定的程度时，会使眼睑不易眨动且对敏感的眼组织产生刺激，令使用者难以耐受。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种重组水蛭素滴眼液及其制备方法，该滴眼液一方面可 以使重组水蛭素长时间滞留病灶区，又不会对敏感的眼组织产生刺激作用，同时还可以保 证重组水蛭素滴眼液的储存稳定性。
[0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 本发明的可防治白内障的重组水蛭素滴眼液，以重组水蛭素为有效成分，透明质酸钠 为增稠剂，还含有等渗调节剂、金属络合剂、防腐剂以及药学上可接受的载体；滴眼液中透 明质酸钠、重组水蛭素、等渗调节剂、金属络合物和防腐剂的质量比为10:2:15. 27:50:3。
[0008] 优选的，所述的等渗调节剂选自氯化钠、硼酸盐缓冲液或者磷酸盐缓冲液中的一 种或几种。
[0009] 优选的，所述的缓冲溶液的pH值为7. 4。
[0010] 优选的，所述的金属络合剂为乙二胺四乙酸二钠。
[0011] 优选的，所述的防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙 酯、苯扎溴铵或硫柳汞中的一种或几种。
[0012] 进一步，所述的药学上可接受的载体是注射用水。
[0013] 本发明还提供一种可防治白内障的滴眼液的制备方法为：将透明质酸钠、等渗调 节剂、金属络合剂和防腐剂溶解于药学上可接受的载体制成滴眼液空白基质，然后将重组 水蛭素溶解于该滴眼液空白基质中，混匀、过滤、除菌分装，制得重组水蛭素滴眼液。
[0014] 本发明的有效成分水蛭素，是相对分子质量为7000的大分子物质，必须借助促吸 收剂的作用才能较好的被眼黏膜吸收。乙二胺四乙酸二钠和壳聚糖作为促吸收剂有较强的 溶细胞能力，且对眼无直接刺激作用，同时乙二胺四乙酸二钠还可螯合溶液中的金属离子， 起到稳定蛋白的作用。重组水蛭素滴眼液通过提高SOD活力，降低MDA含量，减轻氧自由基 对晶状体细胞的损伤而发挥其对白内障的治疗作用。
[0015] 本发明所述的透明质酸钠（SH)为增稠剂，透明质酸钠是透明质酸（HA)的钠盐形 式。透明质酸又称玻璃酸，是以N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸为双糖重复单元构成的粘 多糖类物质，通常以其钠盐形式存在，平均分子量可以是60~280万。不同分子量的透明 质酸钠粘度不同，因此其用途也不同。本发明所述透明质酸钠的分子量大约是130万，属于 滴眼液级别。透明质酸钠广泛存在于动物组织细胞间质和眼玻璃体中，主要的生理功能是 保持组织水分和润滑作用等。透明质酸钠不仅具有卡波姆、泊洛沙姆、羟丙甲纤维素、壳聚 糖等高分子粘性物质的优点，还具有良好的生物相容性，在增加药物黏度的同时，克服了眼 睑不易眨动的缺点，使其成为滴眼液的良好载体。透明质酸钠还能降低滴眼剂中防腐剂的 不良反应。正常情况下，使用含有透明质酸钠的滴眼液时，眼表自然存在的透明质酸钠形成 一层膜覆盖于角膜上皮表面，角膜上皮具有与透明质酸钠特异性结合位点，所以含透明质 酸钠的药物可以长时间存留于眼表，有利于眼组织对药物长久有效的吸收。因此，透明质酸 钠生物相容性极好，不但可以增粘，而且可以保湿，从而能在改善视力的同时保持眼部较长 时间的湿润，对改善视力起到了辅助作用。
[0016] 水蛭素是一种非常稳定的蛋白质，温度的升高和pH的改变不影响其活力，本滴液 制剂添加金属络合剂和防腐剂剂，抑制了可能存在的金属离子对蛋白稳定性的影响和细菌 对蛋白的降解作用。因此本滴眼液表现出相对稳定的性质，可保存一年而未见活力损失。
[0017] 本发明的重组水蛭素滴眼液的制备方法十分简单，可以采用常规的滴眼液生产工 艺生产，简单物理混合即可。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
[0019] 实施例1 本发明滴眼液的配方： 重组水輕素 0. 02g 透明质酸钠 〇.Ig 硼砂 0. 19g 氯化钠 0. 22g 乙二胺四乙酸二钠 0. 5g 对羟基苯甲酸甲醋 0. 03g 注射用水定容至 100mL 制备工艺： 1.在60-80°C的水浴条件下，快速搅拌并缓缓将0.Ig透明质酸钠加入到70ml注射用 水中，使其完全分散，充分溶胀，勿使粘结成团，搅拌30分钟左右即可完全溶解。
[0020] 2.分别将硼砂、氯化钠、乙二胺四乙酸钠和对羟基苯甲酸甲酯加入到上述透明质 酸钠溶液中，搅匀溶解，然后定容至l〇〇ml，即得pH7. 0的滴眼液空白基质。
[0021] 3.将重组水蛭素加入到上述滴眼液空白基质中，搅匀溶解，通过0. 22um滤器过 滤除菌，然后分装，即得重组水蛭素滴眼液。
[0022] 实施例2 本发明滴眼液的配方： 重组水輕素 0. 02g 透明质酸钠 〇.Ig 硼砂 I. 5g 乙二胺四乙酸二钠 0. 5g 对羟基苯甲酸乙酯 0.03g 注射用水定容至 100mL 制备工艺： 1.在60-80°C的水浴条件下，快速搅拌并缓缓将0.Ig透明质酸钠加入到70ml注 射用 水中，使其完全分散，充分溶胀，勿使粘结成团，搅拌30分钟左右即可完全溶解。
[0023] 2.分别将硼砂、乙二胺四乙酸钠和对羟基苯甲酸乙酯加入到上述透明质酸钠溶液 中，搅匀溶解，然后定容至l〇〇ml，即得pH7. 1的滴眼液空白基质。
[0024] 3.将重组水蛭素加入到上述滴眼液空白基质中，搅匀溶解，通过0. 22um滤器过 滤除菌，然后分装，即得重组水蛭素滴眼液。
[0025] 实施例3 本发明滴眼液的配方： 重组水輕素 0. 02g 透明质酸钠 〇.Ig 磷酸盐缓冲液 I.Og 氯化钠 0.5g 乙二胺四乙酸二钠 0. 5g 苯扎溴铵 0. 03g 注射用水定容至 100mL 制备工艺： 1.在60-80°C的水浴条件下，快速搅拌并缓缓将0.Ig透明质酸钠加入到70ml注射用 水中，使其完全分散，充分溶胀，勿使粘结成团，搅拌30分钟左右即可完全溶解。
[0026] 2.分别将磷酸、氯化钠、乙二胺四乙酸钠和苯扎溴铵加入到上述透明质酸钠溶液 中，搅匀溶解，然后定容至l〇〇ml，即得pH7.2的滴眼液空白基质。
[0027] 3.将重组水蛭素加入到上述滴眼液空白基质中，搅匀溶解，通过0. 22um滤器过 滤除菌，然后分装，即得重组水蛭素滴眼液。
[0028] 实施例4 本发明滴眼液的配方： 重组水輕素 0. 02g 透明质酸钠 〇.Ig 磷酸 l.〇g 硼砂 0.5g 乙二胺四乙酸二钠 0. 5g 苯扎溴铵 0. 02g 硫柳汞 0.Olg 注射用水定容至 100mL 制备工艺： 1.在60-80°C的水浴条件下，快速搅拌并缓缓将0.Ig透明质酸钠加入到70ml注射用 水中，使其完全分散，充分溶胀，勿使粘结成团，搅拌30分钟左右即可完全溶解。
[0029] 2.分别将磷酸、硼砂、乙二胺四乙酸钠和苯扎溴铵加入到上述透明质酸钠溶液中， 搅匀溶解，然后定容至l〇〇ml，即得pH7. 4的滴眼液空白基质。
[0030] 3.将重组水蛭素加入到上述滴眼液空白基质中，搅匀溶解，通过0. 22um滤器过 滤除菌，然后分装，即得重组水蛭素滴眼液。
[0031] 实施例5 兔眼刺激实验 将实施例1~4中重组水蛭素滴眼液按照新药临床前指导原则方法进行刺激性考察，选 择健康新西兰兔8只，分为4组，左眼每日给本发明实施例1~4重组水蛭素滴眼液5次，右 眼分别给生理盐水做空白对照，在l，24,48,72h进行眼部检查，观察结膜、角膜、虹膜及其 他可见损伤，连续观察7d，根据眼刺激反应分值标准记录眼部反应的分值（结果见表1)。
[0032] 表1各个观察时间各组眼睛最后得分
由表1可知，重组水蛭素滴眼液给药一侧眼睛眼角膜、虹膜和结膜未出现刺激性，与对 照一侧眼睛一样，由此证明重组水蛭素III滴眼液无眼刺激性。
[0033] 实施例6 稳定性实验 重组水蛭素滴眼液测定抗凝活力后，分别置于4°C冰箱及室温，在放置1，2,4周和3,6， 12个月后，其抗凝活力及pH值没有变化，外观形状、澄明度及无菌检查均符合中华人民共 和国药典（二部）附录IIIA对滴眼液的要求。
[0034] 实施例7 药效学实验对D-半乳糖诱导的白内障大鼠的治疗作用 实验药物：实施例1~4中的重组水蛭素滴眼液 实验动物：SD大鼠，雌雄各半，130±20g 实验方法和结果： I.SD大鼠白内障模型建立 取42只SD大鼠随机分成7组，每组均为6只（雌雄各半），分别为正常对照组、模型 对照组、白内停对照组和重组水蛭素滴眼液（2000ATU/ml)组。除正常对照组外，其它组SD 大鼠均腹腔注射〇. 08%的D-半乳糖溶液25mL/kg，相当于20mg/kg，每日分2次给药，上下 午各1次，连续给14d，并饮用10%D-半乳糖溶液，正常对照组按同样方式腹腔注射同体积 的生理盐水。造模成功后，各组分别双眼点滴给药，各组给药容积均为IOOuL/只/次，每日 分3次给药，连续30天。
[0035] 2.重组水蛭素III滴眼液对白内障大鼠的治疗作用 给药30天后，使用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，用裂隙灯显微镜定期观察大鼠晶状体的 混浊程度，观察后记录结果。晶状体混浊程度按表3标准分别赋予不同分值，进行组间t检 验。模型组大鼠未经药物治疗，随着时间的延长其晶状体的混浊程度越来越高。重组水蛭 素滴眼液组与模型组晶状体混浊程度相比，有极显著差异（P< 0. 01)，表明重组水蛭素滴 眼液可显著缓解晶状体混浊（见表2)。
[0036] 表2 rHVIII滴眼液对SD大鼠晶状体混浊程度的影响（n= 6)
注A:无浑池；B:轻微浑池；C:中等浑池；D:严重浑池；vs模型组，*p< 0. 05,**p < 0.Olo
[0037] 给药30天后，将大鼠处死取眼球，分离出晶状体。分别检测大鼠晶状体SOD活性、 MDA含量和AR活性。与模型组比较，白内停对照组和重组水蛭素滴眼液组均能极显著升高SOD活性（p< 0.01)以及极显著降低MDA含量（p< 0.01)，并且能显著降低AR活性 (见表3)。
[0038] 表3重组水蛭素III滴眼液对SD大鼠晶状体SOD活性、MDA含量及AR活性的 影响（n= 6)
注：vs模型组，*p< 0? 05,#p< 0? 01。
[0039] 实验结论： 重组水蛭素滴眼液能明显减轻晶状体混浊度，缓解半乳糖性白内障症状的发展，并且 能增大SOD活性，降低MDA含量，降低AR活性，显著改善大鼠半乳糖性白内障严重程度。
【主权项】
1. 一种重组水蛭素滴眼液，其特征在于：以重组水蛭素为有效成分，透明质酸钠为增 稠剂，还含有等渗调节剂、金属络合剂、防腐剂以及药学上可接受的载体；滴眼液中透明质 酸钠、重组水蛭素、等渗调节剂、金属络合物和防腐剂的质量比为10:2:15. 27:50:3。2. 根据权利要求1所述的滴眼液，其特征在于：所述的等渗调节剂选自氯化钠、硼酸 盐缓冲液或者磷酸盐缓冲液中的一种或几种。3. 根据权利要求2所述的滴眼液，其特征在于：所述的缓冲溶液的pH值为4. 0~7. 5。4. 根据权利要求1所述的滴眼液，其特征在于：所述的金属络合剂为乙二胺四乙酸二 钠。5. 根据权利要求1所述的滴眼液，其特征在于：所述的防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯、对 羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯扎溴铵或硫柳汞中的一种或几种。6. 根据权利要求1所述的滴眼液，其特征在于：所述的药学上可接受的载体是注射用7. 根据权利要求1所述滴眼液，其特征在于，其制备方法为：将透明质酸钠、等渗调节 剂、金属络合剂和防腐剂溶解于药学上可接受的载体制成滴眼液空白基质，然后将重组水 蛭素溶解于该滴眼液空白基质中，混匀、过滤、除菌分装，制得重组水蛭素滴眼液。
【专利摘要】本发明公开一种重组水蛭素滴眼液，以重组水蛭素为有效成分，透明质酸钠为增稠剂，还含有等渗调节剂、金属络合剂、防腐剂以及药学上可接受的载体；滴眼液中透明质酸钠、重组水蛭素、等渗调节剂、金属络合物和防腐剂的质量比为10:2:15.27:50:3。其制备方法为将透明质酸钠、等渗调节剂、金属络合剂和防腐剂溶解于药学上可接受的载体制成滴眼液空白基质，然后将重组水蛭素溶解于该滴眼液空白基质中，混匀、过滤、除菌分装，制得重组水蛭素滴眼液。本发明的滴眼液一方面可以使重组水蛭素长时间滞留病灶区，又不会对敏感的眼组织产生刺激作用，同时还可以保证重组水蛭素滴眼液的储存稳定性。
【IPC分类】A61K9/08, A61K47/36, A61K47/16, A61K38/58, A61P27/12
【公开号】CN104906037
【申请号】CN201510345194
【发明人】谢海林
【申请人】广西复鑫益生物科技有限公司平南分公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月23日
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药领域，具体为一种重组水蛭素滴眼液及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 水蛭素是一类最初从医用水蛭唾液腺中分离得到的由65~66个氨基酸组成的多 肽物质，主要有HV1、HV2、HV3三种同源性很高的异构体（Hirudinvariant)。水輕素可以通 过直接抑制凝血酶的活性而有效地抑制动脉、静脉血栓的形成及弥散性血管内凝血（DIC)， 因此，水蛭素在预防和治疗深度静脉血栓、冠状动脉血栓、以及心绞痛等疾病方面具有极高 的应用价值。
[0003] 目前，国外已有两个重组水輕素产品批准上市：1.Desirudin(商品名： Revasc，瑞士Novartis产品）；2.Lepirudin(商品名：Refludan，英国Pharmion及美 国BerlexLaboratories产品）。两者结构上仅在N-端存在微小差异，Desirudin为 Vall_Val2,而Lepirudin为Leul_Tyr2。Desirudin用于手术时深度静脉血栓（DVT)的预 防与治疗，Lepirudin用于肝素诱导的血小板减少性疾病病人的抗凝治疗。此外，水蛭素在 防治不稳定性心绞痛、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓等方面都具 有巨大的潜在临床应用价值。
[0004] 吴梧桐等（中国发明专利，专利号：03132224.7)药理试验证明重组水蛭素对 D-半乳糖及亚硒酸钠诱导的白内障均具有显著防治效果，其发明的重组水蛭素滴眼液，采 用壳聚糖为增稠剂，主要用于治疗白内障。然而，壳聚糖大分子具有活泼的羟基和氨基，在 一定的条件下，容易发生水解、烷基化、酰基化、羧甲基化、磺化、硝化、卤化、氧化、还原、缩 合和络合等化学反应，并生成各种性质不确定的壳聚糖衍生物。
[0005] 增稠剂大多数以物理增稠的原理来提高药物的生物利用度，且必须达到一定浓度 才可起作用。但是，物理增稠发挥的增效作用比较有限，当粘度达到一定值时，药效就不会 随着粘度的增大而增加。这类增稠剂常用的有：泊洛沙姆、卡波姆、羟丙甲纤维素等。此外， 在这些增稠剂中，有些是牛顿流体，眨眼时会有疼痛感，且对pH和/或温度敏感，另外一 些还有较多的配伍禁忌。例如，泊洛沙姆温度敏感性凝胶，虽然在25°C以上可由液相转变 为半固体，但当回到低温时，半固体凝胶却很难回到液体状态，因此用于大生产其工艺难以 控制。另外，卡波姆凝胶由于盐类电解质可使其粘性下降，碱土金属离子以及阳离子聚合 物等也可与之结合成不溶性的盐，强酸也可以使其失去粘性，因此，卡波姆有较多的配伍禁 忌。羟丙甲纤维素等纤维素衍生物、聚乙烯醇以及聚乙烯吡咯烷酮等作为滴眼液的增稠剂， 其缺点主要是它们属于牛顿流体，粘度随浓度的增大而提高但不受切变力（如眨眼时的切 变力）的影响，有时为了产生明显的增稠作用，必须添加其至一定浓度，然而当粘度达到一 定的程度时，会使眼睑不易眨动且对敏感的眼组织产生刺激，令使用者难以耐受。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种重组水蛭素滴眼液及其制备方法，该滴眼液一方面可 以使重组水蛭素长时间滞留病灶区，又不会对敏感的眼组织产生刺激作用，同时还可以保 证重组水蛭素滴眼液的储存稳定性。
[0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 本发明的可防治白内障的重组水蛭素滴眼液，以重组水蛭素为有效成分，透明质酸钠 为增稠剂，还含有等渗调节剂、金属络合剂、防腐剂以及药学上可接受的载体；滴眼液中透 明质酸钠、重组水蛭素、等渗调节剂、金属络合物和防腐剂的质量比为10:2:15. 27:50:3。
[0008] 优选的，所述的等渗调节剂选自氯化钠、硼酸盐缓冲液或者磷酸盐缓冲液中的一 种或几种。
[0009] 优选的，所述的缓冲溶液的pH值为7. 4。
[0010] 优选的，所述的金属络合剂为乙二胺四乙酸二钠。
[0011] 优选的，所述的防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙 酯、苯扎溴铵或硫柳汞中的一种或几种。
[0012] 进一步，所述的药学上可接受的载体是注射用水。
[0013] 本发明还提供一种可防治白内障的滴眼液的制备方法为：将透明质酸钠、等渗调 节剂、金属络合剂和防腐剂溶解于药学上可接受的载体制成滴眼液空白基质，然后将重组 水蛭素溶解于该滴眼液空白基质中，混匀、过滤、除菌分装，制得重组水蛭素滴眼液。
[0014] 本发明的有效成分水蛭素，是相对分子质量为7000的大分子物质，必须借助促吸 收剂的作用才能较好的被眼黏膜吸收。乙二胺四乙酸二钠和壳聚糖作为促吸收剂有较强的 溶细胞能力，且对眼无直接刺激作用，同时乙二胺四乙酸二钠还可螯合溶液中的金属离子， 起到稳定蛋白的作用。重组水蛭素滴眼液通过提高SOD活力，降低MDA含量，减轻氧自由基 对晶状体细胞的损伤而发挥其对白内障的治疗作用。
[0015] 本发明所述的透明质酸钠（SH)为增稠剂，透明质酸钠是透明质酸（HA)的钠盐形 式。透明质酸又称玻璃酸，是以N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸为双糖重复单元构成的粘 多糖类物质，通常以其钠盐形式存在，平均分子量可以是60~280万。不同分子量的透明 质酸钠粘度不同，因此其用途也不同。本发明所述透明质酸钠的分子量大约是130万，属于 滴眼液级别。透明质酸钠广泛存在于动物组织细胞间质和眼玻璃体中，主要的生理功能是 保持组织水分和润滑作用等。透明质酸钠不仅具有卡波姆、泊洛沙姆、羟丙甲纤维素、壳聚 糖等高分子粘性物质的优点，还具有良好的生物相容性，在增加药物黏度的同时，克服了眼 睑不易眨动的缺点，使其成为滴眼液的良好载体。透明质酸钠还能降低滴眼剂中防腐剂的 不良反应。正常情况下，使用含有透明质酸钠的滴眼液时，眼表自然存在的透明质酸钠形成 一层膜覆盖于角膜上皮表面，角膜上皮具有与透明质酸钠特异性结合位点，所以含透明质 酸钠的药物可以长时间存留于眼表，有利于眼组织对药物长久有效的吸收。因此，透明质酸 钠生物相容性极好，不但可以增粘，而且可以保湿，从而能在改善视力的同时保持眼部较长 时间的湿润，对改善视力起到了辅助作用。
[0016] 水蛭素是一种非常稳定的蛋白质，温度的升高和pH的改变不影响其活力，本滴液 制剂添加金属络合剂和防腐剂剂，抑制了可能存在的金属离子对蛋白稳定性的影响和细菌 对蛋白的降解作用。因此本滴眼液表现出相对稳定的性质，可保存一年而未见活力损失。
[0017] 本发明的重组水蛭素滴眼液的制备方法十分简单，可以采用常规的滴眼液生产工 艺生产，简单物理混合即可。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
[0019] 实施例1 本发明滴眼液的配方： 重组水輕素 0. 02g 透明质酸钠 〇.Ig 硼砂 0. 19g 氯化钠 0. 22g 乙二胺四乙酸二钠 0. 5g 对羟基苯甲酸甲醋 0. 03g 注射用水定容至 100mL 制备工艺： 1.在60-80°C的水浴条件下，快速搅拌并缓缓将0.Ig透明质酸钠加入到70ml注射用 水中，使其完全分散，充分溶胀，勿使粘结成团，搅拌30分钟左右即可完全溶解。
[0020] 2.分别将硼砂、氯化钠、乙二胺四乙酸钠和对羟基苯甲酸甲酯加入到上述透明质 酸钠溶液中，搅匀溶解，然后定容至l〇〇ml，即得pH7. 0的滴眼液空白基质。
[0021] 3.将重组水蛭素加入到上述滴眼液空白基质中，搅匀溶解，通过0. 22um滤器过 滤除菌，然后分装，即得重组水蛭素滴眼液。
[0022] 实施例2 本发明滴眼液的配方： 重组水輕素 0. 02g 透明质酸钠 〇.Ig 硼砂 I. 5g 乙二胺四乙酸二钠 0. 5g 对羟基苯甲酸乙酯 0.03g 注射用水定容至 100mL 制备工艺： 1.在60-80°C的水浴条件下，快速搅拌并缓缓将0.Ig透明质酸钠加入到70ml注 射用 水中，使其完全分散，充分溶胀，勿使粘结成团，搅拌30分钟左右即可完全溶解。
[0023] 2.分别将硼砂、乙二胺四乙酸钠和对羟基苯甲酸乙酯加入到上述透明质酸钠溶液 中，搅匀溶解，然后定容至l〇〇ml，即得pH7. 1的滴眼液空白基质。
[0024] 3.将重组水蛭素加入到上述滴眼液空白基质中，搅匀溶解，通过0. 22um滤器过 滤除菌，然后分装，即得重组水蛭素滴眼液。
[0025] 实施例3 本发明滴眼液的配方： 重组水輕素 0. 02g 透明质酸钠 〇.Ig 磷酸盐缓冲液 I.Og 氯化钠 0.5g 乙二胺四乙酸二钠 0. 5g 苯扎溴铵 0. 03g 注射用水定容至 100mL 制备工艺： 1.在60-80°C的水浴条件下，快速搅拌并缓缓将0.Ig透明质酸钠加入到70ml注射用 水中，使其完全分散，充分溶胀，勿使粘结成团，搅拌30分钟左右即可完全溶解。
[0026] 2.分别将磷酸、氯化钠、乙二胺四乙酸钠和苯扎溴铵加入到上述透明质酸钠溶液 中，搅匀溶解，然后定容至l〇〇ml，即得pH7.2的滴眼液空白基质。
[0027] 3.将重组水蛭素加入到上述滴眼液空白基质中，搅匀溶解，通过0. 22um滤器过 滤除菌，然后分装，即得重组水蛭素滴眼液。
[0028] 实施例4 本发明滴眼液的配方： 重组水輕素 0. 02g 透明质酸钠 〇.Ig 磷酸 l.〇g 硼砂 0.5g 乙二胺四乙酸二钠 0. 5g 苯扎溴铵 0. 02g 硫柳汞 0.Olg 注射用水定容至 100mL 制备工艺： 1.在60-80°C的水浴条件下，快速搅拌并缓缓将0.Ig透明质酸钠加入到70ml注射用 水中，使其完全分散，充分溶胀，勿使粘结成团，搅拌30分钟左右即可完全溶解。
[0029] 2.分别将磷酸、硼砂、乙二胺四乙酸钠和苯扎溴铵加入到上述透明质酸钠溶液中， 搅匀溶解，然后定容至l〇〇ml，即得pH7. 4的滴眼液空白基质。
[0030] 3.将重组水蛭素加入到上述滴眼液空白基质中，搅匀溶解，通过0. 22um滤器过 滤除菌，然后分装，即得重组水蛭素滴眼液。
[0031] 实施例5 兔眼刺激实验 将实施例1~4中重组水蛭素滴眼液按照新药临床前指导原则方法进行刺激性考察，选 择健康新西兰兔8只，分为4组，左眼每日给本发明实施例1~4重组水蛭素滴眼液5次，右 眼分别给生理盐水做空白对照，在l，24,48,72h进行眼部检查，观察结膜、角膜、虹膜及其 他可见损伤，连续观察7d，根据眼刺激反应分值标准记录眼部反应的分值（结果见表1)。
[0032] 表1各个观察时间各组眼睛最后得分
由表1可知，重组水蛭素滴眼液给药一侧眼睛眼角膜、虹膜和结膜未出现刺激性，与对 照一侧眼睛一样，由此证明重组水蛭素III滴眼液无眼刺激性。
[0033] 实施例6 稳定性实验 重组水蛭素滴眼液测定抗凝活力后，分别置于4°C冰箱及室温，在放置1，2,4周和3,6， 12个月后，其抗凝活力及pH值没有变化，外观形状、澄明度及无菌检查均符合中华人民共 和国药典（二部）附录IIIA对滴眼液的要求。
[0034] 实施例7 药效学实验对D-半乳糖诱导的白内障大鼠的治疗作用 实验药物：实施例1~4中的重组水蛭素滴眼液 实验动物：SD大鼠，雌雄各半，130±20g 实验方法和结果： I.SD大鼠白内障模型建立 取42只SD大鼠随机分成7组，每组均为6只（雌雄各半），分别为正常对照组、模型 对照组、白内停对照组和重组水蛭素滴眼液（2000ATU/ml)组。除正常对照组外，其它组SD 大鼠均腹腔注射〇. 08%的D-半乳糖溶液25mL/kg，相当于20mg/kg，每日分2次给药，上下 午各1次，连续给14d，并饮用10%D-半乳糖溶液，正常对照组按同样方式腹腔注射同体积 的生理盐水。造模成功后，各组分别双眼点滴给药，各组给药容积均为IOOuL/只/次，每日 分3次给药，连续30天。
[0035] 2.重组水蛭素III滴眼液对白内障大鼠的治疗作用 给药30天后，使用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，用裂隙灯显微镜定期观察大鼠晶状体的 混浊程度，观察后记录结果。晶状体混浊程度按表3标准分别赋予不同分值，进行组间t检 验。模型组大鼠未经药物治疗，随着时间的延长其晶状体的混浊程度越来越高。重组水蛭 素滴眼液组与模型组晶状体混浊程度相比，有极显著差异（P< 0. 01)，表明重组水蛭素滴 眼液可显著缓解晶状体混浊（见表2)。
[0036] 表2 rHVIII滴眼液对SD大鼠晶状体混浊程度的影响（n= 6)
注A:无浑池；B:轻微浑池；C:中等浑池；D:严重浑池；vs模型组，*p< 0. 05,**p < 0.Olo
[0037] 给药30天后，将大鼠处死取眼球，分离出晶状体。分别检测大鼠晶状体SOD活性、 MDA含量和AR活性。与模型组比较，白内停对照组和重组水蛭素滴眼液组均能极显著升高SOD活性（p< 0.01)以及极显著降低MDA含量（p< 0.01)，并且能显著降低AR活性 (见表3)。
[0038] 表3重组水蛭素III滴眼液对SD大鼠晶状体SOD活性、MDA含量及AR活性的 影响（n= 6)
注：vs模型组，*p< 0? 05,#p< 0? 01。
[0039] 实验结论： 重组水蛭素滴眼液能明显减轻晶状体混浊度，缓解半乳糖性白内障症状的发展，并且 能增大SOD活性，降低MDA含量，降低AR活性，显著改善大鼠半乳糖性白内障严重程度。
【主权项】
1. 一种重组水蛭素滴眼液，其特征在于：以重组水蛭素为有效成分，透明质酸钠为增 稠剂，还含有等渗调节剂、金属络合剂、防腐剂以及药学上可接受的载体；滴眼液中透明质 酸钠、重组水蛭素、等渗调节剂、金属络合物和防腐剂的质量比为10:2:15. 27:50:3。2. 根据权利要求1所述的滴眼液，其特征在于：所述的等渗调节剂选自氯化钠、硼酸 盐缓冲液或者磷酸盐缓冲液中的一种或几种。3. 根据权利要求2所述的滴眼液，其特征在于：所述的缓冲溶液的pH值为4. 0~7. 5。4. 根据权利要求1所述的滴眼液，其特征在于：所述的金属络合剂为乙二胺四乙酸二 钠。5. 根据权利要求1所述的滴眼液，其特征在于：所述的防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯、对 羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯扎溴铵或硫柳汞中的一种或几种。6. 根据权利要求1所述的滴眼液，其特征在于：所述的药学上可接受的载体是注射用7. 根据权利要求1所述滴眼液，其特征在于，其制备方法为：将透明质酸钠、等渗调节 剂、金属络合剂和防腐剂溶解于药学上可接受的载体制成滴眼液空白基质，然后将重组水 蛭素溶解于该滴眼液空白基质中，混匀、过滤、除菌分装，制得重组水蛭素滴眼液。
【专利摘要】本发明公开一种重组水蛭素滴眼液，以重组水蛭素为有效成分，透明质酸钠为增稠剂，还含有等渗调节剂、金属络合剂、防腐剂以及药学上可接受的载体；滴眼液中透明质酸钠、重组水蛭素、等渗调节剂、金属络合物和防腐剂的质量比为10:2:15.27:50:3。其制备方法为将透明质酸钠、等渗调节剂、金属络合剂和防腐剂溶解于药学上可接受的载体制成滴眼液空白基质，然后将重组水蛭素溶解于该滴眼液空白基质中，混匀、过滤、除菌分装，制得重组水蛭素滴眼液。本发明的滴眼液一方面可以使重组水蛭素长时间滞留病灶区，又不会对敏感的眼组织产生刺激作用，同时还可以保证重组水蛭素滴眼液的储存稳定性。
【IPC分类】A61K9/08, A61K47/36, A61K47/16, A61K38/58, A61P27/12
【公开号】CN104906037
【申请号】CN201510345194
【发明人】谢海林
【申请人】广西复鑫益生物科技有限公司平南分公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月23日
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