一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂及其制备方法
一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤 给药制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 急性软组织损伤系指机体受到外来或内在的不同致伤因素的作用，造成运动系 统、皮肤以下骨骼之外的组织所发生的一系列急性挫伤或（和）裂伤，包括肌肉、韧带、筋 膜、肌腱、滑膜、脂肪、关节囊等组织以及周围神经、血管的不同情况的急性损伤。它又可分 为开放性损伤和闭合性损伤两大类：其中开放性损伤在临床上已有较好的治疗手段；而闭 合性损伤较开放性损伤更为多见，包括关节、韧带的扭伤和肌肉、肌腱的拉伤、骨折等，这些 损伤无裂口与外界相通，因此在治疗中口服用药或普通外用制剂皮肤外用后病灶部位的药 物浓度都很低，难以取得理想的疗效。
[0003] 传递体（transfersomes，TFS)亦称柔性脂质体，是一种新型透皮给药载体，主要成 分为磷脂和边缘活化剂(如胆酸钠、去氧胆酸钠等)，具有高度的变形性，可高效透过比自身 小数倍的皮肤孔道而达到透皮给药目的。
[0004] 三七是五加科植物三七（Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)的干燥根及根 莖，是中医传统用于体内外各种出血之证及跌打损伤、瘀滞肿痛的要药。三七总皂苷（Panax notoginsengsaponins，PNS)是其主要有效部位，在临床上PNS广泛用于软组织损伤、骨折 的愈合、骨关节损伤及肢体功能的恢复等。但是，目前PNS的市售剂型主要以口服给药制剂 及静注制剂为主，这对于身体局部软组织损伤的治疗并不是理想的给药途径。
[0005] 故将PNS制成传递体经皮给药制剂可能可以提高PNS在病灶部位的有效浓度，提 高其生物利用度，为急性闭合性软组织损伤的临床治疗提供新方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有制剂的不足，提供一种治疗急性闭合性软组织损伤的新 型皮肤给药制剂，以提高药物生物利用度，缩短治疗周期，并减少药物的毒副作用；本发明 的另一目的在于提供制备上述新型皮肤给药制剂的方法。
[0007] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特征在于由以下 重量份的成分组成： 三七总皂苷60-120份、磷脂120-150份、胆固醇12-20份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油 40-80份、维生素E2-2. 5份、缓冲液10000-15000份，所述的柠檬烯-柠檬醛混合挥发油由 柠檬烯和柠檬醛按照重量比1:4~4:1混合而成，优选为柠檬烯-柠檬醛混合挥发油由柠 檬烯和柠檬醛按照重量比4:1混合而成，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。
[0008] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特征在于由以下 重量份的成分组成： 三七总皂苷80-110份、磷脂120-140份、胆固醇14-16份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油 60-80份、维生素E2-2. 3份、缓冲液10000-12000份。
[0009] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特征在于由以下 重量份的成分组成： 三七总皂苷100份、磷脂120份、胆固醇15份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油80份、维生 素E2份、缓冲液10000份。
[0010] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特征在于所述的 磷酸盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15mol/L磷酸氢二钠溶液按体积比 53. 4:46. 6混合的混合液。
[0011] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备方法，其特征 在于包括以下工艺步骤： 1) 称取配方量的三七总皂苷、磷脂、胆固醇、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油和维生素E，溶 于有机溶剂中，混合均匀，转移至茄形瓶中，减压旋转蒸去有机溶剂，得到干膜； 2) 以缓冲液水化步骤1)得到的干膜，振摇，使脂质膜完全水化，再以超声波细胞粉碎仪 进行超声破碎处理； 3) 将上述超声破碎处理后的样品放置2~3h后，将其置于脂质体挤出仪中，在0. 25 MPa下挤过100nm聚碳酸酯膜，再于0? 49MPa下挤过50nm聚碳酸酯膜，即得治疗急性闭 合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂。
[0012] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备方法，其特征 在于所述的步骤1)中有机溶剂为甲醇、正丁醇、异丙醇、丙酮、乙腈、正己烷和二氯甲烷中的 一种或两种以上的混合液，优选甲醇-二氯甲烷按体积比3:4混合的混合液。
[0013] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备方法，其特征 在于所述的步骤1)中有机溶剂的加入量与磷脂的重量份比的范围为200~417 :1，优选为 292:1〇
[0014] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备方法，其特征 在于所述的步骤1)中减压旋转蒸馏条件45 °C、50r/min。
[0015] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备方法，其特征 在于所述的步骤1)中超声破碎处理条件温度25 °C，功率16W，每次持续5s，重复6次。
[0016] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备方法，其特征 在于所述的步骤2)中磷酸盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15mol/L磷酸 氢二钠溶液按体积比53. 4:46. 6混合的混合液。
[0017] 本发明中三七总皂苷为提取自中药三七的中药有效部位，符合国家药典2010标 准，有市售产品，生产商如云南植物药物有限公司，但是，绝不仅限于此公司。
[0018] 本发明中作为用于形成传递体的磷脂，可以使用天然磷脂和合成磷脂。天然磷 脂包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵 磷脂、蛋黄磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰丝氨酸、蛋黄磷脂酰肌醇、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷 月旨、氢化卵磷脂、卵磷脂酰甘油、卵磷脂酰丝氨酸和卵磷脂酰肌醇等。合成磷脂为二油酰 磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂 酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二 月桂酰磷脂酰甘油和聚乙二醇衍生化磷脂例如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-mPEG2000);二软酯酰胆磷脂-聚乙二醇2000 (DPPG-mPEG2000);氢化大豆磷脂酰胆 碱-聚乙二醇 2000(HSPC-mPEG2000);二油酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇 2000(D0PC-mPEG2000) 等。
[0019] 本发明人经过研宄发现，市售的PC含量为60%~95%的大豆卵磷脂特别适于作为 基础磷脂膜材料包封活性药物成分，从而形成优质的传递体，优选大豆卵磷脂的PC含量为 70% ~80%。
[0020] 本发明中胆固醇起到调节膜流动性的作用，可以提高脂质双分子层膜的稳定性和 药物的包封率。所用胆固醇符合药典2010标准。
[0021] 本发明中选用柠檬烯-柠檬醛混合挥发油作为边缘活化剂，以挥发油作为边缘活 化剂相对于其他表面活性剂类边缘活化剂，使所形成的传递体安全性大大提高，从而使患 者较长期的使用本品成为可能。
[0022] 本发明人经过研宄发现，柠檬烯-柠檬 醛混合挥发油中两者的比例可在1:4~4:1 (W/W)的范围，当混合挥发油的比例为4:1时，所形成的中西药复方传递体弹性最佳，皮肤 渗透性最优。
[0023] 本发明中维生素E作为抗氧化剂，防止磷脂被氧化。
[0024] 研宄发现，本发明通过三七总皂苷、磷脂、胆固醇、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油和 维生素E合理配比，可以制得品质优良的三七总皂苷传递体，其包封率和稳定性良好，毒性 低，生物利用度高，疗效确切。
[0025] 本发明中混合挥发油的加入方式可采用以下三种方法：与磷脂等一同加入，制成 干膜；除挥发油之外的其他成分按薄膜分散制得脂质体，最后通过涡旋混合的方法加入挥 发油；将挥发油溶于少量乙醇后，进而与水化液混溶，最后以所得混合液水化脂质干膜。结 果表明，挥发油与磷脂等一同加入制成干膜进而制得的传递体弹性及包封率较优。
[0026] 通过本发明的方法能制得品质优良的三七总皂苷传递体，其中传递体弹性较大， 药物包封率高，稳定性高，粒径适宜且分布均匀，生物利用度高，疗效确切。
[0027] 研宄发现，传递体的粒径对其皮肤靶向性有较大影响，粒径越小，药物在皮肤中的 滞留量越大；此外，优良的弹性也是提高传递体透皮性能的重要条件。通过本发明方法制备 的三七总皂苷传递体弹性好，粒径小且分布均匀，这是其在靶部位渗透效率高、生物利用度 高、疗效确切的原因之一。
[0028] 功能与主治：具有活血、抗炎和改善血液微循环等功效，作为软组织损伤等多种疾 病的外用药，尤其对于急性闭合性软组织损伤有很好的疗效。
[0029] 用法与用量：外用药，根据损伤面积大小，取适量药物直接涂抹于患处，尽量使用 药部位处于非封闭状态，每日2-3次。
[0030] 注意：皮肤破损或溃疡者慎用。
[0031] 贮藏：密闭，置阴凉、避光处保存。
[0032] 本发明的三七总皂苷传递体在使用时直接涂抹于患处，具有良好的活血、抗炎和 改善血液流变学等作用，对急性闭合性软组织损伤有良好的治疗和修复作用，明显缩短其 治疗周期。
【附图说明】
[0033] 图1为三七总皂苷传递体对模型大鼠组织形态学的影响图； 图中：正常对照组（A);造模24 h后（B) ;PNS传递体试验组（C);阳性对照青鹏软膏组 (D);血塞通胶囊组（E);血塞通注射液组（F);模型对照组（G)。
【具体实施方式】
[0034] 为了帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明，结合实验数据，详细叙述本发 明的【具体实施方式】。但所列举的实施例不以任何方式限制本发明的权利。
[0035] 本发明实施例中所述及的三七总皂苷传递体的粒径及粒径分布、形态、包封率、弹 性等指标的评价方法如下： 1.粒径及其分布评价方法 取上述三七总皂苷传递体用蒸馏水适当稀释，采用激光粒度仪测定传递体的粒径及其 分布情况。
[0036] 2?形态观察 取上述三七总皂苷传递体适量，用水稀释，滴到铜网上，用1%磷钨酸溶液负染，滤纸吸 取多余染色液，干燥后用透射电子显微镜观察。
[0037] 3?包封率的测定方法 采用离心超滤法进行测定。取待测传递体样品，摇匀，取少量进行光学显微镜观察， 确认其中不含药物结晶后精密量取200yL，置于超滤离心管内（超滤膜的截留分子量为 100000Da)，进行冷冻离心(相对离心力：14000g，温度：4 °C)，收集全部外水相，转移至合 适体积的量瓶中，以流动相定容，摇匀，以三七总皂苷中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1S指标， 以HPLC法测定传递体外水相中各指标成分含量，另外，以HPLC法测定传递体样品中各指标 成分含量，按下式计算包封率： EE= (Ws-Wea) /WsX100% 式中崩为包封率；为取样量中人参皂苷Rgi或人参皂苷Rbi的含量（mg) ; 为外水 相中人参皂苷Rg1或人参皂苷Rbi的含量（mg)。
[0038] 4?弹性的测定方法 精密量取10 mL传递体，置于脂质体挤出仪中，挤过50 nm聚碳酸酯膜，压力为0.49 MPa，将样品全部挤出所用时间记为其弹性。（本法参考文献：Zaafarany G. M.E.，Avad G. A. S. , Holayel S. M. et al. Role of egde activators and surface charge in developing ultradeformable vesicles with enhanced skin delivery [J]. Int J Pharm, 2010,397 (1-2):164-172.) 实施例I 三七总皂苷传递体由以下重量份成分组成： 三七总皂苷 100份 大豆卵磷脂 120份 胆固醇 15份 朽1檬稀-朽1檬醛混合挥发油（4:1，W/W) 80份 维生素E 2份 磷酸盐缓冲液 10000份 主要组成成分的规格与来源：三七总皂苷(符合国家药典2010标准)，云南植物药物有 限公司；大豆卵磷脂（PC含量为80%，注射级)，上海太伟药业有限公司；胆固醇(符合国家药 典2010标准)，南京新百药业有限公司；柠檬烯、柠檬醛(符合国家药典2010标准）吉安市 聚鹏天然香料油有限公司；维生素E(符合国家药典2010标准)浙江新和成股份有限公司； 磷酸盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15mol/L磷酸氢二钠溶液按体积比 53. 4:46. 6混合的混合液。
[0039] 三七总皂苷传递体的制备方法为： 采用薄膜分散法来进行制备，该方法包括以下步骤： (a)称取配方量的三七总皂苷、大豆卵磷脂、胆固醇、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油和维 生素E，溶于有机溶剂(有机溶剂为甲醇-二氯甲烷按体积比3:4混合的混合液)中，有机溶 剂的重量份与磷脂的重量份比为292:1，混合均匀，转移至茄形瓶中，减压旋转蒸去有机溶 剂，减压旋转蒸馏条件45 °C、50r/min，得到干膜。
[0040] (b)以磷酸盐缓冲液水化步骤（a)得到的干膜，振摇，使脂质膜完全水化，再以超 声波细胞粉碎仪进行超声破碎处理。
[0041] (c)将上述超声破碎处理，超声破碎处理条件温度25 °C，功率16W，每次持续5 s，重复6次，超声破碎处理后的样品放置2~3h后，将其置于脂质体挤出仪中，在0.25MPa 下挤过100nm聚碳酸醋膜，再于0? 49MPa下挤过50nm聚碳酸醋膜，即得传递体混悬液。
[0042] 检测结果：上述三七总皂苷传递体的平均粒径为（123. 60 ± 0. 36) nm，人参皂苷 Rg1、人参皂苷1^的包封率分别为（82. 42 ± 0.69) %和（94. 40 ± 0.74)%，弹性为（2. 74 ± 0? 32) min〇
[0043] 实施例2 三七总皂苷传递体由以下重量份成分组成： 三七总皂苷 120份 大豆卵磷脂 150份 胆固醇 17份 朽1檬稀-梓檬醛混合挥发油（I:I，W/W) 60份 维生素E 2. 5份 磷酸盐缓冲液 15000份 主要组成成分的规格与来源：三七总皂苷(符合国家药典2010标准)，云南植物药物 有限公司；大豆卵磷脂（PC含量为75%，注射级)，德国Lipoid公司；胆固醇(符合国家药典 2010标准)，南京新百药业有限公司；柠檬烯、柠檬醛(符合国家药典2010标准）吉安市聚 鹏天然香料油有限公司；维生素E(符合国家药典2010标准）浙江新和成股份有限公司； 磷酸 盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15mol/L磷酸氢二钠溶液按体积比 53. 4:46. 6混合的混合液。
[0044] 三七总皂苷传递体的制备方法为： 采用薄膜分散法来进行制备，该方法包括以下步骤： (a)称取配方量的三七总皂苷、大豆卵磷脂、胆固醇、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油和维 生素E，溶于有机溶剂(有机溶剂为为甲醇、正丁醇、异丙醇、丙酮、乙腈、正己烷和二氯甲烷 中的一种或两种以上的混合液）中，有机溶剂的重量份与磷脂的重量份比为200:1，混合均 匀，转移至茄形瓶中，减压旋转蒸去有机溶剂，得到干膜。
[0045] (b)以磷酸盐缓冲液水化步骤（a)得到的干膜，振摇，使脂质膜完全水化，再以超 声波细胞粉碎仪进行超声破碎处理。
[0046] (C)将上述超声破碎处理后的样品放置2~3 h后，将其置于脂质体挤出仪中，在 0.25MPa下挤过100nm聚碳酸醋膜，再于0.49MPa下挤过50nm聚碳酸醋膜，即得传递体 混悬液。
[0047] 检测结果：上述三七总皂苷传递体的平均粒径为（136. 23 ± 1. 18)nm，人参皂苷 Rg1、人参皂苷Rb1的包封率分别为（81.06 ± 1.09) %和（92. 84 ± 0.94)%，弹性为（3. 54 ± 0? 57)min〇
[0048] 实施例3 三七总皂苷传递体由以下重量份成分组成： 三七总皂苷 60份 大豆卵磷脂 120份 胆固醇 12份 朽1檬稀-朽1檬醛混合挥发油（1:4,W/W) 40份 维生素E 2份 磷酸盐缓冲液 10000份 主要组成成分的规格与来源：三七总皂苷(符合国家药典2010标准)，云南植物药物有 限公司；大豆卵磷脂（PC含量为95%，注射级)，上海太伟药业有限公司；胆固醇(符合国家药 典2010标准)，南京新百药业有限公司；柠檬烯、柠檬醛(符合国家药典2010标准）吉安市 聚鹏天然香料油有限公司；维生素E(符合国家药典2010标准)浙江新和成股份有限公司； 磷酸盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15mol/L磷酸氢二钠溶液按体积比 53. 4:46. 6混合的混合液。
[0049] 三七总皂苷传递体的制备方法为： 采用薄膜分散法来进行制备，该方法包括以下步骤： (a)称取配方量的三七总皂苷、大豆卵磷脂、胆固醇、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油和维 生素E，溶于有机溶剂中，混合均匀，转移至茄形瓶中，减压旋转蒸去有机溶剂，得到干膜。
[0050] (b)以磷酸盐缓冲液水化步骤（a)得到的干膜，振摇，使脂质膜完全水化，再以超 声波细胞粉碎仪进行超声破碎处理。
[0051] (c)将上述超声破碎处理后的样品放置2~3h后，将其置于脂质体挤出仪中，在 0.25MPa下挤过100nm聚碳酸醋膜，再于0.49MPa下挤过50nm聚碳酸醋膜，即得传递体 混悬液。
[0052] 检测结果：上述三七总皂苷传递体的平均粒径为（134. 20±0. 60)nm，人参皂 苷Rg1、人参皂苷1^的包封率分别为（82. 52± 1. 45) %和（92. 92 ± 2. 01 )%，弹性为 (5. 02±1. 06)min。
[0053] 本发明治疗急性闭合性软组织损伤实验研宄 1.材料与方法 I. 1药物(6.::三七总皂苷传递体：由三七总皂苷、胆固醇、大豆卵磷脂、维生素E、中药挥 发油、磷酸盐缓冲液组成，选用实施例1所制得的样品进行药效学考察。含药量：10mg/mL， 由浙江中医药大学中药制剂实验室提供。青鹏软膏：主要由棘豆、亚大黄、铁棒锤、诃子 (去核）等组成，由西藏奇正藏药股份有限公司，国药准字Z54020140。
[0054] 1.2模型建立采用定量化重力打击法进行造模(本法参考文献：马忆南.闭 合性软组织损伤造模方法及存在问题的研宄[J].中国现代医学杂志，2014，24(3): 20-23.)。造模前24h，用剃毛器脱去大鼠右下肢小腿部的毛发。在实验前，腹腔内注射3 mL/kg4 2%戊巴比妥钠将大鼠麻醉，采用自制的重物自由落体打击装置建立大鼠急性软组 织损伤模型。具体操作方法为：通过一金属导杆引导的金属重物160g，于140cm的高处 垂直下落，对大鼠右下肢腓肠肌外侧进行打击，造成面积约4cm2大小有明显皮下出血及肿 胀的急性软组织损伤模型。实验过程中，避免大鼠皮肤的破损和骨折。造模后经肉眼观察， 损伤处明显肿胀、皮下瘀斑以及肌肉颜色明显变深，说明造模成功。
[0055] 1.3分组与给药将造模成功的大鼠随机分为五组，分别为模型对照组、三七总皂 苷传递体经皮给药组(试验组)、青鹏软膏组、血塞通注射液组和血塞通胶囊组，另设一组正 常对照组，每组20只。于实验动物造模24h后开始给药，模型对照组与正常对照组给予一 定量生理盐水，青鹏软膏组给予0. 2g/cm2的青鹏软膏，试验组按I. 4mL/kg/d给予最优处 方传递体(按三七总皂苷临床口服最低剂量，通过等效剂量系数折算所得)，血塞通注射液 组按0. 36ml/kg/d给予血塞通注射液(按血塞通注射液临床给药剂量，通过等效剂量系数 折算所得)，血塞通胶囊组按27mg/kg/d给予血塞通胶囊(按血塞通胶囊临床给药剂量，通 过等效剂量系数折算所得)。试验组以非封闭状态给药(每天给药两次，连续给药5d);模 型对照组、正常对照组及青鹏软膏组均以纱布包扎(每天换药1次，连续给药5d);血塞通 注射液组每天肌注给药2次，连续给药5d;血塞通胶囊组，取胶囊中特定量的药物后以生 理盐水溶解后每天灌胃给药3次，连续给药5天。
[0056] 1.4损伤症候指数观测每天观察伤肢皮下淤血、肌肉肿胀和肌肉颜色的变化并 进行评分，评分标准：皮下瘀血(受损组织局部多量块状计3分，少量点状计2分，无瘀血者 计1分）；肌肉肿胀（受损局部肌肉明显肿胀计3分，稍有肿胀计2分，无肿胀者计1分）；肌 肉颜色(受损局部肌肉呈暗紫色深计3分，暗红色浅计2分，色泽正常计1分)。
[0057] 1.5血液流变学测定于给药3 d及5 d后各组随机取部分大鼠，于大鼠腹主静脉 采集静脉血约5mL，EDTA抗凝，使用血液流变仪进行血液流变学测定。采血后的大鼠进行 集中处死。
[0058] 1.6组织形态学观察于给药5d后各组随机取部分大鼠，处死，分离损伤中心组 织，割取适宜大小的组织块。用中性缓冲福尔马林溶液固定取出的组织块，制作石蜡切片， HE染色，在光镜下观察创伤局部组织形态及炎性细胞的浸润状态。
[0059] 1. 7统计方法所以测定数值以均值土标准差表示，采用SPSS17. 0软件对所有数 据进行单因素方差分析。
[0060] 2?结果 2. 1三七总皂苷传递体对模型大鼠损伤症候指数评分的影响 实验观察发现，给药Id后试验组、阳性对照组、血塞通胶囊组和血塞通注射剂组大鼠 损伤症候情况都有不同程度的改善，模型组大鼠则无明显改善；给药2d后试验组和阳性 对照组大鼠损伤症候指数明显降低，血塞通胶囊组和血塞通注射剂组大鼠损伤症候指数稍 有下降，模型组下降有限；给药3d后试验组和阳性对照组大鼠基本无肉眼可见损伤症候， 血塞通胶囊组、血塞通注射剂组和模型组大鼠无明显足肿胀，但仍存在不同程度的皮下淤 血和肌肉变色情况；给药5d后血塞通胶囊组、血塞通注射剂组和模型组大鼠基本无肉眼 可见损伤症候。统计结果见表1。
[0061] 表1不同观察组损伤症候指数比较
与模型组比较，*P〈 0 .05，#P〈 0.01;与正常组比较，▲P〈 0.05，AAP〈 0. 01 ;与血塞通胶囊组比较，AP〈 0. 05，AAP〈 0. 01 ;与血塞通注射液组比较，&P〈 0? 05, &&P〈 0? 01 ; 注：给药1天后，n= 20 ;给药2天后，n= 20 ;给药3天后，n= 20 ;给药5天后，n= 10 2. 2三七总皂苷传递体对模型大鼠血液流变学的影响 试验结果显示，给药3天后试验组与阳性对照组的全血粘度及血浆粘度皆下降明显， 血塞通胶囊组与血塞通注射液组下降有限，模型组无明显改善；给药5天后试验组与阳性 对照组的全血粘度及血浆粘度皆接近正常对照组，血塞通胶囊组、血塞通注射液组与模型 组依然偏高。统计结果见表2。
[0062] 表2不同观察组血液流变学（mPa?s)比较
与模型组比较，*P〈 0.05，#P〈 0.01;与正常组比较，▲P〈 0.05，AAP〈 0.01;与血塞通胶囊组比较，AP〈 0.05,AAP〈 0.01;与血塞通注射液组比较，&P〈 0? 05, &&P〈 0? 01 ;注：n= 10 2. 3三七总皂苷传递体对模型大鼠组织形态学的影响 正常对照组肌纤维形态较一致，肌细胞呈长梭形，胞浆丰富，无病理变化(见图IA);造 模24h后可见肌纤维变形，甚至断离，且伴有水肿、出血、大量炎细胞浸润，局部组织变性坏 死(见图IB)。给药5d后，试验组与阳性对照组肌纤维肿胀、肌组织内瘀血、水肿、出血灶 基本消失，血管增生、胶原纤维增生与正常组织相比已基本恢复(见图IC，D);血塞通胶囊 组、血塞通注射液组与模型对照组有的可见部分肌纤维肿胀，有的可见白细胞弥漫性浸润， 恢复效果不佳(见图IE，F，G)。
[0063] 3?结论 三七总皂苷传递体能显著降低模型大鼠的损伤症候指数，明显改善其血液高浓、粘、 聚、凝状态，对其病理组织形态也具有良好的修复作用。本发明对大鼠急性闭合性软组织损 伤具有确切的治疗效果。
[0064] 临床资料 基本资料：共观察急性闭合性软组织损伤200例，其中男性126例、女性74例，年龄为 17-35 岁。
[0065] 病例选择：凡由外伤劳损外邪引起的肌肉、韧带、筋膜、肌腱、滑膜等组织以及周围 神经、血管的急性闭合性损伤患者均可纳入。
[0066] 用药方法与疗程：取实施例1的药物适量涂抹在患处，尽量使用药部位处于非封 闭状态，每日2-3次。治疗10天后观察疗效。
[0067] 疗效判断标准： 1、痊愈：用药后局部疼痛、肿胀及皮肤瘀斑消失，活动功能恢复正常。
[0068] 2、显效：用药后局部疼痛大大减轻，肿胀及皮肤瘀斑基本消失，活动功能基本恢 复。
[0069] 3、有效：用药后局部疼痛减轻，肿胀及皮肤瘀斑有所消失，活动功能有所恢复。
[0070] 4、无效：用药后局部疼痛、肿胀及皮肤瘀斑均未有改观。
[0071] 结果：痊愈142例，显效36例，有效15例，无效7例。显效率89. 0%，总有效率 96. 5%〇
[0072] 所有患者均未见有明显的不良反应。
【主权项】
1. 一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特征在于由以下重量份的 成分组成： 三七总皂苷60-120份、磷脂120-150份、胆固醇12-20份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油 40-80份、维生素E2-2. 5份、缓冲液10000-15000份，所述的柠檬烯-柠檬醛混合挥发油由 柠檬烯和柠檬醛按照重量比1:4~4:1混合而成，优选为柠檬烯-柠檬醛混合挥发油由柠 檬烯和柠檬醛按照重量比4:1混合而成，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。2. 如权利要求1所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特 征在于由以下重量份的成分组成： 三七总皂苷80-110份、磷脂120-140份、胆固醇14-16份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油 60-80份、维生素E2-2. 3份、缓冲液10000-12000份。3. 如权利要求1所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特征 在于由以下重量份的成分组成： 三七总皂苷100份、磷脂120份、胆固醇15份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油80份、维生 素E2份、缓冲液10000份。4. 如权利要求1或2或3所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制 剂，其特征在于所述的磷酸盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15mol/L磷酸 氢二钠溶液按体积比53. 4:46. 6混合的混合液。5. 如权利要求1、2、3或4所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂 的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤： 1) 称取配方量的三七总皂苷、磷脂、胆固醇、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油和维生素E，溶 于有机溶剂中，混合均匀，转移至茄形瓶中，减压旋转蒸去有机溶剂，得到干膜； 2) 以缓冲液水化步骤1)得到的干膜，振摇，使脂质膜完全水化，再以超声波细胞粉碎仪 进行超声破碎处理； 3) 将上述超声破碎处理后的样品放置2~3h后，将其置于脂质体挤出仪中，在0. 25 MPa下挤过100nm聚碳酸酯膜，再于0? 49MPa下挤过50nm聚碳酸酯膜，即得治疗急性闭 合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂。6. 如权利要求5所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备 方法，其特征在于所述的步骤1)中有机溶剂为甲醇、正丁醇、异丙醇、丙酮、乙腈、正己烷和 二氯甲烷中的一种或两种以上的混合液，优选甲醇-二氯甲烷按体积比3:4混合的混合液。7. 如权利要求5所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备 方法，其特征在于所述的步骤1)中有机溶剂的加入量与磷脂的重量份比的范围为200~ 417 :1，优选为 292:1。8. 如权利要求5所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备 方法，其特征在于所述的步骤1)中减压旋转蒸馏条件45°C、50r/min。9. 如权利要求5所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备 方法，其特征在于所述的步骤1)中超声破碎处理条件温度25°C，功率16W，每次持续5s，重 复6次。10. 如权利要求5所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备 方法，其特征在于所述的步骤2)中磷酸盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15
【专利摘要】一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂及其制备方法，属于医药技术领域。该制剂由以下重量份的成分组成：三七总皂苷60-120份、磷脂120-150份、胆固醇12-20份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油40-80份、维生素E2-2.5份、缓冲液10000-15000份。本发明的三七总皂苷传递体在使用时直接涂抹于患处，具有良好的活血、抗炎和改善血液流变学等作用，对急性闭合性软组织损伤有良好的治疗和修复作用，明显缩短其治疗周期。
【IPC分类】A61K47/10, A61P29/00, A61K36/258, A61K9/127, A61K47/22, A61K47/24
【公开号】CN104906042
【申请号】CN201510281253
【发明人】郑杭生, 陈思思, 李范珠
【申请人】浙江中医药大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月28日
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤 给药制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 急性软组织损伤系指机体受到外来或内在的不同致伤因素的作用，造成运动系 统、皮肤以下骨骼之外的组织所发生的一系列急性挫伤或（和）裂伤，包括肌肉、韧带、筋 膜、肌腱、滑膜、脂肪、关节囊等组织以及周围神经、血管的不同情况的急性损伤。它又可分 为开放性损伤和闭合性损伤两大类：其中开放性损伤在临床上已有较好的治疗手段；而闭 合性损伤较开放性损伤更为多见，包括关节、韧带的扭伤和肌肉、肌腱的拉伤、骨折等，这些 损伤无裂口与外界相通，因此在治疗中口服用药或普通外用制剂皮肤外用后病灶部位的药 物浓度都很低，难以取得理想的疗效。
[0003] 传递体（transfersomes，TFS)亦称柔性脂质体，是一种新型透皮给药载体，主要成 分为磷脂和边缘活化剂(如胆酸钠、去氧胆酸钠等)，具有高度的变形性，可高效透过比自身 小数倍的皮肤孔道而达到透皮给药目的。
[0004] 三七是五加科植物三七（Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)的干燥根及根 莖，是中医传统用于体内外各种出血之证及跌打损伤、瘀滞肿痛的要药。三七总皂苷（Panax notoginsengsaponins，PNS)是其主要有效部位，在临床上PNS广泛用于软组织损伤、骨折 的愈合、骨关节损伤及肢体功能的恢复等。但是，目前PNS的市售剂型主要以口服给药制剂 及静注制剂为主，这对于身体局部软组织损伤的治疗并不是理想的给药途径。
[0005] 故将PNS制成传递体经皮给药制剂可能可以提高PNS在病灶部位的有效浓度，提 高其生物利用度，为急性闭合性软组织损伤的临床治疗提供新方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有制剂的不足，提供一种治疗急性闭合性软组织损伤的新 型皮肤给药制剂，以提高药物生物利用度，缩短治疗周期，并减少药物的毒副作用；本发明 的另一目的在于提供制备上述新型皮肤给药制剂的方法。
[0007] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特征在于由以下 重量份的成分组成： 三七总皂苷60-120份、磷脂120-150份、胆固醇12-20份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油 40-80份、维生素E2-2. 5份、缓冲液10000-15000份，所述的柠檬烯-柠檬醛混合挥发油由 柠檬烯和柠檬醛按照重量比1:4~4:1混合而成，优选为柠檬烯-柠檬醛混合挥发油由柠 檬烯和柠檬醛按照重量比4:1混合而成，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。
[0008] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特征在于由以下 重量份的成分组成： 三七总皂苷80-110份、磷脂120-140份、胆固醇14-16份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油 60-80份、维生素E2-2. 3份、缓冲液10000-12000份。
[0009] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特征在于由以下 重量份的成分组成： 三七总皂苷100份、磷脂120份、胆固醇15份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油80份、维生 素E2份、缓冲液10000份。
[0010] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特征在于所述的 磷酸盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15mol/L磷酸氢二钠溶液按体积比 53. 4:46. 6混合的混合液。
[0011] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备方法，其特征 在于包括以下工艺步骤： 1) 称取配方量的三七总皂苷、磷脂、胆固醇、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油和维生素E，溶 于有机溶剂中，混合均匀，转移至茄形瓶中，减压旋转蒸去有机溶剂，得到干膜； 2) 以缓冲液水化步骤1)得到的干膜，振摇，使脂质膜完全水化，再以超声波细胞粉碎仪 进行超声破碎处理； 3) 将上述超声破碎处理后的样品放置2~3h后，将其置于脂质体挤出仪中，在0. 25 MPa下挤过100nm聚碳酸酯膜，再于0? 49MPa下挤过50nm聚碳酸酯膜，即得治疗急性闭 合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂。
[0012] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备方法，其特征 在于所述的步骤1)中有机溶剂为甲醇、正丁醇、异丙醇、丙酮、乙腈、正己烷和二氯甲烷中的 一种或两种以上的混合液，优选甲醇-二氯甲烷按体积比3:4混合的混合液。
[0013] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备方法，其特征 在于所述的步骤1)中有机溶剂的加入量与磷脂的重量份比的范围为200~417 :1，优选为 292:1〇
[0014] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备方法，其特征 在于所述的步骤1)中减压旋转蒸馏条件45 °C、50r/min。
[0015] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备方法，其特征 在于所述的步骤1)中超声破碎处理条件温度25 °C，功率16W，每次持续5s，重复6次。
[0016] 所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备方法，其特征 在于所述的步骤2)中磷酸盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15mol/L磷酸 氢二钠溶液按体积比53. 4:46. 6混合的混合液。
[0017] 本发明中三七总皂苷为提取自中药三七的中药有效部位，符合国家药典2010标 准，有市售产品，生产商如云南植物药物有限公司，但是，绝不仅限于此公司。
[0018] 本发明中作为用于形成传递体的磷脂，可以使用天然磷脂和合成磷脂。天然磷 脂包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵 磷脂、蛋黄磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰丝氨酸、蛋黄磷脂酰肌醇、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷 月旨、氢化卵磷脂、卵磷脂酰甘油、卵磷脂酰丝氨酸和卵磷脂酰肌醇等。合成磷脂为二油酰 磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂 酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二 月桂酰磷脂酰甘油和聚乙二醇衍生化磷脂例如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-mPEG2000);二软酯酰胆磷脂-聚乙二醇2000 (DPPG-mPEG2000);氢化大豆磷脂酰胆 碱-聚乙二醇 2000(HSPC-mPEG2000);二油酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇 2000(D0PC-mPEG2000) 等。
[0019] 本发明人经过研宄发现，市售的PC含量为60%~95%的大豆卵磷脂特别适于作为 基础磷脂膜材料包封活性药物成分，从而形成优质的传递体，优选大豆卵磷脂的PC含量为 70% ~80%。
[0020] 本发明中胆固醇起到调节膜流动性的作用，可以提高脂质双分子层膜的稳定性和 药物的包封率。所用胆固醇符合药典2010标准。
[0021] 本发明中选用柠檬烯-柠檬醛混合挥发油作为边缘活化剂，以挥发油作为边缘活 化剂相对于其他表面活性剂类边缘活化剂，使所形成的传递体安全性大大提高，从而使患 者较长期的使用本品成为可能。
[0022] 本发明人经过研宄发现，柠檬烯-柠檬 醛混合挥发油中两者的比例可在1:4~4:1 (W/W)的范围，当混合挥发油的比例为4:1时，所形成的中西药复方传递体弹性最佳，皮肤 渗透性最优。
[0023] 本发明中维生素E作为抗氧化剂，防止磷脂被氧化。
[0024] 研宄发现，本发明通过三七总皂苷、磷脂、胆固醇、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油和 维生素E合理配比，可以制得品质优良的三七总皂苷传递体，其包封率和稳定性良好，毒性 低，生物利用度高，疗效确切。
[0025] 本发明中混合挥发油的加入方式可采用以下三种方法：与磷脂等一同加入，制成 干膜；除挥发油之外的其他成分按薄膜分散制得脂质体，最后通过涡旋混合的方法加入挥 发油；将挥发油溶于少量乙醇后，进而与水化液混溶，最后以所得混合液水化脂质干膜。结 果表明，挥发油与磷脂等一同加入制成干膜进而制得的传递体弹性及包封率较优。
[0026] 通过本发明的方法能制得品质优良的三七总皂苷传递体，其中传递体弹性较大， 药物包封率高，稳定性高，粒径适宜且分布均匀，生物利用度高，疗效确切。
[0027] 研宄发现，传递体的粒径对其皮肤靶向性有较大影响，粒径越小，药物在皮肤中的 滞留量越大；此外，优良的弹性也是提高传递体透皮性能的重要条件。通过本发明方法制备 的三七总皂苷传递体弹性好，粒径小且分布均匀，这是其在靶部位渗透效率高、生物利用度 高、疗效确切的原因之一。
[0028] 功能与主治：具有活血、抗炎和改善血液微循环等功效，作为软组织损伤等多种疾 病的外用药，尤其对于急性闭合性软组织损伤有很好的疗效。
[0029] 用法与用量：外用药，根据损伤面积大小，取适量药物直接涂抹于患处，尽量使用 药部位处于非封闭状态，每日2-3次。
[0030] 注意：皮肤破损或溃疡者慎用。
[0031] 贮藏：密闭，置阴凉、避光处保存。
[0032] 本发明的三七总皂苷传递体在使用时直接涂抹于患处，具有良好的活血、抗炎和 改善血液流变学等作用，对急性闭合性软组织损伤有良好的治疗和修复作用，明显缩短其 治疗周期。
【附图说明】
[0033] 图1为三七总皂苷传递体对模型大鼠组织形态学的影响图； 图中：正常对照组（A);造模24 h后（B) ;PNS传递体试验组（C);阳性对照青鹏软膏组 (D);血塞通胶囊组（E);血塞通注射液组（F);模型对照组（G)。
【具体实施方式】
[0034] 为了帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明，结合实验数据，详细叙述本发 明的【具体实施方式】。但所列举的实施例不以任何方式限制本发明的权利。
[0035] 本发明实施例中所述及的三七总皂苷传递体的粒径及粒径分布、形态、包封率、弹 性等指标的评价方法如下： 1.粒径及其分布评价方法 取上述三七总皂苷传递体用蒸馏水适当稀释，采用激光粒度仪测定传递体的粒径及其 分布情况。
[0036] 2?形态观察 取上述三七总皂苷传递体适量，用水稀释，滴到铜网上，用1%磷钨酸溶液负染，滤纸吸 取多余染色液，干燥后用透射电子显微镜观察。
[0037] 3?包封率的测定方法 采用离心超滤法进行测定。取待测传递体样品，摇匀，取少量进行光学显微镜观察， 确认其中不含药物结晶后精密量取200yL，置于超滤离心管内（超滤膜的截留分子量为 100000Da)，进行冷冻离心(相对离心力：14000g，温度：4 °C)，收集全部外水相，转移至合 适体积的量瓶中，以流动相定容，摇匀，以三七总皂苷中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1S指标， 以HPLC法测定传递体外水相中各指标成分含量，另外，以HPLC法测定传递体样品中各指标 成分含量，按下式计算包封率： EE= (Ws-Wea) /WsX100% 式中崩为包封率；为取样量中人参皂苷Rgi或人参皂苷Rbi的含量（mg) ; 为外水 相中人参皂苷Rg1或人参皂苷Rbi的含量（mg)。
[0038] 4?弹性的测定方法 精密量取10 mL传递体，置于脂质体挤出仪中，挤过50 nm聚碳酸酯膜，压力为0.49 MPa，将样品全部挤出所用时间记为其弹性。（本法参考文献：Zaafarany G. M.E.，Avad G. A. S. , Holayel S. M. et al. Role of egde activators and surface charge in developing ultradeformable vesicles with enhanced skin delivery [J]. Int J Pharm, 2010,397 (1-2):164-172.) 实施例I 三七总皂苷传递体由以下重量份成分组成： 三七总皂苷 100份 大豆卵磷脂 120份 胆固醇 15份 朽1檬稀-朽1檬醛混合挥发油（4:1，W/W) 80份 维生素E 2份 磷酸盐缓冲液 10000份 主要组成成分的规格与来源：三七总皂苷(符合国家药典2010标准)，云南植物药物有 限公司；大豆卵磷脂（PC含量为80%，注射级)，上海太伟药业有限公司；胆固醇(符合国家药 典2010标准)，南京新百药业有限公司；柠檬烯、柠檬醛(符合国家药典2010标准）吉安市 聚鹏天然香料油有限公司；维生素E(符合国家药典2010标准)浙江新和成股份有限公司； 磷酸盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15mol/L磷酸氢二钠溶液按体积比 53. 4:46. 6混合的混合液。
[0039] 三七总皂苷传递体的制备方法为： 采用薄膜分散法来进行制备，该方法包括以下步骤： (a)称取配方量的三七总皂苷、大豆卵磷脂、胆固醇、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油和维 生素E，溶于有机溶剂(有机溶剂为甲醇-二氯甲烷按体积比3:4混合的混合液)中，有机溶 剂的重量份与磷脂的重量份比为292:1，混合均匀，转移至茄形瓶中，减压旋转蒸去有机溶 剂，减压旋转蒸馏条件45 °C、50r/min，得到干膜。
[0040] (b)以磷酸盐缓冲液水化步骤（a)得到的干膜，振摇，使脂质膜完全水化，再以超 声波细胞粉碎仪进行超声破碎处理。
[0041] (c)将上述超声破碎处理，超声破碎处理条件温度25 °C，功率16W，每次持续5 s，重复6次，超声破碎处理后的样品放置2~3h后，将其置于脂质体挤出仪中，在0.25MPa 下挤过100nm聚碳酸醋膜，再于0? 49MPa下挤过50nm聚碳酸醋膜，即得传递体混悬液。
[0042] 检测结果：上述三七总皂苷传递体的平均粒径为（123. 60 ± 0. 36) nm，人参皂苷 Rg1、人参皂苷1^的包封率分别为（82. 42 ± 0.69) %和（94. 40 ± 0.74)%，弹性为（2. 74 ± 0? 32) min〇
[0043] 实施例2 三七总皂苷传递体由以下重量份成分组成： 三七总皂苷 120份 大豆卵磷脂 150份 胆固醇 17份 朽1檬稀-梓檬醛混合挥发油（I:I，W/W) 60份 维生素E 2. 5份 磷酸盐缓冲液 15000份 主要组成成分的规格与来源：三七总皂苷(符合国家药典2010标准)，云南植物药物 有限公司；大豆卵磷脂（PC含量为75%，注射级)，德国Lipoid公司；胆固醇(符合国家药典 2010标准)，南京新百药业有限公司；柠檬烯、柠檬醛(符合国家药典2010标准）吉安市聚 鹏天然香料油有限公司；维生素E(符合国家药典2010标准）浙江新和成股份有限公司； 磷酸 盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15mol/L磷酸氢二钠溶液按体积比 53. 4:46. 6混合的混合液。
[0044] 三七总皂苷传递体的制备方法为： 采用薄膜分散法来进行制备，该方法包括以下步骤： (a)称取配方量的三七总皂苷、大豆卵磷脂、胆固醇、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油和维 生素E，溶于有机溶剂(有机溶剂为为甲醇、正丁醇、异丙醇、丙酮、乙腈、正己烷和二氯甲烷 中的一种或两种以上的混合液）中，有机溶剂的重量份与磷脂的重量份比为200:1，混合均 匀，转移至茄形瓶中，减压旋转蒸去有机溶剂，得到干膜。
[0045] (b)以磷酸盐缓冲液水化步骤（a)得到的干膜，振摇，使脂质膜完全水化，再以超 声波细胞粉碎仪进行超声破碎处理。
[0046] (C)将上述超声破碎处理后的样品放置2~3 h后，将其置于脂质体挤出仪中，在 0.25MPa下挤过100nm聚碳酸醋膜，再于0.49MPa下挤过50nm聚碳酸醋膜，即得传递体 混悬液。
[0047] 检测结果：上述三七总皂苷传递体的平均粒径为（136. 23 ± 1. 18)nm，人参皂苷 Rg1、人参皂苷Rb1的包封率分别为（81.06 ± 1.09) %和（92. 84 ± 0.94)%，弹性为（3. 54 ± 0? 57)min〇
[0048] 实施例3 三七总皂苷传递体由以下重量份成分组成： 三七总皂苷 60份 大豆卵磷脂 120份 胆固醇 12份 朽1檬稀-朽1檬醛混合挥发油（1:4,W/W) 40份 维生素E 2份 磷酸盐缓冲液 10000份 主要组成成分的规格与来源：三七总皂苷(符合国家药典2010标准)，云南植物药物有 限公司；大豆卵磷脂（PC含量为95%，注射级)，上海太伟药业有限公司；胆固醇(符合国家药 典2010标准)，南京新百药业有限公司；柠檬烯、柠檬醛(符合国家药典2010标准）吉安市 聚鹏天然香料油有限公司；维生素E(符合国家药典2010标准)浙江新和成股份有限公司； 磷酸盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15mol/L磷酸氢二钠溶液按体积比 53. 4:46. 6混合的混合液。
[0049] 三七总皂苷传递体的制备方法为： 采用薄膜分散法来进行制备，该方法包括以下步骤： (a)称取配方量的三七总皂苷、大豆卵磷脂、胆固醇、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油和维 生素E，溶于有机溶剂中，混合均匀，转移至茄形瓶中，减压旋转蒸去有机溶剂，得到干膜。
[0050] (b)以磷酸盐缓冲液水化步骤（a)得到的干膜，振摇，使脂质膜完全水化，再以超 声波细胞粉碎仪进行超声破碎处理。
[0051] (c)将上述超声破碎处理后的样品放置2~3h后，将其置于脂质体挤出仪中，在 0.25MPa下挤过100nm聚碳酸醋膜，再于0.49MPa下挤过50nm聚碳酸醋膜，即得传递体 混悬液。
[0052] 检测结果：上述三七总皂苷传递体的平均粒径为（134. 20±0. 60)nm，人参皂 苷Rg1、人参皂苷1^的包封率分别为（82. 52± 1. 45) %和（92. 92 ± 2. 01 )%，弹性为 (5. 02±1. 06)min。
[0053] 本发明治疗急性闭合性软组织损伤实验研宄 1.材料与方法 I. 1药物(6.::三七总皂苷传递体：由三七总皂苷、胆固醇、大豆卵磷脂、维生素E、中药挥 发油、磷酸盐缓冲液组成，选用实施例1所制得的样品进行药效学考察。含药量：10mg/mL， 由浙江中医药大学中药制剂实验室提供。青鹏软膏：主要由棘豆、亚大黄、铁棒锤、诃子 (去核）等组成，由西藏奇正藏药股份有限公司，国药准字Z54020140。
[0054] 1.2模型建立采用定量化重力打击法进行造模(本法参考文献：马忆南.闭 合性软组织损伤造模方法及存在问题的研宄[J].中国现代医学杂志，2014，24(3): 20-23.)。造模前24h，用剃毛器脱去大鼠右下肢小腿部的毛发。在实验前，腹腔内注射3 mL/kg4 2%戊巴比妥钠将大鼠麻醉，采用自制的重物自由落体打击装置建立大鼠急性软组 织损伤模型。具体操作方法为：通过一金属导杆引导的金属重物160g，于140cm的高处 垂直下落，对大鼠右下肢腓肠肌外侧进行打击，造成面积约4cm2大小有明显皮下出血及肿 胀的急性软组织损伤模型。实验过程中，避免大鼠皮肤的破损和骨折。造模后经肉眼观察， 损伤处明显肿胀、皮下瘀斑以及肌肉颜色明显变深，说明造模成功。
[0055] 1.3分组与给药将造模成功的大鼠随机分为五组，分别为模型对照组、三七总皂 苷传递体经皮给药组(试验组)、青鹏软膏组、血塞通注射液组和血塞通胶囊组，另设一组正 常对照组，每组20只。于实验动物造模24h后开始给药，模型对照组与正常对照组给予一 定量生理盐水，青鹏软膏组给予0. 2g/cm2的青鹏软膏，试验组按I. 4mL/kg/d给予最优处 方传递体(按三七总皂苷临床口服最低剂量，通过等效剂量系数折算所得)，血塞通注射液 组按0. 36ml/kg/d给予血塞通注射液(按血塞通注射液临床给药剂量，通过等效剂量系数 折算所得)，血塞通胶囊组按27mg/kg/d给予血塞通胶囊(按血塞通胶囊临床给药剂量，通 过等效剂量系数折算所得)。试验组以非封闭状态给药(每天给药两次，连续给药5d);模 型对照组、正常对照组及青鹏软膏组均以纱布包扎(每天换药1次，连续给药5d);血塞通 注射液组每天肌注给药2次，连续给药5d;血塞通胶囊组，取胶囊中特定量的药物后以生 理盐水溶解后每天灌胃给药3次，连续给药5天。
[0056] 1.4损伤症候指数观测每天观察伤肢皮下淤血、肌肉肿胀和肌肉颜色的变化并 进行评分，评分标准：皮下瘀血(受损组织局部多量块状计3分，少量点状计2分，无瘀血者 计1分）；肌肉肿胀（受损局部肌肉明显肿胀计3分，稍有肿胀计2分，无肿胀者计1分）；肌 肉颜色(受损局部肌肉呈暗紫色深计3分，暗红色浅计2分，色泽正常计1分)。
[0057] 1.5血液流变学测定于给药3 d及5 d后各组随机取部分大鼠，于大鼠腹主静脉 采集静脉血约5mL，EDTA抗凝，使用血液流变仪进行血液流变学测定。采血后的大鼠进行 集中处死。
[0058] 1.6组织形态学观察于给药5d后各组随机取部分大鼠，处死，分离损伤中心组 织，割取适宜大小的组织块。用中性缓冲福尔马林溶液固定取出的组织块，制作石蜡切片， HE染色，在光镜下观察创伤局部组织形态及炎性细胞的浸润状态。
[0059] 1. 7统计方法所以测定数值以均值土标准差表示，采用SPSS17. 0软件对所有数 据进行单因素方差分析。
[0060] 2?结果 2. 1三七总皂苷传递体对模型大鼠损伤症候指数评分的影响 实验观察发现，给药Id后试验组、阳性对照组、血塞通胶囊组和血塞通注射剂组大鼠 损伤症候情况都有不同程度的改善，模型组大鼠则无明显改善；给药2d后试验组和阳性 对照组大鼠损伤症候指数明显降低，血塞通胶囊组和血塞通注射剂组大鼠损伤症候指数稍 有下降，模型组下降有限；给药3d后试验组和阳性对照组大鼠基本无肉眼可见损伤症候， 血塞通胶囊组、血塞通注射剂组和模型组大鼠无明显足肿胀，但仍存在不同程度的皮下淤 血和肌肉变色情况；给药5d后血塞通胶囊组、血塞通注射剂组和模型组大鼠基本无肉眼 可见损伤症候。统计结果见表1。
[0061] 表1不同观察组损伤症候指数比较
与模型组比较，*P〈 0 .05，#P〈 0.01;与正常组比较，▲P〈 0.05，AAP〈 0. 01 ;与血塞通胶囊组比较，AP〈 0. 05，AAP〈 0. 01 ;与血塞通注射液组比较，&P〈 0? 05, &&P〈 0? 01 ; 注：给药1天后，n= 20 ;给药2天后，n= 20 ;给药3天后，n= 20 ;给药5天后，n= 10 2. 2三七总皂苷传递体对模型大鼠血液流变学的影响 试验结果显示，给药3天后试验组与阳性对照组的全血粘度及血浆粘度皆下降明显， 血塞通胶囊组与血塞通注射液组下降有限，模型组无明显改善；给药5天后试验组与阳性 对照组的全血粘度及血浆粘度皆接近正常对照组，血塞通胶囊组、血塞通注射液组与模型 组依然偏高。统计结果见表2。
[0062] 表2不同观察组血液流变学（mPa?s)比较
与模型组比较，*P〈 0.05，#P〈 0.01;与正常组比较，▲P〈 0.05，AAP〈 0.01;与血塞通胶囊组比较，AP〈 0.05,AAP〈 0.01;与血塞通注射液组比较，&P〈 0? 05, &&P〈 0? 01 ;注：n= 10 2. 3三七总皂苷传递体对模型大鼠组织形态学的影响 正常对照组肌纤维形态较一致，肌细胞呈长梭形，胞浆丰富，无病理变化(见图IA);造 模24h后可见肌纤维变形，甚至断离，且伴有水肿、出血、大量炎细胞浸润，局部组织变性坏 死(见图IB)。给药5d后，试验组与阳性对照组肌纤维肿胀、肌组织内瘀血、水肿、出血灶 基本消失，血管增生、胶原纤维增生与正常组织相比已基本恢复(见图IC，D);血塞通胶囊 组、血塞通注射液组与模型对照组有的可见部分肌纤维肿胀，有的可见白细胞弥漫性浸润， 恢复效果不佳(见图IE，F，G)。
[0063] 3?结论 三七总皂苷传递体能显著降低模型大鼠的损伤症候指数，明显改善其血液高浓、粘、 聚、凝状态，对其病理组织形态也具有良好的修复作用。本发明对大鼠急性闭合性软组织损 伤具有确切的治疗效果。
[0064] 临床资料 基本资料：共观察急性闭合性软组织损伤200例，其中男性126例、女性74例，年龄为 17-35 岁。
[0065] 病例选择：凡由外伤劳损外邪引起的肌肉、韧带、筋膜、肌腱、滑膜等组织以及周围 神经、血管的急性闭合性损伤患者均可纳入。
[0066] 用药方法与疗程：取实施例1的药物适量涂抹在患处，尽量使用药部位处于非封 闭状态，每日2-3次。治疗10天后观察疗效。
[0067] 疗效判断标准： 1、痊愈：用药后局部疼痛、肿胀及皮肤瘀斑消失，活动功能恢复正常。
[0068] 2、显效：用药后局部疼痛大大减轻，肿胀及皮肤瘀斑基本消失，活动功能基本恢 复。
[0069] 3、有效：用药后局部疼痛减轻，肿胀及皮肤瘀斑有所消失，活动功能有所恢复。
[0070] 4、无效：用药后局部疼痛、肿胀及皮肤瘀斑均未有改观。
[0071] 结果：痊愈142例，显效36例，有效15例，无效7例。显效率89. 0%，总有效率 96. 5%〇
[0072] 所有患者均未见有明显的不良反应。
【主权项】
1. 一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特征在于由以下重量份的 成分组成： 三七总皂苷60-120份、磷脂120-150份、胆固醇12-20份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油 40-80份、维生素E2-2. 5份、缓冲液10000-15000份，所述的柠檬烯-柠檬醛混合挥发油由 柠檬烯和柠檬醛按照重量比1:4~4:1混合而成，优选为柠檬烯-柠檬醛混合挥发油由柠 檬烯和柠檬醛按照重量比4:1混合而成，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。2. 如权利要求1所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特 征在于由以下重量份的成分组成： 三七总皂苷80-110份、磷脂120-140份、胆固醇14-16份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油 60-80份、维生素E2-2. 3份、缓冲液10000-12000份。3. 如权利要求1所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂，其特征 在于由以下重量份的成分组成： 三七总皂苷100份、磷脂120份、胆固醇15份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油80份、维生 素E2份、缓冲液10000份。4. 如权利要求1或2或3所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制 剂，其特征在于所述的磷酸盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15mol/L磷酸 氢二钠溶液按体积比53. 4:46. 6混合的混合液。5. 如权利要求1、2、3或4所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂 的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤： 1) 称取配方量的三七总皂苷、磷脂、胆固醇、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油和维生素E，溶 于有机溶剂中，混合均匀，转移至茄形瓶中，减压旋转蒸去有机溶剂，得到干膜； 2) 以缓冲液水化步骤1)得到的干膜，振摇，使脂质膜完全水化，再以超声波细胞粉碎仪 进行超声破碎处理； 3) 将上述超声破碎处理后的样品放置2~3h后，将其置于脂质体挤出仪中，在0. 25 MPa下挤过100nm聚碳酸酯膜，再于0? 49MPa下挤过50nm聚碳酸酯膜，即得治疗急性闭 合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂。6. 如权利要求5所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备 方法，其特征在于所述的步骤1)中有机溶剂为甲醇、正丁醇、异丙醇、丙酮、乙腈、正己烷和 二氯甲烷中的一种或两种以上的混合液，优选甲醇-二氯甲烷按体积比3:4混合的混合液。7. 如权利要求5所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备 方法，其特征在于所述的步骤1)中有机溶剂的加入量与磷脂的重量份比的范围为200~ 417 :1，优选为 292:1。8. 如权利要求5所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备 方法，其特征在于所述的步骤1)中减压旋转蒸馏条件45°C、50r/min。9. 如权利要求5所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备 方法，其特征在于所述的步骤1)中超声破碎处理条件温度25°C，功率16W，每次持续5s，重 复6次。10. 如权利要求5所述的一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂的制备 方法，其特征在于所述的步骤2)中磷酸盐缓冲溶液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液和1/15
【专利摘要】一种治疗急性闭合性软组织损伤的新型皮肤给药制剂及其制备方法，属于医药技术领域。该制剂由以下重量份的成分组成：三七总皂苷60-120份、磷脂120-150份、胆固醇12-20份、柠檬烯-柠檬醛混合挥发油40-80份、维生素E2-2.5份、缓冲液10000-15000份。本发明的三七总皂苷传递体在使用时直接涂抹于患处，具有良好的活血、抗炎和改善血液流变学等作用，对急性闭合性软组织损伤有良好的治疗和修复作用，明显缩短其治疗周期。
【IPC分类】A61K47/10, A61P29/00, A61K36/258, A61K9/127, A61K47/22, A61K47/24
【公开号】CN104906042
【申请号】CN201510281253
【发明人】郑杭生, 陈思思, 李范珠
【申请人】浙江中医药大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月28日
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